• CINETICA ENZIMATICA

Dra EMMA GUERRERO HURTADO

CINETICA QUIMICACINETICA QUIMICA

Cinética Química es aquella parte de la Química que se encarga de estudiar la velocidad de una Reacción Química y los factores que permiten su control. Se limita a :

a) Reacciones Reversibles

CLASIFICACION DE LA REACCIONES QUIMICAS

• Según el número de moléculas:A P

A + B p

A + B + C P

SEGÚN EL NÚMERO DE REACCIÓN

R. Primer Orden: A P

V= -d A= K (A)dT

R. Segundo Orden: A+ B P

V= -dA = -dB ó + dP dT dT dT

V= K (A) (B)

CINETICA DE MICHAELIS-MENTEN

En 1913 Michaelis y Menten de Hill propusieron una teória para explicar la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima, en función a la concentración del sustrato.

La concentración de sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima, llamada valor Km o Constante de Michaelis, se puede determinar experimentalmente graficando v1(velocidad inicial) como función de [S].La expresión de Michaelis-Menten Vo = Vmax [S] Km + [S]

M.M.en 1913 investigaron el siguiente sistema :

Sacarosa Glucosa + Fructosa

Midieron la velocidad inicial Vo en condiciones experimentales

a)(E) variable y (S) constante

b)(E) constante y (S) variable

invertasa

agua

(E)

A) Efecto de la (E) sobre la velocidad Enzimática

Vo

Vo & (E)

-------------------------------------------------------

Vo 1/2 Vmax

Sustrato KM

B) Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción

(S)

KM = Constante de Michaelis -Menten

Constante global que sustituye o engloba las constantes de velocidad de la reacción de interacción entre el enzima y el sustrato Vo = Velocidad inicial de reacción

Vmax = Cuando el enzima se halla saturado

Se supone:

E + S ES

ES E + P

Como se relacionan Vmax, Km y Vo?

• Observemos : *

• K1 K3

• E + S ES E + P • K2 K4

• Que hay un solo sustrato

• Que la velocidad K4 se desprecia

• * Que la concentración del E es muy pequeña

• * Que la E puede estar como: E libre y ES

• * Que el equilibrio alcanzado por K1 es más rápido que K3, por lo que éste es limitante determina, o limita, la

cantidad de producto formado

POR LO QUE...

• LA FORMACION DEL PRODUCTO SERA:

• VO = K 3(ES)

• LA ECUACION RESULTANTE SERA:• VO =Vmax.(S)

•

Ecuac. MichaelisMenten

(S) + Km

La dependencia de la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzima en [S] y en Km puede aclararse valorando la ecuación de Michaelis-Menten como sigue:

.-1) Cuando [S] es igual que Km:

vo= Vmax*[S] vo = Vmax*[S] = Vmax[S] = VmaxVmax Km + [S] [S]+ [S] 2[S] 22

2)2) Km= Km= K2 + K3/K2 + K3/ K1K1

Si K2>> K3 Km =K2/K1Si K2>> K3 Km =K2/K1

K m= K m= (E) (S)(E) (S) KK = = (E) (S)(E) (S) (ES) ES)(ES) ES)

SIGNIFICADO E LA VELOCIDAD MAXIMA

• Vmax= K3 (ET)

• # de recambio

• K3= número de moléculas de Sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo, cuando la enzima esta saturada

NÚMERO DE RECAMBIONÚMERO DE RECAMBIO

Carboxipeptidasa 102

Tripsina 102 a 103

Cinasas 103

Deshidrogenasas 103

Transaminasas 103

Anhidrasa carbonica 106

Superoxido dismutasa 106

catalasa 107

DETERMINACIÓN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA ECUACION LINEAL

Se tiene: vo= Vmax*[S] se invierte 1 = Km + [S] Km + [S] vo Vmax*[S]

Se factoriza 1 = Km * 1 + [S] vo Vmax [S] Vmax[S]

Se simplifica: 1 = Km * 1 + 1 vo Vmax [S] Vmax

La ecuación de la recta es: y = a * x + b

La ecuación de la recta es: y = a * x + b

donde: y = 1 y x = 1 Vo [S]

El valor de Km puede ser hallado a partir de la gráfica de Lineweaver-Burk o del doble reciproco usando la pendiente y la intersección negativa de x.

Representación recíproca doble(Lineweaver - Burk)

1/s

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

1 1 1v

KV s V

m

m x m x

-1/Km

1/Vmax

y = a * x + b

INHIBICION ENZIMATICA

• ENTENDEMOS COMO EL EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS SOBRE LA VELOCIDAD CATALITICA DEL ENZIMA

• APLICAMOS LA ECUACION DE LINENWEAVER-BURKE EN LA IDENTIFICACION DEL TIPO DE INHIBICION.

INHIIBIDORES

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E + I EI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:

E + I E’

ES + I ESI

INHIBICIÓN REVERSIBLE

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, IMPIDIENDO LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO: Inhibición Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, NO IMPIDE LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva

E ES

EI

I

S

E + P

Características:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato.- El inhibidor es tan específico como el substrato

Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor:

Ki = [E] [I]

[EI]

Inhibición Competitiva

Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo.

1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

-1/Km

-1/(Km(1 + i/Ki))

1/Vmax

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

COO-

CH2

CH2

COO-

FAD FADH2COO-

CH

CH

COO-

Succinato Fumarato

SDH

Succinato deshidrogenasa COO-

CH2

COO-

Malonato

COO-

C O

CH2

COO-

Oxalacetato

Inhibidorescompetitivos

COO-

CH2

CH2

COO-

Succinato

COO-

C O

CH2

COO-

Oxalacetato

Inhibidores competitivoscomo ánalogos estructurales

del substrato

E ES

EI

I

S

E + PI

ESI

S

Inhibición No Competitiva

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI

ni el complejo ESI son productivos

INHIBICION NO COMPETITIVA

• E + I EI

• I + ES ESI

• El agente quelante EDTA se une reversiblemente al

Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe así de

modo no competitivo a algunas enzimas que precisan

esos iones para su actividad.

DROGA USO TERAPEUTICO

ENZIMA AFECTADA

TIPO DE INHIBICION

Lovastina Hipercolestero

lemia

HMGCoA reductasa

Competitiva

5fluoroacil cancer Dihidrofolato reductasa

competitiva

alopurinol gota Xantino oxidasa

irreversible

cumadin anticoagulante Glutamilcar

boxilasa

competitiva

captopril hipertensión ECA competitiva

concepto de Análogo de Estado de Transición (AET)

- El inhibidor no es estrictamente análogo del substrato, sino del Estado de Transición de la reacción.

- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del orden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que puede considerarse irreversible

Substrato

Estado detransición

Análogo deestado de transición

EN EL ESTADO DE TRANSICIÓN LAS INTERACCIONES ENTRE LA ENZIMA Y EL SUSTRATO SON ÓPTIMAS

INHIBICIÓN IRREVERSIBLE

- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente

E + I E’

-El efecto de los inhibidores irreversibles depende del -tiempo de actuación del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH,

(a) Agentes alquilantes

E SH E S CH2 COO-

ICH2 COO- IHYodoacetato

(b) Compuestos insaturados

N CH2 CH3

O

O

E SHE S

N CH2 CH3

O

O

N-Etil maleimida (NEM)

Reactivos de grupos -SH, 2

(c) Formadores de mercáptidos

HOHg COO-

E SH E S Hg COO-

p-Hidroximercuribenzoato

(d) Oxidantes

Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro

Organofosfóricos

CH CH2 OHSer

PF O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3C

CH CH2 O P O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3C

Ser

DFP:diisopropilfluorofosfato

- Actúan sobre enzimas serínicas- Únicamente sobre la Ser activa- Insecticidas: Parathion, Malathion- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa

Ligandos de coordinación de metales

Es el caso del ion cianuro, CN-

Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinacióndel Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior.

Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadísima toxicidad

SUBSTRATOS SUICIDAS

(Inhibidores activados enzimáticamente)

- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos

- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola

-Tienen por tanto : (a) la especificidad del inhibidor competitivo y

(b) la potencia de los inhibidores irreversibles

E + I EI EI* E’ + I*

Modo de acción de los inhibidores suicidas

1 2 3

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional

2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*

3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

INHIBIDORES SUICIDAS,

- SISTEMA DE LA -LACTAMASA BACTERIANA

La utilización masiva de antibióticos -lactámicos (penicilinas,sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido ala aparición de resistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son porproducir una enzima, la -lactamasa, que inactiva a los antibió-ticos -lactámicos.

R CO NHS

NO

CH3

CH3

COO-

R CO NHS

HN

CH3

CH3

COO-

CO

O-

-Lactamasa

Penicilina (activa)

Ác.peniciloico (inactivo)

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinassemisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicidade la -lactamasa, el ácido clavulánico

O

NO

COO-

CCH2OH

H-Lactamasa

O

HN

COO-

CCH2OH

H

CO

O-

O

HN

COO-

CCH2OH

H

CO

OCH2CHSer

Esta moléculareacciona con la

serina activa de la-lactamasa,

produciendo suinactivación

Ác.clavulánico

- SISTEMA DE LA MONOAMINO OXIDASA (MAO) CEREBRAL

Los estados depresivos, en general, están relacionados con undescenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones delcerebro.

Una de las enzimas encargadas de la degradación de estos neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).

Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea comoterapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchosinhibidores suicidas de la MAO

HO

HO

CHOH CH2 NH2

O2 + H2O

NH3 + H2O2

HO

HO

CHOH CHO

Noradrenalina

Dihidroxifenilglicol

Monoaminooxidasa

La MAO es una flavoproteína:tiene un grupo prostéticoflavínico (FAD) fundamentalpara la catálisis. Los inhibidoressuicidas de la MAO inactivanal cofactor FAD.

HC C CH N+CH3

CH3

N

NNH

N

H3C

H2C

O

OSE

R

N

NNH

NH

H3C

H2C

O

OSE

R

CH

CHCHN+H3C

H3C

Flavina

Flavina modificada

N,N’ dimetilpropargilamina

(pargilina)

Inhibición suicida de laMAO mediante Pargilina

CINETICA DE REACCIONES BIMOLECULARES

1 )Reaccion Secuencial o de Desplazamiento Simple

Azahar:

A +E AE

A E + B AEB

B+ E BE

BE + A BEA

2) ORDENADA

MALATO + NAD

OXALACETATO + NADH.

E-NAD-MALATO 1 2

M.D

2) REACCION DE DOBLE DESPLAZAMIENTO

ASPARTATO + OXOGLUTARATO

OXALACETATO + GLUTAMATO

1) Aspartato + PLP-E NH3- PLP-E + Oxalacetato

2) Oxoglutarato + NH3 PLP-E + Glutamato

qué son las moléculas efectoras o moduladoras ?Son moléculas que pueden ser activadores (+) o inhibidores (-) de la velocidad catalítica.

No cambian la afinidad del enzima por el sustrato.

Pueden ser el mismo sustrato denominado HOMOTROPICO o es otra sustancia al que se le conoce como HETEROTROPICO

ES DIFERENTE A LAS

ENZIMAS ANTES VISTAS?

¡SI!!

PORQUE LOS E.A. PRESENTAN 2 LOCALIZACIONES DE UNION DE LIGANDOS:1.- Las catalíticas (Centro Activo) a las que se une el sustrato.

2.- Las reguladoras (Centro Alostérico) a las que se unen las moléculas denominada efectores o moduladores.

S EF

S

EF

ENZIMA

CA C.ALOST.

ENZIMAS ALOSTERICAS

CINETICA SIGMOIDEA

La unión cooperativa de la primera molécula de S o ligando a la Enzima incrementa la velocidad de unión de subsecuentes moléculas de sustrato a los otros sitios de unión: cooperatividad positiva

Enzimas

susceptibles de

ser modificadas

por moléculas

pequeñas.

ENZIMAS ALOSTERICAS

T

• ESTADO CONFORMACIONAL

R

Baja afinidad por el sustrato

Alta afinidad por el sustrato

MODELOS DE INTERACCIONES ALOSTERICAS

MODELO CONCERTADO:

+ S

RR

RR

TT

MODELO SECUENCIAL :

+ S

+ S

RT

RR

TT