TEMA 15

Métodos genéticos para laidentificación microbiana

Tema 15. Métodos genéticos para la identificación microbiana

1. Introducción2. Técnicas de hibridación de los ácidos nucleicos

2.1. Marcado de la sonda2.2. Utilización de las sondas 2.3. Tipos de hibridación

2.3.1. Hibridación en solución3. Técnicas de amplificación

3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

1. Introducción

Utilidad de las técnicas genéticas:

• Detección directa de microorganismos en muestras clínicas

- Identifican un fragmento específico del genoma del microbio

• Identificación de microorganismos tras su aislamiento por métodosconvencionales

• Estudios de epidemiología molecular

- Permiten comparar cepas aisladas

Clasificación

• Técnicas de hibridación

• Técnicas de amplificación

2. Técnicas de hibridación de los ácidos nucleicos

Desnaturalización y renaturalización del ADN

Sonda de ADN: pequeño fragmento monocatenario (20-40 bases) marcado, utilizado para la detección de su secuencia complementaria por hibridación

2.1. Marcado de la sonda

Inicialmente con sustancias radiactivas 32P o 35S

Actualmente sustancias no radiactivas

• enzimas (peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina)

• sustancias lumínicas (ésteres de acridina)

• sustancias de captura (biotina, digoxigenina)

2.2. Utilización de las sondas

Son específicas

Insuficiente sensibilidad (microorganismos escasos en muestra clínica)

Excelente instrumento para identificar microorganismos aislado por cultivo (ADN en abundancia)

Muy útiles para microorganismos de identificación difícil o compleja (métodos convencionales)

2.3.1. Hibridación en solución

Extracción del ADN

Desnaturalización en solución (en tubo)

Adición de la sonda marcada con acridina

Si encuentra secuencia complementaria se une y forma fragmento bicatenario

Adición de álcali (inactiva acridina en sonda libre)

Medición de luminiscencia (luminómetro)

2.3. Tipos de hibridación

• en solución

• sobre soporte sólido (Investigación)

• in situ (Se realiza sobre un corte histológicoo tejido, lo que permite localizar elmicroorganismo en el contexto del tejido)

3. Técnicas de amplificación

3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

1983, Kary Mullis

Objetivo: amplificar región particular del ADN de un microorganismo quecontiene información útil desde el punto de vista del diagnóstico.

Mezcla de reacción para PCR:

• ADN diana (a amplificar)

• cebadores o “primers” (oligonucleótidos)

• nucleósidos trifosfatos

• polimerasa termoestable (Taq-polimerasa), obtenida de la bacteriatermófila Thermus aquaticus)

3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Cebadores:

• fragmentos cortos (12-20 nucleótidos) monocatenarios de ADN

• sintetizados artificialmente

• uno de ellos complementario de un fragmento de una cadena (5´- 3´)

• el otro complementario de un fragmento de la otra cadena (3´- 5´)situado entre 100 y 2.000 bases de distancia

Termocicladores

3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Termociclador: repite las tres fases del proceso, variando la temperatura (según programa)

Procedimiento

A) Desnaturalización: calentar mezcla (95ºC, 15-60 segundos)

B) Hibridación: enfriar mezcla (30-65ºC, 30 segundos)

C) Polimerización o extensión del cebador: 72ºC,de 30 segundos a 5 minutos

Al final del primer ciclo, por cada dos cadenasiniciales existen cuatro

Se inicia un nuevo ciclo calentando a 95ºC

Tras 20-30 ciclos (2-3 horas) se consiguenmillones de copias del fragmento original

Calentar a 95ºCLas cadenas de ADN se separan

Enfriar a 30-65ºCLos cebadores se unen a las cadenas de ADN

Calentar a 72ºCLa Taq-polimerasa sintetiza nuevascadenas de ADN

Dos nuevas moléculasde ADN

3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Amplicón: fragmento de ADN amplificado

Electroforesis en gel de agarosa (determinación de tamaño y confirmación)

Soporte demetacrilato

Peine

Carga de lasolución deADN en los

pocillos

Gel deagarosa

Polo negativo

Polopositivo

Fuenteeléctrica

Bandasde ADN

(A)Se vierte la agarosa ensobrefusión sobre elsoporte de vidrio conel peine en posición

(B)Se quita el peine después de

que la agarosa solidifique y secoloca el gel en la cubeta

(C)Se enchufa la cubeta

a la corriente

(D)Se tiñe el gel con bromuro

de etidio y se fotografíabajo luz ultravioleta

Gel

Peine

Soporte demetacrilato

Cable del electrodo

Tampón

(A)

(D)

(B)

(C)

Esquema general deelectroforesis horizontal de ADN

Plataformapara el gel

Tanques para el tampón

Accesorios y cubeta para electroforesis horizontal

Peine

Gel

Pocillos

Electrodo

Tampón

Fuente eléctrica

Bandasde ADN

Polonegativo Polo positivo

Tampón

Pocillo

Bromuro de etidio

Transiluminador

Luz ultravioleta