7/30/2019 Tojs fehrji

1/13

A tojsfehrje s a srgja pH-ja

A friss tojsfehrje pH-ja 7,6-8,5 kztti rtk. (Brooks s Taylor, 1955; Heath, 1975, 1977;Romanoff s Romanoff, 1949; Sharp s Powell, 1931). Trols kzben a hjas tojsban a fehrje pH-jaa hmrsklettel arnyosan maximum kb. 9,7 rtkre n (Heath, 1977; Sharp s Powell, 1931). Hromnapon t tart 3 C-on val (37 F) trols utn Sharp s Powell (1931) a fehrje pH-jt 9,18-nak

tallta. 3-35 C kztt (37-77 F) 21 napig trolva, a fehrje pH-ja a trolsi hmrsklettlfggetlenl 9,4 krli rtk lett.Heath (1977) megfigyelte, ha a hjas tojs beolajozsval a szn-dioxidvesztst

megakadlyoztk, a tojsfehrje 8,3-as pH-ja 7 napon t tart 22 C-on (72 F) val trols utn nemvltozott. Az olajjal bevont tojsokat 7 C-on (45 F) trolva a fehrje pH-ja ht nap mlva 8,3-rl8,1-re esett vissza. Hickson s mtsai. (1982) kimutattk, hogy a tojsfehrje pH-ja jelents tnyez atojsfehrje 80 C-on (176 F) trtn hkezelse sorn keletkez glek reolgiai tulajdonsgainakszablyozsban.

A fehrje pH-jnak emelkedst a tojshj prusain keresztl trtn szn-dioxidvesztsokozza. A fehrje pH-ja az oldott szn-dioxid, a bikarbont-ionok, a karbont-ionok s a fehrje kztfennll egyenslytl fgg. A bikarbont- s a karbont-ionok koncentrcijt a kls krnyezetbenlv szn-dioxid parcilis nyomsa szablyozza (Brooks s Pace, 1938). A 6.5 tblzat bemutatja a

szn-dioxid szzalkos mennyisgnek hatst a pH-ra, a bikarbont- s a karbont-ionokkoncentrcijra gz halmazllapot krnyezetben. Ha a krnyezet szn-dioxid koncentrcija n, abikarbont-ionok koncentrcija is n, mivel a karbont koncentrcija cskken.

A frissen lerakott tojs srgjnak pH-ja ltalban 6,0 krli rtk, azonban trols kzben atojsok pH-ja fokozatosan 6,4 s 6,9 kz emelkedik (Sharp s Powell, 1931; Brooks s Taylor, 1955).2 C s 37 C (36 F s 95 F) trolsi hmrskleten a srgja kb. 50 illetve 18 nap mlva rte el a6,4-es pH rtket (Sharp s Powell, 1931).

A TOJSFEHRJE FEHRJI

A tojsfehrje egy ovomucin rostokbl ll fehrjerendszer, amely szmos globulris fehrjttartalmaz vizes oldatban helyezkedik el. A tojsfehrje fehrjit s azok jellemzit a 6.6. tblzatmutatja be, aminosav-sszettelket pedig a 6.7. tblzat tartalmazza. Legfontosabb fehrjknek azovalbumint, a konalbumint (ovotranszferrin), az ovomukoidot, a lizozimet, a globulinokat, azovomucint tekintjk. A hg s a sr tojsfehrje-rteg fehrje sszettele elssorban ovomucintartalmban tr el egymstl (Forsythe s Foster, 1949; Lanni s mtsai., 1949); a sr fehrje kb.ngyszer annyi ovomucint tartalmaz, mint a hg fehrje (Brooks s Hale, 1961).

A tojsfehrje f fehrjefrakciinak elklntse s megtiszttsa ammnium-szulft fokozatoshozzadsval (Warner, 1954), majd karboxi-metil-cellulz (CMC) s dietil-amino-etil-cellulz(DEAE) alkalmazsval ioncserl mdszerrel trtnt (Mandeles, 1960; Rhodes, Azari, s Feeney,1958). Szmos elektroforzises mdszert alkalmaztak a tojsfehrje fehrjefrakciinak jellemzsre.Longsworth s mtsai., (1940) tovbb Forsythe s Foster (1949) a tojsfehrje fehrjit az

elektroforzis mozg hatrfelleti mdszervel ht f cscsra bontottk fel, tartalmazva az A1 s A2ovalbumint, a G2 s G3 globulint, az ovomukoidot s a konalbumint. Evans s Bandemer (1956)paprelektroforzist alkalmazott, s ovalbumin, ovomukoid egytt az ovoglobulinokkal, konalbumin slizozim svokat klntett el. Lush (1961), Stevens (1961), tovbb Feeney s mtsai., (1963)kemnyt-gl elektroforzist hasznltak, s a tojsfehrje fehrjit nem kevesebb, mint 19 svravlasztottk szt. A svok szmnak vltozatossgt a klnbz fajtkbl s beltenysztettvonalakbl szrmaz tojsfehrje esetben a genetikai polimorfizmusnak tulajdontottk (Feeney smtsai., 1963). Klnsen a globulinok esetben tapasztaltk a genetikai szablyozottsgot.Poliakrilamid disc-gl elektroforzissel a tojsfehrje fehrjit 12 svra lehetett sztvlasztani (Chang,Powrie, s Fennema, 1970A; Galyean s Cotterill, 1979; Matsuda, Watanabe, s Sato, 1981).

A tojsfehrjben lv fehrjkrl sszefoglal cikkeket rtak: Baker (1968), Burley sVadehra (1989), Feeney (1964), Froning (1988), Li-Chan s Nakai (1989), Osuga s Feeney (1974,

1977), Parkinson (1966), Robinson (1972), Vadehra s Nath (1973), tovbb Warner (1954).

6.5. TBLZAT: A szn-dioxid tartalom hatsa gz halmazllapot krnyezetben a pH-ra, atojsfehrjben lv bikarbont- s a karbont-ionok koncentrcijra 25 C-on (77 F)

1

7/30/2019 Tojs fehrji

2/13

A CO2 %-osmennyisge akrnyezetben

A tojsfehrje pH-ja Koncentrci g/l

Bikarbont Karbont

0,03 (leveg) 9,61 0,0205 0,0104

1 8,43 0,0448 0,0015

3 7,99 0,0490 0,0006

5 7,78 0,0505 0,0004

10 7,50 0,0528 0,0002

97 6,55 0.0580 --

Forrs: Brooks s Pace (1938).

Ovalbumin

Az ovalbumin, a tojsfehrjben lv meghatroz fehrje, a foszfortartalm glikoproteincsoportba tartozik, mivel a polipeptidhez sznhidrt s foszft rszek kapcsoldnak. A tyk ovalbumin385 aminosavbl ll teljes aminosav sorrendjt Nisbet s mtsai., (1981) hatroztk meg. Az N-terminlis aminosav acetillt glicin, a C-terminlis aminosav pedig prolin. A polipeptidlncmolekulatmege 43 699.

Az ovalbumin ammnium-szulfttal vagy ntrium-szulfttal trtn frakcionlssal (Warners Weber, 1951; Warner, 1954) s kromatogrfival (Mandeles, 1960; Rhodes, Azari s Feeney, 1958)llthat el. A kb. 45 000 molekulatmeg tiszttott ovalbumint hrom, foszfortartalmukban eltrA1, A2, s A3 alkotrsz pti fel (Cann, 1949; Longsworth, Cannan, s Maclnnes, 1940; Perlman,

1952). Az ovalbumin A1, A2, s A3 molekulnknt rendre kett, egy s nulla foszft csoportottartalmaz, s a tojsfehrje frakciban relatv arnyuk kb. 85:12:3. A kt foszft csoport a 68. szm sa 344. szm szerinhez kapcsoldik (Nisbet s mtsai, 1981), a foszforillds felismersi helyt pedigSer-X-Glu-nak hatroztk meg (Henderson s mtsai., 1981).

Az ovalbumin az egyetlen a tojsfehrje fehrji kzl, amelyben szabad szulfhidril-csoportfordul el. Minden egyes ovalbumin molekula ngy szulfhidril-csoportot tartalmaz, amelybl hrom anatv, a negyedik pedig a denaturlt fehrjben reakciba lp a p-klr-higany-benzottal (Feeney,1964; Fernandez-Diez, Osuga, s Feeney, 1964; MacDonnell, Silva, s Feeney, 1951). Fothergill sFothergill (1970) azt tapasztalta, hogy a ngy szulfhidril-csoporton kvl az ovalbumin egy diszulfidcsoportot is tartalmaz molekulnknt.

Az egyetlen sznhidrt rsz a 292. szm aszparagin szrmazkon keresztl kapcsoldik apolipeptid lnchoz (Lee s Montgomery, 1962; Nisbet s mtsai., 1981). A sznhidrt rsz

molekulatmege 1 560 s 1 580 kztt van (Lee, Wu, s Montgomery, 1964; Montgomery, Lee, sWu, 1965), tovbb kt N-acetil-glkzamin egysg magjbl s ngy mannz egysgbl, valamintugyanennek a cukornak vltoz szm tovbbi szrmazkaibl ll (Conchie s Strachan, 1978; Tai smtsai, 1977).

Az oldatban lv ovalbumin, ha j felsznnel rintkezik (pl. rzskor) knnyen denaturldiks koagull, ellenll azonban a h hatsra trtn denaturldssal szemben (Warner, 1954).Lineweaver s mtsai. (1967), szerint a tojsfehrjt pH 9-nl 62 C-ra (143,6 F) 3,5 percig melegtve,csak az ovalbumin 3-5%-a alakult t, mg ugyanennek a fehrjnek elhanyagolhat mennyisgealakult t, ha a tojsfehrjt pH 7-nl melegtettk. A melegtett ovalbumin oldat konformcirarzkeny amid I s amid III vonalainak Raman spektrum eltoldsa jelezte a -rtegek kialakulst ahre bekvetkez aggregldsi esemnyek sorn. (Clark, Saunderson s Suggett, 1981; Painter sKoenig, 1976). A tojsfehrje albumin hrzkenysgt Chang, Powrie s Fennema (1970A), Ma s

Holme (1982) s Matsuda, Watanabe s Sato (1981) vizsglta. Hatta, Kitabatake s Doi (1986) s Dois mtsai., (1989) lltottak fel mechanizmusokat az tltsz illetve a turbid (zavaros) glekkpzdsre.

2

7/30/2019 Tojs fehrji

3/13

Smith (1964) s Smith s Back (1965) szmoltak be elszr arrl, hogy az ovalbumint S-ovalbuminn, egy hhatsra stabilabb fehrjv alaktottk t a tojs trolsa sorn. Az talaktstmegelzte a tojsok olajjal val bevonsa (Vadehra s Nath, 1973). A natv ovalbumin, az S-ovalbumin s egy kztes anyag denaturldsi hmrsklete DSC-vel (Differential ScanningCalorimetry) mrve (Donovan s Mapes, 1976) rendre 84,5 C, 92,5 C s 88,5 C, (184 F, 199 F, s191 F) volt. Kurisakai s mtsai. (1982) arra kvetkeztettek, hogy mivel a friss s a trolt ovalbuminelektroforetikus s az ioncserl kromatogrfis viselkedse kztt nem volt klnbsg, az S-ovalbumin megnvekedett hstabilitst nem lehet a nett negatv tlts nvekedsvel magyarzni.Nakamura, Hirai s Takemori (1980), tovbb Nakamura, Takemori s Shitamori (1981) azonbanszlelt csekly klnbsget a kt fehrje DEAE-cellulz kimossi mintban, az izoelektromosfkuszlsban s a titrlsi grbe viselkedsben. Arrl szmoltak be, hogy kt karboxil-csoport,amely nem volt titrlhat az ovalbuminban, reaktvv vlt az S-ovalbuminban, a fehrjemolekula teljesdenaturldsa nlkl. Kato s mtsai. (1986) a tojsfehrje 35 C-on (95 F) kt htig tart trolsasorn 10%-os amidcskkenst mrtek az aszparaginban s a glutaminban, amelyrl azt feltteleztk,hogy megfelel hrom karboxil szrmazk kialakulsnak az ovalbuminS-ovalbumin talakulssorn.

Smith s Back (1965) azt vetette fel, hogy a szulfhidrildiszulfid talakulsnak szerepe lehetaz ovalbuminS-ovalbumin tmenetben. Nakamura s Ishimaru (1981) a bels viszkozits s a

Stokes-rdiusz cskkensrl szmolt be. Ezeket a vltozsokat gy rtelmeztk, hogy a molekulktmrsge nagyobb a trolt tojsfehrjben lv S-ovalbuminban, mint az ovalbuminban. A szondvalvagy sztvlasztsi mdszerekkel mrt hidrofb viselkeds az S-ovalbumin molekuln ersebbenhidrofb felsznt mutatott. Mivel a molekula alakjnak s a fellet hidrofb tulajdonsgnak ezeket avltozsait nem mutattk ki a trols korai szakaszaiban, feltteleztk, hogy az ovalbuminnak a DSC-vel szlelt kztes anyagg val talakulsa tkrzdtt csak vissza a felszni tlts vltozsaiban, mga ksbbi, az intermedierbl az S-ovalbuminn val talakuls volt felels az alakvltozsrt s afelszn hidrofb viselkedsrt.

Az S-ovalbumin hdenaturldssal szemben megnvekedett stabilitsnak fontoskvetkezmnyei lehetnek a hvel elidzett gleseds jellemzire a trolt tojsfehrjben. Shitamori,Kojima, s Nakamura (1984) arrl szmoltak be, hogy br a glkpzds pH-jellemzi nemklnbznek, a glerssg ovalbuminnal sszehasonltva gyengbb volt, mind az S-ovalbumin, mind

az intermedier esetben minden vizsglt melegtsi hmrskleten. Psztz elektronmikroszkposfelvtelek egy finomabb hromdimenzis hlzatot mutatnak az ovalbumin glekben. Feltteleztk,hogy ez az ovalbumin denaturlds alatti knnyebb aggregldsval fgg ssze (Painter s Koenig,1976).

3

7/30/2019 Tojs fehrji

4/13

Konalbumin (Ovotranszferrin)

A konalbumin s az ovotranszferrin szinonim fogalmak. A konalbumin, egy glikoprotein,knnyen elkszthet ammonium-szulfttal val szakaszos kicsapssal vagy az ovalbuminblkivlasztva, addig rzatva a fehrjeoldatot, amg az ovalbumin koagulldik (Azari s Baugh, 1967;

Warner, 1954).A konalbumin tiszttsra kromatogrfis eljrsokat is kifejlesztettek (Al-Mashikhi sNakai, 1987; Antonini, 1977; Azari s Baugh, 1967; Rhodes, Azari s Feeney, 1958).Longsworth s mtsai. (1940) a konalbumint egyszer fehrjnek gondoltk, de amikor a

frakcit kemnytgl-elektroforzissel megvizsgltk, kt forma vlt nyilvnvalv krlbell 4:1arnyban (Clark, Osuga s Feeney, 1963; Feeney s mtsai., 1963). Rhodes, Bennett s Feeney (1958)tojsfehrjbl kt konalbumin frakcit klntett el ioncserl kromatogrfival. A krlbell 76 000molekulatmeg s 6 pI rtk (6.6. tblzat) konalbumin nem tartalmaz foszfor vagy szabadszulfhidril-csoportot. Tizent diszulfidhd segt megtartani a molekult ktlebenyes szerkezetben a hdrgi ltal sszekapcsolva, ahogy a rntgen diffrakcis vizsglatok 5 felbontsnl mutatjk (Abolas mtsai., 1982).

Williams (1962A, B) kimutatta, hogy a csirke vrszrumban lv konalbumin s transzferrinfehrje rsze azonos, de a sznhidrt kiegszt rszek klnbzk. Az ovotranszferrinben a sznhidrt

tlnyom rsze egy oligoszaccharid lnc formjban van jelen a C-terminlis domnben, amely ngymannz szrmazkot s nyolc N-acetil-glkzamint tartalmaz. Arrl, hogy az ovotranszferrinsokflesge a sznhidrt rsz sszettelben vagy a fehrjhez val kapcsoldsi pontjnakvltozatossgban rejlik, fajok kztt s fajon bell (Graham s Williams, 1975; Iwase s Hotta, 1977;Wagner s Regnier, 1982) szmoltak be.

A konalbumin hrzkenyebb, mint az ovalbumin, de a felszni denaturldsra kevsbhajlamos (Warner, 1954). Cunningham s Lineweaver (1965) kimutatta, hogy a konalbuminnakfoszft-bikarbont pufferben 1%-os szintnl van a legkisebb hstabilitsa kzel 6-os pH-nl. Ha 10perc alatt 57 C-ra (134,6 F) melegtik, kb. 40%-a alakul t. Ha a konalbumin oldatot pH 9-re lltjkbe, s ugyanilyen krlmnyek kztt melegtik, a fehrje jelentsen nem vltozik meg. Atojsfehrjben lv konalbumin hstabilitsa hasonl volt a pufferben lv tiszttott konalbuminhoz(Chang, Powrie, s Fennema, 1970B; Cunningham s Lineweaver, 1965; Seideman, Cotterill, s Funk,

1963). A konalbumin hstabilitsa azonban megnvekedett, ha a fehrjt a srgjval sszekevertk(Chang, Powrie s Fennema, 1970A; Torten s Eisenberg, 1982; Woodward s Cotterill, 1983).

Alderton, Ward, s Fevold (1946) bebizonytotta, hogy a kett s hrom vegyrtk fmionokersen ktdnek a konalbuminhoz. Warner s Weber (1953), valamint Wishnia s Warner (1961)felvetettk, hogy a vas a fehrje hrom fenolos hidroxil-csoportjhoz tovbb egy karbont-ionhozktdik; valsznleg kt nitrogn csoport is kzremkdik a keltkpzdsben (Windle s mtsai.,1963). Magmgneses rezonancia tanulmnyok jelzik a tirozin, a hisztidin, s az arginin szrmazkokklcsnhatst a fmes s az anion ktsben. (Alsadi, Williams s Woodworth, 1981).Fehrjemolekulnknt kt atom Fe (III), Al (III), Cu (II) s Zn (II) 6-os pH fltt stabil komplexetalkot a konalbuminnal (Feeney, 1964). Ezeknek a komplexeknek a szne rendre vrs, szntelen, srgas szntelen. A konalbuminnak a fmionokkal alkotott komplexei ellenllk a hdenaturldssal s a

fehrjebont reakcikkal szemben (Azari s Feeney, 1958, 1961; Cunningham s Lineweaver, 1965;Williams, 1975). A konalbumin vasmegkt kpessgt teszik felelss mikrobal tevkenysgrt(Bezkorovainy, 1981; Valenti s mtsai., 1983).

4

7/30/2019 Tojs fehrji

5/13

Ovomukoid

Az ovomukoid egy hll glikoprotein, amely gy kszthet, hogy elszr triklr-ecetsavval3,5-s pH-nl kicsapatjuk a tojsfehrjben lv egyb fehrjket, majd acetonnal csapadkkalaktjuk az ovomukoidot (Lineweaver s Murray, 1947; Melamed, 1966). Az ovomukoid oldatblammnium-szulfttal val telts utn csapathat ki (Warner, 1954). A tovbbi tiszttsra

kromatogrfis mdszereket is kifejlesztettek. (Kato s mtsai., 1987; Waheed s Salahuddin, 1975).Az ovomukoid molekulatmege krlbell 28 000, izoelektromos pontja kb. 4,1 (6.6.tblzat). Az aminosav-sszettelbl hinyz triptofnt kritriumknt javasoltk annakmegerstsre, hogy az ovomukoid ksztmnyek nem szennyezettek a tojsfehrje ms fehrjivel,pl. ovalbuminnal vagy konalbuminnal, amelyek viszont gazdagok triptofnban (Robinson, 1972). Apolipeptidlnc 26% -hlix szerkezetbl, 46% -szerkezetbl, 10% -kanyar szerkezetbl (-turns) s18% rendezetlen spirlbl ll (Watanabe, Tuskasa, s Sato, 1981).

Lineweaver s Murray (1947) fedezte fel, hogy az ovomukoid tripszin inhibitor. Kevesebb,mint egy molekula ovomukoid szksges egy molekula tripszin aktivitsnak 50%-kal valcskkentshez. Az ovomukoid molekula hrom egyms utn elhelyezked domnbl ll, mindegyiktnyleges vagy felttelezett reaktv hellyel a szerin protez gtlsra.Minden egyes domn ssze van ktve hrom, domnen belli diszulfid-ktssel, s gy viselkedik,

mint egy natv globulris fehrje, tmenve egy jelents denaturcis talakulson, a teljes ovomukoidmolekula lerhat az egyes talakulsok sszegeknt (Kato s mtsai., 1987). A csirke ovomukoidot azegyfej inhibitorok osztlyba soroljk, azaz minden ovomukoid molekula csak egy szerin-protez(tripszin) molekulval kapcsoldik. Ms ovomukoid molekulk lehetnek ktfejek (pl. a pulykaovomukoid) vagy hromfejek (pl. a kacsa ovomukoid), jelezve a kt vagy hrom domn ktdsta tripszinhez, a kimotripszinhez, az elasztinhoz, vagy szubtilizinhez (Laskowski s mtsai., 1989).

Montgomery (1970) szmolt be a csirke ovomukoid a sznhidrt-sszettelrl: D-galaktz1,0-1,5%; D-mannz 4,3-4,7%; 2-amino-2-deoxi-D-glkz 12,5-15,4%; szilsav 0,4-4% s sszeshexz 6-9%. Az ovomukoid legalbb 25% sznhidrtot tartalmaz, hrom oligoszaharid formjban,melyek mindegyike egy aszparagin szrmazkon keresztl kapcsoldik a polipepdidlnchoz(Montgomery s Wu, 1963).

Az ovomukoid sok ms glikoproteinhez hasonlan tbb komponensre bonthat fel

elektroforzissel vagy izoelektromos fkuszlssal. Az elektroforzis mozg hatrfelleti mdszervelaz ovomukoidnak kt formjt vlasztottk szt (Fredericq s Deutsch, 1949; Longsworth, Cannan sMacInnes, 1940). Rhodes s mtsai. (1960) oszlop kromatogrfival eltr pH rtk pufferrel hromfle, klnbz szilsav tartalm ovomukoidot vlasztottak szt. Wise s mtsai. (1964) tovbbMelamed (1967) kemnytgl-elektroforzissel hrom klnll ovomukoid svot kaptak. Beeley(1971) hrom nagyobb s kt kisebb ovomukoid fajta anioncserl kromatogrfival valsztvlasztsrl szmolt be. Izoelektromos fkuszlssal t fajtt vlasztott szt, amelyek pI-je 4,41,4,28, 4,17, 4,01 s 3,83 volt. Ezeken az ovomukoid fajtkon kvl, a triklr-ecetsavval (TCA)kicsapatott ovomukoid frakci ovoinhibitort is tartalmaz, amelyet oszlop kromatogrfival lehetmegtiszttani (Tomimatsu, Clary s Bartulovich, 1966).

A savas oldatokban az ovomukoid rendkvl ellenll a hdenaturldsnak, de lgos

tartomnyban (pH 9) 80 C-on (176 F) ez a fehrje gyorsan talakul (Lineweaver s Murray, 1947).Az ovomukoid hdenaturldsnak ismrve a tripszin gtl tevkenysg elvesztse s akimotripszinnel trtn hidrolzis sebessgnek nvekedse. Feltehetleg a heliklis szerkezet vltozikmeg a hkezels alatt.

5

7/30/2019 Tojs fehrji

6/13

Ovomucin

Az ovomucin, egy szulfttartalm glikoprotein, amely valsznleg hozzjrul a sr fehrjeglszer szerkezethez. Rugalmas rostokat kpez, melyek az elektonmikroszkpos kpen olyan 20-100 tmrj lapos hengerek formjban jelennek meg, melyeknek a magassga feleakkora a

szlessgkhz kpest (Brooks s Hale, 1959; Forsythe s Bergquest, 1951; MacDonnell, Silva sFeeney, 1951). Az ovomucin kpes meggtolni a vrusos hemagglutincit (Gottschalk s Lind, 1949;Lanni s mtsai., 1949).

A tyk tojsfehrjben kt eltr fajta ovomucin komplexrl szmoltak be. Az egyik egyoldhatatlan ovomucin, amelyik a gl frakciban vagy az egszen sr fehrjben, a msik, az oldhatovomucin, a sr fehrje folykony frakcijban vagy a hg fehrjben tallhat (Hayakawa s Sato,1977; Kato, Nakamura, s Sato, 1970). Az ovomucin komplex lert molekulatmege a sztvlasztsimdszer, a pH, az ionerssg s a redukl szer jelenlte fggvnyben vltozik (Li-Chan s Nakai,1989); az oldhat ovomucin molekulatmege a nem-denaturl s nem-redukl krlmnyek kztt5-8x106 intervallumba esik.

Az ovomucin oldatbl a tojsfehrje kt vagy hrom trfogatrsz vzzel val hgtsval (pH6-8), vagy a tojsfehrje pH-jnak 4-re cskkentsvel csapathat ki (Balla s Hoover, 1940). Az

ovomucin csapadk 7-es pH krli hg soldatokban, vagy lgos oldatokban oldhat. Az ovomucinlizozim szennyezdsnek legkisebbre cskkentse rdekben a lizozim kivonhat a tojsfehrjblizoelektromos kicsapssal 9,5-s pH mellett, 5% NaCl jelenltben (Gottschalk s Lind, 1949) vagykation cserl alkalmazsval (Tomimatsu s Donovan, 1972), az ovomucin kicsapdstmegelzen.

Sharp s mtsai. szerint (1951), az ovomucin frakci az elektroforzis mozg hatrfelletimdszervel hrom komponensre klnthet el. A vzzel kicsapatott ovomucin kemnytgl-elektroforzissel hatkonyan nem vlaszthat szt. A kemnyt glben csak egy, az ovalbuminrgiban mozg sv kpzdik (Baker s Manwell, 1962; Oades s Brown, 1965). Ha az ovomucinoldhatsgt merkapto-etanolos reduklssal megnveltk, a fehrje a papron vagy a kemnyt glennem vndorolt, de a poliakrilamid gl elektroforzis sorn egy komponensknt mozgott (Robinson sMonsey, 1964).

Az ovomucin sznhidrttartalmt legalbb 33%-nak rtk le. A szt nem vlasztott ovomucin10-12% hexzaminbl, 15% hexzbl s 2,6-8% kztti szilsavbl pl fel (Feeney, Rhodes sAnderson, 1960; Gottschalk s Lind, 1949; Odin, 1951). A Robinson s Monsey (1964) mdszervelkszlt tiszttott, merkapto-etanollal reduklt ovomucin sznhidrt sszettele a kvetkez volt: 9,3%galaktz, 1,4% mannz; 9,1% glkzamin; 4,8% galaktzamin; s 8,7% szilsav.

Az ovomucinbl kt eltr sznhidrttartalm fehrjefrakcit klntettek el. A sznhidrtbangazdag (60%) s a sznhidrtban szegny (15%) frakcit Kato s Sato (1971) F-nek illetve S-nek,Robinson s Monsey (1971) - illetve -ovomucinnak nevezte el. Robinson s Monsey (1971, 1975)azt is megllaptottk, hogy a sznhidrtban szegny ovomucin fleg N-acetil-glkzamint smannzt, mg a sznhidrtban gazdag ovomucin N-acetil-galaktzamint, szter-szulftokat sszilsavat tartalmaz. Kifejlesztettek egy spektrofotomteres mdszert a kt ovomucin tpus fehrje- s

sznhidrttartalmnak klnbsgn alapul a szimultn meghatrozsra, 280 nm s 490 nm-nl mrtka fenol-knsavval kezelt oldat abszorbancijt. (Hayakawa s mtsai., 1983). Smith s mtsai. (1974)arrl szmoltak be, hogy az ovomucinban a sznhidrt rsz ktfle ktssel van jelen. Az A-tpus O-glikozidos ktssel kapcsoldik az N-acetilgalaktzamin s a szerin vagy a treonin kztt, a B-tpuspedig amino ktssel kapcsoldik az N-acetilglkzamin s az aszparagin kztt. Azoligoszaccharidok sszettelt Kato s mtsai. (1978) vizsgltk.Az O-glikozidos ktssel kapcsoldsznhidrt rszt tartalmaz glikoproteinek sok hidrognkts ltestsre vzzel, s glkpzdsrehajlamosak (Dubois s mtsai., 1974). A sznhidrt rsz brmilyen megvltozsa a glszerkezetmegsznshez vezethet.

Az ovomucin oldatban ellenll a h hatsra bekvetkez mdosulsoknak. Cunningham sLineweaver (1965) szerint a 7,1-9,4 pH kztti ovomucin oldatoknak 2 rig tart, kb. 90 C-ra(194F) trtn melegtse sorn nem vltozik meg viszkozitsuk s optikai tereszt kpessgk. Az

ovomucin s a lizozim oldatban egymssal klcsnhatsba lphetnek s vzben oldhatatlan komplexetkpeznek (Cotterill s Winter, 1955; Hawthorne, 1950; Klotz s Walker, 1948). Lertk, hogy aklcsnhats elektrosztatikus termszet, az ovomucin terminlis szilsavszrmazknak negatvtltsei s a lizozimben lv lizil -amino csoportjainak pozitv tltsei vesznek rszt benne (Kato,

6

7/30/2019 Tojs fehrji

7/13

Imoto s Yagishita, 1975). A 7,2-10,4 pH tartomny fltt ezeknek a fehrjknek a klcsnhatsa apH nvekedsvel cskken (Dam, 1967). Cotterill s Winter (1955) megfigyeltk, hogy atojsfehrjben a komplexkpzds mrtke cskkent, ahogy a pH kzeledett a lizozim izoelektromospontjhoz (10,7).Az ovomucin irnt a legnagyobb rdekldst a sr tojsfehrje gl szerkezetnek fenntartsban, s atojsfehrje hgulsban jtszott lehetsges szerepe vltotta ki. Az ovomucin s a lizozim kztiklcsnhatsok is szerepet jtszhattak ezekben a folyamatokban (Kato s Sato, 1972; Kato, Nakamura,s Sato, 1971; Kato, Imoto s Yagishita, 1975; Robinson, 1972; Robinson s Monsey 1972). Azonbanellentmondsos felttelezsek szlettek. A tojsfehrje hguls mechanizmusra felttelezett elmletekolyan ltalnos csoportokba sorolhatk, amelyekben a vltozs az ovomucin-lizozim klcsnhatst, azovomucinban lv diszulfid-ktst, vagy az ovomucin sznhidrogn rszt rintik. Felvetettk azovomucin komplex ms tulajdonsgainak vagy az ovalbumin fehrjnek a vltozst is.

Hawthorne (1950) gy gondolta, hogy a sr tojsfehrje hgulst, legalbbis rszben, azovomucin lizozimmal val klcsnhatsa okozza, amikor a pH szint 9 krli rtkre emelkedik, atrolsnl bekvetkezszoksos szn-dioxidveszts kzben. Feeney s mtsai. (1952) szerint a lizozimaktivitsnak 20-25%-os cskkenst a 2 C-on (35 F) val 45 napig tart trols kzben egyoldhatatlan ovomucin lizozim komplex kpzdse okozza. Msfell, Cotterill s Winter (1955) aztvetette fel, hogy a tojsfehrje hgulst a termszetesen elfordul ovomucin-lizozim komplex

mennyisgnek a cskkense okozza 9-9,5 kztti pH-nl. Hayakawa s mtsai. (1983) feltteleztk,hogy a hguls hatsai a -ovomucin ovomucin komplexbl val disszocicijnak tulajdonthatk,amelyet az -ovomucin-lizozim komplex oldhatatlann vlsa kvet. Miller, Kato s Nakai (1982)arrl szmoltak be, hogy 0,13 ionerssgnl (a tojsfehrje ionerssge 0,1) a lizozim natvovomucinnal val klcsnhatsnak mrtke csak 6% krl volt, amibl kvetkezik, hogyvalsznleg nem az ovomucin-lizozim klcsnhats az oka a tojsfehrje hgulsnak. Azovomucinban lv polipepdid lncok O-glikozid-jainak kmiai hastsa okozhatja a tojsfehrjehgulst. Tanulmnyok kimutattk, ha a tojsokat 30 C-on (122 F) 20 napig troltk, az ovomucinhexzamin s hexz tartalma 50%-kal cskken, s a szilsav az eredeti szint 12%-ra cskkent. Aglikoproteinekben lv O-glikozidosan kttt sznhidrtok, mint az ovomucin, -elimincijaelfordulhat lgos krlmnyek kztt (Kato s mtsai. 1979).

Lizozim

Alderton, Ward s Fevold (1945) szmolt be arrl, hogy a Longsworth s mtsai. (1940) ltallert G1 globulin tulajdonkppen lizozim volt, az a tojsfehrje enzim, amelynek bont hatsa van abaktriumok sejtfalra (Johnson, 1966). A lizozim Alderton, Ward s Fevold (1945) mdszervelkristlyosthat. A lizozim kt vagy hrom alkotrszbl pl fel, amelyek kation cserlkromatogrfival (Tallan s Stein, 1951, 1953) s az elektroforzis mozg hatrfelleti mdszervel(Wetter s Deutsch, 1951) sztvlaszthatk. A lizozim molekulaslya krlbell 14300, de pH 5-9kztt bekvetkezik a monomerek aggregldsa s dimereket kpeznek. (Osuga s Feeney, 1974). Alizozim szerkezett sikeresen meghatroztk. Az enzim 129 aminosav szrmazkot s ngy diszulfid-

ktst tartalmaz (Canfield, 1963; Canfield s Liu, 1965; Jolls, Jauregui-Adell, s Jolls, 1964).Szabad szulfhidril-csoportot nem talltak benne. Rntgen diffrakcis vizsglattal bepillantst nyertek amsodlagos s harmadlagos szerkezetbe (Blake s mtsai., 1967).

A lizozim (muramidz vagy mukopeptid N-acetil-muramoil-hidrolz, E.C. 3.2.1.17) egymindentt jelenlv enzim, amely kpes hidrolizlni a baktriumok sejtfalban az N-acetil-neuraminsav s az N-acetil-glkzamin kzti (1-4) ktseket, ezltal sejt felbomlst eredmnyezi (Board,1968). Bizonyos baktriumokra s vrusokra gyakorolt old hatsa szmos kutatst indtott el,amelyekben az egyes lelmiszerekben mikrobal szerknt, tovbb terpis szerknt val lehetsgesalkalmazst vizsgltk. (Banks, Board, s Sparks, 1986; Jolls s Jolls, 1984; Roberts s Kruger,1984; Tranter s Board, 1982). A sejt oldson kvl a lizozimnek sok ms hatsmechanizmustjavasoltk, belertve az alvasztst vagy a sejt aggregldst, amely a pozitv tlts lizozim molekulks a negatv tlts fehrjk vagy bakterilis sejtfelsznek kztti az elektrosztatikus klcsnhatsbl

ered, valamint a bomlstermkek immunszablyoz tevkenysgt. Beszmoltak gy a lizozim hatsostevkenysgrl a tumor sejtek (Sava s mtsai., 1986; Warren s mtsai., 1981), a fognymikroorganizmusai (Germaini s Tellefson, 1986; Iacono s mtsai., 1980, 1985A, B), a baktriumokokozta sajthibk (Carini, Mucchetti, s Neviani, 1985) s klnbz lelmiszereket mrgez

7

7/30/2019 Tojs fehrji

8/13

szervezetek ellen (Chander s mtsai., 1984; Hughey s Johnson, 1987; Hughey, Wilger s Johnson,1989; Roberts s Kruger, 1984). Ibrahim, Kato s Kobayashi (1991) szmolt be a lizozimantibakterilis hatsnak a Gram-negatv valamint a Gram-pozitv baktrium trzsekre valkiterjesztsrl, amelyek kovalens ktssel kapcsoldnak a lizozim molekula kt palmitoilszrmazkhoz.

A lizozim, mint enzim h hatsra trtn inaktivldsa a pH-tl s a hmrsklettl fgg(Cunningham s Lineweaver, 1965). Amikor a lizozimet foszft pufferben oldottk, nem trtntinaktivlds 63 C-on (145,4 F) 10 percig, ahogy a pH-t 9-re emeltk. 65 C-on (149 F) azonban azaktivits 70%-ra lecskkent a 10 perces idtartam alatt. A lizozim krlbell 50-szer rzkenyebb ahre a tojsfehrjben, mint a foszft pufferben. A 63 C-ra (145,4 F) melegtett tojsfehrjben, alizozim nagyobb mrtkben inaktivldik, ahogy a pH 7 fl emelkedett. Ezek a vltozsoknyilvnvalak a DSC termogramokban; br a lizozim a tojsfehrje fehrjinek csak 3,5%-t teszi ki,nagy denaturldsi entalpija az oka annak,hogy az endoterm hats knnyen lthatv vlik mg ateljes tojsfehrje termogramjban is(Donovan s mtsai., 1975).

Ovoglobulinok

Longsworth, Cannan, s MacInnes (1940) elektroforzis mozg hatrfelleti mdszervelbebizonytotta, hogy a globulin frakci hrom G1, G2 s G3 fehrjbl ll. A G1-et ksbb lizozimkntazonostottk, s jl jellemeztk. A G2 s G3 alkotrszt kemnytgl-elektroforzissel s ioncserlkromatogrfival klntettk el. Baker s Manwell (1962) azonostotta a G1 s G3 svok helyzett akemnytgl elektroforetogramokon. A G2 alkotrszt Feeney s mtsai. (1963) izolltk DEAE(dietil-aminoetil-) s CM (karboxi-metil-) cellulz kromatogrfival, egytt az ammnium-szulftoskicsapatssal. A G2 izoltum molekulatmege krlbell 35 000, az izoelektromos pontja pedig 5,5.

Nakamura s mtsai. (1980B) arrl szmoltak be, hogy a tojsfehrje globulin frakcijbl talkotrszt lehetett elklnteni 43%-os teltett ammnium-szulftos kiszssal, amelyet glszrs skarboxi-metil-cellulz kromatogrfia kvetett. Ez az t alkotrsz az ovomakroglobulin, a G1 s a G2tovbb kt ovoinhibitor volt. Ellenttben a msik hrom globulinnal, sem a G1 sem a G2 globulin nemfejtett ki gtl hatst a proteinzokra. Az aminosav sszettel s a sznhidrt sszettel (3,2-3,7%

hexz, 2,4-2,5% hexzamin) vizsglata, valamint a molekulatmeg jellemzi azt mutattk, hogy a G 1s G2 a glikoproteinekhez hasonlk. MacDonnell, Silva, s Feeney (1955) azt tapasztaltk, hogy ezekaz ovoglobulinok kitn habost szerek.

8

7/30/2019 Tojs fehrji

9/13

Ovoinhibitor

Matsushima (1958) szerint a tojsfehrje tartalmaz egy ovomukoidtl eltr fehrjebontenzim inhibitort is. Rhodes, Bennett, s Feeney (1960) papr-elektroforzissel bebizonytotta, hogy azovoinhibitor homogn fehrje, elhanyagolhat szilsav tartalommal. Az ovoinhibitor tiszttsa a TCA-

val kicsapatott ovomukoidbl kromatogrfival valsthat meg. (Tomimatsu, Clary, s Bartulovitch,1966). A csirke ovoinhibitor aminosavsorrendjt kzvetlen fehrje szekvenlssal hatroztk meg; ateljes fehrjetrkpet s a gnszerkezetet is meghatroztk izollt cDNS klnokbl (Scott s mtsai.,1987). Ez egy 3,5% hexzt s 2,7% hexzamint tartalmaz glikoprotein; vltozatos sznhidrtsszettelt jelzett szmos ovoinhibitor frakci anion cserl kromatogrfival val elklntse(Davis, Zahnley, s Donovan, 1969).

Az ovoinhibitor kpes gtolni a tripszint, a kimotripszint tovbb klnfle gombkbl sbaktriumokbl szrmaz protezokat (Feeney s mtsai., 1963; Matsushima, 1958; Tomimatsu, Clary,s Bartulovitch, 1966). Az ovoinhibitort 44 000-49 000-nek mrt nagy molekulatmege a fehrjebontenzimek egyik legnagyobb inhibitorv teszi. Amg az ovomukoid, s az ovoinhibitor egyarnt aszerin protez inhibitorok Kazal csaldjhoz tartozik, (Laskowski s Kato, 1980), az ovomukoidnakhrom egyms utni domnje van, amelybl kett a-tpus, egy b-tpus domn, az ovoinhibitornak

pedig hat a-tpus s egy b-tpus domnje van. Az a-tpus domnek sokasgval magyarzzk, hogyaz ovoinhibitor kpes a fehrjebont enzimek szles skljt gtolni.

Ovoglikoprotein

Ketterer (1962, 1965) izollta s jellemezte a tojsfehrjbl szrmaz glikoproteint, amelyetovoglikoproteinnek nevezett el. A tojsfehrje fehrjinek 1%-t alkotja, kalcium-foszft-glelektroforzissel lehet izollni s tiszttani. Egy 13,6% hexzt (mannz s glkz 2:1 arnyban),13,8% glkzamint s 3% szilsavat tartalmaz savas glikoprotein. Stabil glikoprotein, oldhat maradmg 100 C-on (212 F) trtn hkezels vagy triklr-ecetsavas kezels utn is. Keveset tudunk a

tojsban betlttt funkcionlis s biolgiai szereprl.

Ovoflavoprotein

A tojsfehrjben az sszes riboflavin a flavoproteinhez ktdik 1:1 arnyban (Rhodes,Bennett s Feeney, 1959). Az ovoflavoproteint nha riboflavin-kt fehrjnek vagy RBP-nek isnevezik. A riboflavin-kt fehrje f funkcija valsznleg a riboflavin tszlltsa a vrszrumbl atojsfehrjbe. Nishikimi s Yagi (1969) rmutattak, hogy a flavin mag el van temetve az apoproteinhidrofb rgijba s a riboflavin-apoprotein 4,5 s 9,0 pH rtk kztt egy lland konfigurcibanrgztett. A flavin szorosan ktdik az apoproteinhez, a komplex disszocic llandja: 10 -6 M(Winter s mtsai., 1967) vagy 7,9x10 -8 M (Becvar, 1973). Az apoprotein akkor sem veszt kt

kpessgbl, ha a fehrjeoldatot (pH 7) 15 percig 100C-on (212F) melegtettk (Rhodes, Bennett sFeeney, 1959). Papr- s kemnytgl-elektroforzis sorn a flavoprotein kiss az ovalbumin A-svjaeltt vndorolt (Baker s Manwell, 1962; Rhodes, Bennett, arid Feeney, 1959). Az apoproteinugyanazzal a sebessggel vndorolt, mint a flavoprotein kemnytgl-elektroforzis sorn. Ktapoprotein frakci, amelyet cellulz oszlopon vlasztottak szt pH 4,5 s 4,3-nl elulva,molekulnknt ht illetve nyolc foszft csoportot tartalmazott (Rhodes, Bennett, s Feeney, 1959).

Az apoprotein molekulatmege krlbell 32 000, az izoelektromos pontja pedig kb. 4,0 (6.6.tblzat). Az aminosav sorrend amino terminlisknt egy szokatlan piroglutamil szrmazkot s egyklns Gln-Gln-Glu-Glu-Gly-Glu-Glu aminosavakbl ll karboxi-terminlis sorrendet jelez(Hamazume, Mega, s Ikenaka, 1984). A fehrje egyfoszfoglikoprotein, 15% sznhidrtot tartalmaz,amely 6, 1,3, 11,2, s 0,7 relatv arnyban mannzt, galaktzt, glkzamint s szilsavat foglalmagban; molekulnknt kt sznhidrt lnc van sszekapcsolva a 36. szm s a 147. szmaszparaginnl (Hamazume, Mega s Ikenaka, 1984). A ht vagy nyolc foszfo-szerin szrmazkszorosan halmozdik a 16. aminosav szegmensnl, amely egy ersen anionos rgit eredmnyez. Aztfelttelezik, hogy ennek van szerepe a receptor felismersben (Mega s mtsai., 1986).

9

7/30/2019 Tojs fehrji

10/13

Ovomakroglobulin

Az ovomakroglobulin, amelyet elszr 18-as alkotrsznek jelltek meg, utalva relatv vndorlsra akemnytgl-elektroforzis sorn, egy glikoprotein, amelynek a molekulatmege 0,7-0,8x10 6, azizoelektromos pontja 4,5 tovbb 3,5% hexzt, 5,2% hexzamint s kevesebb, mint 0,03% szilsavat

tartalmaz (Miller s Feeney, 1966). Az ovomakroglobulin 4 alegysgbl pl fel, mindegyiknek amolekulatmege 175 000 s az alegysg prok diszulfid-ktsekkel kapcsoldnak (Kitamoto,Nakashima, s Ikai, 1982). Az ammnium-szulft nlkl izollt ksztmnyek, gtl hatst fejtenek kia tripszinre, a papainra s a termolizinre, azaz a klnfle fehrjebont enzimekre, amelyek rendre aszerin, a tiol s a fmprotezokat kpviselik (Kitamoto, Nakashima, s Ikai, 1982). Msik jellemztulajdonsga, hogy ers antign, nagyfok immun keresztreakcikat vlt ki a klnbz madrfajokkztt. (Miller s Feeney, 1964, 1966).

Cisztatin

A tiol proteinzok egyik inhibitort, mint a ficin s a papain, elszr Fossum s Whitaker izollta stiszttotta a csirke tojsfehrjbl 1968-ban. A cisztatin nevet Barrett javasolta (1981) utalva nemcsak a ficinre s a papainra kifejtett gtl tevkenysgre, hanem sok ms cisztein proteinzrabelertve a katepszin-B, -C, -H s -L-et, a kimopapaint, a papaya proteinz III-at s az aktinidint(Barrett s mtsai., 1986). A cisztatin ers komplexet alkot az ltala gtolt proteinzokkal. Adisszocici llandk a beszmolk szerint 10-8-10-12 M tartomnyba esnek.

A cisztatin a tojsfehrjben krlbell 60-80 g/ml mennyisgben tallhat (Barrett, 1981).Kt f izoelektromos forma klnthet el karboximetilpapain-szepharz affinits kromatogrfiaalkalmazsval (Anastasi s mtsai., 1983). A denaturldssal szembeni nagy stabilitst szintnalkalmazzk az elklntsi mdszer alapjul; a tojsfehrje 12-es pH-n vgzett lgos kezelse s 65C-on (149 F) vgzett hkezelse kicsapja a szennyez fehrjket; hrom izoelektromos formt (ktnagyobb komponenst 6,5 s 5,6 pI-vel s egy kisebb komponenst 7 pI-vel) lehet aztn sztvlasztani

anioncserl kromatogrfival (Turk s mtsai., 1983).Ellenttben a tojsfehrjbl izollt tbbi inhibitorral, a cisztatin egyltaln nem tartalmazsznhidrtot. A csirke tojsfehrjben lv cisztatin a cisztatinok csaldjnak II tpushoz tartozik,amelynek a molekulatmege krlbell 12 000 s szerkezetben kt diszulfid-kts tallhat (Barretts mtsai., 1986). A cirkulris dikroizmus s a szmtgpes elrejelzs azt mutatta, hogy a msodlagosszerkezet krlbell 20%-a heliklis szerkezet, a maradk pedig -szerkezet (Schwabe s mtsai.,1984).

A cisztatin C csirke tojsfehrjbl val izollsa ta, klnbz emls szvetekbl acisztatinok szupercsaldj-t izolltk s jellemeztk. A legjabb felvetsek azt valsznstik, hogybizonyos cisztatinoknak nemcsak ltalnos sejtvd szerepk van sajt proteinzuk ellenrizetlenhatsval szemben, hanem specifikus hatst is kifejtenek a vrusfertzsekrt felels vrusosproteinzokkal szemben (Barrett s mtsai., 1986). Mindez tfog folyamatos kutatshoz vezetett a

cisztatin szupercsald tagjainak szerepvel kapcsolatban, belertve a tojsfehrjben lvt is, mint atest vdelmnek rszt s a lehetsges vrus ellenes kemoterpis szert.

10

7/30/2019 Tojs fehrji

11/13

Avidin

Az avidin egy glikoprotein, amely a biotinnal kapcsoldva stabil komplexet kpez, amely nemkpes felszvdni az llatok blcsatornjbl (Green, 1975; Osuga s Feeney, 1974; Wilchek s Bayer,1990). Ez a glikoprotein ngy azonos polipeptid alegysgbl pl fel, mindegyikben 128 aminosav segy molekuln belli diszulfid-kts van a cys-4 s a cys-83 kztt. A tetramer molekulatmegt 66

000-69 000 kzttinek rtk le (Korpela, 1984) (6.6. tblzat). Az amid I rgi Raman spektrumainakvizsglata azt jelezte, hogy az avidin aminosavjainak 105%-a heliklis s 554%-a -redsszerkezet (Honzatko s Williams, 1982). Nem volt jelents klnbsg az avidin msodlagosszerkezete s a biotinnal alkotott komplexnek szerkezete kztt. Az avidint ellltottk kristlyosformban (DeLange, 1970; Green s Toms, 1970) s aminosavainak sorrendjt is meghatroztk(DeLange s Huang, 1971). A sznhidrt rsz, amely az avidin molekulatmegnek kb. 10%-t tesziki, egy egyszer lncbl ll, amely alegysgenknt ngy vagy t mannzt s hrom vagy ngy N-acetil-glkzamin szrmazkot tartalmaz, a 17. szm aszparaginhoz kapcsolva (Huang s DeLange,1971; Green, 1975; Bruch s White, 1982).

Az avidin izollsi s tiszttsi mdjhoz szoksosan tbb lpcs szksges. Ez valsznlegannak ksznhet, hogy a tojsfehrjben kis mennyisgben fordul el, s a tltsi sajtossgai(izoelektromos pontja 10) hasonlak a nagyobb mennyisgben elfordul lizozim fehrjhez. Az

avidin ellltsra lert eljrs magban foglalja az ammnium-szulfttal val kicsapatst(Pennington, Snell s Eakin, 1942), a bentoniton val abszorpcit (Fraenkel-Conrat, Snell, s Ducay,1952) s ioncserl cellulz oszlop kromatogrfit (Melamed s Green, 1963). Durance s Nakai(1988) beszmoltak a lizozim s az avidin egyidej izolcijrl kation cserl kromatogrfival,amelyet az avidin tovbbi tiszttsa kvetett karboxi-metil-cellulz kromatogrfia alkalmazsval,glszrssel vagy hidrofb klcsnhatsos kromatogrfival. Cuatrecasas s Wilchek (1968)megvalstottk a tojsfehrjbl szrmaz avidin egylpcss tiszttst affinits-kromatogrfiaalkalmazsval.

Az avidin alegysgenknt ngy biotin molekulhoz ktdik (Green, 1964). A komplexdisszocici llandja 10-15 M, s a szabadenergia vltozsa 20 kcal/mol kttt biotinra vonatkoztatva(Green, 1963). Az avidin-biotin komplex vagy ABC nagy specifikussga s affinitsa adja az alapjtaz immunksrletek rzkenysge kiterjesztsnek s a hisztokmiai lokalizcis (helymeghatroz)

mdszereknek (Bayer s Wilchek, 1980., Korpela, 1984). Az avidin-biotin komplex ellenll adenaturldsnak s a proteolzisnek. Pritchard s mtsai. (1966) kimutattk, hogy az avidin 70 C-nl(158 F) irreverzibilisen denaturldik, de a komplex 100C-ig (212F) stabil volt.

A kzelmltban azonban maradk avidin aktivitst bizonytottak ftt tojsfehrjben javtottfestkmegkt prbval, 2-(4-hidroxi-azobenol)-benzoesav alkalmazsval, vagy HABA-val(Durance, 1991). Az tlagos maradk avidin hats slt, buggyantott s ftt (2 perces) tojsfehrjbenrendre 33,71, s 40% volt. Az avidin biotinkt hatsnak hpusztulst 0,02 mlos ntrium-foszftpufferben pH 7,3-nl rtk le, a D121C (D250F) rtk 25 perc a Z rtk pedig 33 C (90 F) volt (Durances Wong, 1992). Ezzel bizonytottk, hogy a biotin-kt helyeknek nagyobb hstabilitsa, mint amireaz avidin DSC-vel meghatrozott 85 C-os denaturldsi hmrskletbl lehet kvetkeztetni(Donovan s Ross, 1973).

Az avidin, a biotinhoz fzd ers affinitsa miatt, nemcsak fiziolgiailag fontos, mintlehetsges anti-nutrient (nem felszvd anyag), hanem azt is feltteleztk, hogy mikroba-ellenes szer(Korpela, 1984). A mikroba nvekeds gtlsa nemcsak abbl eredhet, hogy az avidinhoz ktdbiotin nem hozzfrhet, hanem az avidinnak a klnbz Gram-negatv s Gram-pozitvbaktriumokhoz val ktdsi kpessgbl is (Banks, Board, s Sparks, 1986; Korpela s mtsai.,1984).

11

7/30/2019 Tojs fehrji

12/13

A TOJSSRGJA RSZECSKINEK MIKROSZERKEZETE

A tojssrgja gy rhat le, mint egy olyan komplex rendszer, amelyben vltozatos rszecskk egyfehrje oldatban (livetin) vannak szuszpendlva. A rszecskk f tpusai (1) srgja gmbk (spheres),(2) szabadon sz cseppek vagy szemcsk (granulumok), (3) idomok (profile) vagy kis srsg

lipoprotein, (LDL) s (4) mielin alakzatok. A 6.3. bra a vltozatos rszecskket tartalmaztojssrgja kis nagyts elektronmikroszkpos kpe (Chang, Powrie, s Fennema, s mtsai., 1977).A granulumok (Gr) nagy elektronsrsg rszecskeknt ltszanak, mg a kis srsg lipoproteinekkicsi, csoportban megjelen kis elektronsrsg cseppecskeknt (G1) jelennek meg. A mielinalakzatok (MF) kicsi, elektronsr testecskk formjban tnnek el.

A tojssrgja nagy rsze ers pigment megkt kpessggel rendelkezik, s jellemz r asrga szikrteg golycskk nagy arnya. A srgja trfogatnak kb. 3%-a halvnyabb, folykonyabbs fehr szikrteg-knt ismert. A fehr szikrteg a csrafolttl egy vkony jraton keresztl a srgjakzppontjig, a rejtekhelyig (latebra) terjed (Burley s Vadehra,1989).

Moran (1925) arrl szmolt be, hogy optikai mikroszkp segtsgvel 25-150 m tmrjkerek anyagrszecskk figyelhetk meg. Romanoff s Romanoff (1949) megllaptottk, hogy agmbk tmrje a srga szikrtegben sokkal nagyobb (25-150 m), mint a fehr szikrtegben (4-75

m). Grodzinski (1946) szerint a srga szikrtegben lv gmbk belsejben sok szorosan rendezettcseppecske van, mg a fehr szikrtegben csak nhny cseppecske van egy fehrje folyadkban.Bellairs (1961) fziskontraszt s elektronmikroszkpot hasznlt a fehr s a srga szikrtegben lvcseppecskk jelenltnek megerstsre. Chang (1969) sok gmbt (kb. 20 m tmrjeket) tallt afehr szikrtegben, a srga szikrtegben azonban csak nagyon keveset (kb. 40 m tmrjt).Grodzinski (1946, 1951) gy vlte, hogy a gmbk, ozmzismrk, mivel felttelezhetenmindegyiknek a felsznn flig tereszt hrtya van. A 0,16 mlos NaCl oldat bizonyult izotnisnak agmbkkel. Amikor a gmbket 0,10-0,13 mlos hipotnis soldatba tettk, vizet szvtak magukba,s ez a hrtya elszakadst eredmnyezte. Bellairs (1961) elektronmikroszkpos felvteleken hromklnbz felszn gmbt figyelt meg: lemezes kapszult (tbbrteg hrtya), egysgmembrn-szerszerkezetet, s csupasz felsznt. A gmbk tbbsge csupasz felszn.

A szikrteg golycskin vagy gmbcskin kvl a teljes srgja nagy rszecskket is

tartalmaz, amelyeket oldhatatlan szikrteg golycskknak ismernk. Az elnevezs annaktulajdonthat, hogy olyan s vagy karbamid koncentrci hatsra is oldhatatlanok maradnak, amelyfeloldja vagy sztszaktja a srgja ms szerkezeteit (Vadehra, Bam, s Burley, 1977).

A srgjban lv szabadon sz cseppek vagy szemcsk kisebbek s nagyobb szmbanfordulnak el, mint a srgja gmbcski (Bellairs, 1961). A Chang s mtsai. (1977) ltal ksztettelektronmikroszkpos felvteleken, a szemcsk kr alaknak tntek, az tmrjk a 0,3-1,6 mtartomnyba esett. A legtbb szemcse tmrje krlbell a 0,5 m-es volt. Bellairs (1961) arrlszmolt be, hogy szemcsk (lipidcseppek) tmrje kb. 2 m. Chang, Powrie, s Fennema (1977)Coulter szmllt is hasznlt a hidratlt szemcsk mret eloszlsnak becslsre, sszehasonltva amikroszkpos felvtelen ltsz rgztett, nem hidratlt szemcskvel. A hidratlt szemcsk tmrjetbbsgben 0-1,7 m kz esett, melyek kzl az 1,0-1,3 m-es rtk volt tlslyban.

Bellairs (1961) elektronmikroszkpos felvtelei azt jeleztk, hogy a szemcsknek vannak nagys kis srsg, 30-60 tmrj foltjai. Chang, Powrie, s Fennema (1977) felvetette, hogy aszemcsk elektron sr alegysgekbl plnek fel, amelyeket nagy srsg lipoprotein komplexekalkotnak. A 6.4. bra bemutat egy elektronmikroszkpos felvtelt, amelyen vzzel kimosott szemcsklthatk a plazma rszecski nlkl. Amikor Chang, Powrie, s Fennema (1977) a srgjt 0,34 mlosNaCl oldattal meghgtotta, a szemcsk rszben felszakadtak, s az elektron sr alegysgek knnyenlthatv vltak. Az izollt szemcsk 1,71 mlos NaCl-dal val kezelse utn teljes sztszakadskvetkezett be; nagy s kicsi golycskk (300-1000 ) s mielin alakzatok (560-1300 hosszsg)tovbb elektron sr anyagok vltak szemmel lthatv a mikroszkpos felvteleken. A mielinalakzatok nagy nagyts mikroszkpos felvteleken stt folytonos lemezeknek mutatkoznak,amelyekrl azt felttelezik, hogy kt molekulbl ll foszfolipid levlkk (6.5. bra). Ha aszemcsket 1,71 mlos NaCl oldatban diszpergltk, a centrifugls 2 sz s 3 leleped frakcit

eredmnyezett. Ahogy elektronmikroszkppal ltszik, az sz frakcik kis s nagy golycskkat,valamint mielin alakzatokat tartalmaztak. A III s az V frakcik tlnyomrszt sszegubancoldottfonalakbl felpl, vattaszer anyagokbl lltak, amelyekhez az elektron sr mikrorszecskkkapcsoldtak. A mikrorszecskk hozzvetlegesen kr alakak, az tmrjk kb. 100 volt. A IV

12

7/30/2019 Tojs fehrji

13/13

frakciban szmos, kis golycskkkal telehintett elektron sr anyag fordul el. Chang, Powrie, sFennema (1977) felttelezte, hogy a vattaszer anyagok fonalai foszvitin komplexek a kapcsoldmikrorszecskk pedig lipovitellinbl llnak. Radomski s Cook (1964A, B) kimutatta, hogy alipovitellinek s a foszvitin vegylnek egymssal s gy gondolta, hogy a foszvitin-lipovitellinkomplex a szemcse alapegysge.

Bellairs (1961) vette szre, a kicsi (250 tmrj) kerek idomok jelenltt a tojssrgjaelektronmikroszkpos fnykpein. Chang, Powne, s Fennema (1977) megerstette ezeknek arszecskknek a tojssrgjban val jelenltt. Ezek az idomok kis srsg lipoproteinek (LDL).Sugano s Watanabe (1961) a hidratlt LDL tmrjt . (hinyzik az adat )-nak szmolta.

(BRA HELYE)6.5. BRA: Egy mielin alakzat electronmikroszkpos kpe. Vzzel kimosott szemcsk 1,71 mlosNaCl diszperzis oldatbl szrmazik.Forrs: Chang, Powrie, s Fennema, (1977).

13