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ANALISIS LABORATORIAL INFLUENZA AVIAR
Teresa Nuez PoloDepartamento de microbiologíaUASA Conselleria Agricultura Pesca y Agua17/02/2016
EL BROTE DE INFLUENZA AVIAR EN FRANCIA SE ACERCA A ESPAÑA
● Pirineos Atlánticos, el departamento que hace frontera con Gipuzkoa y Navarra La cepa detectada es H5N2 altamente patógena y ha aparecido en una granja de patos de 1.280 cabezas. No es un caso aislado.
H5N2 15,02/2016 HPAI INCUBADORA.
H5N9 09/02/2016 HPAI.POLLOS
(LPAI) H5N2 EN PATITOS (LPAI) H5N2 EN PATITOS (LPAI) H5N3 EN PATOS 22/01/2016
INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAREnfermedad OIE de la lista A
VIRUS DE LA FAMILIA ORTHOMIXOVIRIDAE:
GENEROS:
INFLUENZA A aves, mamíferos y hombreUN VIRUS ARN SEGMENTADO DE CADENA NEGATIVA
la IA denominada altamente patógena (HPAI) conocida como “peste aviar” es una de las enfermedades más temidas
INFLUENZA B
INFLUENZA C
THOGOTOVIRUS O INFLUENZA D
INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR
Tipo A : hemoaglutinina (H) y neuraminidasa (N)
15 subtipos HAs (H1-H15)
9 subtipos NAs (N1-N9)
Aislando en aves todas las combinaciones posibles
Subtipos H5 y H7 predominantes en los brotes de IA en aves de corral
aunque no todos son virulentos HPAI.
virus (LPAI) HPAI. proceso mas grave
MUTACIONES O RECOMBINACIONES
INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR
La mayoría de los virus de la gripe aviar no infectan al ser humano, pero algunos, como A(H5N1) y A(H7N9), causan infecciones humanas graves, contacto directo o indirecto con aves de corral infectadas
en aves de corral pueden ser motivo de preocupación para la salud pública mundial por su por la posibilidad de que causen enfermedad humana grave, y por su potencial pandémico.
La aparición de epidemias de gripe aviar HPAI. en aves de corral como el A(H5N1) puede tener graves repercusiones en la economía local y mundial, así como en el comercio internacional.
No hay pruebas de que la enfermedad pueda transmitirse a las personas a través de los alimentos, siempre que hayan sido bien cocinados.
El control de la enfermedad en los animales es la primera medida para reducir el riesgo para el ser humano.
INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR
HOSPEDADORES NATURALESpatos y aves acuáticas: tracto gastrointestinal en lugar del respiratorio
de forma subclínica, siendo reservorio del virus en la naturaleza :
Liberan el virus durante 30 días Resistencia del virusInfecten otras especies (Cerdos, Caballos,Visones, Aves de corral, Mamíferos acuáticos)
Los cerdos son susceptibles a cepas aviares y humanas por lo que se les considera verdaderas cocteleras en las que se pueden producir cepas nuevas de composición mixta
INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR
TRANSMISION:En explotaciones avícolas :contacto directo o indirecto con aves acuáticas infectadasEstas liberan virus en heces, secreciones nasales y orales No demostrada la transmisión vertical
PROPAGACIÓNVirus en explotación se disemina de granja a granja
mecánica avesequipos utensilios,personal aérea si la densidad de animales es alta
Resiste activo largos periodos de tiempoHeces: 8 díasAgua contaminada: 4 díasMaterial orgánico granja infectada: 100diasSENSIBLE Tª 60ºC/30´ y UV
PROGRAMA VIGILANCIA DE IA EN AVES DE CORRAL 2016MUESTREO REPRESENTATIVO EN CCAA
Vigilancia activa y pasiva
OBJETIVO
DETECCION A TRAVES DE VIGILANCIA ACTIVA DE:
-INF.SUBC DE LPAI DE H5 Y H7 EN AVES GALLINACEAS Y RATITES PARA EVITAR DISEMINACIÓN Y POSIBLE MUTACIÓN A CEPAS DE ALTA PATOGENICIDAD HPAI.
-INFECC.LPAI DE H5 Y H7 Y HPAI EN PATOS, GANSOS Y AVES DE CAZA ANÁTIDAS
PROGRAMA VIGILANCIA DE IA EN AVES DE CORRAL 2016MUESTREO REPRESENTATIVO EN CCAA
OBJETIVO
VIGILANCIA PASIVA
VIGILANCIA CLINICA DE LAS AVES POR EL PROPIETARIO O VETERINARIO Y
REMISION A LABORATORIO MUESTRAS DE AVES MUERTAS O ENFERMAS
ESPECIAL: AVES ACUATICAS, SILVESTRES MIGRATORIAS ESPECIES OBJETIVO
PROGRAMA VIGILANCIA DE IA EN AVES DE CORRAL 2016
MUESTRAS ANÁLISIS SEROLÓGICOS ELISA:
EL NÚMERO DE EXPLOT. A CHEQUEAR :PARA GARANTIZAR LA IDENTIFICACIÓN COMO MINIMO DE UNA EXPLOT INFECTADA EN CASO DE PREVALENCIA 5% CON UN INTERVALO DE CONFIANZA 95%
EN INSTALACIONES:AVES DOMESTICAS Y RATITES
EXPLOTACIONES /MANADAS DE AVES DE CAZA ANÁTIDAS, PATOS Y GANSOS DOMÉSTICOS (MEDIO AMBIENTE)
PROGRAMA DE VIGILANCIA EN AVES SILVESTRES
PROGRAMA DE VIGILANCIA EN AVES SILVESTRES
ESPAÑA IMPORTANCIA INTERNACIONAL DE PASO DE AVES . • ACUATICAS • LIMICOLAS Y MARINAS
DOS RUTASCORREDOR ATLANTICOCORREDOR MEDITERRANEO HASTA LA SUR-ATLANTICA
45% ANATIDAS Y FOCHAS30% GAVIOTAS15% LIMICOLAS
PROGRAMA DE VIGILANCIA EN AVES SILVESTRES
OBJETIVODETECTAR (HPAI) DE SUBTIPO H5N1 A. SILVESTRES PROTEGER AVES DE CORRAL
COLABORACION ORNITOLOGOS CON LA AUTORIDAD COMPETENTE
VIGILANCIA PASIVAMUESTREO LABORATORIAL AVES MORIBUNDAS O AVES MUERTAS ACUATICAS
AVES SILVESTRES EN CONTACTO CON MORIBUNDAS O MUERTAS
AUMENTAR VIGILANCIA SI:
EN HUMEDALES SI EXISTEN EXPLOT DOMESTICAS Y ZONAS DE ALTA DENSIDAD
MUESTRAS HISOPOS CLOACALES Y TRAQ U OROFARINGEOSANIMAL MUERTOMUESTRAS TISULARES:ENCEFALO, CORAZON, PULMÓN, TRAQUEA ,RIÑON O INTESTINO
NOTIFICACIÓN DE ENFERMEDADRD526/2014DE 20 de junio por el que se establece lista
de enf. de DO
Los titulares , propietarios criadores o personal de instalaciones de animales cautivos notificaran si demora a la autoridad competente de Sanidad Animal alguno de estos signos
Caida consumo pienso o agu >20%
Caida puesta >5% durante dos dias
Mort >3% durante una semana
Cualquier signo clinico o post morten sospechoso
INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR
SINTOMATOLOGÍA• Cese postura• Signos respiratorios• Lagrimeo• Edema cabeza y cara• Hemorragias subcutáneas• Cianosis piel, cresta y barbillas• Diarrea• Ocasionalmente signos neurológicos• Puede llegar al 100% de mortalidad
Los subtipos menos virulentos:• Caída puesta• Enf. Respiratoria • Anorexia• Depresión• Ligero aumento de la mortalidad
SINTOMAS
HPAI edema periobital en un brolier
HPAI incoordinacion movimientos en broiler
SINTOMAS
HPAI ponedora en fase preagónica con postración y rechazo al
movimiento
congestion y cianosis de cresta y barbillas
INFLUENZA AVIAR O PESTE AVIAR
LESIONESLas aves que mueren de forma aguda :Fuerte congestión en musculatura y deshidratación Congestión conjuntiva con petequiasHemorragias petequiales en peritoneo y superficies serosas piel,hígado,bazo,corazón,riñón, pulmón, molleja y proventrículoriñón tubulos renales con uratosEdema subcutáneo en cabeza y cuelloExudado mucoso en traqueaTraqueitis hemorrágica similar a laringotraqueitisPancreatitisExudado serofibrinoso en pericardioBazo nódulos linfoides necróticosEn gallina ponedoras ovario hemorrágica y cavidad peritoneal llena de yema de huevos rotos
LESIONES
HPAI traqueitis catarral en gallina ponedora II
LESIONES
HPAI congestión del músculo pectoral en una gallina ponedora
hemorragia traquea
LESIONES
HPAI hemorragias en el epicardio de reproductora de carne
HPAI hemorragia en grasa abdominal gallina ponedora
LESIONES
hemorragias intestino
FOLICULOS HEMORRAGICOS
LESIONES
HPAI congestión y hemorragia de folículos ováricos
HPAI folículos ováricos hemorrágicos en gallina puesta
LESIONES
HPAI Esplenomegalia y folículos ováricos hemorrágicos
HPAI focos necróticos en el bazo de reproductora de carne
HPAI focos necróticos en
bazo
LESIONES
HPAI pancreatitis
HPAI pancreatitis y duodenitis en una oca
LESIONES
HPAI congestión del riñón y depósitos de uratos en uréteres
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
Los síntomas y lesionesEn LPAI: pueden variar dramáticamente En HPAI: se confunden
Enfermedades con las que puede confundirse
Cólera aviar agudo
Forma velogénica de la enfermedad de Newcastle
Enfermedades respiratorias: laringotraqueítis infecciosa
Toma de muestras
TOMA DE MUESTRAS
IMPORTANCIA BIOSEGURIDAD PERSONAL EXTREMA
GAFAS GUANTES
MASCARILLAS
MONOS BOTAS
LEJIA
VACUNACIÓN
TRANSMISIÓN DEL VIRUS
NORMAS BASICAS DE HIGIENE Y BIOSEGURIDAD PRESERVAR EXPLOTACIONES
IDENTIFICACION Y ACREDITACION , NO INTRODUCIR VEHICULO NO SUPERAR LA ZONA DE DESINFECCIÓN
ANOTAR VISITA EN LIBRO DE REGISTRO
CUMPLIR NORMAS DE BIOSEGURIDAD EXPLOTACION :PEDILUVIOS ,PASILLOS DE CAL, DESINFECC ETC , AL ENTRAR LAVARSE Y DESINFECTARSE LAS MANOS
USO DE LA ROPA PROPORCIONADA EN EXPLOT. MASCARILLAS ETC. SI SE INDICA DUCHA Y
SI POR EL CONTRARIO NO SE NOS INDICA NADA AL RESPECTO• ROPA Y CALZADO ESPECIFICO DE PROTECCION LIMPIO Y PULCRO• MONOS DESECHABLES• CALZAS
SI CABINAS DE DESINFEC. MEDIDAS PARA EVITAR IRRITACION DE PIEL Y MUCOSAS
EVITAR ENTRADAS Y SALIDAS INNEC. LAS VISITAS SEGUIR ORDEN DE MENOR EDAD A MAS EDAD
TODO MATERIAL DESECHABLE DEPOSITAR EN BOLSA O CONTENEDORES DE RESIDUOS A LA SALIDAD ELA EXPLOT.
MANTENER ESTRICTO ESTADO DE LIMPIEZA DE PUERTAS ADENTRO COMO DE PUERTAS AFUERA
PROGRAMA DE VIGILNCIA DE IA EN ESPAÑA 2016
20 MUESTRAS POR INSTALACIÓN ELISA O IH
Si serología +(H5,H7): 20m. Serología y 20 hisopos traq y cloaca o 5 aves enfermas o muertas para PCR (H5,H7,H1) ,secuenciación , inoculación en embrión de pollo
Si H5 H7 + encuesta epidemiológica
Los resultados de los LLAA se remiten semestral SGSHAT
Remisión de muestras al LNR acompañada del anexo II
Remitir al LCR los virus hemaglutinantes , guardar copia de suero sanguineo del orden anseriforme
MUESTRAS SEROLOGIALA CALIDAD DE LA MUESTRA ASÍ COMO LA CANTIDAD SON FACTORES CLAVE PARA LA OBTENCIÓN DE UN BUEN
RESULTADO:
VENA BRAQUIAL AGUJA O BISTURI
COLECTAR LA SANGRE MINIMO 3ML. SANGRE O 1ML.SUERO
TUBO SIN ANTICOAGULANTE
EN POSICIÓN HORIZONTAL PARA DESUERADO
ENVIO REFRIGERACIÓN (4ºC) /24H.
NO CONGELAR LA SANGRE ENTERA
VIGILANCIA VIROLOGICA
Vigilancia en aves silvestres :
Hisopos cloacales y traqueales u orofarÍngeosMuestras tisulares:
EncéfaloCorazónPulmónTráqueaRiñonIntestino
Adecuado almacenamiento y transporte (inmersión en transporte vírico) refrigeración y remisión inmediata a laboratorio
El transporte de las muestras
Torunda oHisopo o
heces frescas
Colocar en medio de transporte estéril (con
antibióticos)PBS, pH 7,0 – 7,4 con penicilina (2.000 u/ml),
estreptomicina (2 mg/ml) en muestras de tejidos o hisopo traqueal (5 veces mas en el
caso de heces)
Identificar muestra
Introducir en un recipiente adecuado
Las muestras para aislamiento vírico:• Deben mantenerse en condiciones de refrigeración (4ºC)• Los cadaveres en refrig. No mas de 72h o congelados• Deben ser analizadas entre 24 y 48 h como máximo
Las muestras remitida al Laboratorio de forma
rápida (para evitar su deterioro)
*segura (para evitar la posible infección de otros animales durante el transporte, así como para evitar la contaminación de las mismas muestras).
El envío a 4ºC con un refrigerante dentro de la caja.
Las muestras con un mismo origen (granja, explotación, lote, etc.) deben ir dentro de una caja cerrada y sellada.
En el exterior de la caja se incluirá un informe
En el exterior de la caja debe llevar la siguiente identificación:
1. Etiqueta de “Consérvese a 4ºC.2. Nombre y dirección completa del remitente.3. Dirección del Laboratorio de destino.4. Muestras IA en rojo
Envio de muestras
*REMISION DE MUESTRAS SEGURA
1. EMBALAJE PRIMARIO Estanco enroscable Si van varios recipientes primarios cada uno envuelto individualmente para evitar dañosNo deben contener mas de 500g o 500ml
2. EMBALAJE SECUNDARIOCon suficiente material absorbente para absorber contenido del embalaje primario en caso de
rotura o filtracionesEstanco debe de medir en su superficie externa, al menos 10cmDebe poder llevar los documentos necesarios del transporte
3. EMBALAJE EXTERNONo debe contener mas de 4 litros o 4 kgSi es necesario se pondrá hielo seco o húmedo alrededor del e. secundarioEn caso de hielo seco el envoltorio debe permitir la salida de dióxido de carbono para evitar
incrementos de presiones que lleven a la ruptura del paqueteEntre el e. secundario y el externo se debe incluir lista detallada de los contenidos del paqueteEl embalaje externo de introducirse en una bolsa sellada de plástico para protegerlo de la
humedad
● HOJA DE REMISION DE MUESTRAS
● Señalar si es plan de vigilancia o es sospecha● Categoria del ave o especie en caso de aves silvestres● Datos del remitente
DIAGNOSTICO LABORATORIAL
LABORATORIOS Y PRUEBAS DE LABORATORIO
LNR LCV de Algete
LA CCAA(apoyo y reactivos)
ELISA
Inmunoensayo en la cual un antigeno, o anticuerpo inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo o antigeno enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, con cambio de color
ESPECTROFOTOMETRO
PCRMETODO ENZIMATICO IN VITRO QUE PERMITE AMPLIFICAR MILLONES DE
VECES UNA SECUENCIA DE ADN ESPECIFICA
OBJETIVO ES LA DETECCIÓN VIRUS INFLUENZA A Y DEL VIRUS PANDEMICO H1N1(2009)
MEDIANTE LA RETROTRANSCRIPTASA PCR(RT-PCR)POR TECNOLOGIA PCR EN TIEMPO REAL A
PARTIR DE MUESTRAS DE ORIGEN ANIMAL
TECNICA OPTIMIZADA PARA DETECTAR VIRUS INFLUENZA :
AVIAR
PORCINO
VARIANTE H1N1
PRIMERS M+25 M-124 Y M-124 MODIFICADO
PCRINACTIVACIÓN
1)MUESTRAS( VISCERAS , HECES, HISOPOS DE ARRASTRE) SE
INACTIVAN TERMOBLOQUE EN P3 ( GENOMA VIRICO RNA)
PCR
2) EXTRACCION POR COLUMNAS, BOLAS MAGNÉTICAS O POR CALOR
PCR3)AMPLIFICACIÓN DE ADN O ARN SELECCIONAR UNA REGION DEL
GENOMA A ESTUDIAR Y REALIZAR MULTIPLES COPIAS
Sintesis in vitro del acido nucleicoTAMPONCLORURO DE MAGNESIOMASTER MIX comercialDESOXINUCLEOTIDOS TRIFOSFATO dNTPsPRIMERS INICIADORES O CEBADORESTaq POLIMERASA ACIDO NUCLEICO MOLDE obtenido de la extracción .el ARN previamente es
transformado en ADNc mediante la transcripción inversaSONDA ESPECIFICA utilizan oligonucleotidos fluorescentes
PCR-FASE DE DESNATURALIZACIÓN separación de las dos hebras de ADN 94-95ºC
-FASE DE ANILLAMIENTO unión de los primers a la hebra correspondiente de
ADN 50-60ºC
-FASE DE EXTENSIÓN :La ADN POLIMERASA comienza a añadir nucleótidos por
los extremos de cada uno de los primers reproduciendo así la secuencia del ADN
MOLDE 72ºC
PCRRESULTADO
Ct Cycle threshold Numero de ciclos necesarios para aumento d
fluorescencia significativo con respecto a una señal base viene dado
por termociclador y es invers proporc a la cantidad inicial d
moleculas molde
CT
IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS LNR ALGETE
INOCULACIÓN DE HUEVOS DE GALLINA EMBRIONADOS DE 9-11 DÍAS DE EDAD SEGUIDA POR:
DEMOSTRACIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN PARA CONFIRMAR LA PRESENCIA
DEL VIRUS DE LA INFLUENZA A DETERMINACIÓN DEL SUBTIPO CON ANTISUEROS
MONOESPECÍFICOS
EVALUACIÓN DE LA VIRULENCIA DE LA CEPA: EVALUACIÓN DEL
ÍNDICE DE PATOGENICIDAD INTRAVENOSO EN GALLINAS DE 4-8
SEMANAS DE EDAD SI >1,2 (HPAI)
GRACIAS
