Syngene Transplantation regenerativer Fettgewebszellen nach experimentellem Schlaganfall in der spontanhypertensiven Ratte

Syngene Transplantation regenerativer Fettgewebszellen nach experimentellem Schlaganfall in der spontanhypertensiven Ratte

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Medizin (Dr. med.)

an der Medizinischen Fakultt

der Universitt Leipzig

eingereicht von: Sapida Safdari

Geboren am: 12.12.1983 in Kabul

angefertigt am: Institut fr klinische Immunologie, Universitt Leipzig

in Zusammenarbeit mit dem Fraunhofer Institut fr Zelltherapie und

Immunologie, Leipzig

Betreuer: Prof. Dr. med. Frank Emmrich

Beschluss ber die Verleihung des Doktorgrades vom: 23.09.2014

Fr meinen Vater Anwar

Inhaltsverzeichnis

Bibliografische BeschreibungI

AbbildungsverzeichnisII

TabellenverzeichnisIII

AbkrzungsverzeichnisIV

1. Einleitung1

1.1. Der Schlaganfall1

1.2. Stammzellen9

1.3. Adipose Tissue Derived Cells (ADC)13

1.4. STAIR-Kriterien14

1.5. Fragestellung der Dissertation15

2. Material und Methoden17

2.1. Materialliste17

2.2. Studiendesign20

2.3. Ein- und Ausschlusskriterien21

2.4. Versuchsablauf22

2.5. Versuchstiere22

2.6. Fettgewebsentnahme23

2.7. Isolation23

2.8. Schlaganfall27

2.9. Transplantation29

2.10.Verhaltenstests30

2.11. Magnetresonanztomographie33

2.12. Ttung und Perfusion36

2.13. Statistik36

3. Ergebnisse37

3.1. Pilotversuch der Zellisolierung37

3.2. Ausschlusskriterien und Auswirkungen auf die Versuchstierzahl39

3.3. Ergebnisse des experimentellen Schlaganfalles40

3.4. Zellisolierung41

3.5. Ergebnis der Transplantation42

3.6. Ergebnisse der Verhaltenstests43

3.7. Ergebnisse der MRT-Messungen46

4. Diskussion49

4.1. Methodendiskussion49

4.2. Therapeutische Wirksamkeit von ADC53

4.3. Studienqualitt57

4.4. Beantwortung der Fragen an die Arbeit58

4.5. Ausblick59

ZusammenfassungVI

LiteraturverzeichnisVIII

Erklrung auf die eigenstndige Abfassung der ArbeitXIII

LebenslaufXIV

DanksagungenXVI

Bibliografische Beschreibung

Safdari, Sapida

Syngene Transplantation regenerativer Fettgewebszellen nach experimentellem Schlaganfall in der spontanhypertensiven Ratte.

Universitt Leipzig, Dissertation zur Erlangung des Titels Doktor der Medizin

60 Seiten, 123 Literaturverweise, 19 Abbildungen, 14 Tabellen

Der Schlaganfall gehrt weltweit zu den hufigsten Todesursachen und ist die Hauptursache von Langzeitbehinderungen im Erwachsenenalter. Die derzeitige Behandlung des Apoplex besteht aus der Lysetherapie mit Alteplase. Diese ist jedoch nur zeitlich beschrnkt einsetzbar und birgt Risiken. Neue Behandlungsanstze zur Heilung des Schlaganfalles, wie zum Bespiel medikamentse Neuroprotektiva oder Zelltherapien, zeigten vielversprechende Ergebnisse in diversen, prklinischen Studien. Dennoch konnte sich bisher keines dieser Therapieverfahren in der Klinik durchsetzen. Die vorliegende Studie berprft die Wirksamkeit einer heterogenen Zellpopulation aus dem Fettgewebe spontanhypertensiver Ratten nach syngener Transplantation. Aufgrund der einfachen Zellgewinnung stellt das Fettgewebe eine neue, vielsprechende Alternative fr die Schlaganfalltherapie dar. In der aktuellen Studie wurden 64 spontanhypertensive Ratten in den Versuch eingeschlossen, von denen 32 Tiere einem experimentell ausgelsten Schlaganfall durch Okklusion der mittleren Zerebralarterie unterzogen worden sind. Zur funktionellen berwachung neurologischer Defizite wurden verschiedene Verhaltenstests durchgefhrt und die Tiere in einem Zeitraum von 86 Tagen beobachtet. Als bildgebende Diagnostik wurde die Magnetresonanztomographie eingesetzt. Sowohl in den Verhaltenstests als auch im MRT zeigte die heterogene Fettgewebspopulation keinen therapeutischen Effekt. Die Arbeit diskutiert mgliche Ursachen dieses Ergebnisses und geht dabei auf wesentliche pathophysiologische Aspekte des Schlaganfalls, auf die angewandte Methodik, sowie die Zellpopulation an sich detailliert ein.

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Pathophysiologische Vorgnge nach einem Schlaganfall3

Abbildung 2: Zeitlicher Verlauf der pathophysiologischen Vorgnge nach einem Apoplex6

Abbildung 3: Prinzip einer Stammzelle10

Abbildung 4: Pluripotente Stammzelle11

Abbildung 5: Versuchsablauf22

Abbildung 6: CFU-F-Kolonie26

Abbildung 7: Prinzip der MCAO29

Abbildung 8: Der Ladder Rung mit einer SHR33

Abbildung 9: MRT-Untersuchungen34

Abbildung 10: Auswertung der MRT-Befunde35

Abbildung 11: Ergebnisse der Zellzahl und Zellvitalitt im Pilotversuch37

Abbildung 12: CFU-F Anteil im Pilotversuch fr n=1038

Abbildung 13: Ergebnisse der ersten FACS- Analysen fr n=1039

Abbildung 14: Anteil der untersuchten Oberflchenmarker im Hauptversuch fr n=342

Abbildung 15: Ergebnisse des Beamwalks44

Abbildung 16: Ergebnisse des mNSS45

Abbildung 17: Ergebnisse des Ladder Rung-Tests46

Abbildung 18: Infarktorganisation im Zeitverlauf47

Abbildung 19: Hirndem (eSOE) und das dem-korrigierte Lsionsvolumen (eVLsion)47

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Ergebnisse der Interstroke-Studie aus dem Jahr 20101

Tabelle 2: Bisher eingesetzte Stammzellpopulationen13

Tabelle 3: bersicht der Materialien17

Tabelle 4: Oberflchenmarker26

Tabelle 5: Beamwalk-Test Kategorien30

Tabelle 6: Auswertungskriterien des mNSS31

Tabelle 7: Auswertungskriterien des Foot Fault Score32

Tabelle 8: Auswertungskriterien des Forepaw Digit Score33

Tabelle 9: Ergebnisse der FACS-Analysen im Pilotversuch38

Tabelle 10: Ausschlusskriterien fr den Versuch39

Tabelle 11: Zusammenfassung der physiologischen Parameter whrend der OP40

Tabelle 12: Ergebnisse der Zellzhlung bei der Isolierung im Hauptversuch41

Tabelle 13: Transplantationsdosis42

Tabelle 14: Infarktvolumina der Kontroll- und Therapietiere in mm47

Abkrzungsverzeichnis

Grad

CGrad Celsius

ADCAdipose Tissue-Derived Cells

ADRCAdipose Tissue-Derived Stem and Regenerative Cells

ASCAdult Stem Cells

AUC Area under the curve

BM MNCBone Marrow Derived Mononuclear Cells

BSA Bovines Serumalbumin

CBFCerebral Blood Flow

CD Cluster of Differentiation

CFU-FColony Forming Units for Fibroblasts

cmZentimeter

cm Quadratzentimeter

CO2 Kohlenstoffdioxid

DMEM Dulbeccos Modified Eagle Medium

DWIdiffusionsgewichtete Sequenz im MRT

EEGElektroenzephalografie

engl.englische Bezeichnung

ESCEmbryonic Stem Cells

FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

FKS Fetales Klberserum

FSCFetal Stem Cells

G-CSFGranulocyte-Colony Stimulating Factor

g Gramm

x g mittlere Erdschwerebeschleunigung

HGF Hepatocyte Growth Factor

HUCB MNC Human Umbilical Cord Blood Mononuclear Cells

i.v. intravenous

iPSCinduced Pluripotent Stem Cells

IGF1 Insulin-like Growth Factor 1

IL-1/-6 Interleukin 1/6

KG Krpergewicht

kg Kilogramm

MMPMatrixmetalloproteasen

MCAO Middle Cerebral Artery Occlusion

min Minute

ml Milliliter

mmMillimeter

mmKubikmillimeter

mMikrometer

mNSS modified Neurological Severity Score

MRT Magnetresonanztomographie

MSC Mesenchymal Stromal Cells

MW Mittelwert

PPilotversuch

PAR population attributable risk

PBS Phosphate Buffered Saline

PLA cellsProcessed Lipoaspirate Cells

rt-PA recombinant tissue-Plasminogen Activator

sSekunden

SHR spontanhypertensive Ratten

STAIR Stroke Treatment Academic and Industry Roundtable

T Tesla

TxTransplantation

T2 Bildgebungsmodus im MRT

TNF Tumornekrosefaktor

VVergleich aus anderen Rattenstmmen/Vorversuche

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

V

1. Einleitung1.1. Der Schlaganfall1.1.1 Ursache und Risikofaktoren des Schlaganfalls

Der Schlaganfall gehrt zu den weltweit hufigsten Todesursachen und ist die Hauptursache fr dauerhafte Behinderung im Erwachsenenalter. Die Inzidenz des Schlaganfalles nimmt mit hherem Lebensalter zu. Schtzungsweise 25% der ber 85-jhrigen erleiden einen ischmischen Insult. In 85% der Flle wird die Ischmie durch eine Unterversorgung des Gehirns mit Blut hervorgerufen (1-3). In 15% der Flle tritt eine zerebrale Blutung auf (4). Als Ursachen des ischmischen Schlaganfalls gelten zerebrale Makro- und Mikroangiopathien sowie kardiale und hmodynamische Erkrankungen. Der wichtigste Faktor ist hierbei die Arteriosklerose der hirnversorgenden Gefe. Sie fhrt durch die Ausbildung von Plaques zu Stenosen und Okklusionen. Hierbei ist meistens die Karotisgabel betroffen (4). Die Thrombembolie ist eine weitere Ursache des zerebrovaskulren Verschlusses. Sie kann unter anderem kardialen Ursprungs sein. Kardiale Hirnembolien treten hufig im Rahmen von Herzrhythmusstrungen oder Herzvitien auf. Weiterhin kann sich ein Schlaganfall als Komplikation von entzndlichen Erkrankungen, Autoimmunprozessen, wie zum Beispiel entzndlichen Darmerkrankungen, Vaskulitiden, Rheumatoider Arthritis oder einem Antiphospholipidsyndrom manifestieren (3). Zu den Risikofaktoren des Schlaganfalls zhlen unter anderem die arterielle Hypertonie, der Diabetes mellitus, das Rauchen und die a