Thi Nghiem VSV Hoc Dai Cuong-chinh Sua

5/14/2018 Thi Nghiem VSV Hoc Dai Cuong-chinh Sua - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/thi-nghiem-vsv-hoc-dai-cuong-chinh-sua 1/47

1 Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT

Thí nghiệm Vi sinh vật học đại cương – Trường ĐHBK HN

Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁPGIEO CẤY VI SINH VẬT

A. Môi trường dinh dưỡng

I. Khái niệm chung

1. Mục đích, ý nghĩa:

- Môi trường dinh dưỡ ng có ý ngh ĩa đối vớ i sự bảo tồn và phát triển nòi giống của vi sinhvật. Môi trường dinh dưỡng đượ c sử dụng trong khâu phân lập, nhân giống, giữ giống và nghiên

cứu các hoạt động sinh hóa của vi sinh vật.

2. Yêu cầu đối với môi trường dinh dưỡng:

- Môi trường dinh dưỡ ng là một hỗn hợ p thức ăn cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật.Trong thành phần của môi trường dinh dưỡ ng cần phải có các nguyên tố tạo chất sống (Cacbon,Hydro, Oxi, Nitơ), các nguyên tố đa lượ ng (Phốt pho, Lưu Huỳnh, Kali, Canxi, Magie, Sắt,..),một vài nguyên tố vi lượng (Mangan, Đồng, Natri, Clo, Kẽm, Bor, Molipden,..). Những nguyêntố trên cần thiết phải ở dạng những hợ p chất dễ hấp thu đối vớ i vi sinh vật. Cacbon đượ c các visinh vật dị dưỡ ng hấp thu dễ hơn cả ở dạng glucoza. Ngoài glucoza, vi sinh vật dị dưỡ ng còn hấp

thu đường, rượ u, axit hữu cơ và các hợ p chất khác. Nguồn Nitơ có thể là các chất đạm, pepton,axit amin, muối amon, nitrat. Các nguyên tố còn lại dướ i dạng muối. Môi trường dinh dưỡ ng còncần phải có đủ các chất kích thích sinh trưởng như biotin, vitamin, đặc biệt là các axit aminkhông thay thế.

- Môi trườ ng dinh dưỡ ng cần phải cân đối về thành phần (đẳng trương về nồng độ các chấthòa tan) và có độ ẩm, độ nhớ t, pH, áp suất thẩm thấu tối ưu.

- Môi trường dinh dưỡ ng cần phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng.

3. Cách gọi tên

Môi trường dinh dưỡng thường đượ c gọi tên theo tên tác giả - ngườ i phát hiện ra nó. Thí dụ: Môitrường Sapek, Saburo,... Song đúng hơn là gọi tên theo nguồn thức ăn N và C. Thí dụ môi trườ ngthạch thịt – pepton, môi trườ ng Xenlluloza

II. Phân loại môi trường

1. Phân loại môi trườ ng theo thành phần: Căn cứ vào thành phần môi trường, ngườ ita chia chúng thành các loại sau

Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)

http://www.novapdf.com/








a. Môi trườ ng tự nhiên đượ c chế tạo từ các sản phẩm có nguồn gốc động, thực vật như

thịt, trứng, sữa, nướ c chiết nấm men, nướ c quả, mạch nha,... Thành phần hóa học của những môitrườ ng này phức tạp và không được xác định cụ thể. Nó phụ thuộc vào thành phần nguyên liệuvà các điều kiện tiến hành chế tạo môi trường. Ngườ i ta sử dụng chúng để nuôi cấy vi sinh vật,tích lũy sinh khối, giữ các giống thuần sạch, các mục đích dự đoán, chúng không lợ i cho việcnghiên cứu sinh lý hoặc các quá trình trao đổi chất.

b. Môi trườ ng tố ng hợ p đượ c chế tạo từ các hợ p chất hóa học hữu cơ và vô cơ vớ i nồngđộ định trướ c một cách chính xác. Tùy theo bộ các cấu tử, môi trườ ng tông hợ p có thể phức tạp(môi trườ ng nuôi cấy vi khuẩn lactic) hay tương đối đơn giản (môi trườ ng cho các vi khuẩn tự dưỡng). Ngườ i ta dùng chủng để nghiên cứu sự trao đổi chất, quy luật phát triển hay sinh tổng

hợ p một chất nào đó (VD: axit amin). Trong thực hành thườ ng sử dụng môi trườ ng tổng hợ pSapek để nuôi cấy nấm mốc.

c. Môi trườ ng bán tổ ng hợ p là môi trườ ng chung giữa hai loại trên

2. Phân loại theo mục đích sử dụng

a. Môi trườ ng phổ d ụ ng (môi trường cơ sở hay môi trườ ng chuẩn) là những môi trườ ngthích hợp để nuôi cấy nhiều loại vi sinh vật (VD: môi trườ ng thịt pepton, môi trường nướ c mạchnha,...)

b. Môi trườ ng riêng biệt hay môi trườ ng chọ n l ọ c: đảm bảo sự phát triển ưu thế củamột loài hay một nhóm vi sinh vật nào đó, ít thuận lợ i hoặc hoàn toàn bất lợi đối vớ i sự phát triểncủa các vi sinh vật khác. Các môi trườ ng chọn lọc chủ yếu được dùng để phân lập vi sinh vật từ các môi trườ ng sinh sống tự nhiên của chúng hoặc được dùng để nuôi cấy tích lũy. VD: môitrườ ng tinh bột – ammoniac dùng để nuôi cấy xạ khuẩn.

c. Môi trườ ng chuẩn đo án phân biệ t (môi trườ ng chỉ thị) cho phép phân biệt khá nhanhchóng một loài vi sinh vật này với loài khác và xác định những giống thuần khiết trên cơ sở nghiên cứu những tính chất sinh hóa của chúng. Các môi trườ ng chỉ thị đượ c ứng dụng trong vikhuẩn học lâm sàng, trong nghiên cứu di truyền học và trong việc định tên vi sinh vật. Thông

thường trong các môi trường này ngườ i ta cho vào một số thành phần chỉ thị màu và nhờ sự thayđổi của chất đó mà ngườ i ta có thể xác định đượ c từng loài vi sinh vật.

VD: Trong quá trình sống, vi sinh vật thườ ng tiết ra một loại enzyme nhất định. Dướ i tác dụngcủa các enzyme này các hợ p chất hữu cơ phức tạp có trong môi trườ ng bị phân hủy thành cácdạng đơn giản hơn như axit và muối của chúng. Các chất này làm thay đổi độ pH của môitrường, do đó dẫn đến sự thay đổi màu của chất chỉ thị màu.










3. Phân loại theo tính chất lý học

Tùy theo độ chắc cứng của môi trường ngườ i ta phân biệt môi trườ ng lỏng, đặc, xốp

a. Môi trườ ng l ỏ ng là môi trườ ng thức ăn dướ i dạng dung dịch. Nó đượ c ứng dụng để phát hiện các đặc điểm sinh lý – sinh hóa của vi sinh vật, để tích lũy sinh khối hoặc các sản phẩmtrao đổi chất, để giữ và bảo quản nhiều loại vi sinh vật không phát triển trên các môi trường đặc.

b. Môi trường đặ c là môi trườ ng lỏng có thêm các chất đông dính, đượ c ứng dụng để táchcác giống thuần khiết (nhận từng khuẩn lạc riêng biệt, nghiên cứu định tên, xác định hình tháikhuẩn lạc, đặc điểm sinh trưởng), để giữ giống.

Để làm đông môi trường ngườ i ta dụng thạch, gelatine và silica-gel. Các chất này không làm

thay đổi thành phần môi trường, đồng thời đảm bảo độ trong suet của môi trườ ng.

- Thạch là một loại polysaccarit phức tạp có độ bền vững cao, nhận từ một số loại tảo biểnhộ Floridae. Hầu hết vi sinh vật không sử dụng nó làm cơ chất dinh dưỡng. Trong nướ c, thạchtạo thành dạng gel, chảy ở 100OC và đông ở gần 40OC. Thạch có tính trung tính, không làmthay đổi pH của môi trườ ng song nó bị ảnh hưởng pH môi trườ ng. ở những môi trường có độ axitpH thấp thạch khó đông đặc hơn hơn bở i nó bị thủy phân từng phần. Thạch thường đượ c bổ sungvào môi trườ ng vớ i số lượ ng 1,5 – 2%. Trong trườ ng hợ p cần thiết có thể nâng nồng độ thạch lên3%.

- Gelatin là loại protein nhận được khi ninh xương và sụn của động vật dễ bị vi sinh vật sử dụng nên dễ vữa hơn so vớ i thạch. Mặt khác gelatine dễ làm ảnh hưở ng tới pH môi trườ ng nên ítđượ c sử dụng hơn thạch, Nhiệt độ nóng chảy của gelatine 25-27OC và đông đặc ở 18-20OC.Thường để thu nhận những khuẩn lạc lớ n trong phân loại nấm men.

- Bản silica-gel đượ c dùng làm chất nền đặc cho các môi trườ ng tổng hợ p có thành phầnxác định chặt chẽ bở i vì nó có bản chất vô cơ.

- Môi trườ ng xốp đượ c ứng dụng trong vi sinh vật học công nghiệp. Thuộc loại này có kênấu nhừ, cám, cát thạch anh thấm dung dịch dinh dưỡ ng.

III. Cách làm môi trường

Quá trình tiến hành gồm các bướ c sau:

1. Pha chế

Cân đong chính xác theo đơn.

Cho vào bình sạch đã sấy khô 1/3 lượng nướ c cần thiết, hòa tan trướ c các chất có khối lượ ng nhỏ hơn các chất có khối lượ ng lớn hơn rồi sau cùng là các chất đông dính. Thử pH môi trườ ng.










Dùng lượng nướ c còn lại tráng rửa cổ bình, phễu,... Thể tích môi trườ ng phải nhỏ hơn 1/2 thể tích bình.

Đóng miệng bình bằng nút bông rồi bọc giấy để tránh bị ướ t lúc thanh trùng.

Dán nhãn, ghi tên lên môi trường, pH, ngày và ngườ i chuẩn bị.

Thanh trùng xong kiểm tra pH và chỉnh lại nếu cân bằng NaOH 20% hoặc HCL 20%. Dùngnướ c máy, ấm.

2. Lọc

Môi trườ ng cần trong suốt nên sau khi pha chế phải tách cặn bã, bụi bẩn bằng một trong những

phương pháp sau:

- Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc

- Lọc bằng lòng trắng trứng

- Dùng phễu lọc nóng

3. Phân phối môi trường

Môi trường đượ c phân phối vào bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm,.. sau thanh trùng vào ốngnghiệm hoặc hộp petri.

Thạch nghiêng khoảng 5ml

Thạch đứng 1/2 thể tích ống nghiệm

Hộp petri tráng đều dầy 3mm.

4. Khử trùng môi trường

Tất cả môi trường đều phải vô trùng, tùy loại môi trườ ng, tùy yêu cầu thí nghiệm mà chọn chế độ thanh trùng.

a. Phương pháp Pasteur: chủ yếu dùng để diệt những vi sinh vật không sinh bào tử bằngcách đun nóng phân đoạn ở nhiệt độ 60-75OC trong 15 đến 30 phút hay ở 80OC trong thờ i gian10-15 phút. Phương pháp Pasteur ứng dụng cho những sản phẩm hay môi trường dưới tác độngcủa nhiệt độ cao bị ảnh hưở ng sâu sắc, mất đi những phẩm chất và giá trị dinh dưỡng. Nó đượ cdùng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm

b. Phương pháp Tinđan










Tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ cao liên tục trong 3-4 ngày liền, mỗi ngày một lần, mỗi lầncách nhau 24 giờ . Trong thờ i gian giữa hai lần hấp cần để môi trườ ng ở nhiệt độ thích hợ p chocác bào tử còn sống sót có thể phát triển thành dàng tế bào dinh dưỡ ng. Trong lần thanh trùngtiếp theo các tế bào dinh dưỡ ng này sẽ bị tiêu diệt. Phương pháp này cho hiệu suất vô trùng caohơn phương pháp Pasteur.

c. Phương pháp thanh trùng bằng hơi nước b ão hòa áp suất.

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm gia nhiệt các vật bằng hơi nướ c bão hòa dướ i một ápsuất lớn hơn áp suất của khí quyển. Khi áp suất hơi nước tăng lên th ì nhiệt độ cũng tăng theo.

- Giớ i thiệu cách vận hành nồi hấp áp lực.

5. Bảo quản và kiểm tra môi trường

Giữ môi trườ ng ở nhiệt độ thấp 0-5OC tránh quá khô, nóng, nhiều ánh sáng. Kiểm tra bằng cáchđể môi trườ ng vào tủ ấm có nhiệt độ 30-32OC trong vài ngày. Nếu thấy môi trườ ng bị vẩn đụchoặc có khuẩn lạc phát triển thì loại bỏ.

B. Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật

1. Định ngh ĩa: Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu nghiên cứu vào môi trườ ng thức ănvớ i mục đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt trong đó và thu nhận các canh trườ ng cần thiếtcho nghiên cứu. Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh trườ ng vi sinh vật từ môi trườ ng này

sang môi trườ ng khác vớ i mục đích nhận giống và giữ giống.

Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối

Dụng cụ: Que cấy nhọn hoặc vòng, pipet, que trang,..

2. Một số phương pháp gieo cấy

a. C ấy chu yền từ ống nghiệm n ày sang ống nghiệm khác

Tiến hành từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng).

b. Gieo cấy tr ên mặt thạch nghi êng

- Theo hình chữ chi

- Theo hình vòng xoắn

- Theo những đườ ng song song

- Theo một đườ ng thẳng










- Theo từng chem.

c. Dùng que cấy đâm sâu tr ên thạch đứng

d. C ấy tr ên thạch hộp

Hình chữ chi trên toàn mặt thạch

Theo bốn đườ ng zich-zac ở bốn góc hộp

Theo các đườ ng song song

Chấm điểm

e. Dùng pipet Pasteur hay pipet chia độ

- Dung pipet lấy một lượng canh trườ ng thả trên mặt thạch rồi dung que trang dàn đều giọtcanh trườ ng trên mặt thạch

- Cấy bề sau

Giống – ống nghiệm – hộp thạch

Giống – hộp thạch – ống nghiệm môi trườ ng.








7 Bài 2 : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT


Bài 2 : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

A. PHÂN LẬP VI SINH VẬT Vi sinh vật thườ ng tồn tại trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu dướ i dạng mộthỗn hợ p gồm nhiều loại khác nhau. Muốn nghiên cứu hoặc sử dụng vào thực tế bất kỳ loài nào taphải phân lập để thu được canh trườ ng chỉ chứa loài đó. Quá tr ình tách một vi sinh vật ra khỏihỗn hợ p gọi là phân lập. Tùy mức độ thuần khiết mà ngườ i ta phân biệt canh trườ ng tập trunghay canh trườ ng thuần khiết.

I. Canh trường tập trung

1. Định nghĩa Canh trườ ng tập trung là canh trường trong đó mộ t loài (có khi vài loài) vi sinh vật xác địnhchiếm tỷ lệ cao hơn hẳn về số lượ ng.

Từ canh trườ ng tập trung ta có thể phân lập canh trườ ng thuần khiết hoặc có thể sử dụng nó trongsản xuất hoặc thí nghiệm.

2. Phương pháp phân lập canh trường tập trung

Sử dụng môi trườ ng chọn lọc hoặc là điều kiện chọn lọc, tức môi trườ ng hoặc điều kiện chỉ thíchhợ p cho một loài vi sinh vật nhất định, còn các loài khác thì không thể hoặc khó phát triển.

Để có môi trườ ng chọn lọc, ta có thể thay đổi thành phần, nguồn các bon, nitơ, độ pH ... Ví dụ,để tách nấm men, ta dùng môi trườ ng chứa nhiều đườ ng và pH thấp.

Về các điều kiện chọn lọc, ta thay đổi nhiệt độ môi trường, lưu lượng khí đượ c cấp và các điềukiện khác. Ví dụ: tách vi sinh vật ưa nóng hoặc lạnh bằng cách nuôi ở nhiệt độ 50-600C hoặc 10-150C, để tách các vi sinh vật yếm khí khỏi các vi sinh vật hiếu khí, ta nuôi trong điều kiện yếmkhí.

Nói chung, tuỳ đặc tính sinh lý của từng loài mà ta có những môi trường và điều kiện chọn lọc

khác nhau.II. Canh trường thuần khiết

1. Định nghĩa

Canh trườ ng thuần khiết là canh trườ ng mà tất cả các vi sinh vật trong đó đều sinh ra từ một tế bào ban đầu. Việc phân lập canh trườ ng thuần khiết thườ ng thực hiện từ canh trườ ng tập trung.










2. Các phương pháp phân lập canh trường thuần khiết.

a. Phương pháp pha lo ãng môi trường lỏng

Phương pháp này do Pasteur đưa ra đầu tiên, tiến hành như sau:

- Lấy một số ống nghiệm chứa môi trườ ng lỏng đã vô khuẩn

- Dùng que cấy hoặc pipette cấy vật phẩm nghiên cứu vào ống nghiệm thứ nhất

- Đánh tan và lắc đều rồi cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm thứ hai

- Lặp lại như vậy vớ i ống nghiệm thứ hai, ba, bốn...

Cuối cùng ta có thể thu đượ c ống nghiệm chỉ chứa 1 tế bào duy nhất. Tế bào này sẽ là tổ tiên chocanh trườ ng thuần khiết.

Phương pháp này đơn giản dễ làm nhưng không phải bao giờ cũng bảo đảm, vì vậy nó thườ ngđược dùng như giai đoạn đầu của các phương pháp phân lập khác.

b. Phương pháp gieo cấy trên môi trường đặc

Nguyên tắc của phương pháp này là tách từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ trên môi trường đặc. Cáchtiến hành như sau:

- Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hoà tan và pha loãng dần đến mức độ nhất định trongcác ống nghiệm chứa nướ c cất hoặc nướ c muối sinh lý (0.85%) đã vô trùng. Tuỳ trườ ng hợ p màpha loãng nhiều hay ít hoặc không pha loãng. Nói chung nên pha loãng để các tế bào tách rờ inhau và khi gieo cấy các khuẩn lạc mọc tách biệt.










Hình 1: Sơ đồ quy trình pha loãng Pasteur

Sơ đồ phân lập trên môi trường đặc (có pha loãng trướ c)

Đem vật phẩm đã pha loãng cấy trên môi trườ ng thạch hộp đã vô khuẩn theo một trong các cách

sau:

- Dùng que cấy vòng cấy theo vết cạn dần - cấy thưa và đưa nhanh










Hình 2: Các phương pháp cấy theo vết cấy cạn dần

- Dùng pipet đưa một lượng canh trườ ng nhất định vào hộp petri, sau đó dùng que trang dàn đềuvật gieo cấy trên mặt thạch hộp

- Trộn vật gieo cấy vào ống thạch đã vô trùng và làm nguội đến 450C, sau đó đổ vào hộp petri.

Trong ba cách trên thì hai cách sau hay dùng vì nó thườ ng cho các khuẩn lạc riêng biệt.

Gieo cấy xong, nuôi ở điều kiện thích hợ p nhất cho loài vi sinh vật định phân lập. Sau 1 - 2 ngày,đem quan sát và chọn những khuẩn lạc đứng riêng biệt, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vậty ở khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền lên ống thạch. Mỗi khuẩn lạc cấy lên một ống. Sau đó nuôi ở nhiệt độ thích hợ p ta sẽ được canh trườ ng thuần khiết.

Chú ý nếu sau hai ngày, vi sinh vật chưa phát triển thì có thể để lâu hơn. Phải chọn các khuẩn lạc

riêng biệt

- Ưu điểm: Phổ biến, dễ làm, kết quả tương đối đảm bảo.

- Nhược điểm và cách khắc phục: Khuẩn lạc có thể không phải phát sinh từ một tế bào ban đầumà nhiều tế bào đã dính vớ i nhau từ lúc đầu. Các khuẩn lạc lúc mớ i mọc thì riêng lẻ nhưng để để quá thờ i gian chúng lại dính liền nhau. có thể khắc phục bằng cách phân lập như trên vài lần,đồng thờ i làm tiêu bản để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc đã tách.










c. Phương pháp tách từng tế b ào

Thường dùng để tách các vi sinh vật mà tế bào có kích thước tương đối lớn như nấm men, bào tử nấm mốc. Có thể thực hiện theo hai cách sau:

+ Tách từng giọt chỉ chứa một tế bào có kiểm tra bằng kính hiển vi:

- Pha loãng canh trườ ng vi sinh vật bằng các ống nghiệm chứa môi trườ ng lỏng vô khuẩn. Phaloãng đến mức là trong mỗi giọt nhỏ chỉ có một hoặc hai tế bào vi sinh vật.

- Dùng que cấy nhọn hoặc ngòi bút nhỏ (đã vô khuẩn) chấm từng giọt nhỏ canh trường đã phaloãng lên lá kính vô khuẩn. Chấm thành ba bốn hàng và các giọt cách xa nhau vừa phải để dễ quan sát.

- Nhanh chóng xoay lá kính cho các giọt xuống dướ i rồi đặt lên phiến kính lõm, bôi vazơlinquanh mép lá kính, giữ không cho các giọt bị khô.

- Quan sát dướ i kính hiển vi và đánh dấu những giọt chỉ có một tế bào

- Quan sát xong, đặt các phiến kính vào hộp petri có lót bông hoặc giấy lọc tẩm nướ c (tránh chocác giọt không bị khô đi) rồi đem nuôi ở nhiệt độ thích hợ p.

- Sau 1 - 2 ngày, các tế bào trong giọt sẽ hình thành khuẩn lạc, ta lấy ra và quan sát những giọt đãđánh dấu xem tế bào co sinh sản, phát triển không. Nếu có ta cấy chuyền các khuẩn lạc lên môi

trườ ng thích hợ p. Cách cấy truyền như sau: Dùng kẹp cặp một mảnh giấy lọc hình tam giác (tấtcả đã đượ c vô trùng) thấm giọt có khuẩn lạc định tách rồi nhanh chóng đặt vào ống nghiệm chứamôi trườ ng thích hợp; để ống nghiệm vào tủ ấm, sau 1 - 2 ngày người ta được canh trườ ng thuầnkhiết.

Ưu điểm: Phương pháp này cho kết quả bảo đảm vì có kiểm tra bằng kính hiển vi.

+ Tách từng tế bào nhờ dụng cụ vi thao tác (micromanipulateur)

Micromanipulateur là một dụng cụ tương đối phức tạp, làm việc dướ i sự kiểm tra trực tiếp quakính hiển vi. Nó bao gồm các kim nhỏ, micropipet, giá đỡ và các bộ phận cơ học tinh vi có thể dichuyển các kim và pipet để lấy riêng ra từng tế bào vi sinh vật trong giọt canh trườ ng rồi đemnuôi cấy riêng biệt ta sẽ được canh trườ ng thuần khiết.

Ưu điểm: Phương pháp này tương đối nhanh chóng, chính xác nhưng đòi hỏi cẩn thận, khéo léo.

III. Phân lập vi sinh vật yếm khí

Nói chung có thể phân lập theo các phương pháp trên rồ i nuôi ở điều kiện yếm khí. Nếu khó tạođiều kiện yếm khí thì phân lập như sau:










1. Dùng pipet Pasteur

- Pha loãng vật phẩm nghiên cứu đến mức độ nhất định- Lấy một giọt của canh trườ ng pha loãng cuối cùng cho vào ống thạch (đã đun chảy trướ c vàlàm nguội đến 45 - 50OC) lắc đều.

- Hút một ít môi trường đã trộn vi sinh vật nói trên vào pipet Pasteur rồi dùng đèn cồn hàn kínđầu nhỏ của pipet, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợ p

- Sau 1 - 2 ngày các khuẩn lạc của vi sinh vật sẽ mọc trong ống thạch

- Lấy pipet ra, đánh vỡ và lấy các cục thạch có khuẩn lạc riêng biệt cho vào môi trườ ng nuôi cấy

thích hợ p.Động tác này phải tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng, ngoài ra, để nhận biết vùng có visinh vật yếm khí phát triển ngườ i ta thêm vào ống thạch 0,2% indigocacmin. Những vùng có visinh vật phát triển indigocacmin bị khử và chuyển thành màu vàng.

2. Dùng hộp petri lộn ngược

- Pha loãng rồi cho vào ống thạch như trên

- Lắc đều rồi đổ ra hộp petri và đậy ngược đáy nhỏ của hộp lên lớ p thạch, sau đó dùng paraphinbôi xung quanh mép hộp. (Hộp petri đã vô trùng và đặt lộn ngược trướ c).

- Đặt vào tủ ấm, sau 1 - 2 ngày lấy ra và tách thạch có khuẩn lạc đem cấy vào môi trườ ng thíchhợ p

B. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT Định ngh ĩa: Định lượ ng vi sinh vật là xác định số tế bào vi sinh vật có trong vật phẩm nghiêncứu.

Có hai nhóm phương pháp dùng để định lượ ng vi sinh vật

I. Định lượng trực tiếp

Định ngh ĩa: Định lượ ng trực tiếp là những phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật cótrên tiêu bản làm từ vật phẩm nghiên cứu

Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng










Nhược điểm: Kém chính xác vì khi đếm nhữ vậy ta đếm cả những tế bào đã chết trướ c lúc làmtiêu bản.

Các phương pháp định lượ ng trực tiếp

1. Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu

+ Phạm vi sử dụng: thường dùng để đếm vi sinh vật mà tế bào có kích thướ c lớn như nấm men,bào tử nấm mốc.

+ Mô tả buồng đếm hồng cầu: Đó là một phiến kính dày có đục bốn rãnh chia thành ba khoangngang, khoang giữa thấp hơn hai khoang bên 0,1 mm và đượ c chia thành hai khoang nhỏ nhờ một rãnh dọc; trên mỗi khoang nhỏ này có kẻ một lưới đếm gồm nhiều ô vuông lớ n, một số ô

vuông lớ n lại đượ c chia thành các ô vuông nhỏ (thườ ng là 16) có cạnh dài 1/20 mm. diện tích1/400 mm2; nếu chiều cao 0,1 mm thì thể tích là 1/4000 mm3. Mỗi buồng đếm có kèm theo mộtlá kính.

Hình 3: Cấu tạo buồng đếm hồng cầu + Cách tiến hành:

- Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trườ ng, tùy canh trườ ng mà mức độ pha loãng nhiều hay ít (10, 100...lần)










- dùng bông thấm nướ c, tẩm nướ c cất và phết nhẹ lên hai khoang bên của buồng đếm, đặt lá kínhlên rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt vào phiến kính.

- Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho canh trườ ng chảy từ từ vào khoảng trống giữalưới đếm và lá kính (nên bỏ đi vài giọt đầu).

Chú ý không để canh trường tràn ra ngoài khoang đếm, rơi xuống các rãnh và tránh tạo thành bọtkhí.

- Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút rồi tiến hành đếm trong 5 ô lớ n chéonhau tức là 80 ô vuông nhỏ. Hoặc có thể đếm 4 ô vuông lớ n tức là 100 ô vuông nhỏ (chú ý chọnmỗi ô ở vị trí khác nhau). Tính số tế bào trung bình trong mỗi ô.

Chú ý:

- Cần làm lặp lại 3-4 lần

- Vớ i những tế bào nằm trên đườ ng gạch thì chỉ đếm những tế bào có hơn 1/2 phần nằm trong ôđang đếm.- Trướ c và sau khi dùng, buồng đếm và lá kính phải đượ c rửa kỹ bằng nướ c cất rồidùng bông lau sạch để khô.

- Khi số tế bào trong một ô quá 16 thì nên pha loãng canh trườ ng thêm.

Tính toán:

Nếu dùng buồng đếm có bề sâu h = 0,1 mm và diện tích 1ô S = 1/25 mm2

thì số tế bào trong 1 ml canh trườ ng là: =Sh

f a

1000

trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô

f là hệ số pha loãng của canh trườ ng

h là bề sâu của lưới đếm

S là diện tích một ô

1000 là hệ số chuyển đổi 1ml = 1000mm3.

2. Phương pháp Brit

+ Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng để định lượ ng vi sinh vật có trong sữa hay một số vậtphẩm lỏng.










+ Cách tiến hành:

- Đo đường kính kính trườ ng của hệ thống kính định dùng khi quan sát.

- Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml vật phẩm nghiên cứu. Cho dàn đều lênphiến kính sạch vớ i diện tích nhất định (2 - 4 cm2).

- Để khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh metylen.

- Để khô và quan sát dướ i kính hiển vi. Đếm số tế bào trong 5 - 10 kính trườ ng, lấy trung bình rồisuy ra số tế bào trên một đơn vị diện tích vết bôi và cuối cùng là số tế bào trong một đơn vị vậtphẩm nghiên cứu.

3. Phương pháp Vinogratxki - Sungina+ Phạm vi sử dụng: Phương pháp này thường dùng để định lượ ng vi sinh vật trong đất hay vậtphẩm đặc, rắn.

+ Cách tiến hành:

- Cân một lượ ng nhất định (1g hay 5g) vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ trong cối thủy tinh rồichuyển tất cả vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch. Lắc đều trong 5 phút và để yêntrong 1 - 2 giây.

- Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml hỗn dịch đã chuẩn bị dàn đều trên một diệntích nhất định của phiến kính sạch (4 - 8 cm2). để tránh vi sinh vật dồn lại đầu pipet, động tácnày phải làm nhanh, lượ ng hỗn dịch hút vào pipet không nên nhiều quá và lúc chưa dàn kịp thìphải giữ pipet ở vị trí nằm ngang.

- Để khô rồi đổ lên vết bôi một lớ p thạch mỏng, loãng (0,1%). Lại để khô và cố định bằng cồntuyệt đối trong 5 phút.

- Nhuộm bằng dung dịch eritrozinphenol từ 0,5 - 3 giờ . Trong quá trình nhuộm phải theo dõi để thuốc nhuộm trên vết bôi không bị khô đi.

- Rửa sạch, để khô và đem quan sát bằng vật kính dầu. Cách đếm và tính kết quả gần giống như phương pháp Brit.

2. Định lượng gián tiếp

Định ngh ĩa: Định lượ ng gián tiếp là những phương pháp định lượ ng vi sinh vật bằng cách gieocấy một lượ ng nhất định vật phẩm nghiên cứu lên môi trườ ng thức ăn thích hợ p, nuôi trong 36 -48 giờ, sau đó đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào có trong một đơn vị vật phẩm ban đầu.










Ưu điểm: Chỉ đếm những tế bào vi sinh vật còn sống nên kết quả chính xác hơn

Nhược điểm:

- Tốn thờ i gian, công sức

- Khi cấy từ các vật phẩm pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy số khuẩn lạc chênhnhau 10 lần; vì thế để kết quả kiểm tra vi sinh vật có giá trị so sánh tốt nên sử dụng một độ phaloãng thống nhất đối vớ i từng loại vật phẩm.

- Đối vớ i những vi sinh vật mà bào tử thườ ng dính chặt vớ i nhau thành từng chuỗi, từng đôi,từng khối thì khi phát triển trên môi trườ ng, mỗi chuỗi, mỗi khối đó chỉ tạo thành một khuẩn lạc.Vì thế, số khuẩn lạc chưa phản ánh đượ c chính xác số tế bào vi sinh vật có trong vật phẩmnghiên cớ u.

- Không có loại môi trường dinh dưỡ ng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển.

Phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trườ ng thạch

Nguyên tắc: Gieo cấy một lượ ng vật phẩm nhất định lên môi trường đặc trong hộp petri, nuôi ở nhiệt độ thích hợp. Sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên rồi suy ra kết quả.

Cách tiến hành:

+ Đối vớ i vật phẩm nghiên cứu lỏng tiến hành pha loãng theo tỷ lệ 1/10 như phương pháp phaloãng Pasteur.

+ Đối vớ i vật phẩm nghiên cứu đặc hoặc rắn trướ c tiên cần chuyển thành dạng lỏng bằng cách:Cân 1 g vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ rồi chuyển tất cả vào bình tam giác dung tích 250 mlđã chứa sẵn 99 ml nướ c vô trùng. Lắc đều trong 5 phút, để lắng trong 30 giây rồi tiếp tục phaloãng như trên.

+ Gieo cấy một lượ ng vật phẩm nghiên cứu nhất định (0,1 ml) từ ống nghiệm pha loãng cuốicùng lên hộp petri đã chứa sẵn môi trườ ng vô trùng.

+ Nuôi ở nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc.

+ Đọc kết quả

- Nếu số khuẩn lạc không nhiều lắm ta đếm trực tiếp tất cả các khuẩn lạc có trong hộp

- Nếu số khuẩn lạc nhiều quá ta dùng kính đếm Lafa. đó là mộ t tấm kính hình vuông có kíchthướ c 15 x 15 cm. Mặt kính đượ c chia ra thành những ô có diện tích bằng nhau (1 cm2). Đếm số










khuẩn lạc trên 5 - 10 ô. Lấy trung bình cho 1 ô (ký hiệu là a tế bào). Đếm xong đo đườ ng kínhtrong của đáy hộp (ký hiệu là D). Suy ra số khuẩn lạc trong toàn hộp là a x D2/4.

Định lượ ng vi sinh vật trong không khí

Phương pháp lắng của Omelianxki

Nguyên tắc: Theo Omelianxki ướ c tính: trên một diện tích rộng 100 cm2, mở ra trong 5 phút thìlượ ng vi sinh vật rơI xuống tương đương với lượ ng vi sinh vật có trong 10 lít không khí.

Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất thườ ng dùng.

Nhược điểm: Không thật chính xác vì dựa trên cách ướ c tính.

Cách tiến hành: Đặt hộp petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗ không khí định nghiên cứu.Mở nắp hộp trong thờ i gian xác đinh (thườ ng là 5 phút) rồi đậy nắp hộp và để vào tủ ấm. Sau 24– 48 giờ đem ra, đếm số khuẩn lạc.

Tính toán: Đo đườ ng kính hộp petri (d cm) để tính điện tích (D2/4) rồi suy ra lượ ng vi sinh vậttong 1 lít hay 1 m3 không khí theo ướ c tính của Omelianxki.

Ngoài ra còn có thể ước tính như sau: Hộp petri có diện tích 60 cm2. Sau 1 giờ sẽ có một lượ ngvi sinh vật lắng xuống bằng lượ ng vi sinh vật có trong 6 lít không khí.








18 Bài 3 : KÍNH HIỂN VI. CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT


Bài 3 : KÍNH HIỂN VI. CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT

VI SINH VẬT SỐNG. QUAN SÁT NẤM MEN

A. KÍNH HIỂN VIKính hiển vi là một hệ thống quang học dùng để phóng đại ảnh của vật cần quan sát. Kính hiểnvi có nhiều loại tùy thuộc vào ánh sáng mà ngườ i ta sử dụng như: kính hiển vi quang học, kính

hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi điện tử...

I. Cấu tạo kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận chức năng: cơ học và quang học










Hình 4: Cấu tạo kính hiển vi điện tử

1. Bộ phận cơ học: có cấu tạo khá đơn giản gồm giá kính, ống kính và khay kính.

- Giá kính: có cấu tạo vững chắc để trên đó lắp các bộ phận khác của kính. Nó gồm đế kính vàthân kính

- Khay kính: hình tròn hoặc hình vuông là nơi đặt tiêu bản. Hai bên có ốc để chuyển dịch theohai chiều khác nhau có hai kẹp bằng thép để giữ tiêu bản.










Hình 5: Các loại khay kính thườ ng dùng ở kính hiển vi

- Ố ng kính: là một ống tròn (kính một mắt) hay hai ống tròn (kính hai mắt) . Nhờ ốc cố địnhbên cạnh ta có thể xoay ống kính theo hướ ng thuận với người quan sát người quan sát. Đầu trêncủa ống kính lắp thị kính, đầu dướ i gắn vớ i bàn xoay có lắp nhiều vật kính khác nhau và có thể xoay quanh trục của giá kính. Ống kính có thể di chuyển lên, xuống nhờ các ốc điều chỉnh quaytự do theo hai chiều ngượ c nhau. Ốc di chuyển nhanh (ốc điều chỉnh thô) dùng để tìm ảnh củavật còn ốc di chuyển chậm (ou ốc điều chỉnh tinh) dùng để điều chỉnh cho ảnh của vật rõ nét.

2. Bộ phận quang học

Bộ phận quang học là bộ phận quan trọng nhất của kính hiển vi gồm: vật kính, thị kính, kính tụ quang và, bộ phận truyền quang.

- V ậ t kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại. Mỗi vật kính đèu có ghi số phóng đại bên cạnh (8x,20x, 40x, 90x, 100x...). Những vật kính có độ phóng đại vừa và nhỏ (8x, 20x, 40x...) khi dùngkhông cho dầu nên gọi là vật kính khô. Những vật kính có độ phóng đại lớ n (90x, 100x...) khidùng cần nhỏ trướ c một giọt dầu lên trên tiêu bản nên gọi là vật kính dầu. Dầu phải trong suốt,trung tính và có chiết suất (độ chiết quang) tương đương vớ i chiết suất thủy tinh ( = 1,52). Nhờ đó giữa thủy tinh và dầu tạo thành một môi trường tương đối đồng nhất nên ánh sáng đi quakhông bị khúc xạ mà rọi thẳng vào vật kính. Mỗi vật kính có một khoảng làm việc (khoảng cáchtừ tiêu bản tớ i vật kính cho phép thấy rõ nhất ảnh của mẫu vật) nhất định, cụ thể là: đối vớ i vật

kính 8x - 8,53 mm; 40x - 0,4 mm; 90x - 0,1mm.










(a) (b)

Hình 6: (a) Các loại vật kính, (b) Vị trí của vật kính trong kính hiển vi

- Th ị kính: lắp ở đầu ống kính, cấu tạo từ hai thấu kính. Mỗi loại thị kính cũng có độ phóng đạikhác nhau và ghi ở mặt ngoài thị kính (7x, 10x, 15x...)

Hình 7: Các loại thị kính khác nhau

Khi quan sát ta đượ c một ảnh ảo, ngượ c vớ i vật và có độ phóng đại bằng tích số giữa độ phóngđại của vật kính, thị kính đượ c sử dụng và phóng đại của bộ phận truyền quang (ở một số loạikính hệ thống truyền quang cũng có tác dụng phóng đại).

- Kính tụ quang: lắp dướ i khay kính, gồm một hệ thống thấu kính ghép lại, có tác dụng tậptrung ánh sáng để chiếu vào tiêu bản. Kính tụ quang có thể di chuyển lên, xuống nhờ ốc điềuchỉnh bên cạnh.

Dướ i kính tụ quang là hệ thống chắn sáng cho phép điều chỉnh lượng ánh sáng đi vào nhiều hayít.

II.Cách sử dụng

1. Điều chỉnh ánh sáng

- Điều chỉnh gương: Quay gương phản chiếu về nguồn sáng và điều chỉnh để chùm tia sáng rọivào kính tụ quang. (Nếu ánh sáng tự nhiên thì dùng gương phẳng. Nếu ánh sáng nhân tạo thìdùng gương lõm).

- Điều chỉnh kính tụ quang: Muốn chiếu sáng vừa hoặc ít thì hạ kính tụ quang, mở chắn sáng vừaphải. Muốn chiếu sáng nhiều thì nâng tụ quang lên, mở rộng chắn sáng.

2. Quan sát tiêu bản

- Dùng ốc di chuyển nhanh làm xa khoảng cách giữa vật kính và khay kính.

- Xoay vật kính định sử dụng vào trục giữa. Đặt tiêu bản lên khay kính và nhìn vào thị kính, điềuchỉnh tiêu bản để chọn được vùng định quan sát.










- Nếu dùng vật kính dầu thì nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản. Từ từ đưa vật kính lại gần sát tiêu bản.Không làm nhanh quá, tránh vỡ tiêu bản hoặc vật kính

- Nhìn qua thị kính, dùng ốc di chuyển nhanh từ từ đưa vật kính đến khoảng làm việc tương ứng,khi thấy ảnh của vật thì dừng lại và dùng ốc di chuyển chậm điều chỉnh cho ảnh rõ nét.

III. Cách bảo quản

1. Bảo quản sau khi sử dụng kính

- Nâng vật kính lên, lấy tiêu bản ra, đưa khay kính về vị trí cũ

- Nếu dùng vật kính dầu thì dùng bông tẩm dung môi hữu cơ như xilen hay toluen lau nhẹ đầu

vật kính cho thật sạch.

- Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu

- Xoay điểm giữa của hai vật kính gần nhau vào trục. Xếp khăn lại, đặt lên khay kính rồi hạ vậtkính chạm sát khăn.

- Cho kính vào hộp hoặc phủ kính bằng bao nilon. Chuyển kính vào tủcó hệ thống đèn bậtthường xuyên để chống mốc và bụi bẩn.

2. Bảo quản thông thường và định kỳ

- Giữ kính sạch sẽ ở nơi khô ráo

- Trong thờ i gian không dùng có thể tháo thị kính ra và đậy nắp ống kính.

- Làm sạch kính trên của thị kính bằng khăn mềm, chổi lông.

- Hàng năm cần định kỳ mờ i thợ chuyên môn tu chỉnh, lau chùi để bảo quản kính.

- Ch ỉ di chuyển kính khi thật cần thiết và thao tác di chuyển phải thận trọng: một tay cầm thânkính, một tay đỡ đế kính.

B. CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT SỐNG Các loại tiêu bản quan sát vi sinh vật sống là loại tiêu bản tạm thờ i, có những đặc điểm sau:

- Thao tác làm tiêu bản đơn giản, tiến hành nhanh.

- Quan sát đượ c các trạng thái sống của tế bào như: sự chuyển động của tiên mao, sự sinh sản, sự hình thành bào tử...

- Tiêu bản loại này chỉ sử dụng một lần rồi bỏ đi.










Cách lấy giống vi sinh vật:

Muốn làm bất kỳ một loại tiêu bản nào về vi sinh vật cũng đều phải thực hiện các thao tác lấygiống vi sinh vật để làm vết bôi trên tiêu bản. Các thao tác này diễn ra theo trình tự sau:

- Đốt đèn cồn lên.

- Tay trái cầm ống nghiệm có canh trườ ng vi sinh vật (ngửa lòng bàn tay lên, đặt ống nghiệmgiữa ngón trỏ và ngón cái sao cho ống canh trường hơi nghiêng). Nhất thiết không để canhtrườ ng chạm nút bông (nếu là canh trườ ng lỏng).

- Dùng tay phải xoay nhẹ nút bông một vòng để dễ rút ra.

- Tay phải cầm que cấy, nung nóng đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, lướ t thân que cấy qua đèncồn sao cho toàn bộ que cấy đượ c thanh trùng hoàn toàn.

- Kẹp nút bông giữa ngón út và lòng bàn tay phải hay giữa ngón út và ngón đeo nhẫn của bàn tayphải, rút nhẹ nút bông và giưỡ nguyên như vậy suốt quá trình lấy mẫu. tuyệt đối không để nútbông lên bất kỳ một vật nào khác.

- Đốt miệng ống nghiệm trên đèn cồn.

- Khéo léo đưa đầu que cấy (đã nguội) vào ống giống để lấy canh trườ ng và nhẹ nhàng đưa quecấy ra.

+ Nếu ống giống là canh trườ ng lỏng thì chỉ cần nhúng đầu que cấy vào canh trườ ng rồi rút ra.

+ Nếu ống giống là canh trường đặc thì dùng que cấy lấy một chút sinh khối vi sinh vật trên mặtthạch. Chú ý thao tác hết sức nhẹ nhàng để lấy giống mà không cầy mặt thạch lên.

- Đốt miệng ống nghiệm một lần nữa rồi nút bông lại. Đặt ống nghiệm lên giá.

- Đưa giọt canh trườ ng (hoặc sinh khối) vi sinh vật ở đầu que cấy đặt lên phiến kính để làm vếtbôi.

- Sát trùng lại que cấy rồi đặt lên giá.

I. Tiêu bản giọt ép

1. Phạm vi sử dụng

Tiêu bản giọt ép cho phép quan sát hình dạng, xác định kích thướ c của tế bào vi sinh vật

2. Cách làm










- Chuẩn bị một phiến kính và một lá kính sạch, trong suốt.

- Dùng que cấy hoặc pipet lấy canh trườ ng vi sinh vật đặt lên giữa phiến kính. Với canh trườ ngđặc, cho trướ c một giọt muối sinh lý (0,5 - 0,85% NaCl) lên phiến kính. Sau hòa canh trườ ng visinh vật vào.

Chú ý: Lấy giọt canh trườ ng vừa phải, không nhiều hoặc ít quá. Nhiều quá, canh trườ ng sẽ tràora ngoài. Nếu ít quá, tiêu bản mau khô và hay tạo thành bọt khí trong tiêu bản, rất khó quan sát.

- Ép lá kính lên giọt canh trườ ng bằng cách để một cạnh lá kính tiếp xúc vớ i phiến kính sát mépgiọt canh trườ ng, nghiêng góc 60O, từ từ hạ lá kính nằm lên mặt phiến kính. Tránh đặt lá kínhnhanh, mạnh quá giọt canh trườ ng bắn ra ngoài hoặc lớ p không khí giữa lá kính và phiến kính

không kịp thoát sẽ tạo thành bọt khí.

Chú ý:

+ Nếu giọt dịch nhiều quá, tràn ra ngoài phần tiếp xúc của phiến kính và lá kính ta dùng giấy lọcthấm bớt nước đi.

+ Nếu cần quan sát tiêu bản lâu thì dùng vazơlin bôi quanh mép lá kính để giọt dịch khỏi bị khô.

- Đặt tiêu bản lên khay kính và quan sát.

II. Tiêu bản giọt treo 1. Phạm vi sử dụng

Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phảnứng của tế bào vi sinh vật vớ i các chất kích thích hóa học.

2. Cách làm

- Dùng lá kính và phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.

- Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính.

- Cho một giọt canh trườ ng lên giữa lá kính.

- Thận trọng xoay ngượ c lá kính cho giọt canh trườ ng xuống phía dướ i rồi đặt lá kính lên phiếnkính sao cho giọt canh trườ ng "treo" trong không gian lõm của phiến kính. Không để giọt canhtrườ ng lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm của phiến kính.











Ưu điểm của loại tiêu bản này so vớ i tiêu bản giọt ép là giúp ta quan sát tế bào vi sinh vật dễ dàng hơn, tiêu bản giữ được lâu hơn và nhờ đó ta có thể quan sát phương thức chuyển động vàsinh sản của vi sinh vật.

III. Tiêu bản vết

1. Phạm vi sử dụng

Dùng để nghiên cứu sự phân bố tự nhiên của các tế bào trong khuẩn lạc vi sinh vật hoặc phổ biếnhơn là để nghiên cứu hình thái của chuỗi bào tử và cách sắp xếp cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn,nấm mốc.

2. Cách làmDùng dao mổ cắt lấy một khối nhỏ môi trườ ng thạch có cấy vi sinh vật đã mọc dày đặc hay mọcthành các khuẩn lạc riêng rẽ, đặt lên phiến kính sao cho phía có vi sinh vật nằm ở bên trên. Sauđó lấy một lá kính mỏng dặt lên, dùng que cấy vòng hay kẹp sắt (pince) ép nhẹ lá kính xuống rồirút que cấy hay kẹp sắt ra ngay và giữ đúng vị trí của lá kính. Đặt tiêu bản nhận đượ c lên mộtphiến kính đã có nhỏ sẵn một giọt nướ c hay một giọt dung dịch xanh metylen pha loãng 1/40,cho phần vết nằm ở phía dướ i, ta sẽ thu đượ c tiêu bản "vết". Cũng có thể dùng ngay phiến kínhép nhẹ lên bề mặt của khuẩn lạc hay bề mặt của đám vi sinh vật rồi lấy ra làm tiêu bản "vết"

IV. Nhuộm màu vi sinh vật sống

Đôi khi muốn thấy rõ hơn h ình dạng tế bào vi sinh vật, ngườ i ta sử dụng thuốc nhuộm loãng như:xanh metylen hay fuchsin (1/1000), đỏ công gô 3%, đỏ trung tính từ 0,001 đến 0,00001%

1. Nguyên tắc

Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không độc hoặc ít độc vớ i vi sinh vật và đượ c pha loãngở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu.

2. Cách làm: Có hai cách nhuộm màu vi sinh vật sống

Cách 1

- Nhỏ một giọt thuốc nhuộm (không quá lớ n) lên phiến kính

- Lấy một giọt canh trườ ng vi sinh vật, hòa đều vớ i thuốc nhuộm.

- Đậy lá kính lên và đem quan sát.

Cách 2










- Nhỏ một giọt thuốc nhuộm lên phiến kính. Dùng que cấy dàn đều thành một vùng nhỏ rồi để khô tự nhiên

- Nhỏ một giọt canh trườ ng vi sinh vật lên vùng màu đã khô.


C. QUAN SÁT NẤM MEN

I. Đặc điểm h ình thái, sinh lý và ứng dụng của nấm men trong công nghiệp

1. Đặc điểm h ình thái

- Hình dạng: Nấm men có hình dạng khá phong phú và thay đổi tùy thuộc loài, tùy điều kiện môitrường, tùy độ tuổi sinh lý. Nói chung nấm men có dạng hình cầu, hình trứng, hình bầu dục...

- Kích thướ c: Nấm men có kích thước tương đối lớ n, chiều dài từ 6 -10 µm có khi 12 - 18 µm,chiều ngang từ 4 – 8 µm.

Trong quá trình phát triển, hình thái nấm men có thể thay đổi như sau:

- Ở nấm men trẻ: (qua 12 - 16 giờ nuôi cấy) màng mỏng, căng, nguyên sinh chất đồng nhất,

không bào chưa có hoặc mớ i bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao.

- Ở nấm men trưở ng thành (24 -48 giờ nuôi cấy) , không bào lớ n, số không bào có thể đến hai,lượng glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm 10 -15%.

- Ở nấm men đã già (nuôi cấy từ 72 giờ trở lên) màng dầy, nhăn, nguyên sinh chất không đồngnhất, không bào lớn, lượ ng chất béo tăng, tế bào hầu như không sinh sản nữa, không cóglycogen, tế bào chết chiếm tỷ lệ lớ n.

Một số nấm men có tế bào hình dài nối tiếp nhau thành những đạng sợ i gọi là khuẩn ty hoặckhuẩn ty giả. Ở khuẩn ty giả, tế bào không nối liền vớ i nhau chặt chẽ, trong những điều kiện nhất

định chúng tách rờ i nhau trở thành một tế bào độc lập. Khuẩn ty giả hay khuẩn ty thật thườ ngthấy ở các giống Endomyces, Endomycopsis, Trichosporon. Muốn kiểm tra khả năng này ngườ ita nuôi nấm men trong môi trường có nitơ hữu cơ cao, pepton, cao ngô, cao nấm men...

- Cấu tạo: Hầu hết nấm men là đơn bào. Về cấu tạo nó cũng gồm: màng, nguyên sinh chất, hạch.Trong nguyên sinh chất có không bào và các chất dự trữ khác như glycogen, granuloza, chất béo,volutin...










2. Đặc điểm sinh lý

- Dinh dưỡ ng: Nấm men dị dưỡ ng cacbon. Chúng sống hoại sinh hoặc ký sinh.- Hô hấp: Nấm men hô hấp tuỳ tiện. Trong điều kiện yếm khí, không có oxy, chúng thực hiệnquá trình lên men chuyển hóa đường thành rượ u. Trong điều kiện hiếu khí, có oxy, chúng thựchiện quá trình oxy hóa cho sản phẩm là sinh khối.

- Sinh sản: Nấm men có thể sinh sản theo lối nảy chồi hay tạo bào tử vô tính và sinh sản hữu tínhnhờ kết hợ p bào tử trái dấu. Cách nảy chồi, khả năng tạo bào tử, hình dạng, số lượ ng nang bào tử cũng là đặc điểm quan trọng trong phân loại.

- Khả năng tạo bào tử: Khả năng tạo thành nang bào tử và đặc tính của nang là một trong những

đặc điểm quan trọng để phân loại nấm men. Không phải loài nấm men nào cũng có khả năng tạothành bào tử, mà chỉ là một số nấm men và trong những điều kiện nuôi cấy nhất định. Nang bàotử hình thành trong các canh trườ ng nghèo chất dinh dưỡ ng, nhất là nguồn cacbon. Nang bào tử thườ ng chứa 1- 2 hoặc 4 bào tử. Một số ít loại có tớ i 8 bào tử. Thườ ng nang bào tử đượ c tạothành sau 5 - 10 ngày nuôi cấy trên môi trườ ng thạch mạch nha. Khi gặp điều kiện thuận lợ i,nang bao tử vỡ ra, bào tử nảy mầm và trở thành tế bào dinh dưỡ ng mớ i.

- Khả năng chuyển động: Nấm men không chuyển động

3. Ứng dụng trong công nghiệp

- Nấm men đóng vai tr ò quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên, vô cơ hóacác chất cặn bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trườ ng sinh thái.

- Sản xuất các dung môi hữu cơ: Nhiều loại nấm men có khả năng lên men rượ u, vì vậy từ lâucon người đã biết sử dụng nấm men để nấu rượ u, nấu bia, sản xuất cồn, glyxerin.

- Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao như enzim, protein, vitamin, axit amin: Nấm mensinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng giầu protein và vitamin nên chúng đượ c sử dụng rộngrãi trong ngành công nghiệp sản xuất thức ăn bổ sung cho ngườ i và gia súc. Nấm men cũng đượ clàm nở bột mỳ, gây hương nướ c chấm, sản xuất một số dượ c phẩm... và gần đây còn đượ c

nghiên cứu sử dụng để sản xuất cả lipit.

II. Các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng canh trường nấm men và phương pháp xácđịnh

1. Độ thuần khiết: Canh trường sạch là chỉ tiêu đầu tiên để đánh giá chất lượng một canhtrường nấm men. Để kiểm tra điều này, cách đơn giản, dễ làm nhất trong phòng thí nghiệmlà làm tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi, nếu thấy tất cả các tế bào trong canh trường có










cùng đặc tính h ình thái thì có thể sơ bộ kết luận độ sạch của canh trường; nếu không, đếmsố tế b

ào lạ trong năm đến bảy kính trường, lấy trung b

ình rồi suy ra độ thuần khiết củacanh 2. Tỷ lệ tế bào sống trên tổng số tế bào

Nguyên tắc: Việc quan sát tế bào nấm men sống và chết dựa trên nguyên tắc

- Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ dàng hơn đi qua màng tế bào sống

- Nguyên sinh chất tế bào chết dễ bắt màu

Vì vậy ta có thể dùng xanh metylen để nhuộm phân biệt tế bào sống và chết.

Cách tiến hành:

Cho vài giọt canh trườ ng nấm men và một giọt thuốc nhuộm (đã pha loãng 10 lần) lên phiếnkính, nhẹ nhàng trộn đều, đậy lá kính lại, để yên trong 2 - 3 phút rồi đem quan sát. Tế bào chếtbắt màu xanh còn tế bào sống không màu.

Muốn tính tỷ lệ tế bào sống ta đếm số tế bào chết và tổng số tế bào chung (sống và chết) trên 5kính trườ ng rồi suy ra phần trăm tế bào sống theo công thức sau:

Nếu nấm men đang ở giai đoạn sinh trưởng lượ ng tế bào chết không quá 2 - 4%.

3. Tỷ lệ tế bào nảy chồi trên tổng số tế bào

Đây là một vịec làm quan trọng khi đánh giá chất lượng canh trườ ng nấm men giống để tiếp vàothùng lên men. Trong canh trườ ng nấm men giống đem lên men, lượ ng tế bào đang nảy chồi ítnhất phải chiếm từ 10 đến 15%. Nếu canh trường đang ở giai đoạn sinh trưở ng mạnh, số tế bàonảy chồi có thể đạt tớ i 70 - 80%.

Cách tiến hành:

Cho một giọt canh trườ ng nấm men và một giọt NaOH hoặc H2SO4 10% lên phiến kính trộn đều.Đậy lá kính lại, đặt lên khay kính và quan sát. Đếm số tế bào chung và số tế bào đang nảy chồirồi suy ra phần trăm.

Tế bào được xem là đang nảy chồi là những tế bào có tế bào con bé hơn hoặc bằng 1/2 tế bàomẹ.

4. Số lượng tế bào trong 1 ml canh trường

Khi đánh giá chất lượng canh trườ ng nấm men dùng trong sản xuất, ngoài việc tính tỷ lệ tế bàonảy chồi cần đếm số tế bào trong 1ml. Trong 1ml canh trườ ng nấm men phát triển bình thườ ng,










phải có 12 - 14 triệu tế bào. Người ta thường đếm trực tiếp bằng các buồng đếm Thoma,Goriaep.

C. ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO

Đo kích thướ c tế bào nấm men (hoặc vi sinh vật nói chung) phải dùng những dụng cụ riêng biệtvà đơn vị đo tính bằng micromet (1 = 0,001mm).

I. Dụng cụ đo:

Thước đo vật kính: Thước đo vật kính dùng để xác định hệ số đo. Đó là một phiến kính trong

suốt. Ở giữa có một vòng tròn. Trong vòng tròn có một vạch khắc dài 1mm, đượ c chia thành 100khoảng bằng nhau, mỗi khoảng bằng 10.

Hình 8: Hìnhảnh thước đo vật kính

Thước đo thị kính: Dùng để đo kích thướ c vi sinh vật. Thước đo thị kính gồm một ống kính,trong đó có các vạch chia đánh số từ 1 đến 50. Một vạch chữ thập có thể di động đượ c từ phảisang trái (hoặc ngượ c lại) nhờ một ốc vặn bên ngoài. Xung quanh ốc vặn chia thành 100 vạchbằng nhau. Khi ốc này chuyển đi một vạch thì giao điểm của chữ thập trong ống kính chuyển đimột khoảng bằng 0,01 vạch trên thước đo thị kính.










Hình 9: Hìnhảnh thước đo thị kính

II. Cách tiến hành:

Xác định hệ số đo:

+ Đặt thước đo vật kính lên khay kính, quan sát và điều chỉnh sao cho trong kính trườ ng nhìnthấy rõ các vạch chia của thước đo vật kính.

+ Lấy thị kính ra, lắp thước đo thị kính lên ốngkính. điều chỉnh cho thang chia của thước đo thị kính trùng vớ i các vạch chia của thước đo vật

kính. Tìm 4 vạch của hai thang chia trùng nhau.Xác định xem bao nhiêu vạch trên thước đo thị kính ứng vớ i bao nhiêu vạch của thước đo vậtkính.

Ví dụ: 2 vạch chia của thước đo thị kính trùng vớ i21 vạch của thước đo vật kính. Ngh ĩa là cứ mộtvạch của thước đo thị kính ứng vớ i 10,5 vạch củathước đo vật kính. Vậy, một vạch của thước đothị kính có độ dài bằng 105 . Hệ số đo bằng 105.

Hình 10: Cách xác định hệ số đo

Cách đo

- Làm tiêu bản nhuộm đơn loài vi sinh vật định đo

- Tháo vật kính ra, đặt tiêu bản lên khay kính. Tìm một tế bào điển hình. điều chỉnh cho giaođiểm của hai đườ ng chéo trùng vớ i một đầu của tế bào, gọi đó là điểm a và ghi số khoảng và số










vạch trên ốc chuyển. Ví dụ: không khoảng và số trên ốc chuyển là 23. Lại chuyển giao điểm sangđầu kia của tế bào, trên ốc chuyển thấy vạch 25 (b).

Cách tính

Kích thướ c tế bào vi sinhvật đượ c tính theo công thức:

X = (b - a).h

trong đó: a - số đo ở điểm đầu

b - số đo ở điểm cuối

h - hệ số đo Cần lưu ý rằng hệ số đo của mỗi hệ thống vật kính khác nhau không giống nhau. Vì thế, khi xácđịnh hệ số đo ở hệ thống nào thì phải đo ở hệ thống đó.

Chú ý: Để tìm thấy vạch chia trên thước đo vật kính một cách nhanh chóng, trướ c hết nên dùngvật kính phóng đại nhỏ (10x) để tìm. Điều chỉnh cho vạch chia vào giữa kính trường, sau đó mớ ithay vật kính định sử dụng.








32 Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH


Bài 5: LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH

QUAN SÁT VI KHUẨN

A. LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH

I. Các đặc điểm của tiêu bản vi sinh vật cố định

Quan sát tiêu bản cố định là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh vật học vì nó cóưu điểm sau:

- Đơn giản, dễ làm

- Cho phép ta quan sát rõ hình thái và một số cấu tạo của tế bào vi sinh vật hay định lượ ng visinh vật.

- Không sợ bị lây nhiễm khi làm việc vớ i vi sinh vật gây bệnh.

II. Cách làm tiêu bản

1. Làm vết bôi

- Chuẩn bị một phiến kính sạch và khô

- Lấy canh trườ ng vi sinh vật: thao tác tương tự như cách lấy giống vi sinh vật.

- Nghiêng que cấy 10 - 15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt canh trườ ng ra khắp diện tích đã khoanh. Làmxong, sát trùng que cấy để lên giá.

Chú ý:

- Lượ ng vi sinh vật lấy vừa phải

- Vết bôi tròn, gọn và thật mỏng.- Các tế bào vi sinh vật được dàn đều.

2. Làm khô vết bôi

Để vết bôi khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên phần không khí nóng của đèn cồn cho nhanh. Tránh đốtnóng trực tiếp vì như vậy tế bào bị quắt lại, cấu tạo của nó bị thay đổi. Phải để vết bôi thật khômớ i làm tiếp tục.










3. Cố định vết bôi

a. M ục đích: Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau:

- Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xúc (nếu là loại vi sinh vật gâybệnh).

- Gắn chặt vi sinh vật và phiến kính để lúc nhuộm, rửa chúng không bị trôi.

b. Các phương pháp:

+ Phương pháp dùng nhiệt: Là phương pháp đơn giản và phổ biến nhất.

Kẹp phiến kính giữa hai ngón tay các và trỏ, hơ mặt dướ i của phiến kính qua lại trên ngọn đèn

cồn, tránh không để tiêu bản nóng quá.

+ Phương pháp dùng hóa chất: Khi nghiên cứu cấu tạo tế bào thì cố định bằng cách hơ nóngkhông lợ i mà phải cố định bằng hóa chất vì cách này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế bào và không làm đứt các tiên mao. Người ta thườ ng dùng hóa chất là các loại rượ u hay axetonvà thực hiện một trong những cách sau:.

- Rượ u etylic: Nhỏ rượ u lên vết bôi hoặc nhúng vết bôi vào rượu. Rượ u tuyệt đối tác dụng tứcthời, rượ u 95O ngâm trong 5 - 15 phút, rượ u càng loãng thờ i gian càng lâu.

- Rượ u metylic trong 2-5 phút.

- Ngâm vết bôi vào dung dịch axeton trong 5 phút.

- Dùng rượu etylic và đốt cháy: nhỏ vài giọt rượ u 90 - 95O lên vết bôi rồi đốt cháy và dập tắtngay. Làm thế vài lần rồi để khô.

4. Nhuộm màu

Nguyên tắc:

- Vi sinh vật bắt màu thuốc nhuộm là một quá trình hấp phụ nên cần sử dụng thuốc nhuộm có

khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợ p vớ i thành phần khác nhau của tế bào thànhnhững hợ p chất màu đặc trưng, bền vững. Thuốc nhuộm thườ ng dùng là các chất màu anilin, chủ yếu là loại kiềm và trung tinh.

- Vì thành phần hóa học của tế bào các loài vi sinh vật cũng như các bộ phận trong tế bào rấtkhác nhau nên khả năng và mức độ bắt màu không giống nhau. Tùy theo mục đích nghiên cứumà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợ p.

Các phương pháp Có hai phương pháp nhuộm chính: nhuộm đơn giản và nhuộm phức tạp










a. Nhuộm đơn giản

+ Định ngh ĩa: Tr ên tiêu bản chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm.+ Các bướ c tiến hành: Vết bôi đã cố định phải để khô mới đem nhuộm.

- Đặt tiêu bản lên cầu thủy tinh (gác nằm ngang trên miệng bocan)

- Nhỏ thuốc nhuộm phủ đều vết bôi. chú ý không cho thuốc nhuộm nhiều quá và trong suốt thờ igian nhuộm, trên vết bôi luôn có một lớ p thuốc nhuộm phủ đều.

- Thờ i gian nhuộm tùy tính chất tiêu bản và loại thuốc nhuộm đem dùng. Trong điều kiện nhiệtđộ phòng, đối vớ i thuốc nhuộm Fuchsin Ziehl cần để yên 1 - 2 phút còn xanh metylen là 3 - 5

phút. Để tăng cườ ng tác dụng của thuốc nhuộm và rút ngắn thờ i gian nhuộm có thể hơ nhẹ phíadưới phía kính trên đèn cồn .

- Khi nhuộm xong, đổ hết thuốc nhuộm đi, rửa sạch bằng các nghiêng phiến kính và cho mộtdòng nướ c chảy nhẹ qua. Nướ c sẽ kéo thuốc nhuộm đi. Chú ý không xối nướ c trực tiếp lên vết bôi để tránh bị trôi vi sinh vật.

- Vẩy nướ c, dùng giấy thấm khô hoặc hơ nhẹ trên đèn cồn.

- Quan sát tiêu bản vớ i vật kính (x40) rồi chuyển sang vật kính (x100) soi dầu.

b. Nhuộm phức tạp + Khái niệm: Trên tiêu bản sử dụng đồng thờ i hai hay nhiều loại thuốc nhuộm.

+ Ý ngh ĩa của phương pháp nhuộm phức tạp:

- Nhằm nghiên cứu hình thái, cấu trúc đặc biệt của tế bào làm cơ sở cho việc phân loại vi sinhvật

- Nhằm phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các tổ chức, cơ quan, của cơ thể động thực vậthay trong các vật phẩm nghiên cứu.

- Là biện pháp bảo quản các tiêu bản vi sinh vật lâu dài hơn, phục vụ cho công tác nghiên cứu.

+ Nguyên tắc của nhuộm phức tạp

Các cấu trúc khác nhau, thậm chí các phàn khác nhau của một cấu trúc thườ ng có tính chất lýhọc, hóa học cũng như khả năng bắt màu khác nhau.

Việc sử dụng đồng thờ i các loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản cho phép ta nghiên cứu cấutạo và đặc tính của tế bào cũng như sự khác nhau giữa các loài vi sinh vật.










+ Các phương pháp nhuộm phức tạp thườ ng là: nhuộm Gram, nhuộm bào tử, tiên mao, thể ẩnnhập, chất nhân, vỏ nhày v.v.

Phương pháp nhuộm Gram

Phương pháp này do Christin Gram đưa ra vào năm 1884. Đây là một phương pháp nhuộm quantrọng dùng để định loại vi sinh vật dựa trên thành phần cấu tạo của chúng.

* Nguyên tắc

Ngườ i ta cho rằng trong nguyên sinh chất tế bào của một số loài vi sinh vật có chứa phức chất protein đặc biệt mà thành phần của nó có muối ribonucleat magie, khi nhuộm phức chất này kếthợ p vớ i loại thuốc nhuộm triphenylmêtan (như gential violet, cristal violet, metyl violet...) và iôtsẽ cho màu tím rất bèn vững chịu đượ c tác dụng của cồn. Những vi sinh vật có tính chất này gọilà vi sinh vật Gram dương (+) nếưu không gọi là vi sinh vật Gram âm (-).

Dựa vào khả năng bắt màu gram ngườ i ta chiavi sinh vật thành hai nhóm:

- Gram dương (+): gồm hầu hết các loại cầukhuẩn, các trực khuẩn hiếu khí có bào tử (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus,Bacillus mycoides), nấm men, xạ khuẩn...

- Gram âm (-): gồm nhóm vi khuẩn đườ ng ruộtnhư Bacterium coli, Bacterium typhi,Bacterium aerogenes, Bacterium proteus, vikhuẩn axetic...

Hình 11: Cấu tạo lớ p màng của VSV Gram (-) và Gram (+)

* Các bướ c tiến hành

Sau khi cố định vết bôi thì tiến hành nhuộm:

- Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút.

- Đổ hết thuốc đi, nhỏ dung dịch lugol lên và để trong một phút.

- Rửa nướ c

- Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản nhỏ từ từ từng giọt cho đến khi tan hết màu










- Rửa nướ c

- Nhuộm bổ sung Fuchsin trong một phút

- Rửa nướ c

- Làm khô tiêu bản và soi dướ i vật kính dầu.

- Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) có màu tím, gram (-) màu hồng.

Phương pháp nhuộm Gram không phải bao giờ cũng cho kết quả ổn định, nó còn phụ thuộc trạngthái nuôi cấy, lứa tuổi sinh lý và đặc tính một số loài (nên nhuộm lúc vi sinh vật còn non). Ngoàira lúc tẩy màu nếu làm thiếu cẩn thận thì kết quả cũng không chính xác. Để đảm bảo kết quả nên

dùng cồn có iôt thay cồn (100ml cồn + 2 - 4ml nướ c iôt 10%). Trong cồn có iôt, vi khuẩn gram (-) bị mất màu sau 5 phút còn vi khuẩn gram (+) vẫn giữ màu sau 1 giờ .

B. QUAN SÁT VI KHUẨN

I. Đặc điểm h ình thái, sinh lý và ứng dụng của vi khuẩn trong công nghiệp


Hình dạng: Căn cứ vào hình dạng bên ngoài của vi khuẩn, ngườ i ta chia chúng thành 3 nhómchính là cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn.

+ Cầu khuẩn (coccus) là những vi khuẩn mà tế bào có dạng hình cầu, rất phổ biến trong tự nhiên.Tùy theo kiểu phân chia tế bào mà ngườ i ta chia cầu khuẩn thành một số nhóm như:

- Đơn cầu khuẩn (Monococcus) hay vi cầu khuẩn (Micrococcus) có kích thướ c rất nhỏ, có khả năng phân chia tế bào theo một mặt phẳng duy nhất và sau khi phân chia xong thì hai tế bào contách rờ i nhau. Chúng chủ yếu là những loại sống hoại sinh, có nhiều trong đất nướ c, không khí.

- Song cầu ( Diplococcus) cũng phân chia tế bào theo một mặt duy nhất nhưng sau khi phân chiahai tế bào vẫn dính nhau. Chúng chủ yếu là những vi khuẩn gây bệnh.

- Tứ cầu khuẩn (Tetracoccus) có khả năng phân chia tế bào theo hai mặt phẳng vuông góc vớ inhau, từ một tế bào thành bốn tế bào dính liền nhau. Loại này có ít trong tự nhiên.

- Bát cầu khuẩn (Sarsina) là những cầu khuẩn có khả năng phân chia tế bào theo ba mặt phẳngvuông góc, từ một tế bào thành tám tế bào. Loại này thườ ng sống hoại sinh trong đất, có nhiều ýngh ĩa đối vớ i nông nghiệp. Ví dụ Sarsina urea có khả năng tổng hợ p enzim ureaza. Ngoài ra cònmột số loại bát cầu khuẩn sống ký sinh trong thực vật gây nên hư hỏng rau quả.










- Liên cầu khuẩn(Streptococcus) đượ c tạo thành do sự phân cắt tế bào theo một hướ ng và sau khiphân chia xong thì các tế bào dính liền nhau thành chuỗi. Loại này có nhiều trong tự nhiên, đặcbiệt trong rau quả, thực phẩm. Chúng có nhiều ý ngh ĩa trong công nghiệp, nhất là công nghiệpthực phẩm như sản xuất axit lactic, chế biến sữa chua, fomat, chế biến rau quả. Ngoài ra còn cónhiều loại gây bệnh (liên cầu trùng) làm viêm đườ ng hô hấp, viêm khớ p.

- Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) là những loại cầu khuẩn mà sự phân chia tế bào không xảy ratheo một hướ ng nhất định, sau khi phân chia các tế bào sắp xếp hỗn độn (dạng chùm nho). Trongtự nhiên, đây chủ yếu là loại vi trùng gây bệnh mụn nhọt, ví dụ như Staphylococcus aureus.

+ Trực khuẩn: là những vi khuẩn hình que, chiều dài lớn hơn chiều rộng rất nhiều. Đa số trựckhuẩn có tiên mao và di chuyển nhờ tiên mao. Nhiều loại trực khuẩn có khả năng tạo bào tử. Dựa

vào khả năng tạo bào tử ngườ i ta chia trực khuẩn thành hai nhóm:

- Trực khuẩn có bào tử ( Bacillaceae)

- Trực khuẩn không có bào tử ( Bacterium)

Tùy theo sự bố trí và kích thướ c của bào tử, trực khuẩn có bào tử lại chia thành hai nhóm:

- Bacillus: bào tử nằm lọt trong tế bào, không làm biến dạng tế bào.

- Clostridium: bào tử lớn hơn bề ngang tế bào, làm tế bào bị phình ra hoặc có dạng dùi trống.

Trực khuẩn sinh bào tử thườ ng có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, y học. Ví dụ Bacillus

subtilis đượ c sử dụng để tổng hợ p -amilaza; Bacillus anthracis là vi khuẩn gây bệnh mụi than ở động vật có sừng. Clostridium tetani gây bệnh uốn ván.

Đa số trực khuẩn đứng riêng rẽ, nhưng có một số loại liên kết vớ i nhau gọi là diplococcus haydiplobacterium hoặc xếp thành chuỗi gọi là Streptobacterium hay Streptobacillus.

+ Xoắn khuẩn: là những vi khuẩn mà tế bào có hình dạng lò xo hay một nửa vòng xoắn. Chúngchia làm hai loại chính:

- Phẩy khuẩn (Vibrio) là loại tế bào có nửa vòng xoắn.- Spirillium là loại tế bào có một vài vòng xoắn.

Xoắn khuẩn có khả năng di động bằng tiên mao hoặc bằng cách uốn vặn vòng xoắn. Đa số trongchúng sống hoại sinh, một số sống ký sinh gây bệnh. Ví dụ: Vibrio chorela gây bệnh lao,Spirillium rubrum gây bệnh dịch hạch.

Kích thước:Kích thướ c của vi khuẩn biến thiên theo cấu tạo.










- Cầu khuẩn có kích thướ c xấp xỉ 1 - 2.

- Trực khuẩn dài 1 - 5; đườ ng kính khoảng 0,5 - 1.

- Xoắn khuẩn: Vibrio thườ ng dài 1 -3, còn Spirillium 5 - 30.

Hình dạng và kích thướ c của tế bào là đặc điểm khá ổn định của từng loài và thường đượ c sử dụng như một chỉ tiêu để phân loại. Tuy nhiên, trong thực tế có những biến thiên nhất định. Tùythuộc điều kiện môi trườ ng và thờ i gian nuôi cấy mà hình dạng có thể chuyển từ hình cầu sanghình que qua những dạng trung gian.

Cấu tạo: Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào, có cấu tạo đơn giản, có nhiều tính chất và dấuhiệu của một cơ thể thực vật.Về cơ bản cấu tạo tế bào vi khuẩn không khác so vớ i tế bào sinh vậtbậc cao.

a. Màng của vi khuẩn

Bên ngoài cùng có một lớ p màng dày gọi là màng tế bào. Bên trong có một lớ p màng mỏng gọilà màng nguyên sinh chất. Trong đó có chất nguyên sinh và có nhiều bào quan khác nhau. Mộtsố vi khuẩn bên ngoài có một lớ p giáp mạc (capsul).

+ Giáp mạc (capsul) là một bộ phận phụ của tế bào vi khuẩn, có thể tách ra mà không gây ảnh

hưởng đến hoạt động sống của vi khuẩn. Đó là lớ p chất nhày, lỏng lẻo bám xung quanh tế bàonên còn gọi là màng nhày. Màng nhầy này đượ c hình thành do sự nhày hóa màng tế bào, tạo nênmột lớ p vỏ bao bọc bên ngoài tế bào. Ở một số loại vi khuẩn, vỏ này chỉ bao bọc một tế bào nhưBacillus anthraxit. Ở một số loài khác vỏ này bao bọc hàng chục tế bào, do vậy còn gọi là khuẩn bao đàm như Azotobacter chrococcum.

*Thành phần chủ yếu của giáp mạc là polysacarit hoặc polypeptit tùy loại vi khuẩn. Ví dụ giápmạc của Acetobacter xylynum chủ yếu là polypeptit.

Điều kiện hình thành giáp mạc biến thiên theo tính chất từng loài vi khuẩn nhưng cơ bản là trong

điều kiện môi trường giàu đường, ít đạm.

*Chức năng: Tạo giáp mạc là hình thức tự vệ của vi khuẩn. Vi khuẩn tạo giáp mạc để chống lạichất kháng sinh diệt khuẩn. Tuy nhiên, 98% trọng lượ ng giáp mạc là nướ c, bở i vậy giáp mạc còncó chức năng chống lại sự khô cạn, kéo dài thờ i gian sống của vi khuẩn. Ngoài ra, giáp mạc cònlà nơi dự trữ thức ăn và thải các chất không cần thiết của quá trình trao đổi chất. Một số vi khuẩnnhư vi khuẩn lưu huỳnh dùng giáp mạc bám vào các vật thể trong môi trường để di động










+ Màng (membrane) là bộ phận chính, nằm ngoài cùng, sát giáp mạc, mỏng, bề dày cỡ 10 - 20nm, chiếm 20% trọng lượ ng khô của tế bào, có tính đàn hồi, tính bán thấm và độ bền cơ học cao,nhờ đó chống đượ c sự va đập, giúp cho vi khuẩn trao đổi chất dễ dàng với môi trườ ng.

Màng tế bào không có màu, trong suốt, khả năng khúc xạ ánh sáng kém, rất khó bắt mầu cácthuốc nhuộm thông thườ ng do vậy khi nghiên cứu phải sử dụng biện pháp đặc biệt như gây hiệntượ ng co nguyên sinh (plasmolyse) bằng cách ngâm vào dung dịch muối ưu trương 0,2M KNO3hay 0,2M NaCl thì tế bào chất bị co lại (vì nướ c thoát ra ngoài), màng sẽ tách ra. Cũng có thể dùng siêu âm phá vỡ tế bào hoặc dùng kính hiển vi điện tử để bóc màng.

Thành phần hóa học của màng chủ yếu là polysacarit, lipit, lipoit, protein vớ i các loại đườ ngglucoza, araphinoza, lactoza. Khác vớ i màng tế bào thực vật, màng tế bào vi khuẩn không có hợ p

chất xenluloza.

Chức năng của màng là bảo vệ tế bào chất và thực hiện quá trình trao đổi chất.

+ Màng nguyên sinh chất (citoplasmid membrane). Đó là phần chất nguyên sinh nằm sát màng tế bào, dày khoảng 50 - 100AO, chiếm gần 10 - 15% trọng lượ ng khô của tế bào, đượ c cấu tạo từ một phức chất cơ bản là lipoprotein. Dướ i các tiêu bản siêu cắt, ngườ i ta thấy màng nguyên sinhchất gồm ba lớ p: lớ p trong cùng và ngoài cùng là protein, lớ p giữa là photpholipit. Sự sắp xếpnày làm tăng khả năng bán thấm của màng tế bào.

Chức năng của màng nguyên sinh chất:

- Là nơi thực hiện quá trình tổng hợ p một số thành phần của tế bào như màng tế bào, giáp mạc,tiên mao, vì 90% enzim oxy hóa khử (dehdrogenaza và xitocrom) nằm ở vùng này.

- Nó chủ động tích lũy thức ăn cho tế bào vì enzim permeaza có vai trò quan trọng giống như làmột enzim vận chuyển cũng định cư ở màng tế bào chất.

- Duy trì áp suất thẩm thấu của tế bào.

b. Nguyên sinh chất của tế b ào vi khuẩn.

Nguyên sinh chất là bộ phận chính, chủ yếu của tế bào, nằm phía trong màng nguyên sinh chất,là nơi thực hiện mọi quá trình tổng hợ p và phân giải các chất của tế bào trên cơ sở đó tế bào pháttriển và đổi mớ i.

Thành phần hóa học của nguyên sinh chất gồm 90% nướ c còn lại là protein.

ở tế bào trẻ, nguyên sinh chất là đồng nhất quang học. ở tế bào già nó mất tính đồng nhất do việchình thành một số bào quan như không bào và một số thể vùi dự trữ.










+ Riboxom là trung tâm tổng hợ p protein cho tế bào. Riboxom có hai nửa cấu tạo. Khi tổng hợ pprotein, các riboxom tập hợ p thành một vùng gọi là polyxom. Thành phần hóa học chính củariboxom là protein và axit nucleic.

+ Mezoxom là những tiểu thể hình cầu, nằm ở gần vách ngăn ngang của tế bào, vai trò chính làgiúp tế bào trong quá trình phân chia.

+ Không bào (vacuola) có cấu trúc hình cầu hoặc hình bầu dục, chỉ xuất hiện ở những tế bào già.Trong không bào chứa nhiều nướ c và một số chất vô cơ hòa tan. Vai trò của nó là điều chỉnh ápsuất thẩm thấu của tế bào.

+ Sắc thể là những cấu trúc hình hạt có chứa khuẩn lục tố. Vai trò của sắc thể là chuyển quang

năng thành hóa năng giống như lục lạp ở thực vật.

+ Các loại thể vùi dự trữ: là nơi chứa các chất dự trữ cho tế bào, đượ c hình thành khi tế bào tổnghợ p thừa một số chất hoặc trong môi trườ ng rất giàu thức ăn. Nó được đưa ra sử dụng khi môitrườ ng cạn thức ăn. Thể vùi có các dạng:

- Hạt volutin (hay còn gọi metacromatin - dị nhiễm sắc) bắt màu không đồng đều vớ i màu của tế bào chất. Vì trong thành phần của nó chủ yếu là ARN và photpho nên khi nhuộm xanh metylencho màu tím. Hạt này hình thành khi tế bào rơi vào môi trường giàu nitơ, photpho. Chúng cónhiều trong vi khuẩn Spirillium volutans.

+ Hạt glycogen và granuloza là dạng dự trữ gluxit, thường đượ c hình thành trong môi trườ ng cónhiều đườ ng.Khi nhuộm iôt glycogen cho màu nâu sẫm còn granuloza cho màu xanh thẫm.Những hạt này là nguồn cung cấp cacbon và năng lượng cho cơ thể.

+ Hạt lipit là nơi dự trữ chất béo. Chúng tồn tại trong tế bào chất dướ i dạng những giọt mỡ trungtính.

+ Thể vùi vô cơ bao gồm:

- Hạt lưu huỳnh S là sản phẩm của quá trình oxy hóa sunfua hidro:

H2S + O2 = S + H2O + E

và đượ c sử dụng như một dạng dự trữ lưu huỳnh.

- Ngoài ra còn có những tinh thể muối canxicacbonat và canxioxalat.

+ Nhân của tế bào: Tế bào vi khuẩn có nhân nhưng tồn tại ở dạng nguyên thủy nhất. Đó là mộtsợ i ADN mạch vòng và nằm phân tán đều trong tế bào chất, chưa h ình thành một loại hạt cụ thể nào. Đa số vi khuẩn có nhân theo kiểu này, nhưng ở một số ít vi khuẩn, ngườ i ta thấy phân tử










ADN này nằm tập trung tại một vùng nhất định trong tế bào chất, tạo nên vùng nhân - như vậybắt đầu có dấu hiệu nhân phân hóa khá rõ rệt. Loại này chỉ ở niêm vi khuẩn (vi khuẩn nhầy) mớ icó.

Vai trò của nhân là truyền tín hiệu di truyền và kiểm soát quá trình tổng hợ p protein.


Dinh dưỡng: Đa số sống hoại sinh hoặc ký sinh, một số có khả năng tự dưỡng ni tơ như vi khuẩnnốt sần sống cộng sinh ở rễ cây bộ đậu.

Hô hấp: Các vi khuẩn hô hấp hiếu khí hay kỵ khí hoặc tùy tiện phụ thuộc vào đặc tính loài.

Sinh sản:

a. Hình thức sinh sản của vi khuẩn phổ biến nhất là sinh sản vô tính bằng cách phân cắt ngang tế bào vớ i sự tạo thành vách ngăn.

b. Các giai đoạn:

Giai đoạn 1: - là giai đoạn chuẩn bị. Tế bào phát triển nhanh về chất, kích thướ c lớ n lên rõ rệt,hoàn chỉnh các bộ phận bên trong, tập trung các chất dự trữ cần thiết cho việc hình thành bộ máyhạt nhân và các cấu trúc cho tế bào con ra đờ i.

Giai đoạn 2: - là giai đoạn hình thành màng ngăn. Ở giữa tế bào, sát màng tế bào mọc lên haimấu, đánh dấu vị trí mà tế bào sẽ phân đôi, từ hai mấu này phát triển, tiến dần vào nguyên sinhchất tạo màng ngăn. Hai màng ngăn cứ tiến dần vào nhau, cùng lúc đó các cơ sở vật chất đượ ctách đôi. Quá tr ình này kết thúc khi hai màng ngăn tiến sát vào nhau tạo hai tế bào con đứng độclập (hai màng vẫn dính vào nhau).

Giai đoạn 3: Từ tế bào mẹ hình thành hai tế bào con độc lập. Sự phân chia này xảy ra ở giữa tế bào.

- Phân chia đẳng hình cho hai tế bào con giống hệt nhau

- Phân chia dị hình (sự phân chia lệch về một phía) cho hai tế bào con không bằng nhau.

Các nhóm vi khuẩn khác nhau thì khả năng phân tách tế bào có thể xảy ra theo nhiều hướ ng khácnhau.

- Cầu khuẩn phân tách theo 1, 2 hoặc 3 mặt phẳng trực giao cho 2, 4 hoặc 8 tế bào con.

- Trực khuẩn, xoắn chỉ có hình thức cắt ngang tế bào.










Hình thức sinh sản hữu tính nguyên thủy của tế bào có thể xảy ra nhưng rất hiếm hoi. Hai tế bàokết hợ p vớ i nhau tạo thành kết hợ p tử và tạo ra hai tế bào con theo cách phân đôi. H ình thức nàyđôi khi xảy ra vớ i hai bộ phận trong một tế bào làm cho tế bào có sức sống mạnh hơn, nhưngkhông phổ biến.

c. Tốc độ sinh sản trung bình của tế bào là sau 20 30 phút tế bào phân cắt một lần. Vớ i những vikhuẩn chịu nhiệt, thờ i gian ngắn hơn 5 10 phút một lần còn vi khuẩn chịu lạnh (như vi khuẩnlao) thì 10 18 giờ .

d. Ý ngh ĩa của quá trình sinh sản:

- Duy trì nòi giống giúp vi khuẩn thoát khỏi diệt vong.

- Giải thích tại sao quá trình vi sinh xảy ra nhanh chóng.

Khả năng tạo bào tử: Một số loài vi khuẩn trong điều kiện sống bất lợ i

có khả năng tạo bào tử. Khi bào tử đã già rất khó bắt màu thuốc nhuộm.

+ Bào tử là những dạng hình cầu hoặc hình bầu dục đượ c hình thành bên trong tế bào ở nhữngđiều kiện đặc biệt, có hình thái, cấu trúc khác hẳn tế bào bình thườ ng. Trong ngành vi khuẩn chỉ khoảng 1/3 số vi khuẩn trong tự nhiên có khả năng tạo bào tử khi gặp điều kiện khó khăn. ; đa số nằm trong nhóm trực khuẩn thuộc họ Bacillaceae, hai giống chính là Bacillus và Clostridium.

Trong cầu khuẩn chỉ Sarsina urea có bào tử. Trong xoắn khuẩn chỉ Spirillium và volutansdesunfovibrio (loại phẩy khuẩn phản sunfat hóa) có bào tử.

+ Quá trình hình thành bào tử bắt đầu từ sự tập trung, cô đặc tế bào chất và chất nhân ở một vùngnhất định trong tế bào gọi là vùng bào tử. Lượng nướ c tự do giảm dần, hàm lượng nướ c liên kếttăng lên. Bên ngoài vùng bào tử hình thành một lớ p vỏ rất dày bằng lipit rất khó thấm nướ c vàchất hòa tan từ ngoài vào, làm cho các quá trình sinh hóa giảm xuống mức tối thiểu và tế bào đóbiến thành bào tử. Như vậy, bào tử là một tế bào đặc biệt mà ở đó cường độ trao đổi chất là cựctiểu (minimum). Quá trình này chỉ xảy ra trong những điều kiện môi trường khó khăn: thườ ng lànhiệt độ cao. Thờ i gian có thể từ 4 đến 5 giờ hoặc kéo dài vài chục giờ .

+ Cấu trúc của bào tử:

- Ở bên ngoài là ngoại mạc cấu tạo từ lipit không thấm nướ c và các chất hòa tan.

- Vỏ trong - nội mạc chủ yếu là protein, có vai trò khi bào tử trở thành tế bào.

+ Thành phần hóa học:










- Hàm lượng nướ c: Trong bào tử không có nướ c tự do mà chỉ có nướ c liên kết nên nó có khả năng chịu nhiệt cao hơn tế bào bình thườ ng vì nướ c liên kết không làm biến tính protein dướ i tácdụng của nhiệt độ cao.

- Muối canxidipicolinat có tác dụng giữ cho bào tử có tính ổn định nhiệt cao.

+ Đặc tính của bào tử:

- Bào tử vi khuẩn có thể chịu nhiệt rất cao. Khả năng này của từng loài cũng rất khác nhau. Ví dụ: bào tử của Bacillus cereus chịu đượ c 100OC từ 2 đến 5 phút, bào tử của Bacillus subtillischịu đượ c 100OC trpng 180 phút, còn bào tử của Bacillus megaterium ở 100OC chịu đượ c 360phút. Bào tử của tất cả vi khuẩn thuộc họ Clostridium chịu đượ c 180OC trong 110 phút. Do vậy

phải vô trùng bằng sức nóng khô ở nhiệt độ 160 - 150OC trong 1 - 1, 5 giờ .

- Bào tử rất bền đối vớ i chất phóng xạ và độc tố do có ngoại mạc bảo vệ.

- Khả năng chịu khô cạn của bào tử cũng rất cao

+ Ý ngh ĩa của việc hình thành bào tử:

- Đây chính là h ình thức tự vệ giúp vi khuẩn chống chọi lại những điều kiện khắc nghiệt.

- Việc hình thành bào tử có thể coi là quá trình tiếp xúc, kết hợ p giữa các bộ phận khác nhau củatế bào tạo nên một tế bào mớ i có sức sống mãnh liệt hơn tế bào cũ.

Khả năng chuyển động: Đa số vi khuẩn có khả năng di động và di động một cách chủ động bằngcơ quan di động riêng biệt gọi là tiên mao. Một số khác di động bằng cách uốn vặn vòng vòngxoắn hoặc co bóp, phồng dẹt tế bào. Một số ít di động một cách bị động nhờ những tác động hỗnloạn trong tự nhiên.

Người ta chia nhóm di động chủ động bằng tiên mao ra các nhóm:

+ Nhóm đơn mao khuẩn (monotricha) là những vi khuẩn chỉ có một tiên mao ở đầu tế bào. Ví dụ Anphitricha có hai tiên mao ở hai đầu tế bào

+Nhóm chùm mao khuẩn (lophotricha) có một chùm tiên mao ở đầu tế bào. Ví dụ Spirilliumvolutans có hai chùm tiên mao ở hai đầu

+ Nhóm chu mao khuẩn (peritricha) gồm những vi khuẩn có các tiên mao bố trí xung quanh toànbộ tế bào. Ví dụ vi khuẩn đườ ng ruột Bacterium coli hay Clostridium.










Cấu tạo của tiên mao: Về bản chất, tiên mao là những sợ i nguyên sinh chất kéo dài ra, kích thướ cmỏng 0,01 0,05 ; dài 6 10 , có trườ ng hợ p dài gấp 20 lần kích thướ c tế bào. Sự bố trí tiên maotrên tế bào vi khuẩn ảnh hưở ng lớn đến đến tốc độ và hướng di động của vi khuẩn.

- Loại một tiên mao di động nhanh, hướ ng thẳng vớ i vận tốc 20/s, thậm chí có loài tớ i 200/s.

- Loại chùm mao khuẩn di động chậm hơn và loại chu mao khuẩn còn chậm hơn nữa và khôngcó hướ ng rõ rệt.

Chức năng của tiên mao:

Đây là cơ quan giúp cho vi khuẩn tìm kiếm môi trườ ng mớ i thích hợ p - đó là nhu cầu sinh lý phổ biến. Một số vi khuẩn có tiên mao nhưng trong môi trườ ng cũ hoặc về già tiên mao rụng đi nhưBacillus subtilis, Bacillus mesentericus, nhờ thế làm phát triển bộ máy tiếp xúc của tế bào vikhuẩn với môi trường bên ngoài và do đó tạo điều kiện cho quá trình trao đổi chất (bộ máy cànglớ n việc hấp thụ chất dinh dưỡ ng và thải các chất càng dễ dàng).

3. Vai trò và ứng dụng của vi khuẩn

- Tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất trong tự nhiên, vô cơ hóa các chất cặn bã, xử lý ônhiễm, bảo vệ môi trườ ng sinh thái.

- Sản xuất các axit hữu cơ và dung môi hữu cơ.

- Sản xuất năng lượ ng sinh học (khí thắp, nhiên liệu sinh học - "xăng xanh").

- Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao

B. QUAN SÁT NẤM MỐC

I. Đặc điểm h ình thái, sinh lý và ứng dụng của nấm mốc trong công nghiệp


- Cấu tạo: Nấm mốc là loại nấm hiển vi có cấu tạo sợ i. Có hai loại sợ i nấm: sợi có vách ngăn (đabào) và sợi không vách ngăn (đơn bào)

- Hình dạng: Đa số nấm mốc có hình sợ i phân nhánh. Khi phát triển các sợ i chằng chịt vớ i nhaulàm thành hệ sợ i nấm - gọi là khuẩn ty thể (micelium). Một số sợi sinh trưở ng bằng cách đâm sâuvào môi trườ ng gọi là khuẩn ty cơ chất. Phần khác phát triển trên bề mặt của cơ chất gọi là khuẩn










ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất có nhiệm vụ hút muối khoáng và chất dinh dưỡng để nuôi toàn bộ hệ sợ i. Khuẩn ty khí sinh có chức năng hô hấp và mang cơ quan sinh sản là bào tử.

- Kích thướ c: Sợ i nấm có đườ ng kính từ 5 - 20 m, dài cỡ cm hay hơn nữa.


- Dinh dưỡ ng: Nấm mốc thuộc loại thực vật hạ đẳng không có diệp lục. Chúng có thể sống kýsinh hoặc hoại sinh.

- Hô hấp: Đa phần nấm mốc là vi sinh vật hiếu khí.

- Sinh sản: Nấm mốc có thể sinh sản bằng nhiều phương thức:

+ sinh sản hữu tính bằng tiếp hợ p tử

+ Sinh sản sinh dưỡ ng bằng một đoạn sợ i nấm

+ Sinh sản vô tính bằng hạch và chủ yếu nhất bằng bào tử.

- Khả năng tạo bào tử: Bào tử chính là cơ quan sinh sản của nấm mốc. Có hai loại bào tử:

+ Bào tử nội sinh (bào tử nang - endospore).

+ Bào tử ngoại sinh (bào tử đính - exospore)

Sợ i nấm mang bào tử gọi là cuống bào tử. Bào tử của nấm mốc có màu sắc đặc trưng cho từngloài. Bào tử nang của Mucor, Rhizopus có màu đen.Bào tử của Aspergillus oryzae có màu vànghoa cau, Aspergillus niger - màu đen, Aspergillus usami - màu nâu, Aspergillus awamori - màunâu đen, Penicillium - màu xanh lam.

Sự hình thành bào tử của nấm mốc rất khác nhau và có tính chất đặc trưng cho từng loài.

- Khả năng chuyển động: Nấm mốc không có khả năng di động nhưng chúng phân bố rất rộngrãi trong tự nhiên chính là vì bào tử phát tán trong không khí nhờ gió.

3. Ứng dụng trong công nghiệp - Nấm mốc đóng vai tr ò quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên, vô cơ hóacác chất cặn bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trườ ng sinh thái.

- Sản xuất các axit hữu cơ

- Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao như enzim, protein, vitamin, axit amin, kháng sinh










II. Quan sát và phân biệt bốn loài nấm mốc điển h ình : Mucor, Rhizopus,

Aspergilus và Penicillium.1. Nhóm Mucor và Rhizopus

Sợ i nấm đơn bào, chúng có khả năng tạo thành bào tử nang (bào tử nội sinh). Sợ i màu trắng, bàotử nang hơi vàng.

Ở Mucor cuống của bào tử nang phân nhánh và mọc lên ở bất kỳ vị trí nào của sợ i nấm.

Ở Rhizopus cuống bào tử nang không phân nhánh, chỉ mọc lên ở những chỗ sợ i nấm ăn sâu vàomôi trườ ng, cuống bào tử mọc thành cụm ba bốn cái ở chân của cụm này có mọc ra nhiều sợ inhỏ ăn sâu vào môi trườ ng trông giống rễ bụi lúa gọi là rễ giả.

2. Nhóm Aspergilus và Penicillium

Sợ i nấm đa bào, đầu sợ i nấm mang bào tử phình to ra , tạo thành các tế bào hình chai (hay thể bình) rồi hình thành chuỗi đính bào tử (bào tử ngoại sinh).

Ở Aspergillus cuống của đính bào tử đơn bào. các tế bào hình chai và đính bào tử tỏa đều trênđầu sợ i nấm sinh sản như những tia nước đi ra đầu vòi tướ i.

Ở Penicillium cuống đính bào tử đa bào, đầu cuống phân nhánh nhiều lần thành những đốt songsong rồi mớ i hình thành đính bào tử. Các tế bào hình chai đính bào tử hướ ng lên cùng một phía

giống như cây chổi.










Hình 12: Đặc điểm hình thái của các loại nấm

Documents

Thi Nghiem VSV Hoc Dai Cuong-chinh Sua