TÉCNICAS PARA A DETECÇÃO DE MUTAÇÕESstoa.usp.br/mariohirata/files/2359/13141/Metodologia+de+detecção... · Streptococcus pneumoniae Mecanismos de resistência Aos macrolídeos

TÉCNICAS PARA A DETECÇÃO DE MUTAÇÕES

Prof. Dr. Mario Hiratabiomol

Streptococcus pneumoniaeMecanismos de resistência

Aos macrolídeos

• Produção de bombas de efluxo codificadas pelos genes mefE.

Tait-Kamradt et al., Antimicrob Agents & Chemother 41:2251, 1997.

• Produção de enzimas, metilases, codificadas pelos genes erms - S. pneumoniae gene ermAM

Agem na porção 23S rRNA. Resistência cruzada com lincosaminas e estreptograminas do grupo B (fenótip o MLSB).

Leclerq et al., Antimicrob Agents & Chemother 35:1267, 1991.

Resistência a antimicrobianos que atuam na síntese protéica:

Macrolídeos

• Alterações no RNA ribossômico impedem a ligação do antibiótico

• Alto grau de resistência• Resistência cruzada a outras drogas (grupo MLS B)• Modo de disseminação: ?

Delisle & Tomalty, Microbes in Motion

Resistência mediada por efluxo ativo

• Eliminação da droga por bombas dependentes de energia

• Baixo grau de resistência • Normalmente associado a outros mecanismos• Não respeita classe de antimicrobiano: resistência

cruzada “aleatória”• Resistência intrínseca

Lewis & Lomovskaya. In Lewis et al. Bacterial Resistance to Antimicrobials, 2002, p. 61.

PneumococoBreakpoints para macrolídeos

<0.03 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 >64

MIC (µµµµg/mL) do pneumococo

Bkptatual

Bkpt propostopara pneumonia

Populaçãosensíveis

População resistente

por efluxo - mefE

População resistente

por alt. sítiogene erm

Beta-Lactamases de Espectro Ampliado -ESBL

Escherichia coli - Klebisiella pneumoniae

�Degradam todos os beta-lactâmicos com exceção dos carbapenens

� “Sensíveis” (in vitro) aos inibidores de beta-lactam ases (ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam)

�Não são normalmente detectadas por testes de sensibilidade

�Mediadas por genes plasmidiais não induzíveis

�Derivadas das enzimas TEM-1 e SHV-1

Bush et al., AAC 39:1211, 1995

ββββ-Lactamases de Importância Clínica

Grupo 2 (ESBL ou β-lact. de espectro estendido)• Patógenos : E. coli e K. pneumoniae (40% dos BGNs)• Genética : Plasmidial não induzível

• Prevalência : E. coli: 8-10%K. pneumoniae: 40-50%

• Detecção : Difícil

Bush et al., AAC 39:1211, 1995

- Baixa correlação entre teste in vitro e resposta clínica

- Laboratório deve utilizar testes específicos para detecção de β-lact.

- Amostras produtoras de ESBL devem ser considerados R aos β-lactâmicos suscetíveis a essas enzimas

Testes para Detecção de Cepas Produtoras de ESBL

• Disco difusão ou MIC com diferentes “breakpoints” (NCCLS)

• Dupla Difusão ou Disco Aproximação

• ESBL Etest®• Adição de clavulanato em discos

DETECÇÃO DE AMOSTRAS PRODUTORAS DE ESBL

Disco -aproximação

Teste confirmatTeste confirmat óório da produrio da produ çãção de ESBLo de ESBL

Klebsiella spp. e Escherichia coli

ò Teste de cefotaxima e ceftazidima,

sozinhos e associados à ácido clavulânico

ò Adição de 10 µµµµL de uma solução de ácido clavulânico de 1000 µµµµg/mL a discos contendo 30 µµµµg dos antimicrobianos

ò Aumento ≥≥≥≥5mm indica produção de

ESBL

NCCLS, M100-S11 Tabela 2A, 2002

DETECDETECÇÃÇÃO DE AMOSTRAS O DE AMOSTRAS PRODUTORAS DE ESBLPRODUTORAS DE ESBL

3 Etest®

β-lactâmicos associados a inibidores de β-lactamases

3 Critério de positividade

Redução ≥ 3.0 diluições

Razão TZ/TZL > 8

Razão CT/CTL> 8

Beta-lactamases Cromossômicas Induzíveis (Grupo 1, Classe C ou AmpC)

• Principais espécies que produzem essas enzimas:

Citrobacter, Enterobacter, Serratia e Providencia

• A exposição a ββββ-lactâmicos induz a produção de

grandes quantidades de enzimas � resistência às

cefalosporinas de 2a. e 3a. gerações, associações

de penicilinas com inibidores de ββββ-lactamases e

aztreonam

• A resistência poderá se manifestar durante o

tratamento - inicialmente a bactéria pode se mostrar

sensívelLivermore. Scand J Inf Dis 79(Suppl):7-16, 1991

ββββββββ--lactamases do Grupo 1 lactamases do Grupo 1 (AmpC)(AmpC)

Breakpoints estabelecidos pelo NCCLS para detecção de E. coli e K. pneumoniae

produtoras de ESBL

Disco Difusão MIC

Aztreonam < 27 mm >2 µµµµg/mL

Ceftazidima < 22 mm >2 µµµµg/mL

Ceftriaxona < 25 mm >2 µµµµg/mL

Cefotaxima < 27 mm >2 µµµµg/mL

Cefpodoxima < 22 mm >2 µµµµg/mL

NCCLS 1999

PCR para detecção de metalo-ββββ-lactamase IMP-1

Acinetobacter spp - Hospital São Paulo 1993-2001λλλλ Padrão DNA 100 pb1. Controle positivo SM 320 imp-12. Controle positivo Acb 17-4 imp-13. Controle negativo Psa ATCC 278534. Acb 105078 - 1998 5. Acb 146005 - 19996. Acb A2350 - 05/20007. Acb A68 - 01/2000 8. Acb A3035 - 08/20009. Acb A3076 - 08/200010. Acb A3227 - 08/2000 11. Acb A4201 - 01/200112. Acb A4366 - 02/200113. Acb A4371 - 02/200114. Acb A4468 - 02/200115. Acb A4816 - 04/200116. Acb A4861 - 04/200117. Acb A5063 - 05/200118. Master Mix

λλλλ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12131415 1617 18 λλλλ

PCR

Ribotipagem

AcinetobacterMecanismos de resistência aos

carbapenens

• �� Permeabilidade: Alteração nas proteínas da membrana externa

• Produção de beta-lactamases–– MetaloMetalo --enzimas: IMPenzimas: IMP --1 1 -- 22–– Enzimas do subgrupo 2f: FamEnzimas do subgrupo 2f: Fam íília Oxa lia Oxa

Plasmídios

AcinetobacterOpções terapêuticas

• Ampicilina-sulbactam• Piperacilina-tazobactam• Ceftazidima• Cefepima• Aminoglicosídeos• Quinolonas• Carbapenens

Imipenem ~ MeropenemPOLIMIXINA

S

RESISTÊNCIA

O NH −−−− NH2

C

INH

N Antagonists Efflux NAT? AhpC? DNA damage? NAD metabolism?

Mycolic acid synthesis inhA, kasA,

KatG activation

Reactive oxygen/ Organic radicals

Multiple targets

Proposed Model of INH Action in Mtb

ZHANG & TELENTI, 2000.

Proposed INH Resistance Molecular

Mechanismsin M. tuberculosis

RAMASWAMY & MUSSER, 1998

Mutations in katG identified in INHR M. tuberculosis


Mutation identified in the inhA locus in INHR

and/or ETHR isolates ofM. tuberculosis


Mutation in oxyR-ahpC intergenic region identified in INHR and INHS M.

tuberculosis


Mutations identified in M. tuberculosis kas locus

Genetic Polymorphisms Associated with Resistance to INH (Zhang & Telenti, 2000)

Promoter

mab-inhA (6)

Intergenic

Region

kasA (6)

katG (62)

inhA (6)

oxyR-ahpC (18)

Complete deletion

M1A

D63E

A65ins

I71N

N88R

D94A

G99E

H108E,Q

A110V

G120del

A122del

G123del W198stop

T180C

A172T

S160L

Y155S

L150A

L148A

D142A

S140N,A

A139P

N138S,H

M126I

G125ins V200stop

E217del

F252L

T262R

P275T

E289del

W30DG,stop

S302R

S315T,N,I,R,G

W328L,C

I334T

I335T

L336R L587M,P

A574V

F567S

Q525P

L521del

R515C

D513del

D511del

G485V

W477stop

L463R

I393N

A350S G593D

L617del

L619P

G629S

L634F

S700P

A710V

A714P

A717P

D735A

-81 -> g,a

-15 c -> t -17 g -> t

-16 a -> g -24 g -> t

-55 a -> g

I95P

S94AV78A

I147TI16T

I21V,T

-55 -> g

-46 g ->a

-46 ins at

-45 c -> t -34 t -> a,c

-39 c -> t

-42 t -> c

-44 t -> a -32 g -> a

-30 c -> t

-15 c -> t

-12 c -> t -4 a -> g

-6 g -> a

-9 g -> a

-10 c -> a,t +4 c -> t

+33 g -> a

D66N

R121K

G387D

F413LG312S

G269S

DETECÇÃO DE MUTAÇÕES


ESTRATÉGIAS APLICADAS À DETECÇÃO DE MUTAÇÕES

• MUTAÇÕES– Modificações súbitas ou hereditárias no

conjunto gênico de um organismo que

não é explicável pela recombinação da

variabilidade genética preexistente.

– Mudanças no número de

cromossomos

– Mudanças grosseiras na estrutura dos cromossomos

– Mudanças nos genes individuais

• Algumas vezes deletérias outras não– Fonte básica de toda variabilidade

genética ⇒ Evolução– Recombinação ⇒ rearranja essa

variabilidade em combinações novas– Normal nos seres vivos ⇒

Mutações espontâneas

• Mutações induzidas– Radiação

• Ionizante• Ultravioleta

– Química• Hidroxilamina


• Mutação de Ponto ⇒ Modificação de um único par de base– Substituição (Por modificações tautoméricas) ⇒ Mais comum

– Timina e Guanina (Ceto) ⇔ enol– Adenina e Citosina (Amino) ⇔ Imino

• Transição : Purina por Purina ; Pirimidina por Pirimidina• Transversão : Purina por Pirimidina ; Pirimidina por Purina

– Adição ou Deleção ⇒ Modificam a estrutura de leitura (Frameshift Mutation)

• Mutações silenciosas• Mutações diretas (Inativam o gene)• Aplicações práticas das mutações

– Elucidar vias pelos quais processos metabólicos ocorrem– Agricultura

Sistemas Detecção de Mutação

Unknown Known etc

SSCP analysis Detecting large deletions etc

Heteroduplex analysis DNA chips

DGGE Oligo hybridisation

SSCP/HA/DGGE Oligo ligation assay

RNAse cleavage ARMS

MutS Quantitative PCR

Chemical mismatch cleavage ARCS, UHG etc

Resolvases/ Cleavase Solid-phase minisequencing

Dideoxy fingerprinting Direct Sequecing

DHPLC Classification of methods

Protein Truncation Test Types of mutations, how detected, functional significance


• Podem ser classificadas em três categorias:– aquelas que preferencialmente destroem o alelo selvagem;

– aquelas que preferencialmente amplificam o mutante ou alelo raro;

– aquelas que separam espacialmente o mutante do alelo selvagem.


• Métodos que destroem o alelo selvagem ou abundante:– PCR/RFLP:

• seqüência selvagem contêm o sítio de restrição;• mutação cria um sítio de restrição;• uma mudança de base introduzida pelo PCR cria um sítio de restrição.

• Triagem de mutações já descritas.

DETECÇÃO DE MUTAÇÕES• Proteção por MutS contra a clivagem:

Denaturação e re-hibridação

T7 DNA polimerase, exonuclease

Alelo selvagem Alelo mutante

Homoduplexes Heteroduplexes

MutS

Homoduplexes selvagens foram degradados


• Métodos que amplificam seletivamente o alelo mutante ou raro:– Amplificação alelo específica:

• utiliza iniciadores que apresentam maior homologia pelos alelos mutantes

• Amplificação alelo específica usando 4 iniciadores;• PCR com bloqueador competitivo

– PNA-PCR (peptide nucleic acid-mediated PCR clamping):Amostra selvagem Amostra mutada

PNA

PCR PCR

Pouco ou nenhum produto


• Reação em cadeia pela ligase:

Amostra selvagem Amostra mutante

Várias etapas de ligação, denaturação e hidridação

Pouco ou nenhum produto formado Produto amplificado

DETECÇÃO DE MUTAÇÕES• Métodos que separam espacialmente os alelos selvagens e mutantes:– SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)

Amostra padrão Amostra mutante

Denaturação

Adquire conformação espacial

Diferente migração eletroforética


• SSCP:– Exemplo: região de gene katG que contém o códom 315 em

cepas de Mycobacterium tuberculosis

Onde:

- 1 cepa padrão

- 2 a 19 cepas resistentes

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗


• DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

– Baseia-se no fato de que a desnaturação da fita de DNA ocorre em domínios acarretando diferença de mobilidade eletroforética entre um alelo normal e um mutado.

• Vantagens– Alta sensibilidade– Simples e revelação não radioativa– Fragmento no gel pode ser isolado e

usado para seqüenciar• Desvantagens

– É necessária análise computadorizada para padronizar o DGGE

– Equipamento– Iniciadores mais caros– Análise de fragmento de 100 a 400 pb– Genes ricos em CG não são facilmente

análisados por DGGE• Variações do DGGE

– TGGE– CDGE


• DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis):

PCR da sequência alvo

Amplicons denaturados e re-hibridizados

Homoduplexes Heteroduplexes

Dieferente migração em gel com gradiente de denaturação


• CDCE (Constant denaturant capillary electrophoresis):– Modificação de DGGE

• CMSA (Competitive Mobility Shift Assay):– Baseia-se na especificidade de hibridização de ácidos nucleicos e na separação espacial dos híbridos formados.

PCR

PCR assimétrico

Oligonucleotídeos para selvagem e mutante (mutante marcado)

Hibridização com máxima estringência

Separação eletroforética dos híbridos


• CFLP (Cleavase® Fragment Length Polymorphism):

Denaturação:

5’-ligadoSelvagem Mutante

Mutação pontual

Locais de clivagem

Digestão enzimática parcial

Estruturas mutantes

S M


• CLIVAGEM QUÍMICA OU ENZIMÁTICA DE NUCLEOTÍDEOS COM ERRO DE PAREAMENTO– Química (CCM)

• Fundamenta-se no fato de que a reatividade dos nucleotídeos frente a substâncias químicas (Hidroxilamina e Tetróxido de ósmio)

• T ⇒ com T, C ou G (Tetróxido de ósmio)

• C ⇒ com A, C ou T (Hidroxilamina)

• Vantagens– Alta sensibilidade ( ap. 100%)

– Habilidade de analisar fragmentos grandes(1,6 Kb)

– Não é necessário equipamentos especiais

• Desvantagens– Uso de 32P e Hidroxilamina


• CLIVAGEM QUÍMICA OU ENZIMÁTICA DE NUCLEOTÍDEOS COM ERRO DE PAREAMENTO

– Enzimática (ECM)

• Resolvases (T4 Endonuclease VII,

T7 Endonuclease I)

– Reconhece bases pareadas errada

em ds DNA, cortando no sítio de

pareamento errado

• Cleavases

– CFLP (Cleavase I)

• Vantagens– Sensível e rápido– Nenhum equipamento especial é

requerido– Pode-se estimar a posição da

mutação– Capaz de analisar fragmentos de

100 pb a 2 Kb– Disponível em Kit

• Desvantagens– Otimização é individual– Pode falhar na detecção de

algumas mutações– Usa 32P


• DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)– Método baseado na separação entre homoduplex e heteroduplex em coluna utilizando um

gradiente crescente de acetonitrila.– A absorbância é lida em 260 nm– Heteroduplex são menos estáveis e tem menor afinidade pela coluna– Tempo de retenção e a concentração de acetonitrila é menor do que o do homoduplex

– VANTAGENS• Reinjetar o material e reanalisar• Sensível• Analisa fragmentos de 200 – 500 pb

– DESVANTAGEM• Usa equipamento caro (HPLC)

• TESTE DA PROTEÍNA TRUNCADA• SEQUENCIAMENTO DO DNA


• PESQUISA DA PRESENÇA DE MUTAÇÕES CONHECIDAS– PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

• Requerimento de que o polimorfismo altere o sítio de corte da enzima

– Teste de ligação do nucleotídeo (OLA)• Ocorre hibridização com sonda oligonucleotídica

– 2 sondas alelo específica (1 mutante e outra WT)

– 1 sonda fluorescente comum ao mutante e ao WT

– Ocorre ligação pela ligase

– Solid-phase minisequencing• Método trabalhoso, requer pessoal técnico habilitado para análise final


• Allelic Specific Oligonucleotide(ASO)– Sondas específicas para hibridizar com o alelo normal e com o alelo

mutante

• Ligase Chain Reaction(LCR)– Explora o fato de que as extremidades das duas fitas simples do DNA

devem estar exatamente alinhadas para a ação da DNA ligase

• DNA Microarray Genotyping (DNA Chips)

• Sequenciamento


• Minisequenciamento:

PCR do DNA genômico

Preparação de amostras em fita simples

Hibridização das amostras aos iniciadores

Reação de minisequenciamento

Análise do ddNTP incorporado


• Pirosequenciamento


• PCR em microarrays

DESENVOLVIMENTO DE NOVAS DROGAS

GENE ALVO ALVOTERAPÊUTICO

COMPOSTO ESCOLHIDO

CANDIDATOCLÍNICO

DROGANOVA

GENOMA FUNCIONALPROTEOMA

INFORMÁTICA

HTS E ENSAIO DE MECANISMOQUÍMICA DE COMBINAÇÃO E MÉDICA

DESENHO DA DROGA E ESTRUTUR BIOLÓGICABIOLOGIA CELULAR E FARMACOLOGIA

MODELO IN VIVO DE DOENÇASFARMACOCINÉTICA E METABOLISMO DE DROGA

TOXICOLOGIA PRÉ-CLÍNICA

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