DỰ THẢ

O TCVN

TCVN ……

1 |9

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

DỰ THẢO

MỸ PHẨM – PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH - ĐỊNH TÍNH

TRETINOIN (RETINOIC ACID) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỚP MỎNG (TLC) VÀ SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC)

Cosmetics – Analytical methods – Identification of Tretinoin (Retinoic acid) by thin

layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC)

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN ……

2 |9

Lời nói đầu

TCVN ......được xây dựng trên cơ sở tham khảo ACM 001 - Identification of Tretinoin (Retinoic

acid) in cosmestic products by thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid

chromatography (HPLC) và thực nghiệm.

TCVN .......do Viện Kiểm nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị,

Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN ……

3 |9

T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN .......

Mỹ phẩm – Phương pháp phân tích - Định tính Tretinoin

(Retinoic acid) bằng phương pháp bằng phương pháp sắc ký

lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Cosmetics – Analytical methods – Identification of Tretinoin (Retinoic acid) by thin layer

chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC)

A ĐỊNH TÍNH TRETINOIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC)

1 Phạm vi và lĩnh vực áp dụng

Phương pháp dùng định tính tretinoin trong các sản phẩm mỹ phẩm.

2 Nguyên tắc

Tretinoin được xác định bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC).

3 Thuốc thử

Tất cả các dung môi, hóa chất, thuốc thử sử dụng đều phải đạt tiêu chuẩn phân tích, trừ khi

được nêu cụ thể.

3.1 Ethanol tuyệt đối

3.2 n- Hexan

3.3 Ether

3.4 Methanol

3.5 Cyclohexan

3.6 Aceton

3.7 Acid acetic băng

3.8 Dung môi khai triển:

Hệ A: n-Hexan – 0,33 % acid acetic trong cồn tuyệt đối (9 : 1) (tt/tt)

Hệ B: n-Hexan – aceton (6 : 4) (tt/tt)

Hệ C: Cyclohexan – ether – aceton – acid acetic (54 : 40 : 4 : 2) (tt/tt)

3.9 Thuốc thử phát hiện: Dung dịch acid phosphomolybdic 5 % trong ethanol.

3.10 Chất đối chiếu

Tretinoin, chuẩn gốc hoặc chuẩn thứ cấp. Được bảo quản ở 2 – 8 oC.

4 Thiết bị, dụng cụ

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN ……

4 |9

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1 Bản mỏng Silica gel 60 F254, kích thước 10 x 20 cm, bề dày 0,25 mm (Merck Art 5749 hay

tương đương).

4.2 Đèn soi UV, bước sóng 254 nm.

4.3 Dụng cụ phun thuốc thử.

4.4 Màng lọc PTFE, kích thước lỗ lọc 0,45 µm hoặc tương đương.

4.5 Dụng cụ tối màu

4.6 Ống ly tâm có nắp đậy, dung tích 50 ml.

4.7 Máy lắc ống nghiệm.

4.8 Giấy lọc Whatman, no 41 hoặc tương đương.

4.9 Mấy sấy để sấy bản mỏng.

4.10 Bình định mức, loại A,

4.11 Pipet thủy tinh, với các dung tích khác nhau.

4.12 Bình sắc ký.

4.13. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

4.14. Giấy nhôm

4.15. Hệ thống thổi khí nitơ

5 Cách tiến hành

Lưu ý quan trọng:

Thao tác cân và xử lý mẫu đối với chuẩn tretinoin và mẫu thử phải được tiến hành nhanh

chóng, tránh ánh sáng để giảm thiểu sự phân hủy của tretinoin.

Nếu không có sẵn các dụng cụ tối màu, có thể sử dụng giấy nhôm để bao xung quanh.

5.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn (1 mg/mL)

Cân chính xác khoảng 0,01 g tretinoin vào bình định mức 10 mL (4.10). Thêm 5 mL methanol

(3.4) , siêu âm 5 phút, điền đầy tới vạch với methanol (3.4).

5.2 Chuẩn bị dung dịch thử

5.2.1 Đối với mẫu dạng kem:

Cân chính xác khoảng 3,0 g cho vào ống ly tâm 50 ml (4.6) đã được bọc bằng giấy nhôm (4.14).

Thêm 10 ml methanol (3.4) vào ống và tiến hành lắc trong 5 min. Làm lạnh ống ly tâm (4.6)

trong nước đá trong 15 min và tiến hành lọc dung dịch trong ống qua giấy lọc Whatman (4.8).

5.2.2 Mẫu dạng nước (dung dịch và gel):

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN ……

5 |9

Cân chính xác khoảng 10,0 g mẫu thử vào trong phễu chiết; đối với mẫu thử dạng gel, thêm 5

ml nước để hòa tan, tiến hành chiết với 50 ml n-Hexan (3.2), rửa dịch chiết n-Hexan với 10 ml

nước. Thổi khô lớp n-hexan đến khô bằng khí nitơ (4.15) ở nhiệt độ phòng. Hòa tan cắn thu

được với 1 ml methanol (3.4) và lọc qua màng lọc PTFE (4.4).

5.3 Thực hiện

5.3.1 Bão hòa bình sắc ký (4.12) với dung môi khai triển (3.8).

Đối với mẫu thử dạng kem, sử dụng hệ dung môi A (3.8). Nếu phát hiện được tretinoin, lặp lại

thí nghiệm với hệ dung môi B (3.8).

Đối với mẫu thử dạng nước, sử dụng hệ dung môi C (3.8).

5.3.2 Chấm lên mỗi bản mỏng 5 - 30 µl của dung dịch thử và 5 µl dung dịch chuẩn.

5.3.3 Triển khai bản mỏng sắc ký khoảng 15 cm (tránh ánh sáng).

5.4 Phát hiện

5.4.1 Sau khi triển kha, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới đèn soi tử

ngoại 254 nm (4.2).

5.4.2 Phun thuốc thử phát hiện (3.9). Sấy khô bản mỏng, quan sát màu của vết nhận được.

6 Đánh giá kết quả

6.1 Tính giá trị Rf của mỗi vết quan sát được bằng công thức sau:

f

aR

b

a: khoảng cách từ tâm của vết đến vạch xuất phát.

b: khoảng cách từ đường dung môi đến vạch xuất phát.

6.2 So sánh vị trí, hình dạng và màu sắc: các vết sắc ký khi soi đèn và sau khi phun thuốc

thử của mẫu thử và mẫu chuẩn.

Hoạt chất Giá trị Rf ước tính Màu sắc của vết quan sát được sau

khi phun thuốc thử

Tretinoin

0,1 – 0,3 (Hệ A)

Khoảng 0,5 (Hệ B)

Khoảng 0,4 (Hệ C)

Màu xanh nhạt

6.4 Lưu ý

Giới hạn phát hiện (LOD) trong mẫu là 12,5 µg/g.

Thử nghiệm để xác nhận rõ hơn sẽ được thực hiện bằng phương pháp HPLC được mô tả trong

mục B.

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN ……

6 |9

B ĐỊNH TÍNH TRETINOIN TRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG (HPLC)

1 Phạm vi áp dụng

Phương pháp dùng định tính tretinoin trong các sản phẩm mỹ phẩm.

2 Nguyên tắc

Tretinoin được định tính bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector

PDA.

3 Thuốc thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng

cao hoặc có chất lượng tương đương.

3.1 Nước cất

3.2 Methanol

3.3 Acid acetic băng

3.4 Pha động: methanol – nước cất – acid acetic (85 : 15 : 0,5) (tt/tt/tt)

3.5 Chất chuẩn: Tretinoin, chuẩn gốc hoặc chuẩn thứ cấp. Được bảo quản ở trong môi trường

khí nitơ và bảo vệ tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòng.

4 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm, kèm theo:

4.1 Hệ thống sắc ký lỏng, đầu dò PDA, được trang bị bơm, bộ bơm mẫu tự động, bộ điều

nhiệt cho cột, detector và máy tính phân tích dữ liệu.

4.2 Cột phân tích: cột C18, 5 µm, 250 x 4,6 mm; hoặc tương đương.

4.3 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg, 0,01 mg.

4.4 Ống ly tâm có nắp đậy, dung tích 50 ml.

4.5 Lọ đựng mẫu cho HPLC, loại 2 ml hay tương đương (phù hợp thiết bị)

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN ……

7 |9

4.6 Màng lọc PVDF, 0,45 µm; hoặc tương đương.

5 Cách tiến hành

Lưu ý quan trọng:

Thao tác cân và xử lý mẫu đối với chuẩn tretinoin và mẫu thử phải được tiến hành nhanh

chóng và tránh ánh sáng để giảm thiểu sự phân hủy của tretinoin.

Nếu không có sẵn các dụng cụ thủy tinh tránh ánh sáng, có thể sử dụng giấy bạc để bao

xung quanh.

5.1 Dung dịch chuẩn (0,05 mg/ml).

Cân khoảng 5 mg tretinoin (3.5), chính xác đến 0,01 mg vào bình định mức dung tích 100 ml.

Thêm 50 ml methanol (3.2), siêu âm 5 min. Điền đầy đến vạch bằng methanol (3.2).

Dung dịch này phải được pha mới và sử dụng trong vòng 24 giờ.

5.2 Chuẩn bị dung dịch thử

5.2.1 Đối với sản phẩm dạng dung dịch

Lọc dung dịch mẫu thử qua màng lọc 0,45 µm vào trong vial màu nâu, loại bỏ một vài ml dung

dịch đầu tiên. Dung dịch lọc được để tiêm vào HPLC.

5.2.2 Đối với sản phẩm dạng kem

Cân khoảng 1,000 g mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg cho vào ống ly tâm có nắp đập dung tích

50 ml (4.5) đã được bọc giấy nhôm tránh ánh sáng. Thêm 10 ml methanol (3.2) lắc xoáy trong

5 phút. Làm lạnh trong nước đá 15 phút. Lọc dung dịch qua màng lọc PVDF 0,45 µm (4.6)

5.3 Điều kiện sắc ký

– Pha động: methanol – nước cất – acid acetic (85 : 15 : 0,5) (tt/tt/tt)

– Nhiệt độ buồng cột: 30 C.

– Tốc độ dòng: 1,4 ml/phút

– Detector PDA bước sóng phát hiện 353 nm.

– Khoảng bước sóng: 200 – 500 nm.

– Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN ……

8 |9

– Thời gian sắc ký: 30 phút.

5.4 Tương thích hệ thống: Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn đối chiếu, RSD của diện tích và thời gian

lưu của pic chính phải nhỏ hơn 2 %.

5.5 Tiêm 20 µl cho mỗi dung dịch chuẩn, dung dịch thử, ghi nhận sắc ký đồ và phổ.

6 Đánh giá kết quả

6.1 So sánh thời gian lưu và phổ UV (200 – 500 nm) của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.

6.2 Mẫu thử được xem là dương tính khi xuất hiện pic của dung dịch thử có thời gian lưu khác

biệt không quá 2 % so với thời gian lưu của pic tretinoin tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch

chuẩn. Phổ UV của pic tương ứng trong dung dịch thử phải tương thích với phổ UV của pic

tretinoin trong dung dịch chuẩn. Thời gian lưu của tretinoin khoảng 12 phút.

7 Lưu ý

Giới hạn phát hiện (LOD) là 2 µg/g.

Phương pháp này có thể sử dụng để định tính Isotretinoin (dạng 13-cis của retinoic acid).

Tretinoin hay còn gọi là Retinoic acid hay dạng acid của Vitamin A được liệt kê trong Phụ lục II –

Danh mục các chất không được có trong thành phần mỹ phẩm.

8. Kết luận

Kết quả thu được từ phương pháp TLC và HPLC được dùng để xác định sự hiện diện của

tretionin trong các sản phẩm mỹ phẩm.

Hình 1. Sắc kí đồ và thông tin pic của tretionin

DỰ THẢ

O TCVN

TCVN ……

9 |9

Tài liệu tham khảo

[1]. ACM 001 Modified and approved after the final review in Singapore on November 30th

to

December 2nd

, 2005; updated on 21st June 2019.