Tecnicas Basicas de Biologia Molecular(2)

8/14/2019 Tecnicas Basicas de Biologia Molecular(2)

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Técnicas Básicas de BiologiaMolecular

Diamar Costa-PintoFIOCRUZ



Visão da Apresentação

PCR Bibliotecas genômica e de expressão Fragmentação - digestão Separação - eletroforese Clonagem molecular Sequênciamento Southern, Northern e Western blotting

By Diamar



Diagnóstico do século 21- Podemos fazer análises genômicas,pois a maioria dos cromossomo já estãomapeados.

- O projeto genoma tem sido umagrande ferramenta para unir genomas elaboratório clínico.

Mapas Genéticos, Citológicos eFísicos

EST – Sequências expressas marcadas.cDNA curtos que ligam mapas físicos agenéticos

RFLP- Polimorfismo dos comprimentos

dos fragmentos de restrição

By Diamar



Procurar um gene dentro de um genoma

humano é comparável a procurar uma pessoasem sobrenome em uma casa sem endereçoem uma rua desconhecida em uma cidade não

identificada de um país estrangeiro.

Solange Farah

By Diamar



Enzimas de Restrição

1953 – a eficiência de replicação de umbacteriófago dependia da célula hospedeira

Verificou-se, então, a presença de nucleases Bactéria restringe o crescimento do fago eprotege o seu DNA metilando-o (modificando) Fenômeno chamado restrição/modificação

Advento das endonucleases de restrição Sítio é normalmente uma palíndrome

By Diamar



Enzimas de Restrição(continuação)

Palíndrome:ARARAARARA

OMO

OMO

ANAANA By Diamar




Reconhecem seqüências de 4 a 8 pares debases

Cortes com extremidades abruptas ou coesivas Primeira letra maiúscula é gênero e as duasoutras minúsculas são espécies 1073 – foram usadas para clonagem molecular

Pode-se recombinar DNA humano com qualqueroutra espécie Fragmentos separados por eletroforese

By Diamar




By Diamar


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Vídeo de Enzima de

Restrição

By Diamar



Eletroforese

Já conhecida desde 1930 Difundida em 1950-1960 Movimentação de moléculas submetidas a

campo elétrico Usa um substrato: papel, agarose,

poliacrilamida

Separa proteínas por cargas e peso molecular Separa ácido nucléicos por peso molecular

By Diamar



Eletroforese

+-

Horizontal

Vertical

Fonte de eletroforese

Visualização do gel de agarose

-

+ By Diamar



Eletroforese

By Diamar



Vídeo de Eletroforese

By Diamar



Clonagem Molecular

Consiste no isolamento e propagação demoléculas de DNA idênticas

Primeiro: inserto + vetor = rDNA

Segundo: rDNA + célula hospedeira =

transformação

By Diamar



By Diamar

E h é ( ) l



Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar umgene específico, com uma característica desejada, e transfere este

gene para outro organismo vivo

Célula humana Bactéria

Plasmídeo

DNA

Enzima de restrição

Tesoura genética

Transformação

DigestãoDNA da bactéria

DNA da célula humana

rDNAClonagem

By Diamar



O DNA recombinante

Não se limita a organismos de uma mesma espécie

A compatibilidade sexual torna-se irrelevante

Permite modificações em uma única geração, o queantes levaria dezenas ou centenas de gerações

By Diamar



Vídeo de Clonagem

Molecular

By Diamar



Vetor

São moléculas de transporte Moléculas de DNA

Diversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos,vírus, YACs, etc. Diferenças de tamanho de inserto

Podem ter comportar linear e/ou circular

By Diamar



Vetor(continuação)

Vetores de expressão procarióticos

Promotores fortes Sítios de ligação a ribossomos Sítios de clonagem

Vetores de expressão eucarióticos

Origem de replicação eucariótica Região de controle de transcrição e tradução,

poliadenilação de mRNA, capping Sinais especiais para processamento e secreção

By Diamar




Características gerais

Região promotora Sítio Múltiplo de Clonagem - Polylinker Gene de resistência a antibióticos Origem de replicação Gene repórter

By Diamar




PLASMÍDEOS:

Penetra naturalmente nas bactérias

Fita dupla Circular Extracromossômico

Resistência a antibióticos Vetores shuttle

Insertos até 4000 pb

pUC 18, pUC 19 By Diamar




FAGOS Vírus de bactérias Fago λ é o mais utilizado Fita dupla linear Recirculariza durante a infecção na bactéria Aceita até 20 mil pb

By Diamar




COSMÍDEOS Pequeno tamanho 4 a 6 Kb Engenherado: empacota rDNA no capsídeo do

fago para infectar bactéria Possuem seqüências cos

Aceitam insertos de até 50 mil pb

By Diamar

COSMÍDEOS



COSMÍDEOS

By Diamar




YACs (Yeast Artificial Chromosome)

Células hospedeiras as leveduras Comportam-se como cromossomos Aceitam 400 mil pb Possuem seqüências de DNA específicas de

levedura: telômero, centrômero e origem dereplicação

ARS: Seqüência de replicação autônoma

CEN: Seqüências centroméricas

By Diamar

E h i G éti P d ã é i



Engenharia Genética – Produção em série

- Hormônio de crescimento

- Insulina humana

- Vacina da Hepatite B

- Hormônio sexuais

By Diamar



Sequenciamento

Frederick Sanger (1977), Inglaterra

Segundo Prêmio Nobel Síntese de DNA in vitro por término

didesoxi Mapa físico dos genes e dos

cromossomos

By Diamar



Sequenciamento(continuação)

Hood: Semi-automatizado (1986)

Venter: Genoma de bactéria usandoddNTPs fluorescentes automatizados,robóticas e PCR (1995)

Perkins-Elmer Corp: Comercializado oSequenciamento totalmente automatizado

(1999) By Diamar



ConsideraçõesP

P

BN

A

C

G

T

U

OH

P

OHOH

RiboseC1

C2C3

C4

C5

P

P

BN

A

C

G

T

OH

P

OHOH

dNTP

PentoseC1

C2C3

C4

C5

Ácido ribonucleico Ácido desoxirribonucleico

O - Necessáriopara ligaçãofosfodiéster

5’ 3’

Polimerização

ddNTP (Didesoxinucleotídeo)NTP

By Diamar

Estuda a integridade da sequência de um DNAld A li dif t t h d



molde. Analisa diferentes tamanhos defragmentos formados a partir de um primer e dainserção randômica de dNTPs (polimeriza) e

ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida.Sequenciamento

ddNTP

ddNTP

ddNTP

Fragmento 1

Fragmento 2

Fragmento 3

Primer

DNA molde

dNTPdNTPdNTP

dNTP

dNTPdNTP

DNA polimerase

ACGT

AC

ACG

TGCA

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S i t t ti d



Sequenciamento automatizado



Vídeo do Sequenciamento

(Cycseqpc)

By Diamar



Southern Blotting

E. M. Southern (1975) Fragmentos de DNA são separados em gel de

agarose Transferidos para membranas por ação capilar DNA é desnaturado antes ou durante a

transferência Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na

membrana

Detecta polimorfismo de DNA ou mutação By Diamar

Southern blot



Southern blot

Descrição:

- Digestão do DNA em teste com enzimasde restrição;

- Resolução dos fragmentos comeletroforese em gel de agarose;

- Transferência do DNA para membrana denylon;

- Hibridação com uma sonda de DNA ouRNA marcada com radioatividade ouquimioluminescentes

Aplicação: Alterações em um úniconucleotídeos; detecção de inserções, deleçõese rearranjos; ordenamento de fragmentos doDNA em um mapa físico; fragmentos de

cromossomo.

Com o advento da PCR seu uso tornou-selimitado.

By Diamar

Southern blot



Southern blot

46, XY.Síndrome da insensibilidade

androgênica. Vagina em fundo desaco, sem útero ou tubas uterinas.1:20.000. Testículos no abdome oucanal inguinal (confundidos comhérnias, na infância). Defeitomolecular: varia de deleçãocompleta do gene a mutações de

ponto nos domínios de ligação deandrógenos ou ligação ao DNA daproteína receptora de andrógeno.

Sonda de cDNA para ogene humano ligado ao Xde receptor de andrógeno

hibridando no genomadigerido do paciente.

Exemplo da especificidade dassondas.

By Diamar



Vídeo de Southern blot

(DNA _DetectivePC)



Northern blotting

Corrida de RNA totais ou mRNA em gel deagarose

RNAs devem ser desnaturados (formaldeído) Sensibilidade a RNAses Transferência para membrana por ação capilar Sondas de RNA ou DNA para hibridar

By Diamar



Northern blotting (Continuação)

Úteis em estudo de expressão gênica

Estudo de diferentes tecidos Estuda o padrão temporal de expressão

de genes durante o crescimento do

indivíduo

By Diamar

Northern blotting



o t e b ott g

MarcadoresrRNA

RNAs totais de raízes (R), folhas (L) e flores (F).

A – sonda de α-tubulina – hibrida todos

B - sonda de α1- tubulina – hibrida só flores

C - sonda de α3- tubulina – hibrida todos By Diamar



Western blotting

Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida Separação e caracterização de proteínas Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para

desnaturação Transferência para membrana por força elétrica

By Diamar



Western blotting (continuação)

Proteína alvo é identificada por anticorpo monoou policlonal

Revelação do sistema com anticorpo secundáriofluorescente ou radioativo

Informa o tamanho e a quantidade das proteínas

By Diamar

Western blotting



By Diamar



Western blotting Análise de proteínas por anticorpos específicos após

eletroforese e transferência para membrana.

By Diamar



Vídeo Immunoblotting

(3EIMMBLOT)



RFLPsPolimorfismo dos comprimentos dos

fragmentos de restrição

Uso de enzimas de restrição

Produção de fragmentos de DNA de tamanhoadequados para serem utilizados

As Enzimas de restrição são: previsíveis, pouco

frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos deDNA

Aplicação: compara alelos normais e afetados para

cada mutação estudada.

Mapa de Restrição



By Diamar

PCR - RFLP



By Diamar

RFLPs

P li fi d i t d



Polimorfismo dos comprimentos dosfragmentos de restrição

Um caso de erro inato do metabolismo:

G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase)

By Diamar

RFLP de Planta



DNAs genômico de Arabidopis é digerido

com EcoRI.

Southern blotting

com sonda azul everde.

F1 é heterogêniopossui fragmentos deambos os genitores.

F1 autopoliniza:

1:2:1 Ecotipodiferentes: C-Colombia, N-

Niederzenzes e H –Heterozigoto.

Oligonucleotídeo alelo-específico (ASO)



p ( )

Descrição:

- Hibridação preferencial de sonda

marcada para testar DNA com composiçãode bases complenmentar única.

Aplicação:

- Alelos de composição conhecida.

Mutação é conhecida. Revela uma únicaalteração de base. Distingue hetero ouhomozigotos para a sequência. A análise é

restrita a mutação familiar conhecida ou paradistúrbios genéticos com nº finito demutações diferentes. Ex: beta-talassemia.

By Diamar



FISH

Hibridação in situ com fluorescência Detecta DNA localizados dentro de cromossomos

Usa lâminas de microscopia Cromossomos estão em metáfase, anáfase e

interfase

Usa sondas de DNA específicas

By Diamar

FISH

(Hibridação in situ com fluorescência)




Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no

cromossomo 15 paterno.

By Diamar

By Diamar FISH




Relação evolutivaentre cromossomos.

DNA de gibãoHylobates lar

sondado com DNAHumano.

Setas indicamcromossomo 8 do

gibão.

Cromossomohumano 4 hibridacom cromossomo

(laranja) do macacoverde africano.

Evolução cromossômica em mamíferos

SSCPSingle strand conformational polymorphism



Single-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples

Método baseado na

mobilidade eletroforética.

Gel não desnaturante.

Protocolo Básico PCR do gene alvo.

DNA desnaturado.(eletroforese)

Mobilidade diferente

da normal indicamutação.

Sensível paratamanho e forma da fita

simples.

Detecta a mudançade uma base.

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SSCPSingle-strand conformational polymorphism



Single-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples

Fragmentos até200 pb – 90% desensibilidade.

Fragmentosmaiores que 400 pb- 80% desensibilidade.

(digestão )

Heterozigoto



Microarray – Chip de DNA –

Microarranjos de DNA

Southern blotting em lâmina Chips de genes Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas

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Microdisposição de oligo ou de sondas

- Microssíntese de oligos in situ (no chip )

- Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré

fabricadas

- Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes

Leitura por scanners By Diamar

MicroarrayMicroarranjos de DNA – Chips de DNA



j p

É uma técnica que emprega arranjos (arrays),que contêm um grande número de genesroboticamente distribuídos de forma ordenada emuma placa de vidro.

Pode comparar a expressão de um grandenúmero de gene, simultaneamente.

Existem lâminas de 400.000 pontos.São feitas com ponteiras de titâneo.

By Diamar





Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidossob condições normais e anormais

Sequenciamento do DNA e genotipagem





Contras Utilização

Técnica cara - Mapear mutações

Sensibilidade é reduzida - Oncogenes

Lâminas não são reutilizadas - Expressão das viasmetabólicas

Repetir várias vezes - Regiões regulatórias

de genes de levedura

Grande quantidade de - Expressão de genesmRNA (2 a 5 µg) anônimos

- Analisar 10.000 amostrasem 12 horas



Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA



Descrição:

- Hibridação do DNA emteste com disposições

ordenadas de nucleotídeosem chip de silicone.

Aplicação:

- Detecção de DNA emteste com composiçãoconhecida.

By Diamar



Referências Bibliográficas:

MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: arrayof possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31. MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase

chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65. SANGER , F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA

sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467.

SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequencesamong DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J.Mol. Biol. 98:503-517.

By Diamar



Obrigada!

By Diamar

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