Institutionen för fysik, kemi och biologi

Examenarbete

Alternativ splicing i mänsklig sjukdom

Joel Edin

Examensarbetet utfört vid IFM Biologi

Datum 31/5

LITH-IFM-G-EX--10/2325—SE

Linköpings universitet Institutionen för fysik, kemi och biologi

581 83 Linköping

2

Rapporttyp

Report category

Licentiatavhandling

Examensarbete

x C-uppsats

D-uppsats

Övrig rapport

_______________

Språk

Language

X Svenska/Swedish

Engelska/English

________________

Titel

Title

Alternativ splicing i mänsklig sjukdom

Alternative splicing in human disease

Författare

Author

Joel Edin

Sammanfattning

Abstract

Exons are the sequences in DNA that hold the code for proteins in humans and all other organisms. Introns fill the

space between exons and hold non-coding sequences and control elements. Exons from a particular gene do not

always have to be included in the final mRNA, this allows for one gene to code for more than one mRNA. Therefore

more than one protein can be created from one gene. Alternative splicing is a fast growing field and the importance of

this process in disease has become apparent. This paper reviews articles and research about many of these diseases.

New research of the importance of alternative splicing in the diseases is the focus. Diseases that are reviewed are

cystic fibrosis, inherited frontotemporal dementia, systemic lupus erythematosus, aniridia, myotonic dystrophy,

amyotrophic lateral scleros and familial dysautonomia. All these diseases have involvement of alternative splicing.

The genetic processes that affect them are different though and show that the alternative splicing of involved proteins

can affect the cell or organism in many different ways. The goal of the paper is to give a good view over current

progress of research in the field.

ISBN

__________________________________________________

ISRN

__________________________________________________

Serietitel och serienummer ISSN

Title of series, numbering

LITH-IFM-G-Ex—10/ 2325--SE

Nyckelord

Keyword

alternative splicing, splicing, alternativ splicing, ALS, demens, SLE, aniridi, familial dysautonomia, cystisk fibros,

cystic fibrosis, mutation, sjukdom

Datum

Date

31/5 - 2010

URL för elektronisk version

Avdelning, Institution

Biologi, IFM

Division, Department

Biology, IFM

3

Abstrakt ...................................................................................................................................................... 4

Introduktion: ............................................................................................................................................... 4

Metod: ........................................................................................................................................................ 7

Resultat ....................................................................................................................................................... 9

Cystisk Fibros ......................................................................................................................................... 9

CF transmembrane conductance regulator (CFTR) ................................................................................. 9

Ärftlig frontotemporal demens .............................................................................................................. 10

Microtubule-associated protein tau ....................................................................................................... 11

Systemisk lupus erythematosus............................................................................................................. 11

CD72..................................................................................................................................................... 11

Aniridi................................................................................................................................................... 12

PAX-6 ................................................................................................................................................... 12

Myotonisk dystrofi ................................................................................................................................ 12

DM protein kinase ................................................................................................................................ 14

Amyotrophic Lateral Scleros ................................................................................................................ 14

SLC1A2 ................................................................................................................................................ 15

SOD1 .................................................................................................................................................... 15

TARDBP (TDP-43) .............................................................................................................................. 16

Familial dysautonomia .......................................................................................................................... 16

IkappaB kinase complex-associated protein ......................................................................................... 17

Medicinska framsteg och alternativ splicing. ........................................................................................ 17

Diskussion ................................................................................................................................................ 18

Referenser ................................................................................................................................................. 19

4

Sammanfattning

Exoner är de sekvenser i DNA vilka rymmer koden för proteiner i människan och i alla andra

organismer. Intronerna, vilka utgör utrymmet mellan exoner, består av ickekodande sekvenser

och kontrollelement. Exoner tillhörande en gen måste inte alltid inkluderas i den slutliga mRNA

produkten, alternativ splicing tillåter exkludering av vissa sekvenser och gör att en gen kan ha

mer än en mRNA produkt, därigenom kan en gen koda för flera olika proteiner. Alternativ

splicing är ett fält som snabbt utvecklas och dess relevans för många sjukdomar har blivit

uppenbar. Detta arbete går igenom ett flertal av dessa sjukdomar för att sammanställa ny

forskning och tydliggöra rollen av alternativ splicing i dem. De sjukdomar som undersökts är

cystisk fibros, ärftlig frontotemporal dementia, systemisk lupus erythematosus, aniridi,

myotonisk dystrofi, amyotrophic lateral sclerosoch familial dysautonomia. Dessa sjukdomar har

involvering av alternativ splicing, de genetiska processerna bakom dem är dock mycket olika och

kan visa på de många sätt alternativ splicing kan påverka cell och kroppsfunktion. Målet med

arbetet är en översiktlig bild av framstegen som gjorts och vilken forskning som nu bedrivs.

Introduktion:

Splicing är förändringar av sekvenser, mer specifikt om-arangering av exoner på RNA nivå

vilket förändrar pre-mRNA till mRNA i denna process tas ickekodande regioner av baser

(introner) bort och kodande regioner(exoner) behålls. Alternativ splicing är cellens förmåga att

reglera om en exon skall tas bort eller inkluderas i en gen. Detta gör det möjligt att med samma

stycke DNA koda för flera olika proteiner(Black D. L. 2003). I varje intron finns en 5’ splicesite

och en 3’ splice region. I 3’ regionen finns tre konserverade sekvenselement: förgreningspunkten

följd av ett polypyrimidin område, och i slutet ett terminalt AG. Splicing utförs i huvudsak av

spliceosomen (vissa själv-splicande sekvenser är undantag från detta). Spliceosomen är ett stort

makromolekylkomplex vilket ansamlas vid dessa sekvenser och katalyserar splicingen.

Processen som sker vid splicing förklaras i texten och fig1 nedan.

5

Figur 1. Splicing av en intron mellan 2 exoner.

Under denna process utförs två transesterifieringssteg. Under det första steget attackerar en A

nukleotid i förgreningspunkten en fosfat i 5’ splice site. Detta leder till lösgörning av 5’ exonen

från 5’ splice-siten och i samband med detta inbindning av 5’ änden av intronen till

förgreningspunktens 2’ hydroxylgrupp. De två produkterna av detta steg, 5’ exonen och

lariatform-intronen bunden till 3’ exonen ligger kvar i spliceosomen efter detta. Nästa

transesterifieringssteg består av en attack av den fria exonens 3’ hydroxylgrupp mot fosfatet i 3’

änden av intronen. Detta steg ligerar de två exonerna och frigör intronen i lariatform (en ögla, se

fig1).

Samma process kan utföras mellan splicing-siter i olika närliggande introner vilket leder till att

exonerna mellan dessa följer med de borttagna intronerna (Fig.2). Nya splicing-siter kan

uppkomma genom mutation och även förändring av balans mellan tvåsplicing varianter kan

påverkas av mutationer.

6

Figur 2. Exempel på alternativ splicing, i detta fall exkludering av exon “b” som följd

av användning av en 5’ splicesite i en uppströms intron.

Nya splice-siter kan uppstå både i intronen vilket kan orsaka inkludering av en del av intronen i

mRNA. Splice-siter kan även uppkomma i en exon och därigenom orsaka en delvis exkludering

av denna exon.

I gener finns element som kan förändra med vilken frekvens vissa exoner inkluderas eller

exkluderas. Dessa element kallas exonic splicing enhancers och exonic splicing silencers. Exonic

splicing enhancers är lokaliserade i en exon och aktiverar närliggande splice-siter med följden att

de ökar inkluderingsfrekvensen för just denna exon (Blencowe B. J. 2000). I fallet med exonic

splicing silencers är det motsatta sant, dessa sekvenser tystar närliggande splice-siter och orsakar

ökad exkludering av exonet i vilken sekvensen ligger (Wang et al. 2004).

SR-proteiner är nukleära fosfoproteiner vilka innehåller en eller två sekvensigenkännade

regioner (Van der Houven et al. 2000). Dessa proteiner kan dirigera splicingmaskineriet till en

specifik splicesite och är därigenom ett viktigt element i splicing, alternativ eller ej.

I såväl djur som växter har alternativ splicing stor betydelse för hur många aminosyresekvenser

som kan lagras. I det mänskliga genomet har en mycket hög andel gener alternativ splicing.

Minst 74 % av människans multiexon gener genomgår alternativ splicing (Johnson J. M. et al.

2003). Då denna process är en viktig del i proteintillverkningen hos människor är den intressant

att undersöka. Framförallt de eventuella fel som kan uppstå under förloppet och vilka

konsekvenser de har är fokus för många studier.

Ett flertal sjukdomar har visats vara orsakade eller, i någon mån, påverkade av alternativ

splicing. I denna text kommer både sjukdomarna och de gener som påverkar eller orsakar dem att

diskuteras.

7

Sjukdomar med genetisk orsak diskuteras i de fall det handlar om alternativ splicing förändringar

i splicing kan dock ske på grund av andra mutationer. Som följd av detta kommer även

punktmutationer vilka orsakar förändrat uttryck av gener diskuteras.

Varje sjukdom beskrivs med symptom, utveckling av sjukdomen och behandlingsmetoder tas

upp i ett separat kapitel. Ansvariga genetiska processer identifieras och ansvariga gener

undersöks i detalj.

Mutationer som förändrar hur en gens splicing sker kan uppträda på en serie olika punkter i ledet

vilket kommer att visas. Splicingmaskineriet kan få skador eller förändringar som leder till

förändringar i splicing av en gen. Punktmutationer kan uppträda i genen i fråga vilket förändrar

hur den splicas och delar av genen kan förstöras och ge en produkt vilken saknar en eller flera

exoner.

Metod:

Under arbetet med att samla in och sammanställa informationen i denna artikel har ett flertal

olika sökverktyg använts. Det första steget var att finna lämpliga sjukdomar att fördjupa arbetet

om, detta skedde genom att gå igenom andra review artiklar såsom

―Alternative splicing and disease‖ (Kim et al. 2008), ―The splice of life: Alternative splicing and

neurological disease‖ (Dredge et al. 2001) och genom generella sökningar på pubmed och

Google scholar, sökord som använts visas i Tabell 1. Information om de specifika proteinerna

har funnits via referenser i artiklar om sjukdomarna och genom flitigt användande av UniProts

databas på www.uniprot.org.

8

Tabell 1. Urval av viktiga sökord som använts: Dessa var de första sökord som

användes för att finna information även författarnamn har använts som sökord för

att finna forskning relaterad till de arbeten som funnits relevanta.

Sökning gjord Sökord

I startskedet av arbetet Alternative splicing disease

Alternative splicing

Alternative splicing medicine

Efter genomgång av review artiklar Alternative splicing ALS

ALS

Alternative splicing SLE

Cystic fibrosis

CFTR

CF transmembrane conductance regulator

Systemisk lupus erythematosus

Splicing SLE

Splicing ALS

Parkinsonism

Parkinsons

Alzheimers

Glaucoma

Muscular dystrophy

Efter genomgång av sjukdomsspecifika artiklar Inherited frontotemporal dementia

Frontotemporal lobar degeneration

Aniridi

myotonic dystrophy

Pax-6

TARDBP

TDP-43

SLC1A2

EAAT-2

IkappaB kinase complex-associated protein

IKBKAP

9

Resultat

Cystisk Fibros

Cystisk fibros (CF) orsakas av mutationer i CF transmembrane conductance regulator (CFTR)

genen. Sjukdomen är den vanligaste autosomala recessiva sjukdomen hos västeuropeer

(Bayleran et al.1996). CF är en systemisk sjukdom vilken orsakar nedsatt eller felaktig funktion

av lungor, lever, njurar, tarmkanal och bukspottkörtel (Quinton P. M. 2007). Problem med

exokrina körtlar orsakar överflödig tillverkning av slem vilket ger en serie följdproblem som

andningssvårigheter och ökad risk för infektion. Medellivslängd för patienter med CF är

betydligt kortare än friska individer. Förändringarna i CFTR som kan orsaka cystisk fibros är

flera och har olika verkningssätt. Den vanligaste mutationen i cystisk fibros är en aminosyra

deletion vid position 508 då en phenylalanin försvinner vilket orsakar förlust av CFTR funktion.

Flera typer av alternativ splicing kan också orsaka varianter av sjukdomen.

CF transmembrane conductance regulator (CFTR)

CFTR kallas även Channel conductance-controlling ATPase eller ATP-binding cassette sub-

family C member 7. Isoform 1 av detta protein vilket i databaser behandlas som

―normalversionen‖ är 1480 aminosyror lång (Figur 3). Två andra isoformer är kända och dessa är

involverade i sjukdomstillstånd. Isoform 2 är 1419 aminosyror lång och påträffas i bilateral

avsaknad av vas deferens, vilket är ett genetiskt närbesläktat tillstånd till cystisk fibros som

innebär avsaknad av sädesledare (Mercier et al. 1995). Isoform 3 är 604 aminosyror lång och

anses orsaka cystisk fibros (Aznares et al. 2003). CFTR är en fosforylerings-beroende

kloridkanal vilken aktiveras av cAMP agonister. Till en början placerades CFTR i familjen

ABC-transportörer och ansågs ej vara en Cl- kanal. Det har dock vistats att proteinet är en apikal

membran Cl- kanal genom att uttrycka CFTR i HeLa och CHO celler, vilka ursprungligen saknar

Cl- kanaler (Anderson et al 1991).

Vissa patienter har många symptom typiska för Cystisk fibros men saknar förändrade

kloridvärden i svett. Dessa patienter är svårare att ge en korrekt diagnos och har inte den typiska

förändringen av CFTR genen (Highsmith et al. 1994).

10

Figur 3. Föreslagen struktur av CFTR i cellmembran (Sheppard och Welsh

1999). De olika mutationerna som kan orsaka Cystisk fibros påverkar olika

delar av detta protein och kan försämra dess funktion. Den vanligaste

mutationen är en phenylalanin förlust nära mitten av proteinet. Andra fel som kan

ske är en förlust av exon 9 nära mitten av proteinet och förlust av den C-terminala

delen.

CFTR har undersökts i patienter som stämmer på denna beskrivning och i många av fallen har en

C->T substitution i intron 19 funnits. Denna mutation skapar en delvis aktiv alternativ splice-site

vilken orsakar inklusion av en 84 baspar lång sekvens som i vanliga fall hade räknats som

introniskt material vilket innehåller ett stop kodon. Detta stop kodon kommer i och med

inklusionen att finnas med i mRNA sekvensen mellan intron 19 och 20. Följden blir att

translation avbryts vid denna inklusion och förlust av exon 20 sker. Enbart 8 % normalt mRNA

uttrycks i patienter med denna genotyp.

Ärftlig frontotemporal demens

Frontotemporal lobar degenerering eller Frontotemporal dementia (FTD) är grupp demensformer

skiljda från sjukdomen Alhzeimers. Dessa kopplas till lokaliserad progressiv degenerering i

temporal och frontallober. Sjukdomen har olika uttryck beroende på vilka delar av hjärnan som

drabbas först och kan innefatta stumhet och progressiv apati vid frontal-lobs involvering. Om

skadorna börjar i främre delen av temporal neocortex är de första symptomen istället semantisk

demens och försämrad förmåga att känna igen ansikten och föremål (Pickering-Brown et al.

2002). Temporal neocortex är det yttersta lagret av hjärnan vid temporalloberna, detta område är

viktigt för socialt beteende hos primater (Franzen and Myers 1973). En stor fraktion av patienter

med FTD har visats ha ett sjukdomsorsakande lokus på kromosom 17, denna typ av sjukdomen

11

kallas frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17). Genen

har lokaliserats till 17q21-22. Den gen som är ansvarig är Microtubule-associated protein tau

(MAPT). I 5’ splice-siten kopplad till exon 10 (i intronen angränsande denna) av denna gen har

missense mutationer kunnat kopplas till uppkomst av sjukdomen (Hutton et al. 1998). Totalt har

nio missense mutationer, en deletion och två transition mutationer funnits i exon 9,10, 12 och 13

(Reed et al. 2001). Fem olika intronmutationer i 5’ splice siten till exon 10 har funnits. En

mutation som identifierats ligger +13 från 5’ splice siten en annan vid +16 (Pickering-Brown et

al. 2002). Denna region reglerar splicing av exon 10 genom en stem-loop mekanism.

Förändringen i splice-siten tros orsaka ett ökat uttryck av TAU protein innehållande exon 10

vilket innehåller fyra microtubuli bindande repeats.

Microtubule-associated protein tau

MAPT förbättrar microtubul stabilitet och kan möjligtvis även ha effekt på neuronal polaritet

(Maccioni and Cambiazo 1995). C terminala delen av proteinet binder till microtobuli i axon och

N-terminus binder till plasmamembrankomponenter vilket tyder på att MAPT fungerar som ett

länk protein mellan dem.

MAPT är inte enbart involverad i FTDP-17, även i Alzheimers finns en koppling till detta

protein. Vid Alzheimers störs cytoskelettet i hjärnan och en del i detta skeende är parade

helixfilament bestående av hyper-fosforylerad Tau (Wille et al 1994). Detta är en lång kedja av

motsatta tau proteiner.

Systemisk lupus erythematosus

SLE är en multisystem sjukdom vilken kan orsaka många symptom så som thrombocytopenia,

discoid rash, neurologiska problem (psykos och krampanfall) och hemolytisk anemi (Tsao et al.

2002). T celler i SLE patienter kan inte reglera felaktiga autoimmunsvar som sker i patienter. T

cell receptor kedjan CD3 uttrycks i lägre nivåer i dessa patienter än i friska individer vilket

försämrar intracellulär signal överföring (Moulton et al 2009). T cellerna har förändrad splicing

av CD3 mRNA. Den alternativt splicade varianten av genen saknar 562 nukleotider i 3’ UTR

och detta leder till att RNAt inte kan producera normal nivå av CD3 . Minskningen av CD3

sker troligen genom att serine/arginine-rik (SR) protein alternativ splicing faktor/ splicing faktor

2 (ASF/SF2) förlorat sin inbindningssekvens. ASF/SF2 knockdown har visats orsaka minskat

proteinuttryck av CD3 . Den kortare varianten av av CD3 mRNA är också mindre stabil än

normalvarianten vilket i sig kan leda till minskat proteinuttryck.

CD72

B-cell differentierings antigen CD72 är inblandat i B-cells proliferation och differentiering

(Kumanogoh et al. 2005). CD72 genen har åtminstone 4 polymorfismer vilka kan delas in i två

huvudsakliga haplotyper beroende på om de innehåller en eller två upprepningar av 13

nukleotider i intron 8 (Hitomi et al. 2004). Den andra av dessa haplotyper har en kraftigt ökad

nivå av alternativt splicad CD72. Den alternativt splicade varianten saknar exon8. FCGR2B-

12

Ile232Thr är en polymorfism i B-cells inhibitoriska receptorn FCGR2B (Kono et al. 2005).

Denna polymorfism är associerad med SLE om den uppträder i samband med två kopior av

haplotyp1 CD72 men ej i närvaro av haplotyp2. Detta kan tyda på att CD72 haplotyp 2 skyddar

mot SLE genom att genomgå alternativ splicing.

Aniridi

Aniridi innebär avsaknad av iris och är namnet på en semidominant genetisk sjukdom som

orsakar störd utveckling av iris, lins, hornhinna och näthinna (Glasner et al. 1992). För att hitta

genen ansvarig för aniridi och för att förstå mekanismerna bakom sjukdomen har möss med

mutationen Small Eye (Sey) använts då symptomen är snarlika. Sey orsakas av fel i genen

Vertebrate Pax protein 6 (Paired box protein Pax-6: Pax6) vilket har lett till undersökningar av

denna gen i människor. Den mänskliga motsvarigheten till musens Pax6 har isolerats och det

visades att patienter med aniridi har förändringar på DNA och RNA nivå vid denna gen (Jordan

et al. 1992). Det har visats att sjukdomen orsakas av en mutation i genen Pax6, följderna av

denna mutation är förändrad alternativ splicing (Epstein et al. 1994, Glasner et al. 1992). I

normalt fungerande Pax6, och i övriga pax proteiner, finns en konserverad 128 aminosyror lång

DNA-bindande sekvens kallad ―paired region‖ vilken interagerar med DNA i sin aminoterminala

ände (Epstein et al. 1994). Muterad Pax 6 har en T->C substitution vid -3’ positionen av dess

alternativa splicing acceptor. Mutationen förändrar affiniteten för denna splice site och ökar den

alternativa splicingen av Pax-6 pre-mRNA. Den alternativa splicing-produkten kodar för ett

protein med en 14 aminosyror lång insertion i ―paired region‖ vilket leder i förändringar i

proteinets DNA bindande förmåga. Istället för att binda till DNA med den aminoterminala

regionen kan den alternativa produkten binda in med den C-terminala paired domänen vilket

leder till aniridi.

PAX-6

PAX-6 är genen som kodar för Paired box protein Pax-6 (Pax6). Det är ett homeobox protein och

innehåller förutom homebox regionen en paired domain/paired region (Epstein et al. 1994). Båda

dessa sekvenser kodar för DNA bindande regioner. Ett flertal ögonsjukdomar är förknippade

med fel i PAX6, de flesta av dessa orsakas av missense mutationer i paired domain så som i

Aniridi (D’Elia et al. 2006). Enstaka fall av ögonsjukdom som följd av mutation i homeoboxen

har identifierats och kan möjligtvis förknippas med minskad möjlighet till nedbrytning av Pax6 i

vävnaden.

Myotonisk dystrofi

Myotonisk Dystrofi typ 1 och 2 (DM1 och DM2/proximal myopathy PROMM) är dominanta

genetiska sjukdomar med multisystemisk påverkan (Day et al. 2003). Sjukdomen är relativt

vanlig med en frekvens av 1/8000 (Aslanidis et al. 1992). DM2/PROMM orsakas av en CCTG

expansion i intron 1 av zinkfingerprotein 9 (ZFN9). Symptom innefattar myotonia, muskulär

dystrofi, cataract, diabetes, testikel skador, hypogammaglobulinemia och neurologiska hjärtfel.

En viktig skillnad från DM1 är avsaknaden av en foster eller spädbarnsvariant av sjukdomen.

Hjärtproblem vid Myotonisk dystrofi är vanliga (Die-Smulders et al. 1998, Sovari AA, Dudley

SC Jr.2008). Första gradens hjärtblock är den vanligaste defekten men även förmaksflimmer och

13

andra typer av arytmi kan uppkomma. Ventrikulär arrytmia och hjärtblock är troliga kandidater

för att orsaka plötsliga dödsfall i denna patientgrupp (Harper och Monckton 2004). Studier har

visat på att patienter med tidigt inopererad pacemaker har en bättre sjukdomsbild än övriga

(Lazarus et al. 2002).

Problem med glatt muskulatur ger följder i magtarmsystemet (Rönnblom et al. 1996). Hos barn

kan det orsaka tarmsmärta, ―spastic colon‖ och abnormaliteter i sphinkterfunktion. Hos vuxna

individer är problemen mer framträdande i de övre delarna av magtarmsystemet. Sväljreflex

fungerar inte korrekt med fördröjd avslappning i muskeln runt hyoidbenet och peristalsis i

matstrupen är ofta abnormal. Tarmrörelser är reducerade i jämförelse med friska individer.

I testiklar sker tubulär degradering medan leidigceller förblir relativt oskadda vilket innebär liten

åverkan på endokrin funktion (Harper et al. 1972, Vazquez et al 1990). Patienter har en förhöjd

nivå gonadotrofiska hormoner, speciellt follicle stimulating hormone (Harper och Monckton

2004). Både Leutinizing hormone och FSH har ökade koncentrationer i DM patienter.

Myotonisk dystropfi typ 1 (DM1) orsakas av en defekt i DM protein kinase (DMPK) genen. I 3’

änden av genen som kodar för detta protein har patienter med DM1 en CTG (CUG) trinucleotid

expansion (Savkur et al. 2001)i ett instabilt område (Aslanidis et al. 1992). CTG repeat området i

DMPK är variabelt i den mänskliga populationen och varierar från 4 till 40 repetitioner. I

personer av västeuropeisk ursprung finns tre toppar i repeatlängd. Den vanligaste repeatlängden

är 5 repeats men även 11-14 repetitioner är vanligt, 19 repeats eller fler är relativt ovanligt (Deka

et al. 1996). En repeatlängd på mer än 20 har visats ha en tydlig korrelation med sjukdomen.

Personer som har DM1 har en ovanlig form av insulinresistans (Savkur et al. 2001). Detta

kommer av en felaktig reglering av alternativ splicing i insulinreceptor pre-mRNA vilket leder

till övervägande uttryck av den lågsignalerande ickemuskel isoformen (IR-A). Denna isoform är

den mest utryckta även i skelettmuskulatur i DM1 kulturer. Det är troligt att regleringen av denna

förändring sker via CUG-Binding Protein (CUG-BP) som kan orsaka byte till uttryck av IR-A

genom ett introniskt kontrollelement uppströms från den alternativt splicade exon 11.

Modelldjur har använts för att identifiera vilka eller vilket följdfel det är som orsakar sjukdomen.

När en CTG expansion existerar i DMPK så kommer transkripten av detta att bibehållas i kärnan

och följaktligen minskar nivåerna av DMPK proteinet i cellen (Davis et al. 1997). Expansionen

orsakar även en kromatinförändring och tystande av en närliggande gen SIX5 vilket är en

transkriptionsfaktor (Thornton et al. 1997). Knockoutmöss har använts för att undersöka vad

förändringar i dessa proteiners nivåer orsakar. Knockout av DMPK ger svagare skelettmuskler

och abnormal hjärtkonduktans (Reddy et al 1996, Berul et al. 1999). SIX5 knockout möss har

ökad risk för katarakter (Klesert et al 2000). Ingen av dessa mustyper har dock uppvisat

myotonia, och enbart sent utvecklad progressiv myopati, vilket skiljer dessa från individer med

DM. Då symptomen hos dessa två typer av knockoutmöss ej stämmer med symptomen i

människan kan det antingen innebära olika proteinfunktioner mellan raserna eller att

expansionen har ytterligare funktioner.

För att undersöka om sjukdomen är grundad i själva repeatförlängningen i transkriptet har

transgena möss med CUG expansioner i orelaterat mRNA tagits fram. Dessa möss har uppvisat

både myotonia och myopati (Mankodi et al. 2000). Detta innebär att förändringen troligtvis är en

14

toxisk gain funktion mutation. Det har visats att Muscleblind like protein (MBNL) bildar foci i

DM1 celler till skillnad från i friska celler (Fardaei et al. 2001). Sambandet mellan MBLP1, 2

och 3 har undersökts och MBNL1 och 2 har visats bilda foci med förlängda repetitioner (Holt et

al. 2009). Anledningen till att avsaknad av enbart MBNL kan orsaka DM symptom kan vara

detta proteins dominans i mogen skelett och hjärtmuskulatur. CUG expansionerna i DM1 har

visats påverka reglering av alternativ splicing genom inbindning till CUG-BP vilket i sin tur ger

effekter på alternativ splicing i humant cardiac troponin i skelett och hjärtmuskulatur (Philips et

al. 1998). Som följd av insikten att det är de förlängda repetitionerna som orsakar sjukdomen har

nya mediciner kommit på förslag, dessa riktar sig till att hindra C/CUG från inbindning till CUG-

BP och eventuella andra proteiner med potentiell inbindningsförmåga till denna sekvens

(Mulders et al. 2010). Substanserna som idag undersöks är antisense oligonukleotider, vilka kan

binda C/CUG och blockera annan inbindning, eller små organiska molekyler som förhindrar

interaktion mellan protein och C/CUG hairpinstrukturer.

DM protein kinase

DMPK är ett 639 aminosyror långt multidomän protein kinas vilket krävs för korrekt hjärt

konduktivitet och sammandragningar av hjärtmuskeln (Bush et al. 2000, Kaliman et al. 2005).

Proteinet fosforylerar phospholamban ett membranprotein i hjärtceller vilket är involverat i

reglering av Ca2+

transport över det sarkoplasmatiska retikulumet (Frank och Kranias

2000)(Bush et al. 2000). En serie isoformer är kända, två av dessa är kända för att uttryckas i

muskelceller, DMPK1 är en lång isoform och den primära transkriptionsprodukten. DMPK2 är

en kortare isoform vilken kan tillverkas genom proteolytisk klyvning av DMPK1 nära dess C-

terminal. Den kortare formen av proteinet är trefaldigt mer aktivt än den primära transkriptions-

produkten.

Amyotrophic Lateral Scleros

Amyotrophic Lateral Scleros (ALS) ger försämrat återupptag av synaptiskt glutamat som följd av

fel i Excitatory amino acid transporter 2 (EAAT2). EAAT2 uttrycks i stort sett uteslutande i

hjärnvävnad till skillnad från EAAT1 och EAAT3 vilka är närbesläktade glutamattransportrar

vilka även utrycks i andra vävnader. ALS uppstår vid nedsatt funktion av proteinet Excitatory

amino acid transporter 2 då detta orsakar höjd synaptisk extracellulär glutamatkoncentration

(Couratier et al. 1993). I ALS är mängden Excitatory amino acid transporter 2 i astrogliaceller

nedsatt med 30-95% (Lin et al. 1998).

15

Tabell 2. Typer av ALS och bakomliggande mutationer. ALS typ: Orsakas av mutation i: Locus:

ALS(1) SOD1(superoxide dismutase-1 coding) 21q22.1

ALS(2) ALS2 gene(alsin coding) 2q33

ALS(3) loci 18q21 18q21

ALS(4) SETX gene(senataxin coding) 9q34

ALS(5) loci 15q15-q21.1 15q15-q21.1

ALS(6) FUS gene 16p11.2

ALS(7) loci 20p13 20p13

ALS(8) VAPB 20q13.3

ALS(9) ANG(angiogenin coding) 14q11.2

ALS(10) TARDBP(TDP-43 coding) 1p36.2

ALS(11) FIG4(SAC domain-containing inositol phosfatase 3 coding) 6q21

SLC1A2

SLC1A2 kodar för proteinet Excitatory amino acid transporter 2. Kanalen är en natrium synport

vilken transporterar glutamat från den synapsiska klyftan tillbak in i axonet (Shigeri et al. 2004).

Isoform 1 har 574 aminosyror medan isoform 2 har 565 aminosyror (saknar 9 av de aminosyror

som finns i isoform 1). Alternativ splicing av detta protein har visats ge ytterligare 2 isoformer

vilka kallas EAAT2-C1 och EAAT2-C2. EAAT2-C1 saknar proteinkodande exon 8, sektionen

som splicas bort består av 45 aminosyror C-terminalt (Meyer et al. 1998). EAAT2-C2 tillverkas

genom användande av två interna splicesiter i exon 5 och 6 vilket orsakar förlust av 107

aminosyror i mitten av proteinet.

Tabell 3. Två alternativt splicade varianter av SLCA2/EAAT2 (Meyer et al.1998).

Traskript: Position: Splicade exoner: Splicing typ Aminosyre

positioner

Antal

aminosyror

EAAT2-C1 1320-1454 CDS8 Cassette exon 431-474 45

EAAT2-Cs 791-1111 CDS5(pt) CDS6(pt) Intern splice site 253-356 107

Alternativa splice-varianter har rapporterats vara en trolig orsak till ALS, detta har bestridits i

senare artiklar. Alternativt splicad SLC1A har dock visats vara uppreglerad i ALS patienter

jämfört med friska individer. Vissa av de uppreglerade splice-varianterna har visats ha ett

dominant/negativt förhållande till normalt splicad SLC1A vilket kan innebära att en liten

förändring i förhållande ger en stor förändring i funktion.

SOD1

Muterat superoxide dismutase-1 har visats orsaka ALS (1). Mekanismerna för hur SOD1 kan

orsaka ALS är inte helt känt men det finns några troliga modeller. Sambandet mellan SOD1 och

nedreglering av EAAT2 i ALS (1) orsakas troligen av påverkan på Caspase-3. Caspase-3 kan

klyva EAAT2 och därigenom orsaka förlust av dessa kanaler. Vid mutation i SOD1 associerat

med ALS uppregleras Caspase-3 (Boston-Howes et al. 2006). Detta leder troligtvis till förlust av

EAAT-2 och toxisk ökning av glutamat i den synaptiska klyftan. Det har även visats att muterad

SOD1 kan bilda inkorrekta disulfidbryggor under mild oxidativ stress vilket leder till att tunga

aggregat kan bildas (Niwa et al. 2007). Det orsakar även ubiquitylering av SOD1 och därigenom

16

bidrar det till hastig degradering av proteinet. Då påverkan av Caspase-3 på EAAT2 är en

protein-protein interaktion så är denna form av sjukdomen av ringa intresse i denna text det är

dock den vanligaste formen och beskrivs som kontrast till ALS 10 orsakad av TARDBP.

TARDBP (TDP-43)

TDP-43 eller TAR DNA-binding protein är ett 414 aminosyror långt protein vilket reglerar

transkription och splicing. Proteinet binder till pyrimidinrika motiv i TAR DNA och

enkelsträngar med TG repetitioner. Det binder även till RNA med UG repetitioner längre än 12

baser. Proteinet är närvarande i all vävnad men är extra högt uttryckt i bukspottkörteln,

moderkakan, lungorna, könsorgan och njurarna. TBP-43 påverkar bland annat reglering av

CFTR splicing (Buratti et al. 2001). TBP-43 kan orsaka exon 9 exlusion i CFTR genom

inbindning till ett UG repeat motiv i den polymorfiska regionen nära 3´-splice siten av den

exonen. Följden av den avvikande splicingen hos CFTR är associerad med symptom typiska för

cystisk fibros.

Fel i TARDBP orsakar ALS typ 10. I individer med ALS som ej har fel i SOD1 har en lång serie

undersökningar utförts. När TARBP genen screenades hos en serie individer med ALS

upptäcktes en mutation i exon 6 (Sreedharan et al. 2008). Mutationen orsakar en substitution av

valin till metionin vid position 337. Andra studier har funnit samma mutation (Tamaoka et al

2010). Ett flertal andra mutationer i TARDBP har också påträffats i ALS patienter.

Familial dysautonomia

Familial dysautonomia (FD, även känt som Riley-Day syndrome) är en sjukdom som påverkar

det autonoma nervsystemet och sensoriska nerver. FD orsakas av mutationer i IkappaB kinase

complex-associated protein (IKBKAP) genen. Två olika mutationer i denna gen är kända för att

kunna orsaka sjukdomen. Sjukdomen förekommer i stort sett uteslutande hos Ashkenazi judar. I

denna population är frekvensen för sjukdomsanlaget 1/30(Lehavi et al. 2004) och frekvensen för

sjukdomen är 1 / 3600 levande födslar (Slaugenhaupt et al. 2001). Sjukdomen har alltid dödlig

utgång och enbart hälften av alla patienter lever till 30 års ålder. Patienter lider av symptom som

minskad känsel och uppfattning av kyla/värme, kräkningar, instabilt blodtryck, mm. Symptomen

uppkommer som följd av en progressiv förlust av omyeliniserade sensoriska och autonoma

neuron(Pearson et al 1978). Dödsfall i FD är ofta en följd av cardiorespiratoriska problem.

Hypoxia och hypercapnia i FD patienter leder ej till korrekt svar i cerebral cirkulation. Detta i sin

tur ger hypotension bradycardia hypoventilation (nedsatt puls och andning som följd av felaktig

neurologisk reaktion) och kan potentiellt leda till andningsuppehåll (Bernardi et al. 2003).

För att identifiera området i vilket genen som orsakar FD har forskare vid New York University

Medical Center gjort en serie experiment och publicerat ett flertal rapporter.De har publicerat sitt

arbete regelbundet i och med att de närmat sig svaret. Första rapporten som publicerades uteslöt

en stor del av genomet som potentiell plats för FD genen genom parvisa multipoint analyser av

misstänkta regioner (Blumenfeld et al. 1993a). Efter detta identifierades region 9q31-q33 som

platsen för genen genom en linkage analys (Blumenfeld et al. 1993b). Denna region är 11cM,

17

den exakta platsen för mutationen identifierades genom användning av nya markörer för det

intervallet och en sektion på mindre än 0,5cM kunde identifieras som platsen för mutationen

(Blumenfeld et al. 1999). Haplotypanalys användes för att bekräfta att denna region var

avvikande i FD. En huvudsaklig haplotyp fanns i 435 av 443 FD kromosomer. Tre andra

haplotyper fanns i de övriga 6 kromosomerna. Två av mutationerna som har funnits i IKBKAP

har olika sätt att påverka genens uttryck. Den huvudsakliga haplotypen har en mutation i donator

splice-siten i intron 20 (Slaugenhaupt et al. 2001). Denna mutation orsakar exklusion av exon 20,

ett visst uttryck av vildtyp protein kommer dock fortfarande ske. Den andra haplotypen har en

missense mutation i exon 19 vilken tros förstöra en fosforylerings-site.

Den goda kunskapen om var mutationerna som leder till FD ligger i genomet gör att det nu finns

en god basis till ett genetiskt test för FD istället som det var fram till 2000-talet en diagnos ställd

enbart på symptom. Det gör även att patienter som har atypiska symptom lätt kan få en korrekt

diagnos och att man kan utesluta denna diagnos i patienter med andra liknande neuropatier.

Förhoppningsvis kan kunskapen om vilka fel som sker på genom och mRNA nivå även bidra till

framställning av bättre mediciner. Arbetet som gjorts om denna sjukdom ger en serie goda

följder för drabbade individer.

IkappaB kinase complex-associated protein

IKBKAP kodar för det 1332 aminosyror långa Elongator complex protein 1. Kända interaktioner

är med Elongator complex protein 3 (Creppe et al. 2009), Huntingtin (Goehler et al. 2004), Pre-

B-cell leukemia transcription factor 2 (Lehner et al. 2004) och Mitogen-activated protein kinase

kinase kinase 7. (Ninomiya-Tsuji et al. 1999). IKBKAP är en av sex subenheter i human

elongation komplex (Hawkes et al. 2002). Detta komplex kan i sin sex subenhet form verka som

histon acetyltransferas riktat mot H3 och H4. Elongator complex är involverat i tidig elongering i

modellceller (HeLa-celler) och kan interagera direkt med RNA polymerase II i lösning.

IKBKAPs involvering i transkription och elongering kan tyda på att FD är en följd av fel i denna

process.

Medicinska framsteg och alternativ splicing.

Den ökade kunskapen om mekanismerna bakom de sjukdomar som nämns i denna rapport ger

nya möjligheter till utformning och testning av medicin för dessa åkommor. Inducerade

pluripotenta stamceller med mutationen för familial dysautonomia har använts både för att

undersöka mekanismerna bakom sjukdomen men har även föreslagits som en bra modell för

utformning av mediciner (Lee et al. 2009). Då det är felaktig splicing som orsakar sjukdomen

kan cellnivåmodeller användas som ett första steg i test av potentiella mediciner vilka riktas för att normalisera processen. Nya typer av mediciner som kommer att riktas direkt mot de

sekvenser som orsakar vissa av dessa sjukdomar är idag på försöksstadiet. Ett exempel är de

antisense oligonukleotider som diskuteras i sektionen om myotonisk dystrofi.

18

Diskussion

I de många sjukdomar som vi idag vet involverar alternativ splicing har inga direkta medicinska

behandlingar uppkommit som tacklar denna sida av sjukdomarna. Dessa mediciner är dock på

väg och kanske kommer vi inom några år ha väl fungerande medicin vilken riktas direkt mot

orsaken till myotonisk dystrofi. Det som kunskapen praktiskt kan användas för idag är bättre

diagnostiska verktyg. Om sjukdomar diagnostiseras på DNA nivå istället för genom symptom

blir feldiagnostisering och felbehandling mindre troligt. Korrekt reglering av splicing är oerhört

viktigt för ett fungerande system och mycket små förändringar, ofta punktmutationer som i

frontotemporal demens kan ha förödande konsekvenser för individen. Som har visats med de

sjukdomar nämnda i detta arbete så kan splicing störas på många olika nivåer. Vissa förändringar

innebär att RNAt som innehar förändringen kommer att splicas på ett annat vis än normalt eller

få förändrad balans mellan två splicingformer så som i FTDP-17. Andra förändringar påverkar

funktionen hos proteiner involverade i splicingmaskineriet och kan genom detta orsaka

förändringar i de proteiner som translaterats från felsplicade mRNA-molekyler. Ett exempel på

detta är TBP-43s involvering i CFTR splicing i cystisk fibros. Även förändringar av nivåerna av

proteiner i splicingmaskineriet kan förändra hur splicing sker och därigenom ge avvikande

splicing. Fortsatt forskning på fältet kommer troligen finna många nya samband mellan

avvikande splicing-mönster, mutationer och sjukdomar då de flesta upptäckter av sådana

samband har skett relativt nyligen. Fältet är fortfarande ungt och kunskapen om alternativ

splicings relevans utvecklas varje år med stora kliv.

19

Referenser

Anderson MP, Rich DP, Gregory RJ, Smith AE, Welsh MJ (1991) Generation of cAMP-

activated chloride currents by expression of CFTR. Science. 251(4994). 679-82

Aslanidis C, Jansen G, Amemiya C, Shutler G, Mahadevan M., Tsilfidis C, Chen C,

Alleman J, Wormskamp N G M, Vooijs M, Buxton J, Johnson K, Smeets H J M, Lennon G

G, Carrano A V, Korneluk R G, Wieringa B and de Jong P J (1992) Cloning of the

essential myotonic dystrophy region and mapping of the putative defect. Nature 355. 548 – 551

Aznarez I, Chan E M , Zielenski J, Blencowe B J, Tsui L-C (2003) Characterization of

disease-associated mutations affecting an exonic splicing enhancer and two cryptic splice sites in

exon 13 of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Hum. Mol. Genet. 12

(16). 2031-2040

Bayleran J K, Yan H, Hopper C A and Simpson E M (1996) Frequencies of cystic fibrosis

mutations in the Maine population: high proportion of unknown alleles in individuals of French-

Canadian ancestry. Hum. Genet. 98. 207-209

Bernardi L, Hilz M, Stemper B, Passino C, Welsch G and Axelrod F B (2003) Respiratory

and Cerebrovascular Responses to Hypoxia and Hypercapnia in Familial Dysautonomia Am J

Respir Crit Care Med. 167. 141-149,

Black D. L. (2003) Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing Annu. Rev.

Biochem. 72. 291–336

Blencowe B. J. (2000) Exonic splicing enhancers: mechanism of action, diversity and role in

human genetic diseases Trends Biochem. Sci. 25 (3) 106-110

Blumenfeld A, Axelrod FB, Trofatter JA, Maayan C, Lucente DE, Slaugenhaupt SA,

Liebert CB, Ozelius LJ, Haines JL, Breakefield XO, et al. (1993a) Exclusion of familial

dysautonomia from more than 60% of the genome. J Med Genet 30. 47–52

Blumenfeld A., Slaugenhaupt S A, Axelrod F B, Lucente D E, Maayan C, Liebert C B,

Ozelius L J, Trofatter J A, Haines J L, Breakefield X O & Gusella J F (1993b) Localization

of the gene for familial dysautonomia on chromosome 9 and definition of DNA markers for

genetic diagnosis. Nat. Genet. 4. 160–164

Blumenfeld A., Slaugenhaupt S A, Liebert C B, Temper V, Maayan C, Gill S, Lucente D E,

Idelson M, MacCormack K, Monahan M A, Mull J, Leyne M, Mendillo M, Schiripo T,

Mishori E, Breakefield X, Axelrod F B, and Gusella J F (1999)Precise Genetic Mapping and

Haplotype Analysis of the Familial Dysautonomia Gene on Human Chromosome 9q31 Am. J.

Hum. Genet. 64. 1110–1118,

20

Boston-Howes W, Gibb S L, Williams E O, Pasinelli P, Brown R H Jr., Trotti D (2006)

Caspase-3 Cleaves and Inactivates the Glutamate Transporter EAAT2 J. Bio. Chem. 281. 14076-

14084.

Buratti E, Dörk T, Zuccato E, Pagani F, Romano M, and Baralle F E (2001) Nuclear factor

TDP-43 and SR proteins promote in vitro and in vivo CFTR exon 9 skipping. EMBO J. 20 (7).

1774–1784

Bush E W, Helmke S M, Birnbaum R A, and Perryman M B (2000) Myotonic Dystrophy

Protein Kinase Domains Mediate Localization, Oligomerization, Novel Catalytic Activity, and

Autoinhibition Biochemistry, 39 (29). 8480–8490

Couratier P, Hugon J, Sindou P, Vallat JM, Dumas M (1993) Cell culture evidence for

neuronal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis being linked to glutamate AMPA/kainate

receptors. Lancet. 30. 341 (8840). 265-8.

Creppe C, Malinouskaya L, Volvert M L, Gillard M, Close P, Malaise O, Laguesse S,

Cornez I, Rahmouni S, Ormenese S, Belachew S, Malgrange B, Chapelle J P, Siebenlist U,

Moonen G, Chariot A, Nguyen L (2009) Elongator controls the migration and differentiation of

cortical neurons through acetylation of alpha-tubulin. Cell 136 (3). 551-564

Davis B. M., Mila E. McCurrach, , Krishan L. Taneja, Singer R. H, Housman D. E (1997)

Expansion of a CUG trinucleotide repeat in the 3′ untranslated region of myotonic dystrophy

protein kinase transcripts results in nuclear retention of transcripts PNAS 94 (14) 7388-7393

Day J W, Ricker K, Jacobsen J F, Rasmussen L J, Dick KA, Kress W, Schneider C, Koch

M C, Beilman G J, Harrison A R, Dalton J C, Ranum L P (2003) Myotonic dystrophy type 2:

molecular, diagnostic and clinical spectrum. Neurology. 60. 657-664.

Deka R, Majumder P P, Shriver M D, Stivers D N, Zhong Y, Yu LM, Barrantes R, Yin SJ,

Miki T, Hundrieser J, Bunker C H, McGarvey S T, Sakallah S, Ferrell R E, Chakraborty

R. (1996).Distribution and evolution of CTG repeats at the myotonin protein kinase gene in

human populations. Genome Res. 6(2). 142-54

Die-Smulders C E M de, Ho¨weler C J, Thijs C, Mirandolle J F, Anten H B, Smeets H J M.,

Chandler K E and Geraedts J P M (1998)Age and causes of death in adult-onset myotonic

dystrophy. Brain 121. 1557–1563

Fardaei M., Larkin K, Brook J. D, and Hamshere M. G (2001) In vivo co-localisation of

MBNL protein with DMPK expanded-repeat transcripts. Nucleic Acids Res; 29 (13). 2766–2771

Frank K och Kranias E. G (2000) Phospholamban and cardiac contractility Ann Med. 32 (8).

572-578.

21

Franzen E.A. och Myers R.E. (1973)Neural control of social behavior: Prefrontal and anterior

temporal cortex. Neuropsychologia 11 (2). 141-157

Goehler H, Lalowski M, Stelzl U, Waelter S, Stroedicke M, Worm U, Droege A,

Lindenberg K S, Knoblich M, Haenig C, Herbst M, Suopanki J, Scherzinger E, Abraham

C, Bauer B, Hasenbank R, Fritzsche A, Ludewig A H, Bussow K, Buessow K, Coleman S

H, Gutekunst C A, Landwehrmeyer B G, Lehrach H, Wanker E E (2004) A protein

interaction network links GIT1, an enhancer of huntingtin aggregation, to Huntington's disease.

Mol. Cell 15 (6). 853-865

Harper P, Penney R, Foley Jr T, Migeon C. J, och Blizzard R. M (1972) Gonadal function in

males with myotonic dystrophy. J Clin Endocrinol Metab 35. 852,

Harper PS, Monckton DG (2004) Myotonic dystrophy; in Engel AG, Franzini-Armstrong C

(eds): Myology, ed 3. New York, McGraw-Hill 2. 1039–1076.

Hawkes N.A., Otero G., Winkler G.S., Marshall N., Dahmus M.E., Krappmann D.,

Scheidereit C., Thomas C.L., Schiavo G., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Svejstrup

J.Q. (2002) Purification and characterization of the human elongator complex J Biol Chem. 277.

3047-3052.

Hitomi Y, Tsuchiya N, Kawasaki A, Ohashi J, Suzuki T, Kyogoku C, Fukazawa T,

Bejrachandra S, Siriboonrit U, Chandanayingyong D, Suthipinittharm P, Tsao B. P,

Hashimoto H, Honda Z-I and Tokunaga K (2004) CD72 polymorphisms associated with

alternative splicing modify susceptibility to human systemic lupus erythematosus through

epistatic interaction with FCGR2B Hum. Mol. Genet. 13(23). 2907-2917

Holt I, Jacquemin V, Fardaei M, Sewry CA, Butler-Browne GS, Furling D, Brook JD,

Morris GE. (2009) Similarities and Differences in Normal and Myotonic Dystrophy Muscle Am.

J. of Pathol. 174. 216-227

Hutton M., Lendon C. L., Rizzu P, Baker M, Froelich S, Houlden H, Pickering-Brown S,

Chakraverty S, Isaacs A, Grover A, Hackett J, Adamson J, Lincoln S, Dickson D, Davies P,

Petersen R C, Stevens M, de Graaff E, Wauters E, van Baren J, Hillebrand M, Joosse M,

Kwon J M, Nowotny P, Che L K, Norton J, Morris J C, Reed L A, Trojanowski J, Basun H,

Lannfelt L, Neystat M, Fahn S, Dark F, Tannenberg T, Dodd P R, Hayward N, Kwok J B J,

Schofield P R, Andreadis A, Snowden J, Craufurd D, Neary D, Owen F, Oostra B A, Hardy

J, Goate A, van Swieten J, Mann D, Lynch T & Heutink P(1998) Association of missense

and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17 Nature 393. 702-705

Kaliman P, Catalucci D, Lam J T, Kondo R, Gutiérrez J C P, Reddy S, Palacín M, Zorzano

A, Chien K R och Ruiz-Lozano P (2005) Myotonic Dystrophy Protein Kinase Phosphorylates

22

Phospholamban and Regulates Calcium Uptake in Cardiomyocyte Sarcoplasmic Reticulum The

J. Biol. Chem. 280. 8016-8021.

Kim E, Goren A and Ast G (2008) Alternative splicing and disease RNA Biology 5. 1 -3

Kim JH, Lane WS, Reinberg D. (2002) Elongator facilitates RNA polymerase II transcription

through chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (3). 1241-1246.

Klesert TR, Cho DH, Clark JI, Maylie J, Adelman J, Snider L, Yuen EC, Soriano P,

Tapscott S J (2000) Mice deficient in Six5 develop cataracts: implications for myotonic

dystrophy. Nat Genet. 25 (1). 105-9.

Kono H, Kyogoku C, Suzuki T, Tsuchiya N, Honda H, Yamamoto K, Tokunaga K and

Honda Z-I (2005) FcgRIIB Ile232Thr transmembrane polymorphism associated with human

systemic lupus erythematosus decreases affinity to lipid rafts and attenuates inhibitory effects on

B cellreceptor signaling Hum. Mol. Genet. 14 (19). 2881–2892

Kumanogoh A, Shikina T, Watanabe C, Takegahara N, Suzuki K, Yamamoto M,

Takamatsu H, Prasad D V R, Mizui M, Toyofuku T, Tamura M, Watanabe D, Parnes J R

and Hitoshi Kikutani1 (2005) Requirement for CD100–CD72 interactions in fine-tuning of B-

cell antigen receptor signaling and homeostatic maintenance of the B-cell compartment. Int.

Immunol. 17(10). 1277-1282;

Lazarus A, Varin J, Babuty D, Anselme F , Coste J, and Duboc D, (2002) Long-term

follow-up of arrhythmias in patients with myotonic dystrophy treated by pacing J Am Coll

Cardiol, ; 40. 1645-1652

Lehavi O, Aizenstein O, Bercovich D, Pavzner D, Shomrat R, Orr-Urtreger A, Yaron Y

(2004) Screening for Familial Dysautonomia in Israel: Evidence for Higher Carrier Rate among

Polish Ashkenazi Jews Genet. Test.7 (2). 139-142.

Lee G, Papapetrou E P, Kim H, Chambers S M, Tomishima M J, Fasano C A, Ganat J M,

Menon J, Shimizu F, Viale A, Tabar V, Sadelain M & Studer L (2009) Modelling

pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs Nature 461.

402-406

Lehner B, Semple J I, Brown S E, Counsell D., Campbell R D., Sanderson C M. (2004)

Analysis of a high-throughput yeast two-hybrid system and its use to predict the function of

intracellular proteins encoded within the human MHC class III region. Genomics 83 (1). 153-167

Lin C-L G, Bristol L A, Jin L, Dykes-Hoberg M, Crawford T, Clawson L, and Rothstein .

D (1998) Aberrant RNA Processing in a Neurodegenerative Disease: the Cause for Absent

EAAT2, a Glutamate Transporter, in Amyotrophic Lateral Sclerosis Neuron, 20. 589–602

23

Maccioni R. B. and Cambiazo V. (1995) Role of microtubule-associated proteins in the control

of microtubule assembly Physiol. Rev. 75. 835-864

Mankodi A , Logigian E, Callahan L, McClain C, White R, Henderson D, Krym M,

Thornton C A (2000) Myotonic Dystrophy in Transgenic Mice Expressing an Expanded CUG

Repeat. Science 289. 1769 – 1772

Mercier B, Verlingue C, Lissens W, Silber SJ, Novelli G, Bonduelle M, Audrézet MP, Férec

C (1995) Is congenital bilateral absence of vas deferens a primary form of cystic fibrosis?

Analyses of the CFTR gene in 67 patients. Am. J. Hum. Genet. 56(1). 272-7.

Meyer T, Fromm A, Münch C, Schwalenstöcker B, Fray A E, Ince P G, Stamm S, Grön G,

Ludolph A C and Shaw P J(1999)The RNA of the glutamate transporter EAAT2 is variably

spliced in amyotrophic lateral sclerosis and normal individuals J. Neurol. Sci.170 (1). 45-50

Meyer T, Münch C, Knappenberger B, Liebau S, Völkel H and Ludolph A C (1998)

Alternative splicing of the glutamate transporter EAAT2 (GLT-1) Neurosci. Lett. 241 (1). 68-70

Moulton V R , Perl M A and Tsokos G C (2009) Alternative Splicing Factor/Splicing Factor 2

(ASF/SF2) regulates the expression of human T cell receptor CD3 chain J. Immunol. 182. 48.8

Ninomiya-Tsuji J., Kishimoto K., Hiyama A., Inoue J., Cao Z., Matsumoto K. (1999) The

kinase TAK1 can activate the NIK-I kappaB as well as the MAP kinase cascade in the IL-1

signalling pathway Nature. 18;398(6724):252-6.

Niwa J, Yamada S, Ishigaki S, Sone J, Takahashi M, Katsuno M, Tanaka F, Doyu M and

Sobue G (2007) Disulfide Bond Mediates Aggregation, Toxicity, and Ubiquitylation of Familial

Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutant SOD1 J. Biol. Chem. 282. 28087-28095.

Pearson J, Pytel BA, Grover-Johnson N, Axelrod F, Dancis J. (1978) Quantitative studies of

dorsal root ganglia and neuropathologic observations on spinal cords in familial dysautonomia. J

Neurol Sci. 35(1):77-92.

Philips A V, Timchenko L T, Cooper T A (1998) Disruption of Splicing Regulated by a CUG-

Binding Protein in Myotonic Dystrophy. Science 280. 737 - 741

Pickering-Brown S M, Richardson A M T, Snowden J S, McDonagh A M, Burns A, Braude

W., Baker M., Liu W-K, Yen S-H, Hardy J, Hutton M, Davies Y, Allsop D, Craufurd D,

Neary D and Mann DM A (2002) Inherited frontotemporal dementia in nine British families

associated with intronic mutations in the tau gene Brain 125 (4). 732-751,

Quinton P M (2007) Cystic Fibrosis: Lessons from the Sweat Gland Physiology, 22 (3). 212-

225

24

Reddy S, Smith DB, Rich MM, Leferovich JM, Reilly P, Davis BM, Tran K, Rayburn H,

Bronson R, Cros D, Balice-Gordon R J, Housman D. (1996) Mice lacking the myotonic

dystrophy protein kinase develop a late onset progressive myopathy. Nat Genet. 13(3). 325-35

Reed L ., Wszolekb Z K och Huttonb M (2001) Phenotypic correlations in FTDP-17

Neurobiol. Aging. Volume 22 (1). 89-107

Rönnblom A, Forsberg H, och Danielsson A (1996)Gastrointestinal Symptoms in Myotonic

Dystrophy Scand. J. Gastroenterol. 31 (7). 654-657

Savkur R S, Philips A V & Cooper T A (2001) Aberrant regulation of insulin receptor

alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy Nat. Genet. 29. 40

- 47

Sheppard D N and Welsh M J (1999) Structure and Function of the CFTR Chloride Channel

Physiol. Rev. 79. 23-45

Shigeri Y, Seal R P and Shimamoto K (2004) Molecular pharmacology of glutamate

transporters, EAATs and VGLUTs Brain Res. Rev. 45 (3) 250-265

Slaugenhaupt S A, Blumenfeld A Gill S P, Leyne M, Mull J, Cuajungco M P, Liebert C B,

Chadwick B P,Idelson M, Reznik L, Robbins C M, Makalowska I Brownstein M J,

Krappmann D, Scheidereit C, Maayan C, Axelrod F B, Gusella J F (2001) Tissue-specific

expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am. J.

Hum. Genet. 68. 598-605

Sovari A A, Dudley S C Jr. (2008) Sudden death in myotonic dystrophy. N Engl J Med.

359(15). 1626-1629

Wille H, Drewes G, Biernat J, Mandelkow E M, and Mandelkow E (1992) Alzheimer-like

Paired Helical Filaments and Antiparallel Dimers Formed from Microtubule-associated Protein

Tau In Vitro. J. Cell Biol. 118. 573-584

Tamaoka A, Arai M, Itokawa M, Arai T, Hasegawa M, Tsuchiya K, Takuma H, Tsuji H,

Ishii A, Watanabe M, Takahashi Y, Goto J, Tsuji S and Akiyama H (2010) TDP-43 M337V

Mutation in Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis in Japan . Intern. Med. 49. 331-334

Thornton CA, Wymer JP, Simmons Z, McClain C, Moxley RT 3rd. (1997) Expansion of the

myotonic dystrophy CTG repeat reduces expression of the flanking DMAHP gene. Nat. Genet.

16 (4). 407-409

Tsao B P, Grossman J M, Riemekasten G, Strong N, Kalsi J, Wallace D J, Chen C-J, Lau C

S, Ginzler E M, Goldstein R, Kalunian K C, Harley J B, Arnett F C, Hahn B H, Cantor R

25

M (2002) Familiality and co-occurrence of clinical features of systemic lupus erythematosus

Arthritis Rheum. 46 (10). 2678–2685

van der Houven van Oordt W, Newton K, Screaton G R and Cáceres J . (2000) Role of SR

protein modular domains in alternative splicing specificity in vivo Nucleic Acids Research 28

(24). 4822-4831

Vazquez JA, Pinies JA, Martual P et al (1990) Hypothalmic–pituitary testicular function in 70

patients with myotonic dystrophy. J Endocrinol Invest 13. 375–379.

Wang Z, Rolish M E, Yeo G, Tung V, Mawson M and Burge C B(2004)Systematic

Identification and Analysis of Exonic Splicing Silencers Cell 119 (6). 831-845