teoría y practica en cinética enzimatica

30-07-2015

1

Seminario-Taller Principios Básicos de la

Cinética Enzimática para el

Diseño y Operación de

Reactores

Dr. Roberto J. Vega Paulino [email protected]

1

2

Tema 1

Catálisis y Biocatálisis

Enzimas como catalizadores

Actividad enzimática

Propiedades y significado tecnológico

Sustancia que reduce la barrera energética de una reacción química, aumentando la velocidad de conversión del sustrato a producto.


CATÁLISIS

3

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2

(Enzimas)

Catálisis fisiológica

¿Qué es Biocatálisis?

Catálisis de proceso (artificial) bajo

condiciones de reacción de un proceso

industrial 4


alta especificidad

alta actividad en condiciones moderadas

alto número de rotación

biodegradabilidad

producto “natural” complejidad molecular

alto costo de producción

labilidad

5


Enzimas como Catalizadores. Relaciones

de Estructura funcionalidad

Enzimas son Proteínas

6

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3

ENZIMA

(proteína)

“Catalizadores de la vida”

Catalizan las reacciones Bioquímicas

en condiciones suaves

Catalasa H2O2 H2 O2 +

Ea= 76 KJ M-1

Ea’= 30 KJ M-1

v

v * 108 t: años t: segundos 7



Primaria

Secundaria

Terciaria

sitio activa

Cuaternaria 8



Enzimas son Proteínas Conjugadas

9



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4

E

E

ES

S

P

Modelo de la llave - cerradura (Emil Fischer 1894)

10



E: cerradura

S. llave

Explica la especificidad de la Enzima

Falla al explicar la estabilización del estado de transición

Modelo del ajuste inducido (Koshland 1958)

11



E CoE

P E-CoE S

S P

E E

S P

E··CoE E E

CoE’

CoE

1

2

3

Enzimas de acuerdo a sus requerimientos de cofactor y coenzima

12

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5

E

E

ES

S

P

Actividad (pequeña porción de la enzima)

Estabilidad (Capacidad de la enzima de retener su actividad)

Especificidad

E*

E k dt

dE - D

13



Desnaturalización Pérdida reversible de la actividad biológica por desplegamiento de la estructura terciaria, donde no ocurre cambios químicos en la proteína.

14



Inactivación Pérdida irreversible de la actividad biológica porque existen cambios químicos en la proteína

15



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6

Estabilidad termodinámica o conformacional

Estabilidad cinética o de largo plazo

Proceso Global para la Inactivación

N U I K k

Const. Equilibrio de desplegamiento Const. velocidad inactivación

16



Estabilidad y Actividad tienen Tendencias Opuestas

Estabilidad: Rigidez molecular Actividad: Flexibilidad conformacional

17



dt

dp

dt

ds- v a

Concepto y determinación de la

actividad enzimática

S E P

Definición termodinámica

Definición cinética

p

t

Disminución del sustrato Inactivación enzimática Inhibición enzimática Desplazamiento del equilibrio

18

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7

p

t

0t0t

0tdt

dp

dt

ds- v a



Representa el máximo potencial catalítico en un

set dado de condiciones experimentales 19



Definición de una Unidad de Actividad

La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de

Bioquímica: UI.

Una UI se define como la cantidad de enzima que cataliza la

transformación de un micromol de sustrato por min en

condiciones estandarizadas de T, pH y [S] óptimo.

20

El katal (kat): número de moles de sustrato convertido por segundo

21

Métodos de Análisis de la Actividad

Enzimática

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8

22

Bioprocesos

- células viables

Celulares

- células inviables

Acelulares (enzimáticos) • Libres

• Soportados

• Con CoE disociables

• Sin CoE disociables

23

Fuente de Enzimas

Naturales

• plantas

• animales

• microorganismos mesófilos

extremófilos

Modificados • mutantes

• recombinantes

• Ingenerados

Sintéticos • mimos (molécula orgánica para recrear el

sitio activo de una enzima)

24

1960

%

1985

2000

Planta, Animal

70

25

< 20

Microbiana 30 75 > 80

Producción de Enzimas

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9

25

Manipulaciones ambientales

medio de cultivo

condiciones de operación

modalidad de cultivo

Manipulaciones genéticas

mutación

recombinación

mutagénesis dirigida

Producción de Enzimas

26

Clases de enzimas. Significado

Tecnológico

Procesos con E con CoE disociables

oxidoreductasas

transferasas Intracelulares

Procesos con E sin CoE disociables

liasas

hidrolasas

nitrilo hidratasa

aspartasa

fumarasa

Isomerasas Intracelulares

ligasas ATP

27

Aplicaciones de Enzimas. Catalizadores de

Procesos

Aplicación industrial

Otras aplicaciones

Aditivos

Analíticas

Médicas

Investigación

80 %

20 %

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10

28

Hidrolasas extracelulares

Sin CoE disociables

Biocatalizadores solubes

Medio de reacción acuoso

Reacciones irreversibles

S + H2O P1 + P2


Procesos

29


Procesos

30


Procesos

Novozymes

Fuente: Biocatalysts and Enzyme Technology. Buchholz et al. (2012)

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11

31

Año Rubro

Detergentes Textiles Alimentos Otros

1992 42 15 37 6

1995 35 13 34 18

2000 32 5 30 33

2010 29 4 27 40


Procesos

32

Fuente: Basic Biotechnology. Ratledge y Kristiansen (2006)


Procesos

33

Amano Enzyme: https://www.amano-enzyme.co.jp/

Novozymes:

http://www.novozymes.com/en/Pages/default.aspx

Biocatalysts: http://www.biocatalysts.com/


Procesos

Empresas líderes en la comercialización de

Enzimas industriales

DSM:

http://www.dsm.com/markets/foodandbeverages/en_US/produ

cts/enzymes.html

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12

Enzimas usadas tradicionalmente como

catalizadores industriales

34

35



Enzyme Source Applications

36



Enzyme Source Applications

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13

37

Biocatálisis en Reacciones de Síntesis

Reacciones degradativas

(escaso valor agregado)

Enzimas en solución en reacciones hidrolíticas

Enzimas inmovilizadas en reacciones de hidrólisis e

isomerización

Reacciones de síntesis

(elevado valor agregado)

Enzimas con requerimientos de CoE

Enzimas sin requerimientos de CoE

( hidrolasas en medios no convencionales)

38


39


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14

40


41

Proyección del Uso Industrial de

Enzimas

Industria Alimentaria

Biocombustibles

42

Alimentación animal

Fitasas, β-glucanasas

Alimentos funcionales y nutracéuticos

Lipasas, proteasas, glicosidasas

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15

43


Enzimas

44


Enzimas

45


Enzimas

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16

46

Prebióticos

(Fructooligosacáridos)


Enzimas

Fructosiltransferasa

Enzima clave

47

Prebióticos Oligosacáridos

48

Estructura de los Fructooligosacáridos

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17

49

Agua

Sacarosa

Al-Na Micelio

Sol. CaCl2

Neosugar G

Neosugar

Flujo de Proceso de la Producción de

Neosugar

(1) Reactor de lecho empacado (2) Columna de carbon activo (3) Columna de Intercambio iónico (4) Columna de carbón vegetal (5) Concentrador

(1) (2) (3)

(4)

(5)

(5)

50

51


Fructosiltransferasa Fructosiltransferasa

FOS-3 sacarosa sacarosa

E-Fru

fructosa


FOS-3

FOS-4

glucosa

Mecanismo de Transfructosilación

Vega 2014. Biochemical Engineering Journal 82: 158-165

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18

52

Screening de fructosiltransferasas para

producir FOS

Vega R. 2012. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 76:44-51

53

Picos Cromatográficos de FOS

1) FOS-5 4) Sacarosa 2) FOS-4 5) Glucosa 3) FOS-3 6) Fructosa

Vega R. 2012. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 76:44-51

54

Producción de Biodiesel

Transesterificación de un triglicérido y esterificación de un

ácido graso libre para producir ésteres metílicos de ácidos

grásos , glicerol y agua.

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19

55

56

57

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20

58

59

60

Tema 2

Cinética enzimática en sistema homogéneo

Hipótesis de la cinética enzimática

Determinación de los parámetros cinéticos

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21

61 Time

S, P

Cinética Enzimática Es el estudio de la velocidad de las reacciones enzimáticas, variando

las condiciones químicas y físicas. Las ecuaciones de velocidad son

importantes en el diseño de un bioreactor enzimático.

S P E

[ ] [ ]d S d Pv

dt dt

Mecanismo de la reacción enzima-sustrato

1

1

2

k

k

k

S E ES

ES E P

63

Hipótesis del equilibrio rápido (Michaelis-Menten)

2

1

1

[ ]

[ ] [ ] [ ]

[ ][ ]

[ ]

t

v k ES

E E ES

k E SK

k ES

/[E]t 2 2

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] 1 [ ] [ ]t

v ES ES Ek k

E E ES ES E

[ ] [ ]

[ ]

ES S

E K

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22

64

Hipótesis del equilibrio rápido (Michaelis-Menten)

max[ ]

[ ]

V Sv

K S

[S]

Vmax

maxVmaxV

max 2

1

1

[ ]V k E

kK

k

donde:

65

Hipótesis del Estado Estacionario (Briggs-Haldane)

2

1 1

1 1 2

0

[ ]

[ ][ ] [ ]

[ ][ ] [ ] [ ] 0

[ ] [ ] [ ]

P

s

ES

v k ES

v k S E k ES

v k E S k ES k ES

E E ES

66

max[ ]

[ ]M

V Sv

K S

2 2

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] 1 [ ] [ ]

P

t

v ES ES Ek k

E E ES ES E

1 2 1[ ][ ] ( )[ ]

[ ] [ ]

[ ] M

k E S k k ES

ES S

E K

1)

2)

3)

Hipótesis del Estado Estacionario (Briggs-Haldane)

max 2

2 1

1

max

[ ]

M

M

V k E

k kK

k

V

K

donde:

Eficiencia catalítica

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23

67

Unidades de Vmax

Si v está en mol/L. min, entonces [E]t= mol/L, k+2= min-1 . Se

tiene que conocer el peso molecular de la enzima, la actividad

específica y número de sitios activos.

Si v está en µmol/L.min, entonces [E]t = UI/L, k+2 es 1

UI: Unidades internacionales µmol/min.

68


1) Lineweaver-Burk

69


2) Headdie-Hofstee v

v/S

Vmax

KM

3) Hanes S / v

S K/V

1/V

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24

70

Integración de la Ecuación de Michaelis-Menten

[ ] [ ]

[ ]

dP d S V Sv

dt dt K S

[ ]

[ ] 0

[ ][ ]

[ ]i

S t

S

K Sd S Vdt

S

[ ] [ ] [ ]1 1ln( )

[ ]

i iS S SV

t S K K t

[ ]1 1 [ ]ln( )

[ ] [ ]

P V P

t P P K K t

t [S] [P]

0 [Si] 0

----

-----

-----

-----

too [Poo]

71

Problema 1

β-galactosidasa cataliza la hidrólisis de la lactosa en glucosa y galactosa y es ampliamente utilizada en la industria láctea. Una preparación de β-galactosidasa comercial de Kluyveromyces marxianus var lactis está siendo utilizada en la producción de leche de baja lactosa. Es conocido que 500 UI de β-galactosidasa por litro de leche se requiere para reducir el contenido de lactosa en la leche en un 80% durante almacenamiento (considerado satisfactorio) y usted debe calcular el requerimiento de enzima dosada (mL de preparación enzimática para ser adicionada por L de leche). Para hacer esto, la actividad de la β-galactosidasa de la preparación enzimática se debe determinar. El ensayo enzimático se basa en determinar la glucosa en un sistema de HPLC con un detector de índice de refracción. El procedimiento analítico consiste en adicionar 0.3 mL de la preparación enzimática, diluida tres veces, a 1.2 mL de 150 g/L de solución de lactosa e incubando la mezcla a 35 °C y pH 6.4. Las muestras se toman en diferentes tiempos de reacción y sujetas a inactivación enzimática por calentamiento en agua hirviendo y luego filtrando antes del ensayo de HPLC. Los siguientes resultados se obtuvieron:

72

T (min) 0 2 4 6 8 12 18 26 36 48

G (mM) 0 150 307 461 597 912 942 976 999 1015

Solución:

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60

Glu

cosa

(m

M)

Tiempo (min)

y = 75.811x R² = 0.9997

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 2 4 6 8 10 12 14

Glu

cosa

(m

M)

Tiempo (min)

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25

73

74

Problema 2 Un extracto crudo de glucosa isomerasa se ha obtenido después de la cultivación de Streptomyces flavogriseus y la disrupción celular en un homogenizador. La enzima cataliza la isomerización reversible de glucosa en fructosa. Una muestra de 1 mL de este extracto, diluido como se indica en la siguiente tabla, se puso en contacto con 4 mL de 0. 1 M de glucosa (C6H12O6) solución. La concentración de glucosa se monitoreó durante la reacción y los siguientes resultados se obtuvieron:

Tiempo de Reacción (min)

Concentración de glucosa (g/L)

Dilución 1:50 Dilución 1:100

0 14.40 14.40

2 13.91 14.15

4 13.58 13.91

6 13.27 13.64

8 13.04 13.46

10 13.03 13.34

75

Calcule la actividad de la glucosa isomerasa en el extracto crudo, expresándola en UI/mL.

12.8

13

13.2

13.4

13.6

13.8

14

14.2

14.4

14.6

0 2 4 6 8 10 12

Glu

cosa

(g

/L)

Tiempo (min)

Solución:

y = -0.1254x + 14.4 R² = 0.9994

13.6

13.8

14

14.2

14.4

14.6

0 1 2 3 4 5 6 7

Glu

cosa

(g

/L)

Tiempo (min)

Dilución 1:100

y = -0.1971x + 14.4 R² = 0.9815

13

13.2

13.4

13.6

13.8

14

14.2

14.4

14.6

0 1 2 3 4 5 6 7

Glu

cosa

(g/

L)

Tiempo (min)

Dilución 1:50

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26

76

77

Problema 3

Derive una expresión de velocidad para la formación de P del siguiente mecanismo enzimático reversible:

E S ES P E + + k+1

k-1

k+2

k-2

y cuál sería el diseño experimental para determinar los parámetros cinéticos?

78

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27

79

80

Problema 4: Cinética enzimática de multi-sitio

Suponga que una enzima tiene dos sitios activos de modo que el sustrato se convierte a producto vía la secuencia de reacciones:

E + S ES k+1

k-1

ES S k+2

k-2

ESS +

ESS k+3

ES + P ES k+4

E + P

Derive una expresión de velocidad para la formación de P, asumiendo el estado quasi-estacionario para ES y ESS

81

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28

82

83

84

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29

85

Problema 5:

Empleando métodos numéricos, muestre cómo las concentraciones de sustrato, producto y complejo enzima-sustrato cambian con respecto al tiempo en un reactor por lotes para el simple mecanismo de Michaelis-Menten. S [0]= 0.1 mol/L E [0]= 0.01 mol/L Los valores de las constante de reacción son k+1=40 L.mol-1.s-1, k-1=5 s-1 y k+2=0.5 s-1

86

Problema 6:

De una serie de experimentos por lote con una concentración de enzima constante, los siguientes datos de velocidad inicial se obtuvieron en función de las concentraciones de sustrato inicial.

[S], mmol/L Vel. Rx, mmol/L.min

1 0.2

2 0.22

3 0.30

5 0.45

7 0.41

10 0.5

Determine los parámetros cinéticos, por los cuatro métodos estudiados. Discuta los resultados

87

Problema 6:

α-L-fucosidasa cataliza la hidrólisis de α-L-fucosidos en L-fucosa y un alcohol. La actividad enzimática se determinó por medio de las velocidades iniciales de la hidrólisis del sustrato sintético p-nitrofenil α-l-fucopiranosido. Los siguientes resultados se han obtenidos con una preparación purificada de α-L-fucosidasa del molusco marino Pecten maximus a pH 4.5 y 50 °C.

S 1 2 3 4 5 10 15 20

V 51.52 64.15 69.86 73.12 75.22 79.81 81.47 82.34

S: concentración inicial de p-nitrofenil α-l-fucopiranosido (mM) V: velocidad de reacción inicial (µ mol p-nitrofenol.min-1.mg-1)

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30

88

89

Una situación diferente se da lugar si más error experimental está involucrado. Asuma que para este propósito los siguientes datos obtenidos con α-L-fucosidasa de hígado de abalone. En la cual las cinéticas enzimáticas se determinan midiendo las velocidades iniciales de hidrólisis del sustrato sintético 2-cloro-4-nitrofenil- α-L-fucopiranosido en α-L-fucósido y 2-cloro-4-nitrofenol, siendo cinéticamente cuantificado mediante la medición de la absorbancia a 405 nm.

S 0.5 1 1.5 2 4 8 16 20

V 2.2 4.8 5.73 7.19 9.68 12.04 13.66 14

S: concentración inicial de 2-cloro-4-nitrofenil-α-L-fucopiranosido (mM) v: velocidad de reacción inicial (µ moles 2-cloro-4-nitrofenol.min-1.mg-1 )

90

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31

91

92

Problema 7:

Dibuje el perfil de la concentración de sacarosa sobre el tiempo cuando la invertasa se adiciona en un nivel de 1 g/L a 50 mM de solución de sacarosa. Los parámetros cinéticos de la enzima en condiciones de reacción son: KM=10 mM y Vmax= 1000 μmoles.min-1.g-1

enzima .

93

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32

94

Tema 3

Cinética de Inhibición Enzimática Tipos de inhibición de enzimas Determinación de los parámetros cinéticos

95

MECANISMOS DE INHIBICIÓN:

96

1) Inhibición Competitiva

Mecanismos de Inhibición

E S + ES E P + + I

EI

k+1

[ ]

[ ]

[ ](1 )

ap

ap

i

V Sv

K S

IK K

K

k-1

k+2

k+3 k-3

3

3

i

kK

k

IC

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33

97


2) Inhibición No Competitiva

[ ]

[ ]

apV Sv

K S

P

E S + ES E P + + I

EI

+ I

ESI S +

k+1

k-1

k+2

k+3 k-3 k+1

k-1

k+3 k-3

EI + k+4 [ ]

1ap

i

VV

I

K

'[ ]

[ ]1

iap

i

V IV

KV

I

K

'

4[ ]TV k E

INCT

INCP

98


3) Inhibición Tipo Mixta [ ]

[ ]

ap

ap

V Sv

K S

E S + ES E P + + I

EI

+ I

ESI S +

k+1

k-1

k+2

k+3 k-3 k’+1

k’-1

k’+3 k’-3

EI + k+4 P

'

[ ]1

ap

i

VV

I

K

'

1 [ ]

1 [ ]

iap

i

I KK

I K

IMT

' '

'

[ ]

[ ]1

iap

i

V V I KV

I

K

'

1 [ ]

1 [ ]

iap

i

I KK

I K

IMP

99


4) Inhibición Acompetitiva

E S + ES E P + + I

ESI

k+1

k-1

k+2

k’+3 k’-3

EI + k+4 P

[ ]

[ ]

ap

ap

V Sv

K S

'

[ ]1

ap

i

VV

I

K

'

[ ]1

ap

i

KK

I

K

IACT

' '

'

[ ]

[ ]1

iap

i

V V I KV

I

K

'

[ ]1

ap

i

KK

I

K

IACP

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34

100

DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS

101


102


Total

# parámetros

2

3 3 4 4 5

3

Acompetitiva Parcial

‘ ‘

4 ‘

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35

103

Gráficos Lineales Secundarios

IC INCT

[ ]ap

i

KK K I

K

[I] [I]

1 1 1[ ]

ap i

IV V VK

-Ki -Ki

104

'[ ]

[ ]1

iap

i

V IV

KV

I

K

'

'

[ ]

[ ]

1 1

[ ]

iI ap

i

V V

I KLim V V

I K

105


IMT

'

1 1 [ ]

ap i

I

V V VK

1/Vap

[I]

1/V

[ ](1 )

ap

ap

ap i

K K I

V V K

[ ]ap

i

I

K

[I]

∆ap

∆

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36

106

1 1 [ ]

ap i

I

K K KK

IACT

[I] K’i


107

Inhibición Acompetitiva Total por altas concentraciones de sustrato

'

'

[ ]

[ ]

1

1

ap

ap

ap

i

ap

i

V Sv

K S

VV

S K

KK

S K

2

'

[ ]

[ ][ ]

i

V Sv

SK S

K

[S] v

----- -----

----- ------

----- ------

----- ------

108

Inhibición Acompetitiva Total por altas concentraciones de sustrato

'

1 1 1 [ ]

[ ] i

K S

v V S V K V

Si S << K

1 1 1

[ ]

K

v V S V

Si S>> K

'

1 1 [ ]

i

S

v V K V

1/v

1/[S]

1/V

1/v

[S]

1/V

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37

109

Problema 1 La enzima α-D-galactosidasa cataliza la siguiente reacción de hidrólisis:

Rafinosa ----> galactosa + sacarosa + fructosa

Se ha determinado que la enzima es inhibida por los productos de la reacción siendo uno de ellos un inhibidor competitivo y los dos restantes inhibidores no competitivos. Los siguientes valores experimentales se obtuvieron en presencia y ausencia de estos productos

v · 10-1 ( mol/ L min)

G (mM) 0 10 50 100 0 0 0 0 0 0

S (mM) 0 0 0 0 1 10 30 0 0 0

F (mM) 0 0 0 0 0 0 0 1 10 100

R (mM)

0.10 0.98 0.45 0.13 - 0.90 - - 0.90 - -

0.25 2.14 1.03 0.33 0.17 1.80 0.8 - 2.00 1.60 -

0.50 3.10 1.70 0.60 0.33 2.60 1.23 0,54 3.10 2.20 0.80

0.75 4.00 2.40 0.87 0.51 3.30 1.47 0,66 3.80 2.80 0.99

1.25 4.50 3.30 1.40 0.78 4.20 1.80 0,78 4.70 3.50 1.20

1.75 5.40 3.80 1.80 1.10 4.50 2.10 0,90 5.10 4.10 -

3.50 6.20 5.04 3.00 1.80 5.40 2.40 1,10 5.90 4.50 1.50

7.00 6.40 5.90 4.20 - 5.90 2.50 1,10 6.20 5.10 -

10.0 6.60 6.30 - - - 2.60 - 6.50 - 1.70

12.5 6.70 6.40 - - 6.0 - - 6.60 5.20 -

15.0 6.70 6.50 5.30 - - - - - - -

32.5 6.80 - 6.20 5.50 - - - - - 1.80

Determine el tipo de inhibición que ejerce cada uno de los productos y las constantes cinéticas respectivas.

110

Los siguientes resultados se obtuvieron con una glucosa 6 fosfatasa (EC 3.1.3.9) purificada de un extracto de hígado de rata. La enzima cataliza la hidrólisis de glucosa 6 fosfato (G6P) a glucosa (G) y fosfato inorgánico (Pi).

Determine el tipo de inhibición ejercida por glucosa. Proponga una expresión de velocidad plausible para la hidrólisis de G6P con glucosa 6 fosfatasa.

Página 48

Problema 2

111

La enzima tanasa cataliza la reacción :

Digalato -----> Galato + ác. Gálico Lo que es de importancia en la industria alimentaria en la remoción de ciertos sabores amargos. Los siguientes valores se han obtenido experimentando con un preparado de tanasa de Aspergillus sp actuando sobre digalato de sodio.

S mM 0.1 0.2 0.4 0.8 1 2 10 50 100 150 200

V mM/h

0.2 0.38 0.74 1.37 1.65 2.78 5 2.77 1.65 1.17 0.91

Determine la expresión cinética correspondiente y los parámetros cinéticos

Problema 3

30-07-2015

38

112

Fenilalanina amonio liasa (EC 4.3.1.5) de Rhodotorula glutinis cataliza la conversión de fenilalanina (X) en ácido trans-cinámico (Y) y amonio (Z), donde Y es un inhibidor competitivo y Z un inhibidor acompetitivo parcial. Desarrolle una expresión cinética paramétrica y evalué los parámetros cinéticos aparentes en términos de las correspondientes constantes de Michaelis e inhibición.

Problema 4

113

114

30-07-2015

39

115

Problema 5

La enzima lactasa hidroliza lactosa a galactosa y glucosa. Este último se comporta como inhibidor. a) Determine la expresión cinética b) A partir de la tabla anexa, calcular las constantes cinéticas.

V (mmol/mL.min)

Lactosa (mM)

G= 0mM G= 5mM G= 10mM

G= 100mM

G= 1000mM

10 9.09 7.9 7 2.3 0.31

50 33.3 30 27.5 10.8 1.56

100 50 46.2 43.2 19.5 3.08

250 71.4 68.3 65.7 38 7.39

116

Cinética de Reacción con dos Sustratos Mecanismos y Modelos Determinación de los parámetros cinéticos

Tema 4

117

30-07-2015

40

118

119

MSO

MSA

MO, ping-pong

120

Mecanismo Secuencial Ordenado

KA K’B k

30-07-2015

41

121


EA E + A

EA + B EAB

EAB E Y Z + +

[ ][ ] [ ] [ ]

[ ] [ ]A

A

E A EA AK

EA E K

'

'

[ ][ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]B

B

EA B EAB EA BK

EAB E E K

[ ]v k EAB

[ ]

[ ]

[ ] [ ][ ]1

[ ] [ ]t

EAB

v Ek

EA EABE

E E

k

' '

[ ][ ]

[ ] [ ][ ]A B B

V A Bv

K K K A A B

(1)

Hipótesis del Equilibrio Rápido

122

[ ]

[ ]

AP

AP

V Av

K A

'

'

[ ]

[ ]

AP

AP

V Bv

K B

( )

( )

AP

AP

V f b

K f b

'

'

( )

( )

AP

AP

V f a

K f a


'

'

'

[ ][ ]

[ ]

[ ][ ]

B

A B

B

V BA

K Bv

K KA

K B

' '

[ ]

[ ][ ]

[ ]A B B

V Bv

K K K AB

A

123

Mecanismo Secuencial Aleatorio

KA

K’B

K’A

KB

k

30-07-2015

42

124


EA E + A

EB E + B

EA + B EAB

EB + A EAB

EAB E Y Z + +

[ ][ ] [ ] [ ]

[ ] [ ]A

A

E A EA AK

EA E K

[ ][ ] [ ] [ ]

[ ] [ ]B

B

E B EB BK

EB E K

k

'

'

[ ][ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]B

B

EA B EAB EA BK

EAB E E K

'

'

[ ][ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]A

A

EB A EAB EB AK

EAB E E K

[ ]v k EAB

(2)

(3)

' '

B A A BK K K K

Hipótesis del Equilibrio Rápido

125

[ ]

[ ]

[ ] [ ] [ ][ ]1

[ ] [ ] [ ]t

EAB

v Ek

EA EB EABE

E E E


' ' '

[ ][ ]

[ ] [ ] [ ][ ]A B B A

V A Bv

K K K A K B A B

'

' '

'

[ ][ ]

[ ]

[ ][ ]

[ ]

B

A B A

B

V BA

K Bv

K K K BA

K B

'

' '

'

[ ][ ]

[ ]

[ ][ ]

[ ]

A

A B B

A

V AB

K Av

K K K AB

K A

126

30-07-2015

43

127

Determinación de los Parámetros Cinéticos

A B Y Z + + E

128


GRÁFICOS PRIMARIOS

129


GRÁFICOS PRIMARIOS

30-07-2015

44

130


GRÁFICOS SECUNDARIOS

131



132

Mecanismo Ping-Pong Bi Bi

Ecuación de Velocidad en la ausencia de productos Y y Z

[ ][ ]

[ ] [ ] [ ][ ]B A

V A Bv

K A K B A B

30-07-2015

45

133


[ ][ ]

[ ]

[ ][ ]

[ ]

B

A

B

V BA

K Bv

K BA

K B

[ ][ ]

[ ]

[ ][ ]

[ ]

A

B

A

V AB

K Av

K AB

K A

Mecanismo VAP KAP V’AP K’AP

Ping-Pong [ ]

[ ]B

V B

K B[ ]

[ ]

A

B

K B

K B

[ ]

[ ]A

V A

K A

[ ]

[ ]

B

A

K A

K A

134


GRÁFICOS PRIMARIOS

1/v

1/[A]

[B]

-1/KAP

1/VAP

1/v

1/[B]

[A]

-1/K’AP

1/V’AP

135



1/[B] -1/KB

1/VAP

1/V

1/[B] -1/KB

1/KAP

1/KA

30-07-2015

46

136

Problemas Resueltos

v (µmol/min.gcat)

[FGME] [7ACCA]

2 4 6 8 10

2 5.56 10.81 15.79 20.51 25.00

4 8.51 16.33 23.53 30.19 36.36

6 10.35 19.67 28.13 35.82 42.86

8 11.59 21.92 31.17 39.51 47.06

10 12.50 23.53 33.33 42.11 50.00

Problema1: Se ha reportado recientemente la síntesis del antibiótico β-lactámico cefaclor con penicilina acilasa de Bacillus megaterium a partir de ácido 7-aminodesacetoximetil 3-clorocefalosporánico (7ACCA) y D-fenilglicina metil éster (FGME) (Zhang et al. Biocatal. Biotransform. 25(1): 59-64, 2007). Con dicha enzima se ha obtenido los siguientes resultados para la velocidad inicial de síntesis de cefaclor (v) a distintas concentraciones (mM) de 7ACCA y FGME:

Se pide determinar el mecanismo de reacción y evaluar todos los parámetros cinéticos de la reacción

137

Problemas Resueltos

Problema2: La enzima nucleósido difosfato-quinasa cataliza la siguiente reacción:

Concentración GTP (µmol/L) 22 30 50 200

Concentración dGDP (µmol/L)

Velocidad (UI/ml)

20 0,095 0,112 0,141 0,196 25 0,102 0,120 0,155 0,223 40 0,112 0,136 0,180 0,284

100 0,125 0,156 0,218 0,385

GTP + dGDP GDP + dGTP

En un experimento con la enzima aislada desde eritrocitos se obtuvieron los siguientes resultados:

Indique cuál es el probable mecanismo de reacción enzimática y determine los parámetros cinéticos

138

Problemas Resueltos

Problema 3: Los siguientes resultados de velocidad inicial (moles/min g) de síntesis

de Z-aspartame (Z-AM) se han obtenido con un preparado enzimático comercial:

FAME (mM)

ZA (mM)

5 10 20 40

2.5 0.55 1.09 2.13 4.08

5 0.98 1.92 3.70 6.90

10 1.61 3.13 5.88 10.53

20 2.38 4.55 8.33 14.29

La enzima termolisina cataliza la síntesis de Z-AM mediante la unión peptídica de Z-Aspartato (ZA) y fenilalanina metil éster (FAME) - Determinar el mecanismo de reacción enzimática - Determinar el valor de los parámetros del modelo cinético que representan dicho mecanismo

30-07-2015

47

139

Problemas Resueltos

Revisar el Mecanismo de síntesis de Fructooligosacáridos a partir de sacarosa

Biochemical Engineering Journal (2014) 82: 158-165

140

Efecto del pH y la Temperatura sobre la Actividad Enzimática

Tema 5

141

S

En

EnS

+

H+

H+ +

En Pi +

En-1S En+1S H+

En+1 + H+ + En-1

ka

k-a

kb

k-b

k’-a

k’a k’b

k’-b

k-1 k1

k2

+

bb

b

kK

k

aa

a

kK

k

''

'

bb

b

kK

k

''

'

aa

a

kK

k

2[ ]nv k E S

Efecto del pH en la Cinética Enzimática

1 2

1

k kK

k

30-07-2015

48

142

1[ ][ ] [ ] 0n n

a ak H E k E

1 [ ][ ][ ]

nn

a

E HE

K

1[ ] [ ][ ] 0n n

b bk E k E H

1 [ ][ ]

[ ]

nn bK E

EH

' ' 1[ ] [ ][ ] 0n n

b bk E S k E S H

'1 [ ]

[ ][ ]

nn bK E S

E SH

' ' 1[ ][ ] [ ] 0n n

a ak H E S k E S

1

'

[ ][ ][ ]

nn

a

E S HE S

K

En-1:

En+1:

En-1S:

En+1S:

143

EnS:

' ' ' 1

2 1 1

' 1

( [ ])[ ] [ ][ ] [ ][ ]

[ ] 0

n n n

b a b

n

a

k k k k H E S k E S H k E S

k E S

1 2 1[ ][ ] ( )[ ]

[ ][ ] [ ]

n n

n n

k E S k k E S

E S K E S

1 1 1 1[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]n n n n n n

tE E E E E S E S E S

Balance de la concentración de enzima total

144

'

'

[ ] [ ][ ] [ ][ (1 ) 1 ]

[ ] [ ] [ ]

n b bt

a a

K H K H KE E S

S K H K H

2[ ]nv k E S

2[ ]

[ ] [ ]

n

t t

v k E S

E E

[ ]

[ ]

AP

AP

V Sv

K S

'

'

[ ]1

[ ]

AP

b

a

VV

H K

K H

'

'

[ ][1 ]

[ ]

[ ]1

[ ]

b

aAP

b

a

H KK

K HK

H K

K H

30-07-2015

49

145

'

'

[ ]1

[ ]

AP

b

a

VV

H K

K H

'

' 2 '2

'

1( ) 0

[ ][ ] [ ](1 )

[ ]

AP b

b a

a

dV V K

H Kd H H K

K H

* ' '

' '*

[ ]

2

a b

a b

H K K

pK pKpH

146

Diseño experimental

147

'

'

[ ]1

[ ]

AP

b

a

VV

H K

K H

'

'

[ ]log log log[1 ]

[ ]

bAP

a

H KV V

K H

Zona ácida (I): ' '

a bH K K

'log log log[ ] logAP aV V H K

'log logAP aV pH V pK

' '

a bK K H Zona básica (II):

'log log log[ ] logAP bV V H K

'log logAP bV pH V pK


30-07-2015

50

148

Zona del óptimo (III): ' '

a bK H K

log logAPV V

pH VAP logVAP

--- ---- ----

--- ----- -----

---- ---- -----

---- ----- -----

pK’a pK’b


149

pH KAP ∆AP=KAP/VAP

--- ---- ----

--- ----- -----

---- ---- -----

---- ----- -----

[ ][1 ]

[ ]

[ ][1 ]

[ ]

AP bAP

AP a

bAP

a

K K H K

V V K H

H K

K H

[ ]log log log[1 ]

[ ]

bAP

a

H K

K H

Zona ácida (I): a bH K K

log logAP apH pK


150

Zona básica (II): a bK K H

log logAP bpH pK

Zona del óptimo (III): a bK H K

log logAP


30-07-2015

51

151

pH ∆AP log∆AP

--- ---- ----

--- ----- -----

---- ---- -----

---- ----- -----

pKa pKb


152

Efecto de la temperatura sobre la Afinidad, Reactividad y Estabilidad

0 0 0

0 0

ln

ln

G H T S RT K

H SK

RT R

Donde:

Efecto de T sobre K Rx endotérmica

Lo misma Ec. para las constantes de inhibición

153

Efecto de la temperatura sobre la Afinidad, Reactividad y Estabilidad

Efecto de T sobre kcat Ea: 4-40 kcal/mol

30-07-2015

52

154

Diseño experimental

155

Representación esquemática del efecto de la temperatura en la actividad y estabilidad

156

Efecto de la T sobre los parámetros de Inactivación Enzimática

Inactivación térmica enzimática

T1

T2

T3 T4

e/e0

1

Tiempo

30-07-2015

53

157


Cinética de inactivación de primer orden Dr k e

kD: constante de velocidad de inactivación de primer orden tiempo-1

e: Concentración de la enzima activa UI/unidad de volumen

158


Balance de masa para la enzima en un reactor por lotes

( )D

d eVk eV

dt

D

dek e

dt

0

0

ln

exp( )

D

D

ek t

e

ek t

e

1/2

ln 2

D

tk

159


Eia: Energía de activación para el proceso de inactivación enzimática Eia: 20-200 Kcal/mol

30-07-2015

54

160


[ ] [ ]

[ ] [ ]

ap

ap ap

V S ke Sv

K S K S

0 0

0

exp( ) exp{ [ exp( )] }[ ]

exp( ) [ ]

a iaDo

E Ek e k t S

RT RTvH

K SRT

161

Problemas Resueltos

Problema 1

162

Problema 1

30-07-2015

55

163

Problemas Resueltos

Problema 2

164

Los siguientes resultados correspondientes al perfil de pH de una lactasa de Aspergillus oryzae:

pH A ( mmolgluc/min g)

pH A (mmolgluc/min g)

1,75 8,7 5,2 478,5

2,0 15,5 5,5 471,5

2,5 45,4 6,0 430,5

3,0 120 6,5 332,5

3,5 250 7,0 193,0

4,0 379,5 7,5 83,0

4,5 451,5 8,0 29,5

4,8 471,5 8,5 9,5

5,0 477,5 A partir de la hipótesis de Michaelis y Davidsohn, determinar los valores de pK del complejo activo lactosa-lactasa y calcular el pH teórico óptimo de la enzima.

Problemas Resueltos Problema 3

165

Problemas Resueltos

Problema 1

30-07-2015

56

166

Problemas Resueltos Problema 2

167

2430.1828446 exp( ) [ ]

543.9 [ ]0.52 exp( )[1 ] [ ]

233262584 exp( )

ANTv

AAAN

T

T

Problema 2

168

Problema 3 Problemas Resueltos

30-07-2015

57

169

Inmovilización de Enzimas Cinética Heterogénea Restricciones Difusionales Externas e Internas

Tema 6

Eficiencia de uso

Flexibilidad operacional

Control de reacción

Pureza del producto

Enzimas Inmovilizadas

Enzima asociada o contenida en una matriz

Aumento de estabilidad funcional

Facilidad de recuperación

Desarrollo de procesos continuos

Costo fabricación X

- adsorción

Unión

- covalente

- inclusión en geles Contención - retención en membranas - CLEC Agregación - CLEA

Enzimas Inmovilizadas

CLEA LentikatsR

30-07-2015

58

Inmovilización covalente de enzimas a soportes activados

ACTIVACIÓN DEL SOPORTE

NaIO4

NaOH 0.1N NaBH4

Glicidol

Guisan et al. (1997)

Oxidación

Inmovilización covalente de enzimas a soportes activados

O

H C NH2 +

Grupos aldehído (soporte activado)

Grupos amino (lis reactivas)

Derivado enzimático

CH N C N

Intermedio Base de Schiff

pH 10

Reducción

NaBH4

Estabilización de la enzima por unión covalente multipuntual

Rigididización 3D

Reduce los cambios conformacionales inducidos

por codisolventes, temperatura...

A través de: varios residuos de la enzima unidos por brazos cortos al soporte

30-07-2015

59

CLEA

Cross – Linked Enzyme Aggregates

Enzima Precipitada

Glutaraldehyde

CLEA Enzima Soluble

PEG

A

Enzima Precipitada CLEA DP Enzima Soluble+ PEI + DS

B

Glutaraldehyde PEG

PEG: Polietilino glicol DS: Sulfato dextrano PEI: Polietilenamina

CLEA CLEA LentiKatsTM Enzima Soluble

PVA CLEA G

PRECIPITACION ENCAPSULACION

Enzima Precipitada

ENTRECRUZA MIENTO

Fuente: Illanes (2008)

30-07-2015

60

178

Algunas Aplicaciones

179

1969- 1970 Aminoacilasa Inmovilizada

180

Comparación de los costos de producción de L-aminoacidos por procesos de lotes y continuo

Industrial Applicattion of Immobilized Biocatalysta 1993. Pag. 3

30-07-2015

61

Precio del azúcar: 1970: $ 0.07 a $0.08/lb 1974: > $ 0.5/ lb 1976 : < $ 0.1/lb

182

Estimated world HFS consumption in millions of tons dry basis

183

From starch to HFS. (Courtesy of Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark.)

30-07-2015

62

184

Dos razones para inmovilizar la Glucosa Isomerasa

Glucosa es una enzima cara debido a los rendimientos

de fermentación bajos (intracelular) y actividad

catalítica baja (sustrato natural xilosa).

La fructosa y glucosa no son estables en las condiciones

de isomerización industrial (60 °C, pH 7.5)

185

Ejemplos de Glucosa Isomerasa inmovilizada comercializada

Parámetros de Inmovilización

Rendimiento de inmovilización

.100IE

C

EY

E

Capacidad de carga del soporte

.100 .100I c RP

C c

P P PY

P P

Rendimiento de inmovilización de proteína

Rendimiento de inmovilización de enzima

argI

c ada e

EE A

M

argc R

c ada

P PP

M

30-07-2015

63

Cinética Enzimática en Fase heterogénea

Efectos conformacionales (c)

Efectos microambientales: rest. difusionales (rd)

partición

Cinética intrínseca Enzima soluble

Cinética intrínseca Enzima inmovilizada

Cinética efectiva Enzima inmovilizada

Efectos conformacionales Impedimentos estéricos

Restricciones difusionales

Restricciones Difusionales

Restricciones difusionales externas p0

p

s0

s

Restricciones difusionales internas

0 L

s0 s0

S P E p0

p

s0

s

0

3

3

''

'

( )

[ ]; [ ]; [ ]

[ ]

s

s

s

J h s s

V sv

K s

M L MJ h s K

T T L

MV

T

'r J v Estado estacionario

Caso I: control por transporte (Ss=0)

0

r J h s

Caso II: control cinético (Ss =S0)

' 0

0

'V sr v

K s

30-07-2015

64

Velocidad de conversión de sustrato como una función del sustrato del bulk (Illanes, 2008)

Conc. del seno del líq.

0

'

( ) ss

s

V sh s s

K s

RDE, M-M

00

'

'

'

s

Vh K

SK

S

K

v

V

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65

'

00'

00

0

(1 )( , )

(1 )

s

s s

s

V S

K Sf

V S

K S

obsobs inh

inh

vv v

v

Factor de Efectividad

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 5 10 15 20

β0

η

1,01

5

10

20

100

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66

Illanes (2008)

Engasser (1978)

Restricciones Difusionales Internas

' ' ''

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22

2. 0

d

dz

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67

Sol. Numérica

Sol. Analítica (Cinética Primer orden)

Restricciones Difusionales Internas

' 2 ' 2 '' 3 3

' 22 ''

4.4 .4 . [( ) ]

3

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68

00

0

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(1 )sp f

Perfiles de concentración dentro de una partícula de catalizador esférico

β/ β0

Illanes et al. (2003)

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69

1/v’’

Grunwald (1989). Determination of effective diffusion coefficient: an important parameter for the efficiency of immobilized biocatalysts. Biochem Educ 17:99–102

Handriková et al. (1996). Enzyme and Microbial technology 18: 581-584

Difusividades de lactosa en varios sistemas

Sistema Difusividad (cm2/seg)

K. fragilis en gelatina (5%, 37°C)

4.21x10-8

Gelatina (5%, 5°C) 1.44x10-6

E. Coli en carragenina y goma de algarrobo (5%, 32°C)

3.53x10-8

Carragenina y goma de algarrobo (5%, 32°C)

1.285x10-8

Agua (25°C) 4.9x10-6

Fuente: Castillo et al. (1991)

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70

Método de Clark y Bailey (1983). (Gráfico Eadie-Hofstee)

Engasser (1978)

Engasser and Horvath (1973)

Polakovic et al. (2001) (diseño óptimos)

Bruce et al. (1974)

Referencias Bibliográficas Illanes A. (2008). Enzyme biocatalysis: principles and applications. Springer. Guisan et al. (2007) . Immobilization of enzyme on glyoxil Agarose. In: immobilization of enzymes and cells. GF. Bickerstaff (ed.). Humana Press.

Engasser and Horvath (1973). J. Theor. Biol. 42: 137-155.

Engasser (1978). Biochimica et Biophysica Acta, 526: 301-310.

Handriková et al. (1996). Enzyme microbial technology 18: 581-584. Polakovic et al. (2001). Chemical engineering science 56: 459-466.

Castillo E. et al. (1991). Enzyme and Microbial Technology 13: 127-133.

Bruce et al. (1974). Effect of Diffusional limitations on Lineweaver-Burk plots for immobilized enzymes. AICHE 20: 503

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GRACIAS

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teoría y practica en cinética enzimatica