PEMBUATAN PETA RESTRIKSI DNA PLASMIDI. Tujuan Mahasiswa dapat
menentukan peta restriksi DNA plasmid. II. Dasar Teori Plasmid
adalah DNA ekstrakromosomal yang biasa dimiliki oleh bakteri dan
terletak di luar DNA kromosom pusat sehingga sifatnya independen
dan tidak diatur oleh kromosom pusat. Tidak semua bakteri memiliki
plasmid. Plasmid memiliki kandungan base pair yang lebih kecil
dibandingkan dengan DNA kromosomal dan berbentuk sirkular. Ukuran
dari plasmid bervariasi dari 1- lebih dari 400 kilo pasangan basa
(kbp). Dalam satu sel ada terdapat ratusan plasmid. Jenis DNA ini
sering digunakan untuk keperluan transformasi organisme dalam
bioteknologi. Dalam keperluannya di dalam bidang bioteknologi,
plasmid memiliki peran sebagai kendaraan bagi fragmen DNA asing
untuk bisa masuk ke dalam suatu sel sehingga bisa didapatkan
mikroorganisme rekombinan. Plasmid yang dimasukkan umumnya diberi
marker, marker yang umum adalah gen antibiotik. Plasmid mengandung
setidaknya 1 DNA sequence yang berfungsi sebagai ORI,yang
memungkinkan DNA plasmid diduplikasi secara independent dari DNA
kromosomal (Anonim,2006). Secara kasar proses penyiapan plasmid
untuk transformasi ini, mula-mula plasmid dipotong dan fragmen DNA
asing kemudian disisipkan ke dalam plasmid pada bagian yang
terpotong tersebut. Selanjutnya backbone plasmid disambung kembali
atau yang lebih dikenal dengan peta restriksi. Peta restriksi
merupakan gambaran hasil potongan DNA plasmid, ketika plasmid
dipotong dengan enzim restriksi tertentu. Peta ini penting,
terutama dalam pengaturan konstruksi plasmid yang akan digunakan
dalam rekayasa genetika. Ada beberapa cara untuk membuat peta
restriksi DNA plasmid. Cara pertama adalah dengan mengetahui urutan
DNA plasmid secara keseluruhan, lantas menggunakan sisi pemotongan
enzim restriksi tertentu, kemudian akan dapat disusun peta
restriksi suatu plasmid. Cara kedua adalah dengan cara memotong
langsung plasmid menggunakan beberapa enzim restriksi dan
merekonstruksi plasmid yang telah dipotong tersebut. Enzim
restriksi (atau endonuklease restriksi) adalah jenis enzim yang
dapat memotong DNA double helix. Enzim ini memutuskan ikatan
peptide DNA tersebut tanpa merusak basa-
basa nitrogennya. Enzim ini dapat ditemukan pada bakteri E.Coli
yang melalui penelitian merupakan respon pertahanan bakteri
tersebut dari serangan virus. Enzim restriksi mengkatalis atau
memotong kedua strand DNA pada specific site yang disebut sebagai
recognition site. Biasanya recognition site ini panjangnya 4-8 base
pairs DNA. Terdapat kurang lebih 100 enzim restriksi yang berbeda
untuk memotong pada recognition site.
Gambar 1 : Pemotongan DNA Plasmid dengan Sticky end pada
Restriction SiteAda tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu
tipe I, II dan III. Enzim restriksi
endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil
pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan
enzim restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau
dekat dengan sekuens yang diinginkan (gambar 2).
Gambar 2. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi
endonuklease
tipe I, II, dan III. Contoh enzim restriksi endonuklease tipe II
adalah EcoRI. Enzim EcoRI diisolasi dari E. coli dan memotong
molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5- GAATTC-3(Hirma et al,
2008). Ada 2 jenis pola pemotongan plasmid, yaitu sticky end dan
blunt end. Enzim restriksi memotong rantai DNA dengan sticky ends
yang dapat cocok dan kemudian melekat pada rantai sticky ends
rantai DNA yang lain yang dipotong dengan enzim restriksi yang
sama. Kemudian DNA ligase merekatkan potongan DNA yang sticky ends.
Dan untuk memudahkan proses seleksi, pada plasmid juga ditambahkan
marker yang bisa berupa gen resisten antibiotik ataupun gen
fluorescence. Hal ini sering digunakan sering digunakan dalam
memproduksi senyawa seperti insulin dan interferon atau dapat juga
digunakan untuk memotong gen dalm sel atau organisme untuk
mendapatkan keuntungan tertentu (Hirma et al, 2008). Pada umumnya
molekul DNA memiliki recognition site yang spesifik. Enzim
endonuklease restriksi yang digunakan dalam percobaan ini adalah
Pst I yang berasal dari Providencia stuartii dan HindIII yang
berasal dari Haemophilus influenzae Rd(1). Enzim Pst I Hind III
Recognition site 5'CTGCAG 3'GACGTC 5'AAGCTT 3'TTCGAA Cut 5'---CTGCA
G---3' 3'---G ACGTC---5' 5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'
Pada percobaan ada dua tahap yang akan dilakukan yaitu memotong
DNA plasmid dengan enzim restriksi (Pst I dan Hind III), serta
melakukan elektroforesis untuk melihat hasil dari pemotongan DNA
plasmid apakah proses isolasi yang dilakukan telah berhasil atau
tidak. Pada restriksi DNA plasmid, Sebelum plasmid dipotong dengan
enzim restriksi endonuklease, ke dalam tabung eppendorf berisi
larutan plasmid ditambahkan ditambahkan : ddH 2O, RE buffer
(restriction endonucleases buffer), BSA buffer (bovine serum
albumin), dan enzim restriksi yang diinginkan. RE buffer yang
ditambahkan, sesuai dengan namanya, digunakan untuk mempertahankan
pH, dan menciptakan lingkungan yang ionic strength yang cocok
dengan enzim bersangkutan (spesifik untuk setiap enzim). Walaupun
demikian, kegunaan
utama dari buffer adalah mengatur pH. Aktivitas dari enzim dapat
dipengaruhi oleh suhu dan pH. Karena itu, pemberian pH yang optimum
untuk memaksimalkan kerja enzim sangatlah penting. Sedangkan BSA
buffer memiliki peran sebagai stabilisator bagi enzim restriksi
serta mencegah terjadinya adesi antara enzim dengan dinding tabung
reaksi (eppendorf dalam kasus ini). BSA tidak akan berpengaruh pada
enzim yang tidak membutuhkan stabilisator. Jadi, penambahan BSA
tidak akan menimbulkan efek yang buruk pada reaksi yang terjadi.
Setelah penambahan reagen-reagen ini, barulah enzim endonuklease
restriksi
ditambahkan, baik secara tunggal maupun campuran. Lalu,
dilakukan inkubasi pada suhu yang sesuai. Yang dimaksud dengan suhu
yang sesuai di sini adalah suhu di mana enzim endonuklease
restriksi yang digunakan memiliki aktivitas optimum. Setiap enzim
memiliki suhu optimumnya sendiri. Suhu ini biasa berhubungan erat
dengan suhu tempat hidup organisme dari mana enzim endonuklease
restriksi yang bersangkutan berasal. Suhu 37oC dipilih dalam
percobaan ini karena enzim endonuklease restriksi yang digunakan
berasal dari organisme mesofilik. Seperti yang telah dikemukakan
sebelumnya, aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH dan suhu. Inkubasi
tidak boleh dilakukan terlalu lama karena dapat terjadi reaksi
pemotongan berlebihan oleh enzim yang tidak diharapkan. Enzim
restriksi endonuklease yang digunakan juga tidak boleh melebihi
konsentrasi konsentrasi tertentu ( >100 U/ug dari DNA ).
Keberadaan enzim yang terlalu pekat dalam tabung reaksi dapat
mengakibatkan terjadinya star activity, dimana enzim endonuklease
restriksi memotong pada sequence yang tidak spesifik atau abnormal.
Berikut ini beberapa faktor faktor lain yang menyebabkan terjadinya
star activity : Tingginya pH (>8) Rendahnya ionic strength ( 5 %
Keberadaan pelarut organik seperti etanol dalam reaksi.
Terjadinya star activity ditunjukkan oleh adanya smear pada
hasil elektroforesis.
Dalam percobaan ini, untuk pengecekan keberhasilan isolasi dan
untuk melihat hasil pemotongan plasmid dengan enzim endonuklease
restriksi digunakan teknik elektroforesis. Arti kata elektroforesis
mengarah ke electromotive force (EMF) yang digunakan untuk
mendorong atau menarik molekul-molekul di dalam matriks gel dengan
cara meletakkan molekul-molekul yang ingin diseparasi itu ke dalam
sumur-sumur di dalam gel dan mengalirkan arus listrik ke dalamnya.
Molekul-molekul akan bergerak di dalam matriks dengan kecepatan
yang berbeda-beda dan akan mengarah ke katoda jika molekul itu
bermuatan positif dan mengarah ke anoda jika molekul itu bernuatan
negatif. Gel pada elektroforesis adalah suatu matriks yang
berfungsi untuk menseparasi molekul-molekul yang bersangkutan. Pada
sebagian besar kasus, gel yang digunakan untuk elektroforesis
merupakan crosslinked polymer yang komposisi dan porositasnya
disesuaikan berdasarkan berat dan komposisi sampel. Jenis gel yang
sering digunakan adalah agarosa dan polyacrylamide. Pada percobaan
ini, gel yang
digunakan adalah agarosa. Berikut adalah struktur dasar polimer
linear dari agarosa :
Gambar 2 : Struktur gel Agarosa Elektroforesis gel merupakan
teknik analisis yang penting dan sering dipakai dalam bidang
biokimia serta biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip
dengan kromatografi, yaitu memisahkan campuran bahan-bahan
berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan
dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang
berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis). Dalam
elektroforesis, agarosa biasa digunakan untuk memisahkan DNA atau
RNA berukuran besar (lebih dari beberapa ratusan basa). Adapun
kemampuan gel untuk menseparasi fragmen-fragmen DNA dengan ukuran
yang berbeda-beda terletak pada frictional drag (sentuhan atau
interaksi antar sesuatu dengan yang lainnya). Elektroforesis
gel agarosa dapat digunakan untuk memisahkan molekul DNA yang
bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik DNA akan
bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin
besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat
molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan cara
membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen
molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya.
Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar
ultraviolet setelah terlebih dahulu gel ditambahkan larutan
ethidium bromide dalam pembuatannya. EtBr yang berikatan dengan DNA
di dalam gel agarosa akan berpendar ketika divisualisasi dengan
lampu UV 254 nm. Hal ini dikarenakan radiasi sinar UV akan diserap
oleh DNA dan energinya akan ditransmisikan ke EtBr sehingga EtBr
yang berikatan dengan DNA dapat berpendar. Ketika medan listrik
dinyalakan melalui gel, DNA yang bermuatan negatif bermigrasi dari
anoda ke katoda. Tingkat laju migrasi dari DNA dapat diukur dari
beberapa faktor yaitu : a. Ukuran molekul DNA Semakin besar molekul
DNA maka proses migrasi semakin lambat. Hal ini disebabkan karena
DNA yang ukurannya besar sulit untuk menembus pori-pori gel
agarose. b. Konsentrasi agarosa Semakin tinggi konsentrasi agarose
maka laju migrasi semakin kecil karena konsentrasi agarosa yang
semakin tinggi menyebabkan pori-pori gel semakin kecil. c.
Konformasi DNA Konformasi DNA ada 3 yaitu superhelix
sirkular(bentuk I), sirkuler terbuka (bentuk II) dan linier (bentuk
III). Tingkat mobilitas dari ketiga bentuk ini berbeda-beda
tergantung dari kondisi yang ada (tegangan listrik, kekuatan ionik,
buffer,dsb). Pada beberapa kondisi, DNA superhelix bisa bermigrasi
lebih cepat daripada DNA sirkuler. Pada kondisi lain bisa
sebaliknya. Etidium bromide juga berpengaruh pada konformasi DNA,
makin banyak etidium bromide yang ditambahkan, besar DNA superhelix
meningkat sehingga laju migrasi menurun. Pada titik kritis,
penambahan EtBr menyebabkan DNA superheliks berada pada kecepatan
minimum. Jika ditambah lagi maka DNA superhelix dapat menjadi
kompak dan mobilitasnya meningkat drastis. Bentuk II dan III yang
berubah atau menurun secara bertahap seiring proses penetralan
muatan DNA oleh eter.
d.
Tegangan yang digunakan Pada tegangan rendah, laju pergerakan
fragmen DNA linier harus sesuai dengan tegangan yang diberikan.
Oleh karena itu ketika medan listriknya meningkat, maka pergerakan
d DN berukuran besar akan meningkat dengan cepat. Namun jika
tegangannya ini dinaikkan maka pemisahannya semakin tidak efektif.
Untuk mendapatkan fragmen DNA yang lebih besar dari 2 kb maka harus
menggunakan tegangan tidak lebih dari 5 V/cm.
e.
Arah medan listrik Molekul DNA yang lebih besar dari 50-100kb
panjangnya akan berpindah dengan laju yang sama jika tegangan
listriknya selalu konstan. Jika tegangan listrik diubah secara
periodik, DNA dipaksa untuk mengubah jalur. Karena molekul DNA
berukuran lebih besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk
kembali ke bentuk semula. PFGE dapat digunakan untuk memisahkan
sejumlah besar DNA.
f.
Komposisi basa dan suhu Kelakuan DNA ketika di elektroforesis
pada gel agarosa tidak terlalu dipengaruhi oleh komposisi basa DNA
atau suhu ketika gel tersebut bergerak. Pada gel agarosa, kecepatan
pergerakan fragmen DNA yang berbeda ukuran relatif tidak berubah
antara 4 300C. Secara umum gel agarosa bergerak pada suhu ruang.
Walaupun begitu gel yang berisi kurang dari 0.5% agarosa, gel
agarosa yang mudah meleleh pada suhu rendah cenderung mudah rusak
dan gel tersebut akan memiliki hasil terbaik pada 40C ketika gel
lebih kuat.
g.
Adanya Intercalating Dyes Etidium bromide, pewarna flourosence
yang digunakan untuk mendeteksi DNA pada agarose dan gel
polyacrylamide dapat mengurangi mobilitas elektroforesis dari DNA
linear sekitar 15%. Pewarna tersebut melekat antara pasangan basa,
memperpanjang lengan dari DNA linear dan DNA sirkuler yang terbuka
dan membuatnya semakin kaku.
h.
Komposisi buffer elektroforesis Mobilitas elektroforetik dari
DNA dipengaruhi dari komposisi dan kekuatan ionik dari buffer
elektroforesis. Tanpa adanya ion, konduktifitas listrik kecil dan
migrasi DNA sangatlah pelan. Dalam buffer dengan kekuatan ionik
yang kuat, konduktifitas listrik sangat efesien dan sejumlah besar
panas terbentuk. Dalam kasus terburuk maka gel akan meleleh dan DNA
terdenaturasi.
III. Alat dan Bahan Alat- alat yang digunakan :
Tabung eppendorf Parafilm Tip putih Satu set peralatan
elektroforesis horisontal Mikropipet 1-10 L Satu set peralatan
pembuatan gel agarosa Erlenmeyer Isolasi Mikrosentrifuge Beaker
glass
Bahan bahan yang digunakan:
Sampel DNA plasmid ddH2O RE, BSA, TAE buffer Enzim Restriksi
(Pst I dan Hind III) EtBr EDTA Marker
IV. Cara Kerja 1. Membuat mastermix dengan komposisi sebagai
berikut: Single Digest (pemotongan dengan salah satu enzim, Pst I
atau Hind III) Sampel A: Sampel B: ddH2O 15,5l ddH2O 14,5l Buffer 2
l Buffer 2 l Enzim 0,5 l Enzim 0,5 l Double digest (pemotongan
dengan kedua enzim, Pst I + Hind III) Sampel A: Sampel B:
ddH2O 15l Buffer 2 l Enzim 0,5 l 2. Menambahkan sampel DNA
plasmid.
ddH2O Buffer Enzim Untuk sampel
14l 2 l 0,5 l A, ditambahkan DNA plasmid 2l,
sedangkan untuk sampel B, ditambahkan DNA plasmid 3 l. 3.
Menginkubasi campuran dalam water bath 37 oC selama 1 jam. 4.
Setelah inkubasi, melakukan elektroforesis agarosa untuk melihat
pola hasil potongannya.
V. Hasil PercobaanTidak muncul band
Pst I Hind III
marker
campuran
Band dari kelompok 7
WellMarker Pst I Hind IIICampuran
1 2 1 2 12
3
4
VI. Perhitungan
cm (x) 2.25 2.4 2.6 2.8 3
panjang (bp) 10000 8000 6000 5000 4000
log bp (y) 4 3.90309 3.77815 3.69897 3.60206
3.2 3.4 3.65 4 4.5 5.25 5.8 6.5 7.5
3500 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250
3.54407 3.47712 3.39794 3.30103 3.17609 3 2.87506 2.69897
2.39794
A = 4.522183884 B = -0.29049316 R2 = 0.975531886 Persamaan
linear : Y = 4.522183884 + (-0.29049316)x Jarak migrasi potongan
plasmid (cm) kelompok 7 Enzim Band 1 Band 2 Band 3 Band 4 Pst I 2.8
3.35 Hind III 2.8 3.95 Campuran 3.35 3.95 4.1 6.0
Setelah dimasukkan ke dalam persamaan linear Ukuran plasmid (bp)
Pst I 5114.498 3540.233 Hind III 5114.498 2369.932 Campuran
3540.233 2369.932 2143.689 601.485 Jarak migrasi potongan plasmid
(cm) kelompok kami Enzim Pst I Hind III Campuran
Band 1 Band 2 Band 3 Band 4
2.8 3.35
2.8 3.95
-
Setelah dimasukkan ke dalam persamaan linear Ukuran plasmid (bp)
Pst I 5114.498 3540.233 Hind III 5114.498 2369.932 Campuran VII.
Pembahasan Pada percobaan kali ini praktikan ditujukan agar dapat
menentukan peta retriksi dari DNA plasmid. Peta restriksi adalah
gambaran struktural informasi DNA yang diperoleh melalui proses
pemotongan DNA tersebut dengan menggunakan enzim restriksi. Peta
restriksi biasanya dibuat dengan menggunakan lebih dari 1 jenis
enzim restriksi (Mapping Multiple Cutters). Enzim restriksi yang
digunakan dalam percobaan kali ini adalah Pst I dan Hind III
Berdasarkan dari data hasil perhitungan yang kami dapat, dapat
ditentukan band-band hasil pemotongan dari masing-masing enzim
restriksi ataupun campuran keduanya, yaitu: Pst I Hind III
Campuran
5114.498 bp
5114.498 bp
3540.233bp 2369.932 bp
3540.233bp 2369.932 bp 2143.689 bp
601.485 bp
Berikut adalah gambar dari peta retriksi DNA plasmid sampel A :
Pst I
2369.932 bp
3540.233 bp
Hind III 601.485 bp Pst I Hind III dibuat berdasarkan hasil
percobaan dari
2143.689 bp Peta restriksi DNA plasmid sampel A ini
kelompok 7, karena data hasil percobaan yang kami dapat berbeda
pada well ke-3 dimana tidak ditemukan adanya band sama sekali.
Untuk well ke-1 dan ke-2 pemisahan band sudah bisa dikatakan sama..
Tidak ditemukannya band pada well ke-3 ini bisa disebabkan oleh
konsentrasi atau jumlah dari DNA plasmid yang terlalu sedikit,
sedikitnya jumlah DNA plasmid bisa disebabkan karena kesalahan
sewaktu load ke dalam well (ada sebagian yang tertarik lagi ke
micropipet, ataupun ada juga yang keluar dan tersebar di TAE buffer
di luar well). Lalu pada sampel B juga tidak ditemukan adanya
band-band hasil pemotongan dari enzim restriksi, baik pada enzim
restriksi Pst I, Hind III, maupun campuran keduanya. Hal ini juga
bisa disebabkan sedikitnya jumlah DNA plasmid karena kesalahan
praktikan dalam load sampel. Selain itu bisa juga disebabkan adanya
star activity akibat kesalahan praktikan dalam memipet sehingga
praktikan memasukkan enzim endonuklease restriksi dalam jumlah
berlebih, hal ini menyebabkan plasmid terpotong-potong menjadi
ukuran yang lebih kecil dari seharusnya sehingga dapat bergerak
lebih cepat dibandingkan marker nya (keluar dari gel agarosa).
Kemungkinan penyebab lainnya bisa dikarenakan rusak atau
terdegradasi nya DNA oleh nuklease, ataupun bisa juga disebabkan
oleh pada saat diinkubasi pada suhu 370C ada sebagian air dalam
buffer yang menguap sehingga menyebabkan kekuatan ionik dari buffer
menurun. Selain itu semua, juga ada hal yang perlu diperhatikan
yaitu tegangan saat elektoforesis tidak
boleh terlalu tinggi dan waktu elektroforesis tidak boleh
terlalu lama, karena itu semua juga turut mempengaruhi ada atau
tidak nya band pada hasil pengamatan. VIII. Kesimpulan Peta
restriksi adalah gambaran struktural informasi DNA yang diperoleh
melalui proses pemotongan DNA tersebut dengan menggunakan enzim
restriksi. Peta restriksi biasanya dibuat dengan menggunakan lebih
dari 1 jenis enzim restriksi (Mapping Multiple Cutters). Enzim
restriksi yang digunakan dalam percobaan kali ini adalah Pst I dan
Hind III. Untuk pembuatan peta restriksi dapat digunakan suatu
metode di mana pemotongan dilakukan dengan enzim secara individu
dan secara campuran. Dengan demikian kita akan mendapatkan
band-band hasil pemotongan enzim secara individu dan data
pemotongan dari campuran enzim. Potonganpotongan band tersebut yang
nantinya akan disusun menjadi peta restriksi, berikut gambar peta
restriksi DNA plasmid sampel A : Pst I
2369.932 bp Hind III 601.485 bp Pst I
3540.233 bp
2143.689 bp
Hind III
Daftar Pustaka1. [Anonim,2006]
http://www.britannica.com/EBchecked/topic/463593/plasmid (diakses
25
September 2010)2.
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/E/Enzymes.html#lysozym
(diakses 25 September 2010)
3.
http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/Seq_Anal/Restriction_Map/restriction_map.ht
m (diakses 25 September 2010)4. Hirma, Ratna Dwi; Hariyati;
Yuniati, Afrina. (2008).
http://23bios1unsoed.files.wordpress.com/2008/11/k04-td-04-b1j006019.pdf
(diakses September 2010)
27
5.
http://biotech.biology.arizona.edu/labs/DNA_isolation_plasmid.html
(diakses 27 September
2010).6.
http://www.chembuddy.com/?left=pH-calculation&right=pH-buffer-capacity
(diakses 27
September 2010).7.
http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Restmap.html (diakses
27 September 2010). 8.
http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/cuteffects.html
(diakses 27
September 2010).9.
http://www.cinnagen.com/Loading_Buffer.htm (diakses 27 September
2010).
(http://inherent.brawijaya.ac.id/biomol/materi/midterm/GEL%20ELEKTROFORESISfat.doc)
(diakses 27 September 2010).
10. Fatchiyah,Ph.D, Gel Elektroforesis
