UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA

ANLISIS, INHIBICIN E INGESTA DE NUEVOS CONTAMINANTES QUMICOS DE PROCESADO EN ALIMENTOS

TESIS DOCTORAL DE: GEMA ARRIBAS LORENZO

BAJO LA DIRECCIN DE: FRANCISCO JOS MORALES NAVAS

Madrid, 2013

Gema Arribas Lorenzo, 2008

UNIVERSIDADCOMPLUTENSEDEMADRID

FACULTADDECIENCIASQUMICASDepartamentodeQumicaAnaltica

ANLISIS,INHIBICINEINGESTADENUEVOSCONTAMINANTESQUMICOSDEPROCESADOEN

ALIMENTOS

MEMORIAPARAOPTARALGRADODEDOCTOR

PRESENTADAPOR

GemaArribasLorenzo

Bajoladireccindeldoctor

FranciscoJosMoralesNavas

Madrid,2013

UniversidadComplutensedeMadridFacultaddeCienciasQumicas

DepartamentodeQumicaAnaltica

TesisDoctoral

...

ANLISIS,INHIBICINEINGESTADENUEVOSCONTAMINANTESQUMICOSDEPROCESADOENALIMENTOS

.......

GemaArribasLorenzo

Madrid,2013

....... Dirigidapor:

Dr.FranciscoJosMoralesNavasRealizadaen:

InstitutodeCienciayTecnologadeAlimentosyNutricin(ICTAN),CSIC

Encolaboracincon:LaboratoriodeSaludPblicadeMadrid

.......

INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS Y NUTRICION (ICTAN)

SEDE CIUDAD UNIVERSITARIA: C/ JOS ANTONIO NOVIS, 10 CIUDAD UNIVERSITARIA 28040 MADRID, ESPAA TELS.: 91 544 56 07 91 549 23 00 FAX: 91 549 36 27

SEDE JUAN DE LA CIERVA: C/JUAN DE LA CIERVA, 3 28006 MADRID, ESPAA TELS.: 91 562 29 00 FAX: 91 564 48 53

Dr. Francisco Jos Morales Navas, Investigador Cientfico del Departamento de

Caracterizacin, Calidad y Seguridad del Instituto de Ciencia y Tecnologa de Alimentos y

Nutricin(ICTAN)delaAgenciaEstatalConsejoSuperiordeInvestigacionesCientficas(CSIC)

HACECONSTAR:queelpresentetrabajodeinvestigacintituladoAnlisis,InhibicineIngesta

de Nuevos Contaminantes Qumicos de Procesado en Alimentos ha sido realizado por la

Licenciada enQumica DGema Arribas Lorenzo en este Departamento bajomi direccin,

constituyendolaTesisDoctoraldesuautora.

Madrid,a4defebrerode2013

Fdo.:Dr.FranciscoJosMoralesNavas

...

EstatesisdoctoralhasidorealizadagraciasaunabecapredoctoraldeFormacindelPersonal

Investigador(FPI)concedidaporlaConserjeradeEducacindelaComunidaddeMadridycon

laparticipacindelFondoSocialEuropeo(F.S.E.).

Diversasactividades recogidasenestamemoriahanestado financiadas totaloparcialmente

porlossiguientesproyectos/contratosdeinvestigacin:

ProyectodeExcelenciaCientficade laComunidaddeMadrid.NuevasmetodologasparaelestudioycontroldelaseguridadylacalidaddelosalimentosANALISYC,2005

2009.(S0505/AGR0312).

ProyectodelMinisteriodeEducacinyCiencia.Presenciadenuevoscontaminantesqumicosdeprocesadoenalimentos,20062007,(AGL200626025E/ALI).

ProyectointramuralCSIC.Evaluacinriesgobeneficiodenuevassustanciasduranteelhorneadodecereales,20092011,CSIC(2004470E611).

ProyectoEuropeo6PM.Impedingneoformedcontaminantsaccumulationtoreducetheirhealtheffects(ICARE),20062009,(COLLCT2005516415).

ProyectoEuropeo6PMdeAccionesConcertadas.Thermallyprocessedfoods:possiblehealthimplications,20042009,COST927,EuropeanScienceFoundation(ESF).

Amifamilia

AJosLuis

Agradecimientos

El presente trabajo ha sido realizado en el departamento de Caracterizacin, Calidad y

Seguridad del Instituto de Ciencia y Tecnologa de Alimentos y Nutricin (CSIC) bajo la

direccindelDr. Francisco J.MoralesNavas al cualquiero expresarmi agradecimientopor

habermebrindadolaoportunidaddetrabajaryaprenderensugrupodeinvestigacin,porsu

orientacin, apoyo ydedicacin.Migratitudporayudarmeenmi crecimientoprofesional y

personal.

Graciasatodas laspersonasdelgrupode investigacincon losquehetenido laoportunidad

decoincidira lo largode todosestosaos,Lola,Silvia, JosA.,Cristina,Saray, Juliaporel

buenambientedetrabajo.Hasidounplacertrabajaravuestrolado.

AlInstitutodeCienciayTecnologadeAlimentosyNutricin,porlasfacilidadesprestadas.Ya

todo el personal que de una forma u otra han contribuido directa o indirectamente a la

realizacindeestetrabajo.GraciasespecialesaMiguelA.Martnez,porsubuenadisposicina

compartirlosconocimientosdelespectrmetrodemasas(ydecualquierotrotema).

Me gustaradar las gracias alProfesorVincenzo Fogliano y a todos los componentesde su

laboratorio,poreltiempoylaayudaprestada.

Al Laboratorio de Salud Pblica de Madrid. Todo el Captulo 5 se ha realizado en sus

instalaciones. Gracias en particular a Emiliano, Pilar y Alberto, por el buen trato que he

recibido,siemprehanestadodispuestosaayudarmeen todo loposible.Megustaradar las

gracias especialmente a Justina y a Julia.A Justina,por tomarse el tiemponecesario y leer

detenidamenteestetrabajo,localizandoerroresquemehabanpasadodesapercibidos.AJulia,

porayudarmeaentendermismaraas intelectualescon losclculosyporserunamagnfica

profesoradel tripleQ.A lasdos, graciaspor todo loquehabishechopormi en los aos

transcurridos desde que tuve la suerte de encontraros. Gracias tambin a Montse, por

regaarmeparaquemepusieracon latesisyaJavi.Atodasycadaunade laspersonasdel

Laboratorio,gracias.

Amis compaerosdel Instituto, losqueanestnporally losqueno,MCarmen, Luca,

Begoa,AnaGranado,LauraOtero,Ayln,SaraB.,porcompartirconmigovuestrotiempo.Y

enespecialaPaquitayaPilar,mesientoafortunadadeteneroscomoamiga,milgraciaspor

todovuestroapoyoycreerenm.

Amisamigasdelcole,Ele,Martn,SoniyTrichi.Estetrabajotambinoslodeboavosotras,ya

que esosmomentos que hemos pasado juntasme han dado aire para continuar y tener

siemprepresenteelAdelante,siempreAdelante!.Graciaschicas!.

Graciastambinamisamigasdelafacultad,Ire,Paty,IsayMer,porestarsiempreamilado.

Finalmente,amispadres,hermano,abuelosytito,cadaunode loscualesmerecensolouna

tesisdeagradecimiento,porquesinvuestrocario,apoyoysacrificiodiariosyonuncahubiera

llegadohastaaqu.

Y, a quienme hace feliz cada da, Jos Luis, por ayudarme con la tesis, por escucharme,

animarmeytenerpaciencia.Tequiero.

ABREVIATURASADN cidodesoxirribonucleicoAESAN AgenciaEspaoladeSeguridadAlimentariayNutricinAGEs ProductosavanzadosdeglicacinALEs ProductosavanzadosdelipoxidacinAPCI IonizacinqumicaapresinatmosfricaARN cidoribonucleicoAsn AsparaginaBHT ButilhidroxitoluenoCIAA ConfederacindeIndustriasAlimentariasdelaUE,actualmenteFood

andDrinksEuropeCYP2E1 CitocromoP4502E1monooxigenasaDAD DetectordediodosDGSANCO DireccinGeneraldeSaludyConsumidoresdelaComisinEuropea2,4DNPH 2,4DinitrofenilhidracinaECD DetectordecapturaelectrnicaEFSA AgenciaEuropeadeSeguridadAlimentariaEH HidrolasaepxidoENAC EntidadNacionaldeAcreditacinESI IonizacinporelectrosprayFA cido2furoicoFAO Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la

AlimentacinFAPAS FoodAnalysisPerformanceAssessmentSchemeFDA AgenciadeAlimentosyMedicamentosFDCA cido2,5furandicarboxlicoFFQ CuestionariosdefrecuenciadeconsumodealimentosFURF FurfuralGC CromatografadegasesGCMS CromatografadegasesacopladaaespectrometrademasasGlu GlucosaGSH GlutatinHMF HidroximetilfurfuralHMFA cido5hidroximetil2furoicoHMFG N(5hidroximetil2furoil)glicinaHPLC CromatografalquidadealtaeficaciaHRTOF AnalizadordemasasdealtaresolucintiempodevueloIARC AgenciaInternacionaldeInvestigacinsobreelCncerICTAN InstitutodeCienciayTecnologadeAlimentosyNutricinIR InfrarrojoIRMM InstitutodeReferenciadeMaterialesyMedidasJECFA ComitMixtoFAO/OMSdeExpertosenAditivosAlimentariosJIFSAN InstitutoMixtodeInocuidaddelosAlimentosyNutricinAplicadaLC CromatografadelquidosLCMS CromatografadelquidosacopladaaespectrometrademasasLOD LmitededeteccinLOQ LmitedecuantificacinLSP LaboratoriodeSaludPblicadeMadrid

MAPA Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin, actualmenteMinisteriodeAgricultura,AlimentacinyMedioAmbiente(MAAM)

3MCPD 3Monocloropropano1,2diolMOE MargendeexposicinMRC MaterialesdereferenciacertificadosMRM MonitorizacindereaccionesmltiplesMS EspectrometrademasasMS/MS EspectrometrademasasentndemMSPD Dispersinenmatrizenfaseslidam/z masa/cargaN3GAAde N3(2carbamoil2hidroxiethil)adeninaN7GAGua N7(2carbamoil2hidroxietil)guaninaOPD OrtofenilendiaminaOMS OrganizacinMundialdelaSaludp.f. PuntodefusinPRM ProductosdelareaccindeMaillardQToF Cuadrupolodetiempodevuelo%R Recuperacin(%)RM ReaccindeMaillardRMN ResonanciamagnticanuclearRSD DesviacinestndarrelativaSCI ScienceCitationIndexS/N Seal/ruidoSIM MonitorizacindeionesseleccionadosSMF 5SulfoximetilfurfuralSPE ExtraccinenfaseslidaSPME MicroextraccinenfaseslidaSRM MonitorizacindereaccionesseleccionadasSULT SulfotransferasasTOFMS AnalizadordetiempodevueloacopladoaespectrometrademasasUE UninEuropeaUV UltravioletaVIS Visible

NDICE

I.OBJETIVOS

II.ESTRUCTURADELAMEMORIASUMMARY

III.INTRODUCCIN

A.Introduccingeneral

B.ReaccindeMaillardenalimentos1.Aspectosgenerales2.QumicadelareaccindeMaillard3.Compuestos1,2dicarbonlicos4.ConsecuenciasdelareaccindeMaillard

4.1.Aspectostecnolgicos4.2.Aspectosnutricionales

C.Contaminantesqumicosdeprocesadoenalimentos

1.Hidrocarburosaromticospolicclicos2.Cloropropanolesyclorosteres3.Aminasheterocclicas4.Furano5.Hidroximetilfurfuralyacrilamida

D.NuevosContaminantesqumicosdeprocesadoenalimentos1.Hidroximetilfurfural

1.1.Toxicologa1.1.1.Metabolismo1.1.2.Toxicidad1.1.3.Evaluacinderiesgos

1.2.Mecanismosdeformacin1.2.1.ReaccindeMaillard1.2.2.Caramelizacin

1.3.Mtodosanalticos1.4.Nivelesenalimentos1.5.Estimacindeingesta1.6.Estrategiasdemitigacin

1.6.1.Seleccindemateriaprima1.6.6.Seleccindevariablesdeprocesado1.6.3.Eliminacintraselprocesado

2.Acrilamida2.1.Historia2.2.Toxicologa

2.2.1.Absorcin,distribucin,metabolismoyexcrecin

1

5

11

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18181821232324

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3232323233353535363739414142424344444545

2.2.2.Toxicidad2.3.Actividadesenmateriaderegulacin

2.3.1.Actividadesdeseguimientodenivelesdeacrilamida2.3.2.CajadeherramientasdelaCIAA2.3.3.ProyectoHEATOX2.3.4.Valorseal2.3.5.Organismosinternacionalesyotros

2.4.Mecanismosdeformacin2.4.1.ReaccindeMaillard2.4.2.Rutasalternativas

2.5.Mtodosanalticos 2.5.1.Extraccinypurificacin2.5.2.Cromatografadegasesespectrometrademasas2.6.3.Cromatografadelquidosespectrometrademasas2.5.4.Otrosmtodosanalticos2.5.5.Materialesdereferenciacertificados

2.6.Efectodelatecnologadelprocesado2.6.1.Influenciadelamateriaprima2.6.2.Procesodefritura2.6.3.Procesodehorneado2.6.4.Procesodetostado

2.7.Cinticadeformacineliminacin2.8.Estrategiasdemitigacin

2.8.1.Precursores2.8.2.Condiciones/mtodosdeprocesado2.8.3.Composicin

2.9.Nivelesenalimentos

IV.PARTEEXPERIMENTAL

Captulo1.Estudiossobrelainfluenciadelosconstituyentesdelalimentoylascondicionesdeprocesado

1.1. Contenidodeacrilamidaenalimentosespaoles:estudioenproductosdegalleteraypanadera.Efectodelacomposicindelalimento.

1.2. Influencia del proceso de fritura en la formacin de acrilamida ehidroximetilfurfuralenmasasfritas.

1.3. Efectodeloscompuestosfenlicosydelgradodeoxidacindelaceiteensistemasmodelodegalleta.

Captulo2.Desarrollodeunmtodoanalticopara ladeterminacindeglioxal y metilglioxal en galletas. Estudios sobre la influencia decompuestos dicarbonlicos en la formacin de acrilamida ehidroximetilfurfural

2.1. Anlisis,distribucinyexposicindietticadeglioxalymetilglioxalengalletas.

475656575858586060636565666768757575777880818383848590

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Captulo3.Estudiosdeinhibicin

3.1. Efectodelapiridoxaminaenlaformacindeacrilamidaenunsistemamodeloglucosaasparaginadebajahumedad.

3.2. Mecanismodeaccindelefecto inhibidorde lapiridoxaminasobre laformacindeacrilamida.

3.3. Aislamiento y caracterizacin estructural de los aductos acrilamidapiridoxamina.

Captulo4.Estudiosdeestimacindeingesta

4.1. Contribucindelaspatatasfritasdeaperitivoalaexposicindietticaaacrilamidaenlapoblacinespaola.

4.2. Estimacin de la ingesta en la poblacin espaola dehidroximetilfurfural,ysustanciasrelacionadas,apartirdelcaf.

Captulo 5. Puesta a punto, validacin y acreditacin (norma UNE ENISO/IEC 17025) de un mtodo analtico para la determinacin deacrilamidaenalimentos

5.1. Objetivo5.2. Introduccin

5.2.1.NormaInternacionalUNEENISO/IEC170255.2.2.Validacindelmtodoanaltico

5.3. Parteexperimental5.3.1.Optimizacindelmtodoanaltico5.3.2.Optimizacindelosparmetrosdelespectrmetrodemasas5.3.3.Optimizacindelaseparacincromatogrfica5.3.4.Metodologa5.3.5.Validacindelmtodoanaltico5.3.6.Muestrasreales5.3.7.Ensayosdeaptitud

5.4. Acreditacin

V.DISCUSININTEGRADORA

Captulo1.Estudiossobrelainfluenciadelosconstituyentesdelalimentoylascondicionesdeprocesado

Captulo2.Desarrollodeunmtodoanalticopara ladeterminacindeglioxal y metilglioxal en galletas. Estudios sobre la influencia decompuestos dicarbonlicos en la formacin de acrilamida ehidroximetilfurfuralCaptulo3.Estudiosdeinhibicin

Captulo4.Estudiosdeestimacindeingesta

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166

Captulo 5. Puesta a punto, validacin y acreditacin (norma UNE ENISO/IEC 17025) de un mtodo analtico para la determinacin deacrilamidaenalimentos

VI.CONCLUSIONES

VII.ANEXOSAnexoI.EjerciciosdeintercomparacinAnexoII.Publicacionesrelacionadas

VIII.BIBLIOGRAFA

172

173

177

179181

191

I.Objetivos

ANLISIS,INHIBICINEINGESTADENUEVOSCONTAMINANTESQUMICOSDEPROCESADOENALIMENTOS..........

Objetivos//3

Lasconsecuenciasdirectasde laaplicacindel tratamiento trmicosobre losalimentosson,

porunaparte,lasrelativasalosaspectosbsicosdehigienizacinyprolongacindelavidatil

de losmismos, y por otra, la induccin de una serie demodificaciones fsicoqumicas que

ofrezcan al consumidor un productoms agradable. Sin embargo, las reacciones entre los

constituyentesdelalimentopuedendanlugaraunaseriedenuevoscompuestosque,noslo

tienen implicacionesenelaroma, saborycolor, sinoque tambinposeenunadeterminada

actividadbiolgica. Los compuestos generados trasunprocesado trmico, esdecir,queno

estabanpresentesenlamateriaprimaoriginal,yquepuedensuponerunriesgopotencialpara

lasalud,sedenominancontaminantesqumicosdeprocesado.

En los ltimos aos, dos nuevos contaminantes qumicos de procesado, acrilamida e

hidroximetilfurfural(HMF),handespertadoungranintersenlacomunidadcientficadebidoa

sus efectos toxicolgicos. Desde el descubrimiento en abril de 2002, de la presencia de

acrilamidaendiversos alimentos ricosenhidratosde carbonode alto consumoen ladieta

occidental, se han llevado a cabo diferentes estudios con el fin de mitigar su formacin

durante el procesado. Por tanto, profundizar en el conocimiento de las variables y/o

precursores,as comoenel controlde losparmetros tecnolgicosde losprocesos, resulta

imprescindibleparaconocer losmecanismos implicadosensuformacinyparaofrecerbase

cientficaslidatantoalsectorempresarialcomoalasAgenciasdeSeguridadAlimentaria.

AlserconsideradostantolaacrilamidacomoelHMFcomounriesgopotencialparalasalud,y

debidoa la faltadedatosexistentesen labibliografasobresuexposicin,resultanecesario

realizarestudiosdeestimacindeingestaenlapoblacin.Estosestudiosirnenfocadoshacia

losalimentosque contribuyendemanera significativaen ladietaespaolaa suexposicin,

comosonlaspatatasfritasenelcasodelaacrilamida,yelcafenelcasodelHMF.

EstaTesistienecomoobjetivogeneral:

...

Elestudiode loscontaminantesqumicosacrilamidaeHMFenalimentosprocesadostrmicamente.

...

4

Paralograrestepropsito,sehanpropuestolossiguientesobjetivosespecficos:

Estudiar losconstituyentesdelalimentoascomoelefectode lasprincipalesvariablesqueintervieneneneltratamientotrmicosobrelaqumicadeformacindeacrilamida

eHMF.

Determinar la influencia de los precursores glioxal ymetilglioxal en la formacin deacrilamidaeHMF.

Evaluarelefectoinhibidordelapiridoxaminaenlaformacindeacrilamidayelucidarelmecanismodeaccin.

Evaluar losnivelesde acrilamidaendiversos gruposde alimentos comercializadosenEspaa.

Estimar la ingesta de acrilamida e HMF en la dieta espaola a travs de sus dosprincipalesfuentesdeexposicin:laspatatasfritasyelcaf,respectivamente.

Validar unametodologa analtica para la determinacin de acrilamida en alimentoshorneados y fritosmediante cromatografa de lquidos acoplada a espectrometra de

masasentndem(LCMS/MS)afindequecumplacon losestndaresdecompetencia

tcnicarequeridosporlanormaUNEENISO/IEC17025,yobtenerlaacreditacinporla

EntidadNacionaldeAcreditacin(ENAC).

1

II.EstructuradelaMemoria

ANLISIS,INHIBICINEINGESTADENUEVOSCONTAMINANTESQUMICOSDEPROCESADOENALIMENTOS..........

Estructuradelamemoria//7

EstaMemoria est dividida en ocho bloques. En el Bloque I se encuentran descritos los

ObjetivosdelaTesisDoctoral.Acontinuacin,sedescribelaEstructuradelaMemoria(Bloque

II).

ElBloque III,correspondientea la Introduccin,se iniciaconunabrevedescripcinsobre la

necesidaddeevaluarlosbeneficiosfrentealaslimitacionesoriesgosdelprocesadotrmicode

losalimentosdesdeelpuntodevistatecnolgicoynutricional.Acontinuacin,seofreceuna

visinglobaldelareaccindeMaillard(RM),laprincipalreaccinresponsableenlosalimentos

delaformacindeunagranvariedaddecompuestosentrelosqueseencuentranlaacrilamida

y el HMF, objeto central de esta Tesis. Y finalmente, se discute en detalle acerca de la

toxicologa,losmecanismosdeformacin,losmtodosanalticos,lasestrategiasdemitigacin

ylosnivelesdeestosdoscontaminantesenlosalimentos.

El Bloque IV describe la Parte Experimental. sta se divide en cinco Captulos,

correspondientesalosobjetivosespecficos,dondeseincluyenlosartculoscientficosconlos

resultadosobtenidosdurantelarealizacindelaTesisDoctoral.

EnelArtculo1.1sedescribelacromatografadelquidosacopladaaespectrometrademasas

(LCMS)parallevaracabounestudiosobrelainfluenciadelacomposicindegalletasypanes

comercializadosenEspaarespectoalcontenidodeacrilamida.Estosproductos,debidoaque

suconsumoestampliamenteextendidoen lapoblacin,podranserunafuente importante

de exposicin de acrilamida en la dieta espaola. Por lo tanto, tambin se presenta una

relacinentreelconsumodeacrilamidaylosdiversosgrupospoblacionales.

Ademsdelacomposicindelalimento,lascondicionesdeprocesadoinfluyenenlaformacin

deacrilamidaeHMF.ElArtculo1.2centrasuintersenlosparmetrosdetemperaturayde

tiempode frituraenmasas fritas (churros),yparalelamenteestudiacmo sevenafectados

otrosaspectosimportantesdelacalidaddelproductofinal,comoelcolorylahumedad.

EnelArtculo1.3sepresentalainfluenciadelacomposicindelaceitesobrelaformacinde

acrilamida e HMF en una formulacin convencional de galleta de desayuno. Se estudia el

efectode loscompuestosfenlicosdelaceitedeoliva,ademsdelefectode laoxidacindel

aceite.Eltrabajoexperimentalincluidoenesteartculofuedesarrolladoduranteunaestancia

en laUniversitdegliStudidiNapoli Federico IIde Italia,bajo la supervisindelprofesor

VincenzoFogliano.

8

ElArtculo2.1describeeldesarrollodeunmtodoanalticobasadoen lacromatografade

lquidos de alta eficacia con detector ultravioleta (HPLCUV), capaz de cuantificar los

compuestosdicarbonlicosglioxalymetilglioxalenmuestrasdegalletas,ascomosuposterior

validacin. Este trabajo result muy til debido a la poca informacin existente en la

bibliografa de los niveles de estos compuestos en galletas y porque son intermedios

altamentereactivosenlaformacindeacrilamida(comoseverposteriormenteenelArtculo

3.2).

ElArtculo3.1,elprimerodelosrelativosalcaptulodeinhibicin,estdedicadoalefectode

lavitaminaB6enlaqumicadeformacindeacrilamida.Lapiridoxaminaesuninhibidordela

glicacin proteica en sistemas biolgicos. Numerosos trabajos previos han revelado su

excelente capacidad para inhibir la formacin de productos avanzados de glicacin (AGEs)

siendo uno de losmecanismos la reaccin con los compuestos dicarbonlicos intermedios

glioxalymetilglioxal.Estehechoestimulnuestro intersenestevitmeroB6comoposible

inhibidorde la formacindeacrilamidayaquehastaelmomentoenquesedesarrolleste

trabajonoexistaningnestudioalrespecto.

Enbasealosresultadosobtenidosenelartculoanterior,elobjetivoplanteadoenelArtculo

3.2fueestudiarsi elmecanismodeaccindelapiridoxaminaimplicadoenlareduccindelos

nivelesdeacrilamida seproducea travsdelbloqueodeglioxalymetilglioxal.Para llevara

caboesteestudiofuenecesarioemplearelmtododeHPLCUVdesarrolladopreviamenteen

elArtculo2.1.

Siguiendoelenfoquedelosdosartculosanterioresyconobjetodeinvestigarconmsdetalle

el mecanismo mediante el cual la piridoxamina inhibe la formacin de acrilamida, en el

Artculo3.3seestudia lareaccindirectaentreambassustanciasascomo laformaciny la

elucidacinestructuraldeloscorrespondientesaductos.

DespusdeestudiaralgunosdelosfactoresqueinfluyenenlaformacindeacrilamidaeHMF

ascomoposiblesmecanismosdeinhibicin,resultanecesarioconocerlaingestadeestosdos

contaminantes qumicos de procesado en la poblacin espaola con el fin de proporcionar

datosenunafuturaevaluacinderiesgo.Lasinvestigacionessecentranenlaspatatasfritasy

enelcaf,comoalimentosdereferenciadeingestadeacrilamidaeHMF,respectivamente.

ANLISIS,INHIBICINEINGESTADENUEVOSCONTAMINANTESQUMICOSDEPROCESADOENALIMENTOS..........

Estructuradelamemoria//9

EnelArtculo4.1seinvestigalaexposicindietticaaacrilamidaatravsdelaspatatasfritas

de aperitivo en base a datos de consumo de alimentos tanto delMinisterio deAgricultura

Pesca y Alimentacin (MAPA) como de la Agencia Espaola de Seguridad Alimentaria y

Nutricin(AESAN).

EnelArtculo4.2seestudialacontribucindelcafenlaingestadiariadeHMF.ElHMFesun

conocidomarcadorqumicodelaextensindeldaotrmicoenalimentos.Recientemente,se

ha demostrado su bioactivacin hacia su derivado genotxico y mutagnico 5

sulfoximetilfurfural (SMF), incluyndose por ello en el grupo de los nuevos contaminantes

qumicosdeprocesado.Estedescubrimientohamotivadoalacomunidadcientficaarecopilar

y actualizar la informacin sobre la ingestadeHMF a travsde los alimentos conel finde

evaluar su riesgo. Este trabajo abordaporprimera vez la situacinde la ingestadeHMF a

partirdelcafenEspaa.

La parte experimental finaliza con la optimizacin y validacin del mtodo analtico para

determinar acrilamida en alimentosmediante LCMS/MS y posterior acreditacin segn la

norma ISO17025.EstetrabajoserealizenelLaboratoriodeSaludPblicadeMadrid(LSP),

conlacolaboracindelaUnidaddeTcnicasInstrumentalesyContaminantes.

Acontinuacin,enelBloqueV,seencuentralaDiscusinIntegradora.Elconocimientoacerca

de la formacindeacrilamidaeHMF, inhibicine ingesta,adquiridoa lo largode los cinco

captulos conduce a las Conclusiones ms relevantes de este trabajo de investigacin,

recogidas en el Bloque VI. En el Bloque VII, se expone los resultados obtenidos en los

diferentes ejercicios de intercomparacin. Por ltimo, se citan otros trabajos cientficos

relacionados con la presenteMemoria y publicados en colaboracin con otros centros de

investigacinextranjeros,un captulode libroyvariosartculosdedivulgacin cientfica.Se

finalizaconlaBibliografaenelBloqueVIII.

ANLISIS,INHIBICINEINGESTADENUEVOSCONTAMINANTESQUMICOSDEPROCESADOENALIMENTOS..........

Thesisstructure//11

ThisThesisispresentedinmanuscriptformat,andconsistsofeightparts.InthePartIandPart

IIaredescribedtheaim,objectives,andsummary.

Theaimofthiswork isthestudyofthechemicalcontaminantsacrylamideandHMF inheat

processedfood.

ThePartIIIpresentsabackgroundaboutfoodthermalprocessing,itsbenefitsandrisksfroma

technologicalandnutritionalpointofview,andintroducestheconceptofthermallygenerated

foodcontaminants. Inaddition,asection isdedicated to theMaillardreactionsince it is the

mainreactionresponsible forthe formationofacrylamideandHMF.Finallythissectiongets

insight about toxicology, formation pathways, analyticalmethods,mitigation strategies and

levelsoftheseheatinducedcontaminantsinfoods.

The Part IV dealswith the development of experimental section. Itwas divided into five

chapters,relatedtothemainobjectives,which includethescientificarticlesobtainedduring

thecourseofthisthesis.

TheArticle1.1describestheLCMSanalyticalprocedureforthestudyoftheinfluenceofthe

compositionofcommercialbiscuitsandbreadderivatesmarketedinSpainontheacrylamide

formation. Theseproducts,due to their relativelywidespread consumption, couldbe a key

source of acrylamide in the Spanish diet. Therefore, the relationship between acrylamide

intakeandpopulationfactorsispresented.

Besides food composition, heat processing conditions also affects on the formation of

acrylamideandHMF.TheArticle1.2 focuseson temperatureand time fryingparameters in

frieddough(churros)andotherattributesimportantforthefinalqualityofproductlikecolour

andmoisturecontent.

ThepurposeofArticle1.3 isto investigatetheeffectoftheoliveoilphenoliccompoundsas

wellasofthermoxidizedoilontheformationofacrylamideandHMF.Theexperimentalwork

included in this paper was developed in the Dipartimento di Scienza degli Alimenti of

UniversityofNapoliFedericoII(Portici,Italy).

12

In the Article 2.1 an analyticalmethod using HPLC with UV detection was developed to

measure glyoxal andmethylglyoxal in cookieswith a posterior inhouse validation. Further

studies on these dicarbonyl compounds are necessary because they may provide new

informationaboutthedynamicsofacrylamideandHMF infoodand,subsequently,potential

mitigationstrategies.Moreover,knowledgeofthesereactivedicarbonylsincookies,aswellas

theirconnectionwithacrylamideformation,hasbeenlimited,despiteevidenceindicatingthe

importantroletheyplayinacrylamidegenesis.

In theArticle 3.1, the first one related to inhibition chapter, pyridoxamine is studied as a

possibleinhibitorofacrylamide.PyridoxaminehasbeendescribedasapostAmadoriinhibitor

capableofinhibitingtheformationofadvancedglycationendproductsinvivoandinvitro.The

main purpose of this investigation was to evaluate whether this natural intermediate of

vitaminB6couldmitigateacrylamideformationinfoodssystems.

Asacontinuationofformerresearch,thepurposeoftheArticle3.2isstudyifthereductionof

acrylamide is closely associated to the inhibition rates of glyoxal and methylglyoxal by

piridoxamine.Todeterminethedicarbonylcompounds,itwasusedHPLCUVaccordingtothe

methodpreviouslydevelopedintheArticle2.1.

Followingtheapproachoftwopreviouspapersandtogetfurtherinsightintothemechanism

ofpyridoxamineonreactionsthatinvolvesacrylamideformation,theArticle3.3investigatesa

directreactionbetweenbothcompoundsandcharacterizesandidentifiesitsmajorproducts.

After the identification of several factors influencing or mitigating acrylamide and HMF

formationaswellaspossibleinhibitionmechanisms,itisrelevanttoinvestigatedietaryintake

ofthesechemicalprocesscontaminants intheSpanishpopulation,toobtainapictureofthe

currentsituationandtocomparetheintakewithotherEuropeanUnionMemberStatesbefore

afurtherdecisiononriskmanagement.The investigationsfocusoncommercialpotatocrisps

andgroundandsolublecoffeeasthereferencefoodstotheacrylamideandHMFdailyintake,

respectively.

TheArticle4.1calculatesthedietaryexposuretoacrylamidefrompotatocrispsbyusingtwo

differentfoodconsumptiondatabase.

ANLISIS,INHIBICINEINGESTADENUEVOSCONTAMINANTESQUMICOSDEPROCESADOENALIMENTOS..........

Thesisstructure//13

In theArticle 4.2 thedietary intakeofHMF roasted coffeewas studied.HMF is a classical

chemicalmarker of the extent of the thermal treatment in food. HMF has attracted the

attention of the scientific community in recent years becauseHMF has been shown to be

converted in vivo to 5sulfoxymethylfurfural (SMF), which is a genotoxic and mutagenic

compound.DuetothenewfindingsaboutHMFgenotoxicitypotential,compilingdatainfood

andestimatingconsumerexposuretoHMF isrelevantforfurtherdiscussionsoffoodexperts

andrisksmanagers.ThisinvestigationpresentslevelsofHMFintakefromcoffeeconsumption

in theSpanishpopulation taking intoaccount thepartialcontributionofgroundandsoluble

coffee.

Theanalyticalmethoddevelopment,optimization,validationandaccreditation(ISO17025)of

acrylamide in food by LCMS/MS ispresented at the endof the experimental section. This

workwasdevelopmentintheLaboratoriodeSaludPblicadeMadridincooperationwiththe

UnidaddeTcnicasInstrumentalesyContaminantes.

Consequently, thePartVdescribes thegeneraldiscussion.Theknowledgeaboutacrylamide

andHMF formation, inhibitionand intake,acquired inpreviouschapters, finally leads to the

formulationofthefinalconclusions(PartVI).ReferencesarefoundinPartVII.Finally,thePart

VIII shows the successful participation in different interlaboratory comparison studies.

Additionally,otherresearchpapersrelated to the thesiswerepublished incooperationwith

research centers at international level. It was also published a book chapter and several

manuscriptsforbasicsciencedissemination.

1

III.Introduccin

INTRODUCCINGENERAL..........

Introduccin//17

A. INTRODUCCINGENERAL

El procesado de alimentos se puede considerar como el conjunto de prcticas que utilizan

tecnologas y tcnicas para transformar los alimentos crudos o productos intermedios en

alimentoslistosparaelconsumo(LinebackyStadler,2009).Lasalaznyelsecadofuerondos

de losprimerosmtodosutilizadosporelhombrepara transformaralimentos conel finde

preservarlosymejorarsusabor.Elprocesamientodelosalimentoshapermitidoavanzarenel

abastecimientoalimentarioalprolongarsuvidatilyaumentar lavariedadde losproductos

disponibles.Sinembargo, tanto loshbitosalimentarios como las tcnicasdeprocesadode

alimentoshanidoevolucionandoalolargodelosaos.Sehapasadodecubrirmeramentelas

necesidades basadas en la supervivencia del hombre, a cubrir las demandas que los

ciudadanosplanteanenlassociedadesdesarrolladas:calidadnutricional,sensorialyseguridad

alimentaria.

Eltratamientotrmicoesunode losprocesosmsampliamenteutilizadoscomomtodode

preparacindelosalimentostantoenlaindustriaalimentariacomoenelhogar.Laformaenla

que el alimento es procesado, directamente sobre el fuego, hervido, asado, frito, etc., as

como la temperatura y la duracin del mismo influyen drsticamente sobre los cambios

qumicosylanaturalezadelosproductosoriginados.Debidoaesteproceso,losconsituyentes

delosalimentosexperimentanunaseriedereacciones,muchasdelascualessonresponsables

delaroma,color,texturaysabor,perootrasestnasociadasconlageneracindecompuestos

potencialmente txicos.Aunque lapresenciadeestassustancias txicaspuedesercausade

alarma, siempre es necesario evaluar en un contexto amplio los beneficios y riesgos que

presentan los alimentos procesadospara llegar a una evaluacinde riesgo eficaz y realista

hacia lapoblacin.Enestesentido,elComitCientficode laAgenciaEuropeadeSeguridad

Alimentaria(EFSA)desarrollunaguaenelao2010cuyopropsitoes laevaluacinde los

riesgosybeneficiosdelosalimentosconrespectoalasaludhumana(EFSA,2010).

18

B. REACCINDEMAILLARDENALIMENTOS

1.Aspectosgenerales

LaRMha sido reconocidadurantemsde60 aos como laprincipal ruta implicada en las

propiedades organolpticas de los alimentos tratados trmicamente, y en general, en la

aceptabilidadde losmismos(Kawamura,1983).Se iniciapor lacondensacinentreungrupo

aminolibredeunaminocido,pptidooprotenayelgrupocarbonilodeazcaresreductores

odelpidosoxidados.Posteriormente,ymedianteunaseriedereaccionescomplejasdalugar

alosdenominados,demaneragenrica,productosdelareaccindeMaillard(PRM).LosPRM

estn presentes en la mayora de los alimentos que se consumen en la dieta de pases

occidentales. La RM es especialmente importante para la industria alimentaria, ya que se

desarrolladurantelosprocesosdetostado,horneadoococinadoentreotros,confiriendoalos

alimentos nuevos aromas, sabores y colores agradables para el consumidor (Hodge, 1967;

Mottram,1994).

Seestimaqueaproximadamenteel8090%de losalimentosconsumidosen loshogaresson

procesadosenalgunamedida,deahlaimportanciadeconsiderarlosefectosbeneficiososdel

tratamientosobre laseguridady lacalidadde losproductos(VanBoekelycol.,2010).Aparte

de su influenciaen laspropiedadesorganolpticas, laRMest implicadaenotros aspectos

entre los que se incluyen el deterioro de los alimentos durante su procesado y

almacenamientoyelefectoprotectordedeterminadosPRMconpropiedadesantioxidantesy

antimicrobianas. Sin embargo, laRM tambin est implicada en la formacinde sustancias

perjudiciales, como las aminas heterocclicas o el furano que se describen en el siguiente

captulo, as como en la formacin deHMF y acrilamida, objeto de estudio en la presente

Memoria.

2.QumicadelareaccindeMaillard

La RM fue descrita por primera vez en 1912 por el qumico francs Louis CamilleMaillard

(Maillard, 1912). Sin embargo, fue JohnHodgequien en 1953 propusopor primera vez un

REACCINDEMAILLARD..........

Introduccin//19

esquemadelasetapasdeestacomplejareaccin(Hodge,1953).LaRMpuededividirseentres

etapas:

Etapa inicial: Comienza con una reaccin de condensacin entre el grupo carbonilo,

normalmentedeun azcar reductor, aunque tambinpuede serun compuesto carbonlico

generadoen laetapa intermediade laRMoprocedentede laoxidacin lipdica,yungrupo

amino libredeunaminocido,pptidooprotenaoriginndoseunabasedeSchiff(Figura1).

Por ciclacin, la base de Schiff se transforma rpidamente en la glicosilamina Nsustituida

correspondiente. Cuando la base de Schiff es una aldosilaminaNsustituida, se forma la 1

amino1deoxi2cetosa mediante la denominada reorganizacin de Amadori, siendo esta

epatairreversible.Sinembargo,cuandolamolculaesunacetosilaminaNsustituidaseforma

una2amino2deoxi2cetosayseleconocecomoreorganizacindeHeyns.

Azcar Aldosa+ compuesto amino

Glicosilamina N-sustituida

Reorganizacin de Amadori

+ H2O

Producto de Amadori reorganizado1-amino-1-deoxi-2-cetosa

pH > 7 pH < 7pH > 7

Reductonas Productos de fisin(acetol, diacetilo, piruvaldehdo, etc.)

Base de Schiff deHMF o furfural

- 2H2O

Dehidroreductonas

+ 2H+- 2H+

Aldehdos

- CO2+ -aminocido

Degradacin de Strecker

- 3H2O

HMF o furfural

+ H2O- compuesto amino

Aldoles y polmeroslibres de N

Aldiminas o cetiminas

+ compuesto amino

Melanoidinas (polmeros nitrogenados oscurecidos)

+ compuesto amino

+ compuesto amino

ETAPA INICIAL

ETAPA AVANZADA

ETAPA FINAL

Figura1.EsquemadelaRM(Hodge,1953;Martinsycol.,2001;ZhangyZhang,2007).

Etapaavanzada:LosproductosdeAmadoriyHeynssedescomponendependiendodelpH, la

actividad de agua, la presencia demetales divalentes o la temperatura, dando lugar a la

formacindediferentescompuestos intermediosresponsablesdelaromaquecaracterizana

losalimentoscocinados.ApHneutrooligeramentecido,yencondicionesdebajaactividad

20

de agua, la reaccin predominante es una enolizacin1,2 que da lugar a la formacin de

furfuralcuandoelazcarreductorimplicadoesunapentosaohidroxilmetilfurfuralenelcaso

de una hexosa. Por el contrario, a pH bsicos tiene lugar una enolizacin2,3 formndose

reductonasyunavariedaddeproductosdefisintalescomoacetol,piruvaldehdoydiacetilo,

todosellosdegran reactividad, loquehacequeparticipenennuevas reacciones conotros

productosintermediosdelareaccin(Figura2).

Figura2.Esquemadelasreaccionesdeenolizacin1,2y2,3dependiendodelpH(Hodge,1967).

El producto de Amadori puede degradarse tambin va oxidativa hacia compuestos

carbonlicos (ruta de Namiki). Los compuestos dicarbonlicos producidos, mediante la

degradacin de Strecker (Figura 3) pueden reaccionar con aminocidos y dar lugar a la

formacindealdehdosconuncarbonomenos,aminocetonas,yeliminacindeCO2.Estos

aldehdostambinjueganunpapelimportanteenelaromaysabordelosalimentoscocinados.

Etapafinal:Englobaungrannmerodereaccionesqueincluyenciclaciones,deshidrataciones,

reorganizaciones y condensaciones originando dos clases diferentes de compuestos: los

compuestosaromticosvoltiles,siguiendolaviaparaleladeStrecker,ylasmelanoidinas.

Lasmelanoidinas son polmeros coloreados producidos por reacciones de condensacin de

compuestoscongruposaminoprocedentesdelasetapasintermediasdelaRMcomopirroles

REACCINDEMAILLARD..........

Introduccin//21

Nsustituidos,2formilpirrolesNsustituidos,y2furaldehdo.Laestructuradelasmelanoidinas

varadependiendode lascondicionesen lasquehaya tenido lugar la reaccinascomodel

tipodealimento,adems,poseenmenorsolubilidadque losPRMdepartida(Moralesycol.,

2012).

Figura3.DegradacindeStrecker(Ames,1992).

3.Compuestos1,2dicarbonlicos

Los compuestos1,2dicarbonlicos se formanduranteel calentamientoy/oalmacenamiento

prolongado de los alimentos, principalmente a partir de la autoxidacin de la glucosa, la

degradacindelproductodeAmadoriopor fragmentacinde lasdeoxiosonas.Esteproceso

ocurre principalmente en alimentos ricos en hidratos de carbono, y especialmente en

monosacridos donde la glucosa es ms efectiva que la fructosa en la formacin de

compuestosdicarbonlicos(Hollnagel,1998).

Loscompuestos1,2dicarbonlicossonprecursorestantodeloscompuestosvoltilescomode

las melanoidinas. En la Figura 4 se muestran 11 compuestos dicarbonlicos que pueden

formarse a partir de monosacridos (Thornalley, 2005). Una de sus principales rutas de

formacin a travs de la RM tiene lugar desde la forma 1,2eneaminol del producto de

22

Amadori a intermedios deoxihexosonas (Thornalley, 2005). Una va secundaria implica la

conversindel2,3enediolal intermediometildicarbonlicoelcual sufre transformacina

cetonas, aldehdos, furanos, pirroles, quinolinas e indoles, responsables del aroma de los

alimentos.

Figura4.Compuestos1,2dicarbonlicos,intermediosdelaRM(Thornalley,2005).

Apesardelpapelquedesempeanloscompuestos1,2dicarbonlicos,existepocainformacin

sobre losnivelesdeestoscompuestosen losalimentosyendefinitivasobresuexposicina

travsdeladieta,probablementedebidoalasdificultadadesqueentraalacaracterizacinde

estosintermedios.Loscompuestosdicarbonlicosmsestudiadossonelglioxalyelmetilglioxal,

y se encuentran en productos como el pan, la salsa de soja, el t o el caf tostado y en

alimentosfermentados(Tabla1).

REACCINDEMAILLARD..........

Introduccin//23

Alimentoobebida Glioxal Metilglioxal Referencia

Whisky 390g/L 1500g/L Nagaoycol.,1986

Brandy(manzana) 330g/L 320g/L Nagaoycol.,1986

Vinotinto 970g/L 570g/L Nagaoycol.,1986

Vinoblanco 3601509g/L Barrosycol.,1999

2,1512,72mg/L 3,3811,85mg/L Ferreiraycol.,2007

VinodeOporto 15,302863mg/L 15,6725,40mg/L Ferreiraycol.,2007

Cerveza 29g/L 123g/L Saisonycol.,2009

Cafinstantneo 340g/L 1600g/L Nagaoycol.,1986

Caf 870g/L 700g/L Nagaoycol.,1986

Tnegro 20g/L 50g/L Nagaoycol.,1986

Tverded trazas trazas Nagaoycol.,1986

Bebidascarbonatadas 201730g/L 711395g/L Loycol.,2008

Miel 1,7mg/kg 3,1mg/kg Mavricycol.,2008

MieldeManuka 6511541mg/kg Stephensycol.,2010

Pan 300g/kg 790g/kg Nagaoycol.,1986

Tostadas 500g/kg 2500g/kg Nagaoycol.,1986

Salsadesoja 4900g/L 8700g/L Nagaoycol.,1986

Tabla1.Nivelesdeglioxalymetilglioxalenalgunosalimentosybebidas.

4.ConsecuenciasdelareaccindeMaillard

Hastaladcadadelos80delsiglopasado,lamayoradelasinvestigacionesrealizadassobrela

RM se centraban en aspectos tradicionales de la ciencia y tecnologa de los alimentos,

incluyendo aroma, color, textura, trazabilidad, vidatil y valornutricional. Sin embargo, en

respuestaa la industriaalimentaria y a los interesesde los consumidores,el impactode la

dietaenlasaludharecibidounamayoratencinenlosltimosaos.Estehechohasupuesto

un cambiodeperspectivaen la investigacinde laRMparaalcanzarnuevos conocimientos

sobre laaplicacindeltratamientotrmicosobre losalimentosconel findecrearalimentos

procesadosmssaludables,yasuvez,preservarlascaractersticassensorialesoriginarias.

4.1Aspectostecnolgicos

Como se ha indicado anteriormente, el aroma es una de las principales consecuencias del

desarrollo de la RM. La RM puede generarms de 2.500 compuestos aromticos que se

relacionanconlascaractersticassensorialesdelosalimentosprocesadostrmicamenteyque

24

incidendemaneraespecialen laaceptacindelproductoporpartedel consumidor (Cerny,

2008).Engeneral, la intensidaddelaromayeltipodecompuestosvoltilesdependende los

precursoresde reaccin,de losparmetrosdelprocesado trmicoodelpH (Martinsy col.,

2001;VanBoekel,2006).Algunoscompuestosazufradosvoltiles,relacionadosconelaroma

de la carne, pueden ser obtenidospor reaccin entre la cistena yun azcar reductor. Por

ejemplo,elglutatin,untripptidoquecontienecistena,contribuyealageneracindelsabor

delacarne(Wangycol.,2012).Sehanidentificadomultituddecompuestosrelacionadoscon

elaromaendiversosalimentosprocesados,comosepuedeobservarenlaTabla2.

Clasedecompuesto Aroma Detectadoen

PirazinasCocinado,asado,tostado,cerealeshorneados

Alimentoscalentadosengeneral

Alquilpirazinas Nueces,asado Caf

AlquilpiridinasAmargo,astringente,quemado

Caf,cebada,malta

Acilpiridinas Crackers Cereales

Pirroles Cereal Cereales,caf

Furanos,furanonas,piranonas

Dulce,quemado,picante,caramelo

Alimentoscalentadosengeneral

Oxazoles Nuez,dulce Cacao,caf,carne

Tiofenonas Carne Carnecocinada

Tabla 2.Aromas generadospordiferentes compuestosderivadosde la reaccindeMaillard enalimentostratadostrmicamente(VanBoekel,2006).

4.2.Aspectosnutricionales

Los trabajos publicados en la primeramitad del siglo XXmuestran que las reacciones de

pardeamientopuedentenerunefectoadversosobrelacalidadnutricionaldelasprotenasde

losalimentos(McCollumycol.,1915;Greavesycol.,1938).Esteefectosedebealbloqueode

aminocidos esenciales y en consecuencia, auna reduccin en ladisponibilidadbiolgicao

incluso a la inhibicin que ejercen determinados PRM sobre la actividad de las enzimas

digestivas.

REACCINDEMAILLARD..........

Introduccin//25

LalisinaeselaminocidocomnmentemsreactivohacialaRMysuprdidadedisponibilidad,

pudiendo llegar hasta un 50%, es la consecuenciams significativa del progreso de la RM

(Reratycol.,2002).Estaconsecuenciaesimportanteenlosalimentosenloscualeslalisinaes

elaminocido limitante (Meade y col.,2005).Porejemplo,RufinHenares y col.estimaron

desde un 0,1 hasta un 36,7% el contenido de lisina no disponible en suplementos para

deportistasabasedeprotenas lcteas(RufinHenaresycol.,2007).Duranteeltratamiento

trmico, se produce tambin laoxidacin y la destruccin de otros aminocidos esenciales

como lametionina y el triptfano y laparticipacinde los restos arginina ehistidina en el

entrecruzamientodeprotenas(Moralesycol.,2007).

LasvitaminastambinpuedenverseafectadasporlaRM.Enmuestrasdelecheinfantilesseha

comprobadoquelascondicionesdealmacenamientopromovieronlaRMprovocandoprdidas

dedeterminadasvitaminascomolatiamina,elcidopantotnico,ylasvitaminasB6yB12.Enlo

quealavitaminaCserefiere,esparticularmentepropensaaladegradacintantoduranteel

almacenamiento,debidoasualtasusceptibilidadalaoxidacin,comoduranteeltratamiento

trmico generando diferentes compuestos, especialmente el furano. Sin embargo, en

muestras de leche infantiles fortificadas no se observ ningn efecto significativo en la

degradacindelavitaminaCduranteelalmacenamiento(Gliguemycol.,2005).

ElefectodelosPRMsobrelabiodisponibilidadmineralseatribuyeasucomportamientocomo

agentesquelantesdemetales.En1976,HrdlickaobservquecuandosalesdeFe3+oCu2+se

calientan junto a una mezcla de glucosaglicina o fructosaglicina originan pigmentos

(melanoidinas)capacesdeformarcomplejosestablesconestoscationes,pudiendo influiren

su biodisponibilidad (Hrdlicka, 1976).Delmismomodo, se ha comprobado en animales de

experimentacinyenhumanos,quelosPRMmodificanlaexcrecinurinariadelzincytambin

deotroselementoscomoelcobre,hierroycalcio.Enconcreto,ensayos llevadosacaboen

ratas,hanmostrado larelacinentre losPRMyalgunosmineralescomoelcalcio,magnesio

(DelgadoAndradeycol.,2007a),zinc(Navarroycol.,2000),hierroycobre(Hurrel,1990).

El tratamiento trmicoproduce cambiosestructuralesen lasprotenas, lo cualprovocauna

menorsolubilidadyunamenorsusceptibilidadalaaccindelasenzimasdigestivas.Adems,

determinadosPRMpueden inhibir laactividadde lacarboxipeptidasaAyaminopeptidasaN

(ste y col., 1986). En concreto, se ha descrito que el HMF es un inhibidor de la

carboxipeptidasaA(steycol.,1987).

26

LosPRM,comolasmelanoidinas,soncapacesdeinhibirelcrecimientomicrobianoinfluyendo,

deestamanera,enlavidatildelosalimentos(RufinHenaresyMorales,2007).Losprimeros

estudiosfueronrealizadosutilizandosistemasmodelo,constituidosporazcares,aminocidos

ycaf.Dagliaycol.demostraronque laactividadantibacterianade lasmelanoidinasdelcaf

dependedelgradode tuesteynodelprocedimientoaplicadoparaprepararlo (Dagliaycol.,

1994).Lasmelanoidinaspuedenejerceraccinantimicrobianamedianteunaactividad tanto

bacteriostticacomobactericidadependiendode laconcentracindemelanoidinas,delpHy

delatemperaturadelmedio,ascomodelpesomolecularylaestructuradelosPRM(Rufin

HenaresydelaCueva,2009).

CONTAMINANTESQUMICOSDEPROCESADO..........

Introduccin//27

C. CONTAMINANTESQUMICOSDEPROCESADOENALIMENTOS

El empleode altas temperaturas, en combinacin conotros factores externos al alimento,

ademsdereducirsuvalorbiolgicopuededar lugara la formacindecompuestos txicos

que inciden en la seguridad del mismo. Estas sustancias se denominan contaminantes

qumicosdeprocesado.Son compuestosquenoestabanpresentesenelalimento frescoy

cuyagnesisestdirectamenterelacionadaconelprocesadode losalimentos.Enbaseasu

toxicidadenmodeloscelularesyanimalesdeexperimentacin,seestimaquepuedenejercer

efectos fisiolgicos adversos en humanos, es decir, son sustancias que crean un riesgo

potencialorealpara lasalud.Entreellosdestacan loshidrocarburosaromticospolicclicos,

loscloropropanolesysussteres,ascomo loscontaminantesderivadosde laRMcomo las

aminasheterocclicas,elfurano,elHMFylaacrilamida(Tabla3).

Hidrocarburos

aromticos

policclicos

Cloropropanoles

Aminasaromticas

Furano

Tabla3.Ejemplosdealgunoscontaminantesdeprocesado.

28

1.Hidrocarburosaromticospolicclicos

Loshidrocarburosaromticospolciclicos constituyenungrupodemsde cien compuestos

quesecaracterizanporposeerensuestructuradosomsanillosdebencenounidosentres.

Lamayoracontienensolamentecarbonoehidrgenoysonsiempreestructuraspolinucleares

detipoaromtico.Se formanporcondensacindecompuestosorgnicostantoporpirlisis

como por pirosntesis. A altas temperaturas, los compuestos orgnicos se fragmentan

fcilmente (pirlisis) y los radicales libres producidos se unen para formar compuestos

aromticos polinucleares estables (pirosntesis) mediante reacciones tipo DilesAlder. A

temperaturasinferioresa400Cseformanenpequeascantidades,peroentre400y1000C,

losnivelesproducidos aumentan linealmente con la temperatura (Jgerstad y Skog, 2005).

Entre los alimentos donde se han encontradomayores niveles destacan la carne asada, el

pescado ahumado, los quesos ahumados, curados y semicurados, el t y el caf. Los

hidrocarburosaromticospoliccliclossehanincluidoenlaslistasdecontaminantesorgnicos

prioritariosde laAgenciadeProteccinMedioambientaldeEstadosUnidos (Environmental

Protection Agency, EPA) (U.S. EPA, 2002) y de la Unin Europea (UE) (Commission

Recommendation, 2005) debido a su actividad carcinognica. Adems el benzo[a]pireno,

originalmente definido como probable carcinognico en humanos (grupo 2A), ha sido

recientementeclasificadocomocarcinognicoenhumanos(grupo1)(IARC,2010).

2.Cloropropanolesyclorosteres

Loscloropropanolesylossteresdesuscidosgrasos(clorosteres)soncontaminantesquese

forman durante el procesado y elaboracin de determinados alimentos e ingredientes. En

1978elgrupode trabajodelprofesorVelek fueelprimeroendemostrarquese formaban

mediante hidrlisis cida de la protena vegetal hidrolizada (Velek y col., 1978). El 3

monocloropropano1,2diol(3MCPD)eselcloropropanoldemayorpresenciaenestaprotena.

Lasprotenasvegetaleshidrolizadas sonun ingredientemuyutilizadoendiversosalimentos

como lassalsasdesoja, lassopas, lascomidaspreparadas, losaperitivossaladoso losfideos

instantneos (Xu y col., 2006). Los cloropropanoles se han detectado tambin en otros

alimentos que no son sometidos a hidrlisis cida durante la fabricacin. Entre dichos

productosseencuentranlafrutaylashortalizaselaboradas,losproductosabasedecerealesy

depanadera, las carnesprocesadas,elpescadoahumadoy la cerveza.Tambinel3MCPD

puedemigrardeciertostiposderesinasresistentesa lahumedadabasedeepiclorohidrina,

CONTAMINANTESQUMICOSDEPROCESADO..........

Introduccin//29

utilizadasencubiertasdepapelycelulosacomoporejemplocubiertasdesalchichas,bolsitas

de t y filtros de papel para el caf. La presencia de cloropropanoles en los alimentos es

preocupantedebidoasuspropiedadestoxicolgicas.En laUEsehan fijadonivelesmximos

permitidosde20g/kgparaprotenavegetalhidrolizadaysalsadesoja.

Los steres del 3MCPD son cidos grasos del 3MCPD. Estudios recientes describen la

presenciadeestoscompuestosenvariosproductosalimenticios,principalmenteenaceitesde

oliva refinados y productos elaborados con estos aceites. Actualmente, no se dispone de

suficiente informacin sobre supresenciaen losalimentosni sobre su toxicidadparapoder

evaluar su importancia sobre la salud. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los

clorosteresrepresentanunanuevafuentede3MCPDen losalimentos,puestoquedeellos

sepuede liberar3MCPD invivopor lareaccindehidrlisiscatalizadapor laenzima lipasa.

Hamletycol.encontraronestetipodesteresencerealesprocesadosymostraronquepodan

sergeneradoscomointermediosestablesocomoproductosdeformacinapartirdemonoy

diacilgleroles(Hamletycol.,2004).

ContaminantesqumicosderivadosdelareaccindeMaillard

3.Aminasheterocclicas

Lasaminasaromticasheterocclicassonunafamiliadecompuestosquehanatradoelinters

demuchoscientficosdebidoasuposiblerelacinconelcncer.Eldescubrimientorealizado

en1977porSugimuraycol. revelque,endeterminadascondiciones,elhumoprocedente

delprocesadoycocinadodealimentosricosenprotenascontenacantidadesapreciablesde

sustanciasmutagnicas (Sugimuraycol.,1977).Actualmente,sehan identificadomsde20

derivadosdeestassustancias.Dependiendodelmecanismodeformacinsepuedendividiren

dosgrandesgrupos.

El primero, las carbolinas, se forma a elevadas temperaturas y se conocen como aminas

pirolticas. Se generan durante la pirlisis (> 250 C) de aminocidos (triptfano, cido

glutmico,fenilalaninayornitina)obiendeprotenas(casenayglobulinadesoja).

30

El segundo grupo son los aminoimidazoazarenos, llamados tambin aminas trmicas, los

cuales han recibido una mayor antencin por ser extremadamente mutagnicos en

comparacinconelprimergrupo.Seformanenalimentosricosenprotenascomolacarneo

elpescadoa temperaturas inferioresa300 C.Lasconcentracionesencontradasenalgunos

tiposdealimentossehanrecogidoendiversosartculosderevisin(Feltonycol.,2000;Skogy

Solyakov,2002).

Aunqueexistengrandesvariacionesdebidoa lascondicionesdecocinadooa losdiferentes

tipos de carne, en general, los valoresms elevados corresponden a alimentos tratados a

temperaturaselevadasyconun tiempodecoccinprolongado.Generalmente, los tiposde

coccin(hervidooalvapor)queimplicantemperaturasalrededordelos100Cgeneranpocos

agentesmutagnicos.Sinembargo,lostratamientostrmicosquesuponenuncalentamiento

mediante procesos conductivos, como frer o asar, provocan un aumento de la actividad

mutagnica.Algunosestudiostambinhan identificado lapresenciadeestoscompuestosen

extractosdecarne,condimentosyaromatizantes;ascomoenlosresiduosquequedanenlas

sartenesolasplanchasdespusdelacoccin,generalmenteenlasmismascantidadesqueen

el correspondiente alimento e incluso, en algunos casos, en concentraciones

considerablementemselevadas(Skogycol.,1998).

4.Furano

Elfuranoesuncompuestoqueseformaduranteeltratamientodelosalimentosconcalory

contribuye a las propiedades sensoriales del producto. Se han propuesto mltiples

mecanismosparasuformacinduranteeltratamientotrmico,incluyendoladegradacinde

los derivados del cido ascrbico, degradacin de carbohidratos, degradacin trmica de

aminocidos enpresenciao ausenciade azcares reductores, yoxidacinde cidos grasos

poliinsaturados,carotenoidesycidosorgnicos (BecalskiySeaman,2005).Segnelltimo

Informe Cientfico de la EFSA sobre el furano, los alimentos que ms contribuyen a la

exposicinhumanaatravsdelosalimentossonlospotitosinfantilesyelcaf(EFSA,2011).

CONTAMINANTESQUMICOSDEPROCESADO..........

Introduccin//31

5.Hidroximetilfurfuralyacrilamida

Elestudiodeloscontaminantesenlosalimentoshacrecidoconsiderablementeenlosltimos

aos convirtindose en una cuestin fundamental para elmantenimiento de la seguridad

alimentariaanivelmundial.Estohahechoquesedescubrannuevosriesgoscomoeselcaso

del HMF y la acrilamida, considerados los ms importantes contaminates qumicos de

procesadoenproductosdepanaderaygalleteraademsdelcaf,debidoasualtopotencial

toxicolgicoyasuconcentracinelevadaenestosalimentos.EstaTesissecentrarenestos

dosnuevoscontaminantes.

32

D. NUEVOS CONTAMINANTES QUMICOS DE PROCESADO EN

ALIMENTOS

1.Hidroximetilfurfural

ElHMF(5hidroximetil2furaldehdo;CASNo.67470)esunaldehdocclicoformadotantoa

travs de la RM como de la deshidratacin de los azcares (caramelizacin). El HMF est

ampliamentedistribuidoen ladietaoccidentalyseha identificadoenunagranvariedadde

alimentosprocesados.Suestructuraascomoalgunasdesuscaractersticassepresentanenla

siguientetabla.

Estructura

C6H6O3

Pesomolecular

Puntodefusin

Solubilidad

Mximoabsorbancia

126,11g/mol

3234C

agua,etanol,metanol,acetatodeetilo

284nm

Tabla4.Identificacin,estructuraypropiedadesdelHMF.

1.1.Toxicologa

El tratamiento trmicoascomoelalmacenamientode losalimentosproducenunaseriede

reaccionesqueconducenacompuestosquepuedenafectarenlasalud.ApesardeserelHMF

unasustanciaconocidaen la industriaalimentariayqumicadesdehacedcadas, larelacin

entreHMFysusmetabolitos,ylasaludnosehaestudiadoendetallehastaelao2006(Glatt

ySommer,2006).

1.1.1.Metabolismo

ElHMFseabsorberpidamenteeneltractogastrointestinaldelosroedoresyseeliminaconla

misma rapidez de todos los tejidos, sin evidencia de una acumulacin significativa. Sin

embargo,suabsorcinpuedeestarinfluenciadaporotrosconstituyentesde ladietacomoes

elcontenidodefibra,elcualparecereducireltransporteylaabsorcindeHMFenlaslneas

celularesCaco2 (DelgadoAndradeycol.,2008).ElHMFesmetabolizadoparafinalmenteser

eliminadoenlaorina(~90%)ylasheces(~10%).Adems,sehadesarrolladounmtodopara

HIDROXIMETILFURFURAL..........

Introduccin//33

cuantificarlosaductosdeHMFapartirdealdehdosunidoscomobasesdeSchiffalnitrgeno

terminal de la hemoglobina.Dichos aductos pueden ser utilizados como biomarcadores de

exposicin(Daviesycol.,2009).

LaFigura5muestralasvasdebiotransformacindelHMFsiendolarutaprincipallaoxidacin

delHMFalcido5hidroximetil2furanoico(HMFA)ylaposteriorformacindelconjugadode

glicina, N(5hidroximetil2furoil)glicina (HMFG). El HMFA y el HMFG son los principales

metabolitosdelHMF excretados en laorina. Tanto en ratas como enhumanos, la relacin

HMFA/HMFG disminuye amedida que aumenta la ingesta de HMF, lo que sugiere que la

disponibilidad de glicina libre puede limitar la tasa de conjugacin, y como resultado se

produce la excrecin de cido furoico libre (FA) o de cido 2,5 furandicarboxlico (FDCA) a

travsdeunasegundaruta.LoscidosHMFA,HMFG,yFDCAsehanidentificadoenlaorinade

roedoresyen lade loshumanos,demostrandoqueestoscidos sederivandelHMFde los

alimentos.ElHMFesbiotransformadoaSMFporsulfonacindesugrupofuncionalhidroxilo

allico, reaccin catalizada por sulfotransferasas (SULT) (Glatt y Sommer, 2006; Surh y

Tannenbaum,1994).Esimportanteresaltarqueenelao2009,sedetectporprimeravezel

SMFinvivoensangrederatones(Monienycol.,2009).

UnarutamenorenlaeliminacindelHMFseralaoxidacincompletadeHMFaCO2atravs

delaaperturadelanillo,formndoseprimeroelcidocetoglutrico.Estavasehadescrito

enlaliteraturapararoedoresperoannosehaconfirmadoenhumanos(Nomeirycol.,1992).

1.1.2Toxicidad

ExistenevidenciasdelefectopotencialmentenocivodelHMFbasadasenensayosinvitroyen

experimentos realizados en animales de laboratorio. Sin embargo, cuando los estudios se

extrapolan a los humanos, los resultados no son del todo concluyentes, siendo objeto de

estudio en la actualidad. El SMF induce efectos genotxicos ymutagnicos en bacterias y

lneas celulares demamferos (Surh y col., 1994; Glatt y col., 2006). La interaccin de este

intermedio reactivo connuclefilos celulares (ADN,ARNyprotenas)puedeprovocardaos

estructuralesenestasmacromolculas.Enroedores,elHMFsehaidentificadocomoiniciador

ypromotordel cncerde colon,deprocesosnefrotxicosodeaberraciones cromosmicas

(Zhangycol.,1993;Bakhiyaycol.,2009).

34

O

HO OH

O

O

CO2

OOH

cido cetoglutrico O

OOH

OSO

O

HO

5-Sulfoximetilfurfural (SMF)

5-Hidroximetilfurfural (HMF)

OOH

HO

O

cido 5-hidroximetil-2-furoico (HMFA)

OOH

HO

O

O

cido 2,5-furandicarboxlico (FDCA)

OOH

O

S

HMFA-CoA

CoA GlicinaO

OH

O

NH

N-(5-Hidroximetil-2-furoil)glicinaO

HO

(HMFG)

OOH

O

NH

(cido 5-carboxlico-2-furoil)glicinaO

HO

(CAFG)

OHO

OH

O

NH

(cido 5-carboxlico-2-furoil)amino-metano

H3C

OH

(CAFAM)

SULT

HS-CoA

Figura5.Metabolismodel5hidroximetilfurfural(EFSA,2005a).

LatoxicidadagudaporvaoraldelHMFcomocompuestopuroesrelativamentebaja,siendola

dosisletal(DL50)de2,5g/kgdepesocorporalenratas(U.S.EPA,1992).ElProgramaNacional

deToxicologadeEstadosUnidos llevacabounestudiodurante2aosencontrandoqueel

HMF aumentaba la incidenciade adenomashepatocelulares en ratoneshembrade la lnea

B6C3F1.Sinembargo,nosehaencontradoevidenciacientficadecarcinogenicidadenratasde

la lneaF344/N (NTP,2008).Ms tarde,elHMFhademostradoseruncarcingenodbilen

ratones debido al aumento significativo del nmero de pequeos adenomas intestinales

(Svendsenycol.,2009).

HIDROXIMETILFURFURAL..........

Introduccin//35

1.1.3.Evaluacinderiesgos

En el ao 2005, el comit cientfico de la EFSA estim una ingesta diaria de HMF de 1,6

mg/persona (EFSA, 2005a). Este valor es muy superior al valor de 0,54 mg/persona/da

calculado a partir de una amplia base de datos sobre estudios crnicos y subcrnicos

realizados con animales (JECFA, 1996). Sin embargo la preocupacin sobre el riesgo viene

asociadapor laconversindelHMFaSMF.ElSMFescapazdereaccionarconelADNyotras

macromolculasydarlugaraefectostxicosymutagnicos.AunqueelSMFesmuyinestable,

sehadetectadorecientementeenlasangredelosratonestratadosconHMF,loqueindicasu

metabolizacin in vivo a SMF. Adems, las SULT semanifiestanms extensamente en los

tejidosextrahepticosde loshumanosqueenelde los roedoressiendosuactividadmayor.

Estosugiereque losriesgosasociadosa laexposicindelHMFpodranseranmayorespara

los humanos que los descritos para los roedores (Monien y col., 2009), aumentando las

incertidumbres sobre si la exposicin a HMF podra suponer un riesgo real para la salud

(GkmenyMorales,2012).

1.2.Mecanismosdeformacin

ElHMFesuncompuestointermedioenlaRMqueseproducecuandolashexosasreductoras

se calientan en presencia de aminocidos o protenas. Una ruta alternativa consiste en la

deshidratacin trmica directa de fructosa, sacarosa, y enmenormedida, de glucosa. Esta

reaccinnorequierelapresenciadegruposaminoyestcatalizadaencondicionescidas.En

laFigura6serepresentanlasprincipalesrutasdeformacindelHMFenlosalimentos.

1.2.1.ReaccindeMaillard

ElHMFse formapordegradacindelproductodeAmadoria travsdeunaenolizacin1,2,

siendola3deoxiosonaelintermedioclaveenlareaccin.ElcompuestodeAmadoriescapaz

degenerar,enlasmismascondicionesdereaccin,aproximadamente10vecesmsHMFque

el respectivo azcar y aminocido. Si elmedio de reaccin y las condiciones trmicas son

apropiados,elcompuestodeAmadorisedegradarhacialosPRM.ApHneutrooligeramente

cido,elproductodeAmadoriformael1,2eneaminol,elcualpierdeungrupohidroxiloenel

C3 y sufre una desaminacin en el C1 y una hidratacin para formar un compuesto

intermediodenominado3deoxisona.La3deoxiosonasufreciclicacinygeneraunhemiacetal

elcualsedeshidrataparaformarfinalmenteHMF.Estarutaselaconocecomoenolizacin1,2.

36

Sacarosa

O

OH

HO

HOOH

OH

D-Glucosa

R-NH2

N

OH

HO

HOOH

OH

Base de Schiff

+

HO

OH

HO

HOOH

OH

1,2-Enediol

HO

OH

HO

HOOH

OH

D-Fructosa

OOH

OHHO

HO+ H+

Catin fructofuranosil

NH

OH

HO

HOOH

OH

1,2-Eneaminol

RNH

OH

HO

HOOH

OH

1-Amino-1-deoxicetona

R

N

OH

HO

HOOH

R

- H2O

- R-NH2

O

OH

HO

HOOH

O

OH

O

HOOH

3-Deoxiosona

OOH

OHHO

HO

- H+

OO

HO

HO

OO

HO

OO

HO

- H2O

O

OH

O

OH

1,2-Diulosa(3,4-dideoxiosona)

OHH

5-Hidroximetilfurfural

- H2O

Caram

elizacin

- H2O

- H2O

- H2O

R

Figura6.Principalesrutasdeformacindel5hidroximetilfurfural(PerezLocasyYaylayan,2008a).

1.2.2.Caramelizacin

Lacaramelizacinrequieremayorenergadeactivaciny temperaturasmselevadasque la

RMaunque,demanera similar, tambin se formael intermedio3desoxiosona. La Figura6

muestra la formacindeHMFpordeshidratacinde losazcaresduranteel calentamiento.

Durante la caramelizacin, los azcares reductores a travs de la enolizacin1,2 sufren

reaccionesdedeshidratacin y ciclacinpara formar finalmenteelHMF. En condicionesde

baja humedad, se ha propuesto una va alternativa de formacin de HMF a partir de la

degradacin de sacarosa en fructosa, que conlleva la formacin del catin reactivo

fructofuranosil,elcualpuedeconvertirsedirectamenteaHMF(PerezLocasyYaylayan,2008a).

Losautoresconcluyeronqueatemperaturaselevadas,lacantidaddeHMFformadoapartirde

HIDROXIMETILFURFURAL..........

Introduccin//37

sacarosa esmayor que a partir de fructosa o glucosa. Esto es debido a que este catin

intermedio se convierte de manera ms eficiente a temperaturas ms bajas en HMF en

comparacinconla3deoxiglucosona,vaglucosayfructosa.

1.3.Mtodosanalticos

Unode losaspectosmsestudiadosha sidoel tratamientode lamuestra,yen concreto la

extraccindelHMFde lamatriz del alimento. En el casodematrices sencillas, comomiel,

bebidas alcohlicas y zumos de frutas, se realiza una extraccin acuosa seguida de una

filtracin.Sinembargo,paraelcafserecomiendaelusodetcnicasmsselectivascomo la

extraccin en fase slida (SPE) para obtener extractos libres de interferentes (Murkovic y

Pichler,2006).

Enlosalimentosdebaselctea,elextracto,despusdelaadicindecidooxlico,secalienta

durante 25min para realizar el clculo del denominado HMF total. En otros casos, se ha

conseguidomejorar laextraccin conelempleodedisolventes comometanoloacetatode

etilo,seguidodeevaporaciny reconstitucindelextractoenunmedioacuosoantesdesu

anlisis.

En los productos a base de cereales y vegetales se recomienda la utilizacin de soluciones

clarificantescomoCarrez,K4[Fe(CN)6]+ZnSO4.7H2O,en lugardecidoscomotricloroactico,

metafosfricoosulfosaliclico,debidoaqueesposiblequeapHbajosegenereHMFinsitua

partirde laglucosapresenteen lamatriz.Sinembargo,AitAmeurycol.demostraronqueel

uso del cido tricloroactico durante la extraccin de cereales no condujo de nuevo a la

formacindeHMF(AitAmeurycol.,2006).

Conrespectoalapurificacindelamuestra,laSPEeselmtodomsutilizado.Leeycol.(Leey

col.,1986)emplearon cartuchosdeextraccindeoctadecil slice (C18) seguidodeun lavado

conhexanoenextractosdenaranja.Gkmenycol.utilizarontambincartuchosdeextraccin

OasisHLBparaclarificarelextractoacuosoantesdelanlisisporLCMS(Gkmenycol.,2006a).

EnlaliteraturasehadescritounaampliavariedaddetcnicasanalticasparadetectarHMFen

losalimentos,queincluyenlacolorimetra,espectrofotometraycromatografa(Tabla5).

38

Mtodo Referencia

Colorimtrico

Resorcinol/HCl

Difenilamina

Anilina

cidotiobarbitrico

pToluidina/cidotiobarbitrico

Directo

Automatizado

Espectrofotomtrico

Medidadirecta

Atomatizada

Derivado

Medidaindirecta

Tiosemicarbacida

Polarografa

Espectroscopia1HRMN

Cromatografa

Enpapel

2,4DNPHderivado

Particinlquidolquido

Capafina

degases

delquidos

2,4DNPHderivado

Intercambioaninico

Intercambiocatinico

Faseinversa

Cereales

Miel

Mermelada

Frutaseca

Vinagre

Zumodefrutas

Productosabasedetomate

Caf

Leche

Electroforesiscapilar

Cromatografaelectrocinticamicelar

Hadornycol.,1960

Garoglio,1961

DinsmoreyNagy,1972

KeeneyyBassette,1959

Winkler,1955

DelaIglesiaycol.,1997

DattatreyayRankin,2006

EspinosaMansillaycol.,1993

MontillaGmezycol.,1988

ReyesSalasycol.,2006

ConsonniyGatti,2004

Riceycol.,1951

VanDuin,1957

SchuckyPavlina,1994

Teixidycol.,2006

LoCocoycol.,1996

KimyRichardson,1992

Risnerycol.,2006

RufinHenaresycol.,2006a

JeuringsyKuppers,1980

RadaMendozaycol.,2002

MurkovicyPichler,2006

Theobaldycol.,1998

BlancoGomisycol.,1991

Porrettaycol.,1991

Wuycol.,2009

Moralesycol.,1992

MoralesyJimnezPrez,2001

Tabla5.MtodosparaelanlisisdelHMFenalimentos(Morales,2009).

HIDROXIMETILFURFURAL..........

Introduccin//39

En la actualidad, la cromatrografa lquida de fase inversa es la tcnicams utilizada para

analizardeformaprecisayfiablelapresenciadecompuestosfurnicosenalimentoscomolos

zumosdemanzanayconcentrados,brandysyotrasbebidasalcohlicas,caf,leche,frmulas

infantiles, cereales de desayuno, productos a base de tomate, ymermeladas. Esta tcnica

puededeterminardirectamenteHMF,furfuralyfurfurilalcoholsinnecesidaddelaformacin

deunderivadocoloreadodebidoalafuerteabsorcinenelUV(280nmaproximadamente)de

losfurfurales.

La elucindelHMFnormalmente se lleva a cabo empleandouna separacin isocrtica con

fases mviles conteniendo 510% de acetonitrilo o metanol en agua, agua acidificada o

tampnacetato(cidoacticoacetatosdico,pH3,6).

Algunosautoresutilizaronunderivadode la2,4DNPHparaelanlisisdelHMFconel finde

mejorar tanto la selectividad como la sensibilidad delmtodo enmatrices como zumo de

frutasycerveza,debidoa laaltaespecificidadquepresenta la reaccinentre laDNPHy los

compuestoscarbonlicos.Yuanycol.(Yuanycol.,1998)aplicaron lacromatografa lquidade

intercambio inico condetector fotodiodo arraypara la separacindelHMF, 2,5dimetil4

hidroxi3(2H)furanona (DMHF), cido furoico, furfural, 2acetilfurano y furfuril alcohol en

zumosdefrutas.Posteriormente,Gkmenycol.hanutilizadoLCMSconionizacinqumicaa

presinatmosfrica (APCI)enalimentos infantiles (Gkmenycol.,2006a).Finalmente,cabe

comentarque,aunqueenmenormedida,tambinsehanempleadotcnicasdecromatografa

de gases acoplada a espectrometra de masas (GCMS) (Teixid y col., 2006) para la

determinacindeHMFenalimentos.

1.4.Nivelesenalimentos

AunqueelHMFnoseencuentrapresenteenproductosfrescosonoprocesadostrmicamente,

seacumularpidamenteduranteelcalentamientoyelalmacenamientodealimentosricosen

hidratosde carbono,yenalgunos casospuedeexcederelvalorde1g/kg, comoocurreen

frutossecosyproductosabasedecaramelo.ElHMFestampliamentereconocidocomoun

ndice vlido para estimar el deterioro generado en el alimento como resultado de un

calentamientoexcesivoodurantecondiciones inadecuadasdealmacenamiento.De lamisma

manera, se ha utilizado como marcador para controlar el procesado trmico de algunos

productoselaboradosabasedecerealescomopasta,galletas,pan,cerealesdedesayunoy

pantostado.

40

EnlaTabla6serecogenlasconcentracionesdeHMFencontradasendiferentesalimentos.

Tabla6.ContenidodeHMFendiversosalimentosybebidas(CapuanoyFogliano,2011).

Matriz HMF(mg/kg)

*mg/L

Caf 1001900

Cafinstantneo 4004100

Descafeinado 430494

Achicoria 20022500

Malta 1006300

Cebada 1001200

Miel 10,458,8

Cerveza 3,09,2*

Mermelada 5,537,7

Zumodefrutas 2,022,0

Vinotinto 1,01,3*

Vinagredemalta 1,67,3*

Vinagredejerez 13,834,8*

Vinagrebalsmico 316,435251,3*

Galletas 0,574,5

Pan(blanco) 3,468,8

Pan(tostado) 11,887,7

Pan(snacks) 2,210,0

Cerealesdedesayuno 6,9240,5

Whisky 1,413,1*

Brandy 1,54,8*

Ron 1,7*

Alimentosinfantilesabase

deleche

0,180,25

Alimentosinfantilesabase

decereales

057,18

Frutadesecada 252900

Almendratostada 9

Avellanatostada 2,266,5

Productosabasedecaramelo 1109500

HIDROXIMETILFURFURAL..........

Introduccin//41

1.5.Estimacindeingesta

Como se ha descrito anteriormente, los niveles de HMF encontrados en fruta desecada,

carameloyvinagrebalsmicosonextremadamenteelevados.Sinembargo,losalimentosque

mscontribuyenalaingestadeHMFenlapoblacinsonelcafyelpan.Sehaestimadouna

ingestaaproximadadeentre30y150mgdeHMFporda(2,5mg/pesocorporal/da)(Ulbricht

ycol.,1984).Msrecientemente,RufinHenaresyde laCuevaestimaronuna ingestadiaria

para la poblacin espaola de 2,1mg, 9,7mg y 23,0mg, valormnimo,medio ymximo,

respectivamente, de HMF en los alimentos (RufinHenares y de la Cueva, 2008). Estos

resultadosestndeacuerdo con lospublicadosenelao2007porDelgadoAndradey col.

(DelgadoAndrade y col., 2007b), quienes calcularon una ingesta diaria de 5,1mg para los

adolescentesespaoles,peropordebajodeaquellosexpuestosporotrosautores(Ulbrichty

col., 1984). La diferencia podra explicarse a que en la investigacin realizada en 1984 por

Ulbricht se emplearonmtodos espectrofotomtricos poco precisos habindose producido

una sobreestimacinenel contenidodeHMF.En cualquier caso, laexposicinestimadaes

variosrdenesdemagnitudmsaltaqueparaotroscontaminantesdeprocesadotalescomo

laacrilamidaoelfurano.Anas,losdatosqueexistenenlabibliografasobrelaexposicina

HMFsonmuylimitados,deahlanecesidaddellevaracaboestudiosadicionalesparaevaluar

tantoelcontenidomediocomoelmximoen lasdiferentespoblaciones.Adems, sehade

tenerencuentaqueelalmacenamientoylascondicionesdecocinadodelospropiosalimentos

podranafectaralaexposicinrealdeHMFcomoocurreconotrassustanciastxicas(Gkmen

yMorales,2012).

1.6.Estrategiasdemitigacin

ElHMFseformaporeltratamientotrmicoyseencuentraenalimentosprocesados,deahla

necesidaddedesarrollarestrategiasparareducirsu formacinduranteelcocinado.Hasta la

fechasedisponedeabundanteinformacinsobrelacinticadelasreaccionesimplicadasylas

energas de activacin en sistemas modelo que simulan procesos en diferentes matrices

alimentarias. Sin embargo, es importante tener en cuenta el balance riesgo/beneficio y la

calidadglobaldelproductofinal.Resultaratilestablecerunabasededatosparaconocerqu

familiadealimentoscontribuyenmsa la ingestadiariadeHMF,yconsiderarapartirdeah

mtodosprcticosparareducirelcontenidoenaquellosproductosprioritarios.Teniendoen

cuenta los posiblesmecanismos de formacin, previamente comentados, los factores que

afectanalaformacindeHMFseindicanenlasiguientetabla(GkmenyMorales,2012).

42

Factores Correlacin

Precursores(azcares,aminocidos)

Temperatura

Tiempo

pH

Humedad

Positiva

Positiva

Positiva

Negativa

Negativa

Tabla7.FactoresqueafectanalaformacindeHMFenlosalimentos.

Acontinuacinsedescribenalgunasestrategiasdemitigacin,teniendoencuentaqueen la

actualidadnoesposibleunaeliminacincompletasinafectaralaspropiedadesorganolpticas

yalaseguridaddelospropiosalimentos.

1.6.1.Seleccindemateriaprima

Losazcares (hexosas)y losaminocidosson losprincipalesprecursoresde la formacinde

HMF. Los alimentos ricos en hidratos de carbono son, por tanto, los productos donde se

encontrarn losmayoresnivelesdeHMF.Limitandoelcontenidodeazcares reductores se

reducirasuvezsuformacin.Sinembargo,cuandosesustituye,porejemplo,enlasgalletas

laglucosaofructosaporsacarosa,seproduceparadjicamenteunaumentoenlosnivelesde

HMF a temperaturas superiores a 250 C. Adems, utilizando bicarbonato amnico como

gasificante,lasacarosasedescomponemuyrpidamenteyporconsiguienteproducemayores

nivelesdeHMF(Gkmenycol.,2007).

El uso de ingredientes con un elevado contenido de HMF como jarabe de azcar omiel,

incrementaran las concentraciones en el producto final. Sin embargo, estos ingredientes

reforzaran la aceptabilidad del consumidor, de ah la necesidad de alcanzar un equilibrio

riesgo/beneficio.Enciertoscasosesposiblevariaralgunoscomponentesantesdeltratamiento

trmico,comoporejemplolacomposicindelamasaduranteelprocesadodeloscerealesy

de las frmulas infantiles.Generalmente, si se aumenta el pHde lamasa enproductosde

panadera,losnivelesdeHMFdisminuyen(Gkmenycol.,2007).

1.6.2.Seleccindevariablesdeprocesado

La RM y la carmelizacin se ven favorecidas en gran medida por la relacin

temperatura/tiempo y las condiciones delmedio de reaccin (contenido de agua, acidez,

cationesdivalentes).Deestamanera,disminuyendolatemperaturaduranteelprocesamiento

HIDROXIMETILFURFURAL..........

Introduccin//43

y/oalmacenamientoseconsiguedisminuir la formacindeHMFdeunamanerasencilla.En

general, el aumento del tiempo de almacenamiento tambin aumenta la cantidad deHMF

formado.Condicionesdebajaymoderadahumedadseasocianaunaumentoenlaformacin

deHMF,debidoaquelaRMseveaceleradaporladeshidratacindelazcar.

1.6.3.Eliminacintraselprocesado

En condiciones extremas de procesado se ha observado un descenso del HMF en galletas

debidoa ladegradacindesteaproductossecundarios, lamayorpartevoltiles (Ameury

col., 2006). Sin embargo, estas condiciones afectarn de forma drstica a la calidad del

productopudiendollegaragenerarseotroscompuestosindeseadoscomolaacrilamida.

44

2.Acrilamida

Laacrilamida(2propenamida;CASNo.79061)esunamolculaquecontieneundobleenlace

electrfiloyungrupoamida.Setratadeunasustanciablancae inodora,queatemperaturas

superioresa84,5Csufrepolimerizacinespontnea(Friedman,2003).Alserunaamida,

insaturada le permite reaccionar con compuestos nucleoflicos a travs de adiciones de

Michael.Debidoa la limitadaconjugacinqueenvuelvealdobleenlace,carecedeunfuerte

grupocromforoparaladeteccinUVVISytampocopresentafluorescencia.EnlaTabla8se

presentalaestructuraypropiedadesdelaacrilamida.

Estructura

C3H5NO

Pesomolecular

Puntodefusin

Puntodeebullicin

Solubilidad

71,08g/mol

84,5C

136Ca25mmHg

agua,metanol,etanol

Tabla8.Estructuraypropiedadesdelaacrilamida.

2.1.Historia

La acrilamida se ha utilizado en la industria desde 1950. Puede polimerizarse fcilmente y

formarpoliacrilamidascuyasprincipalesaplicacionesdestacanen la industriadelpapel,enel

tratamiento de aguas residuales, como acondicionadores del suelo, y como agentes

cementantesenlaconstruccindecimientosdepresas,tnelesycolectores.Esteltimouso

fueelque lleva sudescubrimientoen losalimentos.Durante la construccindeun tnel

ferroviariobajoun lagoenelao1997enSuecia, seutilizcomoagente sellanteunagran

cantidaddeprecursoresdelpolmerodeacrilamida, filtrndoseporaccidentepartealagua,

contaminando arroyos cercanos y aguas subterrneas. Los primeros efectos fueron la

presenciadeanimales(ganadoypeces)conparlisis,ademsdesntomasneurotxicosenlos

trabajadoresdedichotnel(Reynolds,2002).

Enlaposteriorinvestigacindelaccidentesedescubriunaumentosignificativoenlosniveles

delosaductosdeacrilamidahemoglobinaenlostrabajadores(Hagmarycol.,2001),ascomo

en el ganado y en los peces del entorno. Tras nuevas investigaciones, se descubrieron

ACRILAMIDA..........

Introduccin//45

cantidades inesperadas de aductos en personas que vivan fuera de la zona contaminada

(Tarekeycol.,2002).Elhallazgoenanimalesyganadosexpuestosalafugadeconcentraciones

de aductos inferiores a las de las personas no relacionadas con el accidente, hizo que se

considerara laposibilidaddeque laexposicinen loshumanosprovinieradeotrafuente: los

alimentoscocinados.Paraello,sellevaronacabounaseriedeinvestigacionesenanimalesde

experimentacinalimentadosdurantesemanasconalimentosfritos,loquepermitiobservar

que aqullosque consumieronunadieta rica en fritospresentabanmayoresnivelesde los

aductoshemoglobinaacrilamida (Tarekeycol.,2000).No fuehastaabrilde2002,cuando la

AdministracinNacional deAlimentos de Suecia anunci concentraciones de acrilamida en

unaampliavariedaddealimentosfritosyhorneados (SNFA,2002).Esteanunciofueseguido

rpidamente por otras publicaciones, informando de concentraciones hasta del orden de

partespormillnenalimentosricosenhidratosdecarbonotratadosaaltastemperaturas(U.S.

FDA, 2002). Estos resultados fueron confirmados por otros investigadores, de modo que

comenzaronlosesfuerzosinternacionalesparacomprendery,finalmente,reducir,elriesgode

lapresenciadeacrilamidaenlosalimentos.

2.2.Toxicologa

Eldescubrimientode laacrilamidaen losalimentosprovocundebatepblicodebidoa la

relativa faltadedatostoxicolgicosenhumanosyalconocimientode lagenotoxicidadde la

acrilamidaenclulasyanimalesdeexperimentacin.

2.2.1.Absorcin,distribucin,metabolismoyexcrecin

Absorcinydistribucin

Apartirdeestudios toxicocinticos llevadosa cabo conacrilamidamarcada isotpicamente

(13Cy14C)sehademostradoquesuabsorcinpuedeocurriratravsdediferentesrutascomo

laexposicinoral,drmicaoporinhalacin.Debidoasupolaridad,solubilidadenaguayasu

bajopesomolecular, laacrilamida se absorbemuy fcilmente (Shipp y col.,2006).Una vez

absorbida,laacrilamidasedistribuyerpidamenteatravsdelasangrealosdiferentestejidos

yrganos,comoelmuscular,lapiel,elhgado,losriones,elcorazn,elcerebrooelpulmny

sehadetectadotambinenlaplacentayenlalechematerna(Schettgenycol.,2004).

Metabolismo

Posteriormente,laacrilamidaseconvierterpidamenteensuepxidogenotxico:glicidamida.

EstaepoxidacintienelugarenelhgadoporlaaccindelcitocromoP4502E1monooxigenasa

46

(CYP2E1) mediante la oxigenacin del doble enlace de la acrilamida (Friedman, 2003).

Posteriormente,laglicidamidaylaacrilamidapuedenformarconjugadosconelglutatin(GSH)

atravsde laenzimaglutatinStransferasa(GST)(Paulssonycol.,2005).Unavisingeneral

delasprincipalesrutasmetablicasdeacrilamidasedescribeenlaFigura7.

--------------

Figura7.Metabolismodelaacrilamida(basadoenSumnerycol.,2003).

La glicidamida tambin puede ser hidrolizada a travs de la hidrolasa epxido (EH) a 2,3

dihidroxipropionamidaogliceramida(Sumnerycol.,2003).Losconjugadosde laacrilamiday

la glicidamida con el glutatin se convierten en conjugadosdel cidomercaptrico (AAMA,

AAMAsulfxido,GAMA, isoGAMA) loscuales sonexcretadosposteriormentea travsde la

orina. La participacin del CYP2E1 en la conversin de la acrilamida a glicidamida se ha

demostradoenhumanos,tantoenestudios invivocomo invitro(Doroshyenkoycol.,2009).

Ambas son sustancias electrfilas con una fuerte afinidad por sitios nucleoflicos. En este

sentido,sehacomprobadolaformacindeaductostantoconelgrupoaminodelresiduoN

terminaldelavalinacomoconelgrupotioldelacistenadelahemoglobina(Trnqvistycol.,

ACRILAMIDA..........

Introduccin//47

2008),siendolaglicidamidamsreactivahacialasprotenasyelADNquelapropiaacrilamida.

Sinembargo,laepoxidacindelaacrilamidaaglicidamidaparecesermenosimportanteenlos

humanosqueenlosroedores(Fennellycol,2006).

Excrecin

Laeliminacinseproduceprincipalmenteenlaorinacomoconjugadosdelcidomercaptrico

(Figura7).Lamayorparte (4070%)de laacrilamidamarcada,queesabsorbidaen ratas,se

excretaenlaorinacomometabolitos(Shippycol.,2006)Laexcrecindeacrilamidaenforma

demetabolitosurinarioscomienzapocodespusdelaexposicinycercadel50%esexcretado

en24horas(Fennellycol,2006).Adiferenciadelosaductosdehemoglobina,losmetabolitos

urinarios del cidomercaptrico pueden dar idea de una exposicin a corto plazo (que va

desdehorashastaunosdas).Ademshayquetenerencuentaqueestosmetabolitosestn

muyinfluenciadosporfactorescomoelestilodevidaylaedad,yaquesehademostradoque

losniosyadolescentesexcretanconcentracionessignificativamentemayoresdelmetabolito

glicidamida(Hartmannycol.,2008).

2.2.2.Toxicidad

Neurotoxicidad

Los estudios sobre neurotoxicidad en humanos se refieren a la exposicin ocupacional de

trabajadoresatravsdelaabsorcinporvacutneaoporinhalacin.Afectatantoalsistema

nerviosocentralyperifricocomoalasterminacionesnerviosas,produciendolainhibicinde

la liberacin de neurotransmisores y la degeneracin del nervio terminal (LoPachin y col.,

2008). Recientemente, se ha sintetizado un derivado de lamelatonina que ha demostrado

tener efecto protector frente a la neurotoxicidad causada por la acrilamida (Ahmed y col.,

2010).Enestudiosrealizadosconratasyratones,elnivelsinefectoobservable(NOEL)parael

efectoneurotxicosehaestimadoentre0,2y10mg/kgpesocorporal/da,muyporencimade

laexposicindiettica.Sinembargo,sehaencontradoquelaneurotoxicidaddelaacrilamida

podraseracumulativa,porloquelaexposicindietticapodranoserinsignificante(LoPachin,

2004).

Carcinogenicidad

Desde1994,laAgenciaInternacionaldeInvestigacinsobreelCncer(IARC)haclasificadoala

acrilamida como sustancia probablemente carcinognica en humanos. Varios estudios

realizados en roedores apoyan dicha evidencia, ya que puede causar tumores en diversos

rganoscomoelpulmn,tero,piel,cerebro,etc.Ademspuedeafectara lareparacindel

48

ADNyprovocar lasntesisnoprogramadadelmismotantoen lasclulasmamariashumanas

comoenlostejidosdelasratas(Laffertyycol.,2004).

La oxidacin de la acrilamida a glicidamida es un requisito previo para estimar su

genotoxicidaddebidoaqueestaltimapresentamayorreactividadparaformaraductosconel

ADN (Rice, 2005; Tareke y col., 2006). Aunque la acrilamida y la glicidamida reaccionan

directamente con la hemoglobina, slo la glicidamida lo hace extensamente con el ADN,

formando el aducto N7GAGua (N7(2carbamoil2hidroxietil)guanina) y en menor

proporcinelaductoN3GAAde(N3(2carbamoil2hidroxiethil)adenina)(Figura7)(Dybingy

col.,2005;Doergeycol.,2005).Portodoello,laglicidamidahademostradosermutagnicay

genotxica in vitro e in vivo. Sin embargo, en un estudio realizado en bacterias y lneas

celularesdemamferossehademostradoquelaacrilamidanoesgenotxicainvitroyaqueno

seactivmetablicamenteaglicidamida(Koyamaycol.,2011).Porotraparte,laextrapolacin

de estos resultados a los humanos no es tan evidente, entre otras cosas por los elevados

niveles de exposicin utilizados en los estudios llevados a cabo con animales y clulas en

comparacin con la exposicin a travs de los alimentos, las diferencias en las vas de

exposicinascomoenelmetabolismo(Dybingycol.,2005).

Hastaahora,losestudiosepidemiolgicosnohanrespondidodeformaclaraysinningntipo

deambigedada lapreguntadesi laexposicindietticaa laacrilamidapuedeaumentarel

riesgo de cncer en los humanos. Algunos resultados coinciden en sealar que no hay

asociacinentrelaingestatotaldeacrilamidaenladietayelriesgodecontraeralgunostipos

decncer(revisindeMucciycol.,2009),mientrasqueparatiposdecncercomoelrenal,de

esfago,deovarioodemama, los resultadosepidemiolgicossoncontradictorios (Wilsony

col., 2010; Larsson y col., 2009;Hogervorst y col., 2008; Lin y col., 2011). Sin embargo, de

formagenerallosestudiosepidemiolgicossuelentenerlimitaciones,yaseaenlaevaluacin

delaexposicin(generalmenteconcuestionariosdefrecuenciadeconsumodealimentos),las

coexposicionesolacapacidadlimitadaparadetectarpequeosaumentosenlaincidenciade

tumores (Mucciycol.,2006).Por tanto, laasociacin realentre laexposicinaacrilamidaa

travsdelosalimentosyelriesgodealgunostiposdecncerpodrasermayorquelosriesgos

relativosestimadosatravsdelosestudiosepidemiolgicos.

Evaluacinderiesgos

ElReglamento (CE)N1272/2008sobresustanciasde riesgohaclasificadoelmonmerode

acrilamida como carcingeno de categora 1BH350 y mutgeno de categora 1B340 en

ACRILAMIDA..........

Introduccin//49

humanos (Reglamento (CE)N1272/2008). La acrilamida, como carcingeno genotxico, se

consideraquenotieneumbrallmitedeexposicinparasureaccinconelADNyporlotanto,

efectosadversos(O'Brienycol.,2006).Enelreadeseguridadalimentaria,talescompuestos

sontratadosprincipalmenteporelprincipio"ALARA",loquesignificaquelosnivelesdebenser

"tan bajos como sean razonablemente posibles". Sin embargo, este enfoque se basa

nicamenteenlaidentificacindelpeligroynotieneencuentanielpotencialcancergenoni

laexposicinhumana.

Otra de las tcnicas generalmente empleadas para caracterizar el riesgo para los seres

humanoseslaextrapolacindelarelacindosisrespuesta.Losdatosobtenidosconanimales

debenextrapolarse adosismuy inferiores a lasestudiadasparapo