Transfección de células eucariotas

Dra. Anabel Alvarez JuliáBiología celular - 2017

Transfección: Proceso por el cual un ácidonucleico foráneo ingresa en unacélula eucariota

¿Para qué transfectar?•Estudiar la regulación de la expression génica(promotores y otros elementos regulatorios)

•Estudiar mecanismos involucrados en el procesamiento del ARN, postraduccionales, etc.

•Estudiar la localización subcelular y/o el efectode la expression de una proteína sobre el fenotipo celular

•Expresión de proteínas para su purificación

•Evaluar la interacción de proteínas

•Producir organismos transgénicos

•Terapia génica

Estable Transitoria

No se transmite en la división celular.

El ADN introducido no se integra al genoma. Existe solo por un período limitado de tiempo.

El ADN se incorpora dentro del genoma.

Transmiten el ADN introducido a su progenie.

Tipos de transfección

Producción de proteínas a granescala, estudios farmacológicoslargos, terapia génica…

Efectos rápidos de la expresión degenes o sus productos o producciónde proteína a pequeña escala

¿Cuál elijo?Estable Transitoria

Es necesario seleccionar las célulasque han incorporado el ADN.

Se requiere de un método de transfección de alta eficiencia.

Se puede evaluar el efecto de la transfección a tiempos cortos

Brooks, PNAS 2007

Métodos físicos

Métodos químicosLiposomas

Fosfato de calcio

Polímeros catiónicos

Electroporación

Biobalística

Microinyección

Métodos biológicos (transducción viral)Adenovirus

Retrovirus

Lentivirus

¿Cómo transfecto?

BiobalísticaProyección de micropartículas de oro recubiertas con el ácido nucleico a alta velocidadDispositivo: Gene gunCélulas vegetales

MicroinyecciónMicroinyección del ADN al núcleoDispositivo: microagujas/micromanipuladosCélulas individuales

ElectroporaciónEl ADN pasa a través de poros temporarios en lamembrana celularDispositivo: electroporador. Da un pulso eléctrico queeleva el potencial eléctrico de la membrana celularSuspensión celular

Métodos físicos

Moléculas catiónicas:•Péptidos y sus derivados (por ejemplo, polilisina)•Polímeros sintéticos (polietilenimina o PEI) o naturales (colágeno)•Lípidos catiónicos (liposomas)

Mecanismo: forman complejos con el ADN, que se adhieren a la membranacelular mediante interacciones electrostáticas y son incorporadospor endocitosis.

Métodos químicos

Difieren en eficiencia y

citotoxicidad

Fosfato de calcio: se utiliza una solución buffer para formar un coprecipitadode ADN y fosfato de calcio sobre el cultivo celular. Este precipitado ingresa a lacélula por endocitosis

Métodos biológicos1. Producción de partículas pseudovirales en células empaquetadoras: virus

defectivos para la replicación cuyo genoma incluye al gen de interés2. Infección de células de interés con partículas virales

Ventajas:• Amplio rango de células de mamíferos con alta eficiencia de transfección• Dependiendo el tipo de virus se puede:

Restringir la infección a células en división o a células que no se dividen únicamente

Dirigir a un tipo celular específico (terapia génica) Integrar o no en el genoma

Ejemplo: lentivirus

No todas las células incorporan el ADN foráneo.

Eficiencia: porcentaje de células que incorporaron el ADN.

• Tipo celular• Viabilidad celular • Confluencia• Medio de cultivo• Tipo de molécula

transfectada• Método de transfección• Calidad y cantidad de ADN

Eficiencia de la transfección

Método A Método B

Un vector es una molécula de ADNque se utiliza como vehículo paraintroducir material genético exógenoa otra célula, donde puede replicar oser expresado.

Vectores

Los plásmidos son un tipo de vector. Son moléculas pequeñas deADN circular doble cadena. Se replican en forma independiente delcromosoma bacteriano

Plásmidos

¿Cómo ingresa el ADN a la célula?

Los vectores de clonado son pequeñas moléculas de ADN,con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de lacélula hospedadora y en general, producen un gran numerode copias.

Los vectores de expresión poseen toda la información necesaria para expresar el gen.

¿Clonar o expresar?

Origen de replicación (ori)

Sitios únicos de clivaje para enzimas de restricción (MCS –Multiple cloning site)

Marcadores que permitan su reconocimiento (resistencias a antibióticos)

Entonces, para clonar necesito:

Además del origen de replicación, marcador de selección y MCS, necesito:

Promotor

Sitio de terminación de la transcripción

Sitio de unión a ribosomas

Plus: tags a proteínas fluorescentes o detectables por anticuerpos

¿Y si quiero expresar el gen?

Marcador de selección para eucariotas (transfección estable)

Ya tenemos el gen de interés en nuestro vector… ¿y ahora?

Línea celular

Cultivo primario Células, tejidos u órganos tomados directamentedel organismo y cultivados en un medio artificial.

Cultivo celular que tiene capacidad demultiplicarse indefinidamente

Cultivo celular

Adheridas: Disgregación química, mecánica o enzimática

Suspensión: Dilución

Confluencia – pasajes celulares

Establecimiento de una línea celular

Debe aportar todos los requerimientos para el crecimiento de las células

Buffer: Mantenimiento del pH, bicarbonato, HEPES

Base: Glucosa (fuente de C), aminoácidos (fuente de N), cofactores enzimáticos, vitaminas, sales

Suero: Estímulos proliferativos y adhesivos. Ejemplos: Transferrina, albúmina, factores de crecimiento, etc.

Antibiótico: Prevención de contaminación. Ejemplos: Penicilina, estreptomicina, gentamicina

Suplementos

Medio de cultivo

pH: 7.2 -7.5Osmolaridad: 280 -320mOsmol/kg

CO2: 5 -7 %Temperatura: 37 °C (mamíferos)

Esterilidad → Técnica asép ca

Condiciones físico-químicasMedio de cultivo

Técnica aséptica

Guardapolvo Limpiar el área antes de empezar a trabajar

Corrientes de aire estéril. Esperar 5 minutos antes de comenzar a trabajarMedios esterilizados (filtración), material autoclavado

Esterilizar la cabina con luz UV antes de usarGuantes

Cabinas de seguridad biológicas Mechero

-Cabello recogido-Guardapolvo

Limpiar la mesada de trabajo con alcohol 70%

Verificar el material de trabajo

Saber qué hay que hacer = Leer la guía

Descartar el material,Verificar mecheros,Limpiar la mesada,Dejar las pipetas en su máxima graduación

Antes de entrar

Antes de empezar

Al finalizar

Reglas de trabajo en el laboratorio

Desarrollo del TPMaterialesTubos eppendorfs estérilesTips estérilesMicropipetas

SolucionesPEI 87kOpti-MEMADN plasmídico-GFPPBS estérilMedio de cultivo completo (DMEM con 5% Suero fetal bovino, antibiótico)

TP de transfección

N-cadherina-GFP 850 ng/µlβ3-integrina-GFP 490 ng/µlα Actinina-GFP 370 ng/µlPTP1B-D181A-GFP 560ng/µlPaxilina-GFP 610 ng/µlTubulina-GFP 580 ng/µl

1. Sembrar las células en una placa multipocillos a una densidad celular adecuada 24 hs antes de la transfección

2. Preparar la mezcla de transfección usando los reactivos a temperatura ambiente en tubos de 1,5 ml estériles de la siguiente manera:-1 µg de DNA/pocillo -2 µl de PEI 87k /pocillo -100 µl/pocillo de Opti-MEMIncubar durante 10 minutos a temperatura ambiente

3. Lavar cada pocillo de células con PBS estéril 2 veces4. Agregar 200 µl de Opti-MEM a cada uno5. Agregar la mezcla de transfección a cada pocillo

6. Incubar 2 a 4 hs en estufaCambiar el medio de las células por medio fresco completo a 37 °C