INDICE

1. Introduzione 31.1 Sistema immunitario......................................................................................................................................3

1.2 Anticorpi........................................................................................................................................................4

1.2.1 Struttura anticorpi e meccanismo d’azione.....................................................................................................4

1.2.2 Classi di anticorpi............................................................................................................................................7

1.3 Anticorpi monoclonali e anticorpi policlonali.........................................................................................................8

2. Ibridomi 92.1 Immunizzazione....................................................................................................................................................10

2.2 Scelta mieloma......................................................................................................................................................12

2.3 Fusione.......................................................................................................................................12

2.4 Crescita selettiva ibrido su terreno HAT ………….………………………………….………………………………………………………..…14

2.5 Screening Ab…….………………………………………………………………………………………………………………………………………………16

2.6 Clonazione ……………………..………………………………………………………………………………………………………………….…………...19

3. Produzione anticorpi monoclonali 203.1 Introduzione.................................................................................................................................................20

3.2 Produzione mAB in vitro...............................................................................................................................20

3.2.1 Terreni di coltura.................................................................................................................................20

3.2.2 I metodi di coltura...............................................................................................................................21

3.2.3 Metodi in vitro.....................................................................................................................................23

3.3 Produzione mAB in vivo................................................................................................................................34

3.4 Recenti innovazioni produttive..................................................................................................................35

3.5 Vantaggi e limiti dei metodi in vivo e in vtro................................................................................................36

4. Tecnologia del DNA ricombinante 374.1 Anticorpi chimerici .......................................................................................................................................37

5. Metodi di purificazione 425.1 Tecniche di precipitazione............................................................................................................................43

5.2 Gel filtrazione...............................................................................................................................................44

5.3 Cromatografia a scambio ionico...................................................................................................................47

5.4 Cromatografia di affinità...............................................................................................................................51

6. Applicazioni terapeutiche…………………………………………………………………………………………………………………….……………55

6.1 Applicazioni terapeutiche mAb…………………………………………………………………………………………………………………….………55

6.2 Terapia anticancro………………………………………………………………………………………………………………………………………………..55

6.3 Anticorpi anti-cd 20…………………………………………………………………………..…………………………………………………………………57

6.4 Anticorpi radioconiugati-radioimmunoterapia………………………………………………………………………………………………………59

6.5 Radioimmunoterapia: la tecnica Avidina-Biotina………………………………………………………………………..…………………………62

6.6 Anticorpi anti CD 33 ……………………………………………………………………………………………………………………………………………..64

6.7 Anticorpi anti CD 53……………………………………………………………………………………….……………………………………………………..65

6.8 Anticorpi anti HER-2 NEU ………………………………………………………………………………….………………………………………………….67

6.9 Anticorpi anti EGFR ……………………………………………………………………………………………….……………………………………………..68

6.10 Anticorpi anti VEGF ……………………………………………………………………………………….……………………………………………………72

6.11 Immunosoppressione …………………………………………………………………………….…………………………………………………………..73

6.12 Profilassi del rigetto…………………………………………………………………………………….………………………………………………………73

6.13 Anticorpi anti CD3 ………………………………………………………………………………….…………………………………………………………..73

6.14 Anticorpi anti CD25 ……………………………………………………………………..……………………………………………………………………..74

6.15 Anticorpi anti CD3 di nuova generazione ………………………………………………………………………….………………………………..74

6.16 Anticorpi anti TNF-alfa………………………………………………………………………………………..……………………………………………….75

6.17 Anticorpi anti TNF-alfa di nuova generazione …………………………………………………………………….……………………………….76

6.18 Anticorpi anti IL-6R di nuova generazione ………………………………………………………………………….……………………………….77

6.19 Anticorpi anti CD-11A ………………………………………………………………………………………………………………………………………..77

6.20 Anticorpi anti alfa 4 Integrine …………………………………………………………………………………………………………………………….77

7 Altre Applicazioni in campo farmaceutico…………………………………………………………………………………………..78

7.1 Anticorpi anti GPiib/iiia………………………………………………………………………………………………………………………………………….78

7.2 Anticorpi anti proteina f di rsv …………………………………………………………………………………………………………………………….79

7.3 Anticorpi anti- IGE……………………………………………………………………………………………………………………………………………….80

7.4 Anticorpi vegf……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….81

7.5 Anticorpi in fase di sviluppo…………………………………………………………………………………………………………………………………..82

7.6 MNAC - 13 umanizzato …………………………………………………………………………………………………………………………………………82

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1. Introduzione

1.1 Sistema immunitario

Il sistema immunitario rappresenta un prodotto dell’evoluzione estremamente specializzato e complesso. La sua funzione è quella di proteggere l’organismo dall’attacco di agenti estranei (detti antigeni) mediante la sintesi di molecole altamente specializzate quali gli anticorpi e la generazione di elementi cellulari quali linfociti e fagociti che contrastano e distruggono gli antigeni. Esso è costituito da numerosi organi linfoidi e da differenti popolazioni cellulari con una varietà di funzioni (fig. 1.1).

Fig. 1.1- Localizzazione dei principali linfonodi, timo e midollo osseo femorale.

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1.2 Anticorpi

Gli anticorpi sono una classe di glicoproteine del siero, il cui ruolo nella risposta immunitaria specifica è di enorme importanza. Hanno la capacità di legarsi in maniera specifica agli antigeni (microrganismi infettivi come batteri, tossine, o qualunque macromolecola estranea). Vengono prodotti nel sangue, in presenza di un antigene, da un particolare tipo di cellule, le plasmacellule, derivanti dalla differenziazione dei linfociti B. Il legame antigene-anticorpo è altamente specifico e consiste in una serie di interazioni non covalenti, quindi reversibili (legame a idrogeno,legame ionico,interazioni di Van der Waals,interazioni idrofobiche). L’anticorpo riconosce una regione distinta dell’antigene detta epitopo o determinante antigenico. Si distinguono, in linea di massima, due tipi di epitopi: sequenziali e conformazionali. Gli epitopi sequenziali sono caratterizzati da una specifica sequenza amminoacidica lineare, ad esempio Arg-Glu-Ser. Quelli conformazionali sono tali in base alla loro struttura tridimensionale.

1.2.1 Struttura e meccanismo d’azione degli anticorpi

Nella struttura di un anticorpo possiamo distinguere due domini:

Dominio di legame: regione che riconosce l’antigene; Dominio effettore: regione che induce la risposta immunitaria al fine di

distruggere l’antigene.

Strutturalmente è un tetramero costituito da due catene proteiche pesanti H uguali fra loro e due catene proteiche leggere L anch’esse uguali, tenute insieme da legami idrogeno e ponti disolfuro localizzati. Queste interazioni fanno sì che le catene si dispongano nella caratteristica forma a “Y”. Ciascuna catena è costituita da regioni costanti (C) e da regioni variabili (V). Le regioni costanti sono comuni a tutte le immunoglobuline appartenenti alla stessa classe e la loro funzione è quella di avviare la risposta immunitaria. Le regioni variabili sono specifiche per ogni anticorpo e contengono i siti che riconoscono e fissano l’antigene. Dunque sono queste ultime che conferiscono specificità al dominio di legame. Le regioni variabili sono collocate alle estremità N-terminali delle due catene pesanti e delle due catene leggere.

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Fig.1.2- Struttura di un anticorpo.

La struttura degli anticorpi è stata compresa attraverso l’uso di enzimi proteolitici quali:

Papaina: scinde la molecola in tre frammenti, due uguali tra loro, capaci di legare l’antigene, denominati Fab (fragment antigen binding); il terzo è denominato Fc (frammento cristallizzabile) perché a bassi valori di pH cristallizza facilmente.

Pepsina: scinde la molecola in un frammento più grande,uno più piccolo ed alcuni oligopeptidi. Il frammento di dimensioni maggiori è simile al dimero del frammento Fab, quindi è detto F(ab’)2; il frammento di dimensioni minori è una versione tronca del frammento Fc, quindi è detto Fc’.

Plasmina: scinde la molecola in due frammenti nella regione compresa tra i ponti disolfuro del frammento Fc, generando così due nuovi frammenti pFc e Facb.I meccanismi attraverso cui gli anticorpi proteggono il nostro organismo sono principalmente due:

La neutralizzazione del patogeno, in cui il semplice legame antigene-anticorpo blocca il processo di entrata nella cellula bersaglio;

L’opsonizzazione, ovvero quel processo attraverso cui gli anticorpi legano in superficie il microrganismo rendendolo visibile al macrofago e permettendo così il processo di fagocitosi (citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente, ADCC). Quest’ultimo

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plasmina

papaina

pepsina

meccanismo può essere direttamente mediato dalla porzione Fc dell’anticorpo riconosciuta dal fagocita, oppure mediato dall’intervento delle proteine del complemento. Altri meccanismi coinvolgono l’agglutinazione delle particelle antigeniche;la precipitazione di antigeni solubili e, infine, la già citata attivazione del complemento, che determina la formazione di pori nelle cellule microbiche e lisi cellulare. Dopo essere stato a contatto con un dato antigene, l'organismo continua a produrre anticorpi specifici per un dato periodo di tempo: dopo avere raggiunto un valore massimo, la produzione decresce e infine si arresta. In alcuni casi, l'organismo mantiene nel suo sangue alcuni anticorpi per quell' antigene: esso, cioè, resta immunizzato in modo permanente.

Fig.1.3- Meccanismo d’azione degli anticorpi.

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1.2.2 Classi di anticorpi

Ogni anticorpo appartiene ad una delle 5 possibili classi di immunoglobuline denominate rispettivamente IgG, IgA, IgM, IgD e IgE; queste differiscono fra loro per la diversa composizione delle catene pesanti (γ per le IgG, α per le IgA, µ per le IgM, δ per le IgD, ε per le IgE), per l'eventuale configurazione delle subunità e per la diversa distribuzione fisiologica. Le IgG sono gli anticorpi più importanti e più abbondanti nel sangue (70-75 %). Si suddividono in quattro sottogruppi a seconda di diversi sottotipi di catene γ. Sono monomeri con PM di 150.000 dalton. Le IgG sono gli anticorpi maggiormente impiegati durante la risposta immunitaria secondaria, cioè sono prodotte tardivamente e in maniera massiccia dai linfociti B differenziatisi in plasmacellule. Sono potentissime opsonine, ossia si legano ai microbi con grande efficienza e ne permettono la fagocitosi da parte dei macrofagi. Hanno un'importante funzione nel proteggere il neonato durante i primi mesi di vita: le IgG sono infatti in grado di passare la barriera placentare, immettendosi nel sangue del feto. Le IgA sono anticorpi predominanti nelle mucose; quelle presenti nel sangue (20-25 %) hanno un ruolo marginale. Nelle secrezioni mucose che ricoprono l’apparato digerente e respiratorio sono prodotte in forma dimerica, mentre quelle presenti nel siero sono in forma monomerica. Rappresentano un importante mezzo di difesa contro le infezioni locali.

Le IgA sono molto importanti anche per la trasmissione di una prima forma di difesa dalla madre al lattante, che nei primi sei mesi di vita è incapace di produrre anticorpi suoi.

Le IgM sono la classe di anticorpi predominanti nella risposta immunitaria primaria, prodotte in occasione della prima infezione con qualunque germe. Hanno due funzioni, che si rispecchiano nelle due possibili conformazioni in cui vengono prodotte: in forma monomerica rimangono ancorate ai linfociti B non ancora attivati e fungono da recettore per l’antigene, ossia captano le molecole estranee con cui il linfocita viene a contatto e trasmettono al suo interno un segnale che lo attiva; in forma pentamerica vengono secrete nell'ambiente extracellulare e svolgono un'importantissima funzione di opsonizzazione e di attivazione del complemento.

Le IgD si ritrovano soltanto sulla superficie dei linfociti B immaturi, assieme alle IgM, ed hanno come unica funzione quella di attivare i linfociti B e di promuovere la loro maturazione verso lo stadio di plasmacellule quando vengono a contatto con l'antigene per il quale sono specifiche. Non si ritrovano IgD libere nel plasma (se non in tracce).

Le IgE hanno fondamentalmente la funzione di proteggere l'organismo dalle infezioni da parte di parassiti e soprattutto elminti. Esse sono anche le principali responsabili di malattie allergiche quali l’asma, l’eczema o il raffreddore da fieno.

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Fig.1.4- Conformazioni delle immunoglobuline.

1.3 Anticorpi monoclonali e anticorpi policlonali

Gli anticorpi monoclonali sono anticorpi identici tra loro, in quanto prodotti da cloni di uno specifico linfocita B o di una plasmacellula, e sono in grado di riconoscere uno solo epitopo dell’antigene. Gli anticorpi policlonali, invece, sono anticorpi prodotti da plasmacellule diverse, per cui sono in grado di riconoscere diversi epitopi di uno stesso antigene. Questa differenza permette di sfruttare entrambe le tipologie di anticorpi per scopi diagnostici e terapeutici. Gli anticorpi policlonali sono utili per la rilevazione di proteine con bassi livelli di espressione, proprio per la caratteristica di riconoscere epitopi diversi. Preparati di anticorpi policlonali sono stati usati per diversi anni per indurre immunizzazione passiva contro malattie infettive ed altri agenti dannosi. Lo svantaggio di tali preparati era quello di indurre effetti indesiderati, tra cui possibili reazioni di ipersensibilità, le quali possono arrivare fino allo shock anafilattico. Gli anticorpi monoclonali, essendo in grado di legare uno specifico epitopo, sono raccomandati per la rilevazione di proteine altamente espresse o per altre applicazioni dove è necessario legare il target con esattezza per evitare i falsi positivi. Possono, inoltre, essere utilizzati per la rilevazione di alterazioni della struttura proteica. L’incomparabile specificità degli anticorpi monoclonali, unita alla loro relativamente facile produzione e alla possibilità di averne scorte pressoché inesauribili, li rende interessanti strumenti in campo biochimico e terapeutico. Riguardo le applicazioni terapeutiche, i primi studi sono stati concentrati sulla terapia anticancro, ma i preparati di anticorpi monoclonali trovano oggi diverse applicazioni cliniche, ad esempio:

nell’ immunosoppressione; nella profilassi del rigetto; nella terapia delle malattie autoimmuni; nella terapia di patologie cardiovascolari, asma, osteoporosi, ecc.

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2. Gli ibridomi

Con il termine ibridoma intendiamo il prodotto della fusione tra un linfocita-B, responsabile della produzione di un anticorpo, e una cellula tumorale del midollo osseo, un mieloma. L'ibrido ottenuto avrà le caratteristiche di entrambi i costituenti, infatti, in quanto prodotto da un singolo linfocita-B, sarà un anticorpo (Ab) specifico , e dalla componente mielomica dipenderà la capacità di crescere in continuo. L'importanza degli ibridomi risiede nella possibilità di produrre anticorpi monoclonali in luogo di quelli policlonali per l'utilizzo diagnostico dei quali è necessaria una prolungata fase di purificazione. Il vantaggio consisterà nella maggiore specificità e nella possibilità di produzione in grande quantità a partire da un clone isolato.La ricerca sui metodi di produzione degli anticorpi monoclonali ebbe un sostanziale sviluppo a partire dal 1975 grazie a Milstein e Kohler. Una volta prodotto, l'ibridoma, deve essere isolato e mantenuto in coltura. Ogni ibridoma clonato ( isolato e messo in coltura separatamente) produce uno specifico anticorpo (monoclonale) che sarà in grado di reagire specificamente proprio con l'antigene che è stato responsabile della sua stessa produzione. E' necessario selezionare linee cellulari di mieloma che non secernono più la paraproteina, Ig del mieloma, per evitare che l'ibrido dia luogo anche alla produzione dell'anticorpo della linea tumorale. Una volta mescolati i linfociti e le cellule di mieloma bisogna separare le cellule di mieloma non fuse e gli ibridi mieloma-mieloma da quelle che invece hanno subito la fusione, la qual cosa è resa possibile dall'uso del terreno HAT.

Schematicamente il processo di produzione di un anticorpo monoclonale mediante un ibridoma può essere schematizzato così (fig. 2.1) :

1. Immunizzazione2. Scelta del mieloma 3. Fusione 4. Crescita selettiva dell'ibrido5. Screening Ab6. Clonazione 7. Caratterizzazione dell'anticorpo8. Produzione anticorpo in vitro-vivo

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Figura 2.1- Schema generale produzione ibridomi

1. Immunizzazione

Consiste nella inoculazione dell'antigene , caratteristico per l'anticorpo che si vuole ottenere, nel topo. Solitamente i protocolli di immunizzazione prevedono una iniezione di richiamo 3-5 giorni prima della fusione. Oltre all'antigene possiamo aggiungere un adiuvante ( fig.2.2) che si comporta da potenziante non specifico della risposta immunitaria.

Adiuvante Composizione e utilizzo

Adiuvante di Freund completo Olio minerale contenente micobatteri inattivati al calore

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(FCA, Freund’s Complete Adjuvant) (Mycobacterium tubercolosis o M. butyricum).

Utilizzato come emulsione con antigeni in soluzione acquosa.

Adiuvante di Freund incompleto

(FIA Freund’s Incomplete Adjuvant)

Olio minerale.

Utilizzato come emulsione con antigeni in soluzione acquosa.

Allume Sali complessi d’alluminio. Esistono diverse versioni dell’adiuvante: alcune sono vendute pronte all’uso (per esempio Alhydrogel); altre si possono preparare in laboratorio, mescolando vari sali, per esempio NaHCO3 con solfato di potassio e alluminio. L’antigene acquoso è adsorbito dal gel.

Bentonite Bentonite di sodio del Wyoming (montmorillonite) in gel. L’antigene acquoso si adsorbe alla superficie.

Quil A Saponina derivata dalla Quillaja saponaria Molina (albero del Sud America). Miscelato per formare un complesso con l’antigene acquoso.

Muramil dipeptide (MDP) N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina. Mescolato con l’antigene acquoso. Si utilizzano anche vari derivati del MPD come adiuvanti.

Lipide A monofosforico (MPL) Utilizzato in varie formulazioni, spesso come emulsionante con oli. L’antigene è incluso nell’emulsione.

Bacillus pertossi Organismo ucciso mescolato all’antigene acquoso.

Figura 2.2- Adiuvanti

Le milze degli animali che producono una maggiore quantità di anticorpi vengono rimosse, private del grasso che le circonda e frantumate. Alternativamente se la concentrazione è bassa si può procedere con un'iniezione di antigene senza adiuvante 3 giorni prima della fusione e 2 settimane dopo la prima immunizzazione. Successivamente una sospensione di linfociti splenici (circa 108) viene mischiato con una di cellule di topo ottenute da un mieloma (circa 107). La miscela viene quindi incubata con polietilenglicole per 8 minuti per favorire la fusione delle membrane cellulari.

2. Scelta del mieloma L'ideale sarebbe quello di avere linee mielomatose che non producano anticorpi in modo tale che gli ibridomi diano luogo ad anticorpi solo derivati dalle cellule B usate per la fusione. A questo proposito una linea che viene spesso scelta è la MOPC 21, tumore murino indotto con olio minerale, linea che viene scelta per la mancanza di sintesi di una o di entrambe le catene immunoglobuliniche.

La linea plasmacellulare murina deve quindi

non produrre Ig perché non deve essere prodotto il tipo anticorpale della linea tumorale11

non deve essere in grado di produrre il gene per l'enzima ipoxantina guanina fosforibosil trasferasi (HGPRT,fig-2.3) un'enzima di recupero che permette di ottenere nucletidi purinici a partire da purine libere derivate dalla degradazione degli acidi nucleici.

Posso selezionare le cellule che vengono private della funzionalità di questo enzima facendole crescere in un terreno in cui è presente la 6-tioguanina (fig.2.4). Quando la funzionalità dell'enzima non è compromessa avviene la trasformazione della 6-tiopurina in 6-tirosina-5-monofosfato che provoca morte cellulare.

3. Fusione

Per avere la fusione vengono mescolate cellule spleniche e cellule di mieloma in rapporto 1:2 , 1:5 si centrifuga e si aggiunge PEG 4000 al 45% dunque le cellule vengono risospese in terreno e piastrate in multiwell da 24 o 96 pozzetti. Quando viene aggiunto il PEG, che si comporta da induttore della fusione delle membrane cellulari, si formerà una membrana citoplasmatica comune contenete due o più nuclei. I nuclei quindi in poco tempo si fonderanno e daranno luogo a mitosi sincrone. La fusione di cellule di mieloma HGPRT negative e di cellule immuni di milza darà luogo in definitiva a cellule ibride di diversi tipi: mieloma-mieloma, mieloma-milza, milza-milza (fig.e 2.5; 2.6).

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Figura 2.3- Struttura HGPRT

Figura 2.4- Struttura 6-tioguanina

Figura 2.5- Fusione

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Figura 2.5- Schema Fusione

4. Crescita selettiva dell'ibrido, terreno hat

E' proprio per selezionare l'ibrido mieloma milza che uso un terreno selettivo come l'HAT. (amminopterina, ipoxantina, timidina).

Aminopterina= antibiotico, inibisce le vie metaboliche di sintesi dei nucleotidi bloccando l'enzima diidrofolato reduttasi quindi la riduzione di folato a tetraidrofolato e la conseguente formazione di IMP, fondamentale per la produzione di purine. L'azione di blocco dell'aminopterina si estene anche alle pirimidine in quanto viene bloccata anche la metilazione di dUMP a dTMP. Esiste un percorso alternativo per la sintesi di questi che prevede il riciclo dei prodotti di degradazione degli acidi nucleici stessi.

Questa via alternativa (che diventa l'unica in presenza del blocco (dovuto all'amminopterina) è accessibile se è presente una fonte esogena di precursori come ipoxantina e timidina (fornite dall'hat). Le cellule di mieloma mancanti della funzionalità dell'HGPRT non possono utilizzare questa via alternativa e quindi tutte le cellule di mieloma non fuse e quelle fuse ma mieloma-mieloma muoiono per azione del blocco dell'aminopterina non potendo percorrere questa altra strada. Se invece la cellula di mieloma è fusa con una cellula di milza potrà contare su HGPRT, usare ipoxantina e timidina, dividersi e moltiplicarsi.

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Ipoxantina= infatti può essere usata come sorgente di purine in quanto grazie all'azione dell'enzima HGPRT può formare IMP.

Quindi se blocco con l' aminopterina, le cellule normali possono sopravvivere grazie al terreno HAT perchè contiene ipoxantina e timidina grazie alla normale funzionalità dell' HGPRT.

Timidina= è aggiunta per risolvere il blocco dell'enzima diidrofolato reduttasi.

A questo punto le sospensione di cellule viene diluita e seminata in micropiastre in modo che per ogni pozzetto ci sia statisticamente una cellula che possa quindi formare un clone e verranno quini coltivate in un mezzo di coltura senza HAT. In questo modo ogni clone di linfocita B produrrà un unico tipo di anticorpo. Per favorire la formazione dei cloni a partire da una singola cellula sarà utile seminare le cellule in gel agarosio al quale vengono aggiunti linfociti di un altro topo che

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coadiuveranno la crescita della cellula (feeder layer). Dopo due settimane circa noteremo la formazione dei cloni.

Quindi sarà possibile procedere allo screening degli anticorpi specifici per l'antigene immunizzante.

5. SCREENING Ab

È un momento importante nella produzione di un ibridoma perchè comporta una ricerca dell'anticorpo che reagisce con l'immunogeno tra i medium di ciascun pozzetto. Le tecniche più utilizzate sono essenzialmente tre: test di immunofluorescenza, test radioimmunologico (RIA), test immunoenzimatico (ELISA).

Test enzimoimmunologico (ELISA) : l’antigene (immunogeno) viene attaccato od adsorbito ad un supporto in fase solida (polistirene). La fase solida viene quindi lavata con tampone fosfato salino-Tween 20 per rimuovere l’antigene non adsorbito. A ciascun pozzetto viene aggiunto il terreno in cui sono cresciuti diversi ibridomi. Si legherà solo l’anticorpo specifico con reattività contro l’antigene. L’anticorpo che non ha reagito verrà rimosso. Quindi se è presente l’anticorpo specifico, sarà possibile visualizzare il complesso che questo forma con l’antigene tramite l’utilizzo di un anticorpo marcato con un enzima.Tra gli enzimi più utilizzati in tal senso ricordiamo: la perossidasi da rafano (HRPO), che ossida il luminolo, producendo luce, la fosfatasi alcalina (AP) che converte il p-nitrofenilfostato incolore in p-nitrofenolo giallo e la beta galattosidasi. In seguito viene aggiunto il substrato per l’enzima. Dopo un dato tempo necessario per lo sviluppo massimo del colore, la reazione enzimatica viene bloccata, e viene determinata l’intensità del colore di ciascun campione che darà una misura della quantità di enzima marcante attaccato, che è proporzionale all’anticorpo specifico dell’ibridoma nel medium del micropozzetto.

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Figura 2.6- Schema ELISA

Test di immunofluorescenza: Il legame dell'anticorpo monoclonale all'antigene è messo in evidenza con un secondo anticorpo anti-Ig marcato con sostanze fluorescenti le quali mostrano la capacità di emettere fotoni di lunghezza d'onda visibile se eccitate con radiazioni di lunghezze d'onda adeguate.

Figura 2.7

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Test radioimmunologico: è un test più sensibile del precedente, per evidenziare il legame suddetto viene usato sempre un secondo anticorpo ma marcato con l'isopoto 125 (radiattivo) dello Iodio . La quantità di radioattività sarà proporzionale all'anticorpo dell' ibridoma (fig. 2.8).

Figura 2.8- RIA

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6_Clonazione

I pozzetti della piastra da microdosaggio originale il cui mezzo fornisce all'immunodosaggio risposta positiva (colorazione) possono contenere una miscela di cellule di fusione. Tali cellule perciò vengono diluite con mezzo di coltura e inoculate in pozzetti vergini, onde impiantare linee cellulari da cellule individuali (cloni). Dopo avere coltivato i cloni se ne saggia il mezzo nuovamente per stabilire quali linee cellulari (ibridomi) producano molecole di anticorpi monoclonali atte a riconoscere l'antigene bersaglio. Se si isola più di un ibridoma specifico si effettuano ulteriori saggi per stabilire se i diversi cloni producano anticorpi contro il medesimo determinante antigenico. La tecnica per diluizione al limite (di meno di una cellula per coltura) o l’uso di terreni di coltura semisolidi come l’agar, permette agli ibridi di crescere con una densità talmente bassa che ogni crescita si può considerare derivante da un singolo clone. La procedura della riclonazione permette l’eliminazione della contaminazione di varianti, dei cloni che non producono anticorpi, e le cellule che hanno perso la capacità di produrre anticorpi a causa della perdita di cromosomi. Se si permette che la crescita continui, le varianti degli ibridi possono sovracrescere gli ibridomi desiderati. Una volta individuati i pozzetti positivi, le cellule vengono diluite in una elevata quantità di terreno di coltura che viene ridistribuito in diversi pozzetti. Questa operazione ripetuta più volte permette di ottenere in un pozzetto una singola cellula, da cui poi si origina una colonia di cellule; questo procedimento corrisponde al clonaggio della cellula producente un singolo anticorpo. Sulle diverse colonie cellulari si ripete lo screening più volte, in quanto le cellule producenti anticorpi possono non essere stabili e portare ad un decadimento del titolo di anticorpi, ed inoltre nello stessso pozzetto si possono trovare cellule ibridizzate che non producono nulla. Quest’ultime sono pericolose in quanto proliferano velocemente e tendono a sostituirsi alle prime. Quando le cellule produrranno un titolo costante di anticorpi, si potrà essere certi di aver selezionato un clone. La clonazione deve essere fatta quanto più velocemente possibile per eliminare varianti ed ibridi non producenti anticorpi. Un clone stabile viene mantenuto con la subclonazione. La ripetizione delle tecniche di clonaggio aumenta la probabilità che le cellule risultanti siano monoclonali ma è comunque necessario eseguire dei controlli per accertarsi di aver ottenuto la monoclonalità. A questo scopo si preparano subcloni di linee ibridomi e si calcola la percentuale di cellule che secernono anticorpi con la specificità appropriata che deve essere vicina al 100%.

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3. PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI

3.1 Introduzione

Gli anticorpi, oltre all’importanza che rivestono nella naturale risposta immunitaria, si sono dimostrati uno strumento molto valido per la ricerca grazie alla loro specificità nell’identificare particolari molecole o cellule con conseguente possibilità di separarle da una miscela. Una volta individuati i cloni producenti l’anticorpo monoclonale a reattività desiderata, si passa alla produzione su larga scala. Questa può essere effettuata espandendo la coltura dell’ibridoma in vitro e raccogliendo il surnatante. In alternativa, si può ricorrere a metodi in vivo, attraverso l’inoculazione dell’ibridoma in topi che abbiano derivazione genetica uguale a quella dell’ibridoma per la produzione di liquido ascitico. Nel caso in cui gli mAb non vengano subito purificati, sia il surnatante che l’ascite possono essere conservati a -20 °C. Al fine di garantire un elevato grado di purezza, impedendo quindi qualsiasi forma di contaminazione batterica, è necessario effettuare prelievo e conservazione in forma sterile o aggiungendo 0.2% di NaN3.

3.2 Produzione di mAb in vitro

Per ottenere elevate rese di mAb è necessario far crescere in coltura liquida gli ibridomi fino a saturazione. L’eventuale morte delle cellule dovuta alla loro eccessiva concentrazione nel mezzo di coltura, non dovrebbe alterare la quantità dell’ mAb poiché gli Ab risultano in genere resistenti alle proteasi rilasciate in seguito a morte cellulare. I surnatanti contengono una quantità di Ab specifici variabile da 5 a 20 µg\ml e possono raggiungere i 50 µg\ml. La contaminazione proteica più rilevante è dovuta alle proteine sieriche bovine nel siero utilizzato per la coltura. Per ovviare a questo inconveniente esistono in commercio terreni sintetici a basso contenuto proteico in grado di sostenere la crescita degli ibridomi.

3.2.1 Terreni di coltura

Gli ibridomi possono crescere in coltura di sospensione o stazionaria, essendo cellule ancoraggio-indipendenti. La quantità di anticorpo prodotta dipende dalla concentrazione delle cellule ottenute e dal periodo di tempo sufficienti a raggiungere quantità di anticorpo in cui rimangono vitali e produttive.

La crescita in vitro e il rendimento degli ibridomi vengono assicurati da diversi fattori:

a) elementi nutritivi di base (glucosio, aminoacidi, Sali minerali) contenuti nel mezzob) fattori di crescita (presenti nel siero) c) rimozione dei residui metabolicid) stabilità del pHe) temperatura

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f) adeguata diffusione di ossigeno

Rispondono a questi requisiti due tipologie di terreni: DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s

medium) e RPMI-1640. Queste due formulazioni differiscono tra loro per il contenuto in

amminoacidi e vitamine. Per la crescita ottimale le cellule richiedono un valore di pH del mezzo

compreso tra 7,2 e 7,4. Per mantenere costante tale valore di pH, si ricorre per lo più ad incubatori

con una fase gassosa contenente il 5% di CO2 (Fig. 3.2.1 ) e terreni contenenti NaHCO3. In

soluzione acquosa il bicarbonato dissocia, va incontro ad idrolisi basica tende a riformare l’acido

debole di partenza) e poi si ha rilascio di CO2. La CO2 presente nell’incubatore tende a

controbilanciare questo aumento, mantenendo così il giusto pH del terreno. Quando non è

disponibile un incubatore a CO2 ,si può in alternativa utilizzare un tampone organico, come

l’HEPES; questo consente di mantenere le cellule nel terreno di coltura per periodi piuttosto lunghi

fuori dall’incubatore. Numerosi terreni commerciali sono dotati di un sistema tampone misto

HEPES\CO2 al fine di incrementare le capacità tamponanti del terreno. I terreni liquidi non

contengono antibiotici, siero ed L-glutammina, poiché molto instabili; questi vanno perciò aggiunti

prima dell’uso. La glutammina costituisce una delle fonti principali di carbonio per molte cellule in

coltura ed è in grado di fornire precursori per la biosintesi e per la sintesi proteica. Inoltre

costituisce un’importante fonte energetica mediante il ciclo di Krebs, insieme a glucosio e piruvato.

Il siero è una miscela complessa di proteine plasmatiche, come transferrina e albumina, fattori di

crescita, minerali e ormoni. Il siero di uso più comune nelle colture cellulari è il siero fetale di

bovino o vitello (FBS o FCS). Il siero umano è usato solo per particolari scopi e non è

commerciale. Spesso, tuttavia, al fine di ottenere elevata purezza, gli ibridomi vengono fatti

crescere in terreni con quantità ridotte di siero o serum-free anche se non sempre riescono bene a

svilupparsi o produrre l’anticorpo in tale mezzo.

Figura 3.2.1- Incubatore a CO2

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3.2.2 I metodi di coltura

Si possono crescere e mantenere ibridomi nelle colture i stazionarie, in sospensione, o in perfusione.

Nella coltura stazionaria (per esempio T flask), le cellule ed i terreni non sono agitati. Nella coltura in sospensione (per esempio, roller bottles o splinner flask), il mantenimento

della sospensione è garantito dalla continua agitazione delle cellule e dei mezzi. Ciò consente di fornire uno scambio migliore di gas. Uno svantaggio potenziale delle colture in sospensione è che alcuni ibridomi sono sensibili a forze di taglio (interazione del liquido in movimento sulla cellula) che si sviluppa in una coltura agitata. Usando questi metodi le concentrazioni massime di cellule non eccedono generalmente il milione di cellule per ml, così da essere considerate colture a bassa densità.

Nelle colture a perfusione (per esempio, bioreattori a fibra cava), tramite l’utilizzo di una membrana selettiva, le cellule vengono mantenute in compatimenti separati dal serbatoio del terreno. Queste sono continuamente perfuse dal terreno, ma non sono esposte a forze di taglio. I sistemi a perfusione risultano più efficaci sia nel rifornimento di sostanze nutrienti sia nella rimozione dei cataboliti. Si ottengono colture ad alta densità che si avvicinano a 107-108 cells/ml.

Nella coltura in serie, le cellule ed i terreni sono inoculati in coltura e non sono maneggiati fino alla raccolta. La vitalità della coltura è limitata dal consumo dei nutrienti o dall’accumulo di residui metabolici. Si può usare la tecnica in serie nelle colture sia stazionarie che in sospensione. La tecnica di alimentazione in serie consiste nella periodica aggiunta di terreno fresco. Poiché le sostanze nutrienti sono continuamente aggiunte, la durata della coltura ad alimentazione in serie è prolungata e può essere sostenuta per parecchie settimane. La durata della coltura è limitata dall’accumulo dei residui metabolici. Le cellule raggiungono una concentrazione più alta che in una coltura in serie.

Nella coltura continua, che consente alle cellule di rimanere vitali per mesi, poiché non vi è un limite né dell’apporto nutritivo, né dell’accumulo di cataboliti, il terreno fresco è aggiunto continuamente, mentre il terreno esausto è rimosso con o senza le cellule. Il sistema a coltura continua si può applicare sia a colture in sospensione che in perfusione. Lo sviluppo degli ibridomi nella coltura continua in perfusione trae vantaggio massimo da una cinetica di produzione di secondo ordine per la maggior parte degli ibridomi: anche se una certa quantità di anticorpo è prodotta durante la fase di crescita logaritmica cellulare, la maggior parte dell’anticorpo anticorpo è prodotta quando le cellule si trovano nella fase stazionaria, poiché non stanno consumando l'energia per la replicazione.

La coltura di cellule animali è diventata il metodo d’elezione per la produzione di anticorpi monoclonali ad uso farmaceutico. La rimozione delle cellule dal mezzo contenente gli anticorpi è

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portata a termine mediante centrifugazione o filtrazione e normalmente si fa anche un’ultrafiltrazione per concentrare il filtrato, che viene poi sottoposto a diverse purificazioni di tipo cromatografico. A seconda dell’utilizzo previsto, l’anticorpo può essere coniugato a specifiche molecole “segnale”, come radionuclidi o tossine. Alla fine vengono aggiunti al prodotto degli agenti stabilizzanti come tamponi, glicina o albumina. Il prodotto viene poi liofilizzato e venduto confezionato in atmosfera di gas inerte.

3.2.3 Metodi in vitro

In base alle differenti linee cellulari di ibridoma coltivate in vitro, si può riscontrare una vasta gamma di parametri nella produzione di mAb. Questa risulta essere, per l'appunto, dipendente dalla linea cellulare dell'ibridoma, dal metodo di coltura utilizzato, dal tipo di terreno utilizzato e dai protocolli usati.

3.2.3.1 Requisiti essenziali per la preparazione dei terreni di coltura

La preparazione dei terreni di coltura richiede l’utilizzo di acqua bi distillata o tridistillata (ancor

meglio se prima deionizzata e poi bi distillata).

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E’ importate sottolineare che tutti i procedimenti che coinvolgono le colture cellulari , e di

conseguenza anche la preparazione dei terreni, devono essere necessariamente effettuati con

materiale sterile utilizzando una cappa a flusso laminare (fig.3.2.3.1) che consente di ottenere un

ambiente sterile. La cappa a flusso laminare viene utilizzata per proteggere sia il prodotto dalla

contaminazione che l’operatore. La protezione dell’operatore e’ assicurata dalla barriera di aria

frontale, in grado di impedire il passaggio di aerosol dall’interno all’esterno dell’unita’ e viceversa.

Le pareti della cappa possono essere in acciaio inox o in cristallo temperato. Lo schermo frontale,

sempre in vetro, resistente agli UV, può essere inclinato per facilitare la visione e la manipolazione

all’interno dell’area di lavoro. E’ quasi sempre previsto un pannello asportabile per la chiusura

dell’apertura frontale, su cui e’ in genere montata una lampada germicida UV per la sterilizzazione

della camera di lavoro durante la notte. La lampada UV e’ abilitata al funzionamento solo quando il

pannello di chiusura e’ posizionato correttamente nella zona frontale della cabina.

Figura 3.2.3.1- Cappa per colture cellulari

La cappa possiede un flusso laminare discendente che limita

l’ingresso di microrganismi.

3.2.3.2 Classificazione dei metodi in vitro

Diversi sono i metodi di coltura cellulare, essi possono essere distinti in:

Colture cellulari, stazionarie, in matracci

Per colture stazionarie è possibile utilizzare matracci (T flask o fiasche) o in alternativa

piastre. Entrambe le tipologie di contenitori vengono realizzate con particolari materie

plastiche, previamente trattate al fine di garantire la proliferazione e l’adesione cellulare

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sulla superficie. Esse vengono inoltre commercializzate in confezioni sigillate e sterilizzate.

Le fiasche (T flask) per colture cellulari standard (fig.3.2.3.1a) sono disponibili in una varietà

di formati, con zone di crescita dai 12.5 cm2 ai 300 cm2, e volumi variabili dai 5 ai 400 ml..

Le cellule ed i terreni vengono seminati nelle fiasche e mantenuti in un incubatore a CO2.

E’ necessario mantenere la fiasca sdraiata su una delle facce maggiori sulla cui superficie

cresceranno le cellule. Le T flask sono caratterizzate dalla presenza di tappi che possono

essere mantenuti chiusi al di fuori dell’incubatore o anche all’interno di incubatori a

“secco”. Tuttavia e’ possibile acquistare fiasche i cui tappi sono dotati di un filtro, che

permette gli scambi gassosi pur mantenendolo chiuso, diminuendo cosi’ il pericolo di

contaminazioni accidentali. La densità di semina iniziale richiesta per la proliferazione delle

cellule, al fine di ottenere un risultato finale riproducibile e veloce, varia in relazione alle

diverse linee cellulari; il tempo fra la fine della proliferazione delle cellule, l'inizio del

decremento della vitalità cellulare ed il livello di massima produzione dell'anticorpo è

ibridoma dipendente.I tempi di incubazione sono di 7-10 giorni prima della raccolta. La

concentrazione di mAb è tipicamente tra 10-100 µg/ml. Poco o nessun controllo è richiesto

e il contenuto del flask può essere raccolto quando il terreno vira al giallo (diventa acido)

con colonie di cellule vitali al 5-10% circa. Le fiasche sono di semplice utilizzo e richiedono

minima perizia tecnica. Sono relativamente economiche e sono accatastabili, il che

minimizza i requisiti di spazio all’interno dell’incubatore. Lo svantaggio principale legato

alle colture in fiasche è che le concentrazioni di mAb ottenute sono notevolmente basse,

con una produzione di piccole quantità di mAb. Per tali ragioni i T flask dovrebbero essere

considerati solo per piccole produzioni di mAb, in questo caso le concentrazioni basse di

mAb sono soddisfacenti.

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Figura 3.2.3.1a – Fiasche per colture cellulari standard

Le piastre, utilizzate anch’esse per colture stazionarie, possono essere distinte in piastre Petri e piastre multipozzetto (meglio conosciute come multiwell) (figure 3.2.3.1a e 3.2.3.1b). Le prime sono generalmente rotonde le seconde, al contrario, sono piastre quadrate suddivise in diversi pozzetti (da 6 a 96) a volume variabile a seconda del numero di pozzetti. Nei pozzetti della piastra da 96 vengono di solito inoculati circa 200 μL di sospensione cellulare. Dal momento che le piastre sono dotate di un coperchio non a tenuta, il rischio di contaminazioni è maggiore, e pertanto queste richiedono una maggiore manualità nel trattamento.

Figura 3.2.3.1 a- Piastre Petri Figura 3.2.3.1 b- Multiwells da 6 e da 96 pozzetti

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Colture cellulari in condizioni dinamiche

Condizioni di coltura dinamica, per la produzione di anticorpi monoclonali, vengono realizzate attraverso l’utilizzo di spinner flask (fig.3.2.3.1c-d) o roller bottles (fig.3.2.3.1e) . La coltura in spinner flask viene realizzata per creare condizioni dinamiche che favoriscano l’apporto uniforme di nutrimenti e ossigeno. Le concentrazioni di mAb ottenute con questi due metodi sono in genere superiori rispetto alle tecniche di coltura stazionarie, variando da circa 10-220 µg/ml e la durata media della coltura è maggiore (circa 12 giorni). I volumi della coltura sono tipicamente inferiori o uguali ai 2l. I vantaggi e gli svantaggi sono simili a quelli descritti per i T flask, ma le roller bottles e gli spinner flask richiedono uno spazio maggiore nell’incubatore e sono inoltre più costose.

Figure 3.2.3.1. c-d – Spinner flask

Figura 3.2.3.1. e- Roller Bottles

Colture cellulari in Sacchetti Gas-Permeabili I sacchetti gas permeabili sono in commercio: presterilizzati, flessibili, monouso e permeabili al gas. Questi sacchetti sono di semplice utilizzo grazie alla presenza di orifizi e tubi fissati con morsetti che permettono l’inoculazione di cellule e terreni, sia in fase di produzione che in raccolta. Il sacchetto, inoculato con le cellule ed il terreno, viene disposto all’interno di un incubatore a CO 2 e

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Figura 3.2.3.1 f- Sacchetto Gas-Permeabile

viene trattato come una coltura in serie. Il terreno viene raccolto alla concentrazione plateau di mAb o quando la vitalità delle cellule cade al 10% circa (fig. 2.3.1 f).

Rispetto ai T flasks standard, i sacchetti hanno una maggiore superficie di diffusione per l'ossigeno e la CO2, migliorando così l'ossigenazione delle cellule. Non vi è un incremento della densità delle cellule rispetto ai T flasks, ma sembra che vi sia una produzione superiore di mAb per cellula, inoltre la vitalità delle cellule è mantenuta per periodi di tempo più lunghi. I sacchetti di coltura presentano altri vantaggi rispetto alle piastre o le T flasks: i sacchetti sono sistemi completamente chiusi, ciò riduce la contaminazione microbica e possono essere disposte orizzontalmente sul piano dell'incubatrice o essere appese, riducendo così lo spazio richiesto.

Colture cellulari in bioreattori ad onda ( Wave Bioreactor)

Il bioreattore ad onda (Wave bioreactor) è costituito da un sacchetto (cell bag) plastico e flessibile, presterilizzato con radiazioni gamma e può essere utilizzato una sola volta. Cellbag viene parzialmente riempito con il mezzo di coltura e viene posta sull’unità di base del bioreattore. La parte alta del sacchetto, priva di liquido, è aerata continuamente. L'agitazione generata dal meccanismo di oscillazione permette il trasferimento e la miscelazione dell’ossigeno. L'azione dell'onda aumenta la superficie aria-liquido per il trasferimento dell'ossigeno, mescola il liquido nel bioreattore e sospende le cellule con basse forze di taglio. Il sacchetto è dotato di due filtri dell'aria, uno in ingresso e uno in uscita, di una siringa per il campionamento e di un tubo connettore per l’aggiunta ed il prelievo. Non è richiesto il flusso laminare né per le eventuali aggiunte, né per le campionature. La velocità di oscillazione è regolata da un pannello digitale; è presente una pompa d’aria elettrica che mantiene il sacchetto aerato e richiede 2 bar di pressione. Quando viene usato in sistemi ad alimentazione seriale, il volume del terreno può essere aumentato gradualmente, con aumento contemporaneo della densità cellulare. La densità raggiunta dalle cellule è di 7 x 106 cellule/ml.

CONFIGURAZIONE DEI SISTEMI WAVE

I sistemi Wave Bioreactor sono disponibili in diverse configurazioni che consentono il controllo di alcuni parametri chiave. Questi possono essere controllati dagli strumenti integrati in WAVE bioreactor e/o da strumenti esterni, ossia da moduli WAVEPOD (disponibili con diverse funzionalità) e autonomi. Per alcuni parametri, sono disponibili diverse opzioni di controllo. Ad esempio il pH del mezzo di coltura può essere controllato mediante:

il controllo on-line del pH attraverso la misurazione del pH e la regolazione del pH con aggiunte di acidi e basi.

Controllo indiretto del pH attraverso la regolazione della concentrazione di CO2

SCHEDE TECNICHE RELATIVE AD ALCUNI MODELLI DI WAVE BIOREACTOR

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SCHEDA TECNICA SISTEMA WAVE BIOREACTOR 2/10

Un sistema WAVE BIOREACTOR 2/10 è costituito da:- WAVE Bioreactor 2/10- Supporto cellbag- Cellbag presterilizzato mono uso- Regolatore di perfusione- Moduli strumenti esterni

Illustrazione di Wave Bioreactor 2/10

DESCRIZIONE1 Unità di base Bioreactor2 Pannello anteriore con comandi3 Display LCD4 Unità di oscillazione5 Supporto Cellbag6 Regolatore di perfusione (opzionale)

SCHEDA TECNICA SISTEMA WAVE BIOREACTOR 5/20

Un sistema WAVE BIOREACTOR 5/20 è costituito da:- WAVE Bioreactor 5/20- Supporto cellbag- Cellbag presterilizzato mono uso- WAVEPOD (opzionale)- Moduli strumenti esterni (opzionale)

Illustrazione di Wave Bioreactor 5/2029

DESCRIZIONE1 Unità di base Bioreactor2 Soffietti di protezione, meccanismo oscillante3 Unità di oscillazione4 Supporto Cellbag5 Pannello a sfioramento rimovibile

SCHEDA TECNICA CELLBAG

Illustrazione cellbag:

DESCRIZIONE1 Asta Cellbag2 Linee di inoculazione/raccolta3 Filtro dell’aria in uscita

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4 Filtro dell’aria in entrata5 Oxywell2TM

6 Punto di campionamento senza ago7 Raccordo Luer di ricambio/sonda pH opzionale

SCHEDA TECNICA WAVEPOD

Il modulo strumento WAVEPOD integra la strumentazione associata a Wave Bioreactor 20/50. Questo comprende i controlli di pH, ossigeno disciolto e miscelazione dei gas di CO2/O2. Per ottenere la funzionalità desiderata è possibile istallare contemporaneamente in WAVEPOD fino a quattro moduli strumenti. WAVE Bioreactor può essere azionato dal pannello a sfioramento di WAVEPOD.

Illustrazione WAVEPOD

DESCRIZIONE1 Postazione 1- modulo pH 2 Postazione 2- modulo ossigeno disciolto (DO)3 Postazione 3- modulo pompa aria4 Postazione 4- moduli CO2e O2

5 Pannello a sfioramento

Sistemi di coltura CELLine

I dispositivi di coltura CELLine (figura 3.2.3.1g) sono basati su tecnologia di compartimentalizzazione delle membrane. Le cellule ed i mAb secreti sono mantenuti in uno scompartimento centrale di

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piccolo-volume, che è separato attraverso una membrana semipermeabile da quello superiore di più grande volume che contiene il terreno. Una membrana permeabile al gas sulla parte inferiore dello

scompartimento delle cellule provvede all’ossigenazione ed allo scambio di CO2. All’ingresso del compartimento contenente il terreno vi è un largo orifizio con un tappo a vite ed un altro orifizio è posizionato all’ingresso dello scompartimento delle cellule con setto a vite accessibile da una pipetta. I sistemi sono costruiti con polistirene trasparente, sono presterilizzati e monouso. Il

produttore segnala che se viene usato siero, i costi sono ridotti considerevolmente perché il siero è presente soltanto nello scompartimento delle cellule. Le cellule raggiungono alte densità, e le concentrazioni di mAb, significativamente più alte, sono ottenute in un piccolo volume, rispetto ad altre tecniche di coltura stazionarie. I sistemi sono facili da maneggiare e le unità sono collegate ed accatastabili per minimizzare i requisiti di spazio nell'incubatrice a CO2. Le cellule sono inoculate attraverso una pipetta nello scompartimento delle cellule ed il terreno è versato nello scompartimento centrale. Circa sette giorni dopo l’inoculazione, il terreno è rimosso dallo scompartimento centrale del nutriente e una parte della sospensione cellulare è raccolta dallo scompartimento. Il terreno fresco è aggiunto sia allo scompartimento del terreno che a quello delle cellule. Questo processo è ripetuto approssimativamente ogni tre giorni.

Colture cellulari in bioreattore miniPERM®

Figura 3.2.3.1h- Bioreattore miniPERM®

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Figura 3.2.3.1g- Sitemi di coltura CELLine: destrizione della tecnologia a compartimentalizzazione

Il bioreattore miniPERM® (fig.3.2.3.1 h) è un minifermentatore modulare da laboratorio, utilizzato per colture di ibridomi e altre linee cellulari, ideale per la produzione di proteine e anticorpi. Questo è costituito da due compartimenti: il modulo di produzione (40 mL) ed il modulo dei nutrienti (400 mL) separati da una membrana da dialisi semipermeabile che consente il trasferimento di gas e dei nutrienti, ma non consente il passaggio di cellule e prodotti ad alto peso molecolare. In questo modo i nutrienti e i gas disciolti passano dal modulo dei nutrienti a quello di produzione, così come i cataboliti vengono trasferiti nel modulo dei nutrienti dove vengono diluiti. Dall’altra estremità del modulo di produzione è presente una membrana in silicone gas-permeabile per l’ottimale scambio di ossigeno e anidride carbonica. Sul modulo di produzione sono presenti dei connettori che sono usati per l'inoculazione delle cellule e l'accumulazione del campione. Il modulo dei nutrienti è provvisto di tappo a vite con membrana integrata in grado di equilibrare la pressione con l’esterno. Il bioreattore miniPERM®è fornito sia nella versione sterile monouso, che nella versione in cui il modulo dei nutrienti è autoclavabile e riutilizzabile (il modulo di produzione è sempre monouso).

Questo è progettato per ruotare su un dispositivo all'interno di un incubatore a CO 2 che mantiene le cellule nel modulo di produzione in sospensione ed agita il mezzo nutriente per facilitare il passaggio delle sostanze nutrienti e dei metaboliti attraverso la membrana di dialisi. Il miniPERM® è dotato di un sistema di coltura ad alimentazione seriale con la possibilità di raccogliere periodicamente il prodotto dal modulo di produzione. I vantaggi di questo sistema includono: sviluppo delle cellule ad alte densità (107 cell/ml); alta concentrazione di mAb; alta purezza del prodotto dovuta alla riduzione o alla rimozione del siero dallo scompartimento nutriente; facilità di utilizzo; capacità di effettuare le colture per un periodo di tempo relativamente lungo; capacità di riutilizzare alcuni componenti. “miniPERM®” è adatto per colture contenenti siero e colture serum-free.

Colture cellulari in bioreattori a fibra cava (HFB)

I bioreattori a fibra cava (fig. 3.2.3.1 i) originariamente sviluppati da Knazek, sono apparati per colture cellulari, progettati per simulare il sistema capillare in vivo, fornendo un ambiente simil-fisiologico alle cellule coltivate. Consentono quindi di mantenere l’ibridoma in coltura per lungo tempo. Grazie al continuo ricircolo del terreno di coltura e al passaggio in un apparato per lo scambio gassoso, vengono garantiti un costante apporto nutritivo, la rimozione di cataboliti ed il mantenimento di valori ottimali di pH. Le concentrazioni di

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anticorpo ottenute sono dell’ordine di grandezza di un liquido ascitico. È inclusa all'interno del circuito del bioreattore una bottiglia di terreno; una pompa a velocità variabile per mantenere un flusso di terreno continuo e unidirezionale; una cartuccia HFB; e terreni che permettono lo scambio di ossigeno e CO2. La maggior parte dei sistemi ha degli orifizi in cui sono presenti i campioni di terreno per il monitoraggio. Le HFBs, il percorso del fluido e il terreno, sono presterilizzati e monouso. Tutti i sistemi hanno un modulo di controllo dello strumento per la regolazione della portata dei fluidi ed un altro caratteristico per ogni sistema. I bioreattori consistono tipicamente in fasci di fibre vuote posti in una cartuccia di plastica, attraverso la quale i terreni di coltura perfondono continuamente nello spazio intracapillare. Le cellule si sviluppano nello spazio extracapillare che circonda le fibre. Le pareti delle fibre vuote servono da membrane semipermeabili di ultrafiltrazione. Il cut-off, in base al peso molecolare, è dato dalla dimensione del poro della membrana, il quale è abbastanza ridotto da trattenere le cellule e lasciar passare il mAb che viene escreto nello spazio extracapillare, mentre il gas, le sostanze nutrienti ed i residui metabolici diffondo liberamente attraverso la membrana secondo le differenze di pressione e le pendenze idrostatiche di concentrazione. Gli orifizi di raccolta permettono l'accesso nello spazio extracapillare per l’esame delle cellule e la raccolta di mAb.

Figura 3.2.3.1 h- Bioreattore a fibra cava

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3.3 Metodi di mAb in vivo

La produzione degli anticorpi monoclonali può essere anche condotta mediante iniezione degli ibridomi nella cavità peritoneale di ratti istocompatibili (fig 3.3.1), che servono dunque da camera di fermentazione vivente. Crescendo, le cellule di ibridoma trapiantate, cominceranno a secerne l’anticorpo monoclonale nel liquido ascitico a concentrazioni più elevate (1-25 mg/ml) rispetto ai metodi di coltura in vitro. L’innesco nella cavità peritoneale è spesso realizzato attraverso una iniezione intraperitoneale di pristano (0.1- 0.2 ml), un adiuvante immunogenico, capace di indurre reazioni granulomatose e di interferire con il drenaggio di liquido peritoneale. Di solito, 10- 14 giorni dopo l’innesco, viene iniettata una sospensione di ibridomi nella cavità peritoneale, ciò porta allo sviluppo di un tumore, ad accumulo di liquido ascitico e a distensione addominale. In seguito all’accumulo di liquido è necessario effettuare un immediato drenaggio ( volume di liquido non superiore al 20 % del peso corporeo). Esso conterrà grandi quantità di anticorpi antigene-specifici. Molti dei primi preparati di anticorpi monoclonali venivano prodotti in questo modo, tra questi OKT-3, il primo anticorpo monoclonale approvato per l'uso terapeutico dalla Food and Drug Administration. Questo metodo, nonostante consenta di ottenere elevate concentrazioni di anticorpo, presenta però degli svantaggi quali l'alto costo e il fatto che il prodotto sia contaminato da significativi livelli di lipidi ed altre sostanze presenti nel peritoneo del topo.

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Figura 3.3.1

3.4 Recenti innovazioni produttive

E' stata messa a punto una tecnica più rapida per la produzione di anticorpi monoclonali umani contro l'influenza, ma ora è allo studio la creazione di anticorpi anche contro altre infezioni come antrace, pneumococco e epatite C. Con questa nuova tecnica, i tempi di produzione degli anticorpi monoclonali si sono ridotti a poche settimane, contro i tre mesi necessari alla tecnica attuale. Quando l'organismo è colpito da un agente infettivo, il sistema immunitario inizia a produrre anticorpi ma solo una piccola parte di questi si lega all'agente patogeno e lo neutralizza. Ed è questo problema che limitava la produzione di anticorpi monoclonali con le tecniche tradizionali. La nuova tecnica è stata messa a punto da un team di ricercatori della Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF) e della Emory University, diretti da Patrick Wilson, J. Donald Capra e Jens Wrammert. Wilson ha spiegato: " Il problema è che non si può identificare e scegliere in modo semplice le cellule che producono gli anticorpi contro i patogeni che si vuole combattere". Esiste un altro metodo più rapido, che consiste nel creare anticorpi ibridi con cellule B, ma esiste il rischio di incompatibilità fra le proteine di questi anticorpi ibridi e l'organismo. La nuova tecnica invece consiste nell'isolamento di plasmacellule dal sangue di persone vaccinate contro l'influenza, delle quali vengono poi clonati i geni per gli anticorpi. Le plasmacellule sono l'elemento centrale della reazione iniziale ad un'infezione o ad una vaccinazione, ma hanno una vita breve, di pochi giorni. I ricercatori hanno trovato un modo per catturare le plasmacellule circolanti poco tempo dopo la vaccinazione, intercettando quelle che producevano anticorpi anti-influenza specifici, cioè circa l'80% delle plasmacellule isolate. La risposta di questi anticorpi è molto rapida e mirata e potrebbero essere prodotti anche a partire dalla risposta immunitaria di persone che hanno un'infezione, anche cronica, in corso.

3.5 Vantaggi e limiti metodi in vivo ed in vitro.

Sin dagli anni ’80 ebbero grande sviluppo i metodi in vitro, un’ottima alternativa tecnologica alla produzione di anticorpi monoclonali in ascite di topo. Le colture cellulari sono più VELOCI e SPECIE-SPECIFICI, non richiedono l’uso di animali e possono essere utilizzati in svariati campi di applicazione (ricerca, diagnosi, terapia ecc). Tuttavia, i sistemi

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in vitro valutano gli effetti di un composto in un ambiente isolato, privo di influenze ormonali, immunitarie o neuronali, non consentendo, quindi, di ricreare un ambiente che mimi le interazioni dell’intero organismo. Il metodo in vivo, sebbene consenta di ottenere elevate concentrazioni dell’anticorpo prodotto, risulta essere più veloce, poco costoso e facile solo su piccola scala, ma all’aumentare della quantità di mAb da produrre, il metodo in vitro può diventare competitivo nonostante gli alti costi di ottimizzazione dati dalla selezione dei cloni e l’uso di terreni di crescita addizionati di siero che rendono il prodotto finale più difficile da purificare. Inoltre vi sono dei limiti alla produzione di mAB in ascite, soprattutto se il prodotto è destinato all’uso umano. Nei topi, infatti, si sviluppano spesso importanti anomalie clinico-patologiche come conseguenza della crescita del tumore all’interno della cavità peritoneale e dell’accumulo del fluido ascitico. La progressione delle anomalie è ibridoma-dipendente; possono essere osservate profonde differenze fra le linee cellulari, dovute allo sviluppo degli ibridomi o alla secrezione di potenti sostanze bioattive secrete dall’ibridoma o dal topo.

4.TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

Un problema alquanto rilevante per quanto concerne l'utilizzo degli anticorpi monoclonali, è la loro suscettibilità al sistema immunitario umano il quale li riconosce come agenti estranei, quindi da neutralizzare e/o eliminare. Si è stimato che una singola iniezione di anticorpi monoclonali murini provoca una risposta immunitaria nel 50-80% dei pazienti, e si rileva la presenza di anticorpi umani anti murini (HAMA) entro 14 giorni dalla somministrazione. Inoltre, frequenti somministrazioni aumentano di gran lunga la risposta, anche negli individui che si erano dimostrati insensibili alla prima dose.

Conseguentemente alla risposta HAMA avremo:

clearance accelerata Riduzione efficacia anticorpi monoclonali preclusione di somministrazioni ripetute

L'unica plausibile soluzione al problema per ovviare a queste non trascurabili conseguenze, è l' utilizzo di anticorpi monoclonali di origine umana. I linfociti umani produttori di anticorpi possono potenzialmente essere resi immortali per mezzo di EBV(epstain-Barr

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virus):è l'agente eziologico della mononucleosi infettiva e ha la capacità di infettare linfociti sia in vitro che in vivo inducendo cosi una trasformazione neoplastica. Però, nonostante l'EBV sia capace di indurre trasformazione cellulare, pochi linfociti B presentano il recettore di superficie per questo virus, e quindi la maggior parte di essi risulta immune all'infezione. Comunque anche dopo un'eventuale trasformazione, molti producono anticorpi IgM a bassa affinità, e le cellule sono spesso instabili. Altre possibili soluzioni ma pur sempre poco efficienti sono la fusione di linfociti umani con linee cellulari linfoblastoidi umane o con cellule di mieloma murino.

Fortunatamente la tecnologia del Dna ha portato ad una positiva conclusione fornendo un incisivo metodo per ridurre l'immunogenicità innata degli anticorpi monoclonali murini. La clonazione dei geni di tutti i sottotipi di immunoglobuline umane ha permesso la produzione di vari anticorpi ibridi ad immunogenicità ridotta. I limiti di natura murina dei mAb sono stati superati smontando l'immunoglobulina murina, conservando le regioni variabili murine ma utilizzando sequenze umane per la parte costante, ottenendo cosi un anticorpo immunogenico, più adatto per impieghi in vivo.

4.1 Anticorpi chimerici

Conservano la specificità di legame ma assomigliano maggiormente ad un anticorpo umano naturale. Sono costituiti dalla fusione molecolare della regione variabile del mAb murino con la regione costante di una IgG umana. La molecola ibrida è risultata meno immunogenica del mAb di partenza (la porzione murina rappresenta circa il 5% della molecola) e più efficiente nell’interazione con il sistema immune umano, grazie alla presenza di un dominio Fc di origine umana. Gli impieghi clinici dei mAb chimerici hanno tuttavia evidenziato ancora un effetto antigenico, imputabile alla regione variabile murina.

L'"ibridazione" degli anticorpi monoclonali di topo e di ratto è stata ulteriormente sviluppata, rispetto alla formazione delle molecole chimeriche appena viste, sostituendo negli anticorpi umani solo le CDR (regioni determinanti la complementarietà) degli anticorpi monoclonali di roditore. Poiché possiedono affinità di legame per l'antigene simile a quella degli anticorpi monoclonali di roditore originali, gli anticorpi "umanizzati" potrebbero dimostrarsi utili come agenti terapeutici.

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L'umanizzazione degli anticorpi monoclonali umani si può realizzare così. Partendo da una linea di ibridomi di roditore, si possono isolare i cDNA per le catene L e H. La PCR servirà ad amplificare le regioni variabili di tali cDNA. Gli inneschi oligonucleotidici adoperati per la suddetta amplificazione sono complementari alle sequenze delle estremità 5' e 3' del DNA che codifica le regioni variabili, dove le sequenze nucleotidiche si conservano in grado elevato da un gene anticorpale all'altro. In base alla sequenza nucleotidica dei cDNA delle regioni leggere e pesanti (VL e VH) si possono delimitare i confini delle CDR. Di solito si stabilisce immediatamente dove incominciano e terminano le CDR, giacché queste regioni presentano sequenza altamente variabile, laddove la sequenza delle regioni dell'intelaiatura tende relativamente a conservarsi. Sulla base della sequenza dei DNA che codificano le CDR di roditore si sintetizzano sei coppie di inneschi PCR oligonucleotidici. Ciascuna coppia di inneschi è concepita per iniziare la sintesi del DNA di una delle CDR di roditore: tre provenienti dalla catena L, tre dalla catena H. Inoltre ogni innesco comprende alla estremità 5' 12 nucleotidi in più, complementari alle regioni fiancheggiatrici interne al DNA dell'intelaiatura umana al quale è indirizzato il DNA delle CDR di roditore.

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A questo punto si utilizza la mutagenesi mirata agli oligonucleotidi per sostituire, una alla volta, le sequenze DNA complete di ognuna delle CDR umane con il DNA amplificato originante dai roditori. Così facendo, per sostituire tutte le CDR occorrono sei cicli di mutagenesi mirata agli oligonucleotidi. Il procedimento "trapianta", di fatto, le CDR di roditore dentro l'intelaiatura dell'anticorpo umano. Successivamente si clonano i cDNA delle regioni variabili umanizzati in vettori di espressione che vengono poi introdotti in cellule ospiti idonee, di solito cellule di E. Coli o di mammifero, in modo da produrre gli anticorpi. Con questa tecnica sono già stati umanizzati oltre 50 anticorpi monoclonali diversi; la tecnologia è senza dubbio efficace e diffusamente applicabile, tuttavia è costosa e lunga. Una strategia promettente è comunque costituita da genoteche combinatorie a espressione fagica, costruite con mRNA provenienti da cellule B umane di donatori non immunizzati(phage display).

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Amplificazione delle sequenze di cDNA codificanti per le catene L e H ; le sequenze sono fiancheggiate da 12 nucleotidi in più complementari al DNA umano.

Phage display:

1. le catene pesanti e leggere delle regioni variabili (rispettivamente VH e VL) possono essere unite tramite un tratto di DNA sintetico che codifica un peptide di connessione (linker). L’uso del linker impedisce la dissociazione delle due catene, che altrimenti non sarebbero legate covalentemente;

2. il costrutto viene quindi amplificato nuovamente con primer contenenti siti di restrizione appropriati per la successiva digestione con endonucleasi (Xbal, SFiI, NotI e IndIII ) e ligazione in un vettore fagico adatto per l’esposizione, per esempio pGZ-1;

3. questo viene introdotto in cellule ospiti idonee, di solito cellule di E. Coli o di mammifero, in modo da produrre gli anticorpi; questo vettore consente sia l’espressione delle due catene, separate dal linker, sulla superficie del fago, come prodotto di fusione con una proteina fagica dell’involucro (gene III), sia l’espressione della proteina solubile. La disponibilità della tecnologia del phage-display ha consentito di ottenere anticorpi monoclonali interamente umani. La tecnologia del phage-display è attualmente il metodo più diffuso per selezionare frammenti anticorpali ricombinanti con elevata affinità.

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1. Le sequenze codificanti per le catene H ed L, amplificate tramite PCR, vengono tagliate con gli enzimi di restrizione SfiI e NotI ed assemblate: le due sequenze sono separate da una regione codificante per un peptide linker, che consente il giusto orientamento dei frammenti.

2. Il costrutto viene inserito in un fagmide (pGZ-1), un vettore ibrido derivato dalla fusione di fagi e plasmidi

3. Il costrutto viene fuso con l’estremità N-terminale del gene III del fago, che codifica per 5 copie di una proteina del capside; in tal modo si ha un fagmide di fusione. Oltre a codificare per il capside, la pIII (geneIII) è essenziale per il riconoscimento del pilo batterico (F) e del fago nella cellula ospite. La produzione dei fagi è garantita da un fago helper selvatico che, coinfettando la stessa cellula, fornirà proteine necessarie alla maturazione delle particelle fagiche. A monte del costrutto è presente un peptide leader che, in seguito a distacco, su intervento di

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una peptidasi codificata dall’ospite lascia una nuova regione ammino terminale in cui vengono esposte le sequenze dei peptidi ospiti.

4. Replicazione in E. coli.5. Il fago entra nelle cellule di E. coli attraverso il pilo F. In seguito alla replicazione, il

DNA viene impacchettato nel capside ed espulso attraverso la membrana di E. coli. Durante la trascrizione dei geni del capside viene espresso anche il costrutto accoppiato al gene III.

6. Una tripletta di basi amber che codifica per un codone di fine traduzione TGA. La mutazione amber viene annullata in ceppi di E. coli soppressori in cui esiste un tRNA che la riconosce come codificante: una parte rilevante della traduzione del costrutto non si arresterà in corrispondenza della mutazione e sarà così prodotta la proteina di fusione In ceppi non soppressori, tuttavia, tutta la traduzione si interromperà all’amber generando la sola proteina anticorpale solubile.In ceppi soppressori, il costrutto viene esposto sulla superficie del fago M13, in fusione alla proteina III, creando una proteina chimerica di fusione; la particella fagica viene selezionata in funzione delle sue capacità d’interazione con una proteina target (per questa ragione viene inserita la sequenza codificante per l’anti-anticorpo o tag). Per la purificazione sono inserite sequenze di sei istidine (his6) che, sono inserite per purificare per affinità su colonne di Nickel.

5. PURIFICAZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI

Dopo aver ottenuto, un campione di ibridomi o un campione di liquido ascitico, gli anticorpi desiderati devono essere estratti. I contaminanti presenti nel campione di coltura cellulare possono essere principalmente componenti come fattori di crescita, ormoni, e transferasi. Al contrario, il campione in vivo può contenere gli anticorpi dell’ospite, proteasi, nucleasi, acidi nucleici e virus. In entrambi i casi possono essere presenti altre secrezioni degli ibridomi come le citochine. Può essere presente anche una contaminazione batterica e, di conseguenza, endotossine secrete dai batteri. A seconda della complessità dei mezzi necessari in coltura cellulare, e quindi contaminanti in oggetto, un metodo (in vivo o in vitro) può essere preferibile agli altri.

Il campione a questo punto viene preparato per la purificazione.

Le cellule, detriti cellulari, lipidi, e materiale coagulato vengono prima rimossi, in genere mediante filtrazione con un filtro da 0,45 micron. Queste particelle di grandi dimensioni possono

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provocare un intasamento nelle fasi di purificazione successive. Inoltre, la concentrazione del prodotto nel campione può non essere sufficiente, soprattutto nei casi in cui l'anticorpo desiderato è quello prodotto da una linea cellulare a bassa secrezione. In tal caso il campione viene quindi condensato tramite ultrafiltrazione o dialisi .

Purificazione

I metodi di purificazione comprendono tecniche di precipitazione che sfruttano le diverse caratteristiche degli anticorpi rispetto alle altre proteine e tali processi di purificazione saranno più lunghi e costosi quando l’anticorpo proviene dal liquido ascitico (a causa delle numerose proteine endogene murine che questo contiene), rispetto a quello che proviene dalle colture in vitro.

Per ottenere elevati gradi di purezza, cioè per quei anticorpi di uso clinico sono necessari due o più strategie di purificazione ed esse vanno scelte in funzione delle proprietà specifiche dell’anticorpo ed al bilancio tra velocità, risoluzione, capacità e recupero.

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1) Tecniche di precipitazione, separa gli anticorpi in base al grado di solubilità a diverse concentrazioni saline

2) gel filtrazione, che separa gli anticorpi in base alle dimensioni3) cromatografia a scambio ionico, che sfrutta le differenze di carica tra le Ig e le altre

proteine;4) cromatografia d'affinità, che sfrutta le specifiche interazioni tra anticorpo e ligando.

5.1 Tecniche di precipitazione

Alcuni sali, solventi e polimeri organici provocano la precipitazione di Ig in soluzione, formando così un aggregato visibile insolubile che è recuperato tramite centrifugazione e successivamente risospeso nel tampone appropriato. Le Ig in soluzione sono circondate da uno strato di idratazione strettamente legato, perturbato dalle tecniche di precipitazione. Queste sono solubili in un range di valori di concentrazione salina, ma diventano insolubili a valori più alti o più bassi. Le alte concentrazioni saline allontanano lo strato di idratazione della proteina, favorendo l'interazione delle parti idrofobiche delle Ig con regioni simili delle altre molecole,e quindi causando un “raggruppamento di molecole” e la loro precipitazione.

Questo fenomeno, detto salting-out, consente la precipitazione reversibile degli anticorpi monoclinali; in questa tecnica gli ioni più efficaci sono gli anioni a carica multipla insieme a cationi monovalenti; i più usati

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sono solfato d'ammonio e di sodio. Si può anche usare, in maniera analoga l’ acido caprilico( ottanico) che viene utilizzato soprattutto per Ig provenienti da siero e liquido ascetico, ma a differenza del solfato di ammonio, l’acido caprilico non concentra le immunoglobuline che quindi rimarranno in soluzione.

La precipitazione delle immunoglobuline tende ad essere più efficiente al punto isoelettrico in quanto si riduce al minimo la repulsione elettrostatica tra le molecole. Le tecniche di precipitazione sono economiche e di facile esecuzione, ma spesso vengono utilizzate solo come passo preliminare in un protocollo di purificazione a più passaggi, perchè il prodotto non è sufficientemente puro.

Inoltre le tecniche di precipitazione sono influenzate dalla temperatura, pH e concentrazione del campione. Questi parametri devono essere controllati per garantire la riproducibilità dei risultati.La maggior parte delle tecniche di precipitazione non sono adatti per la preparazione su larga scala.Non tutte le proteine sono facili da riportare in soluzione, il rendimento può quindi essere ridotto.

La risolubilizzazione delle proteine

Molte proteine sono facilmente risolubilizzate in una piccola quantità di buffer da utilizzare per ilsuccessivo step cromatografico. Tuttavia, può essere necessario un agente di denaturazione per proteine meno solubili. Questi agenti devono sempre essere rimossi per consentire completo ripiegamento delle proteine e di massimizzare il recupero di massa e di attività.

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5.2 Gel filtrazione

Meccanismo: una colonna di particelle di gel è in equilibrio con un solvente adatto alle molecole da separare. Le molecole più grandi, completamente escluse dai pori, rimangono nel volume vuoto (o volume escluso) e passano attraverso gli spazi interstiziali, mentre le molecole più piccole si distribuiscono nel solvente presente sia all'interno sia all'esterno del setaccio molecolare e attraversano quindi la colonna a velocità più bassa.

Per ciascun tipo di gel il coefficiente di ripartizione Kd (tra il solvente interno e quello esterno al gel) di un determinato soluto è funzione del peso molecolare del soluto stesso. Se la molecola del soluto è così grande da essere esclusa dal solvente interno al gel, Kd è uguale a 0 e la parti-cella, non trattenuta, viene fluita. velocemente Se invece il soluto è abbastanza piccolo da essere liberamente permeabile alle particelle di gel, Kd = 1 (cioè la particella partiziona egualmente tra interno ed esterno).

E' proprio la variabilità di Kd tra questi due estremi che rende possibile, nei vari gel, la separazione di soluti in un ristretto campo di pesi molecolari.

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Le matrici usate comprendono destrani a legami crociati, legami ottenuti da reazione con epicloridrina (Sephadex), agarosio (Sepharose, Bio-Gel A, Savagac), poliacrilammide (Bio-Gel P), poliesteri, gel di silice, poliacrilomorfolina e polistireni.

Queste matrici funzionano sotto forma di gel idratato, ma spesso sono vendute sotto forma di polvere secca, che deve essere idratata prima di impaccare la colonna. L’idratazione si ottiene in genere mescolando una parte di polvere con dieci di soluzione tamponata, e lasciando che la matrice assorba tampone per parecchie ore, mescolando di tanto in tanto.

L’impaccamento della colonna si ottiene, in estrema sintesi, sospendendo la matrice in tampone ed aggiungendola delicatamente all’interno della colonna. Il rubinetto d’uscita deve essere aperto, così che ci sia flusso di liquido nella colonna mentre la resina decanta e si assesta (dopo avere versato tutta la matrice, si continua ad aggiungere tampone).E’ importante effettuare l’impaccamento in un’unica fase ed evitare di intrappolare bolle d’aria nel gel, per evitare variazioni nella uniformità della matrice.

Risoluzione: nella gel filtrazione, la risoluzione dipende dalle dimensioni delle particelle di gel, dalle dimensioni dei pori, dalla lunghezza e dal diametro della colonna e dal volume del campione, che in questo sistema è particolarmente critico. Generalmente si consiglia di usare volumi di campione <5% del volume totale della resina impaccata.

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La gel filtrazione separa le molecole in base alle dimensioni e di solito si usa secondo metodi convenzionali o in HPLC. La sola gel filtrazione non è molto efficace per la purificazione di IgG, ma può essere impiegata a questo scopo in combinazione con altri metodi, come la cromatografia a scambio ionico.

5.3 Cromatografia a scambio ionico

In questo tipo di cromatografia, l’adsorbimento delle particelle sulla fase stazionaria è determinato da interazioni di tipo elettrostatico (gruppi con cariche di segno opposto). Le proteine, possiedono gruppi ionizzabili e il fatto che essi possano portare una carica netta positiva o negativa può essere utilizzato nella separazione di miscele che li contengano. La carica netta che questi composti presentano dipende dal loro pK e dal pH della soluzione secondo l'equazione di Henderson-Hasselbalch.

Negli scambiatori anionici (come la DEAE nello schema a lato) la resina espone gruppi carichi positivamente (in generale, gruppi basici) che attraggono molecole cariche negativamente, e ne favoriscono l’adsorbimento sulla fase solida, mentre le molecole neutre o cariche po-sitivamente vengono eluite nel tempo morto della colonna. Gli scambiatori cationici possiedono invece gruppi carichi negativamente (acidi) e attraggono, quindi, molecole cariche positivamente.

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Si parla anche di scambiatori ‘forti’ o ‘deboli’, in riferimento al pK dei gruppi carichi attaccati alla resina: uno scambiatore forte ha un pK molto alto (per le basi) o molto basso (per gli acidi), tale per cui rimane ionizzato in un largo intervallo di pH.

La conoscenza delle caratteristiche di anticorpi e frammenti aiuta notevolmente nellascelta delle condizioni corretta purificazione, soprattutto per quanto riguarda l'eliminazionedi contaminanti noti.

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Se il P.I. dell'anticorpo è sufficientemente diverso da quello dei contaminanti,possiamo minimizzare la contaminazione utilizzando uno scambiatore cationico(carica negativa) ad un pH sopra il pI delle impurità e inferiore a quello degli anticorpi. Questo assicurerà che l’anticorpo (carica positiva) si leghi alla colonna e le impurità (a carica negativa, acidi nucleici e endotossine) passino attraverso.

Più alta è la forza ionica, maggiore è la competizione degli ioni in soluzione con la proteina. Per questo, solitamente le proteine vengono eluite in gradiente di pH oppure di forza ionica: a seconda della loro carica netta complessiva più o meno elevata, proteine diverse scenderanno in punti diversi del gradiente.

Molti scambiatori ionici sono costituiti da matrici di cellulosa modificata chimicamente: ad es. la carbossimetilcellulosa (CM-cellulosa) e la DEAE-cellulosa. Analoghi ai derivati della cellulosa sono i derivati del destrano e dell'agarosio (Sephadex e Sepharose). Questi scambiatori sono affini ai materiali impiegati nella gel filtrazione e presentano quindi limiti d'esclusione. Pertanto uniscono al processo di scambio ionico quello di filtrazione molecolare, migliorando così la risoluzione complessiva soprattutto nella separazione di proteine ad elevato peso molecolare e di acidi nucleici. Vice versa, per la separazione di molecole piccole sono preferibili supporti poco porosi o con bassi limiti di esclusione.

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Resina Supporto Gruppo funzionale Tipo

DEAE Sepharose (Pharmacia)

DEAE Bio-Gel A (Bio-Rad)

Agarosio -CH2CH2N+H(CH2CH3) 2

dietilaminoetil (DEAE)

Scambio anionico (debole)

QAE Sephadex C50 (Pharmacia) Destrano Dietil-(2-idrossipropil) aminoetil (un ammina quaternaria)

Scambio anionico (forte)

CM Sepharose (Pharmacia) Agarosio -CH2COO-

Carbossimetil

Scambio cationico (debole)

SP Sephadex C50 (Pharmacia) Destrano -(CH2) 3SO3-

Sulfopropil

Scambio cationico (forte)

Nella scelta di una resina per lo scambio ionico è opportuno considerare anche la forma ionica (cioè, qual è il controione normalmente presente nella fase stazionaria) e la dimensione delle particelle. Molte resine per scambio ionico sono disponibili in diverse forme ioniche, ed è possibile convertire una forma ionica nell’altra (‘scambiare’ il controione). Diversi controioni avranno diverse affinità per una resina, e sarà quindi più o meno facile per le molecole del campione spiazzare questi controioni per legarsi.

I sistemi di cromatografia a scambio ionico sia convenzionali che HPLC o FPLC (fast protein liquid chromatography) utilizzano la carica superficiale delle Ig per separarle dalle altre componenti. A ph neutro, la maggior parte delle Ig ha carica negativa, quindi legherà matrici anioniche con carica positiva. Queste possono poi essere eluite dalla matrice innalzando la concentrazione salina o variando il valore di ph del tampone.

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5.4 Cromatografia di affinità

La purificazione tramite cromatografia d'affinità non si basa sulle differenze nelle proprietà fisiche delle molecole da separare, ma sfrutta le interazioni altamente specifiche delle molecole biologiche.

Per questo la cromatografia d'affinità è in grado, almeno in teoria, di raggiungere una purificazione completa in una singola tappa, anche partendo da miscele complesse.

Questa tecnica sfrutta l’interazione specifica ma reversibile, tra l’anticorpo da purificare e un ligando attaccato covalentemente ad un supporto inerte.

Nel caso degli anticorpi monoclonali il ligando è un antigene, oppure una proteina che lega anticorpi (molti ceppi batterici producono proteine che legano mAb).

Se, in condizioni sperimentali corrette, si introduce in una colonna contenente il ligando la miscela contenente il composto da purificare, solo quel composto si legherà alla colonna, mentre gli altri

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componenti, rimasti nella fase mobile, si potranno rimuovere con un semplice lavaggio. Il componente interessato sarà poi recuperato rimuovendolo dal ligando con un'opportuna eluizione.

La tecnica è quasi esclusivamente preparativa e necessita di accurate conoscenze sulla struttura e sulla reattività della molecola da separare, tali da permettere la scelta di un giusto ligando.

La matrice ideale da utilizzare nella cromatografia di affinità deve possedere le seguenti caratteristiche:

- contenere gruppi reattivi numerosi ed essere stabile nelle condizioni in cui avviene l’attacco;

- essere stabile nelle condizioni di interazione della macromolecola e nella successiva eluizione;

- non adsorbire aspecificamente altre macromolecole

- possedere buone capacità di flusso.

In pratica si usano particelle uniformi, sferiche e rigide, solitamente costituite da derivati del destrano (Sephacryl S), dell'agarosio (Sepharose 4B e 6B, Bio-Gel A), gel di poliacrilammide (Bio-Gel P) e cellulosa.

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Adsorbimento ed eluizione.

La colonna cromatografica viene impaccata con la matrice a cui è legato il ligando; quindi viene equilibrata con un tampone che favorisce il massimo di interazione con l’anticorpo da purificare. Una volta applicato il campione, la colonna viene lavata con lo stesso tampone (per allontanare i composti contaminanti legati aspecificamente) prima di operare l’eluizione vera e propria, che può essere specifica o aspecifica.

Tabella 5.1 Condizioni per l’eluizione di anticorpi da colonne d’affinità

Condizioni di eluizione Modalità d’azione

Glicina-HCl, pH 2,2-2,8 Modifica la conformazione e distrugge le interazioni elettrostatiche

2-8 M urea

5-6 M guanidina cloridrato

Fortemente denaturante

3,5 M sodio tiocianato

4 M potassio tiocianato

2-5 M MgCl2, KI, NaI

Agenti caotropici *

50% etilenglicole, pH 11,5

10% (v/v) diossano a pH acido

Distrugge le interazioni idrofobiche

Nell’eluizione aspecifica, la macromolecola può essere staccata dalla fase stazionaria cambiando il pH o la forza ionica: una variazione di pH provoca una dissociazione dei gruppi del ligando o della macromolecola coinvolti nel loro attacco; una variazione della forza ionica, non necessariamente accompagnata da una di pH, provoca anch'essa un'attenuazione del legame tra proteina e ligando; solitamente si usa a questo scopo NaCl o sali caotropici, o ancora guanidina e urea; si hanno però problemi di denaturazione della proteina. Anche la modificazione della temperatura provoca una eluizione aspecifica, in quanto la sua diminuzione tende a ridurre le interazioni idrofobiche.

L’eluizione specifica si ha per aggiunta di substrato o inibitori reversibili oppure per aggiunta di composti dotati di maggiore affinità per il ligando. La glicina in HCl a pH 2-3 è l'eluente di elezione ad esempio per rompere l'interazione antigene-anticorpo, in questo caso l'anticorpo viene denaturato reversibilmente. Un altro metodo di eluizione comporta l'aggiunta di ligando libero, ma questa soluzione può essere molto costosa e se il legame è piuttosto forte possono essere

* Gli agenti caotropici sono usati per ottenere la disgregazione della struttura cellulare; in questo caso ci riferiamo alla struttura proteica

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necessarie elevate concentrazioni di ligando libero. Il materiale così eluito conterrà anche gli agenti impiegati per l'eluizione che dovranno essere successivamente rimossi. I problemi più rilevanti derivanti da questo tipo di cromatografia riguardano la bassa capacità degli adsorbenti, il ruolo dei legami aspecifici, la scelta del gruppo chimico da legare (tra un ligando di maggiori dimensioni e uno di minori dimensioni è più opportuno scegliere quello di maggiori dimensioni) e la stabilità del legame ligando-matrice o ligando-braccio spaziatore, che è relativa e determina una progressiva perdita di ligando.

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6. APPLICAZIONI TERAPEUTICHE

6.1 Applicazioni terapeutiche anticorpi monoclonali

Gli anticorpi monoclonali rappresentano degli importanti strumenti in campo biochimico e terapeutico: costituiscono la più grande categoria di sostanze biofarmaceutiche attualmente in studio. I primi studi si sono concentrati sul loro uso nel campo della diagnostica per immagini(come agenti traccianti)e in terapia, in particolare in campo oncologico,con risultati chiaramente positivi nel trattamento del melanoma, carcinoma del colon, leucemia e linfomi, ma oggi i preparati di anticorpi monoclonali sono utilizzati in svariati campi della medicina.

6.2 Terapia anticancro

La comparsa di una massa tumorale è normalmente associata ad un aumento dell’espressione di antigeni di superficie riconosciuti come estranei dal sistema immunitario dell’organismo ospite. I principali elementi che costituiscono quest’ultimo sono:

Linfociti T in grado di riconoscere e distruggere le cellule maligne Cellule Natural Killer (NK) che inducono la lisi delle cellule tumorali Macrofagi capaci di distruggere le cellule tumorali, soprattutto mediante il rilascio di enzimi

lisosomiali e di citochine tra cui la TNF(tumor necrosis factor). Anticorpi che mediante il legame con gli antigeni di superficie marcano le cellule tumorali

per la distruzione.

La target therapy (terapia mirata),in campo oncologico, ha rivoluzionato l’approccio alla malattia. In particolare l’anticorpo monoclonale è capace di riconoscere e reagire con una cellula tumorale presente tra oltre 100000 cellule sane vicine, quindi è possibile portare l’agente antineoplastico direttamente sulla cellula cancerosa: la produzione di anticorpi capaci di legarsi selettivamente al tessuto tumorale, in seguito all’identificazione di specifici antigeni presenti sul tumore, riduce la tossicità e ne aumenta l’efficacia, ma lo spettro d’azione è limitato a quelle neoplasie che dipendono da specifiche alterazioni molecolari. Il riuscire a colpire la cellula tumorale in modo specifico rappresenta un’importante speranza per migliorare la prognosi e la qualità della vita del paziente,riducendo gli effetti collaterali causati nel corso della chemioterapia sistemica. E’ importante precisare che l’applicazione di queste tecniche non è facile,anche perché ogni paziente andrebbe trattato con uno specifico anticorpo monoclonale, considerando che gli epitopi espressi dalla cellula neoplastica variano nei diversi soggetti.

La distruzione delle cellule tumorali mediata da anticorpi avviene mediante più meccanismi sia diretti che indiretti:

Il legame alla cellula tumorale da parte dell’anticorpo può indurre una risposta infiammatoria provocando la distruzione della cellula tumorale da parte del sistema

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immunitario. Le cellule NK (natural killer) e i macrofagi esprimono recettori di superficie che si legano alla porzione Fc dell’anticorpo; questo cosi, una volta legato all’antigene tumorale,dirige questi elementi del sistema immunitario direttamente alla superficie del tumore inducendo una risposta citotossica anticorpo mediata(ADCC Antibody Dependent Cell Cytotoxicity).

Gli anticorpi inoltre attivano il complemento, che è in grado di lisare le cellule tumorali direttamente (CDC Complement Dependent Cytotoxicity).

Un altro meccanismo diretto è dovuto alla capacità dell’anticorpo monoclonale di indurre apoptosi.

L’anticorpo monoclonale può legarsi a un fattore di crescita critico o a un recettore per un fattore di crescita, interferendo così con la crescita o regolazione della cellula tumorale.

L’impiego di anticorpi anti-idiotipo, in grado di mimare l’antigene tumorale, può indurre un’attiva risposta immunitaria antineoplastica. Gli anticorpi anti-idiotipo sono diretti contro regioni variabili uniche (idiotipi) di altri anticorpi. Le regioni variabili degli anticorpi anti-idiotipo che riproducono siti antigenici tumorali, possono essere utilizzati come vaccini contro l’antigene in oggetto, per stimolare la risposta anticorpale.

Gli anticorpi monoclonali nella terapia anti-cancro possono essere utilizzati come tali (interessanti per l’assenza di effetti di tossicità) o coniugati a molecole tossiche quali tossine (che vengono internalizzate per endocitosi e rese disponibili all’interno della cellula cosi da poter esplicare il loro effetto tossico), radioisotopi (principale applicazione è quella della diagnostica per immagini), nonché farmaci che verranno dunque rilasciati selettivamente al tumore. E’possibile infatti accoppiare chemioterapici antitumorali (adriamicina, amminopterina, metotrexato e alcaloidi della vinca) ed anticorpi monoclonali specifici per le proteine situate sulla superficie delle cellule tumorali, ma solo un numero limitato di molecole può essere coniugato ad ogni anticorpo. In alternativa è possibile somministrare, ad esempio per via iniettiva, pro-farmaci inattivi, che vengono attivati solo alla superficie del tumore grazie ad enzimi che verranno accoppiati all’anticorpo monoclonale diretto contro antigeni specifici sulla superficie della cellula bersaglio. Questo metodo è stato chiamato Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) o Antibody-directed catalysis (ADC). Chiaramente, trattandosi di un meccanismo di natura catalitica, verranno attivate molte molecole del pro-farmaco in questione e molti degli agenti citotossici-attivi rilasciati nella superficie del tumore entreranno nelle cellule tumorali per diffusione semplice o per trasporto attivo mediato da carrier. I profarmaci usati dovranno essere poco costosi, biodisponibili, stabili alla degradazione chimica/enzimatica in vivo, mentre gli enzimi attivatori dovranno essere stabili in condizioni fisiologiche, manifestare un ragionevole numero di turn over in vivo e avere attività indipendente da cofattore.

Finora sono stati approvati una decina di prodotti a base di anticorpi monoclonali, di uso esclusivamente ospedaliero, come agenti terapeutici anticancro. Il primo è stato il RITUXIMAB (MABTHERA®),approvato dalla FDA per il trattamento dei linfomi non Hodgkin (1997); in seguito sono stati approvati IBRITUMOMAB-ITTRIO90 (ZEVALIN®) e TOSITUMOMAB-IODIO131 (BEXXAR®) nel 2003. Il GEMTUZUMAB (MYLOTARG®) è stato approvato nel 2000 per la leucemia mieloide acuta e nel 2001 è stato approvato l’ALEMTUZUMAB(MABCAMPATH®) per la leucemia linfocitica

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cronica. Uno solo al momento è stato approvato per la cura del carcinoma mammario metastatico, il TRASTUZUMAB(HERCEPTIN) nel 1998, mentre diversi sono quelli approvati per il trattamento del cancro colon-retto: CERUXIMAB (ERBITUX®) nel 2004 e PANITUMUMAB (VECTIBIX®) nel 2006.

6.3 Anticorpi anti-cd 20

RITUXIMAB (Mabthera®)-CHIMERICO

E’ un anticorpo monoclonale chimerico murino/umano costituito da una immunoglobulina glicosilata le cui regioni costanti sono di origine umana (IgG1kappa), mentre quelle variabili della catena leggera e di quella pesante sono di origine murina. Rituximab è diretto contro l’antigene transmembranico CD20, una fosfoproteina non glicosilata presente sui linfociti pre-B e sui linfociti B maturi. L’antigene viene espresso su oltre il 95% dei linfomi non Hodgkin a cellule B. Esso si trova nelle cellule B normali e neoplastiche ma non è presente sulle cellule staminali emopoietiche, sulle cellule pro-B, sulle plasmacellule normali, o su altri tessuti normali;non viene internalizzato dopo il legame con l’anticorpo, non circola libero nel sangue e quindi non compete con il legame degli anticorpi. Il Rituximab agisce attaccando sia i linfociti B maligni e sia quelli normali ma, poiché l’organismo è in grado di sostituire rapidamente quelli danneggiati, si riduce il rischio di effetti collaterali da linfocitopenia o comunque si rendono più tollerabili. Il legame dell’anticorpo alla proteina bersaglio determina la lisi dei linfociti B, e ne blocca la crescita patologica. Il dominio Fab del rituximab si lega all’antigene CD20 sui linfociti B e il dominio Fc può attivare le funzioni effettrici del sistema immunitario. I meccanismi possibili della lisi cellulare mediata dall’effettore comprendono la citotossicità complemento-mediata (CDC) e la citotossicità anticorpo dipendente(ADCC) che, come abbiamo visto precedentemente, prevede l’attacco alla cellula neoplastica tramite il frammento Fc e l’attivazione di cellule natural killer (NK). Si è anche dimostrato che il legame di rituximab all’antigene CD20 sui linfociti B induce la morte cellulare per apoptosi. E’stato approvato dalla FDA nel 1997,disponibile in Italia dal 1998 per il trattamento dei linfomi non-Hodgkin follicolari in stadio avanzato, resistenti alla chemioterapia, o nei casi di recidiva tumorale dopo chemioterapia. E’ indicato anche nel trattamento del linfoma non-Hodgkin, CD20 positivo, diffuso a grandi cellule B, in associazione a chemioterapia. Gli studi clinici, volti a valutare la percentuale di risposta al tumore,il follow-up della durata della risposta e l’intervallo prima della progressione della malattia, hanno dimostrato che MABTHERA® ha un buon profilo di tollerabilità, accompagnato da un tasso di risposta positivo e da una durata della risposta sufficientemente prolungata. Si è evidenziata una percentuale di risposta globale nella popolazione del 48%, mentre nei pazienti precedentemente trattati con trapianto di midollo osseo, la risposta globale è stata del 78% contro il 43% dei pazienti non sottoposti a trapianto; la combinazione rituximab più chemioterapia piuttosto che la sola chemioterapia, aumenta la percentuale di risposta del tumore con un significativo prolungamento della sopravvivenza senza progressione della patologia. I pazienti sono stati randomizzati a ricevere CHOP (ciclofosfamide, doxorubicina,vincristina,prednisone)oppureCHOP+rituximab.Dopo un anno l’83% dei pazienti che avevano ricevuto CHOP + rituximab erano sopravvissuti

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rispetto al 68% di coloro che avevano assunto solo CHOP.Inoltre ad un anno il 69% del gruppo CHOP + rituximab era libero da malattia contro il 49% dei pazienti del gruppo CHOP. La soluzione di MABTHERA® preparata per l’infusione è chimicamente e fisicamente stabile per 24h a temperatura compresa tra 2 e 8 °C, ma dal punto di vista microbiologico deve essere utilizzata immediatamente. Si somministra per infusione endovenosa tramite un deflussore dedicato, in un ambiente con immediata disponibilità di strutture per la rianimazione. Poichè alcuni pazienti potrebbero sviluppare una reazione allergica al farmaco, la prima dose di rituximab viene somministrata molto lentamente al fine di ridurre tale rischio.

Nel marzo 2001, la Roche, industria farmaceutica che commercializza il rituximab in Europa, ha comunicato di aver ricevuto 20 segnalazioni di gravi reazioni avverse mucocutanee con 8 decessi (sindrome di Stevens-Johnson, necrolisi tossica epidermica, pemfigo paraneoplastico). Inoltre esso dovrebbe essere usato con cautela in pazienti con patologie cardiovascolari, in quanto sono stati riportati casi di riacutizzazione di angina, aritmie e scompenso cardiaco. Effetti collaterali legati all’infusione (inclusa la sindrome da rilascio di citochine) sono stati riportati di frequente e includono febbre, nausea, vomito, reazioni allergiche. I pazienti con elevata massa tumorale o con elevato numero di cellule neoplastiche circolanti,possono essere esposti ad un rischio maggiore di sindrome da rilascio di citochine particolarmente grave, caratterizzata da dispnea, broncospasmo, ipossia, oltre che da febbre, orticaria, angioedema. In alcuni pazienti, dopo il primo ciclo di MABTHERA® si sviluppano anticorpi antichimerici umani (HACA): la loro presenza può essere associata ad un peggioramento delle reazioni infusionali o allergiche, nel corso dei cicli successivi. Segnalati anche casi di neutropenia tardiva e di grave tossicità cutanea. Studi di farmacocinetica su pazienti con linfoma non-Hodgkin, trattati con una singola dose di rituximab nel range 10-500 mg/m2 di superficie corporea,hanno indicato che i livelli sierici e l’emivita di rituximab sono stati proporzionali alla dose (nei pazienti trattati con rituximab 375 mg/m2, l’emivita media è stata di 76,3 h dopo la prima infusione e di 205,8 h dopo la quarta). La media della Cmax dopo la prima infusione è stata di 205,6 e 464,7µg/mL , rispettivamente, con concentrazioni sieriche di rituximab statisticamente molto più elevate nei pazienti responsivi rispetto a quelli non-responsivi.

6.4 Anticorpi radioconiugati-radioimmunoterapia

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La radio immunoterapia è un metodo moderno per il trattamento mirato di determinati tipi di neoplasie come i linfomi non-Hodgkin. Infatti ancora oggi, nonostante l’avvento di nuovi e più efficaci farmaci citotossici e di nuove strategie terapeutiche, la gestione del paziente affetto da linfoma rimane un evento difficile e complesso, con un elevato numero di pazienti che sfugge alla capacità di controllo terapeutico della malattia, andando incontro a recidiva o morte. L’elevata radiosensibilità ed immunogenicità del linfoma lo rendono particolarmente adatto al trattamento con anticorpi monoclonali impiegati come vettori di agenti citolesivi, quali i radionuclidi, e aprono nuove e interessanti prospettive nelle applicazioni di tecniche radioimmunoterapiche. La radio immunoterapia determina la distruzione delle cellule neoplastiche attraverso due distinti meccanismi fisiopatologici. Il primo, innescato dalla reazione antigene-anticorpo, prosegue con l’internalizzazione dell’anticorpo radioattivo all’interno della cellula tumorale e conseguente danneggiamento del DNA .Il secondo, di natura aspecifica, sfrutta l’emissione radioattiva indiretta sulle cellule tumorali: sia su quelle provviste di antigene, sia su quelle che, nell’ambito della stessa popolazione neoplastica, risultano prive di antigene e quindi non altrimenti raggiungibili dall’anticorpo; questa azione in profondità è chiamata cross-fire effect ed è un elemento essenziale per l’efficacia della terapia. L’attività dell’immunoconiugato marcato è innanzitutto dovuta alla radioattività emessa dal radionuclide legato all’anticorpo, ma l’anticorpo stesso può contribuire alla distruzione del tumore attraverso diversi meccanismi biologici. La formazione dell’immunocomplesso può infatti provocare sia l’attivazione della cascata del complemento che l’induzione di una citotossicità anticorpo –dipendente, attraverso l’azione effettrice di cellule che si legano alla regione costante Fc. Gli anticorpi inoltre legandosi agli antigeni di superficie, causano un segnale apoptotico nelle cellule linfomatose. La possibilità di ottenere con tecniche di ingegneria genetica, un numero pressoché illimitato di anticorpi con diverse caratteristiche e differente target, la messa a punto di nuove tecniche di marcatura e la possibilità di veicolare direttamente sul tumore il radio farmaco, così da colpire selettivamente le cellule maligne e risparmiare dall’azione lesiva i tessuti sani, rappresentano i fondamenti di questo approccio terapeutico. Sono stati approvati due anticorpi monoclonali di origine murina radio coniugati: IBRITUMOMAB e TOSITUMOMAB, per il trattamento di linfomi non-Hodgkin. Il successo della terapia è ovviamente condizionato dalle caratteristiche dell’antigene associato alle cellule B. In generale l’antigene target ideale dovrebbe rispondere a determinati requisiti tra cui quello di essere espresso solo dalle cellule maligne, di avere una elevata densità di espressione sulla superficie delle cellule, di non essere espresso nelle diverse varianti e infine di non staccarsi dalla superficie delle cellule maligne, o non essere secreto in circolo. L’antigene CD20 è un buon target,in quanto espresso solo dalla linea cellulare B,non è schermato e, dopo legame con l’anticorpo, non viene internalizzato. Gli anticorpi monoclonali marcati con un determinato radionuclide sono particolarmente adatti a veicolare direttamente all’interno del tumore dosi radioattive killer. L’attività antitumorale si esplica attraverso l’emissione continua ed esponenzialmente decrescente di radiazioni a basso rateo. In questo senso la radio immunoterapia si differenzia sostanzialmente dalla radio terapia esterna che, al contrario, somministra in un breve lasso di tempo alti ratei di dose. Studi di laboratorio hanno dimostrato che l’apoptosi, indotta da una prolungata esposizione a radiazioni a basso rateo, è un importante mediatore di citotossicità. Il radionuclide adatto alla radio immunoterapia deve essere un beta-emittente e deve avere

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un’emissione gamma a bassa energia; dovrebbe inoltre avere un’emivita di diversi giorni tale da consentire la somministrazione di un’elevata dose al tumore . Lo iodio(131I), non ha caratteristiche ottimali a causa dell’emissione beta a bassa energia e dell’emissione gamma ad alta energia; inoltre lo iodio in caso di internalizzazione del complesso anticorpale viene liberato per dealogenazione e rimesso in circolo. Nonostante tali limiti è un radioisotopo molto utilizzato per la semplicità delle procedure di marcatura,prontamente disponibile,relativamente economico e di facile coniugazione. La marcatura con il beta-emittente ittrio –90 (90Y) rispetto a quella con I, ha il vantaggio di una dosimetria più favorevole, in quanto ha un’emissione beta di più elevata energia e sufficientemente penetrante, che lo rendono più efficace nel trattamento di tumori di grandi dimensioni. Altre caratteristiche vantaggiose sono l’assenza di danno tiroideo da iodio libero e il profilo più sicuro, rimanendo coniugato persino dopo l’endocitosi. Di contro la disponibilità di 90Y è bassa e il costo è elevato.

90Y-IBRITUMOMAB TIUXETANO( ZEVALIN® ) -MURINO

E’ un anticorpo monoclonale della classe IgG1kappa ricombinante murino, legato covalentemente al tiuxetano, un chelante dell’ittrio-90. ZEVALIN® è la prima radio immunoterapia disponibile sul mercato. Prodotto con tecniche di ingegneria genetica, a partire da una linea cellulare ovarica di criceto cinese, esso è fornito sottoforma di kit per radiomarcare l’ibritumomab tiuxetano con 90Y. La preparazione combina la capacità selettiva dell’anticorpo monoclonale anti –CD20 con il potere citotossico del radioisotopo ittrio-90, allo scopo di distruggere le cellule tumorali, laddove queste non hanno risposto alla terapia con rituximab o in casi di ricaduta. L’isotopo 90Y è un puro β-emittente, con una penetrazione media della radiazione nei tessuti di circa 5mm, da cui deriva la sua capacità di distruggere sia le cellule bersaglio che quelle vicine. L’ittrio-90 decade per emissione di particelle β ad alta energia con un ‘emivita fisica di 64,1 h (2,67 giorni). Il farmaco ha un meccanismo d’azione nuovo rispetto agli altri farmaci con la stessa indicazione, tuttavia i risultati clinici sono simili: non ci sono differenze significative nella durata della risposta e nel tempo di progressione della malattia, inoltre non è dimostrato che l’uso di ibritumomab aumenti la sopravvivenza. L’anticorpo coniugato possiede una costante di affinità apparente per l’antigene CD20 corrispondente a circa 17nM. Il legame è molto specifico, senza alcuna reattività crociata con altri leucociti o con altri tipi di tessuto umano. Approvato dalla FDA nel Marzo 2002, ZEVALIN® radiomarcato con 90Y è indicato per il trattamento di pazienti adulti affetti da linfoma non-Hodgkin follicolare, a cellule B CD20 positivo, recidivo o refrattario al rituximab. L’Agenzia Italiana del Farmaco nel Giugno 2005 ha approvato l’autorizzazione all’immissione in commercio. Il regime terapeutico ZEVALIN® impiega un pretrattamento con un anticorpo non marcato, il rituximab che risulta necessario per eliminare le cellule B circolanti e saturare così i punti di legame periferici. Rituximab, legandosi al CD20 dei linfociti circolanti e presenti nei tessuti normali, ottimizza la biodistribuzione di ibritumomab radiomarcato, portando in modo specifico la radiazione a livello del linfoma. La penetrazione media della radiazione nei tessuti di circa 5 mm permette di trattare tumori voluminosi o poco vascolarizzati. Anche le cellule maligne non accessibili all’anticorpo possono essere distrutte dalla radiazione ionizzante emessa dall’immunoconiugato. In questo regime terapeutico, rituximab è somministrato a una dose inferiore rispetto a quella approvata per il suo uso in ionoterapia. La soluzione di ZEVALIN® preparata, deve essere somministrata per

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infusione endovenosa lenta della durata di 10 minuti. Si raccomanda l’uso immediato dopo la radiomarcatura (è stata dimostrata la stabilità fisica e chimica del radiomarcato per 8 ore a 2-8 °C e al riparo dalla luce). Il trattamento con ZEVALIN® radiomarcato con 90Y provoca la deplezione delle cellule B CD20 positive normali, ma gli studi di farmacocinetica hanno dimostrato che si tratta di un effetto temporaneo. La sicurezza e l’efficacia terapeutica del trattamento con ZEVALIN® ,in confronto al rituximab, sono state valutate nell’ambito di studi clinici multicentrici che hanno evidenziato un indice di risposta globale significativamente più alta (80% versus 56%)nei soggetti trattati con ZEVALIN® . Le proprietà farmacocinetiche valutate su pazienti sotto regime terapeutico ZEVALIN® (pretrattamento con rituximab + ibritumomab tiuxetano 90Y)hanno evidenziato una mediana dell’emivita serica di ZEVALIN® radiomarcato con 90Y pari a 28h. Visto che l’ittrio-90 forma un complesso stabile con ibritumomab tiuxetano, la biodistribuzione del radiomarcato è comparabile a quella dell’anticorpo. Il regime terapeutico ZEVALIN® può causare effetti indesiderati, tra cui grave e rara citopenia, di norma irreversibile, infezioni (per lo più di natura batterica), emorragia durante lo stato trombocitopenico e reazioni allergiche(broncospasmo e angioedema). Sono possibili tumori secondari causati dalla dose di radiazioni derivante dall’esposizione terapeutica.

Sono state registrate anche reazioni cutanee e mucocutanee. I pazienti che hanno ricevuto anticorpi murini prima del trattamento con ZEVALIN® devono essere valutati per la possibile presenza di anticorpi umani antimurini(HAMA): in caso positivo, si possono verificare reazioni allergiche o da ipersensibilità, quando trattati con ZEVALIN® o altre proteine di origine murina. Il farmaco deve essere manipolato e somministrato solamente da personale qualificato provvisto delle dovute autorizzazioni governative, e abilitato all’uso e alla manipolazione di radionuclidi in un contesto clinico. La sua preparazione, l’uso, il trasferimento, l’immagazzinamento, e lo smaltimento sono soggetti alle disposizioni e/o alle relative autorizzazioni da parte delle autorità ufficiali locali di competenza.

131I.TOSITUMOMAB (bexxar ®)-MURINO

Un altro anticorpo radio coniugato è il tositumomab, immesso nel mercato nel 2003, con indicazioni terapeutiche ristrette al trattamento chemioterapico del linfoma non- Hodgkin refrattario al trattamento con il rituximab. Dal punto di vista strutturale è costituito da un anticorpo monoclonale murino (IgG2a) legato, mediante legame chimico,allo iodio-131 (131I). Si produce da una linea cellulare murina (ibridoma). Anche in questo caso il target è la proteina CD20, espressa sulla superficie delle cellule B. L’anticorpo riconosce un epitopo localizzato sul dominio extracellulare di CD20.

BEXXAR ®, come ZEVALIN ®, è un regime radio immunoterapeutico, che associa la capacità dell’anticorpo monoclonale di individuare il bersaglio con l’azione terapeutica della radiazione. L’anticorpo specifico anti-CD20, tositumomab, si lega alle cellule tumorali, fungendo da veicolo per lo iodio radioattivo (emivita 8.02 giorni) che le distrugge. L’emissione incrociata di radiazioni β e γ da parte di BEXXAR ® può uccidere le cellule normali e quelle tumorali del linfoma non –Hodgkin non accessibili all’anticorpo non radiomarcato. L’elevato percorso spaziale delle radiazioni di

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questo radionuclide, attraverso l’effetto cross-fire aumenta il danno, oltre che della cellula bersaglio, anche di quelle circostanti (cellule tumorali non raggiungibili dall’anticorpo non coniugato). E’ stata valutata l’efficacia di BEXXAR® in uno studio clinico che ha coinvolto pazienti con linfoma non Hodgkin follicolare refrattario al rituximab e recidivante dopo chemioterapia: il 63% di questi ha risposto a trattamento con BEXXAR® con una durata media della risposta di 25 mesi, il 29% ha presentato una risposta completa (nessun segno clinico della malattia). Una sperimentazione condotta su 76 pazienti con linfoma follicolare di stadio III o IV, chemio resistenti o recidivanti dopo chemioterapia, ha evidenziato una risposta positiva nel 95% dei pazienti dopo una sola settimana di trattamento e una completa remissione della malattia nel 75% dei soggetti. La percentuale di sopravvivenza libera da progressione della malattia a cinque anni è stata del 59% e del 77% in coloro che avevano avuto una risposta completa. Lo studio ha dimostrato che, contro il linfoma follicolare (sesta causa di morte in USA per tumore), si è rivelata efficacissima e con minimi effetti collaterali una sola settimana di regime terapeutico BEXXAR® , il cui uso era stato già approvato dalla FDA nel 2003, ma solo come ultima terapia possibile in caso di fallimento dei precedenti trattamenti; in questo studio invece, per la prima volta BEXXAR® è stato usato come primo protocollo terapeutico di scelta e i risultati sono stati molto promettenti. Il regime con BEXXAR® prevede un singolo ciclo terapeutico: non sono state valutate sicurezza di molteplici cicli di trattamento né la combinazione di tale regime terapeutico con altre forme di irradiazione o di chemioterapia. Si somministra per infusione lenta in vena e le dosi sono decise in maniera personalizzata per ogni malato. Il regime terapeutico Bexxar®, come ZEVALIN®, per migliorare la distribuzione dell’anticorpo marcato (tositumomab coniugato con iodio-131), impiega un pretrattamento con l’anticorpo monoclonale non marcato (tositumomab) somministrato per infusione in un’ora, prima dell’anticorpo radioconiugato. E’ sufficiente una settimana di trattamento e come unico effetto collaterale importante si ha la riduzione dell’ematocrito nelle settimane successive. Una temporanea riduzione dei globuli bianchi può evidenziarsi poche settimane dopo il trattamento, ma la conta leucocitaria si normalizza generalmente nell’arco di 3-4 settimane. L’infusione è di solito ben tollerata. Tra i più comuni effetti avversi non ematologici sono stati registrati astenia, febbre, nausea, suscettibilità alle infezioni, oltre a reazioni allergiche, quali broncospasmo, angioedema, rash cutaneo. Il trattamento con BEXXAR® è stato anche associato ad un rischio di ipotiroidismo e, a causa della componente murina, di risposta HAMA.

6.5 Radioimmunoterapia: la tecnica avidina-biotina

La radioimmunoterapia è la cura dei tumori attraverso anticorpi carichi di radiazioni intelligenti che colpiscono le cellule maligne ma risparmiano quelle sane. La sua completa applicazione è tuttavia frenata dal problema dei cosiddetti “anticorpi dispersi”, cioè l’anticorpo marcato si lega al tumore solo in una piccola percentuale mentre il restante continua a circolare nel sangue e finisce con il disperdersi nell’organismo. I ricercatori dello IEO (Istituto Europeo di Oncologia) di Milano hanno messo a punto una tecnica grazie alla quale si evita la dispersione dell’anticorpo. Questa nuova tecnica prende il nome di PAGRIT (Pre-Targeted Antibody Guided Radio Immuno Therapy) e sfrutta l’interazione naturale tra due molecole, avidina-biotina, grazie alla quale è possibile

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caricare di radioattività solo quegli anticorpi che si posizionano sul tumore. L’avidina, proteina presente nell’albume dell’uovo, ha un peso molecolare di 66kD ed è composta da quattro subunità identiche ognuna delle quali presenta un sito di legame per la biotina. La biotina (vitamina H) è una proteina di 244 D è disponibile commercialmente con diversi linkers, che facilitano le interazioni con le diverse proteine.

Lo schema terapeutico della nuova tecnica radioimmunoterapica si realizza in tre fasi:

Il primo giorno il paziente riceve un'iniezione endovenosa di anticorpi monoclonali precedentemente legati a molecole di biotina. Questi anticorpi andranno a localizzarsi sul loro bersaglio (il tumore) nell'arco di 24-48 ore.

24-48 ore dopo la prima somministrazione, il paziente riceve un'altra infusione endovenosa, questa volta di avidina: grazie alla fortissima affinità fra queste due molecole, l'avidina si lega alla biotina già presente sul tumore, mentre quella rimasta in circolo viene metabolizzata a livello epatico. L'avidina, ha 4 siti di legame, 4 piccole "tasche" in cui potrà nuovamente inserire altre molecole di biotina.

Il terzo giorno, quando gli anticorpi non legati al tumore sono stati eliminati, il paziente riceve l'ultima iniezione, questa volta di biotina precedentemente marcata con un isotopo radioattivo. La biotina radioattiva è dunque "calamitata" dall'avidina presente nel tumore, e raggiunge in pochi minuti il suo target specifico, provocandone la distruzione. La biotina radioattiva non legata al tumore viene rapidamente eliminata attraverso i reni.

Finora questo tipo di radioimmunoterapia è stata applicata solo su casi gravi di tumore in stadio avanzato, dopo che erano risultate inefficaci le altre terapie. I tipi di tumore che paiono più sensibili a questa terapia sono quelli del cervello ed i linfomi. Anche se il trattamento è stato ben tollerato e privo degli effetti collaterali, propri di altre terapie tradizionali, è doveroso sottolineare

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che si tratta ancora di una terapia sperimentale, indicata solo per alcuni tipi di neoplasie e solo quando il tumore non supera i 2 centimetri di diametro. Il sistema di pretargeting a base di avidina-biotina rappresenta un modello di radioimmunoterapia mirata molto promettente per la terapia del cancro. In teoria è applicabile a tutti i tipi di tumore per i quali siano disponibili anticorpi specifici. Anche se complesso, il sistema non è difficile da usare. Richiede, però, strutture idonee all'utilizzo di radioisotopi.

6.6 Anticorpi anti-cd 33

L’antigene CD-33 è presente sulla maggior parte delle cellule emopoietiche, in più dell’ 80% dei blasti leucemici dei soggetti affetti da leucemia mieloide acuta e nella maggior parte delle mielodisplasie. La terapia ha come bersaglio questo antigene e si attua con il GEMTUZUMAB, MYLOTARG, un anticorpo monoclonale umanizzato legato covalentemente ad un derivato semisintetico della calicheamicina, un potente antibiotico con azione citotossica. L’azione terapeutica è svolta proprio da questo antibiotico che, veicolato tramite l’anticorpo all’interno dei lisosomi dei mieloblasti, viene rilasciato e, entrato nel nucleo, causa rottura del DNA e conseguente morte cellulare. Come risultato quindi avremo la morte delle cellule leucemiche, mentre le cellule staminali emopoietiche sane continueranno nel rifornimento delle cellule sangiugne, senza essere state intaccate dall’intervento dell’antibiotico. MYLOTARG è stato approvato nel 2000 dalla FDA per il trattamento delle recidive della leucemia mieloide acuta,positiva per il CD33. Il piano terapeutico convenzionale prevede due o tre somministrazioni, con intervallo compreso tra 14 e 28 giorni. La dose raccomandata è di 9mg/m2, somministrata per via endovenosa. I danni epatici e la mielosoppressione rappresentano le tossicità primarie. Sono anche stati riportati anemia, trombocitopenia, infezioni e reazioni allergiche.

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Internalizzazione di un coniugato farmaco-anticorpo: Il coniugato, dopo il legame all’antigene, viene endocitato attraverso una via dipendente dalla clatrina. Nel lisosoma subisce un taglio che rilascia l’agente citotossico.

6.7 Anticorpi anti-cd52

L’antigene CD52 è una proteina espressa ad alta densità su tutti i linfociti B e T, su monociti, macrofagi, eosinofili.

MabCampath è un farmaco antitumorale, indicato per il trattamento di pazienti affetti da leucemia linfocitica cronica (LLC). La LLC è un tumore dei linfociti (un tipo di globuli bianchi del sangue). MabCampath è utilizzato nei pazienti cui non si adattano terapie combinate comprendenti fludarabina (un altro farmaco usato nel trattamento della leucemia). Il medicinale può essere ottenuto soltanto con prescrizione medica. MabCampath deve essere somministrato sotto la supervisione di un medico esperto nell’uso della terapia oncologica. Ai pazienti devono essere somministrati steroidi, un antistaminico e un antidolorifico prima della dose iniziale e prima di ciascun aumento della dose. Inoltre, medicinali antibiotici e antivirali devono essere somministrati nel corso della terapia e dopo la terapia. MabCampath è somministrato per infusione della durata di due ore circa. Durante la prima settimana di trattamento, MabCampath deve essere somministrato in dosi crescenti: 3 mg il 1° giorno, 10 mg il 2° giorno e 30 mg il 3° giorno, purché ciascuna dose sia ben tollerata. Questa modalità di somministrazione è detta “intensificazione della dose”. In seguito, la dose raccomandata è di 30 mg al giorno, somministrati tre volte alla settimana (a giorni alterni), fino a un massimo di 12 settimane. I pazienti vanno monitorati nel corso del trattamento sia per osservarne la risposta, sia per controllare i livelli ematici di piastrine (i costituenti del sangue che aiutano la coagulazione) e neutrofili (i globuli bianchi che combattono l’infezione): se sono troppo bassi, il trattamento deve essere sospeso o interrotto. Per ulteriori dettagli, si rimanda al Riassunto delle caratteristiche del prodotto (anch’esso accluso all’EPAR).

ALEMTUZUMAB, il principio attivo di MabCampath, è un anticorpo monoclonale. Nella LLC si producono troppi linfociti. Alemtuzumab è stato concepito per legarsi a una glicoproteina (un proteina ricoperta con molecole di zucchero) denominata CD52 che si trova sulla superficie dei linfociti. In seguito al legame, il linfocita muore e in tal modo si tiene sotto controllo la LLC. MabCampath è stato esaminato in quattro studi principali, su di un totale di 446 pazienti affetti da LLC. Uno studio ha interessato 297 pazienti mai trattati in precedenza. Lo studio poneva a confronto l’efficacia di un trattamento di dodici settimane con MabCampath con quella di un trattamento di un anno con clorambucile (altro farmaco antitumorale). Il principale indicatore dell’efficacia era l’intervallo di tempo alla progressione della malattia o al decesso del paziente. Gli altri tre studi condotti hanno interessato in tutto 149 pazienti che avevano già ricevuto altri trattamenti. In questi studi, MabCampath non è stato posto a confronto con altri trattamenti. Lo

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studio principale ha riguardato 93 pazienti che non rispondevano più al trattamento con fludarabina. Il principale indicatore dell’efficacia era la risposta complessiva al trattamento. Nei pazienti che non avevano ricevuto alcun precedente trattamento, MabCampath si è dimostrato più efficace rispetto al clorambucile. Per i pazienti trattati con MabCampath, l’intervallo medio intercorrente prima del peggioramento della malattia o del decesso del paziente era di 14,6 mesi, rispetto a 11,7 mesi per i pazienti trattati con clorambucile. Nello studio principale condotto su pazienti già trattati in precedenza, la percentuale di pazienti che ha risposto parzialmente o completamente al trattamento con MabCampath è stata pari al 33%. Analoghi risultati sono stati osservati negli altri due studi condotti su pazienti già trattati in precedenza. Si manifestano effetti indesiderati nel 97% circa dei pazienti mai trattati in precedenza e in circa l’80% di quelli già precedentemente trattati. Gli effetti indesiderati più comuni (osservati in oltre 1 paziente su 10) sono: infezioni, ipotensione (bassa pressione arteriosa), nausea, orticaria, eruzioni cutanee, febbre, brividi, basso contenuto di cellule del sangue (granulociti, piastrine e globuli rossi), anoressia (perdita di appetito), mal di testa, dispnea (difficoltà di respirazione), vomito, diarrea, prurito, iperidrosi (sudorazione eccessiva) e affaticamento. Per l’elenco completo degli effetti indesiderati rilevati con MabCampath, si rimanda al foglio illustrativo. MabCampath non deve essere somministrato a persone che potrebbero essere ipersensibili (allergiche) ad alemtuzumab, alle proteine del topo o a uno qualsiasi degli altri componenti. MabCampath non deve essere utilizzato in pazienti:

con infezione attiva, che si è propagata in tutto l’organismo;

con infezione da HIV;

che hanno tumori attivi secondari;

in gravidanza.

Il comitato per i medicinali per uso umano (CHMP) ha concluso che l’efficacia di MabCampath è stata dimostrata, sebbene non vi sia notizia di studi che abbiano messo direttamente a confronto MabCampath con trattamenti combinati, comprendenti fludarabina, ampiamente impiegati per il trattamento di pazienti affetti da LLC. Il CHMP ha deciso pertanto che i benefici di MabCampath sono superiori ai suoi rischi nel trattamento di pazienti affetti da LLC a cellule B per i quali non è adatto un trattamento chemioterapico con fludarabina. Il comitato ha raccomandato il rilascio dell'autorizzazione all'immissione in commercio per MabCampath. L’autorizzazione di MabCampath è stata rilasciata inizialmente in “circostanze eccezionali” in quanto, per ragioni scientifiche, non è stato possibile ottenere informazioni complete sul medicinale. Dal momento che la casa farmaceutica ha fornito le informazioni supplementari richieste, la suddetta condizione è decaduta il 4 luglio 2008.

6.8 Anticorpi anti-her-2neu

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Il gene codifica per una proteina transmembrana di 185 kDa che è il sottotipo 2 del recettore per il fattore di crescita dell’epidermide umano (HER2).Questo è il recettore media la crescita cellularela cui espressione del gene HER2 è aumentata del 25-30% nel tumore al seno.

Il trastuzumab si usa soprattutto per il trattamento delle pazienti affette da carcinoma mammario avanzato, recidivante o diffuso ad altri organi (carcinoma mammario secondario).Derivato dall’anticorpo umanizzato mumMAb 4D5.Il trastuzumab può essere somministrato sia da solo sia in combinazione con alcuni chemioterapici. Sono in corso degli studi miranti a verificare se il trastuzumab è in grado di ridurre le possibilità di recidiva del carcinoma mammario, dopo il trattamento iniziale Il trastuzumab agisce interferendo con una delle modalità di crescita e divisione delle cellule del carcinoma mammario. Allo stato attuale sembra che solo uno su cinque (20%) casi di tumore della mammella sia sensibile a questo farmaco. Il fattore di crescita umano dell’epiderma è una proteina prodotta naturalmente dal corpo umano, che in alcuni casi si attacca ad un’altra proteina (HER2 o CerbB2) che si trova sulla superficie delle cellule neoplastiche. Questo legame stimola la moltiplicazione delle cellule neoplastiche.Il trastuzumab blocca tale azione attaccandosi alla proteina HER2, impedendo in tal modo al fattore di crescita umano dell’epiderma di raggiungere le cellule neoplastiche e, di conseguenza, impedendone la divisione e la crescita. Il trastuzumab agisce anche da stimolatore delle cellule immunitarie dell’organismo per aiutarle a distruggere le cellule neoplastiche.I meccanismi d’azione attraverso i quali il farmaco esplica la sua azione antitneoplastica sono molteplici:

blocco dei segnali di crescita trasdotti dal recettore HER-2neu. Questa interazione impedisce al fattore di crescita epiteliale di interagire con il proprio recettore posto sulle cellule tumorali e ne blocca quindi la proliferazione;

coinvolgimento delle cellule del sistema immunitario nella distruzione delle cellule tumorali bersaglio,attraverso la citotossicità anticorpo-dipendente cellulo-mediata;

down-regulation del fattore di crescita dell’endotelio vascolare e di altri fattori di moltiplicazione dei vasi sanguigni;

potenziamento della chemioterapia,attraverso la prevenzione dei processi di ricaptazione del DNA daneggiato dai farmaci citotossici.

Il trastuzumab è efficace solo nelle donne con un livello elevato di proteina HER2, mentre i suoi effetti sono meno evidenti nelle altre pazienti. Sono disponibili diverse modalità di determinazione del livello di HER2. Attualmente il dosaggio della proteina HER2 non si esegue ancora di routine su tutte le pazienti affette da tumore della mammella, ma vi si fa ricorso di solito quando l’oncologo ritiene che il trastuzumab possa rappresentare un’opzione terapeutica per un caso specifico.Il dosaggio della proteina HER2 può essere eseguito in occasione del trattamento chirurgico di prima istanza oppure su campioni di cellule neoplastiche prelevati da biopsie o reperti operatori

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precedenti. La farmacocinetica del trastuzumab è stata studiata in pazienti affetti da carcinoma mammario metastatico e in fase iniziale. E’ stata rilevata una farmacocinetica dose dipendente dopo somministrazione i.v. di concentrazioni comprese nel range di 10-500 mg, una volta a settimana. L’emivita è di circa 28 giorni e il periodo di eliminazione è fino a 24 settimane. L’effetto indesiderato più frequente è una reazione similinfluenzale che si verifica nel corso della prima infusione.Il trastuzumab somministrato da solo riduce la massa tumorale in una minoranza di casi, mentre ne blocca la crescita in altre. Sono attualmente in corso degli studi per valutare gli effetti del farmaco somministrato in combinazione con alcuni chemioterapici. Se associato in particolare con paclitaxel (Taxol®), il trastuzumab migliora la risposta alla chemioterapia e potrebbe prolungare anche la sopravvivenza.

6.9 Anticorpi anti-egfr

1. Che cos’è Erbitux?

Erbitux è una soluzione per infusione (flebo in vena) contenente il principio attivo cetuximab.

2. Per che cosa si usa Erbitux?

Erbitux è utilizzato per il trattamento dei seguenti tipi di tumori:

tumore metastatico del colon o del retto (intestino crasso). “Metastatico” significa che il tumore si è diffuso ad altre parti del corpo. Erbitux è usato nei pazienti le cui cellule tumorali presentano sulla superficie una proteina detta recettore del fattore di crescita

epidermica (EGFR) e contengono un gene “di tipo selvaggio” (non mutato) chiamato “KRAS”. Erbitux è indicato in associazione con altri farmaci antitumorali oppure da solo se un precedente trattamento antitumorale con oxaliplatino e irinotecan non ha dato risposta e il paziente non è in grado di ricevere irinotecan;

carcinomi “a cellule squamose” di testa e collo. Questi tipi di carcinomi colpiscono le cellule del tessuto che riveste la bocca o la gola oppure altri organi, come la laringe. Nel carcinoma localmente avanzato (quando il tumore è cresciuto ma non si è diffuso), Erbitux è somministrato in combinazione con radioterapia (terapia radiante). Nel tumore recidivante (che ricompare in seguito a un precedente trattamento) o metastatico, Erbitux è indicato in associazione ad una combinazione di farmaci antitumorali “a base di platino” (tra cui farmaci quali cisplatino o carboplatino).

Il medicinale può essere ottenuto soltanto con prescrizione medica.

3. Come si usa Erbitux?

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Erbitux va somministrato esclusivamente da medici esperti nell’uso dei farmaci antitumorali. Prima della somministrazione di Erbitux per la prima volta, il paziente deve ricevere un antistaminico e un corticosteroide per evitare reazioni allergiche. Ciò è raccomandato anche per tutte le infusioni successive. Erbitux va somministrato una volta alla settimana. La prima infusione viene somministrata a una dose di 400 mg per metro quadro di superficie corporea (calcolata in funzione dell’altezza e del peso del paziente) e dura due ore. Le infusioni successive sono di 250 mg/m2 e durano un’ora ciascuna. In monoterapia o in associazione con altri farmaci antitumorali, il trattamento con Erbitux deve essere proseguito per il tempo necessario in funzione della risposta terapeutica. Quando Erbitux è somministrato in concomitanza con radioterapia, il trattamento con Erbitux deve iniziare una settimana prima dell’inizio della radioterapia e va proseguito fino al termine della radioterapia.

4. Come agisce Erbitux?

Il principio attivo di Erbitux è cetuximab, un anticorpo monoclonale, ovvero un anticorpo (un tipo di proteina) concepito per riconoscere una struttura specifica (antigene) presente su alcune cellule dell’organismo e legarsi ad essa. Il cetuximab è stato concepito per legarsi al recettore del fattore di crescita epidermica (EGFR), che può essere presente sulla superficie di alcune cellule tumorali. Di conseguenza, le cellule tumorali non possono più ricevere i messaggi necessari per crescere, progredire e diffondersi. Tra il 79 e l’89% dei tumori colorettali e più del 90% dei tumori a cellule squamose di testa e collo esprimono l’EGFR sulla superficie delle loro cellule.

5. Quali studi sono stati effettuati su Erbitux?

Per i casi di tumore metastatico del colon o del retto, Erbitux è stato studiato nel corso di cinque studi principali:

due studi hanno interessato 1 535 pazienti, che in precedenza non avevano ricevuto chemioterapia,

e hanno analizzato gli effetti dell’aggiunta di Erbitux alla terapia di associazione a base di irinotecan od oxaliplatino;

tre studi hanno interessato 2 199 pazienti in cui la malattia era peggiorata durante un precedente trattamento comprendente irinotecan, oxaliplatino o entrambi, o ai quali non potevano essere somministrati tali medicinali.

Per i casi di tumore di testa e collo, Erbitux è stato studiato nel corso di due studi principali:

il primo studio ha interessato 424 pazienti affetti da tumore localmente avanzato e ha analizzato gli effetti dell’aggiunta di Erbitux alla radioterapia;

il secondo studio ha interessato 442 pazienti con tumore recidivante o metastatico e ha analizzato gli effetti dell’aggiunta di Erbitux alla combinazione di farmaci antitumorali a base di platino.

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Tutti gli studi hanno esaminato la durata del periodo di vita senza peggioramento del cancro o il tempo di sopravvivenza dei pazienti. La maggior parte degli studi ha valutato separatamente i risultati nei pazienti con tumore con gene KRAS di tipo selvaggio rispetto ai pazienti con tumore con gene mutato. Nelle cellule tumorali il gene KRAS stimola la crescita tumorale quando esso è mutato.

6. Quali benefici ha mostrato Erbitux nel corso degli studi?

Negli studi relativi al tumore del colon o del retto, i pazienti i cui tumori presentavano il gene KRAS di tipo selvaggio e che assumevano Erbitux sono sopravvissuti più a lungo senza peggioramento della malattia:

nei pazienti che non erano mai stati sottoposti a chemioterapia in precedenza, i pazienti erano sopravvissuti più a lungo senza peggioramento della malattia quando erano stati trattati con Erbitux in aggiunta a chemioterapia. Questo comprendeva chemioterapia con irinotecan (l’intervallo medio è stato di 9,9 mesi rispetto a 8,7 mesi) e con oxaliplatino (l’intervallo medio è stato di 7,7 mesi rispetto a 7,2 mesi);

il primo studio in pazienti che erano già stati sottoposti a chemioterapia non ha esaminato le mutazioni del gene KRAS, mentre negli altri due studi, i pazienti con tumore con gene KRAS di tipo selvaggio sono sopravvissuti più a lungo senza peggioramento della malattia quando Erbitux era somministrato in associazione alla propria terapia. I pazienti che non avevano risposto al trattamento con oxaliplatino né con irinotecan sono sopravvissuti in media 3,6 mesi con Erbituxil fino al peggioramento della malattia, rispetto a 1,9 mesi per i pazienti trattati soltanto con la miglior terapia di supporto (cura dei sintomi ma non del tumore stesso). I pazienti che non avevano dato risposta al trattamento con oxaliplatino sono sopravvissuti in media 4,0 mesi con Erbitux e irinotecan fino al peggioramento della malattia, rispetto a 2,6 mesi con irinotecan da solo.

Per quanto riguarda il tumore di testa e collo localmente avanzato, i pazienti sono sopravvissuti più a lungo fino al peggioramento della malattia aggiungendo Erbitux alla radioterapia (in media 24,4 mesi rispetto ai 14,9 mesi). Nel tumore di testa e collo recidivante o metastatico, la sopravvivenza era risultata maggiore aggiungendo Erbitux alla combinazione di farmaci antitumorali a base di platino (in media 10,1 mesi rispetto ai 7,4 mesi).

7. Qual è il rischio associato a Erbitux?

Gli effetti indesiderati più comuni associati a Erbitux (osservati in più di un paziente su 10) sono reazioni cutanee quali eruzioni, ipomagnesemia (bassi livelli di magnesio nel sangue), reazioni correlate all’infusione (fra cui febbre, brividi, capogiri e difficoltà a respirare), mucosite (infiammazione della mucosa della cavità orale) e valori elevati di taluni enzimi epatici. Eruzioni cutanee si verificano in oltre l’80% dei pazienti. Per l’elenco completo degli effetti indesiderati rilevati con Erbitux, si rimanda al foglio illustrativo. Erbitux non deve essere usato in soggetti che sono ipersensibili (allergici) al cetuximab. Sono possibili gravi reazioni durante l’infusione, per cui in questa fase il paziente va tenuto sotto stretta osservazione.

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8. Perché è stato approvato Erbitux?

Il comitato per i medicinali per uso umano (CHMP) ha deciso che i benefici di Erbitux sono superiori a suoi rischi nel trattamento di pazienti affetti da carcinoma colorettale metastatico con espressione di EGFR, con gene KRAS di tipo selvaggio e di pazienti con tumore a cellule squamose di testa e collo. Il comitato ha raccomandato il rilascio dell’autorizzazione all’immissione in commercio per Erbitux.

PANITUMUMAB (VECTIBIX)

Approvato della FDA nel 2006 indicato nel trattamento del cancro metastatico del colon-retto, EGFR positivo.

Anticorpo monoclonale umano ottenuto sfruttando la tecnologia XenoMouse che ha reso possibile la produzione di anticorpi monoclonali completamente umani.

Miglioramento della vita in quanto studi hanno dimostrato una regressione della massa tumorale fino al 50%.

Efficacia terapeutica simile al Cetuximab; il primo in vitro dimostra maggiore affinità per il recettore,il secondo ha la caratteristica di innescare azione citotossica anticorpo-mediata.

Migliore farmacocinetica con possibilità di somministrazione mono-,bi-,tri- settimanali con rischio di tossicità inferiore.

Effetti collaterali: tossicità dermatologica,fibrosi polmonare, alterazioni a carico dell’apparato gastrointestinale.

6.10 Anticorpi anti-vegf

VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) è una proteina naturale che regola il processo dell’angiogenesi nelle sue diverse tappe.

Elevata secrezione di questa proteina si verifica dove c’è un’intesa proliferazione cellulare neoangiogenese tumorale.

Terapia effettuata con Bevacizumad (AVASTIN).

Farmaco il cui principio attivo è il Bevacizumab,anticorpo monoclonale con regioni leganti l’antigene derivate dall’anticorpo murino muMAb VEGFA461.

Viene prodotto con tecniche di DNA ricombinante in cellule ovariche di criceto cinese.

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Azione specifica sul VEGF in quanto previene il legame di tutte le isoforme del fattore angiogenico ai recettori relativi presenti sulla superficie delle cellule endoteliali inibendo la neoangiogenesi tumorale inibendo il tumore o le metastasi.

Approvato dalla FDA nel 2004 viene utilizzato per il trattamento di prima linea nei pazienti affetti da tumore metastatico al colon e al retto.

Studi clinici hanno valutato la combinazione con altri chemioterapici(5-FU e AF) i cui risultati hanno evidenziato un incremento della sopravvivenza globale

Posologia: 5 mg/Kg 1 volta ogni due settimane i.v. per pazienti con carcinoma al retto e al colon; 10 mg/Kg i.v. per pazienti affetti da carcinoma mammario.

Stabilità fisica e chimica dimostrata per 48 ore ad una temperatura compresa tra i 2 e 30 °C; emivita 20 gg.

Effetti indesiderati: ipertensione, astenia, disordini gastrointestinali e nausea. Riscontrate anche emoraggie a carico di vari organi.

Altre applicazioni: malattie oculari ad impronta vasogenica, emoraggica ed essudativa in cui la via di somministrazione è la via intraoculare; azione inibitoria della genesi vascolare della malattia.

6.11 Immunosoppressione

Le patologie che coinvolgono il sistema immunitario costituiscono un significativo problema di carattere sanitario. Tali patologie includono una verità di malattie a base autoimmune ,quali artrite reumatoide, morbo di Crohn, psoriasi ecc. Farmaci immunosoppressori possono essere impiegati per attenuare la risposta immune nel trapianto d’organo e nelle malattie autoimmuni. In questo ambito, la terapia con anticorpi, finalizzata a creare uno stato di immunosopressione ha registrato qualche successo. Le prime strategie avevano l’intento di uccidere queste cellule utilizzando sia meccanismi effettori naturali degli anticorpi, sia agenti citotossici (immunotossine). Successivamente, c’è stato uno spostamento di indirizzo della terapia anticorpale verso l’utilizzo di anticorpi bloccanti, che non uccidono le cellule. Mediante l’uso di anticorpi in grado di interferire nei normali processi cellulari l’obiettivo è potere riprogrammare le cellule nelle reazioni autoimmuni per bloccarle; in modo simile si può pensare di fare accettare al sistema immunitario tessuti estranei trapiantati. Queste funzioni bloccanti degli anticorpi richiedono che essi siano ancora in grado di legare l’antigene, ma che non attivino il complemento o il recettore Fc sulle cellule effettrici e, in qualche caso sono state realizzate modificazioni a carico delle sequenze nelle regioni costanti degli anticorpi, critiche per le funzioni effettrici. Preparazioni a base di anticorpi

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(sia mono che poli-clonali) diretti contro le cellule T-reattive costituiscono importanti terapia di supporto e forniscono un’opportunità unica per colpire, in modo selettivo specifiche cellule immuno-reattive permettendo trattamenti più mirati.

6.12 Profilassi del rigetto

La terapia di induzione con anticorpi era quella di somministrare ai pazienti un anticorpo specifico,che si legasse a ceri linfociti,diminuendo la risposta immunitaria diretta contro l’organo trapiantato. Due sono gli obiettivi della terapia anticorpale di induzione:ritardare l’uso di farmaci immunosoppressori più tossici o intensificare la terapia immunosoppressiva iniziale nei pazienti ad alto rischio di rigetto. La terapia di induzione con anticorpi si impiega in circa il 70%dei soggetti trapiantati. L’uso è stato favorito da diversi fattori,quali l’introduzione di anticorpi monoclonali chimerici o umanizzati, non antigenici e con emivita serica prolungata ,e di anticorpi diretti contro il recettore dell’IL-2 (IL-2 R), più sicuri. Gli anticorpi usati in terapia di induzione possono essere divisi in due gruppi : anticorpi che depletano i linfociti T e anticorpi immunomodulatori.

6.13 Anticorpi anti –cd3

MUROMONAB-CD3 (orthoclone okt3)- murina

Muromonab-CD3 è stato il primo anticorpo monoclinale ad essere approvato dalla FDA americana, come agente immunosoppresore nella profilassi del rigetto. E’un prodotto di origine murina, lanciato negli anni 80’ come anticorpo monoclonale terapeutico di prima generazione. Agisce legandosi specificatamente a un componente del complesso recettoriale sulla superficie cellulare, denominato CD3, dei linfociti T umani, inibendo tutte le funzioni di queste cellule, che giocano un ruolo primario nel rigetto acuto. Come preparazione di anticorpi monoclonale, ORTHOCLONE OKT3 in vivo reagisce con la maggiore parte dei linfociti T del sangue periferico e dei tessuti, ma non risulta che reagisca con altri elementi emopoietici o altri tessuti. Il legame dell’anticorpo alla molecola CD3induce una rapida internalizzazione del recettore dei linfociti T, prevenendo così un successivo riconoscimento dell’antigene. La somministrazione di muromonab -CD3 è seguita da deplezione della maggior parte delle cellule T dal torrente sanguigno e dagli organi linfatici periferici. Al termine della terapia, le cellule T riappaiono rapidamente e raggiungono entro una settimana i livelli di pre-trattamento. Tuttavia in alcuni pazienti è stato osservato un numero crescente di linfociti CD3 positivi prima della fine del trattamento con ORTHOCLONE OKT3. La ricomparsa di linfociti CD3positivi è attribuibile allo sviluppo di anticorpi anti muromonabCD3, che ne bloccano la capacità di legare l’antigene l’uso ripetuto di ORTHOCLONE OKT3 determina immunizzazione del paziente contro i determinanti di origine murina dell’anticorpo (risposta HAMA) e questo può neutralizzare e prevenire la sua efficacia immunosoppressiva. L’immunosoppressione non è esente da svantaggi, ogni qual volta riceva un’immunosoppressione intensa il paziente vede aumentare il rischio di subire infezioni e/o neoplasie. Sono state riportate

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reazioni gravi talvolta fatali a livello sistemico cardiovascolare e del sistema nervoso centrale. Il principale effetto collaterale è la sindrome da rilascio da citochine prevenuta da preventiva somministrazione di glucocorticoidi.

6.14 Anticorpi anti cd25

Daclizumab e Basiliximab sono anticorpi monoclonali diretti contro la subunità alfa del recettore dell’IL2 (antigene CD25)espresso sulla superficie dei linfociti T in risposta a uno stimolo antigenico. La produzione si realizza sempre in un linea cellulare di mieloma,opportunamente trasformata con plasmidi contenenti le sequenze per le regioni variabili di topo geneticamente fuse con quelle umane. L’indicazione approvata è, per entrambi, la profilassi del rigetto acuto in pazienti adulti e pediatrici sottoposti a trapianto renale e allo genico. Il legame ad alta affinità dell’anticorpo all’IL2R ne impedisce il legame con l’IL2, segnale per la proliferazione dei linfociti T passaggio critico nella risposta immunitaria cellulare coinvolta nel rigetto allo genico. Entrambi gli anticorpi anti CD25,somministrati per iniezione o infusione endovenosa, vengono associati alla ciclosporina e ai corticosteroidi. Per quanto riguarda gli effetti indesiderati sono state osservate alterazioni strutturali renali e della funzionalità epatica;alterazioni dell’apparato respiratorio,muscolo scheletrico e gastrointestinale. Di rado gravi reazioni di ipersensibilità.

6.15 Anticorpi anti cd3 di nuova generazione

ChAglyCD3 e hOKT3yl sono anticorpi monoclonali umanizzati e ingegnerizzati, in grado di legare specificamente il complesso proteico di membrana CD3 presente sulle cellule T umane. L’umanizzazione minimizza l’instaurarsi di risposta AMA ;le mutazioni prevengono il loro legame ai recettori Fc e sono determinanti per il legame dell’anticorpo sulle cellule T attivate ma,non su quelle native. Le modifiche nella struttura anticorpale prevengono le complicazioni legate all’attivazione delle cellule T e associate alla terapia anti CD3 di prima generazione. L’azione anti CD3 dell’anticorpo impedisce la piena risposta immunitaria e ha aperto nuove prospettive per il trattamento del diabete. Ad eccezione di fastidi digestivi reazioni cutanee e anemia, non è stato riscontrato alcun grave effetto indesiderato.

6.16 Anticorpi anti tnf ALFA

INFLIXIMAB

Infliximab è un anticorpo monoclinale chimerico murino/umano ad azione inibitoria specifica nei confronti di una citochina proinfiammatoria, il fattore di necrosi tumorale alfa,che gioca un ruolo centrale nel sistema immunitario come mediatore dell’infiammazione locale. Infliximab è stato

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geneticamente ingegnerizzato per fusione della regione variabile dell’anticorpo murino 2(lega con alta specificità il TNFalfa umano) con la regione costante di una immunoglobulina umana (Ig G 1K),impiegando la tecnica del DNA ricombinante .Legandosi sia la forma trimerica che quella monomerica, Infliximab rallenta o addirittura impedisce, la formazione dei complessi trimolecolari biologicamente attivi del TNFalfa ,processo che porta alla perdita di attività biologica della citochina. Infliximab inoltre può determinare lisi cellulare attraverso l’attivazione classica del complemento. E’ indicato per il trattamento di soggetti adulti affetti da diverse patologie su base immunitaria. In combinazione con metotrexato ,Infliximab è indicato per il miglioramento della funzionalità e la riduzione dei sintomi dell’artrite reumatoide. Nel morbo di Crohn il trattamento con infliximab riduce l’infiltrazione di cellule dell’infiammazione delle aree dell’intestino coinvolte e la presenza in queste sedi di marker dell’infiammazione,come la proteina C reattiva. Nel trattamento della psoriasi Infiximab determina un netto miglioramento delle chiazze della pelle anche in casi gravi. Un aspetto importante da considerare è la immunogenicità , dal momento che la porzione variabile dell’anticorpo che reca il sito di legame con il TNFalfa è costituita da proteine murine. La possibilità di sviluppare anticorpi anti Infliximab (risposta AMA)limita l’efficacia del farmaco e aumenta il rischio di reazioni infusionali. Il trattamento con Infliximab è stato associato ad infezioni talvolta gravi come tubercolosi e setticemia e i pazienti devono essere monitorati prima durante e dopo il trattamento.

ETANERCEPT

Un agente terapeutico che manifesta un meccanismo d’azione simile all’Infliximab pur non essendo un anticorpo monoclonale. E’ una proteina di fusione prodotta in un sistema di espressione di mammifero (cellule CHO) attraverso la tecnologia del DNA ricombinante. Etanercpet è il dimero di una proteina chimerica,sintetizzata geneticamente mediante fusione di due identiche catene monometriche del recettore 2 del TNF umano, responsabile del legame con il ligando, con il dominio Fc dell’immunoglobulina umana Ig G 1. Etanercpt è efficace in analogia ad Infliximab, nel trattamento di disordini reumatologici ed è indicato per la riduzione dell’infiammazione associata all’artrite reumatoide.

ADALIMUMAB (humira) -umano

Un altro prodotto diretto contro il TNFalfa è Adalimumab,anticorpo monoclinale interamente umano (IgG 1) creato con la tecnologia del phage display, che permette la selezione da un ampio repertorio di anticorpi, di uno specifico per u antigene a differenza dell’In cui la componente murina incrementa il potenziale immunogeno e limita l’uso a lungo termine, la natura umana di adalimumab consente l’ottenimento di una risposta a lungo termine, con una basso grado di immunogenicità. Il legame specifico dell’ adalimumab con TNF alfa dà luogo ad un addotto voluminoso, costituito da tre molecole di adalimumab complessate con tre trimeri di TNF alfa. Anche in questo caso il legame è selettivo con il TNF alfa e bloccando la sua interazione con i recettori ne neutralizza le funzioni. Adalimumab è in grado inoltre di determinare lisi delle cellule immuni attraverso meccanismi anticorpo mediati e complemento mediati. E indicato nell’artrite

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reumatoide e psoriasica e morbo di Crhon. Gli effetti avversi più comunemente riportati comprendono infezioni delle vie respiratorie, urinarie, fungine superficiali, herpes, influenza.

6.17 Anticorpi anti –tnf ALFA di nuova generazione

CERTOLIZUMAB PEGOL (cimzia)- FRAMMENTO FAB

Certolizumab è un singolo frammento Fab di un anticorpo monoclonale anti TNF alfa umanizzato. Per estendere l’emivita ad un valore comparabile a quello dell’intera molecola anticorpale, il frammento Fab è stato pugilato. Il sito di pegilazione è in corrispondenza della cerniera tiolica. La pegilazione comparabile con la somministrazione per via sottocutanea, aumenta l’emivita del farmaco e sono in via di sperimentazione protocolli di somministrazione a cadenza bi-settimanale e mensile.

Certolizumab pegol è dotato di affinità per il TNF alfa e ne neutralizza gli effetti pato-fisiologici,ma sebbene leghi sia la forma solubile che transmembranica della citochina,non induce apoptosi dei linfociti e dei monoliti nel sangue periferico. Il farmaco è risultato complessivamente ben tollerato: gli effetti collaterali gravi sono stati rari e distribuiti uniformemente tra i gruppi di trattamento. In generale si osservano mal di testa, dolori addominali, nausea,febbre, eruzioni cutanee e soprattutto al sito di iniezione, infezioni, fino a possibili setticemia e tubercolosi.

6.18 Anticorpi anti il- 6r di nuova generazione

TOCILIZUMAB (actemra)-umanizzato

L’artrite reumatoide è una malattia infiammatoria autoimmune caratterizzata da una iperattività di citochine infiammatorie come il TNFalfa,IL1,IL6. La terapia con anti TNFalfa ed anti IL1 ha già dimostrato di possedere una certa efficacia nel trattamento di questa patologia.L’Il6 rappresenta un altro target molecolare nel trattamento dell’artrite reumatoide. Tocilizmab è un anticorpo monoclinale umanizzato diretto contro i recettori dell’IL-6. Il legame ad alta affinità dell’anticorpo ai recettori dell’IL-6 impedisce il legame della citochina pro-infiammatoria ai suoi recettori e ne neutralizza gli effetti.

6.19 Anticorpi anti-cd11a

EFALIZUMAB (raptiva)- umanizzato

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Efalizumab è un anticorpo monoclinale umanizzato ricombinante prodotto da cellule ovariche di criceto cinese, con tecniche di ingegneria genetica. Sequenze umane (Ig G1k) sono state inserite in luogo di quelle murine,preservando solo le CDR originarie,importanti per il riconoscimento dell’antigene. Efalizumab ha come bersaglio la subunità CD 11° dell’LFA-1 (antigene associato alla funzione dei linfociti), una proteina di adesione della superficie delle cellule leucocitarie. Il legame specifico di Efalizumab all’antigene CD 11a previene il legame tra LFA-1 e ICA-1 ,interferendo con l’adesione dei linfociti T ad altri tipi di cellule LFA-1 è presente sui linfociti T attivati. Gli effetti collaterali sono di norma lievi. Le reazioni avverse più frequentemente osservate durante la terapia sono state sintomi simil-influenzali acuti e dose-correlati.

6.20 Anticorpi anti –ALFA 4 integrine

NATALIZUMAB (tysabri)-umanizzato

Natalizumab è un anticorpo monoclonale ricombinante umanizzato prodotto in una linea cellulare murina mediante la tecnologia del DNA ricombinante. È un inibitore selettivo delle alfa4 subunità delle integrine umane alfa4 beta1 ed alfa4beta7, espresse sulla superficie di tutti leucociti, ad eccezione dei neutrofili. Natalizumab si lega al’integrina alfa4beta1 bloccando così l’interazione con il suo recettore complementare VCAM-1, molecola di adesione delle cellule vasali ,critica per il passaggio delle cellule T dalla periferia all’interno del sistema nervoso centrale, e con i ligandi osteopontina 23 e CS-1. l’alterazione di tali interazione molecolari impedisce la migrazione dei leucociti mononucleati attraverso l’endotelio fino al tessuto parenchimale infiammato. Un ulteriore meccanismo d’azione di Natalizumab può consistere nella soppressione delle reazioni infiammatorie in atto nei tessuti ammalati,mediante l’inibizione dell’interazione dei leucociti che esprimono alfa4 con i loro ligandi nella matrice extracellulare e sulle cellule del parenchima. In tal modo Natalizumab può sopprimere l’attività infiammatoria presente nell’area malata ed inibire un’ulteriore migrazione nei tessuti infiammati di cellule del sistema immunitario. TYSABRI è indicato come monoterapia per il trattamento di pazienti con sclerosi multipla recidivante- remittente. Gli effetti indesiderati più comuni associati a Natalizumab sono stati: infezione (delle vie urinarie,del naso e della gola),orticaria (rash), mal di testa, vertigini, vomito, nausea, artralgia, brividi, piressia e stanchezza. TYSABRI non va usato nei pazienti che potrebbero essere ipersensibili (allergici) al Natalizumab o ad uno qualsiasi degli altri componenti,nei pazienti con PML e nei pazienti a rischio di contrarre un’infezione.

7. ALTRE APPLICAZIONI IN CAMPO FARMACEUTICO

7.1 Anticorpi anti-gpiib/iiia79

ABCIXIMAB (ReoPro®) frammento Fab

Abciximab è un singolo frammento Fab di un anticorpo monoclonale chimerico murino/umano prodotto a partire dall’anticorpo monoclonale murino 7E3. La proteina chimerica (IgG1k-7E3) originaria è una proteina ricombinante costituita dalle regioni variabili del topo e dalle regioni costanti dell’uomo e viene secreta nel mezzo di coltura da una cellulare di ibridomi, in cui sia stato precedentemente inserito il gene chimerico. Il frammento Fab si ricava per digestione della

proteina chimerica con la papaina. Il prodotto finale è costituito per il 50% circa da sequenze murine e per il rimanente da sequenze di origine umana. E’ diretto contro il recettore glicoproteico GPIIb/IIIa situato sulla superficie delle piastrine umane. Questi recettori glicoproteici di membrana appartiengono alla famiglia delle

integrine, maggiormente coinvolti nell’aggregazione piastrinica. Si ritiene che Abciximab comporti un impedimento sterico e modifiche conformazionali a livello del recettore glicoproteico, con il conseguente blocco dell’accesso al recettore delle grandi molecole di adesione, e quindi della capacità delle piastrine di legarsi. Inoltre, l’ Abciximab si lega al recettore della vitronectina presente sulle piastrine e sulle cellule endoteliali. Il recettore della vitronectina è responsabile

delle proprietà pro-coagulanti delle piastrine e delle proprietà proliferative delle cellule endoteliali e muscolari lisce della parete vasale. A causa della duplice specificità, Abciximab blocca più efficacemente il meccanismo di amplificazione della generazione di trombina conseguente all’attivazione piastrinica, rispetto ad altri composti che inibiscono solo il recettore GPIIb/IIIa. Approvato dalla FDA nel 1994 REOPRO® è formulato in soluzione acquosa tamponata (pH 7.2), non contiene conservanti ed è indicato per mono somministrazioni. Deve essere impiegato subito dopo la diluizione. Il livello del

blocco dell’ 80% dei recettori è stato scelto come obiettivo per la dimostrazione dell’efficacia farmacologica di REOPRO®. L’ Abciximab dovrebbe essere utilizzato solo una volta: non si dispone di dati da indagine sistematica concernenti la reiterazione del trattamento. Previene l’occlusione delle arterie coronariche e le complicanze da angioplastica e impianto di stent. E’ un potente

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inibitore dell’aggregazione piastrinica. La funzione piastrinica viene ripristinata generalmente entro 48 ore, anche se il REOPRO® rimane in circolo per 15 giorni o più legato alle piastrine. A causa della componente murina, la somministrazione di Abciximab può causare la formazione di anticorpi umani antichimerici. La risposta HACA, che può portare a manifestazioni allergiche, o reazioni di ipersensibilità, è stata osservata in circa il 5-6% dei pazienti. Altri effetti indesiderati comprendono complicanze emorragiche, trombocitopenia, nausea, ipotensione, dolore toracico, febbre.

7.2 Anticorpi anti-proteina f di rsv

PALIVIZUMAB – (synagis®) – umanizzato

Palivizumab è un anticorpo monoclonale umanizzato (classe IgG1k) prodotto in linee cellulari stabili di mieloma murino. Per l’umanizzazione, sequenze codificanti le CDR dell’anticorpo murino mAb1129 sono state introdotte in sequenze di DNA codificanti le regioni variabile (Fab) e costante (Fc) di una immunoglobulina umana. E’ diretto contro un epitopo nel sito antigenico A della glicoproteina F, una delle due maggiori glicoproteine dell’envelope del virus sinciziale respiratorio (RSV), e manifesta una potente attività neutralizzante e inibitoria dei meccanismi di fusione nei confronti del RSV, sia ceppi del sottotipo A, che in quelli del sottotipo B. Il legame di Palivizumab alla glicoproteina F sulla superficie virale impedisce al virus di infettare le cellule, e inibendo la fusione delle cellule indotta da virus, determina una potente attività neutralizzante nei confronti dell’RSV. Rappresenta il primo anticorpo approvato dalla FDA per la profilassi di una malattia infettiva. In Europa è stato approvato nel 1999. E’ indicato per la prevenzioni di affezioni gravi del trattamento respiratorio inferiore, che richiedono ospedalizzazione, provocate da RSv, nei bambini ad alto rischio di malattia. In questi, l’RSV puo causare bronchiolite e polmonite grave, con rischio di ospedalizzazione; mentre nei bambini che godono di buona salute, l’RSV provoca una infezione lieve delle vie aeree superiori. Synagis® viene somministrato per iniezione intramuscolare una volta al mese durante la stagione a rischio per il RSV, che ha l’incidenza massima tra novembre e aprile. Commercializzato in polvere e solvente per soluzione iniettabile, dopo la ricostruzione la stabilità è stata dimostrata per tre ore. I dati di sicurezza dimostrano che Palivizumab è in genere sicuro e ben tollerato. La maggior parte degli effetti indesiderati è stata di carattere transitorio e di gravità da lieve a moderata. Anticorpi anti- Palivizumab sono stati riscontrati approssimativamente, nell’1% dei pazienti durante la prima fase della terapia, determinando una risposta HAHA clinicamente non rilevante. Gli effetti indesiderati piu comuni comprendono febbre, reazioni in sede di iniezione, nervosismo; di rado possono verifiacarsi episodi di difficoltà respiratoria, reazioni da ipersensibilità, rash, disturbi gastrointestinali, diminuzione del numero di globuli bianchi e alterazione dei test di funzionalità epatica. E’ in fase di valutazione l’uso nei bambini con fibrosi cistica.

7.3 Anticorpi anti-ge

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OMALIZUMAB (xolair®)-umanizzato

Omalizumab è un anticorpo monoclonale umanizzato prodotto con la tecnologia del DNA ricombinante in una linea cellulare ovarica di criceto cinese (CHO). L’anticorpo è una IgG1k, contenente regioni di supporto umane insieme a regioni determinanti la complementarietà di un anticorpo murino (MAE11) diretto contro le IgE. L’asma allergica è scatenata dal legame di IgE allergene-specifiche al proprio recettore (FcεRI), che innesca il rilascio di istamina e l’inizio della cascata infiammatoria. L’individuo che soffre di asma allergica, a contatto con un allergene, produce un eccesso di IgE. La regione Fc

della catena pesante dell IgE si lega con alta affinità ai recettori situati sulla membrana plasmatica di mastociti, basofili ed altre cellule. L’allergene che interagisce con il suo sito di legame sulle IgE legate alle cellule, si lega indirettamente al recettore attraverso un legame a ponte (cross-linking) e attiva le cellule. Omalizumab legando con alta affinità il dominio Fc della IgE previene il legame delle IgE al recettore espresso su mastociti e basofili. L’anticorpo lega lo stesso dominio sulla IgE che interagisce con il recettore specifico e il complesso ad alta affinità (IgE-anti IgE) che origina, privo di affinità per il recettore, riduce la quantità di IgE libera che può innescare la cascata allergica; Omalizumab neutralizza in tal modo, le IgE libere nel siero e blocca l’attivazione cellulare indotta da allergene. Inoltre, Omalizumab riduce il rilascio di istamina ed il numero dei recettori situati sui mastociti e basofili. Approvato dalla FDA nel 2003, xolair® è il primo farmaco biologico disponibile per il trattamento dell’asma. E’ indicato per il controllo dell’asma allergica grave e persistente, di accertata natura IgE mediata, in pazienti adulti e adolescenti. Inoltre non è stato osservato nessun effetto rebound sul livello di IgE dopo il periodo di eliminazione del farmaco. In generale, xolair® è ben tollerato, è dispensato sotto forma di polvere e solvente per soluzione iniettabile ed il prodotto deve essere utilizzato subito dopo la ricostituzione. L’effetto collaterale piu frequente è stato rappresentato dalle reazioni al sito di infezione, comprendenti dolore, gonfiore, eritema, prurito e cefalea. La maggior parte delle reazioni è stata di lieve o moderata gravità. Tra gli effetti collaterali non comuni, sono stati riportati infezioni parassitarie, alterazioni dell’apparato respiratorio e gastrointestinale.

7.4 Anticorpi anti-vegf

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RANIBIZUMAB (lucentis®) – frammento anticorpale

Il Ranibizumab è un frammento anticorpale umanizzato, derivato dall’anticorpo monoclonale anti-VEGF bevacizumab, rispetto al quale ha delle proprietà peculiari, quali il piccolo raggio ed il minor peso molecolare. Si riproduce in cellule di Escherichia coli, impiegando la tecnologia del DNA ricombinante. E’ diretto contro il fattore di crescita endoteliale vascolare umano A (VEGF-A), maggiore responsabile della formazione dei neovasi sottoretinici, causa principale di perdita della funzione visiva nei pazienti affetti dalla forma essudativa della degenerazione maculare. Nello spazio extracellulare, Ranibizumab si lega con elevata affinità alle diverse isoforme del VEGF-A, prevenendone così il legame ai recettori specifici VEGFR-1 e VEGFR-2. Il legame del VEGF-A ai suoi recettori porta ad una proliferazione delle cellule endoteliali, ad una neovascolarizzazione, e ad un aumento della permeabilità vasale, che si ritiene contribuiscano alla progressione della forma neovascolare della degenerazione maculare senile. Il blocco delle funzioni del VEGF-A esercitato dal Ranibizumab comporta inibizione della crescita neovascolare e riduzione della permeabilità vasale. Le piccole dimensioni del frammento Ranibizumab, rispetto alla molecola intera bevacizumab, consentono una ottimale capacità di penetrare tutti gli strati della retina e di diffondere nello spazio sottoretinico, dopo somministrazione intravitreale. La somministrazione per tale via ha l’obbiettivo di massimizzare l’effetto inibitorio del VEGF-A, senza interferire con il suo ruolo fisiologico nei tessuti extraoculari. Approvato dalla FDA nel 2006, è indicato per il trattamento della degenerazione neovascolare essudativa correlata all’età. I risultati degli studi clinici hanno dimostrato che quasi tutti i pazienti trattati con LUCENTIS® hanno mantenuto la loro acuità visiva. Il 34-40% dei pazienti trattati ha manifestato un miglioramento clinicamente significativo della visione, definita come aumento di 15 o più lettere a 12 mesi. Nell’occhio, i più comuni effetti indesiderati causati da Ranibizumab, o dalla procedura di iniezione, comprendono: emorragia della congiuntiva e retinica, dolore all’occhio, corpuscoli o macchie nella visione, aumento della pressione intraoculare, cataratta. Gravi eventi avversi correlati alla procedura iniettiva si sono presentati in meno dello 0.1% delle iniezioni intravitreali, tra cui il distacco della retina, cataratta traumatica.

7.5 Anticorpi in fase di sviluppo

DENOSUMAB (già AMG162)- umano

Il Denosumab è un anticorpo monoclonale interamente umano (IgG2), sintetizzato in laboratorio, diretto contro il ligando del recettore attivante il fattore nucleare kappa B, o RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa B ligand), mediatore primario del riassorbimento dell’osso. Il RANKL è una citochina appartenente alla famiglia dei ligandi per TNF, responsabile della riduzione del tessuto osseo mediata dagli osteoclasti, e quindi dell’indebolimento e della fragilità ossee, in numerose condizioni fisiopatologiche, quali osteoporosi, artrite reumatoide, metastasi delle ossa. RANKL, legandosi al suo recettore RANK, espresso su cellule della linea osteoclastica, stimola la differenziazione, l’attivazione e la sopravvivenza degli osteoclasti e ne inibisce l’apoptosi. In condizioni fisiologiche, viene prodotta l’osteoprotegerina (OPG), una citochina appartenente alla

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famiglia dei recettori per il TNF, che agendo come un recettore solubile per il RANKL, ne modula gli effetti. Alterazioni nel rapporto OPG/RANK/RANKL sono critiche nella patogenesi del danno osseo di molte malattie, in quanto l’OPG, legando ad alta affinità il RANKL, ne previene il legame con il suo recettore, localizzato sia sulla superficie degli osteoclasti, che dei loro precursori. Il legame di OPG a RANKL, impedendo la formazione e l’attivazione degli osteoclasti, aiuta a controllare il processo di riassorbimento osseo. Denosumab, mimando l’azione dell’OPG, inibisce specificatamente gli effetti del ligando di RANK, senza interferire con il processo di formazione delle ossa, favorendo, inoltre, l’attivazione dei processi di protezione endogeni. Il blocco risulta in una diminuzione del riassorbimento osseo e in un aumento della densità minerale ossea. Negli studi condotti Denosumab è risultato ben tollerato, senza alcuna differenza significativa, nel verificarsi di effetti avversi, tra anticorpo, alendronato e placebo. Come effetti avversi non comuni, sono stati riportati anticorpi anti-denosumanb; infezioni; neoplasie.

7.6 MNAC13 –umanizzato

MNAC13 è un anticorpo monoclonale umanizzato con azione bloccante il fattore di crescita delle cellule nervose (NGF, nerve growth factor), uno dei mediatori chiave del dolore. Nel trattamento del dolore cronico, sia la proteina NGF che il suo recettore ad alta affinità (TrkA) rappresentano due bersagli terapeutici estremamente importanti, dal momento che il sistema NGF/TrkA, funzionando a monte di diversi meccanismi molecolari coinvolti nel processo infiammatorio, costituisce un vero e proprio sistema di controllo della diffusione dell’infiammazione a livello delle terminazioni nervose. Da un punto di vista funzionale, i neuroni nocicettivi mostrano durante il processo infiammatorio livelli aumentati di NGF; inoltre, la sensitizzazione dei nocicettori periferici è ampiamente dipendente dalla disponibilità di NGF. Il legame specifico dell’anticorpo al recettore TrkA è responsabile dell’azione inibitoria nei confronti del fattore di crescita NGF. MNAC13, sostituendosi alla proteina NGF, ne impedisce il legame con il suo recettore, riducendo la trasmissione e la percezione del dolore. Nella prospettiva di una utilizzazione clinica, la produzione della versione umanizzata dell’anticorpo risulta vantaggiosa, poiché permette di ridurre il rischio di risposte immunitarie avverse da parte del paziente. Tra i potenziali vantaggi della molecola MNAC13 sono da sottolineare l’elevata specificità di azione e il profilo di tollerabilità, traducibili in un’elevata efficacia terapeutica e un eccellente compliance alla terapia da parte del paziente.

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