ĐỘT BIẾN GEN BETA-GLOBIN

Ở BỆNH NHI BETA-THALASSEMIA

MIỀN BẮC VIỆT NAM

Nguyễn Hoàng Nam, Dương Bá Trực

Bệnh viện Nhi trung ương

HNNKTQ TpHCM 30/11-1/12-18

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

2

• Beta-thalassemia là bệnh di truyền phổ biến ở Việt Nam,

do giảm hay không tổng hợp được mạch beta globin của

Hb, do đột biến gen beta-globin.

• Nghiên cứu về đột biến gen beta-globin gây beta-

thalassemia giúp ích cho việc tư vấn di truyền, chẩn đoán

trước sinh.

• Mục tiêu nghiên cứu:

“ Nghiên cứu một số đặc điểm đột biến gen beta-globin ở

bệnh nhân beta-thalassemia phía bắc Việt Nam ”

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Đối tượng nghiên cứu

• 104 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chẩn đoán : 55 là beta-

thalassemia,

49 là beta-thalassemia / HbE vào Bệnh viện Nhi trung ương.

• Tuổi - Dưới 5 tuổi : 89 (85,6%), trong đó < 1 tuổi 50 (44,4%)

- Từ 5-10 tuổi : 12 (11,5%)

- Từ 10-15 tuổi : 3 ( 2,9%)

• Giới : Nam / Nữ : 59/45 (1,3/1)

• Dân tộc - Kinh : 71 (68,3%), - Ít người gồm Thái, Tày,

Mường, Nùng, Sán Dìu, Dao, Bố Y : 33 (31,7%).

• Địa phương : Hà Nội và 28 tỉnh thành miền bắc. 3

Phương pháp nghiên cứu

4

• Nghiên cứu tiến cứu, mô tả, phân tích, cắt ngang. bằng các kỹ thuật

lâm sàng và xét nghiệm, tại BVNTƯ

• Phát hiện đột biến gen tại Khoa Sinh học phân tử, BVNTƯ :

- Tách DNA từ máu ngoại biên với bộ kít QIA gen DNA của Đức.

- Sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR phát hiện 9 đột biến điểm

thường gặp ở Châu Á là CD41/42, CD17, IVS1-1, -28,

IVS2-654, CD71/72, IVS1-5, CD95, CD26 (HbE).

- Giải trình tự gen khi không thấy đột biến với Multiplex ARMS-PCR

- Sử dụng kỹ thuật GAP-PCR để phát hiện đột biến xóa đoạn nếu cần.

Sơ đồ quy trình phát hiện đột biến gen β-globin

Bệnh nhân β-thalassemia

Thu thập mẫu máu và tách DNA

Phát hiện đột biến gen bằng Multiplex PCRvà ARMS-PCR

Có đột biến gen Không thấy đột biến gen

Xác định kiểu gen đột biến: Dị hợp tử, đồng hợp tử

Giải trình tự gen

Có đột biến gen Phát hiện đột biến

xóa đoạn bằng

GAP- PCR

Một số đột biến gen -globin phát hiện bằng kỹ thuật ARMS

1 2 3 4 5 6 7 8

Panel 1: 1-6

1: Dị hợp tử -28

2: Dị hợp tử kép -28/71-72

3: Dị hợp tử Codon 17

4: Dị hợp tử Codon 43

5: Thang DNA 100 bp

6: Mẫu nội kiểm không DNA

Panel 2: 7-8

7: Di hợp tử IVS 2-654

8: Mẫu nội kiểm không DNA

Nội kiểm

-28

17

43

71-72

654

Nội kiểm

Phân tích đột biến gen theo chức năng và vị trí

ĐỘT BIẾN SAO MÃ (Kiểu hình β+- thalassemia)

- Vùng khởi động (promotor)

- Vị trị 5’UTR (5’ - Vùng không phiên mã)

ĐỘT BIẾN HOÀN THIỆN RNA (Kiểu hình β+ hay β0-thalassemia)

- Vị trí nối (splice junction)

- Vị trí nối đòng thuận (consensus splice site)

- Exon

- Intron

- Vị trí 3’UTR.

ĐỘT BIẾN DỊCH MÃ RNA (Kiểu hình β0-thalassemia)

- Codon khởi đầu (Initiation Codon)

- Codon vô nghĩa (Nonsense Codon)

- Dịch khung (Frameshift) 7

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

ĐỘT BIẾN GEN β-GLOBIN GÂY BETA-THALASSEMIA Đã phát hiện 208 alen đột biến gen ở 104 bệnh nhân β-thalasemia

Đột biến gen β – globin ởβ – thalassemia Kiểu hình

Số alen đột

biếnTỷ lệ %

CD 41/42 (-TCTT) β0 63 30,3

CD 17 (AA – TAG) β0 62 30,0

CD 26 (GAG – AAG) HbE 49 23,5

CD 71/72 (+ A) β0 10 4,8

IVS 2 -654 (C – T) β+ 6 2,9

- 28 (A – G) β+ 6 2,9

- 88 (C – T) β++ 3 1,4

CD95 (TAC – TAA) β0 2 1,0

IVS 1 – 1 (G – T) β0 2 1,0

IVS 1- 5 (G – C) β0 2 1,0

Các đột biến hiếm gặp β+ 3 1,4

c-140 (C – T) 1 0,5

c-441-c442 ins AC 1 0,5

2.3kb – deletion 1 0,5

Tổng 208 100

Các đột biến gen β -globin phát hiện ở 104 bệnh nhân

0

5

10

15

20

25

30

35

Đột biến gen

β – globinKinh Tày Thái

Khác(Mường,

Nùng, Sán

Dìu, Dao, Bổ

Y)n % n % n % n %

CD41/42 43 30,3 10 50 6 25 4 18,2

CD17 41 29,9 6 30 6 25 9 40,9

CD26 33 23,2 1 5 12 50 3 13,7

CD71/72 8 5,6 1 5 0 1 4,5

IVS 2-654 5 3,5 0 0 1 4,5

- 28 3 2,1 1 5 0 2 9,1

- 88 3 5,6 0 0 0

CD95 2 1,4 0 0 0

IVS 1-1 2 1,4 0 0 0

I VS 1-5 1 0,7 0 0 1 4,5

Đột biến hiếm gặp 1 0,7 1 5 0 1 4,5

Cộng 142 100 20 100 24 100 22 100

Phân bố đột biến gen beta-globin theo dân tộc

Tần số các đột biến gen beta-globin ở β-thalassemia tại Việt Nam

Đột biến

Miền Bắc

(Nghiên

cứu này)

Miền Bắc 2.000

[Filon,Trực, cs.]

Miền Trung 2013

[Triết LPM.]

Miền Nam 2002

[Saovaros,và cs.]

Miền Nam 1988

[Hảo LT. vàcs.]

CD41/42CD17CD26 CD71/72 IVS 2-654 -28-88CD95IVS 1-1IVS 1-5c-140c441-c442 ins AC2.3 kb deletion Khác

30,3%30,0%23,5%4,8%2,9%2,9%1,4%1,0%1,0%1,0%0,5%0,5%0,5%

-

34,5%48,3%

-3,5%

13,8%

--------

+++-----+-----

35,7%25%

-7,3%7,3%7,3--

6,0%----

11,8%

43.5%13.0%

-8.7%

13.0%---

4.4%----

17.4%

Phân bố đột biến gen β– thalassemia phổ biến ở Châu Á

*Việt Nam [Nghiên cứu này] *Các nước khác [Southat F.2011]

Nhận xét: Các đột biến phổ biến ở Việt Nam khá giống với Trung

Quốc,Thái Lan: giống một phần với Myanma, Indonesia,

Malaysia.

Tần xuất đột biến Beta Thalassemia phổ biến ở các nước châu âu và địa trung hải

Quốc gia Đột biến Quốc gia Đột biến

Pháp

CD39 C – T 41,90%

Italia

CD39 C – T 41,00%

IVS 1-110 G – A 25,70% IVS 1-110 G – A 23,50%

IVS 1-1 G – A 10,50% IVS 1-6 T – C 10,10%

IVS 1-6 T – C 8,60% IVS 1-1 G – A 10,10%

Tây Ban Nha

CD39 C – T 50,00%

Hy Lạp

IVS 1-110 G – A 43,10%

IVS 1-110 G – A 16,50% CD39 C – T 20,90%

IVS 1-6 T – G 12,60% IVS 1-1 G – A 13,50%

IVS 1-1 G – A 11,50% IVS 1-6 T – C 8,60%

Bồ Đào Nha

CD39 C – T 37,30%

Cyprus

IVS 1-110 G – A 78,40%

IVS 1-1 G – A 21,00% IVS 1-6 T – C 6,40%

IVS 1-1 T – C 19,00% IVS 2-745 C – G 5,70%

IVS 1-110 G – A 11,50% CD39 C – T

Vương Quốc

Anh

CD39 C – T 34,80%

Sardinia

CD39 C – T 95,70%

CD 121 G – A 13,00% CD6 – A

IVS 1-1 G – A 8,70% IVS 2-745 C – G

CD5 – CT 8,70%

Exon 1 (30%)

Exon 2(59,6%)

Intron 1 (1,9%)

Intron 2 (2,9%)

Vùng khởi động (4,3%)

Đột biến khác (1,4%)

Phân bố đột biến gen β -globin theo vị trí

Chức năng gen Số lượng Tỷ lệ %

ĐỘT BIẾN SAO MÃ (Kiểu hình β+ thalassemia) 9 4,3

- Yếu tố điều hòa khởi động

- 28 (A – G)

- 88 (C – T)

ĐỘT BIẾN HOÀN THIỆN RNA(Kiểuhình β0hay β+thal) 10 4,8

- Vị trí đầu kết nối IVS 1-1 (G – T)

IVS 1-5 (G – C)

IVS 2-654 (C – T)

ĐỘT BIẾN DỊCH MÃ RNA (Kiểu hình β0 thalassemia) 186 89,4-Codon vô nghĩa CD17 (AAG – TAG)

CD26 (GAG – AAG)

CD95 (TAC – TAA)

-Dịch khung CD 41/42 (- TTCT)

CD71/72 (+A)

Đột biến ít gặp khác 3 1,4

Cộng 208 100

Phân bố các đột biến gen β-globin ở theo chức năng gen

Phân bố đột biến theo kiểu genKiểugen

Kiểu phối hợp

đột biến

Sốbệnh nhân

Tỷ lệ%

β0β0

Đồng hợp tửCD41/42 - CD41/42

CD17 - CD17

4017

9

8

38,46

8,7

7,7

Dị hợp tử kép

CD41/42 - CD17

CD17 - CD71/72

CD41/42 - CD71/72

CD41/42 - CD95

CD41/42 - IVS1.5

23

15

3

3

1

1

14,4

2,9

2,9

0,96

0,96

β+β+ Dị hợp tử kép

IVS2.654 - 2,3kb del1

1

0,96

0,96

Phân bố đột biến theo kiểu gen (tiếp)

Kiểugen

Kiểu phối hợp

đột biến

Sốbệnh nhân

Tỷ lệ%

β0β+ Đị hợp tử kép-28 - CD17

-28 - CD41/42

-88-CD41/42

CD17 - IVS2.654

CD41/42 - IVS2.654

CD71/72 - IVS2.654

IVS1.1 - IVS2.654

-140 - CD17

CD17- c441.c442 ins A

143

2

2

2

1

1

1

1

1

13,462,9

1,9

1,9

1,9

0,96

0,96

0,96

0,96

0,96

‘

Phân bố đột biến theo kiểu gen (tiếp)

Kiểugen

Kiểu phối hợp

đột biến

Sốbệnh nhân

Tỷ lệ%

β0βE Dị hợp tử phối hợp HbECD17 -CD26

CD41/42 - CD26CD71/72 - CD26

IVS1.1 - CD26IVS1.5 - CD26CD95 - CD26

47

21

20

3

1

1

1

45,20

21,2

19,2

2,9

0,96

0,96

0,96

β+βE Dị hợp tử phốihợp HbE-28 - CD26

-88 - CD26

2

1

1

1,920,96

0,96

KẾT LUẬN

• Đã phát hiện 208 alen đột biến ở 104 bệnh nhân, với 13 dạng :

- 4 đột biến phổ biến là CD41/42, CD17, CD26, và

CD71/72 với tỷ lệ 30,3%, 30%, 23,5% và 4,8%;

- 6 đột biến ít phổ biến là :

-28, IVS2-654, -88, CD95, IVS1-1, IVS1-5;

- 3 đột biến hiếm là:

-140, c441-c442 ins AC , và 2,3kb deletion.

• Không khác biệt nhiều về đột biến giữa các dân tộc, chỉ thấy CD26 gặp

nhiều ở người Thái hơn Kinh và Tày. CD41/42 gặp nhiều ở Tày hơn

Kinh

19

Các đột biến gen beta-globin đã phát hiện :

Đặc điểm đột biến gen beta-globin ở Việt Nam :

• Đột biến ở quá trình dịch mã RNA (80,4%) nhiều hơn hoàn thiện RNA

và sao mã; nhiều ở exon (89,6%), ít hơn ở intron và vùng khởi động.

• Đa số đột biến có kiểu hình β0 (68%), βE (23,5%), đột biến β+ ít

• Đã phát hiện 25 kiểu phối hợp đột biến, 5 kiểu phối hợp phổ biến :

CD17-CD26, CD41/42-CD26, CD41/42-CD17, CD41/42-CD41/42,

CD17-CD17. Kiểu gen β0 βE phổ biến nhất (45,3%), tiếp theo β0 β0

(38,4%), β0 β+ (13,4%), β+ βE (1,92%), cuối cùng là β+ β+ (0,96%).

Từ đó có thể kết luận :

Phần lớn β-thalassemia ở Việt Nam là β0-thalassemia

20

Trân trọng cảm ơn