Wykład 12 Analiza toksykologiczna materiału biologicznego i próbek środowiskowych

Cele i zadania analizy toksykologicznej Wykrywanie , identyfikacja i oznaczanie ilościowe naturalnych i syntetycznych związków chemicznych

wykazujących szkodliwy wpływ lub działanie toksyczne na organizm żywy Cel ogólny

- udział w ochronie zdrowia człowieka i czystości środowiska- realizowany przez wczesne wykrywanie występowania szkodliwości chemicznych,

niebezpieczeństwa powstawania zatruć oraz wykrywania zatruć już zaistniałych

Rodzaje badań w analizie toksykologicznej

badanie jakościowe – wykrywanie i identyfikacja (informują o rodzaju szkodliwości, narażenia lub zatrucia)

badania ilościowe (pozwalają na określenie stopnia skażenia, narażenia lub ciężkości zatrucia) badanie ukierunkowane na określoną substancje lub substancję z określonej grupy badanie w kierunku poszukiwania nieznanej substancji

Dane, których dostarcza analiza toksykologiczna pozwalają na:- ustalenie przyczyny zatrucia (przyżyciowe i po śmierci)- ocenę narażenia zawodowego na substancje toksyczne (przemysł, rolnictwo)- ocenę rodzaju i intensywności zanieczyszczenia i/lub potencjalnego zagrożenia środowiska przez związki chemiczne- ocenę szkodliwości związków chemicznych i produktów je zawierających -----są wykorzystywane do celów medycznych, administracyjnych i prawnych- opracowanie metodyk, często indywidualnie dla konkretnego przypadku skażenia, narażenia lub zatrucia

Kierunki analizy toksykologicznej Analiza toksykologiczna sądowa Analiza kliniczno-toksykologiczna

- badanie materiału biologicznego do celów diagnostyki zatruć- monitorowanie stężenia trucizn w płynach ustrojowych w przebiegu leczenia zatruć

Analiza toksykologiczna środowiskowa- kontrola zanieczyszczenia środowiska ogólnego (powietrze, woda, gleba, opady, ścieki,

flora, fauna, żywność)- oznaczanie w materiałach środowiskowych stężenia zanieczyszczających je związków

chemicznych oraz produktów ich degradacji lub biotransformacji środowiskowej- kontrola chemizacji w rolnictwie: - oznaczanie pozostałości pestycydów w środowisku i płodach rolnych- określenie dynamiki zanikania pestycydów w płodach rolnych

Analiza toksykologiczna przemysłowa- ocena narażenia zawodowego na substancje toksyczne- kontrola zatruć w przemyśle

monitoring środowiska pracy (NDS, NDSCh, NDSP)oznaczanie stężeń substancji w powietrzu na stanowiskach pracy

monitoring biologiczny celem określenia biologicznych skutków narażeniaOznaczanie:

- stężenia substancji toksycznych i/lub metabolitów- produktów patologicznych powstałych w ustroju w wyniku działania substancji toksycznych

(np. HbCO przy zatruciu CO, MetHb przy związkach methemoglobinotwórczych)- poziomów niektórych związków endogennych lub aktywności enzymów (np. AchE przy

insektycydach fosforoorganicznych i karbaminianowych, stężenie ALA w moczu przy Pb) Analiza substancji toksycznych (wykrywanie, identyfikacja, oznaczanie) prowadzone:

- dla celów badawczo – naukowych, wypracowywania nowych metodyk stanowiących zabezpieczenie metodyczne toksykologii doświadczalnej

- jako badanie dowodów rzeczowycho lekio chemikalia użytkowane w przemyśle, rolnictwie, gospodarstwie domowymo żywność i napojeo przedmioty różne (opakowania po chemikaliach, odzież, strzykawki, igły)

Wykrywanie i kontrola- toksykomanii – w tym narkomanii- dopingu w sporcie- kontrola u kierowców leków ograniczających sprawność psychofizyczną

Specyfika analizy toksykologicznej Różnorodność prób do badań

- zróżnicowany materiał- materiał biologiczny – roślinny, zwierzęcy oraz ludzki- próbki środowiskowe – woda, powietrze, gleba, opady, rośliny- przedmioty użytkowe – żywność, leki, opakowania

o różny stan skupienia prób (gazowe, ciekłe, stałe)o różna budowa chemiczna substancji (zw. org. i nieorganiczne, naturalne i syntetyczne)o substancje o różnych właściwościach toksykodynamicznycho związki czyste oraz ich różne formy użytkowe (leki, pestycydy, chemikalia gospodarstwa

domowego, przemysłowe i rolnicze) Konieczność wykrywania, identyfikacji i oznaczania niewielkiej ilości substancji chemicznej w dużej

masie badanych prób Obecność w analizowanej próbie jednej lub kilku substancji toksycznych z tej samej lub różnych grup

chemicznych Występowanie w analizowanej próbie obok substancji toksycznej produktów jej biotransformacji lub

produktów rozkładu materiału biologicznego oraz produktów degradacji środowiskowej – substancje te mogą interferować w analizie. Leki oraz substancje czynne z używek (kofeina, nikotyna) mogą utrudniać analizę

Ilość materiału jest często ograniczona (brak możliwości powtórzenia oznaczeń) Czas na wykonanie może być bardzo krótki (np. diagnostyka zatruć ostrych) Konieczność odpowiedniego zabezpieczenia prób do badań na czas transportu (przed rozmyślnym

zniszczeniem lub zafałszowaniem oraz niezamierzoną pomyłką) i odpowiednio przechowywane Konieczność stosowania szkła i odczynników o wysokiej czystości (np. spektralnie czyste kwasy i

wzorce metali do AAS, rozpuszczalniki do HPLC)

Rodzaje materiału do badańZatrucia ostre przyżyciowe

Mocz Krew – krew pełna, osocze, erytrocyty Zawartość żołądka – odessana treść pokarmowa, popłuczyny, wymiociny

Zatrucie ostre śmiertelne Mocz z pęcherza Krew Tkanki i narządy wewnętrzne pobrane na sekcji zwłok

- żołądek z zawartością, jelito cienkie z zawartością, okrężnica z zawartością- wątroba i woreczek żółciowy - płuca- nerki - serce- śledziona - kości- mózg - macica, pochwa- odbytnica, pęcherz - wycinki skóry

Zatrucie przewlekłe oraz do celów monitoringu uzależnienia, narażenia zawodowego i środowiskowego mocz krew włosy, paznokcie (np. As) slina (np. kotynina, kokaina, heroina, metadon, amfetamina)

materiały dodatkowe resztki żywności leki opakowania części garderoby różne przedmioty użytkowe powietrze w miejscu zatrucia (przy zatruciach inhalacyjnych)

Zasady doboru materiału do badańRodzaj materiału do badań zalezy od rodzeju rozwiązywanego problemu (rodzaj narażenia, kierunku prowadzonych badań), stosowanych metod analitycznych

badanie ukierunkowane – materiał, w którym substancja toksyczna występuje w najwyższym stężeniu w stanie niezmienionym oraz materiał, w którym można wykryć metabolity substancji (potwierdzenie rozpoznania)

badanie w kierunku poszukiwania nieznanej substancji – różnorodny materiał pozwalający wykryć substancje z różnych grup analitycznych

do celu toksykologii przemysłowej – wg. obowiązujących norm i przepisów prawnych do celów toksykologii sądowej – wg. obowiązujących zaleceń odnośnie podziału materiału i dla

badania analitycznego, sposobu i czasu jego przechowywania do kontrekspertyzyo właściwości fizykochemiczne substancji toksycznej, skażeniao losy substancji toksycznej w organizmie lub zanieczyszczenia w środowisku

o materiał biologiczny (ludzie zwierzęta)- kinetyka wchłaniania- zdolność kumulacji- kierunki i szybkość biotransformacjio próby środowiskowe- trwałość i zdolność substancji do przemieszczania się w środowisku- degradacja środowiskowa pod wpływem warunków atmosferycznych- biotransformacja środowiskowa z udziałem bakterii, drożdży i grzybów

Podział materiału do badańZasady podziału

badania ukierunkowane – zabezpieczenie prób do:- wykrycia objętej poszukiwaniem substancji lub grupy substancji- wykonanie oznaczenia ilościowego- powtórzenia prób

badanie w kierunku poszukiwania nieznanej substancji (pełna analiza toksykologiczna) – zabezpieczenie materiału do:

- poszukiwania substancji ze wszystkich grup analitycznych- wykonania oznaczenia ilościowego z oddzielnej porcji materiału- powtórzenia prób- kontrekspertyzy

Tok postępowania w analizie toksykologicznej pobranie i przygotowanie próby do badania wykonanie prób wstępnych i testów skryningowych bezpośrednio w materiale biologicznym izolowanie wstępne (dla nielotnych trucizn organicznych) oczyszczanie, zagęszczanie podział na podgrupy wykrywanie – grupowe (jest – nie ma) i szczegółowa identyfikacja oznaczanie ilościowe (najczęściej z oddzielnej porcji materiału) ocena i interpretacja wyników

Podział analityczny trucizn na grupy trucizny lotne i gazowe nielotne trucizny organiczne (tzw. Trucizny ekstrakcyjne) trucizny metaliczne

trucizny dializujące różne o indywidualnych metodach izolowania

Metody analityczne w analizie toksykologicznejChemiczne

badania wstępne- organoleptyczne- makroskopowe i mikroskopowe- spławianie- w rurce do prażenia- na węglu- na perle boroksowej- w płomieniu- pienienia

identyfikacyjne reakcje barwne- z odczynnikiem specyficznym- z odczynnikami grupowymi

metody scriningowe- chemiczne i fizykochemiczne- biologiczne- botaniczne

Aparaturowe metody spektralne

- emisyjne- absorpcyjne (UV –VIS, IR,AAS)

metody chromatograficzne- TLC, HPLC, GC/MS

Elektroforeza Fluorymetria NMR Neuronowa analiza aktywacyjna Polarografia Metody izotopowe Elektrochemiczne (elektrody jonoselektywne) Immunologiczne

- EMIT (immunoenzymatyczne)- RIA (radioimmunologiczne)- FIA (właściwości fluorescencyjne)- HI (oparta na aglutynacji)- FRAT (oparta na wolnych rodnikach)

Analiza trucizn lotnych i gazowych Związki organiczne

- alkohole- aldehydy- ketony- estry- węglowodory alifatyczne, aromatyczne, aminowe i nitrowe pochodne węglowodorów- kwasy organiczne (np. salicylowy, mrówkowy, octowy, benzoesowy )- fenole i wielofenole- disiarczek węgla

związki nieorganiczne- tlenek węgla- fosfor

- cyjanki, żelazo – i żelazicyjanki- lotne sole niektórych metali oraz fungicydy metaloorganiczne (np. Sn- organiczne, Hg -

organiczne)

Analiza trucizn lotnych i gazowychMetody izolacji

destylacja z parą wodną (np. fenol z moczu) metody oparte na zjawisku dyfuzji

- odparowanie (izolacja etanol w metodzie Widmarka – roztwór K2Cr2O7 w H2SO4)- mikrodyfuzja (cyjanki – roztwór NaOH, chloroform - toluen)- technika „head - space”

Aeracja (wymywanie strumieniem gazu obojetnego np. izolacja CS2 z krwi)Metody identyfikacji i oznaczania

Chromatografia gazowa (+ izolacja techniką „head - space” ; detekcja – spekrometria masowa)- metoda uniwersalna w badaniach skryningowych przy poszukiwaniu nieznanej substancji

toksycznej oraz w badaniach ukierunkowanych metody spektralne metody miareczkowe (np. metoda widmarka) grupowe i specyficzne testy i reakcje chemiczne – do celów jakościowych

Nielotne trucizny organicznenielotne związki organiczne izolowane przez ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi („trucizny ekstrakcyjne”)ok. 90% wszystkich potencjalnie szkodliwych związków chemicznych

leki pestycydy chemikalia przemysłowe i stosowane w gospodarstwie domowym, kosmetyki, substancje dodawane

do żywności- związki naturalne i syntetyczne- związki zasadowe, kwaśne, obojętne i amfoteryczne

Analiza nielotnych trucizn organicznychMetody izolacji i oznaczaniaetap Materiał Czynność EfektI.Izolowanie wstępne

-sekcyjny-ekshumacyjny-żywność (tłusta)-treść żołądka (tłusta)-krew pełna-mocz patologicznyniektóre formy leków

-macerowanie kwaśnym płynem wodno-alkoholowym-oczyszczanie wyciagu

Kwaśny, wodny oczyszczony roztwór

II.Izolowanie właściwe

-z zatruć przyżyciowych-kwaśny wodny roztwór po izolacji wstępnej-niektóre formy leków

- ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi

Wyizolowanie substancji toksycznej i podział na podgrupy

Metody ekstrakcji ciecz – ciecz

- ekstrakcja eterem dietylowym ze środowiska kwaśnego (dla substancji kwaśnych i obojetnych)

- ekstrakcja chloroformem ze środowiska amoniakalnego (dla substancji zasadowych i amfoterycznych)

ciecz – ciało stałe (SPE)

Metody oznaczania metody chromatograficzne

- chromatografia cienkowarstwowa TLC- chromatografia cieczowa HPLC/MS- chromatografia gazowa GC/MS

metody instrumentalne- spektrofotometria UV i VIS- spektrofluorymetria- immunologiczne

metody chemiczne metody fizyczne metody biologiczne

Analiza trucizn metalicznych- metale- metaloidy- pary metali- związki metaloorganiczne (fungicydy SN- Hg- organiczne, tri- i tetraetylek Pb)

metody izolacji mineralizacja

- na sucho- na mokro

solubilizacja- trawienie Soluenem – VI –rzędowa sól amoniowa zmydla materiał biologiczny w

środowisku alkalicznym- maceracja w 1M buforze TRIS – trawienie enzymatyczne przy użyciu alkalicznej proteazy

metody oznaczania spekrometria atomowo – absorpcyjna AAS spektrofotometria płomieniowo – emisyjna spektrografia polarografia (Pb, Zn, Cd) metody elektrochemiczne – elektrody jonoselektywne neuronowa analiza aktywacyjna reakcje charakterystyczne dla poszczególnych metali (z odczynnikiem kompleksującym np. ditizon,

ditiokarbaminian sodu)

Trucizny dializujące substancje rozpuszczalne w wodzie

- kationy, aniony- kwasy i zasady (kwas siarkowy, azotowy, solny)- sole (szczawiany, chlorany, bromki, jodki)

metody izolacji

przechodzenie do wyciągów wodnych dializa elektrodializa

metody identyfikacji i oznaczania reakcje barwne i z odczynnikami osadowymi metody spektrofotometryczne metody elektrochemiczne

Interpretacja wyników badańWłaściwa interpretacja wyników

konieczność uwzględnienia- poziomów fizjologicznych (np. fenolu w moczu)- stężeń normalnych metali toksycznych (np. Pb, Cd)- dopuszczalnych stężeń biologicznych- stężeń terapeutycznych (leki)- stężeń toksycznych- stężeń śmiertelnych

Kontrola jakości oznaczeń zasady dobrej praktyki laboratoryjnej (DPL) walidacja metod analitycznych (wykazanie prawidłowości wyboru metody do celu, któremu służy)