Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata-B szint

Core modul 3.1/3

A zebrahalak jelentősége a kutatásban.

Szegedi Tudományegyetem ÁOK

Sebészeti Műtéttani Intézet

2017. december 06-december 15.Referencia szám: AA1.0/2015; AB1.0/2015

ELI, Sugárbiológiai Kutató csoport

2017-2018-I. szemeszter

A zebrahalak jelentősége a kutatásban.

Szabó Emília Rita

A zebradánió (Danio rerio) mint modellállat a kutatásban

• világszerte népszerű modell fajjá vált az orvos biológiai, toxikológiai, genetikai és tumorbiológiai kutatásokban

• Humán betegségek állati szervezeten történő modellezése

• első klónozott fajok közé tartozik

• kísérleti célból az űrbe is felvittek

• figyelemre méltó a regeneratív képességük• figyelemre méltó a regeneratív képességük

• génmódosítás, transzgenikus vonalak

• teljes genomja ismert

• az embriók használata kap egyre nagyobb figyelmet, mivel azok helyettesítő módszerként tekinthetők az állatkísérletekben

• a sejtvonalakkal végzett kísérletek egy adott sejttípusra vonatkoznak, és hiányzik a komplex organizmus sejt-közötti állománya, illetve a különböző szövetek, egymásra-hatásából, a szervek működéséből származó hatás

több végpont vizsgálata

2010/63 / EU európai parlamenti és tanácsi irányelv szerint:

• a korai élet-szakaszban a Zebradánió nem tartozik a védett kategóriába

• míg elúszásra (úszóhólyag levegővel még nem telítődik) és önálló táplálkozásra képtelenek (5 nap a megtermékenyítés után)

• A Zebradánió mint kutatási modell, népszerűsítése az 1980-as évben kezdődött, amikor Streisinger György és kollégái, az oregoni Egyetem munkatársai felismertek és közzétettek számos olyan tulajdonságát, melyek alapján e szervezet hatalmas potenciális lehetőségeket, nyújt a fejlődésbiológiai és genetikai kutatásokban

• ezt követően a zebrahal modellt, szinte minden tudományág széleskörűen alkalmazza

• biológiai és orvos-biológiai kutatásokban való alkalmazása kimagaslóan megnövekedett, nagyobb népszerűségnek örvend, mint bármely más gerinces modell

• a muslicákhoz és férgekhez hasonlóan egy újabb egyszerű modell szervezet, viszont ellentétben velük gerinces faj.

• van gerincük, agy és gerincvelő, valamint számos más szervekkel rendelkeznek, beleértve a szív, a máj és a hasnyálmirigy, a vesék, a csontok és a porcok, ezáltal jobban hasonlítanak az emberekre, és alkalmasabbak a perklinikai kutatásokra.

Zebradánió előnyei és hátrányai az egérrel szemben

Rend: Pontyalakúak (Cypriniformes)

Család: Pontyfélék (Cyprinidae)

Alcsalád: Danioninae

Nem: Danio

• trópusi, édesvízi hal

• Indiában őshonos: Banglades, Nepál, Burma, Gangesz régió

Származása, elterjedése

• Patakok, csatornák, árkok, tavak és lassan mozgó, állóvizek, rizsföldek

Faj: Danio rerio

The natural habitat of the zebrafish

Photo credit: R. Spence, University of St Andrews

Megjelenése, felépítése

• négy egységes, pigmentált, horizontális, kék csíkok megléte• oldalán, a test egész hosszán végighúzódnak és kiterjednek a farok úszó végéig

hím nőstény

nagyobb, fehéres hassal rajtuk ezüst csíkok figyelhetők meg, teltebb, színei kevésbé élénkek

karcsú, arany (narancssárga)csíkokkal a kék csíkok között

Általános jellemzői

• a teljesen kifejlett egyed 6 cm hosszúságura nőhet, élettartamuk mintegy 2-3 év, viszont ennek ellenére, ideális körülmények között való tartásuk során életkoruk kiterjedhet 5 évre

• az ivarérettkor elérésének hozzávetőleges ideje három hónap

• a hát olajbarna, az oldalak és a has alapszíne sárgásfehér

• törzsén a kopoltyúfedőtől a farokúszó végéig, négy sötét acélkék csík húzódik

• a hátuszó alapszíne sárgás barna, kék szegéllyel, valamint kívül fehérrel szegélyezett. A kopoltyúfedő kék-fehér foltokkal

• farok és a has úszói fátyolszerűen megnyúlhatnak, melyek akár a testhossz egyharmadát is kitehetik

• embriók, korai felnőtt egyedek optikailag átlátszóak

Előnyei

• kis méret: embriók ~ 1 mm, kifejlett egyedek ~ 6 cm

• könnyen tenyészthetőek laboratóriumban

• gyors fejlődés, bőséges szaporodás

• számos kulcsfontosságú génnel rendelkeznek, génállományuk feltűnően hasonlít az emberi génállományra- 70%

• embriógenezis genetikai manipuláció

Mikroinjektálás

• a fluorescens festéket termelő transzgénikus (ér és idegjelölt) típusok is ígéretesnek bizonyulnak, esetükben is könnyen detektálható egyes szervek fejlődése

endothelsejtek zölddel jelölve, eritrociták pirossal jelölve – konfokális mikroszkóp felvételtumor

• Genetikai manipulációk eredményeként egy fluoreszkáló fajtát (úgynevezett Glofish) is létrehoztak

• Specifikus gén kiütéssel létrehozták a transzparens ( nem csíkos) változatát is a zebradániónak, az úgynevezett Casper halat, (nevét a rajzfilmben szereplő szellem után kapta), ami megkönnyítette a tumorok viselkedésének, növekedésének napi megfigyelését, a testük teljes átlátszósága miatt.

Laboratóriumi tartásuk

• csoportos hal 20 literes akváriumokban legfeljebb 25 egyed tartható

• hőmérséklet a víz optimális hőmérséklete 28,5 ºC lehet, ha meghaladja ezt az értéket pl. 31 ºC, illetve 25 ºC alá csökken szaporodási zavarok állnak be

kísérlet eredményessége

• melegebb hőmérsékleten nagyobb a betegségek előfordulása ill. eltolódhat az állomány ivararányaaz állomány ivararánya

• a víz pH- értéke kiemelkedő 7-8 között

• a víz oldott iontartalma és összetétele mely befolyásolja a petefészek működését, ivarsejtek termelődését 500-700 µs között van, ezt az értéket nitrát és foszformentes tengeri só adagolásával érik el

• oxigénigény kevés adat, recirkulációs rendszer

Laboratóriumi tartásuk

Táplálkozás

• mindenevők, állati és növényi eleséget

• a tápok különféle húsokból, májból, ikrákból, rákokból, algákból, lisztekből készülnek, számos ásványi anyaggal és vitaminnal kiegészítve

• alkalmanként kiegészítő csemegeként tubifexet, szárított szúnyoglárvát adva a változatosság kedvéért ajánlott

• ez viszont kellő elővigyázatosság híján, alkalmat nyújt vírus, de • ez viszont kellő elővigyázatosság híján, alkalmat nyújt vírus, de főként parazitafertőzésre

• etetésenként csak annyi tápot szabad adni, amennyit a halak max.5 perc alatt maradéktalanul elfogyasztanak

• halivadékok táplálása apró szemcsés ivadéktáppal valamint keltetett artémiával (sórákkal) történik, melyet nagy előszeretettel fogyasztanak a kifejlett egyedek is

• egy-egy párzás alkalmával minden páros képes 200-300 megtermékenyített petét lerakni minden héten

• általában hetente egyszer, bőséges táplálkozás mellett kéthetente háromszor párzanak

Szaporodás

• 10-12 hetes korban már ivarérettek, de maximális embrió termelésre csak a 7-18 hónapos korban lehet számítani

Szaporodás• a halakat szaporítást megelőző napon délután szaporító edényekbe kell kiválogatni

• a kifejlett egyedek erősen ikrafalóak (fehérje pótlás miatt), ezért az ivató edénybe rácsos elem kerül, mely alá az ikrák letudnak süllyedni, de a felnőttek számára hozzáférhetetlenek

• edénybe a válaszfal, egyik oldalára 1-2 nőstényt, másik oldalára 2-3 hímet helyezünk

• ívás a kora reggeli órákban történik

Az embrió fejlődéseA zebradánió embriógenezisében 7 nagy periódust különíthetünk el:

1. zigóta periódus - 1 sejtes állapot

-az ikra megtermékenyülésétől számítjuk, az első sejtosztódás bekövetkezéséig

a zigóta körülbelül 0,7 mm átmérőjű

2. barázdálódás

- barázdálódás stádiuma alatt a blasztomérák (barázdálódó sejtek) első 6 osztódása következik 15 percenként

3. hólyagcsíra periódus

• ebben a periódusban a marginális blasztóma átalakul, az embrió elkezd midblaszt állapotba fejlődni. A mélyen fekvő sejtek erőteljes fekvő sejtek erőteljes osztódásba kezdenek, a balsztomert burkoló réteg egyrétegű epitheliális réteggé alakul. A mitózis hullámszerűen megy végbe.

4. gastruláció

A fejlődés szakaszán egyes területek átrendeződése következik be, sejtek vándorolnak, más területek növekedésnek indulnak. Kialakul a germ ring, amely övszerűen körbefogja az embriót.

5. Szegnemtáció

- során erős morfológiai változások indulnak meg. Megjelennek az ősszelvények, amiből kialakulnak az első szervkezdemények, és feltűnnek az első testrészek is. Megszűnik a farok egyoldalú növekedése. Innentől kezdve a többi testrész hosszanti növekedése együtt zajlik le a farok növekedésével.

6. pharyngula stádium Ez a periódus a zsigerívek kialakulásának stádiumát jelenti. Ez a halembrió fejlődésének 1/3- át öleli fel. A farok úszó növekedése tovább folytatódik, megjelennek a mellúszók, és az első pigment sejtek, megindul a vérkeringés.

A mozgás kezd rendezetté válni, vagyis megjelennek az első úszást imitáló mozgások. A mozgások. A szegmentációs periódusban a fej és a farki vég ventrális (hasi) oldala rásimul a szikre. Ebben a periódusban kezdetét veszi a kiegyenesedés.

7. kikelési periódus

Az embriók fejlődésének utolsó periódusa. Az embriók hosszanti növekedése a sejtek differenciálódása folytatódik, megjelennek a mellúszók sugarai, a bélrendszer, kopoltyúívek, valamint megindul az állkapocs fejlődése.

A zebradánió legfontosabb betegségei

• a pontyfélékre jellemző megbetegedéstípus megfigyelhető

• kizárólag zebradánió-specifikus vírust nem izoláltak eddig, a pisztrangokpancreasnecrosisát (IPN) és a pisztrángok vérképző szöveteinek elhalását (IHN) okozó vírusok szaporodnak zebradánió eredetű sejttenyészeteken, de a halakat nem betegítik meg

• a zebradánió két leggyakoribb betegsége a bársonykór és a haltuberkolózis (mycobacteriosis), ami az ember bőrére való ráterjedés lehetősége miatt fontos zoonozislehetősége miatt fontos zoonozis

Felhasználásuk

• az emlősökhöz hasonló reakciókat mutatnak, ezért alkalmasak például az öregedés folyamatainak vizsgálatára, tumor biológiával kapcsolatos kísérletekre, szervi rendellenességek genetikai hátterének értelmezésére, tanulmányozására

• humán tumorokból származó rákos sejtek Zebradánióba való átültetése során vizsgálható a tumor térfogatának növekedése, terjedése, kezelés –

• széles körben használják a fejlődésbiológiai kérdések megválaszolására, számos jelenlegi kutatás az emberi egészséget javító vizsgálatokra irányul

• gyógyszerek kifejlesztésében, különböző vegyszerek, kis és nagymolekulák szűrésére, tesztelésére

során vizsgálható a tumor térfogatának növekedése, terjedése, kezelés –rákkutatás

Melanoma LeukémiaHasnyálmirigy rákHepatocelluláris karcinómaVéralvadásErek kiakakulásaSzívelégtelenségVeleszületett szív és vese megbetegedésekAkut gyulladás

A zebradánió egyéb laboratóriumi felhasználása

Akut gyulladásRetina sérülésekFejlődési rendellenességekMezőgazdasági kutatásBiotechnológiai kutatásKörnyezetvédelmi kutatásToxikológia vizsgálatokFarmakológiai kutatásGenetikai módosításSugárbiológiai vizsgálatok

20x20 mező2 cm plexi lapAPPA

Sugárbiológia

- mivel a korai felnőtt egyedek optikailag átlátszóak, ez a jellegzetességük megkönnyíti a toxikus anyagok, illetve a vizsgálatok során kialakult, rendellenességek belső szervekre kifejtett hatásának közvetlen megfigyelését.

Ko

Commet assay

LD50 meghatározás, morfológiai rendellenessége detektálása

1,25 Gy

2 Gy

-ɣ H2AX festés- DNS szálltörés vizsgálat

- apoptózis vizsgálat

• Szövettani vizsgálatuk is kivitelezhető, viszont a parafinba ágyazásuk valamint a metszetek készítése nagy precízitást és odafigyelést igényel a kis és törékeny méretük miatt

Köszönöm a figyelmet!