1

Določanje strukture

mikrobne združbe

2

Določanje strukture mikrobne združbe

• mikroskopija

• gojenje (fiziološka različnost)

• FAME, PLFA

• imunološki testi

• tipizacije (fagotipizacija, ribotipizacija)

• analiza DNA in RNA (16S rRNA, PCR, ARDRA, DGGE, RFLP,

RAPD, DNA/RNA sonde, metagenomika)

• GFP

3

Nivoji ločljivosti za posamezne metode

družina rod vrsta sev

RFLP

ribotipizacija

DNA amplifikacija (AFLP, AP-PCR, rep-PCR, RAPD, ARDRA)

fagotipizacija

serologija

cimologija

elektroforeza vseh proteinov

DNA-DNA hibridizacija

4

Nivoji ločljivosti za posamezne metode

družina rod vrsta sev

%GC

poliamini, kinoni

FAME

celična stena

fiziološki testi (Biolog, API)

rRNA

DNA probe

DNA sekvence

5

Klasični fenotipski testi

Redukcijo nitratov do nitritov lahko določimo s SA+NEDA reagentom

Hidroliza arginina povzroči sproščanje amonija, ki ga lahko detektiramo s Neslerjevim reagentom

Hidroliza UREAe povzroči sproščanje amonija, ki sprememni pH in posledično barvo gojišča

6

Hitri testi za identifikacijo mikroorganizmov: Biolog

• v mikrotitersko ploščo dodamo različne vire ogljika in nacepimo neznane mikroorganizme (npr. okoljski vzorec)

• zaradi rasti mikroorganizmov pride do spremembe barve tetrazolijevih soli (meri aktivnost dehidrogenaz)

• odčitamo rezultate

• s pomočjo podatkovne baze identificiramo mikroorganizem

7

Hitri testi za identifikacijo mikroorganizmov: API

• celice nacepimo v liofilizirana

gojišča, ki smo jih predhodno

omočili

• rast mikroorganizmov se kaže

kot sprememba barve

• s pomočjo numeričnih oznak za

spremembo barve določimo

kodo, ki jo primerjamo z

znanimi vnosi v podatkovni bazi

8

Hitri testi za identifikacijo mikroorganizmov

Rapid ANA MicroRespRapid One

MicroID VITEK

BBL Crystal Riboprinter

9

Določanje strukture mikrobne združbe na osnovi makromolekul

- lipidi

- proteini

- nukleinske kisline

10

Molekularna identifikacija - FAME (Fatty Acid Methyl Esters)

V celicah je veliko različnih lipidov (> 100), ki so zastopani v različnih

deležih. Za analizo lipide izoliramo, modificiramo do metilnih estrov,

analiziramo s plinsko kromatografijo. Kromatogrami lipidnih profilov

dajejo značilne vzorce, ki jih med seboj primerjamo.

Pri analizi uvrstimo lipide v več skupin:

- nasičene maščobne kisline

- nenasičene maščobne kisline

- ciklopropanske maščobne kisline

- razvejane maščobne kisline

- hidroksilne maščobne kisline

11

Zakaj uporabljamo maščobne kisline (predvsem fosfolipide - PLFA)?

• so esencialne komponente vsake žive celice in imajo uporabne

biomarkerje, ker so strukturno zelo raznolika skupina molekul z

visoko biološko specifičnostjo

• lahko jih uporabljamo za oceno aktivne biomase, zato ker je:

- fosfatna skupina je tako po propadu organizma porabljena

- običajno fosfolipidov ne najdemo v rezervnih snoveh mikrobov

- običajno so zastopani v dokaj konstantnih deležih v biomasi

12

PLFA ločljivost

• primerjava celotnega PLFA vzorca z multivariantno statistiko

pokaže na spremembe v mikrobni združbi

• sprememba določene PLFA komponente je indikator za

spremembo specifične skupine mikrorganizmov

13

Procedura

• ekstrakcija

• separacija lipidov

• saponifikacija/metilacija

• GC analiza

• podatkovna analiza in intepretacija

14

Ekstrakcija maščobnih kislin iz tal

– 1-25 g tal (zračno suha tla)

– kloroform : metanol : fosfatni pufer (2:1:0.8)

– centrifuga, filtracija in odstranjevanje kloroforma

– sušenje z N2

15

Separacija lipidov

• uporaba silicijeve kolone. Lipide ločimo z naslednjimi eluenti:

- nevtralne lipide s kloroformom

- glikolipide z acetonom

- fosfolipide z metanolom

• metilacija z uporaba 2M KOH raztopljenega v MeOH

• uporaba GC-FID

– uporaba standardov za identifikacijo kromatografskih pikov

16

Primer kromatograma identifikacija s standardi

min14 16 18 20 22 24 26 28 30

pA

20

40

60

80

100

120

FID1 A, (C:\DOCUME~1\JENN\MYDOCU~1\RESEARCH\GC-FID~1\08120312.D)

15:0i

16:0

19:0 cy

18:2 w6,9 18:1 w9c

18:1 w7c

15:0a

14:0

16:0 10 Me

12.

990

13.

161

13.

387

13.

618

13.

726

13.

899 14.

131

14.

480

14.

739

15.

009

15.

174

15.

418

15.

581

15.

677

15.

823

15.

926 16.

146

16.

492

16.

884

17.

003

17.

292

17.

399

17.

622

17.

736

17.

910

18.

127

18.

318

18.

569

18.

951

19.

093

19.

192

19.

317

19.

483 1

9.62

3 1

9.76

4 1

9.90

1 2

0.00

6 2

0.07

6 2

0.37

2 2

0.46

8 2

0.76

8 2

1.06

2 2

1.18

5 2

1.31

1 2

1.41

6 2

1.51

3 2

1.67

1 21.

838

21.

972

22.

365

22.

535

22.

804

22.

933

23.

141

23.

308

23.

408

23.

590

23.

686

23.

892

24.

049

24.

199

24.

321

24.

423

24.

496

24.

603

24.

872

25.

151

25.

289

25.

545

25.

751

25.

975

26.

171

26.

272

26.

361

26.

480

26.

689

26.

913

27.

064

27.

247

27.

359

27.

465

27.

594

27.

895

28.

052

28.

228

28.

490

28.

659

28.

837

28.

941

29.

035

29.

131

29.

376

29.

609

29.

863

18:0 10 Me

17

Nomenklatura maščobnih kislin

• Maščobne kisline označujemo tako,

da najprej označimo skupno število ogljikovih atomov,

nato število dvojnih vezi,

mesto formiranja zadnje dvojne vezi gledano od metilne skupine

molekule označimo z ω,

• v primeru, ko gledamo od karboksilnega dela molekule označimo

mesto formiranja zadnje dvojne vezi z ∆.

18

Primer nomenklature maščobnih kislin

ime: 5,8,11,14,17-eicosapentaenojska kislina trivialno ime: EPAkratka oznaka: 20:5ω3

pomeni, da gre za 20-C maščobno kislino s 5 dvojnimi vezmi,

zadnja se začenja na poziciji 3 od metilnega dela,

ostale dvojne vezi so na mestih 5, 8, 11, 14, in 17

19

Nomenklatura maščobnih kislin

• predpona i in a označujeta izo in anzeizo maščobno kislino,

anteizo je razvejanje na tretjem ogljikovem atomu od konca verige

• -cy pomeni ciklopropansko maščobno kislino

• -Me pomeni metilno razvejanje iz karboksilnega dela verige

• okrajšave t pomeni trans konfiuracijo dvojne vezi

• okrajšave c pomeni cis konfiuracijo dvojne vezi

20

Primer nomenklature maščobnih kislin

• kratka oznaka: i16:0

maščobna kislina ima metilno skupino na prvem ogljikovem

atomu iz w konca

• kratka oznaka: 10Me16:0

maščobna kislina ima metilno razvejanje na 10 ogljikovem

atomu iz karboksilnega konca

21

Interpretacija

maščobne kisline mikrobna skupina

15:0i, 17:0i, 15:0a, G pozitivne bakterije

i15:0, i17:0, cy17:0, cy19:0 anaerobne G negativne bakterije

16:1ω8c, 16:1ω5c, 16:1ω8t, 18:1ω8c, 18:1ω8t, 18:1ω6c

metanotrofi

20:5, 22:6 barofili/psihrofili

cy17:0, cy19:0, 18:1∆11c G negativne bakterije

10 Me18:0, 10 Me17:0, 10 Me16:0 aktinomicete

18:2ω6,9, 18:1ω9c, 18:3ω6, 18:3ω3 glive

20:3ω6, 20:4ω6 protozoji

20:5ω3, 18:3ω3 alge

10Me16:0, i17:1ω7, i17:1ω6 sulfat reducirajoče bakterije

16:1ω5 arbuskularne mikorizne glive

18:2ω6 cijanobakterije

22

Interpretacija

• vsoto naslednjih maščobnih kislin lahko uporabimo za določanje

bakterijske biomase: i15:0, a15:0, i16:0, 16:1ω9, 16:1ω7t, i17:0,

a17:0, 17:0, cy17:0, 18:1ω7 in cy19:0

• naslednji dve maščobni kislini lahko uporabimo za določanje

biomase gliv 18:2ω6,9 in 18:1ω9c

• ciklopropilne maščobne kisline so značilne za stacionarno fazo, do

njihove produkcije pride pri stresnih pogojih (prekurzorja za cy17:0

in cy19:0 sta:16:1ω7c in 18:1ω7c)

23

Prednosti PLFA

• omogoča bolj natančno določanje žive biomase kot fumigacijske metode

• lahko detektiramo mikrobno strukturo v naravnih vzorcih

brez predhodnega gojenja

• uporabno za detekcijo sprememb strukture v različnih talnih,

vodnih in vzorcih iz sedimenta

• relativno enostavna omogoča veliko število vzorcev

24

Pomankljivosti PLFA

• ne omogoča določanje vrstne sestave

• arhej ne moremo določiti natančno

• ne more določiti maščobnih kislin v zelo nizkih koncentracijah,

ki pa lahko kljub temu predstavljajo pomembne skupine

• PLFA profilom ne moremo direktno vezati na funkcijo ekosistema

• podatkovna baza je vezana na maščobne profile

pridobljene iz bakterij v čistih kulturah

25

Proteinski vzorci

• elektroforetska primerjava proteinov neznanega izolata z

elektroforetskim profilom znanega mikroorganizma

• uporaba pulzne elektroforeze ali 2D elektroforeze

• za kompleksne okoljske vzorce manj primerno, ker zahteva gojitev

mikroorganizmov v čisti kulturi

26

Rezultati analize skupnih proteinov različnih sevov Lactococcusov in Lactobacillov

27

2D Gel elektroforeza - princip

SDSPAGE

IEF

pH

28

Identifikacija proteinov z MS in 2D gel

29

Mikrosekvenciranje

elektro-blotting

• generira sekvenco z N-terminalnega dela• uporabna za nizke koncentracije proteina (5-50 ng)• lahko preberemo do 20 aminokislin, kar omogoča ID proteinov• relativno počasna

30

Proteinski čipi (Protein Arrays)

razporeditev protiteles razporeditev antigenov razporediterv ligandov

Detekcija z: MS, fluorescenco, SPR, electrokemijsko, radioaktivnost

31

“Funkcionalni” proteinski čipi

Niklova prevleka

32

Imunološke metode za identifikacijo

Uporabljamo označeno protitelo, ki ga vežemo na mikrobni antigen.

Specifično vezavo protitelesa na antigen določimo z:

• imunofluorescenco

• radioimunskimi testi (RIA - radioimumunoassay)

• encimsko imunsko reakcijo (ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

• encimsko reakcijo kombinirano s fluorescenco (ELFA - Enzyme Linked

Fluorescence Assay)

• aglutinacijo

• imunomagnetno precipitacijo (IMS - Immuno Magnetic Separation)

33

ELISA

protein

E

S P

ELISA

protitelo z encimom

34

Metode za določanje strukture mikrobne družbe na

osnovi nukleinskih kislin

• sekvenciranje

• DNA – DNA hibridizacije

• PCR

• kloniranje

• metagenomika

35

Molekularne metodevzorec

ekstrakt DNA

PCR in kloniranje

knjižnica klonovsekvenciranje in ID

pregled klonov

individualni kloni

T-RFLP

PCR

restrikcija

profil združbe

dizajn in izbira ustreznih prob

FISH

mikroskopija

36

Molekularna identifikacija: sekvenciranje DNA

C G A C T C G A T T C 5’ DNA, ki jo sekvenciramo3’

radioaktivno označen začetnik

-AG-AGCTAAG

-A-AGCTA-AGCTAA

-AGCT -AGCddGTP ddATP ddTTP ddCTP

G A T C

avtomatsko sekvenciranje s fluorescenčno označenimi dideoksi nukleotidi

7654321

37

Molekularna identifikacija: GC deleži

Organizmi s podobnimi

fenotipi imajo podobna GC

razmerja. Po drugi strani

pa imajo organizmi lahko

podobne GC deleže,

vendar so taksonomsko in

filogenetsko različni.

38

Hibridizacija DNA

vrsta A vrsta B vrsta C

T T T C C G A AA G C A A T G C T C G T T A C G

A G T T T C A AT C

GT T A C G

Tarčna DNA in neznana DNA sta delno homologni in zato delno hibridizirata.

T C G T T A C G

Tarčna DNA in nznana DNA sta nehomologni in ne hibridizirata.

Tarčna DNA in označena neznana DNA sta homologni in zato dobro hibridizirata.

39

Molekularna identifikacija - restrikcijska analiza

vrsta A vrsta BDNADNA

Restrikcijsko analizo lahko naredimo za celoten genom (RFLP

makrorestrikcijska analiza), ali pa za izbrani gen (npr. ribotipizacija).

Predhodno lahko željeni del DNA namnožimo s PCR in tako dobimo

AFLP profil.

40

RAPD - PCR, (Random Amplification of Polymorphic DNA)

• uporabljamo za identifikacijo specifične variabilnosti med vrstami

• izbrane začetne oligonukleotide za amplifikacijo kromosomske DNA

uporabljamo pri manj strogih pogojih PCR namnoževanja (npr. nižje

temperature), kar omogoča vezavo tudi na nesorodno DNA

• zaradi variabilnosti DNA različnih organizmov

pride do različnega števila in velikosti PCR pomnožkov,

kar omogoča identifikacijo

41

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

• s PCR selektivno pomnožimo restrikcijske fragmente,

ki smo jih predhodno dobili z restrikcijskimi endonukleazami

• PCR pomnožke ločimo z gelsko elektroforezo

• AFLP ne zahteva predhodnega poznavanja specifičnih zaporedij DNA

in poteka z uporabo dveh specifičnih oligonukleotidnih začetnikov

• metoda je predvsem uporabna za tipizacijo

in preiskavo DNA različnega izvora

42

SSCP (single stranded conformationalpolymorphysm)

• PCR pomnožke segrejemo na 95 oC in jih nato zelo hitro ohladimo

• enovrvična DNA se zvije v 3D strukturo, ki je odvisna od baznih parov

• različne DNA imajo različne 3D strukture,

ki različno hitro potujejo na elektroforezi

• pri homolognih DNA fragmentih dobimo eno liso pri heterolognih

pa dve (občutljivost za mutacije, npr. insercije, delecije)

43

Heterodupleks analiza

• dva PCR pomnožka sta zmešana v enekih deležih in denaturirana

pri 95 oC

• mešanica se nato počasi ohladi

• med ohlajanjem pride do renaturacije in tvorbe heterodupleksov

• vsaka napaka pri nalaganju se bo poznala kot različna 3D

struktura in posledično različna mobilnost na elektroforezi

44

Molekularna identifikacija: ribotipizacija

• polimorfizem na celotnem genomu se velikokrat kaže tudi na

posameznih genih

• geni za ribosomsko RNA so običajno evolucijsko stabilni

in imajo zaradi tega bolj enostaven restrikcijski vzorec

• naredimo RFLP polimorfizem genov za rRNA

• po encimskem razrezu DNA identificiramo rDNA fragmente s Southeren

blot analizo

• primerjamo restrikcijske vzorce različnih organizmov

45

Molekularna identifikacija - FISH z ribosomsko tarčo

mikroskopija

Vezava označene probe naribosome tarčnega organizma

A T T C G A C

46

Sestava bakterijskega ribosoma

23S rRNA + 5S rRNA

50S

30S

16S rRNA

23S rRNA ~ 2900 nukleotidov

5S rRNA ~ 120 nukleotidov

16S rRNA ~ 1500 nukleotidov

47

Bakterijski ribosom

30S50S proteini

rRNA

48

16S rRNA

49

Določanje 16S rRNA sekvence

mikroorganizem

izolirana DNA

16S rRNA gen

PCRpomnoževanje

DNA

Sekvenciranje 16S rRNAPCR pomnožka

50

ekstrakcija DNA

Konstrukcija klonske knjižnice iz rDNA

kloniranje pomnoženih genov v E. coli

pomnožitev DNA s PCR

ekstrakcija individualnih DNA fragmentov in elektroforeza

sekvenciranje in identifikacija

.. ..

.

..

. ..gojitev E.coli, prenos na titrske plošče

51

Ločevanje PCR pomnožkov

Če želimo ločit PCR pomnožke 16S rRNA,

potem je navadna gelska elektroforeza nezadostna,

ker so vsi pomnožki približno enako veliki.

Alternative:

• ARDRA

• TRFLP

• ITS-RFLP

• DGGE

• TGGE

52

ARDRA-PCR 16S rDNA (amplified ribosomal DNA restriction analysis) Staphilococcov

53

Terminal Restriction Fragment Length

Polymorphism (T-RFLP)

Fluorescenčni primer

mesto, kjer reže encim

profil združbe

C A B E Dvrsta A

vrsta B

vrsta C

vrsta D

vrsta E

54

DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis)

• majhni DNA fragmenti potujejo pri elektroforezi skozi

poliakrilamidni gel v gradientu formamida ali urea

• DNA fragmenti se pri kritični koncentraciji denaturanta raztopijo

(iz dvojne vijačnice nastane enojna) pri tem se jim spremeni

struktura in se prenehajo gibati v električnem polju

• GC spona na enem koncu prepreči popolno razpiranje vijačnic

• zaradi razlik v sestavi DNA dobimo raztapljanje pri različnih

koncentracijah denaturanta

55

TGGE (temperature gradient gel electrophoresis)

• majhni DNA fragmenti potujejo pri elektroforezi skozi

poliakrilamidni gel v temperaturnem gradientu

• DNA fragmenti se pri kritični temperaturi raztopijo pri tem se jim

spremeni struktura in se prenehajo gibati v električnem polju

• GC spona na enem koncu prepreči popolno razpiranje vijačnic

• zaradi razlik v sestavi DNA dobimo raztapljanje pri različnih

temperaturah

• lahko uporabljamo tudi za analizo RNA in proteinov

56

ITS-RFLP (Intergenic spacer-restriction fragment

length polymorphism)

ITS2ITS1

začetni oligonukleotid v 18S

18S 5.8S 28S

začetni oligonukleotid v 28S

5.8S

PCR produkt

57

Metode za nukleinske kislinevzorec

ekstrakt DNA

PCR in kloniranje

knjižnica klonov

pregled klonov

sekvenciranje in IDdizajn prajmerjev za vrsto ali gen

Q-PCR

kventifikacija vrste ali gena

reverzna transkripcijaDNA

ekstrakt mRNA

kvantifikacija genske ekspresije

58

Kvantitativni real-time PCR

3’5’

5’3’

R Q

3’5’

5’3’

3’5’

5’3’

3’5’

5’3’

polimerizacija

RQ

ločevanje fluorescenčne probe

QRpolimerizacija komnčana

QRcepitev fluorescenčne probe

S cepitvijo fluorescenčne

probe se sprosti quenching

fluorofora, kar omogoča

povečan kvantni prinos

fluorescence.

59

DNA mikročipi za določanje strukture mikrobne združbe

• mikročip je sestavljen iz več različnih celotnih genomskih DNA

iz dobro okrakteriziranih referenčnih organizmov

ali pa iz okoljskih vzorcev

• dodamo izolirano DNA in ugotavljamo hibridizacijo z znanimi

vrstami, kar nam omogoča določitev strukture mikrobne združbe

• uporabni za nativne vzorce, za sledenje sprememb v združbi zaradi

polucije ali druge fizikalno-kemijske spremembe

60

2003 Metagenomika

• vzamemo okoljski vzorec

• pridobimo celotno DNA

• sekvenciramo DNA (shot gun tehnika)

• z matematičnimi algoritmi obdelamo dobljene sekvence

• preverimo kateri genomi in kateri geni so prisotni v vzorcu

61

Diverziteta ali podobnost mikroorganizmov, ki tvorijo mikrobno združbo

Katerakoli metoda,

ki nam omogoča kvantitativno razlikovanje med mikroorganizmi

je uporabna za izgradnjo statističnih sorodstvenih dreves

(npr. PLFA, 16s rRNA).

62

Evolucijske razdalje

Povprečno število različnih nukleotidov na 100 nukleotidov.

7.107.397.557.51E

3.042.982.98D

1.571.51C

1.45B

DCBA E

A 0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

A in B sta si najbližja, zato ju združimo A B

63

Evolucijske razlike

Povprečno število različnih nukleotidov na 100 nukleotidov.

7.107.397.53E

3.042.98D

1.54C

DCA-B

Primer izračuna razdalja od klade (A-B) do C = (A-C+B-C)/2 = (1.51+1.57)/2 = 1.54

Od vseh klonov je najbližje A-B kladi klon CA BC

64

Evolucijske razlike

Število različnih nukleotidov na 100 mest.

7.107.46E

3.00D

DA-B-C

A BCDEPrimer izračuna razdalja od klade (A-B-C) do D = (A-D+B-D+C-D)/3 = (2.98+2.98+3.04)/3 = 3.0

Od vseh klonov je najbližje kladi A-B-C klon D. Klada A-B-C je zelo blizu politomije, kjer ne moremo zanesljivo ločiti, katera vrsta se je evolucijsko prej ločila.