Trucos y consejos en el desarrollo de métodos en LC y LCMS fileTrucos y consejos en el desarrollo de métodos en LC y LCMS 1 Jos Juan Rivero Especialista de producto Agilent Technologies,

Trucos y consejos en el desarrollo

de métodos en LC y LCMS

1

Jos Juan Rivero

Especialista de producto

Agilent Technologies, Spain

16 de Abril de 2015

Indice

En esta sesión se abordará :

Introducción

Fundamentos de la técnica LC

Requisitos para el desarrollo de un método

Parámetros de optimización y variables

Especificidad del método LCMS.

Indice


Introducción





El desarrollo de un método LC depende principalmente de:

El objetivo del método

• Cuantitativo o Específico, Cualitativo o Genérico, Alto rendimiento, número de muestras…

El sistema de detección (selectividad)

• UV,FLD, ELSD, IR, MS FullSCan, MS Target

El origen de la muestra y su extracción (carga de matriz)

• Biológica, extracto de alimento, suelo, aguas, etc….

Las características del equipo/columna

disponible

Page 5

o Diferentes tipos de método

o Diferentes criterios de desarrollo

o Diferentes objetivos de optimización

o Diferente instrumentación

Base Fundamentos LC

Definición

Objetivo

Instrumento

Pruebas de desarrollo

Indice


Introducción





El desarrollo y la optimización del método requiere el conocimiento de :

o El sistema completo (diagrama del sistema)

o Las reglas del juego – Conceptos Teóricos

o Los fenómenos asociados

o Detalles del proceso de separación

o Principio de detección

Page 8

Injector

Detector

Column

Solvents

Pumps

Mixer

Chromatogram

Start Injection

mAU

time

Page 9

Tipo de compuestos Modo Fase

Estacionaria

Fase Móvil

Neutros

Acidos Débiles

Bases Débiles

Compuestos Muy polares

Fase Reversa

“HILIC”

C18, C8, C4

ciano, amino

Silica acuosa

Agua/Orgánicos

Modificadores

Agua/Orgánicos

Iones , Bases, Acidos Par Iónico C-18, C-8 Agua/Orgánicos

Sal Par Iónico

Compuestos hidrofobos Fase Normal Silica, Amino,

Cyano, Diol

“Silica HILIC”

Organics

Agua / ACN

Iones Inorgánicos Intercambio

Iónico

Anion or Cation

Exchange

Resin

Agua Tampones

Contra Ión

Compuestos de Alto

peso molecular

Polimeros

Size

Exclusion

Polystyrene

Silica

Gel Filtration-

Aqueous

Gel Permeation-

Organic

Page 10

• Ecuación fundamental de Resolución

• La curva de Van Deemter

• Los procesos de difusión

• Particulas superficialmnete porosas

• Calentamiento por fricción

)(2/1 2,1, tt

Rs

ww

tR

Time t

Separation ΔtPeak width w

¿Qué pasa dentro de la columna?Importancia de la resolución

Δt Δt

Buena separación Separación pobre

w www

Buena separación Separación pobre

Resolución - selectividad - retención

k

kNRs

1

1

41

R = Resolución

N = Numero de platos Long. Columna y tamaño de partícula

α = Selectividad Fase móvil y estacionaria, Temperatura

k = Ret. relativa Fase móvil y estacionaria

O

t - tOR

t=k' = k’B

k’A

p

cS

d

LNR ~

N y R aumentan con :

La columna más larga

Un tamaño de partícula menor

)(2/1 2,1, tt

Rs

ww

tR

p

cs

dh

LR

41~

)(wfh

La combinación de ambas fórmulas resulta la Ecuación de VanDeemter que considera las propiedades físicas, termodinámicas y cinéticas de una

separación.

h = f ( weddy + wax + wC )

La eficacia de la columna dependerá de tres tipos diferentes de difusión

weddy ~ Calidad empaquetamiento y dp1. Diferencias en el trayecto recorrido:

Diferentes camino Mal empaquet. Distrib. Tamaño

Diferentes difusiones en el sistema

wC ~ dp2

Partícula porosa

Capa de fase móvil

3. Difusión por resistencia a la transferencia de masa:

2. Difusión lineal en el seno de un fluido :

A bajo flujo, el analito permanece más tiempo en la fase móvil. Mayor anchura de pico.

wax Flujo

Longitudinal diffusion

Página

16

Optimización del Flujo de Fase Móvil.

Ecuación Van Deemter: Inverso Eficacia “ vs“ Flujo

Pla

te H

eig

ht

H:

HE

PT

1/N

Linear Velocity u

Eddy Diffusion *

H Sum Curve: Van Deemter

Resistance to Mass Transfer *

u opt

H min

C

A B C

A

B

Static Mobile Phase

Diffusion Path Deviations

into pores of particle

Porous Particles

Las partículas más pequeñas otorgan una mayor eficacia de separación.

Además la influencia del incremento del flujo en la eficacia de la separación es mucho menor.

H = + + u

u

< 2 µm

Totalmente porosas< 2 µm , sub-two-micron (STM)

SOLID CORE < 3 µm

Superficialmente porosas

~ 0.5µm

• Distancia de difusión es menor.

• Luego también la resistencia a la transferencia de masa.

• Eficacia similar (80%) a las totalmente porosas STM.

• Aproximadamente 40-50% presión de las STM.

C

Tipos de partículas

Fast Analysis of Analgesics on Poroshell 120 Column

Definición : Calor generado por la fricción entre fase móvil y estacionaria

Cuantitativamente podría calcularse como ::

Potencia = ΔP x F

ΔP = Caída de presión a lo largo de la colmuna [N/m2]

Depende de : • Longitud de la columna

• Diametro de la columna

• Tamaño de la partícula

• Viscosidad de la fase móvil

• Flujo

F = Flujo [m3/s]

Las columnas con mayor diámetro trabajan a mayor flujo y por lo tanto son capaces de disipar mayor potencia.

Calentamiento por fricción

Gradiente longitudinal

Flow

Gradiente radial

Flow

Situación adiabáticaTipo horno de ventilador

Optimas condicionesTipo columna en baño

• Gradiente de temperatura dentro de la columna

Calentamiento por fricción – consecuencias

40° C

65° C

100 5Time in Minutes

A B

AB

Calentamiento por fricción – consecuencias

Indice


Introducción





El desarrollo del método generalmente no parte de cero.

Un desarrollo desde cero implica disponer de muchos más recursos y un sistema más complejo para poder experimentar con muchas fases móviles, estacionarias, modificadores, Temp. , etc…

La propia experiencia y la búsqueda en bibliografía nos debe permitir encontrar un punto de partida :

Columna, Disolventes, Gradiente, …

La fase estacionaria (selectividad , α) es el factor que mayor influencia tiene en la separación pero es difícil de poder predecir.

Hay que tener en cuenta además aquellos factores que van a “penalizar” el rendimiento del método :

Volumen muerto del sistema, de la columna.

Page 24

• “System volume from the point of mobile phase mixing to the columnhead” (W. Dolan LCGC 2006 Vol. 24, No. 5, 458-466)

• Retrasa la llegada del gradiente a la columna.

• Prolonga el tiempo que la muestra permanece en la columna en condiciones isocráticas.

Totvolumen

Reducción del volumen muerto

Page 25

• La dispersión es la dilución de la muestra que ocurre en tubos, vávulas, celdas y conexiones.

• Conexiones capilares (diam.interno, longitud)

DispersiónAltura de pico : pérdida de sensibilidad

Anchura de pico : pérdida de resolución


2.1 mm 3 mm 4.6 mm

Agilent 1100 / Standard 1200

Agilent 1200 RRLC (standarddelay vol.)

Agilent 1200 RRLC (low delay vol.)

Agilent 1290 Infinity LC

El volumen muerto de los sistemas está en relación con el diámetro de columna y el flujo.


Indice


Introducción





Page 28

Menor tiempo de análisis(misma resolución)

Mayorsensibilidad Aplicación

Mayor resolución(mismo tiempo de análisis)

Mayor resoluciónY menor tiempo de análisis

Hacia dónde dirigir la optimización

Page 29

Menor tiempo de análisis(misma resolución)

Aplicación

Optimizando el tiempo de análisis

Tomamos como punto de partida un método definido, con tipo de columna definida. El objetivo es hacer un método más rápido que permita hacer un mayor número de muestras por día p.e.

Page 30


A través del desarrollo teórico visto anteriormente se llega a una de las fórmulas más importantes para la optimización de métodos :

Ft

Vb

G

c

~

F: Flujo

b: Pendiente de gradiente

Vc: Volumen de la columna

Vm ≈ Vc (mínimo vol.muerto)

Lc: Longitud de la columna

Ft

L

G

c

~

Si b permanece constante, el perfil de elución no cambia.

Esto nos permite jugar en varias direcciones.

Page 31

consFt

Lb

G

c

~

p

c

d

LN ~

Acortar la longitud de la

columna pero mantener a

misma eficacia requiere :

=> Partículas más

pequeñasMenor tiempo de análisis(misma resolución)

Aplicación

En éste caso queremos acortar la columna pero mantener la resolución y el Flujo.


Page 32


Regla genérica Longitud / Diam.Part

2

2

1

1~p

c

p

c

d

L

d

LN

Al final obtenemos un método más rápido con la misma resolución cambiando :• Columna más corta (Lc)• Diámetro de partícula más pequeño (dP)• Gradiente más rápido (tG)

2.1mm x 50mm 1.8µm

1.00ml/min, 40°C

Grad.: 35-95% en 0.9 min

Analysis Time= 1.1min

UHPLC/RRLC, 40°C

10x faster

PW = 0.5 sec

min0.2 0.4 0.6 0.8 10

Ejemplo de Mejora de Velocidad HPLC vs UHPLCAgilent 1200-RRLC

HPLC, 40°C

PW = 3.4sec

4.6 x 150mm, 5µm

1.20ml/min, 40°C

Grad.: 35-95% en 10.8 min

Analysis Time = 11min

min0 2 4 6 8 10

0.2 0.60 0.4 min

2.1mm x 50mm 1.8µm

2.40ml/min, 95°C

Grad.: 35-95% en 0.38 min

Analysis Time: 0.4min

UHPLC/RRLC, 95°C

27x faster

PW = 197msec

150mm > 50mm: 3x

1.2ml/min on 4.6 > 2.4ml/min on 2.1: 10x3 x 10 = 30x

Hasta 20x más rápido que un HPLC. Manteniendo la resolución

Página 33

Page 34

Aplicación


Optimizando laresolución

p

c

d

LN ~

Page 35


Aplicación


consFt

Lb

G

c

~

Incrementar la longitud de

columna

Pero esto obliga a

aumentar el tiempo de

gradiente (b= cte)

Page 36


p

cS

d

LNR ~

Particulas más

pequeñas


Aplicación


Otra forma es simplemente disminuir el tamaño de partícula

Como consecuencia, la Presión de trabajo será más alta.

4.6 x 150, 1.8um

490 bar

N = 28669

RS = 1.80 (+ 57%)

S/N = 44

7 Impurezas

Las 7 Separadas

a línea de base

4.6 x 150, 5um

93 bar

N = 7259

RS = 1.15

S/N = 42

Ejemplo de un cliente

Método Impurezas Isocr.

Zoom zona critica

rango tiempo @ 7min

4.6 x 150, 3.5um

165 bar

N = 14862

RS = 1.37

S/N = 50

7 Impurezas

6 No Separadas

a línea de base

Ejemplo de Mejora de Resolución HPLC vs

UHPLC con Columnas de 150mm x 1.8µmEjemplo con muestra compleja: hasta un 60% de Mejora en la Resolución

4 Impurezas

2 No Separadas

a línea de base

HPLC UHPLC

Página 37

p

c

d

LN ~

Page 38


Aplicación


consFt

Lb

G

c

~

Incrementar la longitud de

columna

Se aumenta el flujo para

mantener (b= cte)

Otra forma es aumentar Longitud y Flujo

Como consecuencia, la Presión de trabajo será más alta.

1. Las partículas más pequeñas otorgan una mayor eficacia de separación.

2. Además la influencia del incremento del flujo en la eficacia de la separación es mucho menor.

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0030

0.0035

0.0040

0.0045

0.0 0.5 1.0 1.5

Alt

ura

eq

uiv

alen

te d

el p

lato

teó

rico

HET

P

5.0 m

3.5 m

1.8 m

Flujo

Page 40

En 2 versiones

On-line

o en su PC

Esta herramienta funciona muy bien para el traslado de métodos sí :

1. Se dispone de la misma fase estacionaria en diferentes tamaños de partícula, manteniendo la selectividad.

2. El volumen del sistema cromatográfico está en línea con el tipo de la columna.

AgilentMethod Translator

http://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Instruments-Systems/Liquid-Chromatography/Pages/1200infinity_cost_calculator.aspx

http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe

Page 41

El papel de la Temperatura

La temperatura tiene influencia en varios sentidos :

• Viscosidad de la fase móvil (presión, tiempo de análisis)

• Transferencia de masa (anchura de pico, resolución).

• Selectividad

• Estabilidad de los analitos.

Page 42

El papel de la Temperatura

EficaciaPresión

Selectividad

Page 43

Optimizando lasensibilidad

Mayorsensibilidad Aplicación

La sensibilidad, o más en concreto el LOD de un análisis viene determinado por la relación de señal y ruido (S/N).

Su optimización pasa por incrementar la señal y disminuir el ruido

El LDI (límite de detección instrumental es un indicador más robusto para medir el limite real de detección de un equipo)

Noise

Signal

hSignal = 3(2) x hNoise

Limit of Detection (LOD):

Page 44

Optimizando lasensibilidad

La capacidad de optimización de sensibilidad de un método depende principalmente del tipo de detector, UV-Vis, FLD, ELSD, MS …

Desde el punto de vista del pico, se puede hacer que sea más estrecho y por lo tanto más alto aumentando la señal.

Puesto que el detector UV-Vis es probablemente el más usual, observaremos como se puede aumentar la sensibilidad en UV-Vis.

Más adelante cubriremos las especificidades del LCMS.

Page 45

Optimizando laSensibilidad UV-Vis

From: “Enhancing Signal to Noise”, John W. Dolan, LC/GC, March, 2010

Factores dependientes del

analito

Longitud de onda

Modificación del analito (*)

Inyección de más muestra (*)

Factores dependientes del

detector

Mejor detector (*)

Incrementar la frecuencia (*)

Mejorar el filtrado (*)

Factores dependientes del sistema (columna,

bomba,etc..)

Reducir anchura de pico (*)

Control de la Temperatura

Pureza de disolventes (*)

Menor ruido de mezcla

(*) Parámetros válidos para cualquier detector en general

Page 46


Optimización del Detector UV-VIS

Ruido de línea de base

• Tipo y Geometría de la celda de flujo

• Diseño de la óptica

• Frecuencia de muestreo

• Rendija óptica

Page 47


Tipo y Geometría de la celda de flujo

10 mm path length

13 µL volume

4.6 mm i.d. column

+ =

+ =

Short 2.1 mm i.d. column 10 mm path length

13 µL volume

+ =

Short 2.1 mm i.d. column Long path length (10 mm, 0.5 µL)Low light transmission => high noise

Ventajas:

• Alta sensibilidad con bajo volumen de celda.

• Reducción de efectos de IR (Índice de refracción) y térmicos (temperatura del disolvente).

• Diseño en cartucho para comodidad de manipulación e intercambio .

Non-coated fiber (Fused Silica)

Alta transmisión de luz por la tecnología de Total-Internal Reflection (TIR) principle

Page 48

Optofluidic

Waveguides

Agilent Infinity

Diode Array Detector


Tipo y Geometría de la celda de flujo

Lampara de D2

Cartucho “Max-Light” Con celda de 3,7 , 10 o 60 mm

Rendija programable

Diode arraycon 1024 elementos

DifractorEspejo

Page 49

Optofluidic

Waveguides Agilent 1260/90 Infinity Diode Array Detector

Optimizando laSensibilidad UV-Vis Diseño de la óptica

Page 50

Optimizando laSensibilidad UV-Vis Rendija óptica

nm230 240 250 260 270 280

Absorbance

00.10.20.30.40.50.6

(mAU)

1 nm

2 nm

4 nm

8 nm

Noise

Rendija programable para optimizar la sensibilidad y la resolución espectral.

Rendija programable

Page 51

• Sample: Phenone Test Mix

• Column: Zorbax SB-C18, 4.6x30, 1.8um

• Gradient: 50 -100% ACN in 2 min

• Temperature: 50°, Flow Rate: 2.5 mL/min

• Signal: 250nm, Bandwith: 20nm

• Reference: 360nm, Bandwidth: 100nm

Hz Height (% Difference) Resolution (% Difference) Efficiency (% Difference)

40 11.3 4.01 23622

20 10.8 (-4.4%) 3.76 (-6.2) 20889 (-12)

10 9.62 (-15%) 3.29 (-18) 15824 (-33)

2.5 4.6 (-59%) 1.34 (-67) 2680 (-89)

Peak Width 0.10 min. (2.5Hz)

Peak Width 0.025 min. (10Hz)



min0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95

mAU

0

2

4

6

8

10


Frecuencia de muestreo

Page 52



min0 0.5 1 1.5

mAU

0

2

4

6

8

min0 0.5 1 1.5

mAU

0

2

4

6

8

Noise(PtoP, 0.5 – 1.5 min) = 1.48 x 10-2 Noise(PtoP, 0.5 – 1.5 min) = 5.43 x 10-2

File size(DAD1A.ch) = 9 KB File size(DAD1A.ch) = 45 KB

Data rate = 10 Hz Data rate = 160 Hz

Page 53



Frecuencia óptima para máxima sensibilidad 40 HzPara éste método

Indice


Introducción





Page 55

En LCMS existe dos principales modos de trabajo

Enfoque dirigido (Target)

• Cuantificación de compuestos conocidos

• Lista cerrada de compuestos

• Técnica de máxima sensibilidad

Enfoque NO dirigido (Untarget)

• Identificación de compuestos desconocidos

• Confirmación de compuestos “desconocidos”

• Lista de compuestos a identificar abierta

Consideraciones generales

Agilent 6000 Series LC/MS Portfolio

6200 series TOF

6100 series Quad

6500 series Q-TOF

6400 series QQQ

Alta resolución – Cuali y Cuantitativo

Baja Resolución - Cuantitativo

MS

MS / M

S

Page 57

El enfoque Dirigido o NO Dirigido conlleva el crear un método específico o genérico respectivamente.

La técnica, basada en la formación de iones moleculares, busca el máximo rendimiento del proceso de ionización, cualquiera que sea éste : ESI, APCI, APPI, MALDI, NanoESI, etc….


Sin embargo ambos enfoques buscarán siempre la menor interferencia posible de la matriz por los efectos de supresión iónica que ésta puede generar.

Page 58

El enfoque Dirigido busca siempre la máxima sensibilidad y requiere una mayor optimización del método :

Optim.Cromatográfica Mínima coelución :Por supresión iónicaPor interferencia espectralPor máximo tiempo dedicado (dwell time)

Parámetros de IonizaciónParámetros óptimos para cada compuesto (Fragmentor, CE)EMV


Page 59


El enfoque NO Dirigido se conforma con una mínima separación cromatográfica para evitar la supresión iónica.

Adquiere en FullScan siempre MS y/o MS/MS. Método simple y sencillo. NO dependiente del compuesto (¿Cuál?)

La potencia del enfoque se centra en el tratamiento de los datos de alta resolución.

Algoritmos de deconvolución sofisticados pero de fácil manejo para extraer datos del FullScan.

Page 60

Optimizando un método LCQQQ

Obtener el máximo de información posible de la muestra

• Origen, cantidad solubilidad, estabilidad, condiciones de almacenaje.

• Estructura molecular, MW, pK, pI, polaridad.

• Utilizar la técnica de ionización más adecuada : ESI, APCI,….

• Utilizar la polaridad apropiada.

– Negativa para : ácidos, hydroxilos, fosfatos, sulfatos, etc…

– Positiva para : bases, aminas, amidas, antibióticos, etc…

Consultar literatura de trabajos previos en MS para el compuesto.

• http://www.chem.agilent.com/scripts/Library.asp?OPT=OL

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez

Utilizar la introducción de muestra más conveniente : infusión, FIA, Cromatografía, CE, etc..

Información previa

http://www.chem.agilent.com/scripts/Library.asp?OPT=OL

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez

Page 61


1. Determinar / confirmar el ión precursor por MS2 scan (Protonados, ¿aductos Na+, AcO-,

NH4+, en muestra?

2. Optimizar los parámetros de la fuente basado en la composición de la fase móvil y el flujo?

3. Optimizar los parámetros propios de cada compuesto por FIA (o importar directamente de

una Database)

a. Determinar el Fragmentor óptimo para una máxima transmisión del precursor

b. Determinar la óptima Energía de Colisión para cada compuesto

4. Crear el método de MRM o DMRM

a. Los parámetros de la fuente no suelen cambiar

b. Utilizar los optimizados de cada compuesto: Fragmentor, Product Ions & Collision Energies

• Pueden también importarse de la Database del OPTIMIZER

c. Ajustar la separación cromatográfica en base a un óptimo ciclo (num.puntos por pico)

d. Determinar los segmentos de tiempo, dwell times, o usar Dynamic MRM

e. Inyectar una recta de calibrado y establecer un método de procesado cuantitativo

Desarrollo del Método

MRM dinámico (DMRM)

Mejora de la sensibilidad basado en la

especificidad de la transición a su tiempo

Page 62

tMRMConfirmación espectral de los target sin barrido

ni perdida de sensibilidad

Optimizer

Si no se dispone de Kits de Agilent permite

buscar los valores de adquisición óptimos

para la cuantificación

Counts vs. Acquisition Time (min)

x105

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Segmento 1Segmento 2

Segmento 3

Segmento 4

Análisis por segmentos vs. MRM dinámico

MRM Dinámico: No hay segmentos de tiempo

La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interés

Menor tiempo de ciclo/Mejor definición de pico

x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1Nº de TransicionesConcurrentes =

Rt

Selección de 24 transiciones de analitosPara ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.

Tiempo de Ciclo

MRM dinámico

x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1

Selección de 24 transiciones de analitosPara ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.

Nº de TransicionesConcurrentes =

Tiempo de Ciclo

MRM dinámico

Time >>>

Abundance

>>

>

Concurrent

Compounds

MRM dinámico - Simulación

Resultados típicos: 10 pg Atrazine on-column usando Dynamic

MRM

6460A QQQ with Jet Stream Technology

Avg. Signal Height: 15,650

Avg. Signal Area: 50,966

RSD: 3.2 %

Estimaciín LOQ: < 100 fg

6-7 puntos por encima de media

altura.

3 seg. de anchura a media altura

(FWHM) 6 seg @10% valle

20 puntos de inicio a fin de pico

•

•

•

•

•

•

••

•••

••

•

• • •

•

•• • •

3 sec FWHM

10% valley

Pesticides LC/MS method

Jet stream conditions

Drying gas temperature 275 ºC

Drying gas flow (nitrogen) 6 L/min

Nebulizer gas pressure (nitrogen) 35 psig

Capillary voltage 4000 V

Sheath gas temperature 325 ºC

Sheath gas flow 12 L/min

Nozzle voltage Off

6460A QQQ

settings

MS1 and MS2 resolution Unit

Time Filtering pk width = 0.03

min

Dynamic MRM transitions up to 4000

Constant cycle time 373 ms

Delta EMV 400 V

1200 LC parameters

Column Eclipse Plus-C18, 2.1 x 100mm, 1.8 µm

Column temperature 35 ºC

Injection volume 5.0 L

Autosampler temp 6 ºC

Needle wash flushport (MeOH:H2O 75:25), 5 secs

Mobile phase A = 0.01% formic acid in water

B =5 mM ammonium formate 0.01% formic acid in 95:5 acetonitrile:water

Flow rate 0.3 mL/min

Gradient 0 min 6% B

15 min 95% B

Stop time 20 min 6% B

Post time 1 min

Dynamic MRM of 300 Pesticides two Transitions Each

Page 69

LC 2.1 x 100 C18 Eclipse PLUS 1.8 u

Fragmentor Voltage Collision Energy

QQQ Analyte Optimizer: Máxima Sensibilidad

Optimización Automática de 2 Settings clave

MassHunter Optimizer – Step 1: Compound Setup

First, click the New Project button.

In Compound Setup tab:

• Right-click in the table, and select Add compound.

• Enter compound name and either formula or nominal mass.

• Enter Vial Number.

• Select compound for optimization.

New

Project

Select

compound

FIA to Optimize Fragmentor Voltage

Voltage: 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

EIC 316.2 (clonazepam precursor ion) Optimum Fragmentor Voltage

FIA to Optimize Collision Energy

CE (V): 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

EIC 270.2 (a clonazepam product ion; -NO2)

Optimum Collision Energy

¿Para qué sirve el triggered MRM?Cuantificación y Confirmación : Fingerprinting

Enfoque de barrido:

Barrido de la huella del compuesto

Estrategia tMRM:

Foco en las características (fragmentos)

del compuesto

Dos posibles escenarios:

- Confirmación de positivos con información adicional

(confirmación espectral)

- Eliminación de negativos debido a interferencias de la matriz

Mayor confianza en la confirmación

“Triggered MRM (tMRM) Data Dependent”: ~“Scan”

Especifico con la Sensibilidad y Rapidez de un MRM

Cuantificar e Identificar con la sensibilidad y rapidez de un MRM

1 MRM de monitorización por compuesto dispara hasta 8 MRM de

confirmación de cada uno de los compuestos detectados

Muy útil para cuantificación y confirmación masiva de analitos con Triple

Cuadrupolo: análisis multiresiduos, metabolitos …

Página 75

Threshold

Secondary MRM

Transitions are “Triggered”

Primary cycle (below threshold)

Triggered cycle (above threshold)

tMRM Product Ion Spectrum

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

334.2171.1

145.0

132.1

117.0

105.191.176.0

tMRM Product

Ion Spectrum

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080

76.0

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100

91.1

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100 120

105.1

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100 120

117.0

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

0100 140

132.1

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100 120

119.0

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

0100 140 180

145.0x103

8

7

6

5

4

3

2

1

0100 140 180

147.0

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

080 100 120 140 160 180

171.1

334 > 76 334 > 91 334 > 105 334 > 117 334 > 119

334 > 132 334 > 145 334 > 147 334 > 171

tMRM Library Searching

Tebufenpyrad Standard 50 ppb

Library match score: 96.75

Page 78

En muestras complejas de alta carga de matriz, buscar la separación cromatográfica de ésta.

Evitar la coelución con compuetos polares de la matriz. Típicamente éstos compuestos eluyen :

– Durante los -2 minutos en columnas de fase reversa convencionales.– Durante < 1 minuto en columnas UHPLC.– Consejo: durante ése período enviar el lo que eluye de la columna a desperdicio

para evitar que entre en el espectrómetro.

Las separaciones con gradiente son menos propensas a acumular background de la matriz que las separaciones isocráticas. Aún así limpiar la columna a menudo.

Debe considerarse técnicas como patrones con marcaje isotópico, si hay disponibles, para compensar restos de supresión iónica en matrices de alta dificultad (cereales).


Supresión Iónica de la Matriz

Page 79

Patrones en

dilución, Sin

Preparación

Extracto de Blanco

de matriz + Adición

de Patrones

Extracto de Blanco de

matriz dopada con

patrones antes de la

extracción

Comparar la

respuesta de área

para determinar la

supresión iónica

Comparar respuesta de área

para determinar la

recuperación de la

extracción

El estudio debería realizarse con múltiples muestras de diferentes orígenes. e.g.

Blanco de orina de diferentes pacientes, blanco de tomate de diferentes especies,

etc.

Evaluación del impacto de la supresión Iónica

Supresión Iónica de la Matriz

Agilent 1290 Infinity LC

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Trucos y consejos en el desarrollo de métodos en LC y LCMS fileTrucos y consejos en el desarrollo de métodos en LC y LCMS 1 Jos Juan Rivero Especialista de producto Agilent Technologies,