TestdellaframmentazionedelDNAspermatico:metodieinterpretazionedeirisultati

L’integrità del DNA dello spermatozoo è considerata di fondamentale importanza perottenere una normale fertilizzazione, un normale sviluppo embrionale, il successivo impiantodell’embrioneel’ottenimentodigravidanzasianellafecondazionenaturalecheinquellaassistita.IlDNAdellospermatozooèfisiologicamentesoggettoaframmentazionedurantelaspermiogenesiperpermettere lariorganizzazionedellacromatina.Questitaglisonopoiriparatiperoperadelletopoisomerasi. Tuttavia, se questo processo di riparazione non funziona e se intervengono altrimeccanismi (difettidella condensazionecromatinica,processiapoptoticie stressossidativo) cheinduconorotturenonfisiologichenelDNA,nell’eiaculatosarannopresentispermatozoiconDNAframmentato.Taleanomaliagenomicasiosservainpercentualielevateneipazientisub-einfertili,nei fumatori, negli uomini di età avanzata, nei soggetti esposti a sostanze tossiche o a terapiegonadotossiche.

Numerosistudihannodimostratochelapercentualedispermatozoiframmentatipresentiinuneiaculato correla con iparametri seminali convenzionali, anche se taleassociazionenonècosìstretta,indicandocheildannoalDNAspermaticopotrebbepredire,inmodoindipendente,ilpotenziale fecondantedellospermatozoo.Tuttavia,almomento, l’accuratezza, la sensibilitàe laspecificità diagnostica dei test utilizzati per la valutazione dell’assetto del DNA spermatico, neldiscriminare tra soggetti fertili e infertili, non sono completamente validate e rimane ancoraincertalalorocapacitàdiprediregliesitidelletecnichedifecondazioneassistita.Visonoprincipalmentequattrometodiutilizzatiper ladeterminazionedellaframmentazionedelDNAspermatico:Cometassay(singlecellgelelectrophoresis),TUNEL(terminaldeoxyuridinenickendlabelingassay),SCSA(SpermChromatinStructureAssay)eSCD(SpermChromatinDispersionassay)(veditabella).1. Comet assay: prevede l’inclusione degli spermatozoi in un gel di agarosio su vetrino e lamigrazioneperelettroforesidelsingolospermatozoolisatoincondizionineutralioalcaline;ilDNAèvisualizzatograzieall’impiegodiuncolorantespecificoelecelluledanneggiateappaionocomeunacometa,conunatestafluorescenteeunacodalacuilunghezzaefluorescenzaèproporzionalealnumeroditaglialDNA.E’unmetodorapidoesensibilechepermettelavalutazionedeldannoalDNAancheincampioniconunnumerolimitatodispermatozoierivelaitaglisiaasingolasiaadoppiaelica.E’statapropostaunaversionemodificatadellaCOMET,pretrattandoglispermatozoiconl’enzimaformamidopirimidinaDNAglicosilasi, checonverte l’8-idrossi-deossiguanosina in tagli alDNA. LaframmentazionedelDNArisultanteèdatadallasommadeitaglialDNAelapresenzadi8-idrossi-deossiguanosina, unmarker del danno al DNA da stress ossidativo. Utilizzando tale metodo, ilpotere predittivo della Comet, in termini di esiti di fecondazione assistita, è aumentato sia perFIVETsiaICSI.2.TUNEL:quantificaillivellodinucleotidifluorescentiincorporatialleestremità3’liberedelDNAderivate da rotture a singola o doppia elica in una reazione catalizzata dall’enzimadeossinucleotidil transferasi terminale stampo-indipendente. Si può rivelare sia attraversomicroscopiaafluorescenzasiacitometriaaflusso.Perquestametodologiasonostatiriportatidiversivaloridicut-offperlostatodifertilitàmaschile.Alcuni studi hanno cercato dimigliorare la sensibilità e la specificità di questo test apportandodellemodifiche,ovvero:analizzandoirisultaticonuncitometroaflussoinvececheinmicroscopiaa fluorescenza, decompattando ilDNA conditiotreitolo (che facilita l’accessibilità ai nuclei dellospermatozoodapartedell’enzima),eliminandotuttigli interferentipresentinelsemenell’analisicitofluorimetrica o aggiungendo un colorante nucleare per discriminare tra popolazioni dispermatozoichemostranodifferentigradididannoalDNA.

Altro vantaggiopotrebbeessere rappresentatodall’utilizzodella tecnica TUNEL accoppiata auncolorante vitale, che permetterebbe la rivelazione della frammentazione del DNA solo nellafrazione di spermatozoi vivi, che teoricamente dovrebbe avere un impattomaggiore sugli esitiriproduttivi,migliorandoquindiilpoterepredittivodellatecnica.3.SCSA: i taglialDNAspermaticosonodeterminati inmodo indirettovalutando lasuscettibilitàdellacromatinaalladenaturazionedelDNA.Determinal’estensionedeldannomisurandoloshiftmetacromaticodallafluorescenzaverde(tagliadoppiofilamento)allafluorescenzarossa(tagliasingolo filamento) in seguito a denaturazione acida e colorazione con arancio di acridina. Ilrapporto tra queste due emissioni determina l’indice di frammentazione del DNA (DFI:fluorescenza rossa/(fluorescenza rossa+fluorescenza verde)). SCSA è l’unica metodicastandardizzataecon laqualesonostatideterminatideivaloridicut-offperdistingueresoggettifertili e infertili. Un DFI < 30% identifica una popolazione di spermatozoi con buona integritàcromatinica e un potenziale stato di fertilità, mentre un DFI ≥ 30% indica una popolazione dispermatozoiconanomaliedellastrutturacromatinica.4. SCD: determina la capacità della cromatina spermatica di formare aloni di dispersione inseguito a decondensazione cromatinica, permettendo di differenziare gli spermatozoi non-frammentati(conalone)daquelliframmentati(senzaalone)inmodoindiretto.Iltestèeffettuatomedianteunkitcommerciale(Halosperm)erivelatomediantemicroscopioincampochiaro.

Unostudio recentehacomparato lediverse tecnichesullastessapopolazionedi soggettifertilieinfertilicalcolandolerispettivecurveROC:laCometalcalinasièrivelataquellaconl’AUC(areaunderthecurve)piùaltaeconvalorimaggioridisensibilitàespecificitàseguitadaTUNEL,SCD,SCSAeCometneutrale.

Numerosi studi hanno valutato la relazione tra danni al DNA (valutato con le variemetodiche sopradescritte) ed esiti riproduttivi sia nelle gravidanze naturali che in quelle dafecondazione assistita. I risultati dimostrano che il danno al DNA è associato a un tasso digravidanzapiùbassonellafecondazionenaturale, intrauterinaeFIVETe,che,soggetticonbassaframmentazionedelDNAhannounpiùaltoindicedibimbinatirispettoaquelliconelevatilivelli,inseguitoaFIVET.Èmenochiaral’associazionetradannoalDNAedesitiriproduttiviinseguitoadICSI,ancheseinunameta-analisirecentementepubblicatasidimostraunimpattonegativodellaframmentazione del DNA anche con l’impiego di questa tecnica. Le recenti meta-analisi hannomostratoanchecheletecnicheutilizzatehannounimpattodiverso:dairisultatisembrainfatticheSCSAeSCDsianometodipocopredittividegliesitidellafecondazioneassistita,mentreilTUNELela Comet sembranopresentareunamaggior capacità predittiva.Al contrario, nel concepimentonaturaleenelleinseminazioniintrauterinel’SCSArisultaessereunbuonpredittoredigravidanza.Dasottolinearechequestidatiprovengonodareviewemeta-analisi,chedaunlato,analizzandonumerosi studi, aumentano la dimensione del campione e la potenza statistica, dall’altro,risentonodell’eterogeneitàdeidati,inquanto,includonostudicheutilizzanometodologiediverse,popolazionidifferentievaloridisogliadiversi.

L’impiego, quindi, di test per la valutazione della frammentazione del DNA come markerdiagnosticopermegliogestireilmaschioinfertilerimanecontroversoe,aoggi,unconsensononèstatoraggiunto.Lemotivazionidiquestomancatoaccordosononumerose:

- ledifferentimetodichemisuranoaspettidiversideldannoalDNA(mentreCometeTUNELrivelanoitagli“reali”alDNA,SCSAeSCDmisuranol’integritàcromatinicaelasuscettibilitàdelDNAalladenaturazione),portandoquindiarisultatiincongruentienoncomparabili;

- nonesisteunconsensosuqualesiailmetodo“goldstandard”;- mancanzadistandardizzazionedellemetodiche(eccettoperSCSA)cherende difficile il

paragonetralaboratori;

- ampi range di valori di soglia ottenuti, anche per lo stesso test (dovuto alla mancatastandardizzazionedellametodica);

- bassaspecificitàeriproducibilitàdellediversemetodiche;- gli studi spesso non riportano i dati corretti per i fattori confondenti (ad es. il fattore

femminilepuòavereunruolomodulatore);- questimetodi spessonondifferenziano il dannoalDNApatologico (ovvero clinicamente

significativo)daquellofisiologico(ovveroclinicamentenon-significativo).Perché un test possa essere introdotto nella diagnostica dell’infertilità maschile dovrebbe

essere in grado di discriminare tra soggetto fertile ed infertile e riuscire a predire l’esitoriproduttivo. Inoltre, dovrebbero raggiungere buoni livelli di sensibilità, specificità, ripetibilità,predittività e robustezza statistica. Al momento, l’impiego dei test per la valutazione dellaframmentazione del DNA nella pratica clinica presenta delle limitazioni, per cui non è possibilegiungere a conclusioni chiare riguardo all’utilità di questi metodi finché non saranno effettuatistudi randomizzati, bendisegnati, conunapotenzaadeguata, che comparino soggettimaschidicoppieinfertiliconsoggettidiprovatafertilitàedescludanocasidiinfertilitàfemminile.Talistudidovranno anche tener presente che il danno più rilevante è quello che impatta sugli esitiriproduttivi e quindi focalizzarsi sulla relazione tra i test utilizzati e l’esito riproduttivo preso inconsiderazione.Una volta che questo tipo di studi sarà stato eseguito, potranno essere definitiprotocolli standardizzati che saranno poi verificati da opportuni controlli di qualità e chepermetterannodiraggiungereunabuonariproducibilitàsiaintra-cheinter-laboratori.Infinesarà importantedefinire lecategoriedisoggetti incuiuneventualetestper larivelazionedeldannoalDNApotrebbeessereutilee fornire informazionicliniche (ades. coppieconabortiricorrentio fallimentidi ciclidi fecondazioneassistita, soggetti chepresentanoetàavanzatadelmaschio,esposizioneasostanzetossicheoterapie,obesità,fumo,segnidiinfezioni/infiammazionideltrattogenitale,lesionidelmidollospinale,varicocele).Tabella.PrincipalimetodiperlavalutazionedellaframmentazionedelDNAneglispermatozoi.ModificatadaAgarwaletal.TAU2016.

Lettureconsigliate:

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Autore:SaraMarchiani(Firenze)CommissioneLineeGuidaSIAMS : ElisaGiannetta (Roma) , Sandro LaVignera (Catania),SaraMarchiani(Firenze),PierFrancescoPalego(Padova).