Terveyttä ja kauneutta Pohjolan marjoista · 2016. 3. 11. · mansikka –ryhmän tutkimushenkilöistä • Kaikki muutokset liittyivät clostridial-ryhmiin, jotka ovat tärkeimpiä

1 11/03/2016 1

Terveyttä ja kauneutta

Pohjolan marjoista

PilkeCafe360°, Luontokeskus Siida, Inari 2.3.2016

Dosentti Riitta Puupponen-Pimiä

VTT

2 11/03/2016 2

Sisältö: Marjat ja terveys

• Johdanto

• Marjojen bioaktiiviset yhdisteet

• Marjojen polyfenolit

• Marjojen terveysvaikutuksista

• Tutkimusesimerkkejä: 1) Marjojen antimikrobiset ominaisuudet

• 2) Kliininen marjatutkimus

•Prosessoinnilla terveellisempiä ja maukkaampia marjatuotteita • Marjojen bioprosessointi

• Marjojen kuivafraktiointi

• Ekstruusioteknologia

• Marjojen märkäjauhatus

• Marjat ja trendit - Esimerkkituotteita maailmalla

3 11/03/2016 3

Sisältö: Marjat ja kauneus

• Marjat kosmetiikassa

• Luonnollisia säilöntäaineita kosmetiikkaan

• Marjojen antimikrobiset yhdisteet

• Ihon mikrobiston tasapaino • Uudentyyppisiä tuotteita kosmetiikkaan

• Marjojen soluviljelyteknologia

• Avaa uudenlaisia mahdollisuuksia kosmetiikkateollisuudelle

• Kosmetiikkatrendit

4

Pohjoisen luonnon marjat

• Kotimaisia syötäviä marjoja lähes 40

• Poikkeuksellisen suuri määrä bioaktiivisia yhdisteitä

johtuen arktisista kasvuolosuhteista

• Paljon arvokkaita rasvahappoja

• Ainutlaatuinen maku ja aromi

• Voimakas väri

• Vuotuiset sadot huomattavia

• Pitkälti hyödyntämätön luonnonvara!

• Pitkä perinne kansanlääkinnässä: mustikka, karpalo

kiinnostava ja houkutteleva raaka-aine elintarvike-

ja kosmetiikka-teollisuudelle

• Jotkin marjalajit ovat uhanalaisia ja yhä harvinaisempia

luonnossamme

Biotekniikka tarjoaa mahdollisuuden hyödyntää

näitä lajeja luontoystävällisellä tavalla

5 11/03/2016 5 Photo Jouko Lehmuskallio

VTT:n marjatutkimus

6 11/03/2016 6

Lakka

Rubus chamaemorus

Mesimarja

Rubus arcticus

Mustaherukka

Ribes nigrum,

var. Öjeby

Mustikka

Vaccinium myrtillus

Pensasmustikka

Vaccinium

corymbosum

Aronia

Aronia melanocarpa

Var. Viking

Karpalo

Vaccinium oxycoccus

Kaarnikka

Empetrum nigrum

Puolukka

Vaccinium vitis-idaea

Vadelma

Rubus idaeus,

var. Ottawa

Pihlajanmarja

Sorbus aucuparia

Tyrnimarja

Hippophae

rhamnoides

Mansikka

Fragaria ananassa,

Var. Senga Sengana

7

• Koko marjakasvin biosynteesi-

kapasiteetin hyväksikäyttö

• Bioaktiiviset yhdisteet, aromi-

ja väriaineet

• Uudet yhdisteet

Marjatutkimuksen osa-alueet VTT:llä

• Stabiilisuus ja rakenne

• Aistittavat ominaisuudet:

maku, maun ja kemian yhteys

In vitro:

• Antimikrobinen aktiivisuus antioksidanttiaktiivisuus,ruoansulavuu

smallit, solumallit:keratinosyytit,

CaCo-2 ARPE

In vivo

• Kliinisten näytteiden analysointi

metabolomiikan menetelmin

• Marjojen ja marja -

fraktioiden ja –uutteiden

koostumus,

• Aineenvaihduntatuotteiden

analysointi

• UPLC, LC-MS, NMR,

UPLC-MS, GC-MS

• Entsyymiavusteinen prosessointi

• Mikrobifermentaatiot

• Fraktiointiteknologiat

• Uuttoteknologiat

• Jauhatusteknologiat

• Sivuvirtojen hyväksikäyttö

• Pilot-mittakaavan laitteistot

Teknologinen

laatu

Biologiset

vaikutukset

Analytiikka

Prosessointi ja

fraktiointi

Soluviljelyteknologia

8

Bioaktiiviset marjafraktiot erityyppisiin tuotteisiin

Raaka-aineet

Marjojen

sivuvirrat

Prosessoidut

marjat

Marjasolu-

viljelmät

Mikrobiologinen

riskinhallinta Suodattimet

Membraanit

Kosmetiikka Naamiot ja liinat

Kasvovedet

Voiteet

Hygieniatuotteet Ihon desinfiointi

Deodorantit

Saippuat ja kylpytuotteet

Pakkaukset Elintarvikepakkaukset

Eläinten ruoat Lemmikkieläinten ruoat

Siipikarjan rehu

Elintarvikkeet ja

virvoitusjuomat

Markkinat

Luonnolliset

marjapohjaiset

yhdisteet

VTT

IPR

VTT

IPR

VTT

IPR


Marjojen bioaktiiviset yhdisteet

10

Polyfenolit • Flavonoidit

• Tanniinit

• Fenolihapot

Rasvat

Bioaktiiviset yhdisteet

Proteiinit ja peptidit

Hiilihydraatit

• Sokerit

• Kuitu

Vitamiinit ja karotenoidit

• C, E ja A vitamiinit

Sterolit

Orgaaniset hapot

Mineraalit

• K, Mg, Fe, Zn, Mn

http://1.bp.blogspot.com/-poIm03f7dXQ/T1ieqK3YusI/AAAAAAAAEhA/teCL5kKHZ0Q/s1600/lumene2.jpg

11

Flavonoidit

Antosyaanit

Flavonolit

Flavanolit (Katekiinit)

HO O

OH

OH

OH

OH

(+)-Katekiini

Kompleksiset fenolipolymeerit (polymeeriset tanniinit)

OH

OH

OC

O O

O

O O

O

OC OC

CO OC

HO

HO

HO OH

OH

OH

OH HO

HO HO

HO

HO

Kasuariktiini

Ellagitanniinit

Proantosyanidiinit

HO O

OH

OH

Trimeerinen prosyanidiini

(flavanoli)

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

OH

Pelargonidiini Syanidiinn Delfinidiini Peonidini Petunidiini Malvidiini

Kversetiini Myrisetiini Kemferoli

(+)-Katekiini (-)-Epikatekiini Gallokatekiini Epigallokatekiini

HO O

OH

OH

OH

Syanidiini

+

OH

Fenolihapot

Kahvihappo

OH

HO

Kanelihapot

Kahvihappo p-Kumariinihappo Ferulahappo

Bensoehapot

Protokatekiinihappo p-Hydroksibentsoehappo Gallihappo

HO

OH

Gallihappo

HO OH

O OH

O

Lignaanit

HO

OH

OH

OCH3 OH

Sekoisolarikiresinoli

H3CO

HO

OH

OH

OCH3 OH

H3CO

Stilbeenit

Resveratroli

OH

HO

OH

HO O

O OH

OH

OH

Kversetiini

OH

Marjojen polyfenolien luokittelu

Ref. Puupponen-Pimiä et al. 2005 BioFactors 23:243

12

ANTOSYAANIT

• Väripigmenttejä, jotka antavat monelle marjalle tumman punaisen tai sinisen värin: syanidiini (oranssi), delfinidiini, malvidiini ja petunidiini (violetti), pelargonidiini and peonidiini (punainen)

• Esiintyvät marjoissa sokerijohdannaisina

• Suurimmat pitoisuudet tumman sinisissä marjoissa, 6 g/kg tp

• Mustikka

• Aronia

• Kaarnikka

• Pensasmustikka

• Mustaherukka

• Juolukka (1,5 g/kg fw)

• Määrällisesti marjojen tärkein flavonoidiluokka

R1=R2H : Pelargonidiini

R1=OH; R2=H = Syanidiini

R1=R2=OH : Delfinidiini

R1=OCH3; R2=OH = Petunidiini

R1=R2=OCH3 : Malvidiini

13

FLAVONOLIT

• Yleisiä kaikissa marjoissa

• Yleisimmät yhdisteet ovat kversetiini, myrisetiini ja kemferoli. Kaikissa marjoissa on kversetiiniä.

• Esiintyvät marjoissa sokerijohdannaisina

• Tyypillisesti kitkerä ja karvas maku

• Suurimmat pitoisuudet noin 900 mg/kg tp

• Juolukka

• Tyrnimarja

• Karpalo

• Kaarnikka

• Mustaherukka

• Puolukka (150 mg/kg fw)

R2=OH; R1=R3=H : Kemferoli

R1=R2=OH; R3=H : Kversetiini

R1=R2=R3=OH´: Myrisetiini

14

FENOLIHAPOT

• Kaksi pääluokkaa: hydroksibentsoehapot ja hydroksikanelihapot

• Yleisiä kaikissa marjoissa

• Suurimmat pitoisuudet noin 500 mg/kg tp

• Mustikka

• Lakka

• Kaarnikka

• Puolukka

• Mustaherukka (250 mg/kg tp)

Hydroksibentsoehapot

R1=R2=OH, R3=H : Protokatekiinihappo

R1=R2=R3=OH : Gallihappo

Hydroksikanelihapot

R1=OH : Kumariinihappo

R1=R2=OH : Kahvihappo

R1=OCH3, R2=OH : Ferulahappo

15

ELLAGITANNIINIT

• Kompleksisia ellagihapon johdannaisia

• Spesifisiä Rubus-marjoille, 2-3 g/kg tp • Lakka

• Mesimarja

• Vadelma

• Mansikka (750 mg/kg tp)

Lambertianiini C (trimeeri)

16

PROANTOSYANIDIINIT

• Yleisiä kaikissa metsämarjoissa

• Katekiiniyksiköiden dimeerejä tai oligomeerejä

• Katekiiniyksiköt ovat sitoutuneet toisiinsa yksinkertaisella (B tyyppi) tai kaksinkertaisella sidoksella (A tyyppi)

• Suurimmat pitoisuudet noin 7 g/kg tp

• Aronia

• Ruusunmarja

• Pihlajanmarja

• Mustaherukka

• Karpalo

• Puolukka

• Pensasmustikka (3 g/kg tp)

17 11/03/2016 17

Kuopion yliopisto tutkimus marjojen fenoliyhdisteiden pitoisuuksista

(Määttä-Riihinen et al. J Agric Food Chem 2004, 2005)

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Valkoherukka

Keltainen karviainen

Viherherukka

Punaherukka

Punainen karviainen

Tyrni

Karpalo

Mansikka

Makeapihlaja

Puolukka

Pensasmustikka

Keltainen vadelma

Punainen vadelma

Metsävadelma

Lakka

Variksenmarja, etel.

Mustaherukka

Juolukka

Mesimarja

Variksenmarja, pohj.

Mustikka

Marja-aronia

mg/100 g

Antosyaanit

Flavonolit

Katekiinit

Hydroksikanelihapot

Ellagitanniinit

18

Polyfenolit osoittavat mielenkiintoisia biologisia aktiivisuuksia in vitro:

Omaavat antioksidantti aktiivisuutta

Estävät haittamikrobien kasvua

Estävät virusten kasvua

Estävät syöpäsolujen kasvua

Verenpainetta alentavaa vaikutusta

Tulehduksia hillitsevää vaikutusta

Vaikutus oksidatiiviseen stressiin → Vaikutus matala-asteiseen tulehdukseen

Tulehduksia lieventävä vaikutus (pitkäkestoinen tulehdus → tyypin 2 diabetes ja

valtimotauti)

Polyfenolien terveysvaikutuksista

19 11/03/2016 19

Antioksidanttiaktiivisuus (kaikki marjat, kaikki polyfenolit)

Mikrobien kasvua estävää vaikutusta (Rubus-marjat, ellagitanniinit)

Tulehdusta hillitsevää aktiivisuutta (Vaccinium-marjat, antosyaanit)

• Fenolien laaja kirjo

• Eriyhdisteiden vaihteleva imeytyminen

• Muilla ruoasta saatavilla yhdisteillä on vaikutusta marjafenolien imeytymiseen

• Yhdisteiden muuntuminen aineenvaihduntatuotteiksi

Polyfenolien terveysvaikutuksista

20 11/03/2016 20

Marjojen terapeuttisia vaikutuksia

Kroonisten sairauksien ennaltaehkäisy?

• Diabetes?

• Sydän- ja verisuonisairaudet?

• Degeneroivat silmäsairaudet?

• Muistisairaudet?

• Vanhenemiseen liittyvät aineenvaihdunnalliset häiriöt?

• Syöpäsairaudet?

Epidemiologiset tutkimukset viittaavat siihen, että marjoilla olisi kroonisilta sairauksilta

suojaavaa vaikutusta

Kliinistä tutkimustulosta positiivisista vaikutuksista kertyy vähitellen

21 11/03/2016 21

Tyypin 2 diabetes • Antosyaanit parantavat insuliiniresistenssiä

• Antosyaaniuutteet vähentävät tulehdusvastetta

• Resveratroli saattaa lieventää riskitekijöitä ja parantaa

glukoositasapainoa

Sydän- ja verisuonisairaudet • Antosyaanit tehostavat verisuonten endoteelin toimintaa

(endoteelin toimintahäiriö →verisuonten kalkkeutuminen)

• Tummat marjat laskevat verenpainetta

• Tummat marjat nostavat HDL-kolestrolia

• Tummat marjat ja tyrnimarja nostavat veren kversetiinipitoisuutta

• Tummilla marjoilla suotuisa vaikutus verihiutaleiden toimintaan

• Mustikka auttaa krooniseen matala-asteiseen tulehdukseen ( →

riski sairastua sydän- ja verisuonisairauksiin pienenee)

• Mustikka alentaa verenpainetta

• Mustikka vähentää valtimojäykkyyttä

Suoliston mikrobisto • Rubus-marjojen syönti muuttaa yksilöllisesti suoliston mikrobistoa

• Suolistobakteeristo saattaa vaikuttaa ellagitanniinien vaikutuksiin

Kliininen

marjatutkimus


Marjojen mikrobien kasvua estävät vaikutukset

23 11/03/2016 23

Antimikrobisen aktiivisuuden tutkiminen

• Tutkittu Pohjoisen luonnon tärkeimmät marjat ja niiden

polyfenolit

• Normaaleja suolistomikrobeja vastaan

• Suoliston hyviä (probiootit) bakteereita vastaan

• Ihmiselle haitallisia suolistobaktereita vastaan

• Elintarvikkeita ja kosmetiikkaa pilaavia bakteereita

vastaan

• Tunnistettu antimikrobisesti kiinnostavimmat polyfenolit

• Tutkittu niiden vaikutusmekanismeja

• Tutkittu bioprosessoinnin vaikutusta antimikrobiseen

tehoon

24

Marjat

Polyfenolipuhdasaineet, tunnetut aineenvaihduntatuotteet, erilaiset polyfenoleita sisältävät uutteet,

Eri polyfenoliryhmät: ellagitanniinit, antosyaanit, proantosyanidiinit, kokonaiset marjat, marjan lehdet,

marjojen soluviljelmät

Mustikka Vaccinium myrtillus

Pensasmustikka Vaccinium corymbosum

Puolukka Vaccinium vitis-idaea

Karpalo Vaccinium oxycoccus

Vadelma Rubus idaeus, var. Ottawa

Lakka Rubus chamaemorus

Mesimarja Rubus arcticus

Mansikka Fragaria ananassa Senga Sengana

Mustaherukka Ribes nigrum, var. Öjeby

Tyrnimarja Hippophae rhamnoides

Aronia Aronia melanocarpa var. Viking

Kaarnikka Empetrum nigrum

Pihlajan marja Sorbus aucuparia

25

Antimikrobisuustutkimuksissa käytetyt mikrobit

Bakteerit • Bacillus cereus

• Bacteroides fragilis

• Bifidobacterium sp (probiotic strains)

• Campylobacter jejuni

• Enterococcus faecalis

• Escherichia coli

• Helicobacter pylori

• Lactobacillus species (also probiotic strains)

• Listeria innocua, L. monocytogenes

• Pseudomonas aeruginosa, P. fragi

• Salmonella enterica sv. Typhimurium; S. infantis

• Staphylococcus aureus, S. epidermidis

Hiivat • Candida albicans, C. krusei

• Saccharomyces cerevisiae

Homesienet • Penicillium sp.

26 11/03/2016 26

Antimikrobisen tehon testaaminen

Staphylococcus aureus E-70045

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

0 5 10 15 20 25 30

Growth period (h)

cfu

ml-1

Control

Cloudberry /VTT

Rowanberry /VTT

Rowan leaves /VTT

Kuva 2.

Kuva 3.

Kuva 1.

• Nesteviljelmä (0.5 -10 ml) johon lisätään testattavaa yhdistettä (Kuva 1.)

• Testattavan mikrobin optimikasvuolosuhteet

• Sopii myös huonosti liukenevalle materiaalille

• Otetaan näytteitä kasvatuksen eri aikapisteissä (Kuva 2.)

• Määritetään kasvukäyrän perusteella tutkittavan yhdisteen vaikutus kasvuun /

kasvunestoon / viljelmän kuolemiseen (Kuva 3.)

27

Marjojen polyfenolien antimikrobiset vaikutukset

Berry extract

(1 mg ml-1

)

Bacillus

cereus

Campylo-

bacter

jejuni

Clostridium

perfringens

Escherichia

coli

Helico-

bacter

pylori

Staphylo-

coccus

aureus

Staphylo-

coccus

epidermidis

Salmonella

enterica sv.

Typhimurium

Candida

albicans

bilberry

++++ - + ++ +++++ ++ nt ++ -

black currant

++++ - + + +++++ +++ nt - -

buckthorn

berry ++++ - + + nt nt nt - -

chokeberry

+++ - + +++* nt ++ ++ nt -

cloudberry

++++ +++ +++++ +++ +++++ +++++ ++++ ++++* +++*

cranberry

++++ - +++* ++ nt +++ +++ - -

crowberry

++++ - - nt nt nt nt nt -

highbush

bilberry ++++ - ++ - nt ++ ++ - -

lingonberry

++++ - - + nt +++ ++++ - -

raspberry

++++ +++ +++ +++ +++++ ++++ ++++ ++++* ++

rowanberry

++++ + - - nt + nt + -

strawberry

++++ ++ ++ + +++++ ++++ +++ +++* ++++*

-no inhibitory effects; + weak inhibition; ++ clear inhibition; +++ strong inhibition; ++++ very strong inhibition; +++++ death of the culture

* decrease in plate count during first 5 to 10 hours, but later during the incubation period strong increase in cell numbers; nt not tested

Nohynek et al. 2006, Nutririon and Cancer 54:18

28 11/03/2016 28

Puhdistusliinat kosketusnäytölle ja kännykälle

29 11/03/2016 29

Esimerkki kliinisestä marjatutkimuksesta

Photo Jouko Lehmuskallio

30 11/03/2016 30

Marjojen terapeuttisesti aktiiviset yhdisteet

Kliininen tutkimus VTT – Itäsuomen yliopisto– Tampereen yliopisto

TAVOITE

Tutkia runsaasti marjoja sisältävän ruokavalion vaikutusta

metabolisen oireyhtymän henkilöillä

Sydän- ja verisuonisairauksien riskitekijöihin

• Verenpaine

• Seerumin lipidit ja lipidiprofiilit (lipidomiikan menetelmä)

• Veren antioksidanttikapasiteetti

• Tulehduksiin liittyvät tekijät

• Insuliiniherkkyys ja sokeriaineenvaihduntaabolism

Suolistomikrobiston koostumus ja stabiilisuus

• Suolistobakteerien profiilit

31 11/03/2016 31

-4 0 4 8 12

Ryhmä K (n=12): Kontrolli

Ryhmä M (n=15): Antosyaani Mustikka

Ryhmä LVM (n=20): Ellagitanniini Lakka-vadelma-mansikka

Interventiojakso Aloitusjakso Palautumisjakso

Tutkimuksen

rakenne

32 11/03/2016 32

Marjat

• ryhmä LVM (n=20) mansikkapurée 100 g + vadelmia 100 g +

lakkoja 100 g

• ryhmä M (n=15) mustikkapurée 200 g + kuivatut mustikat 40 g

(vastaa 3 dl tuoreita marjoja)

• ryhmä K (n=12) kontrolli, ei marjoja)

33 11/03/2016 33

Tulokset (1)

Veren lipidit ja antioksidanttistatus

• fS-Tot-Chol ↓ Laskeva suuntaus lakka, vadelma, mansikka -ryhmässä

• fS-HDL-Chol

• fS-LDL-Chol ↓ Laskeva suuntaus lakka, vadelma, mansikka -ryhmässä

• fS-Triglycerides

• Apo A1

• Apo B

• Total antioxidant capacity TRAP

• 8-isoprostane ↓ Laskeva suuntaus lakka, vadelma, mansikka -ryhmässä

• Lipidomiikka-tarkastelussa lakka, vadelma mansikka –ryhmässä nähtiin

vaikutuksia useassa lipidiryhmässä

• Tulokset viittasivat siihen, että lakka, vadelma mansikka –dieetillä saattaa olla

positiivista vaikutusta veren lipideihin

34 11/03/2016 34

Tulokset (2)

Tulehduksen välittäjäaineet

• TNFα ↓ Laskeva suuntaus mustikka-ryhmässä

• Interleukiini 6 ↓ Laskeva suuntaus mustikka-ryhmässä

• CRP ↓ Tilastollisesti merkittävä lasku mustikka-

ryhmässä

35 11/03/2016 35

Tulokset (3)

Paino ja verenpaine

• BMI

• Vyötärönympärys

• Elimistön rasva (%)

• Systoolinen verenpaine Suotuisa suuntaus kummassakin ryhmässä

• Diastoolinen verenpaine Suotuisa suuntaus kummassakin ryhmässä

Sokeri- ja insuliiniaineenvaihdunta

• Glukoositoleranssi Suotuisa suuntaus mustikka-ryhmässä

• Insuliiniherkkyys Suotuisa suuntaus mustikka-ryhmässä

36 11/03/2016 36

Tulokset (4)

Ravinteiden saanti

• Kuidun saanti ↑ Tilastollisesti merkitsevä nousu kummallakin ryhmällä

Suolistomikrobisto

• Yksilökohtaisia muutoksia suolistomikrobistossa 35% lakka, vadelma,

mansikka –ryhmän tutkimushenkilöistä

• Kaikki muutokset liittyivät clostridial-ryhmiin, jotka ovat tärkeimpiä

butyraatteja tuottavia suolistobakteereita. Tarvitaan lisää tutkimusta , jotta

voidaan identifioida bakteeri-lajit ja varmentaa mahdolliset positiiviset

tulokset.

• Marjojen ellagitanniinien biologinen hyväksikäytettävyys näyttää riippuvan

suolistomikrobiston koostumuksesta.

37 11/03/2016 37

Lopulliset tulokset

Anthocyanin rich diet had positive effects on chronic inflammation

Bioavailability of ellagitannins appear to be dependent on gut microbiota

38 11/03/2016 38

Kliininen marjatutkimus

julkaistiin DOSIKSESSA


Marjojen prosessointi bioaktiivisiksi jakeiksi

40

Edelleen muokkaus toimivuuden parantamiseksi elintarvikkeissa,

kosmetiikassa tai rehuissa

Rikasteet

Marjarikasteiden valmistaminen VTT:llä

Marja Puristusjäte

Hybridiprosessi

Proteiini Kuitu Bioaktiiviset

yhdisteet

Bioprosessointi Jauhaminen ja

kuivafraktiointi

Termo-

mekaaninen

prosessointi

Entsyymit

ja

mikrobit

Erottaminen ja konsentrointi

Marjasoluviljelmä

Rasvat

41 41 11/03/2016

Aromia ja terveyttä Pohjolan marjoista

Miksi puristekakku?

Tarve

• Marja- ja mehuteollisuus tuottaa

suuria määriä puristekakkua, jota ei

riittävästi hyödynnetä.

• Kuluttajan kiinnostus

välipalatuotteisiin on kasvanut

Tarve tuottaa terveellisiä, hyvän

makuisia ja laadukkaita, mutta

edullisia välipalatuotteita, on kasvanut

voimakkaasti

Edut

• Puristekakku on edullinen raaka-aine,

jonka tiedetään olevan terveellinen ja

sitä voidaan käyttää kokomarjan

asemasta terveystuotteissa (marjan

kuoret ja siemenet)

Kilpailu

• Voidaan hyvin korvata koko marja

• VTT on kehittänyt

prosessointimenetelmiä, joilla

puristekakusta voidaan valmistaa

edullisesti terveellisiä tuotteita

(polyfenolit ja kuitu)


Marjojen bioprosessointientsyymien ja fermentaation

avulla

43 11/03/2016 43 43

Aromia ja terveyttä Pohjolan marjoista –

Miksi bioprosessointi?

• Bioprosessoinnilla entsyymien tai fermentaation avulla voidaan muokata

marjaraaka-ainetta hyvin kokonaisvaltaisesti, sen rakennetta, makua,

väriä, säilytysaikaa ja voidaan myös vapauttaa bioaktiivisia yhdisteitä

marjaraaka-aineesta.

• Hyödyt

• Uudenlaisia tuotteita ja ainesosia elintarviketeollisuudelle

• Enemmän bioaktiivisia yhdisteitä (antioksidantteja ja haittamikrobien

kasvua estäviä aineita) ja enemmän mehua

• E.g. Puupponen-Pimiä et al. 2008, J. Agric. Food Chem. 56:681

• E.g. Buchert et al. (2005) J. Sci. food Agric. 85:2548-2556

• Uudenlaisia bioaktiivisia yhdisteitä

• Lisää aromia, voimakkaampi väri, pitempi säilytysaika

• E.g. Viljanen et al. 2014 Food Chem 157, 148-156

44

Entsyymiavusteinen marjojen prosessointi

Parempi

antioksidantti

Lisääntynyt

antimikrobinen

aktiivisuus

Enemmän

Bioaktiivisia

yhdisteitä

Mehu Puristekakku

Entsyymikäsittely

• Marjamateriaalin

perusteellinen muokkaaminen

kasvin soluseinää pilkkovilla

entsyymeillä ja bioaktiivisten

yhdisteiden vapautuminen ja

muuttuminen

Raaka-aine

• Erilaiset marjat

• Soluseinää pilkkovat entsyymit

• Sellulaasit,

hemisellulaasit,

pektinaasit, ksylanaasit

jne.

• Prosessin ylösskaalaus:

• Kapasiteetti n. 10 L

Puristus

Pakastemarjat

Käsittely entsyymeillä

Kuumennus

Sulatus ja murskaus

45

90

100

110

120

Ref

.

Pec

tinex

Ultr

a SP-L

Pec

tinex

Sm

ash

Pec

tinex

BE-3

L

Bio

pectin

ase C

CM

Ref

. (fo

r Eco

nase)

Eco

nase C

E

Mehusaanto

Sa

an

to

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Ref

.

Pec

tinex

Ultr

a SP-L

Pec

tinex

Sm

ash

Pec

tinex

BE-3

L

Bio

pectin

ase

CCM

Ref

.(for

Eco

nase)

Eco

nase

CE

Unknown

Arabinosides

Glucosides

Galactosides

Antosyaaniglykosidien jakaantuminen

mustikkamehussa

Pit

ois

uu

s (

mg

/kg

-1)

Mustikan entsymaattinen

mehunpuristus

Ref. Buchert et al. (2005) J. Sci. food Agric. 85:2548-2556

46 11/03/2016 46

Entsyymien vaikutus

antioksidanttiaktiivisuuteen

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

1,600 Ei entsyymejä

Pectinex Smash

Pectinex BE 3-L

Biopectinase CCM

Pectinex Ultra SP-L

Pectinex 3 XL

Pectinex BE XXL

Polygalacturonase

Pectinex Smash XXL

Biopectinase Super

Karpalo Musta-

herukka

Viher-

herukka

Mustikka Puolukka

47 11/03/2016 47

Pectinex BE XXL –entsyymikäsittelyn vaikutus

Salmonella- bakteeriin

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

0 5 10 15 20 25 30

cfu

/ml

Kasvatusaika (h)

Pectinex BE XXL

0-growth

control juice

control cake

BE XXL 10 nkat juice

BE XXL 10 nkat, cake

BE XXL 50 nkat juice

BE XXL 50 nkat, cake

Puupponen-Pimiä et al. 2008, J. Agric. Food Chem. 56:681

48 11/03/2016 48

Uusi väri

Marjafermentaatiot VTT:n teknologialla

Fermentaatio

• Marjamateriaalin

perusteellinen muokkaaminen,

rakenne, maku, väri,

säilytysaika ja bioaktiivisten

yhdisteiden vapautuminen

Raaka-aine

• Puolukka, vadelma, lakka

• Mikrobit

• LAB, hiivat

• Prosessin ylösskaalaus:

• Kapasiteetti n. 10 L

Marjat

Marjojen murskaus

Fermentaatio

Esikäsittelyt

Mikrobit

Uusi aromi Enemmän

bioaktiivisia

yhdisteitä

Mehun puristus

Kuivaus, fraktiointi

49 11/03/2016 49

VTT: mikrobikantakokoelmat

http://culturecollection.vtt.fi

Yli 200 maitohappobaktterilajia:

• Lactobacillus acidophilus

• Lactobacillus buchneri

• Lactobacillus brevis

• Lactobacillus casei

• Lactobacillus delbrueckii

• Lactobacillus fermentum

• Lactobacillus reuteri

• Lactobacillus paracasei

• Lactobacillus plantarum

VTT:n mikrobikantakokoelmassa (VTTCC) on noin

6500 mikrobikantaa ja kasvisolulinjaa, jotka kattavat

yli 800 bakteerilajia, jotka edustavat 225 sukua, yli

600 sienilajia, jotka edustavat 255 sukua, ja vuodesta

2014 lähtien myös noin 50 kasvisolulinjaa. Monet

kannat ovat ainutlaatuisia ja saatavilla ainoastaan

VTT:n kantakokoelmasta.

50 11/03/2016 50

• Entsyymikäsittely vähentää puolukan hapanta

makua

• Puolukan fermentaatio lisää luontaisen

säilöntäaineen, bentsoehapon, määrää

51 11/03/2016 51

Bioprosessointi pilot-mittakaavan bioreaktoreissa

• Kapasiteetti noin 15 L

• 4 lead-ins for sensors, two

gas connections

• Kolmilapainen sekoittaja

• Säädettävä lämpötila,

kasvatusaika, kaasufaasi ja

sekoitusnopeus

• Entsyymireaktoreiden kapasiteetit 2 x 1 L ja 1

x 10 L

• Ohjelmoitava sekoituksen ja lämpötilan säätö

• Tiedon taltiointi

HAFICO High Pressure

Tincture Press HP 5 H: Hydraulisesto toimiva

korkeapainen Hydraulic

operated high-pressure

tincture press for

Noin 5 L täyttötilavuus .


Marjojen kuivafraktiointi bioaktiivisiksi jakeiksi

53

Stereomikroskooppikuvia lakasta.

A) Lakan siemenet; B); Hieno siemenfraktio

C) Kiekkomyllyllä jauhetut siemenet; D) Marjan

kuoret ja E) Karkea siemenfraktio.

Mikroskooppileikekuva lakan siemenestä.

Kuivafraktiointi:

Marjakakku kuivataan, jauhetaan ja

seulotaan erikokoisten seulojen läpi:

hedelmäliha, kuoret, siemenet, hieno ja

karkea siemenfraktio

54 11/03/2016 54

• Kuivafraktioinnilla voidaan tuottaa voimakkaan

bioaktiivisia jakeita lakan siemenestä

• Toiset fraktiot lieventävät tulehduksia ja toiset

estävät virtsatulehduksia aiheuttavan E.coli-

bakteerin kiinnittymistä


Ekstruusioteknologia marjojen prosesoinnissa

56 11/03/2016 56 kuiva mustikka märkä mustikka märkä mustaherukka

Marja-välipalatuotteita ekstruusioteknologialla

Mustikka,

kuiva

Mustaherukka,

märkä

Mustaherukka,

kuiva

Kuivafraktioita sekä märästä

puristekakusta tehtyjä ainesosia

voidaan käyttää kehittämään

rapeita ilmavia rakenteita tai

lastumaisia tai hiutalemaisia

tuotteita.

Mansikka-sivuvirta-

fraktio paransi

tuotteen rakennetta

57 11/03/2016 57

Perinteinen vs. Superkriittinen fluidi-ekstruusio (SCFX)

15% marjasivuvirtaa

30 % marjasivuvirtaa kontrollil

• SCFX –menetelmällä voidaan käyttää

miedompia prosessiolosuhteita (100 rpm,

T<80C)

• Väri ja aromi ovat stabiilimpia (marjan aromi

voidaan hyvin aistia näissä tuotteissa)

• Hyvin pienet ja tasaisesti jakaantuneet

ilmakuplat lisäävät tuotteen

laajenemisnopeutta

• Aromiyhdisteet, mausteet ja muut lämpöherkät

yhdisteet (vitamiinit, mineraalit jne.) voidaan

laittaa mukaan jo prosessin alussa SCFX-

tekniikalla, jolloin tuotteessa on parempi

aromi-profiili ja stabiilisuus verrattuna

perinteiseen ekstruusio-menetelmään.

30 %

marjasivuvirtaa


Märkäjauhatusteknologia

59 11/03/2016 59

VTT’s patent

• ”Marjan puristekakku jauhetaan veden läsnäollessa toistuvasti

(1-5 kertaa), jolloin saadaan homogeenisen suspension, jossa

partikkelikoko on hyvin pieni, 50 – 1000 pm”. Saatua homogeenista

seosta voidaan sekoittaa erityyppisiin elintarvikematriiseihin.

60 11/03/2016 60

Märkäjauhatus Masuko

-Supermass Colloider-laitteella

Equipment manufactured by Masuko Sangyo Co., Ltd., Japan

61 11/03/2016 61

Esimerkkituotteita, joissa on märkäjauhettua mustikkakakkua

Marjanauhat • Sisältävät marjaa (mustikka,

mansikka, omena), vesi, sokeri

ja tärkkelys -> kuivattuna

sopivaan koostumukseen

• 1/3 marjaraaka-aineesta

puristekakkua

Muffinsit, joissa

mustikkaraitoja • Kaikki marjaraaka-ainen on

puristekakkua (10%)

• >7% kuitua

Leivonnaisia, joissa

mustikkaa ja suklaata • Kaikki marjaraaka-aine on

puristekakkua (6%)

• >6% kuitua


Marjat ja trendit

63 11/03/2016 63

Top 10 elintarvike-trendiä 2015

1. From clean label to clear label

2. Convenience for foodies

3. Reaching Millennials

4. Snacks rise to the occasion

5. Good fats, good carbs

6. More in store for protein

7. New routes for fruit

8. A fresh look at frozen

9. Private label powers on

10. Rich, chewy and crunchy

http://www.foodnavigator.com/Market-Trends/Innova-top-ten-food-trends-2015/%28page%29/10

64 64 11/03/2016

1. From clean label to

clear label

• Luomusta luonnolliseen,

lisäaineettomaan. Trendi on

lisääntynyt viime vuosina

• “Some of these claims have been so

overused that they are beginning to

lose some of their potency” (Lu Ann

Williams, director of innovation at

Innova Market Insights)

• Tuotteille halutaan selviä ja

yksinkertaisia pakkausmerkintöjä

4. Snacks rise to the

occasion

• ”We are seeing the snackification of

just about everything” (Lu Ann

Williams, director of innovation at

Innova Market Insights)

• Perinteiset ateria-ajat ovat

vähentyneet ja terveelliset

välipalatuotteet korvaavat

aterioita

• Elintarviketeollisuus on vastannut

välipalatuotteiden kysynnän kasvuun

korvaamalla perinteiset aamiaisruoat

esimerkiksi myslivälipaloilla ja

aamiaiskekseillä, ja nyt ollaan menossa

kohti mukaan otettavia ja käteviä

lounaita ja päivällisiä korvaavia aterioita

http://www.foodingredientsfirst.com/Home/KeyTrendsAjax?Id=48&ImageId=369&pageno=1

http://www.foodingredientsfirst.com/Home/KeyTrendsAjax?Id=48&ImageId=371&pageno=1

65 65 11/03/2016

7. Uudenlaisia

hedelmätuotteita

• Marja-ja hedelmäpohjaisissa

välipalatuotteissa ja aineosissa

on havaittavissa valtavaa kasvua.

Hedelmä-pohjaiset välipalatuotteet

ovat ohittaneet hedelmällä

maustetut välipalat.

10. Täyteläinen, rapea

ja sitkeä

• Rakenne on usein aliarvioitu, - mutta

näin ei pitäisi olla

• ”Rakenne tulee saamaan paljon

enemmän huomiota kuin koskaan

aikaisemmin”. (Lu Ann Williams,

director of innovation at Innova

Market Insights

66

Sept 2014, 10 Unique Ingredient Applications http://www.foodingredientsfirst.com/Home/KeyTrendsAjax?Id=41&ImageId=283&pageno=3

Esimerkkejä innovatiivisista markkinoilla olevista marjatuotteista

July 2014, 10 Superfood Innovations

Makeutettu

hedelmällä,

luonnolliset aromi- ja

väriaineet, ei

säilöntäaineita

Välipalajuoma luomu

hedelmistä ja

vihanneksista

Mustikka smoothie

Superfood, ei lisättyä

sokeria

67

June 2014, 10 Drinks with a Difference April 2014, 10 Trends for the Soft Drinks Gategory

Hyvinvointijuoma,

sokeriton,

antioksidantteja

Luonnollinen

makeutus Raakakaakao

smoothie

68 11/03/2016 68

Esimerkkejä markkinoilla olevista välipalatuotteista (U.S.)

http://thepurebar.com/ https://www.kashi.com/our-foods/snack-bars

(Kellogg’s)

• Luomu

• Ei-GMO

• Gluteeniton

• Vegaani • LUomu

• Ei-GMO

http://thepurebar.com/

https://www.kashi.com/our-foods/snack-bars







Marjat kosmetiikassa

70 11/03/2016 70

Marjat pitävät huolta ihostasi

• Ihon suojaaminen (UV säteily, saasteet)

• Ihon ennenaikaisen vanhenemisen estäminen

• Ihon uusiutuminen

• Ihon kirkastaminen ja vaalentaminen

• Ihon mikrobiston tasapainotus, uusi kasvava trendi!

71 11/03/2016 71

Aktiiviset marjayhdisteet kosmetiikassa

Siemenöljyt: Omega rasvahapot

Sterolit

Tokoferolit

Karotenoidit

Kleimit:

Vahvistavat ihosolujen solumembraanien toimintaa

Suojelevat tehokkaasti solumembraanien rasvahappoja

hapettumiselta

Voimistavat kollageenin synteesiä

Stabiloivat solurakenteita

72 11/03/2016 72

Aktiiviset marjayhdisteet kosmetiikassa

Bioaktiiviset uutteet:

Polyfenolit, arbutiini

Kleimit:

Antioksidantti- ja anti-inflammatorinen aktiivisuus

(suojelevat ihoa)

Stabiloivat kollageenia ja elastiinia estämällä niiden

hajoamista ja siten edistävät ihon elastisuuden

säilymistä

Tasapainottavat ihon mikrobistoa

Vahvistavat ihon pintaverisuonia

Vaalentavat ihoa

Mineraalit ja aromaattiset tuoksut

Kleimit:

Kosteuttavat, puhdistavat ja suojelevat ihoa


Marjojen antimikrobiset yhdisteet kosmetiikassa

74

Marjojen antimikrobiset yhdisteet

kosmetiikassa

Marja-

sivuvirrat

Prosessoidut

marjat

Marjojen

soluviljelmät Kosmetiikka

Luonnolliset

Antimikrobiset

yhdisteet

Luonnolliset säilöntäaineet - ihon mikrobiston tasapaino

75 11/03/2016 75

Lakan (Rubus chamaemorus) antimikrobinen

vaikutus Staphylococcus aureus -bakteeriin

102

103

104

105

106

107

108

109

0 5 10 15 20 25 30

Kasvatusaika (h)

pm

y/m

l

kontrolli Pakkaskuivattu lakkamarja (10 mg ml-1)

Lakkamarjan fenoliuute (1 mg ml-1)

Lakkamarjan ellagitanniinifraktio(1 mg ml-1)

Puupponen-Pimiä et al. 2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 67:8


Marjojen soluviljelmät kosmetiikassa

77 11/03/2016 77

1. Marjakasvi Suomen

luonnosta

2. Pieni osa kasvia + hormonit

erilaistumaton

haavasolukko eli kallus

3. Kallussolukon valinta ja

optimointi (kestää noin

vuoden)

4. Eriväristen, nopeasti

kasvavien kallussolukoiden

ylläpito

5. Suspensioviljelmien aloitus

Ainutlaatuinen kokoelma marjojen soluviljelmiä

78 11/03/2016 78

Marjojen soluviljelyteknologia

• Erilaistumattomia,

totipotentteja soluja,

”kantasoluja”

• Koko marjakasvin

biosynteesikapasiteetin

hyödyntäminen

• Mahdollisuus tuottaa uusia

yhdisteitä • Ei ilmastovaikutuksia

• Saanto ja laatu eivät juurikaan muutu

• Ei sairauksia tai kasvituholaisia

• Ei maatalouskemikaaleja

• Tuotteen puhdistus ja talteenotto helppo

79 11/03/2016 79

Marjojen soluviljelmien tutkiminen

• Soluviljelytuotteet

• Solut & solu-uutteet

• Bioaktiiviset yhdisteet

• Aromiyhdisteet

• Pigmentit, väriaineet

• Primääriaineen-

vaihduntatuotteet

• rasvat, proteiinit

• Sekundääriaineen-

vaihduntatuotteet

• Fenoliyhdisteet

• Teollisuuden

käyttämiä

valmistusaineita:

• Kosmetiikassa

• Lääkkeissä

• Hygieniatuotteissa

• Elintarvikkeissa

• Rehuissa

• Jne …

• Teknologiat

• Soluviljelmien aloitus

• Kasvatus olosuhteet

• Kemiallinen

karakterisointi

• Bioaktiivisuuksien

arviointi

• Ylösskaalaus

teollisuuden tarpeisiin

• Uuttoteknologia

• Viljelmien kryösäilöntä

80 80 11/03/2016

Kemiallinen karakterisointi

Analyysi

(g / 100 g kp) Marja

Solu-

viljelmä

Proteiini 9 38

Lipidit 3,1 - 5,6 2,9

Monosakkaridit nd 24

Ravintokuitu ~ 40 ~ 20

C vitamiini ~ 0,4 - 0,6 ~ 0,1

Fenoliyhdisteet 1,5 - 3 0,2 - 1

Antioksidanttiaktiivisuus

(DPPH) 100 492

Lakan soluviljelmän

ominaisuuksia

• Mineraalit (korkea tuhka-

pitoisuus

• Proteinit

• Rasvahapot

• Kuidut

• Flavanolit 10 x enemmän

kuin marjassa

81

Flavonoidit

Antosyanidiinit

Flavonolit

Flavanolit (Katekiinit)

HO O

OH

OH

OH

OH

(+)-Katekiini

Polymeeriset tanniinit

OH

OH

OC

O O

O

O O

O

OC OC

CO OC

HO

HO

HO OH

OH

OH

OH HO

HO HO

HO

HO

Kasuariktiini

Ellagitanniinit

Proantosyanidiinit

HO O

OH

OH

Proantosyanidiini trimeeri (flavanoli)

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

OH

Pelargonidiini Syanidiini Delfinidiini Peonidiini Petunidiini Malvidiini

Kversetiini Myrisetiini Kemferoli

(+)-Katekiini (-)-Epikatekiini Gallokatekiini Epigallokatekiini

HO O

OH

OH

OH

Syanidiini

+

OH

Fenolihapot

Kahvihappo

OH

HO

Kanelihapot

Kahvihappo P-Kumariinihappo Ferulahappo

Bentsoehapot

Protokatekiinihappo P-Hydroksibentsoehappo Gallihappo

HO

OH

Gallihappo

HO OH

O OH

O

Lignaanit

HO

OH

OH

OCH3 OH

Sekoisolarikiresinoli

H3CO

HO

OH

OH

OCH3 OH

H3CO

Stilbeenit

Resveratroli

OH

HO

OH

HO O

O OH

OH

OH

Kversetiini

OH

Lakkamarjan fenoliyhdisteet

Oranssilla merkittyjä yhdisteitä

esiintyy marjan hedelmälihassa

82

Flavonoids

Anthocyanidins

Flavonols

Flavanols (Catechines)

HO O

OH

OH

OH

OH

(+)-Catechin

Complex phenolic polymers (polymeric tannins)

OH

OH

OC

O O

O

O O

O

OC OC

CO OC

HO

HO

HO OH

OH

OH

OH HO

HO HO

HO

HO

Casuarictin

Ellagitannins

Proanthocyanidins

HO O

OH

OH

Procyanidin trimer (flavanol)

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

OH

HO O

OH

OH

OH

OH

Pelargonidin Cyanidin Delphinidin Peonidin Petunidin Malvidin

Quercetin Myricetin Kaempferol

(+)-Catechin (-)-Epicatechin Gallocatechin Epigallocatechin

HO O

OH

OH

OH

Cyanidin

+

OH

Phenolic acids

Caffeic acid

OH

HO

Cinnamic acids

Caffeic acid p-Coumaric acid Ferulic acid

Benzoic acids

Protocatechuic acid p-Hydroxybenzoic acid Gallic acid

HO

OH

Gallic acid

HO OH

O OH

O

Lignans

HO

OH

OH

OCH3 OH

Secoisolariciresinol

H3CO

HO

OH

OH

OCH3 OH

H3CO

Stilbenes

Resveratrol

OH

HO

OH

HO O

O OH

OH

OH

Quercetin

OH

Lakan soluviljelmän fenoliyhdisteet

Vihreällä merkittyjä yhdisteitä

esiintyy soluviljelmässä

83 83

Lakkasolukon tuoton ylösskaalaus ja tuotto

bioreaktoreissa

300 L teräksinen

bioreaktori

2 – 50 L kertakäyttöinen

Wave-tyyppinen

bioreaktori

Suodatus ja pesu Pakkaskuivaus

Raaka-aine

lopputuotteeseen

Nohynek, L., Bailey, M., Tähtiharju, J., Seppänen-Laakso, T., Rischer, H., Oksman-Caldentey, K.-M. & Puupponen-Pimiä, R. (2014): Cloudberry (Rubus

chamaemorus) cell culture with bioactive substances: establishment and mass propagation for industrial use. Eng Life Sci 14: 667-675.

Kallusviljelmä kasvatusmaljoilla


Marjat kosmetiikasa – tulevaisuudennäkymiä

85 11/03/2016 85

Tulevaisuudennäkymiä – marjat kosmetiikassa

• Luonnollisuus - synteettisten valmistusaineiden, säilöntäaineiden ja värien korvaaminen

luonnollisilla

• Cosmeceuticals - cosmetics + pharmaceuticals: kosmetiikka menossa kohti lääkkeitä,

hoitava kosmetiikka

• Edistyksellisempiä ihonhoitotuotteita tarvitaan - tieteellisesti tutkittua, luotettava tietoa

• Monitoiminnalliset tuotteet – estävät mikrobien kasvua, ovat antioksidantteja, hillitsevät

tulehduksia

• Nutrikosmetiikka – ihoa hoidetaan ulkoisesti ja sisäisesti, vaikutetaan syvempiin ihon

kerroksiin

• Terveen ihon mikrobiston tukeminen - haittamikrobien kasvun esto vaikuttamatta hyviin

mikrobeihin

• Kestävä kehitys, ympäristöystävällisyys - välttämättömyys tulevaisuuden kosmetiikassa

• Kasvien soluviljelyteknologian hyödyntäminen - pitkäaikainen trendi kosmetiikassa

86 11/03/2016 86

Marjatutkimus VTT:llä

Kaisa Poutanen (terveysvaikutukset prosessointi)

Riitta Puupponen-Pimiä (bioaktiivisuudet, soluviljelmät, fraktiointi)

Anna-Marja Aura (aineenvaihdunta suolistomallit),

Liisa Nohynek (antimikrobisuus, soluviljelmät)

Kaisu Honkapää (prosessointi)

Raija-Liisa Heiniö (aistinvarainen arviointi)

Emilia Nordlund (entsymaattinen prosessointi)

Veera Virtanen (liiketoiminnan kehitys)

Kirsi-Marja Oksman-Caldentey (biotekniikka, soluviljelmät)

87 11/03/2016 87

Photo Jouko Lehmuskallio

KIITOS! [email protected]

Documents

Terveyttä ja kauneutta Pohjolan marjoista · 2016. 3. 11. · mansikka –ryhmän tutkimushenkilöistä • Kaikki muutokset liittyivät clostridial-ryhmiin, jotka ovat tärkeimpiä