Studio SASdell’equilibrio monomero-dimero

della ß-lactoglobulina

Seminario XVIII Ciclo

Dottorato in Fisica-Universita’ di Perugia

Dottoranda: Maria Grazia Ortore

Tutore: Prof. Giuseppe Onori

Struttura delle proteine

sequenza funzionalità conformazione

La catena peptidica è costituita da 20 tipi di aminoacidi(a) Struttura primaria (b) Struttura secondaria

(c) Struttura terziaria (d) Struttura quaternaria

elica

foglietto

dominio

Protein Unfolding: perchè usare la pressione?

• 1895 Royer scoprì che un’elevata pressione idrostatica può inibire la crescita di batteri.

• 1899 Hite utilizza la pressione per la conservazione del latte.

• 1914 Bridgman nota che il bianco dell’uovo sembra cotto dopo un trattamento in pressione.

Benché non sia intuitivo, anche le proteine denaturano con la pressione. Questa modifica la compressibilità, il volume, la flessibilità e di conseguenza la funzionalità della proteina.

Trattamento termico

Agenti chimici denaturanti

Trattamento in pressione

le eccitazioni termiche modificano le interazioni si modifica la cinetica

a basse concentrazioni hanno un effetto indiretto modificando le caratteristiche del solvente ad alte concentrazioni possono rompere i ponti salini (acidi), i legami idrogeno e disolfuro (urea) modificano l’attività enzimatica

agisce fondamentalmente modificando i volumi

Panorama termodinamico

Capacità termica Cp = (H/T)p kT Cp = T<S-<S>>2

Fattore di compressibilità = -1/V(V/p)T kT V= <V-<V>>2

Fattore di espansione = -1/V(V/T)p kT V = <SV-<S><V>>2

P

T

S=0

V=0

Smeller (BBA 2002)

•Teoria di Hawley

G = GU-GN

G = G0– S0(T-T0) – Cp[(T-T0)+ln(T/T0)]+ V0(p-p0) + /2(p-p0)2 + (p-p0)(T-T0)

G=0

Quali tecniche usare?

Vantaggi del SAS:• perturbo poco il sistema• ottengo informazioni sia sulle caratteristiche strutturali, sia sulle interazioni in condizioni sperimentali molto diverse (pH, temperatura, pressione, forza ionica)

SANS o SAXS?

SANS SAXS

Densita’ di lunghezza di scattering isotopico b e magnetico B

Densita’ elettronica

Sorgenti dal flusso debole Alta brillanza delle sorgenti

0.210 Angstrom 0.52 Angstrom

Diversi segnali da H e da D Poca visibilita’ degli H

Bassa lunghezza di penetrazione all’interno del campione

Possibile danneggiamento del campione

• due monomeri costituiti ciascuno da 162 aminoacidi e di peso 18350 Da• appartiene alla famiglia delle lipocaline• è contenuta nel latte

-Lactoglobulina

funzionalità struttura

Interazioni proteina-proteina in soluzione

Aspetti energetici e geometrici del riconoscimento molecolare

• A temperatura ambiente e pH neutro la -Lg è un dimero (la carica teorica del monomero è –8).

• A pH acido (condizione fisiologica) si perde la struttura quaternaria, ma i monomeri conservano le proprie caratteristiche strutturali.

• A pH acido (pH=2.3) una forza ionica variabile è in grado di modificare l’equilibrio monomero-dimero. 21

. .2 i i

i

F I C Z

Curve SAXS per la -Lg a concentrazione 10mg/ml, pH=2.3 e forza ionica crescente.

F.I.=7mM Rg=17.9±0.3

F.I.=507mM Rg=20.7±0.3

Macromolecules (1999), 32, 6128-6138

Kratky plot di curve SAXS:

Beta-lactoglobulina 10mg/ml

pH=2.3

T=20°C

F.I.=7-507 mM

Frazione di monomeri di beta-lactoglobulina

A) in funzione della concentrazione C di proteina stessa (le bande sono ottenute dall’analisi dei coefficienti di diffusione, i punti da dati SAXS)

B) in funzione della forza ionica e a C=10mg/ml (le bande sono ottenute da dati SAXS, i punti dall’analisi dei coefficienti di diffusione)

Macromolecule (1999), 32, 6128-6138

Approccio teorico alla tecnica SAS:

• Consideriamo il solvente come un dielettrico continuo ed uniforme e utilizziamo un modello a due ‘macroioni’

• Assumiamo interazioni solo a simmetria sferica

Richiami alla teoria generale:

Sezione d’urto differenziale

Utilizzando un modello a due fasi:: contrasto elettronico

p:numero di specie di proteine

Vi , ni :volume e densità numero della specie iesima

Fi (Q) : fattore di forma

Sij (Q): fattore di struttura parziale

gij (r): funzione di distribuzione di coppia

gij (r)=exp(- Wij (r))

Wij (r): potenziale di forza media

( ) ( ) ( )ij ij ijW r u r r ( )iju r

( )ij r

interazione fra le specie i-j

interazione fra le specie i-j e le altre macroparticelle

in soluzione

( ) ( ) ( )HS Cij ij iju r u r u r

2 exp

( )1 1

D i ji jCij

D i D j

r R RZ Z eu r

rR R

Potenziale a sfere dure Potenziale Coulombiano

KD: lunghezza di schermo di Debye (dipende in maniera nota da forza ionica e controioni) : costante dielettrica del mezzo

Deve esserci un’interazione attrattiva responsabile dell’aggregazione dei monomeri in dimeri

dis el nelG G G

contributo non elettrostatico, parametro libero nell’analisi di best fit

Curve SAXS e relativi fit :Beta-lactoglobulina 10mg/ml

pH=2.3T=20°C

Funzioni di distribuzione di coppia risultanti dall’analisi delle curve SAXS.

A sinistra approssimazione ordine 0, a destra di ordine 1.

Puntini: monomero monomero, tratteggio: monomero dimero, linea: dimero dimero.Biophysical Journal (2002) , 82, 2165-2175

Ethylene Glycol: HOCH2CH2OH

Andamento della costante dielettrica in funzione della percentuale di glicol-etilenico in soluzione

Esperimenti preliminari

• pH=2.3

forza ionica: 0÷200 mM

glicol etilenico: 0÷50% w/w

T=10÷50°C

P=1÷1800 barAnalisi preliminare : approssimazione di Guinier

Valida per

con

Ad esempio per una sfera di raggio R :

2 2

2 2 31 0 0( ) ( )

gQ R

I Q A V e

1.3gQR

0

2 2

0

1g

V

R r drV

2 23

5gR R

~

A termocoppiaB cella a pressione dove arriva il fascioC sensori per la pressioneD valvola pneumatica che equilibra i due circuiti a pressioneE valvola a doppio braccioF pompa per generare alte pressioniG motore per la pompa

Cella a pressione ad Elettra (Trieste)

Studio in pressione in presenza di solvente organico

Esperimento in preparazione: SANS

LABORATOIRE LEON BRILLOUIN ,Saclay, France

Cella a pressione : 1÷7Kbar

Esperimenti futuri

• Verificare quanto sia significativo il parametro r utilizzando alcool in diversa percentuale come solventi;

• Analizzare il panorama sperimentale a pressioni piu’ elevate;

• Migliorare il metodo di analisi dati.