Instructions for use

Title 生体侵襲下臓器障害と血管新生関連因子の連関の研究

Author(s) 和田, 剛志

Citation 北海道大学. 博士(医学) 乙第6929号

Issue Date 2014-09-25

DOI 10.14943/doctoral.r6929

Doc URL http://hdl.handle.net/2115/57217

Type theses (doctoral)

Note 配架番号：1682

File Information Takeshi_Wada.pdf

Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP

学 位 論 文

生体侵襲下臓器障害と血管新生関連因子の連関の研究

(Investigation of the relationship between angiogenic factors and

organ dysfunction associated with critical illness)

2014年 9 月

北 海 道 大 学

和田 剛志

目 次

I 発表論文目録および学会発表目録・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1

II 緒言・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 3

III 略語表・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 7

IV 対象と方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 8

1. 対象患者および組み入れ基準・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 8

2. 疾患定義と診断基準・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 8

3. 研究方法および測定方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 9

4. 統計・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 9

V 結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10

1. 患者背景・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10

(1) 敗血症・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10

(2) 重症外傷・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 10

(3) 心停止後症候群(post-cardiac arrest syndrome: PCAS)・・・・・・・ 11

(4) Acute lung injury(ALI)/acute respiratory distress syndrome(ARDS) 12

2. 血管新生関連因子の経時的変化・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 13

(1) VEGF・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 13

(2) sVEGFR1・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 14

(3) sVEGFR2・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 15

(4) Angiopoietin1・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 16

(5) Angiopoietin2・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 17

(6) Angiopoietin1と Angiopoietin2 の比・・・・・・・・・・・・・・ 18

(7) sTie2・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 19

小括 1・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 20

3. 臓器不全, 予後と血管新生関連因子・・・・・・・・・・・・・・・・ 21

(1) 敗血症・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 21

(2) 重症外傷・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23

(3) PCAS・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23

(4) ALI/ARDS・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 25

小括 2・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 27

VI 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 28

1. VEGF・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 28

2. sVEGFR1・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 28

3. sVEGFR2・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 29

4. Angiopoietin・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 30

5. sTie2・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 30

VII 総括・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 32

VIII 本研究の限界・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 33

IX今後の展望・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 34

X 結語・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 36

XI謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 37

XII文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 38

1

発表論文目録および学会発表目録

本研究の一部は以下の論文に発表した.

1. Wada T, Jesmin S, Gando S, Yanagida Y, Mizugaki A, Sultana SN,

Zaedi S, Yokota H.

Angiogenic factors and their soluble receptors predict organ

dysfunction and mortality in post-cardiac arrest syndrome.

Crit Care, 16, R171 (2012)

2. Wada T, Jesmin S, Gando S, Sultana SN, Zaedi S, Yokota H.

Using angiogenic factors and their soluble receptors to predict organ

dysfunction in patients with disseminated intravascular coagulation

associated with severe trauma.

Crit Care, 16, R63 (2012)

3. Wada T, Jesmin S, Gando S, Yanagida Y, Mizugaki A, Sultana SN,

Zaedi S, Yokota H.

The role of angiogenic factors and their soluble receptors in acute

lung injury (ALI)/ acute respiratory distress syndrome (ARDS)

associated with critical illness.

J Inflamm (Lond), 10, 6 (2013)

4. Jesmin S, Wada T, Gando S, Sultana SN, Zaedi S.

The dynamics of angiogenic factors and their soluble receptors in

relation to organ dysfunction in disseminated intravascular

coagulation associated with sepsis.

Inflammation, 36, 186-96 (2013)

本研究の一部は以下の学会に発表した.

1. Wada T, Jesmin S, Gando S, Sultana SN, Zaedi S, Yokota H.

Angiogenic factors and their soluble receptors in patients with DIC

2

associated with severe trauma.

32nd International Symposium on Intensive Care and Emergency

Medicine

Mar, 2012. Brussles

2. Wada T, Jesmin S, Gando S, Yanagida Y, Mizugaki A, Sultana SN,

Zaedi S, Yokota H. Angiogenic factors and their soluble receptos in

ALI/ARDS in critical illness.

25th European Society of Intensive Care Medicine Annual Congress.

Oct, 2012. Lisbon

3. Wada T, Jesmin S, Gando S, Yokota H.

Angiogenic factors and their soluble receptors predict organ

dysfunction and mortality in post-cardiac arrest syndrome (PCAS).

42th Society of Critical Care Medicine Annual Congress.

Jan, 2013. Puerto Rico

4. 和田剛志, ジェスミン・サブリナ, 小野雄一, 宮本大輔, 柳田雄一郎,

早川峰司, 澤村淳, 丸藤哲

敗血症性 DIC に合併する臓器不全と血管新生関連因子の連関

第 18 回エンドトキシン救命治療研究会 2014 年 1 月 東京

3

【緒言】

生体反応は敗血症や外傷, 虚血/再灌流などすべての生体侵襲に対して非

特異的に発現し, 侵襲に起因する生体損傷を制御かつ修復することにより

生体恒常性を維持する反応と定義される. 生体侵襲により細胞・組織傷害が

起こり臓器不全を発症するが（一次性臓器不全）, 過剰あるいは過小な生体

反応も病的生体反応として二次性臓器不全を引き起こし生体の予後を大き

く規定する. 生体反応は, 神経内分泌反応, 炎症反応, 凝固線溶反応が知ら

れ, これら三反応が複雑に連関し, 生体恒常性の維持, あるいは臓器不全発

症に深く関わっている 1 (図 1). 2000年にCouglineらは, protease-activated

receptors(PARs)が凝固線溶反応と炎症反応の橋渡し的な役割を果たしてお

り, その連関が臓器不全発症の一因となっていることを報告した 2.

敗血症, 外傷, 虚血/再灌流はいずれも炎症反応が非特異的に亢進し外因

系凝固反応が活性化され , 播種性血管内凝固症候群 (disseminated

intravascular coagulation: DIC)を合併する. DIC では凝固炎症反応が相乗

的に作用して臓器不全を惹起し症例の予後を規定するが, 血管透過性亢進

による capillary leak syndrome がその病態の一つとして知られている .

Capillary leakに重要な役割を果たすのが血管新生関連因子である. 血管透

過性亢進は, 生体恒常性維持のため組織修復・細胞増殖に関与する因子を血

管外に漏出させる , あるいは組織低酸素に対して新たな血管を新生する ,

という生理的反応として捉えることが可能で, 悪性腫瘍や循環器領域にお

いて血管新生関連因子に関する研究が進んだ . 血管新生関連因子は主に ,

血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor: VEGF)と VEGF

receptor(VEGFR)が関与する情報伝達系, Angiopoietin(Ang)/Tie2 情報伝達

系が知られている.

VEGF は血管内皮細胞, 肺上皮, 血小板などで合成され放出される糖タ

ンパクであり, 膜貫通型受容体である VEGFR1, VEGFR2 に主に結合し血

管透過性亢進, 血管新生に深く関与する 3,4. VEGFR1 は血管内皮細胞と単

球上に発現しており, 虚血や炎症状態下において主に血管透過性を亢進さ

せる作用を持つ. 一方, VEGFR2 は血管内皮細胞上に特異的に発現してお

り, 主に内皮の増殖や生存 , 透過性亢進や病的血管新生に関与している 5

(図 2).

Ang/Tie2 系は, 血管新生だけでなく VEGF 系とともに内皮の炎症調節に

も重要な役割を果たしており, 多臓器障害に関与する経路として知られて

いる 6,7 (図 3). Ang1は Tie2に結合し血管内皮細胞を安定化させ血管透過性,

4

炎症, 凝固関連の遺伝子発現を抑制する 7-9. 一方 Ang2は Ang1の作用に拮

抗し, 血管透過性を亢進させ炎症反応を惹起する 10. 内皮細胞にとっては

Ang1, Ang2 は作動薬-拮抗薬の関係にあり, Ang1 と Ang2 の比が血管内皮

細胞の活性化状態をよく反映しているとする報告も散見される 11,12. さら

に VEGF が血管内皮細胞上の Tie2 を切断することで soluble Tie2 (sTie2)

が生成され, Ang の情報伝達を阻害するといった VEGF 系と Ang 系の相互

作用の報告も興味深い 13(図 4).

以上のことを踏まえ, 本研究では以下の検討を行った.

1. 救急集中治療領域において三大侵襲とされる, 敗血症, 重症外傷, 全身

性虚血 / 再灌流障害である心停止後症候群 (post-cardiac arrest

syndrome: PCAS)における血管新生関連因子とその可溶性受容体の経

時的変化について.

2. 三大侵襲に合併する臓器不全の中で高頻度に認められる急性肺障害

(acute lung injury: ALI), 急性呼吸窮迫症候群 (acute respiratory

distress syndrome: ARDS)における血管新生関連因子の役割について.

3. 三大侵襲における血管新生関連因子と DIC 発症および臓器不全の関連

について.

和田剛志 . Thrombosis Medicine, 2014 1)より改変引用

図 1 生体侵襲と生体反応

5

Takahashi H, et al. Clin Sci (Lond), 2005. Shibuya M. J. Biochem, 2013 5)より改変引用

図 2 VEGF/VEGFR 情報伝達系

VEGFが VEGFR1, VEGFR2に結合すると FAK, PI3K, Srcなどの様々な

蛋白が活性化され, 細胞遊走, 血管透過性亢進, 血管新生, 細胞増殖などが

起こる.

van Meurs M, et al. Crit Care, 2009 6)より改変引用

図 3 Ang/Tie2 情報伝達系

Ang1 は Tie2 に結合することにより , NFκB を介した抗炎症作用 ,

PI3K/Akt を介した細胞生存や接着因子の発現誘導, また Rho kinese を介

6

した細胞間接着の安定化作用を持つ. 内皮細胞の Weibel-Palade body から

分泌された Ang2 は Ang1 の Tie への結合と競合し Tie2 情報伝達を阻害す

ることで, 炎症性メディエーターの細胞感受性を上昇させるなどして向炎

症作用を発揮する.

Novotny et al. SHOCK, 200913)より改変引用

図 4 VEGF/VEGFR 系と Ang/Tie2 系の相互作用

VEGF が血管内皮細胞上の Tie2 に作用し sTie2 が生成される. sTie2 は

Ang1, Ang2 に結合することで Tie2 の情報伝達を阻害する.

7

【略語表】

本文中および図中で使用した略語は以下の通りである.

ALI: acute lung injury

Ang: Angiopoietin

ANOVA: analysis of variance

APACHE: acute physiology and chronic health evaluation

ARDS: acute respiratory distress syndrome

AUC: area under the curve

β: standard partial regression coefficient

B, partial regression coefficienct

CI, confidence interval

CPR: cardio-pulmonary resuscitation

DIC: disseminated intravascular coagulation

ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay

HIF-1: hypoxia- inducible factor-1

ISS: injury severity score

ISTH: International Society on Thrombosis and Haemostasis

JAAM: Japanese Association for Acute Medicine

LPS: lipopolysaccharide

MODS: multiple organ dysfunction syndrome

PAI-1: plasminogen activator inhibitor-1

PARs: protease-activated receptors

PCAS: post-cardiac arrest syndrome

P/F: PaO2/FiO2

ROC: receiver operating characteristic

R2: coefficient of determinant

SE: standard error

SIRS: systemic inflammatory response syndrome

SOFA: sequential organ failure assessment

sVEGFR: soluble vascular endothelial growth factor receptor

sTie2: soluble Tie2

TNF-α: tumor necrosis factor-α

VEGF: vascular endothelial growth factor

VEGFR: vascular endothelial growth factor receptor

8

【対象と方法】

1. 対象患者および組み入れ基準

本研究は北海道大学病院自主臨床試験審査委員会の承認を得て行われた .

研究開始時に患者あるいは患者代諾者に研究内容に関し説明し書面による

許可を取得した.

(1) 対象患者のうち, (2)選択基準をすべて満たし, かつ(3)除外基準のいず

れにも該当しない場合を研究に組み入れた.

(1) 北海道大学病院先進急性期医療センター（救急室・集中治療室）に

入院の敗血症, 重症外傷, 心肺停止蘇生後の患者を対象とする.

(2) 選択基準

① 同意取得時において年齢が 15 歳以上, 90 歳未満の患者

② 本研究の参加にあたり十分な説明を受け , 十分な理解の上 , 患者

本人または患者代諾者の自由意思による文書同意が得られた患者

(3) 除外基準

①肝硬変患者

②抗凝固薬, 抗血小板薬服用中の患者

③心肺停止蘇生後においては外傷による心肺停止患者

④その他, 研究責任者が被検者として不適当と判断した患者

2003 年 5 月から 2008 年 3 月の間に基準を満たした重症外傷 50 名, 敗血

症 56 名, PCAS 52 名の患者を本研究の対象とした. また健常成人 8 名を対

照群とした.

2. 疾患定義と診断基準

全身性炎症性反応症候群 (systemic inflammatory response syndrome:

SIRS), 敗血症 (sepsis), 重症敗血症 (severe sepsis), 敗血症性ショック

(septic shock) は , American College of Chest Physicians/Society of

Critical Care Medicine Consensus Conference における定義を使用した 14.

重症外傷は, Injury Severity Score (ISS)が 9 点以上 (Abbreviated Injury

Score の少なくとも一つが 3 点以上)とした 15. PCAS は救急隊により頸動脈

が触知不能とされたのちに自己心拍が再開した患者と定義した. ALI/ARDS

は American-European Consensus Conference on ARDSの定義を用いた 16.

DIC 診断には日本救急医学会急性期 DIC 診断基準(Japanese Association

for Acute Medicine DIC criteria: JAAM DIC criteria) 17, 国際血栓止血学

会 DIC 診断基準(International Society on Thrombosis and Haemostasis

9

DIC criteria: ISTH DIC criteria)を用いた 18. 患者の疾患重症度は Acute

Physiology and Chronic Health Evaluation (APACHE) II スコア 19を, 臓

器不全重症度は Sequential Organ Failure Assessment (SOFA) スコアを

用いて評価し, 多臓器不全症候群(multiple organ dysfunction syndrome:

MODS)は SOFA スコア>12 とした 20.

3. 研究方法および測定方法

初日(救急搬入後 12時間以内), 第 3病日, 第 5病日の血液検体を動脈カテ

ーテルから採取した. 血液を速やかに 4℃, 3000rpm で遠心分離し測定に使

用するまで-80℃で凍結保存した. 血管新生関連因子の測定はすべて血清を

用い, VEGF (Quantikine; R&D systems, Inc. Human VEGF, Minneapolis,

MN, USA); soluble VEGF receptor (sVEGFR)1 (Quantikine; R&D

systems, Inc. Human sVEGF R1/Flt-1, Minneapolis, MN, USA);

sVEGFR2 (Quantikine; R&D systems, Inc. Human sVEGF

R2/KDR/Flk-1, Minneapolis, MN, USA); Ang1 (Quantikine; R&D

systems, Inc. Human Angiopoietin-1, Minneapolis, MN, USA); Ang2

(Quantikine; R&D systems, Inc. Human Angiopoietin-2, Minneapolis,

MN, USA); and soluble Tie2 receptor (sTie2) (Quantikine; R&D systems,

Inc. Human Tie-2, Minneapolis, MN, USA) の enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA)キットを使用した. 敗血症, 重症外傷にお

いては DIC 群(JAAM DIC criteria, ISTH DIC criteria)/非 DIC 群間で,

PCAS では生存群/非生存群間で, ALI/ARDS では, 非 ALI・ARDS 群/ALI

群/ARDS 群の間で比較を行った. 転帰は 28 日死亡とした.

4. 統計

統計処理は SPSS 19.0 software package (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA)

を使用した. 二群間比較はノンパラメトリック Mann-Whitney U 検定を,

三群間比較は Kruskal-Wallis 検定を使用した. カテゴリー変数の解析には

Pearson のχ2分析, あるいは Fisher の直接確率検定を用いた. 相関の解析

は Spearman 法を使用した. 多変量解析による従属変数と独立変数の解析

は, 従属変数がダミー変数である場合には多重ロジスティック回帰分析を ,

連続変数の場合は重回帰分析法のステップワイズ法を用いた. 敗血症患者

における MODS 発症および死亡, また PCAS 患者の死亡を予測するための

receiver operating characteristic curve (ROC 曲線)を作成した. 結果は平

均+標準誤差(standard error: SE)で示し, p<0.05 で有意差有りとした.

10

【結果】

1. 患者背景

(1) 敗血症

50 名の敗血症患者のうち, JAAM DIC criteria を満たしたのは 37 名であ

った. 37 名のうち 15 名は同時に ISTH DIC criteria を満たした. 3 群間で敗

血症の重症度, APACHE II スコアに有意差は認められなかったが, SOFA

score の最大値と MODS 罹患率に有意差を認めた.

表 1 敗血症の患者基本特性

表中の SOFA score max, SIRS score max, JAAM DIC score max, ISTH

DIC score max は, それぞれのスコアの研究期間中の最大値とした.

11

(2) 重症外傷

57 名の重症外傷患者のうち, JAAM DIC criteria を満たしたのは 30 名で

あった. 30 名のうち 9 名は同時に ISTH DIC criteria を満たした. 3 群間で

外傷の重症度, APACHE II スコア, 敗血症や ARDS の発症率に有意差はな

かったが, 研究期間中の SOFA スコアの最大値, 死亡率に有意差を認めた.

表 2 重症外傷の患者基本特性

表中の SOFA score max, JAAM DIC max, ISTH DIC max は, それぞれの

スコアの研究期間中の最大値とした.

12

(3) PCAS

52 名の PCAS 患者のうち 28 日生存した 23 名(生存群: survivors)と死亡

した 29 名(非生存群: non-survivors)の 2 群に群分けした. 居合わせた人に

よる心肺蘇生 (bystander cardio-pulmonary resuscitation: bystander

CPR)の有無, 初期心電図波形(initial rhythm)に 2 群間で有意差はなかった

が, APACHE II スコア, SOFA スコアの最大値, MODS 罹患率, ISTH DIC

スコア最大値に有意差を認めた.

表 3 PCAS の患者基本特性

表中の SOFA score max, ISTH DIC score maxは, それぞれのスコアの研究

期間中の最大値とした.

13

(4) ALI/ARDS

敗血症患者 50 名, 重症外傷 57 名, PCAS 患者 52 名のうち, ALI を来たし

たのは 25名, ARDSを来たしたのは 101名であった. 非 ALI・ARDS群, ALI

群, ARDS群の 3群間において APACHE IIスコア, SOFAスコアの最大値に

有意な差を認めた.

表 4 非 ALI・ARDS, ALI, ARDS の患者基本特性

表中の SOFA score max は研究期間中の SOFA スコアの最大値 , P/F

(PaO2/FiO2) ratio min は研究期間中の P/F ratio の最小値とした.

14

2. 血管新生関連因子の経時的変化

(1) VEGF

VEGF は敗血症, 重症外傷, PCAS の三侵襲すべての患者群において, 対

照群と比して有意に低値であった. 敗血症, 重症外傷の ISTH DIC 群の第 1

病日の血清 VEGF 値は非 DIC 群に比して有意に低値であった.

a. 敗血症 b. 重症外傷

c. PCAS d. ALI/ARDS

図 5.

a. 敗血症, b. 重症外傷 白, 対照群(control); 斜線, 非 DIC 群; 灰, JAAM

DIC 群; 黒, ISTH DIC 群

c. PCAS 白, 対照群; 灰, 生存群; 黒, 非生存群

d. ALI/ARDS 白 , 対照群 ; 薄灰 , 非 ALI・ARDS 群 ; 濃灰 , ALI 群 ; 黒 ,

ARDS 群

15

(2) sVEGFR1

敗血症患者における第 1病日の sVEGFR1値, 外傷患者における第 5病日

の sVEGFR1 値は, 非 DIC 群と比して ISTH DIC 群で有意に高値であった.

ALI, ARDS 群の sVEGFR1 値は, 全研究期間において非 ALI・ARDS 群に

比して有意に高値であった.

a. 敗血症 b. 重症外傷

c. PCAS d. ALI/ARDS

図 6

各棒グラフが示す患者群, +, ＊は 図 1 に同じ.

16

(3) sVEGFR2

ARDS 患者の第 1 病日の sVEGFR2 値は, 非 ALI・ARDS 患者に比して

有意に低値であった.

a. 敗血症 b. 重症外傷

c. PCAS d. ALI/ARDS

図 7

各棒グラフが示す患者群, +, ＊は 図 1 に同じ.

17

(4) Ang1

すべての侵襲, および ALI, ARDS 患者の血清 Ang1 値は, 研究期間全体

において対照群と比して有意に低値であった. 重症外傷の ISTH DIC 群は,

非 DIC 群に比して有意に低値であった.

a. 敗血症 b. 重症外傷

c. PCAS d. ALI/ARDS

図 8

各棒グラフが示す患者群, +, ＊は 図 1 に同じ.

18

(5) Ang2

敗血症患者の第 1 病日, 重症外傷患者の第 5 病日における ISTH DIC 群

の Ang2 値は, 非 DIC 群と比して有意に高値であった. PCAS においては,

生存群と対照群では有意な差は認めなかったが , 非生存群は全研究期間に

おいて, 対照群, 生存群と比して有意に高値であった. また ALI, ARDS を

来たす群は, 非 ALI・ARDS 群と比して有意に高値であった.

a. 敗血症 b. 重症外傷

c. PCAS d. ALI/ARDS

図 9

各棒グラフが示す患者群, +, ＊は 図 1 に同じ.

19

(6) Ang1 と Ang2 の比

敗血症患者の第 1 病日, 重症外傷患者の第 3, 5 病日における ISTH DIC

群は, 非DIC群と比して有意に Ang2が Ang1よりも相対的に高値であった.

PCASにおいて Ang2/Ang1 値は, 生存群と対照群では有意な差は認めなか

ったが, 非生存群は全研究期間において, 対照群, 生存群と比して有意に高

値であった. ARDS 群の Ang2/Ang1 は 非 ALI・ARDS 群と比して、全研究

期間において有意に高値であった.

a. 敗血症 b. 重症外傷

c. PCAS d. ALI/ARDS

図 10

各棒グラフが示す患者群, +, ＊は 図 1 に同じ.

Ang1 と Ang2 の比は, 敗血症においては Ang1/Ang2, 重症外傷, PCAS,

ALI/ARDS は Ang2/Ang1 で示している.

20

(7) sTie2

重症外傷において, 第 1 病日の ISTH DIC 群の sTie2 値は非 DIC 群に比

して有意に低値であった. PCAS において, 第 5 病日の死亡群の sTie2 値は

生存群と比して有意に高値であった.

a. 敗血症 b. 重症外傷

c. PCAS d. ALI/ARDS

図 11

各棒グラフが示す患者群, +, ＊は 図 1 に同じ.

21

【小括 1】

1. 敗血症, 重症外傷に合併する DIC では血清 VEGF 値は低値であった.

2. 敗血症の第 1 病日, 外傷の第 5 病日, すなわち線溶抑制型 DIC の病期に

おいて血清 sVEGFR1 は高値であった.

3. ARDS では sVEGFR2 値は低値であった.

4. PCAS は Ang/Tie2 情報伝達系の変化が顕著であった.

5. 三大侵襲すべて, また ALI/ARDS において疾患重症度が増すとともに

Ang2 上昇による Ang1 と Ang2 の不均衡が顕著となった.

以上から, VEGF/VEGFR 情報伝達系, Ang/Tie2 情報伝達系と三大生体侵

襲における DIC や臓器不全発症, 疾患重症度との関連が示唆された.

22

3. 臓器不全, 予後と血管新生関連因子との関連

(1) 敗血症

敗血症患者全体, また JAAM DICcriteria を満たす敗血症患者において

VEGF, Ang1/Ang2 と SOFA スコアの間に有意な負の相関を認めた. また

sVEGFR1, Ang2 と SOFA スコアには有意な正の相関を認めた(表 5). Ang2

は MODS 群/非 MODS 群間(a), 生存群/非生存群間(b)に有意差を認めた(図

12). 図 13 に Ang2 の MODS 発症, および死亡予測の ROC 曲線と, area

under the curve (AUC)値など統計解析結果を示す.

表 5. 血管新生関連因子と SOFA スコアの相関

研究期間中の SOFA スコアの最大値と血管新生関連因子の最大値の相関を

検討

Total patients; 敗血症患者 50 名, DIC; JAAM DIC criteria を満たした 37

名

23

図 12. MODS 群と非 MODS 群(a), 生存群と非生存群(b)における Ang2 値

Ang2 値は研究期間中の最大値を用いて解析した.

Total; 敗血症患者 50 名, DIC; JAAM DIC criteria を満たした患者 37 名

a. 白, 非 MODS 群; 灰, MODS 群

b. 白, 生存群; 灰, 非生存群

*p<0.05, **p=0.001 vs. 生存群 or 非 MODS 群

図 13. 敗血症患者の MODS発症(a)および死亡(b)予測の Ang2 の ROC 曲線

および解析結果

Ang2 は研究期間中の最大値を用いて解析した.

24

(2) 重症外傷

sVEGFR1, Ang2, Ang2/Ang1 と SOFA スコアに有意な正の相関を認めた

(表 6). 重回帰分析において, 研究期間内における sVEGFR1 と Ang2 の最

大値が SOFA スコア増加の独立した予測因子であることが示された(表 7).

表 6. 血管新生関連因子と SOFA スコアの相関

研究期間中の SOFA スコアの最大値と血管新生関連因子の最大値の相関を

検討

表 7. DIC 患者における SOFA スコア予測の重回帰分析

(3) PCAS

PCAS 患者の Ang1 値は, MODS 群, 非 MODS 群ともに対照群に比して

有意に低値であったが, MODS 群と非 MODS 群の間には有意な差は認めな

かった. MODS群の Ang2値, Ang2/Ang1比は全研究期間において, 対照群,

非MODS群と比して有意に高値であった(図 14). Ang2は SOFAスコア上昇

の独立した予測因子であることが示された (表 8). 図 15 に Ang2,

25

Ang2/Ang1の死亡予測の ROC曲線と Youden Indexを用いて測定した至適

カットオフ値, そのカットオフ値における死亡予測特性を示す.

図 14 MODS 群, 非 MODS 群間の血管新生関連因子の経時的変化

白, 対照群; 灰, 非 MODS 群; 黒, MODS 群

表 8. PCAS 患者における SOFA スコア予測の重回帰分析

26

図 15. PCAS 患者の死亡予測の Ang2, Ang2/Ang1 の ROC 曲線と死亡予測

特性

Ang2, Ang2/Ang1 は第 1 病日の値を用いて解析した.

(4) ALI/ARDS

単変量解析において p<0.1 であった因子を, ロジスティック回帰分析の

独立因子として投入し分析を行った. 研究期間内における sVEGFR2 の最

低値, および Ang2 の最大値が ALI/ARDS 発症の独立した予測因子となっ

た(表 9). また同因子は , 死亡の独立した予測因子としても抽出された (表

10).

27

表 9. ALI/ARDS 発症に関する単変量および多変量解析結果

血管新生関連因子の最大値(max)あるいは最小値(min)は, 図 5～11 を参考

に選択した.

表 10. ALI/ARDS 患者の死亡に関する単変量および多変量解析結果

血管新生関連因子の最大値(max)あるいは最小値(min)は, 図 5～11 を参考

に選択した.

28

【小括 2】

1. 敗血症

臓器不全重症度を示す SOFAスコアとVEGFの間には負の相関関係を,

sVEGFR1, Ang2 との間には正の相関関係を認めた . 特に Ang2 は

MODS 群において有意に高値であり, 研究期間中の Ang2 の最大値は

MODS 発症および死亡を高い精度で予測可能であることが示された.

2. 重症外傷

DIC 患者において, sVEGFR1 と Ang2 の研究期間中の最大値が, 臓器

不全重症度の独立した予測因子であることが示された.

3. PCAS

MODS 群では Ang2, Ang2/Ang1 が有意に高値であり, 第 1 病日の

Ang2, Ang2/Ang1 値は, 死亡を高い精度で予測可能であることが示され

た. また第 1 病日の Ang2 値は臓器不全重症度の独立した予測因子であ

った.

4. ALI/ARDS

研究期間内のAng2の最大値および sVEGFR2の最小値は, 敗血症, 重

症外傷, PCAS 患者における ALI/ARDS 発症の独立した予測因子であり,

同因子は ALI/ARDS 患者の死亡の独立した予測因子であることが示さ

れた.

以上より, 生体侵襲に合併する臓器不全には Ang2 が深く関わっており,

Ang2 値が MODS 発症および死亡を高い精度で予測できることが示唆され

た.

29

【考察】

本研究において, 血管新生関連因子, 特に Ang2 が DIC発症を通じて, 敗

血症, 重症外傷, 虚血/再灌流障害の三大生体侵襲に合併する, ARDS をはじ

めとした臓器不全発症に深く関わっており, 予後を大きく規定しているこ

とが示された.

1. VEGF

本研究結果同様, 敗血症において VEGF の低値は臓器障害を引き起こし

予後不良となるという過去の報告 21,22 がある一方で, 敗血症性ショック患

者の血漿 VEGF 値は, ショックを呈さない敗血症患者よりも高値であり,

入院時の VEGF 値は疾患の重症度と相関する, という結果も報告されてい

る 23,24. また, VEGFの過剰発現は肺水腫の発症に重要な役割を果たす半面,

ALI/ARDS 病態に対しては保護的役割を果たすという動物実験, 臨床研究

結果が示されている 25. この一致しない結果が導き出されている原因は, 測

定サンプルと sVEGFR1 値で説明可能である. 血小板は VEGF の主となる

輸送体であり , 血小板のトロンビン刺激による凝固の過程で分泌される

26,27. すなわち血清検体での測定は, DIC による血小板減少の影響を大きく

受ける可能性がある. Webb らは, VEGF 測定は血漿を使用するのが望まし

いと報告している 28. また sVEGFR1 が VEGF の測定値を見かけ上低くす

る可能性も指摘されている 28. 本研究において, VEGF の有意な低値を認め

た敗血症, 重症外傷における ISTH DIC 群の第 1 病日の sVEGFR1 が高値

の傾向を認めたことは, Webb らの指摘に一致する結果である.

VEGF は組織修復など生理的反応として捉えることも可能であるが, そ

の過剰な作用は細胞傷害的に働くため , 生体侵襲や重症病態下における

VEGF の役割に関しては意見の分かれるところである. また測定検体の種

類により測定値の解釈に違いが生じる可能性があり注意が必要である .

2. sVEGFR1

sVRGFR1 は VEGFR1 の選択的スプライシングにより産生され, VEGF

の VEGFR1 への結合を競合する, いわゆる「おとり受容体」としての機能

を持つ 24. 血管内皮細胞障害があると細胞表面上の VEGFや VEGFR1 はア

ップレギュレーションされ, 内皮細胞の再構築が促進される 29. 言い換える

30

と, sVEGFR1 の高値は VEGF が持つ血管内皮修復作用を阻害し, 疾患病態

を進行させ臓器不全を惹起するものと捉えることができる 30. さらに

sVEGFR1値は死亡率と相関し, 敗血症やその他の重症病態の疾患重症度を

示すマーカーであるとする報告もみられる 31,32. 敗血症や重症外傷で DIC

を来たす群や ALI/ARDS 群で有意に sVEGFR1 が高値であったこと ,

sVEGFR1 が重症外傷に合併する DIC 患者における臓器不全重症度の独立

した予測因子であったという結果は過去の報告結果に一致するものである.

一方 , VEGFR1 は単球 /マクロファージの遊走に重要な役割を果たし ,

sVEGFR1 の増加は抗炎症作用を持つ, という報告もあり 31,33, VEGF 同様,

重症病態下での役割に関しては意見の分かれるところである . 本研究結果

と過去の報告から, sVEGFR1 は向炎症, 抗炎症の両方の作用があるが, 過

大生体侵襲下では , 向炎症反応が抗炎症作用に打ち勝ち , 臓器不全発症に

関与していると捉えることができる. また敗血症の第 1 病日と重症外傷の

第 5 病日に同じ変化が見られた点は注目に値する. 外傷では急性期に線溶

亢進型 DIC を呈するが, その後 plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)

が上昇し, 第 4, 5 病日から線溶抑制型 DIC に変化する 34,35. 敗血症は線溶

抑制型 DIC を来たす代表的疾患として知られており , 以上の結果は

sVEGFR1 と PAI-1 など線溶を抑制する因子との密接な関係を示唆するも

のと考えられる.

sVEGFR1 は生体侵襲下においては炎症惹起の作用を持ち, PAI-1 など凝

固線溶に関与する因子とともに臓器不全発症に深く関与している可能性が

示唆される.

3. sVEGFR2

VEGFR2 は VEGF に高い親和性を持ち血管新生や組織増殖, 血管透過性

亢進に重要な役割を果たすことが知られている. sVEGFR2 は VEGFR2 が

細胞から切断された状態で存在し, sVEGFR1同様 VEGFが関与する血管新

生などの作用を調整する作用がある. しかしながら, sVEGFR2 の重症病態

への関与を示唆する過去の報告はほとんどなく , 本研究でも敗血症, 重症

外傷、PCAS に合併する DIC や臓器不全への関与は指摘されなかったが,

ALI/ARDS 発症とその予後に sVEGFR2 の低値が関与している, という興

味深い結果を得た. sVEGFR2 の低値は細胞表面から切断される VEGFR2

の減少を意味する. すなわち, 肺血管透過性亢進という VEGF/VEGFR2 の

情報伝達の増強を意味しているものと考えられる.

31

sVEGFR2の生体侵襲下での役割は明らかではないが, 肺特異的に血管透

過性亢進に関与している可能性が示唆される.

4. Ang

Ang1 は抗炎症作用を持ち血管漏出を阻害する一方, Ang2 は炎症を促進

し血管透過性を亢進させ ARDS を発症させる 36-39. さらに, Ang2 は腫瘍壊

死因子(tumor necrosis factor-α: TNF-α)やインターロイキン 6 などの炎症

性サイトカインと正の相関が認められる 39. 敗血症や重症病態患者におい

て, 血清 Ang1 の低値と Ang2 の高値, すなわち Ang1 と Ang2 の不均衡

(Ang2/Ang1 の高値)は予後不良と関連している 11,12,21,36,37,40. これらの結果

は, 生体侵襲に合併するDICの重症化とともに Ang2の値が上昇し, 臓器不

全発症や死亡に深く関わっているという本研究結果に一致するものである .

動物実験において, Ang1 投与により血管漏出が抑制され, VEGF をはじめ

とした血管透過性亢進や向炎症作用に拮抗することが報告されている 41,42.

また, ALI 患者において輸液制限により Ang2 が低値となり, 結果として血

管内皮細胞障害が軽減され病態の改善につながったとする結果も興味深い

37. 過去の複数の研究結果と本研究結果は, Ang1 投与, あるいは Ang2 抑制

による Ang1と Ang2の不均衡の是正が, 敗血症, 重症外傷, PCASに合併す

る重症炎症病態の新たな治療標的となる可能性を示唆している. また敗血

症の第 1 病日と重症外傷の第 5 病日という線溶抑制型 DIC を来たす病期に

同じ変化を認めた結果は, sVEGFR1 同様, Ang 系と凝固線溶反応の密接な

関係を示唆するものであろう.

すべての生体侵襲に合併する DIC, 臓器不全には Ang1と Ang2の不均衡

が非常に強く関与しており予後も予測可能である. その不均衡は Ang1の減

少ではなく Ang2 の過剰発現が大きく影響している.

5. sTie2

sTie2 は Tie2 細胞外ドメインのタンパク分解切断により放出される 43.

sTie2 は Ang1 と Ang2 に結合し, Tie2 の情報伝達を阻害する 44. VEGF が

Tie2を切断し sTie2を生成することが知られており, VEGFと sTie2の相関

も認められる 45. 本研究においては, 重症外傷の VEGFと sTie2の経時的変

化は同様のものであった. Yuenらは, Ang1は Ang2の約 20倍大きい親和性

を持って sTie2 に結合するので, sTie2 は Ang2 の情報伝達の影響をより大

32

きくする , と報告している 46. 本研究の外傷患者にみられる第 5 病日の

Ang2, Ang2/Ang1 の高値は sTie2 の変化の影響を受けているかもしれない.

以上より, VEGF/VEGFR 系と Ang/Tie2 系の間に密接な関係があること

が示唆される.

33

【総括】

本研究は以下を明らかにした.

1. 血清 VEGF は疾患重症度が増すにつれ低下する傾向にあるが, DIC によ

る消費性血小板減少と sVEGFR1 値の影響を受けて見かけ上低下してい

るものと捉えることができる.

2. sVEGFR2 の低値は肺特異的な VEGF/VEGFR2 系による肺血管透過性

亢進作用の減弱を反映している.

3. Ang2 の上昇, あるいは Ang2/Ang1 の上昇で捉えられる Ang1 と Ang2

の不均衡は , 救急集中治療領域で三大侵襲とされる敗血症 , 重症外傷 ,

全身性虚血/再灌流障害である PCASにおいて, DICや ARDSをはじめと

する臓器不全発症に深く関わっており, 予後不良につながっている.

4. 線溶抑制型 DIC において, sVEGFR1, Ang2 は有意に上昇する.

5. sTie2 と VEGF の変化から, VEGF/VEGFR 系と Ang/Tie2 系の間に密接

な関係の存在が示唆される.

敗血症, 重症外傷, PCAS すべてにおいて Ang2 の過剰発現が DIC や臓器

不全発症と深く関わっており予後を規定するという結果は, 「生体侵襲に対

する生体反応は非特異的に発現する」という概念を支持するものであり ,

Ang2 をはじめとする血管新生関連因子の炎症と凝固のクロストークへの

関与を支持するものである.

34

【本研究の限界】

1. 本研究では連続した患者データを収集していない.

2. 敗血症患者に対する DIC 治療薬や PCAS 患者に対する低体温療法施行

の有無など治療介入の影響を検討していない.

3. 敗血症の原因菌, 感染部位について検討していない.

4. PCAS 患者の心肺停止原因について検討していない.

1. に関しては, 単独の研究者が検体収集を行っているため , 患者選択に

バイアスは生じていないと考えている. 2, 3 に関しては追加の検討が必要か

もしれない. 4. に関しては, 心肺停止の原因としては急性冠症候群、低酸素

血症, クモ膜下出血など多様であるが , 全身性虚血/再灌流障害の侵襲は原

因疾患による侵襲をはるかに上回るものであると考える.

35

【今後の展望】

近年, 未分画ヘパリンが Tie2 と Ang1 の遺伝子発現を増加させ, Ang2 を

抑制することにより, lipopolysaccharide (LPS)による内皮細胞の透過性亢

進を改善させた, という興味深い報告がなされた 47. ヘパリンの作用はアン

チトロンビンを介していることは広く知られており , ヘパリン , アンチト

ロンビンともにグリコサミノグリカンのシンデカン 4 を受容体としている

ため, アンチトロンビンも Ang/Tie2 系に影響を与え抗炎症作用を発揮する

という新たな機序が想定される.

また, Endothelial cell protein C receptor/protease-activated recetor-1

による血管漏出抑制効果に Ang/Tie2が関与しているというというBaeらの

報告 48は, 現在新規 DIC 治療薬として注目を集め様々な研究が行われてい

る遺伝子組換え型ヒトトロンボモジュリンが PARs や Ang/Tie2 系にも影響

を与え, 抗 DIC 効果を発揮しているという可能性を引き出すものである.

DIC が臓器障害を引き起こす際に重要な役割を果たすトロンビンや

PAI-1, また VEGF や Ang などの血管新生関連因子は , 低酸素誘導因子

(hypoxia- inducible factor-1: HIF-1)により制御されるとう事実は非常に興

味深い 49. 酸素が豊富な循環血液内に存在する好中球やマクロファージは,

低酸素状態の炎症部位でその作用を発揮するための仕組みが必要であり ,

その機構が HIF-1 である. Toll-like receptors などの pattern recognition

receptors が細菌や LPS などの pathogen-associated molecular patterns

を認識すると, NFκBや MAPK 情報伝達系を介して HIF-1 の発現が刺激さ

れる. そして TNF-αをはじめとする炎症性サイトカインや VEGF などが放

出され, 炎症, 血管透過性亢進を来たす. HIF-1 の発現増強が免疫力を向上

させる一方で, HIF-1の抑制により炎症性サイトカイン産生を抑制し敗血症

臓器障害を改善させる , といった報告がみられる 50,51. これらの結果は ,

HIF-1 制御により凝固線溶異常や血管新生関連因子の異常発現が抑制され ,

敗血症のみならず, 過大生体侵襲に合併する二次的臓器障害の新たな治療

標的となる可能性を示唆するものである . しかしながら , VEGF や

sVEGFR1の生体侵襲下での反応がそうであるように, 病的と捉えられる生

体反応は裏を返せば生体恒常性維持のために起こっている反応である .

我々は生理的と病的を見分ける術を持ち合わせておらず, 治療介入が逆に

生体に悪影響をもたらす可能性も忘れてはいけない. 新たな治療標的の検

討とともに , 治療を要する適切な患者選択 , という観点も必要であると考

える.

36

以上より, 今後は以下の研究を予定している.

1. 敗血症患者におけるアンチトロンビン値と血管新生関連因子 , 特に

Ang2 との相関を確認する.

2. 敗血症患者に対するアンチトロンビン製剤 , トロンボモジュリン製剤

投与後の血管新生関連因子の変化を確認する.

3. HIF-1 を制御することで, 血管新生関連因子の過剰発現や病的凝固線

溶反応が抑制され, PCAS 患者で最も多い死亡原因である心停止後脳

障害やその他の臓器障害が軽減するという仮説を証明するために ,

PCAS ラットモデルを用いた基礎実験を行う.

4. 異なる LPS 量を投与する敗血症ラットモデルにおいて, アンチトロン

ビンやトロンボモジュリン製剤投与が与える炎症性サイトカイン , 血

管新生関連因子への影響や臓器不全抑制効果を検討する.

37

【結語】

本研究において, 血管新生関連因子がDIC発症を通じて, 敗血症, 重症外

傷, 虚血/再灌流障害の三大生体侵襲に合併する, ARDS をはじめとした臓

器不全発症に深く関わっており, 予後を大きく規定していることが示され

た. 現在まで主に敗血症治療研究において , 炎症反応あるいは凝固線溶反

応のみを対象としたものはことごとく失敗に終わった. 炎症と凝固の連関

に深く関わっている血管新生関連因子あるいはそれらの発現を調節する

HIF-1 の制御は, 生体侵襲に合併する二次的臓器障害の新たな治療標的と

なりうるものと考える.

38

【謝辞】

稿を終えるにあたり , 本研究の機会を与えてくださり , 御指導と御助言

を賜りました北海道大学大学院医学研究科侵襲制御医学講座救急医学分野

丸藤 哲教授に深く御礼申しあげます. また, 本研究にご協力いただいた筑

波大学医学医療系救急・集中治療部 ジェスミン・サブリナ博士に心より御

礼申し上げます.

なお, 本研究の一部は文部科学省科学研究費補助金の助成を受け施行し

ております.

39

【文献】

1 和田剛志 . コリン作動性抗炎症反応経路と敗血症 , 臓器不全 .

Thrombosis Medicine 4, 28-33 (2014).

2 Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated

receptors. Nature 407, 258-264, (2000).

3 Ferrara, N. Molecular and biological properties of vascular

endothelial growth factor. J. Mol. Med. 77, 527-543 (1999).

4 Takahashi, H. & Shibuya, M. The vascular endothelial growth

factor (VEGF)/VEGF receptor system and its role under

physiological and pathological conditions. Clin. Sci. (Lond). 109,

227-241, (2005).

5 Shibuya, M. Vascular endothelial growth factor and its receptor

system: physiological functions in angiogenesis and pathological

roles in various diseases. J. Biochem. 153, 13-19, (2013).

6 van Meurs, M. et al. Bench-to-bedside review: Angiopoietin

signalling in critical illness - a future target? Crit. Care. 13, 207,

(2009).

7 Fiedler, U. & Augustin, H. G. Angiopoietins: a link between

angiogenesis and inflammation. Trends Immunol. 27, 552-558,

(2006).

8 Ricciuto, D. R. et al. Angiopoietin-1 and angiopoietin-2 as

clinically informative prognostic biomarkers of morbidity and

mortality in severe sepsis. Crit. Care. Med. (2011).

9 Brindle, N. P., Saharinen, P. & Alitalo, K. Signaling and functions

of angiopoietin-1 in vascular protection. Circ. Res. 98, 1014-1023,

(2006).

10 Maisonpierre, P. C. et al. Angiopoietin-2, a natural antagonist for

Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 277, 55-60 (1997).

11 Ganter, M. T. et al. Angiopoietin-2, marker and mediator of

endothelial activation with prognostic significance early after

trauma? Ann. Surg. 247, (2008).

12 Ong, T. et al. Ratio of angiopoietin-2 to angiopoietin-1 as a

predictor of mortality in acute lung injury patients. Crit. Care.

Med. 38, 1845-1851, (2010).

40

13 Novotny, N. M. et al. Angiopoietin-1 in the treatment of ischemia

and sepsis. Shock 31, 335-341, (2009).

14 American College of Chest Physicians/Society of Critical Care

Medicine Consensus Conference: definitions for sepsis and organ

failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis.

Crit. Care. Med. 20, 864-874 (1992).

15 Civil, I. D. & Schwab, C. W. The Abbreviated Injury Scale, 1985

revision: a condensed chart for clinical use. J. Trauma. 28, 87-90

(1988).

16 Bernard, G. R. et al. The American-European Consensus

Conference on ARDS. Definitions, mechanisms, relevant outcomes,

and clinical trial coordination. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 149,

818-824 (1994).

17 Gando, S. et al. Natural history of disseminated intravascular

coagulation diagnosed based on the newly established diagnostic

criteria for critically ill patients: results of a multicenter,

prospective survey. Crit. Care. Med. 36, 145-150, (2008).

18 Taylor, F. B. J.et al. Towards definition, clinical and laboratory

criteria, and a scoring system for disseminated intravascular

coagulation. Thromb. Haemost. 86, 1327-1330, (2001).

19 Knaus, W. A., Draper, E. A., Wagner, D. P. & Zimmerman, J. E.

APACHE II: a severity of disease classification system. Crit. Care.

Med. 13, 818-829 (1985).

20 Vincent, J. L. et al. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure

Assessment) score to describe organ dysfunction/failure. On behalf

of the Working Group on Sepsis-Related Problems of the European

Society of Intensive Care Medicine. Intensive Care Med. 22,

707-710 (1996).

21 Mankhambo, L. A. et al. The role of angiogenic factors in

predicting clinical outcome in severe bacterial infection in

Malawian children. Crit. Care. 14, R91, (2010).

22 Karlsson, S. et al. Vascular endothelial growth factor in severe

sepsis and septic shock. Anesth. Analg. 106, 1820-1826, (2008).

23 Pickkers, P. et al. Vascular endothelial growth factor is increased

during the first 48 hours of human septic shock and correlates

41

with vascular permeability. Shock 24, 508-512, (2005).

24 Shapiro, N. I. et al. A prospective, observational study of soluble

FLT-1 and vascular endothelial growth factor in sepsis. Shock 29,

452-457 (2008).

25 Mura, M., dos Santos, C. C., Stewart, D. & Liu, M. Vascular

endothelial growth factor and related molecules in acute lung

injury. J. Appl. Physiol. 97, 1605-1617, (2004).

26 Verheul, H. M. et al. Platelet: transporter of vascular endothelial

growth factor. Clin. Cancer. Res. 3, 2187-2190 (1997).

27 Mohle, R. et al. Constitutive production and thrombin-induced

release of vascular endothelial growth factor by human

megakaryocytes and platelets. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94,

663-668 (1997).

28 Webb, N. J., Bottomley, M. J., Watson, C. J. & Brenchley, P. E.

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is released from

platelets during blood clotting: implications for measurement of

circulating VEGF levels in clinical disease. Clin. Sci. (Lond). 94,

395-404 (1998).

29 Vidal, F., Aragones, J., Alfranca, A. & de Landazuri, M. O.

Up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor Flt-1

after endothelial denudation: role of transcription factor Egr-1.

Blood 95, 3387-3395 (2000).

30 Alves, B. E. et al. Time-course of sFlt-1 and VEGF-A release in

neutropenic patients with sepsis and septic shock: a prospective

study. J. Transl. Med. 9, 23, (2011).

31 Yang, K. Y. et al. Plasma soluble vascular endothelial growth

factor receptor-1 levels predict outcomes of pneumonia-related

septic shock patients: a prospective observational study. Crit. Care.

15, R11, (2011).

32 Shibuya, M. Structure and dual function of vascular endothelial

growth factor receptor-1 (Flt-1). Int. J. Biochem. Cell. Bio.l 33,

409-420, (2001).

33 Yano, K. et al. Vascular endothelial growth factor is an important

determinant of sepsis morbidity and mortality. J. Exp. Med. 203,

1447-1458, (2006).

42

34 Gando, S., Sawamura, A. & Hayakawa, M. Trauma, shock, and

disseminated intravascular coagulation: lessons from the classical

literature. Ann. Surg. 254, (2011).

35 Murakami, H. et al. Disseminated intravascular coagulation (DIC)

at an early phase of trauma continuously proceeds to DIC at a late

phase of trauma. Clin. Appl. Thromb. Hemost. 18, 364-369, (2012).

36 Ricciuto, D. R. et al. Angiopoietin-1 and angiopoietin-2 as

clinically informative prognostic biomarkers of morbidity and

mortality in severe sepsis. Crit. Care. Med. 39, 702-710, (2011).

37 Calfee, C. S.et al. Plasma angiopoietin-2 in clinical acute lung

injury: prognostic and pathogenetic significance. Crit. Care. Med.

40, 1731-1737, (2012).

38 Kumpers, P. et al. Excess circulating angiopoietin-2 is a strong

predictor of mortality in critically ill medical patients. Crit. Care.

12, R147, (2008).

39 Orfanos, S. E. et al. Angiopoietin-2 is increased in severe sepsis:

correlation with inflammatory mediators. Crit. Care. Med. 35,

199-206, (2007).

40 Giuliano, J. S. J. et al. Admission angiopoietin levels in children

with septic shock. Shock 28, 650-654 (2007).

41 Thurston, G. et al. Angiopoietin-1 protects the adult vasculature

against plasma leakage. Nat. Med. 6, 460-463, (2000).

42 Alfieri, A. et al. Angiopoietin-1 variant reduces LPS-induced

microvascular dysfunction in a murine model of sepsis. Crit. Care.

16, R182, (2012).

43 Reusch, P. et al. Identification of a soluble form of the angiopoietin

receptor TIE-2 released from endothelial cells and present in

human blood. Angiogenesis 4, 123-131 (2001).

44 Findley, C. M., Cudmore, M. J., Ahmed, A. & Kontos, C. D. VEGF

induces Tie2 shedding via a phosphoinositide 3-kinase/Akt

dependent pathway to modulate Tie2 signaling. Arterioscler.

Thromb. Vasc. Biol. 27, 2619-2626, (2007).

45 van der Heijden, M., van Nieuw Amerongen, G. P., van Hinsbergh,

V. W. & Groeneveld, A. B. The interaction of soluble Tie2 with

angiopoietins and pulmonary vascular permeability in septic and

43

nonseptic critically ill patients. Shock 33, 263-268, (2010).

46 Yuan, H. T., Khankin, E. V., Karumanchi, S. A. & Parikh, S. M.

Angiopoietin 2 is a partial agonist/antagonist of Tie2 signaling in

the endothelium. Mol. Cell. Biol. 29, 2011-2022, (2009).

47 Li, X., Zheng, Z., Mao, Y. & Ma, X. Unfractionated heparin

promotes LPS-induced endothelial barrier dysfunction: a

preliminary study on the roles of angiopoietin/Tie2 axis. Thromb.

Res. 129, e223-228, (2012).

48 Bae, J. S. & Rezaie, A. R. Thrombin upregulates the

angiopoietin-Tie2 Axis: endothelial protein C receptor occupancy

prevents the thrombin mobilization of angiopoietin 2 and

P-selectin from Weibel-Palade bodies. J. Thromb. Haemost. 8,

1107-1115, (2010).

49 Pugh, C. W. & Ratcliffe, P. J. Regulation of angiogenesis by

hypoxia: role of the HIF system. Nat. Med. 9, 677-684, (2003).

50 Zinkernagel, A. S., Johnson, R. S. & Nizet, V. Hypoxia inducible

factor (HIF) function in innate immunity and infection. J. Mol.

Med. (Berl). 85, 1339-1346, (2007).

51 Yeh, C. H. et al. Anticancer agent 2-methoxyestradiol improves

survival in septic mice by reducing the production of cytokines and

nitric oxide. Shock 36, 510-516, (2011).