TESIS DE GRADO Elaborado por: Mirabá Guerrero Mariuxi Morán Castillo Aida

“SILENCIAMIENTO DE POSIBLES GENES ANTIVIRALES EN Litopenaeus vannamei Y SU EFECTO EN LA

SUSCEPTIBILIDAD AL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV)”

TESIS DE GRADO

Elaborado por: Mirabá Guerrero Mariuxi Morán Castillo Aida

ESCUELA SUPERIOR DEL LITORALFACULTAD DE INGENIERÍA MARÍTIMA

Y CIENCIAS DEL MAR

La charla de hoyI. Introducción:

• Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV)• ARN de interferencia (ARNi) • Efectos de inyectar dsRNA en camarón L. vannamei

II. Métodos

III.Resultados:• Bioinformática• Fenotipos encontrados

IV. Conclusiones

• Identificar, de entre 54 genes candidatos, genes potencialmente involucrados en la respuesta antiviral de L. vannamei usando la técnica de silenciamiento genético (RNAi, siglas en inglés) mediante la inyección de ARN bicatenario (dsRNA, siglas en inglés).

• Determinar las posibles proteínas codificadas por cada uno de los genes evaluados mediante análisis bioinformático de la base de datos genéticos (NCBI, National Center for Biotechnology Information).

Objetivos

Introducción La industria camaronera representa una de las actividades

comerciales de mayor importancia para la economía del Ecuador.

El Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) ha causado en el país grandes mortalidades en cultivos de camarón L. vannamei ocasionando pérdidas económicas sustanciales.

Exportaciones Ecuatorianas de Camarón Anual. Fuente: Datos tomados del CNA (Cámara Nacional de Acuicultura).

1994

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

0

20,000,000

40,000,000

60,000,000

80,000,000

100,000,000

120,000,000

140,000,000

Año

White Spot Syndrome

Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV)

Familia, Nimaviridae

Género Whispovirus

ADN circular de doble cadena y envoltura lipídica exterior a la nucleocápside

275 nm de longitud y 85 nm de diámetro

Fuente: Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on the Taxonomy Viruses

Núcleo -capsideVirión

Morfología de WSSV

Aparición de manchas blancas en la cara interna de la cutícula de los crustáceos

Manifestación de signos de estrés Letargia Coloración rojiza Anorexia Natación en superficie Muerte en horas o en unos pocos días

Mortalidades altas en cultivo

Enfermedad es atenuada a temperaturas altas

Transmisión Horizontal

Descripción de la Enfermedad

Tejido sano Tejido infectado (WSSV)

Tejido hematopoyetico teñido conAnticuerpos contra WSSV

Manchas Blancas

Reacción +

anticuerpo

Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV)

ARN mensajero degradado Bloqueo de ciclo

de vida viral

ARN de Interferencia (ARNi) : mecanismo antiviral

en camarón

21 a 23 nucleótidos

Efectos de inyectar dsRNA en camarón L. vannamei

dsRNA

Respuesta inmune innata

dsRNA Homólogo

Silenciamiento (ARNi)

Criterios para la selección de genes candidatos

1. Expresión aumenta en respuesta a una inyección de dsRNA.

2. Expresión aumenta en respuesta a infección con WSSV.

3. Genes importantes para el sistema inmune del camarón

HIPOTESIS: Para genes importantes en la respuesta antiviral de L. vannamei, la inyección de un dsRNA homólogo a los genes candidatos resulta en una respuesta inmune deficiente en comparación con dsRNAs usados como controles en este estudio.

Genes candidatos

54 genes candidato

s

Salina (control)

dsRNA ARNm aislado de branquias 0, 6, 16, 30 h post-inyección

ADNc Fluorescent

e

Microarray

ARNm aislado de branquias 0, 6, 16, 30 h post-inyección

Cuantificación de niveles de expresión,identificación de genes con expresión más abundante en animales inyectados con dsRNA

ADNc Fluorescente

Extracto SPF

(control)

WSSVARNm aislado de hepatopáncreas 48 h post-inyección

ADNc Fluorescent

e

ADNc Fluorescent

e

ARNm aislado de hepatopáncreas 48 h post-inyección

Cuantificación de niveles de expresión, identificación de genes con expresión más abundante en animales infectados con WSSV

Microarray

Síntesis de ARN de doble cadena (dsRNA)

• ADN purificado kit QIAquick (QIAGEN)

• dsRNA sintetizado in vitro con ARN polimerasas T3 y T7

•400 ug dsRNA (260/280=1.9-2.1)

•dsRNA inyectado 4 ug/ind.

Transcripción

ARN polimerasa T7

3’ 5’5’5’ 3’

3’

5’ 3’3’ 5’

3’3’ 5’5’

Transcripción

Hibridación de las dos cadenas

ARN de doble cadena

ARN polimerasa T3

3’3’ 5’5’

ADN

5’

Sistema de Bioensayo: Diseño ExperimentalSistema de desafíos individuales

CONTROL POSITIVO

(WSSV)

CONTROL NEGATIVO

(Sol. Salina)

CONTROL RESP.

ANTIVIRAL (dsRNA-Inespecífico)

CONTROL ESPECÍFI

CO (dsRNA-Sal)

dsRNA-WSSV

Tamaño de la muestra= 40Animales ≈ 1 gr.

CONTROLES TRATAMIENTOS

Estrategia de Análisis: Bioinformático

Busca el contig (porciones de un genoma completo) en L. vannamei.

Busca todos los EST que poseen similitud con el contig.

Ensambla todos los EST encontrados y forma un nuevo contig.

Traduce la secuencia de nucleótidos en aminoácidos en todos los posibles ORF. Valor Expect (<10-6) ; Referencia del ORF correcto.Muestra el dominio funcional para determinar la posible proteína que codifica

DNA protein-translate ExPASy

InterProScan Sequence

Search

Marine Genomics

BIOINFORMÁTICA

Nucleotide Blast (NCBI)

CAP3 Sequence Assembly

Program

Blastx(NCBI)

Protein Blast (Blastp NCBI)

Dominio Funcional

Estrategia de Análisis: Estadístico

Si el valor de p > 0.05

dsRNA especifico-sal vs Neg.

FENOTIPOS DE GENES

Mortalidad de cada tratamiento

Si el valor de p ≤ 0.05ESENCIAL

dsRNA esp-WSSV vs dsRNA inesp-WSSV

I. sucp. +p > 0.05

SIN FENOTIPO Índice de

susceptibilidad

p ≤ 0.05

I. sucp. -

ANTI-VIRAL

PRO-VIRAL

Tabla de Contingencia

ResultadosNº de Acceso del

EST en NCBI Dominio Funcional Fenotipo Observado

CK725277 Ldla, CLECT lectina tipo C

ESENCIAL

CK570744 Granulinas

CK572129 Proteínas de choque térmicoHsp70

CK571978 Chaperonas

CK571718 Vigilin

CK570770 DnaJ o J-DnaJ/Hsp40

CK572639 WD40

CK571807 Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa

CK743206 ATP sintasa subunidad C

CK572496Factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGF; Factor de crecimiento endotelial vascular

VEGF

CK591644 Factor antilipolisacárido

Nº de Acceso del EST en NCBI Dominio Funcional Fenotipo

Observado

CV468236 Sar1 Ras-Like GTPasa

ESENCIAL

MGID514847Histona de unión RBBP4 o subunidad C de complejos

CAF1

CV468041 Factor de iniciación eucariótico

CK571791 Proteínas transportadoras

MGID513560 Proteosoma C-terminal de la subunidad reguladora

CK739385 Helicasa con dominio DEAD

CK572488 ADN helicasa putativa

MGID515874 sin dominio funcional

MGID515663 sin dominio funcional

CK572424 sin dominio funcional




CK571943 Tiolasa

SIN FENOTIPO

CK591675 Dominio de unión al ARN

CK591701 Cofactor tubulina vinculante C

CK571271 Peroxidasa hemo

CK572760 Catepsina D

CV133220 TB2/DP1 Familia HVA22

CK591002 Acetil-CoA-Crotonasa/enoil-coenzima A (CoA)

CK571502 Familia Peptidasa (M20, M25 y M40)

CK592593 Peroxirredoxinas, thiorredoxinas

CK572962 Dominios relacionados con el fibrinógeno

CV468320 Peptidasa C1A

CK572708 ATPasa

CK571517 Cadherinas

CK592250 Ribosomal L7Ae

CV468393 Mesd

Nº de Acceso del EST en NCBI Dominio Funcional Fenotipo

ObservadoCK572677 Dominio SWIB MDM2

SIN FENOTIPO

CK591233 Dominio SWIB MDM3

CK591012 Inositol polifosfato quinasa

CK591345 Dominio catalítico,alfa amilasa, alfa, alfa-phosphotrehalase















CK725515 Peptidasa C1A PRO-VIRAL

57%41%

2%Fenotipos Identificados

Sin Feno-tipoEsencial

Discusión-Conclusiones Uno de los 54 genes estudiados presentó un fenotipo de

potencial interés (posible gen pro-viral).

El 41% de los genes evaluados fueron esenciales para la supervivencia del camarón, aún en ausencia de infección experimental

Encontrar genes antivirales tiene aplicación en la selección de camarones más resistentes a enfermedades.

Identificar genes antivirales tiene relevancia para comprender a nivel molecular los mecanismos antivirales en el camarón.

Discusión-Conclusiones

El silenciamiento con dsRNA (ARNi) representa un método promisorio para la evaluación funcional de genes candidatos.

Recomendaciones En base a los resultados, se recomienda realizar

más bioensayos en busca de genes antivirales en L. vannamei realizando réplicas para cada tratamiento.

Confirmar los fenotipos identificados en este y en futuros trabajos mediante la cuantificación de los niveles de ARN de los genes bloqueados

Realizar análisis a nivel histológico de animales que presentaron alta mortalidad en ausencia de WSSV (fenotipo esencial).

Agradecimientos• FINANCIAMIENTO:

MUSC-USABIOGEMAR-EC

• ESPOL: Ph.D. Javier Robalino (Director de Tesis)

Ph.D. Marcelo MuñozPh.D. Washington Cardenas

• BIOGEMAR:Ing. Walter IntriagoMsc. Ricardo Cedeño

• CENAIM:Lcda. Irma Bentancourt

Ph.D. José Melena

http://www.musc.edu/

Gracias =)

Documents

TESIS DE GRADO Elaborado por: Mirabá Guerrero Mariuxi Morán Castillo Aida