Tcnicas de Diagnstico MicrobiolgicoSu funcin es identificar el agente causal de una enfermedad, en otras palabras identificar la bacteria.

Mtodos de Identificacin de Microorganismos Observacin directa del agente Cultivo (Mtodo estndar que es pauta para cualquier otro test) Deteccin de agentes estructurales y metabolitos Agentes estructurales Enzimas, toxinas o metabolitos (Ej: Staphylococcus aureus) Deteccin de cidos nucleicos Cito-histopatologa (No se ocupa por ser un mtodo invasivo) Serologa (Elisa, ltex para pesquisar anticuerpos contra microorganismo o los antgenos)Nota:El cultivo est por encima de otros test, por ejemplo el ltex. En un caso hipottico, aadimos LCR en una prueba ltex y da negativo pero en el cultivo da positivo, se deduce que si tiene una infeccin en el LCR. Caso opuesto si en el ltex sale positivo y en el cultivo negativo, se debe repetir el proceso.

DiagnosticoPrincipios bsicos Identificacin del microbio especifico que lo causa El microorganismo debe haberse cultivado de forma pura Este microorganismo debe producir la enfermedad cuando es inyectado en animales (tcnica antigua y mtodo experimental) El microorganismo debe ser aislado de los animales a los que se le administra.

Tinciones1. Tincin de Gram Cubrir el frotis con cristal violeta por 1 (minuto) Se lava con agua y se agrega lugol por 1 Se decolora rpidamente con alcohol-acetona y se lava con agua Safranina al 1% por 1. Se lava y se deja secarPermite revelar la afinidad tintorial, forma y naturalezaConocer la disposicin bacteriana2. Tincin de Ziehl Neelsen (para ver y diagnosticar tuberculosis) Se cubre el frotis con fucsina (colorante bsico) concentrada Se calienta el frotis hasta que emita vapores (2 o 3) Se decolora escurriendo alcohol-acido Se tie de contraste con azul de metileno por 30 (segundos)3. Tincin de Capsula Uso de tinta china para evidenciar presencia de capsula Tie de negro todo el frotis excepto la capsula El microorganismo se puede teir con safranina

CultivoEs una tcnica de referencia para los otros test. Requiere de microorganismos vivos Su rendimiento depende de que la muestra sea obtenida del sitio anatmico donde est ocurriendo la infeccin. Que el paciente no est usando antibiticos (para evitar negativos) La muestra debe depositarse en recipientes estriles

Medio CultivoConsisten en mezclas de elementos nutritivos de distinta naturaleza que utilizan las bacterias para su crecimientoEl agar: Es un polisacrido que sirve de soporte para el crecimiento bacterial. Se extrae de algunos tipos de algas. El extracto se filtra, luego se concentra y se deseca (deshidratar) para posteriormente disolverlo en agua caliente en una placa de 15 cm de dimetro. El producto final se solidifica al enfriarse.Salvo excepciones, no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l.No olvidar: Todo cultivo debe tener nutrientes, pH, temperatura y niveles de oxgeno favorables para el crecimiento bacteriano.

Consistencia adecuada del medio Presencia o ausencia de oxgeno y otros gases Condiciones adecuadas de humedad Luz ambiental Temperaturas entre 35C a 38C, principalmente 37C

Nota: Algunos microorganismos crecen en ausencia de oxigeno como es el caso del Clostridium perfringens, para su cultivo se genera una anaerobiosis a travs de productos qumicos que consumen oxgeno. El cefadroxilo es eficaz para tratar infecciones bacterianas del tipo anaerobias.Algunas bacterias presentan sensibilidad a la presencia de luz, como la Serratia un microorganismo que en presencia de luz por 24 horas cambia su tonalidad blanquecina a anaranjada.Por ultimo dentro de las bacterias hay quienes crecen en temperaturas desde los 20C hasta los 37, como la Listeria monocytogenes que se encuentra en verduras y carne, este patgeno es peligroso por inducir el aborto en las mujeres.

Esterilidad del MedioSe logra usualmente por autoclave

Clasificacin de los Medios de CultivoEstado FsicoPresentacinContenido de nutrienteUtilidad

Solidos

Lquidos

Semi-solidosTubo

Placa (15cm de dimetro)Enriquecidos

Comunes/Corrientes(Agar)Aislamiento primario Selectivos Diferenciados Selectivos/Diferenciados

Pruebas Bioqumicas

Los medios semi-slido y lquidos bsicamente permiten medir la motilidad de las bacterias.En el caso de los Selectivos/Diferenciados existe el Agar McConkey, consistente en: pH rojo neutro: En el caso de los G+, para diferenciar si el microorganismo utiliza lactosa o no. Si lo utiliza dejar puntos negros, caso contrario dejara puntos blancos. Cristal violeta y sales biliares.En el caso de los Tubos tenemos: Tsi, Lia y Mio (Para estas dos ltimas consultar bibliografa abajo) Agar Hierro Tres Azucares (Tsi o Tri sugar iron)Es una prueba usada para la fermentacin de la glucosa, lactosa y sacarosa y la produccin de H2S por parte de la bacteria sumndole produccin de gas. El cambio de color rojo-anaranjado (color inicial del medio) a amarillo indica fermentacin. Si se fermenta nicamente la glucosa el cambio de color del medio ocurre solamente en el fondo debido a que se encuentra 10 veces menos concentrada que la sacarosa y la lactosa, adems los radicales libres no son suficientes para hacer virar el medio.Si se fermentan los 3 azucares hay cambio de color tanto en la superficie como en el fondo. La presencia de burbujas que rompen el medio y a veces tienden a expulsarlo indica presencia de gas como producto final de la fermentacin. La produccin de H2S se manifiesta por la aparicin de un precipitado color negro debido a la reduccin de la sal de hierro presente en el medio.Inocular el medio realizando siembra mixta del microorganismo en estudio, incubar a 37 grados C por 24 horas.

INTERPRETACION A: Reaccin acida. Color amarillo A/A: Fermentacin 3 azucares K: Reaccin alcalina. Color roja naranja K/A: Fermentacin de la glucosa Burbujas: Produccin de gas K/K: No hay fermentacin de los 3 Precipitado negro: Formacin H2S

Nota bibliogrfica: TSI (Tres Azucares-Hierro) Complemento para la clase de Agentes Patgenos, sacado de http://dianayjulian.galeon.com/bioquimicas.htm

Deteccin de Antgenos y Productos BacterianosPermite un diagnstico rpido y son de utilidad en bacterias de difcil desarrollo, no reemplaza la tincin de Gram y el cultivo.

BacteriaTest RpidoMuestra

Streptococus peumoniaeLatexLCR, liquido pleural

Neisseria meningitidisLatexLCR

Chlamydia trachomatisElisaSecrecin uretral, vaginal y ocular

Cito-histopatologia Secreciones Fluidos corporales estriles (LCR, articular, peritoneal) Orina Lavados endoscpicosLas muestras son tejidos, por lo que es un procedimiento invasivo.Deteccin de anticuerpos especficos (Estudiar la clase de inmunologa: Antigeno-anticuerpo) Determinacin de IgM e IgG Tipo de respuestaImportante:Una bacteria contaminante (ambiental) es carne de perro crecen con poco. Al contrario de una bacteria infecciosa (patgena) que son de crecimiento lento