Terhes nık véralvadási paramétereinek

monitorozása, fibrinogéneredmények statisztikai

elemzése

RRRééégergerger Barbara, FBarbara, FBarbara, Füüüzinzinzinééé BudosBudosBudosJulianna, Julianna, Julianna, LitterLitterLitter IlonaIlonaIlona

Baranya Megyei KBaranya Megyei KBaranya Megyei Kóóórhrhrh áááz Klinikai z Klinikai z Klinikai ééésss

MikrobiolMikrobiolMikrobiol óóógiai Laboratgiai Laboratgiai Laboratóóórium rium rium

PPéécs, MOLSZE XI. Nagygycs, MOLSZE XI. Nagygyőőlléés, 2009.08.28.s, 2009.08.28.

Bevezetés

• Köztudott tény, hogy a terhesség hyper-coagulációs irányba változtatja a haemos-tasis rendszert

• A terhesség elırehaladtával az egyéb véralvadási faktorokkal együtt a fibrinogén(Fg, Faktor I.) szintje is megemelkedik

• Vizsgálatunk célja az volt, hogy ezt a folyamatot nyomonkövessük és megfelelıstatisztikai módszerekkel értékeljük

Fibrinogén/Fibrin

• Fibrinháló létrehozásával a véralvadási rendszer egyik legfontosabb eleme

• Megakadályozza az érpályából történıvérvesztést

• A véralvadási folyamat végterméke• Fibrinolitikus folyamat kiindulópontja• Májban és a megakaryocytákban terme-

lıdik

• 3000 AS – ból álló, helikális szerkezetőszolubilis glikoprotein

• Szerkezetileg 3-pár láncból áll: Aα, Bβ, γ, melyeket diszulfid hidak kötnek össze

Fibrinogén

Fibrinogén

Fibrinolízis során a plazmin a „trinoduláris”molekulát egy centrális (E-domain) és két terminális (D-domain) részre hasítja

Fibrinogén

• A plazma fibrinogén (Fg) ~340 kD• Kombinált analitikai eljárással többféle

molekulatömegő Fg különíthetı el:

→ VLMW-Fg = 280 kD→ LMW-Fg = 300 kD→ HMW-Fg = 340 kD→ VHMW-Fg = 420 kD

A fibrinogén akut fázis protein

• Pozitív akut fázis fehérje, a gyulladásos folyamatok, szövetszétesés indikátora

• Gyulladásos megbetegedések akut fázi-sában nagymérető molekulák szinteti-zálódnak (HMW-Fg, VHMW-Fg), melyek a keringésbe kerülve veszítenek glikáltságiés foszforiláltsági szintjükbıl, proteolitikushatások következtében pedig egyre kisebb fragmentumokká degradálódnak

Akut fázis proteinek dinamikája

• Félélet idı: 3-4,5 nap• Referencia tartomány: 2.0-4.0 g/L

(reagens, módszer, referens anyag; 2005)• Korrekt haemostasis fenntartásához szük-

séges minimális koncentráció: 0.8 g/L• Alacsony Fg-szint, vagy kóros molekula-

szerkezet vérzésveszéllyel járhat

Fibrinogén

• Emelkedett Fg-szint növeli a szív- és ér-rendszeri betegségek rizikóját, az artériás-és vénás trombózis valószínőségét

• Fg mérsékelt emelkedése figyelhetı meg:

–– TerhessTerhess éégg– Dohányzás– Orális fogamzásgátló– Ösztrogén adás során

A fibrinogén biológiai variabilitása

Fiziológiás folyamatok jelentısen befolyásolják a Fg biológiai variabilitásának értékét →

CVW = 15,8% (Westgard)Pl.: napi-, havi-, szezonális ciklus, nem, életkor, terhesség, életvitel, étkezési szokások, táplálék kiegészítık, gyógyszerek, stress stb.

Fibrinogén

• Rutin meghatározásának módszerei:

– Gravimetriás– Fehérjemeghatározás fotometriásan (Biuret-

módszer)

– Clauss módszer (rutinban legáltalánosabban használt)

– Kinetikus (derivált)– Immunológiai

Kutatási terv

• Várandós nık véralvadási paramétereit követtük nyomon más laboratóriumi para-métereik mellett, terhességük alatt mind a 3 trimeszterben, a 16., 26. és 36. terhes-ségi héten.

• Jelen elıadásban a Fg eredmények alaku-lását mutatjuk be a terhességi kor elıre-haladtával, kétféle Fg meghatározási mód-szerrel.

Anyag és módszer

• Reagens:1. HemosIL PT-Fibrinogen Recombinant

thromboplastin (nyúlagy, derivált-Fg módszer)Standard visszavezethetısége: International Reference Standard RTF/95 a WHO ajánlásával

2. HemosIL Fibrinogen-C Clauss (bovin thrombin) Standard visszavezethetısége: International

Fibrinogen Standard• Mérımőszer: IL ACL 9000 véralvadási automata

Anyag és módszer

• Minta: Na-citráttal (129 mmol/L) alvadásgátolt TCT-szegény plazma

• 89 terhes nı mintáit vizsgáltuk a várandósságuk alatt mind a 3 trimeszterben (16., 26. és 36. terhességi hétben)

• Centrifugálás: 2000 g, 20 perc, 24 °C• Tárolás: -80 °C-on feldolgozásig

• Statisztikai elemzés: SPSS 15.0 programcso-maggal történt

Módszer precizitás

• Mindkét módszernél meghatároztuk az intra- (within runprecision) ill. az intervariabilitás (day to day precision) mértékét Calibration plasma-, Normal control- és Lowcontrol bemérésével.

Fg (g/L) TargetWithin runprecision

n=18

Day to dayprecision

n=20Átlag SD CV % Átlag SD CV %

PT-R Calibration Plasma 3,23 g/L3,046 0,178 5,843 2,975 0,197 6,629

PT-R Normal Control 3,03 g/L3,029 0,112 3,713 3,054 0,194 6,362

PT-R Low Control 1,84 g/L1,814 0,132 7,28 1,847 0,161 8,691

Clauss-Fg Calibration Plasma 3,02 g/L3,122 0,051 1,619 3,167 0,144 4,547

Clauss-Fg Normal Control 2,91 g/L3,104 0,07 2,27 3,102 0,165 5,311

Clauss-Fg Low Control 1,78 g/L1,8 0,041 2,258 1,847 0,1 5,402

Statisztikai elemzés

Normalitásvizsgálat:

Grafikai tesztek:1. Boxplot diagram (kiugró értékek elemzése)

2. Hisztogram (eloszlásdiagram, haranggörbe)3. P-P Plot (Normál eloszlás ábra)

Statisztikai tesztek:1. Kolmogorov-Smirnov-próba

2. Shapiro-Wilk-próbaÖsszesen hat adatsort vizsgáltunk: 3 trimeszter Fg adatai két módszerrel

Eredmények

838383N =

Fib C (g/L) 36. hét

Fib C (g/L) 26. hét

Fib C (g/L) 16. hét

10

9

8

7

6

5

4

3

2

81

3

10128151

69

• Boxplot ábra(mind a három trimeszterben, kiugróértékekkel)

Derivált módszer Clauss módszer

898989N =

Fibr (g/L) 36 hetes

Fibr (g/L) 26 hetes

Fibr (g/L) 16 hetes

9

8

7

6

5

4

3

32489

5171

• Boxplot ábra(mindhárom trimeszterben, kiugró értékek kizárásával)

Derivált módszer Clauss módszer

Eredmények

838383N =

Fibr (g/L) 36 hetes

Fibr (g/L) 26 hetes

Fibr (g/L) 16 hetes

9

8

7

6

5

4

3 727272N =Fibr C (g/L) 36. hét

Fibr C (g/L) 26. hét

Fibr C (g/L) 16. hét

9

8

7

6

5

4

3

2

• Hisztogram(2. trimeszter)

Derivált módszer Clauss módszer

Eredmények

Fibr (g/L) 26 hetes

7,25

7,00

6,75

6,50

6,25

6,00

5,75

5,50

5,25

5,00

4,75

4,50

4,25

4,00

20

10

0

Std. Dev = ,67

Mean = 5,62

N = 83,00

• Normál eloszlás ábra (3. trimeszter)

Derivált módszer Clauss módszer

Eredmények

Normal P-P Plot of Fibr (g/L) 36 hetes

Observed Cum Prob

1,0,8,5,30,0

Exp

ecte

d C

um P

rob

1,0

,8

,5

,3

0,0

Normal P-P Plot of Fibr C (g/L) 36. hét

Observed Cum Prob

1,0,8,5,30,0

Exp

ecte

d C

um P

rob

1,0

,8

,5

,3

0,0

Kiugró értékek nélküli adatok statisztikai jellemzıi

Derivált módszer Clauss módszer

Eredmények

Statistics

83 83 83

0 0 0

5,20390 5,62001 6,42420

,078945 ,073781 ,089107

5,10500a 5,58800a 6,32200a

6,259 6,095b 5,495b

,719220 ,672176 ,811808

,517278 ,451820 ,659032

,638 ,099 ,209

,264 ,264 ,264

-,492 -,242 -,498

,523 ,523 ,523

2,698 3,298 3,642

4,106 4,061 4,577

6,804 7,359 8,219

431,924 466,461 533,209

4,58250c 5,20250c 5,75325c

5,10500 5,58800 6,32200

5,55050 6,09533 7,01100

Valid

Missing

N

Mean

Std. Error of Mean

Median

Mode

Std. Deviation

Variance

Skewness

Std. Error of Skewness

Kurtosis

Std. Error of Kurtosis

Range

Minimum

Maximum

Sum

25

50

75

Percentiles

Fibr (g/L)16 hetes

Fibr (g/L)26 hetes

Fibr (g/L)36 hetes

Calculated from grouped data.a.

Multiple modes exist. The smallest value is shownb.

Percentiles are calculated from grouped data.c.

Statistics

72 72 72

0 0 0

4,27394 5,09361 6,02999

,070566 ,084972 ,099266

4,16920a 4,90000a 6,01425a

3,937 4,756b 5,885

,598770 ,721013 ,842299

,358525 ,519859 ,709468

,523 ,262 -,136

,283 ,283 ,283

,152 -,696 -,488

,559 ,559 ,559

2,875 3,081 3,615

2,999 3,670 4,075

5,874 6,751 7,690

307,724 366,740 434,159

3,83710c 4,59767c 5,60400c

4,16920 4,90000 6,01425

4,68914 5,63320 6,72650

Valid

Missing

N

Mean

Std. Error of Mean

Median

Mode

Std. Deviation

Variance

Skewness

Std. Error of Skewness

Kurtosis

Std. Error of Kurtosis

Range

Minimum

Maximum

Sum

25

50

75

Percentiles

Fibr C (g/L)16. hét

Fibr C (g/L)26. hét

Fibr C (g/L)36. hét

Calculated from grouped data.a.

Multiple modes exist. The smallest value is shownb.

Percentiles are calculated from grouped data.c.

• A Kolmogorov-Smirnov próba alátámasztja, hogy az összes adatsor - a páronkénti adatok is normál eloszlásúak (legkisebb p érték p=0,093)

• A normálistól való eltérés nem igazolhatóvagy kicsi, ezért páros t próbá val ellenıríztük a trimeszterek alatti változást és a két metodika összehasonlítását

Eredmények

A két módszerrel kapott Fg eredmények között

szignifikáns a különbség mindhárom trimeszterben(p

A két metodika közti különbség csökken aterhességi kor el ırehaladtával, ill. a Fg-szintemelkedésével (p

16 hetes terhesek

y = 0,8654x + 1,3595

R2 = 0,7613

2,93,43,94,44,95,45,96,46,97,47,9

2,9 3,9 4,9 5,9 6,9 7,9 Fg Clauss (g/L)

Fg (g/L)

Fibr (g/L) 16 hetes

Lineáris (Fibr (g/L) 16 hetes)

26 hetes terhesek

y = 0,7645x + 1,6617

R2 = 0,703

2,5

3,5

4,5

5,5

6,5

7,5

8,5

2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 Fg Clauss (g/L)

Fg (g/L)

Fibr (g/L) 26 hetes

Lineáris (Fibr (g/L) 26 hetes)

36 hetes terhesek

y = 0,759x + 1,7479

R2 = 0,7563

3,94,44,95,45,96,46,97,47,98,48,9

3,9 4,9 5,9 6,9 7,9 8,9 9,9 Fg Clauss (g/L)

Fg (g/L)

Fibr (g/L) 36 hetes

Lineáris (Fibr (g/L) 36 hetes)

Eredmények

Következtetés I.

• A terhesség el ırehaladtával a Fg értékek szignifikánsan emelkednek

• A két módszerrel kapott Fg eredmények között szignifikáns a különbség

• A derivált módszerrel kapott adatok szignifikánsan nagyobbak

• A két módszer közti különbség a terhesség el ıre-haladtával csökken

• A magyarázat talán a biológiai folyamatokat alapvet ıen eltérı módón prezentáló, más-más alapelven m őködımódszerekben rejlik

Következtetés II.

Adataink szerint terhességben az alábbi fibrinogén „referencia tartományok” fogadhatók el:

– Clauss módszerrel (g/L): • 16 hét: 4,43 ± 1 ,65 (91,6%) • 26 hét: 5,14 ± 1,79 (95,2%)• 36 hét: 6,15 ± 1,97 (94,0%)

– Derivált módszerrel (g/L):• 16 hét: 5,22 ± 1,63 (96,6%)• 26 hét: 5,59 ± 1,60 (94,4%)• 36 hét: 6,40 ± 1,72 (95,5%)