Uji Aktivitas Amilase (Kelompok 1) Biokimia

8/20/2019 Uji Aktivitas Amilase (Kelompok 1) Biokimia

1/10

Uji Aktivitas Amilase

Rajkannah Poongan 2601101320011

, Shadish Kumar Subramaniam 2601101320022

,

Jimmy Chan Wei Kit 2601101320033, Vikneswaran Mutayah 2601101320044,

Mahalacimy Selvaraj 2601101320055

Abstrak

Enzim amilase dapat memutuskan ikatan glikosidik (α 1 4) di antara satuan glukosa

yang membentuk polimer, seperti pati. Pati terdiri atas amilosa dan amilopektin, yang

tersusun atas satuan glukosa rantai lurus dan rantai bercabang. Hasil hidrolisis pati

oleh amilase adalah glukosa. pengujian aktivitas enzim amilase dengan menggunakan

metode Caraway – Somogyl. Metode ini menggunakan larutan iodin/kalium iodide

sebagai indikator. Enzim amilase yang digunakan adalah enzim yang terdapat dalam

ekstrak pepaya dan aktivitas enzim tersebut dilakukan terhadap larutan pati dengan

menggunakan variasi suhu dan pH. Berdasarkan data hasil pengamatan, dapat

diketahui dimana enzim amilase dapat berkerja dengan baik dan optimal pada suhu

37oC dan pH 5.6. Data yang diperoleh adalah cocok dibandingkan dengan literature.

Oleh itu, suhu tersebut merupakan suhu normal tubuh manusia yaitu 37oC dan pH 5.6

merupakan pH yang mendekati netral seperti air liur manusia.

Abstract

Amylase enzyme may decide glycosidic bond ( α 1 4 ) in the glucose unit forming the

polymer , such as starch . Starch consists of amylose and amylopectin , which is

composed of glucose units straight chain and branched chain . Results of starch

hydrolysis by amylase is glucose . amylase enzyme activity test using Caraway -

Somogyl . This method uses a solution of iodine / potassium iodide as an indicator .


2/10

Amylase enzyme used is an enzyme found in papaya extract and enzyme activity was

directed against starch solution by using a variation of temperature and pH . Based on

the observed data , it can be seen that the enzyme amylase can work properly and

optimally at 37 ° C and pH 5.6 . The data obtained are suitable as compared to

literature . Thus , the temperature is normal human body temperature is 37 ° C and

pH 5.6 is the pH close to neutral as human saliva.

Pendahuluan

Enzim adalah molekul biopolimer

yang tersusun dari serangkaian asam

amino dalam komposisi dan susunan

rantai yang teratur dan tetap. Enzim

memegang peranan penting dalam

berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai

protein, enzim diproduksi dan

digunakan oleh sel hidup untuk

mengkatalisis reaksi, antara lain

konversi energi dan metabolisme

pertahanan sel. Enzim meningkatkan

laju reaksi sehingga terbentuk

kesetimbangan kimia antara produk

dan pereaksi. Pada keadaaan

kesetimbangan, istilah pereaksi danproduk tidaklah pasti dan bergantung

pada pandangan kita. Dalam keadaan

fisiologi yang normal, suatu enzim

tidak mempengaruhi jumlah produk

dan pereaksi yang sebenarnya dicapai

tanpa kehadiran enzim. Jadi, jika

keadaan kesetimbangan tidak

menguntungkan bagi pembentukan

senyawa, enzim tidak dapat

mengubahnya (Shanbagh, 1990).

Suatu enzim dapat mempercepat reaksi

108 sampai 1011 kali lebih cepat

daripada apabila reaksi tersebut

dilakukan tanpa katalis. Jadi enzim

dapat berfungsi sebagai katalis yang

sangat efisien, disamping itu

mempunyai derajat kekhasan yang

tinggi. Seperti juga katalis lainnya,

maka enzim dapat menurunkan energi

aktiasi suatu reaksi enzim dapatmenurunkan energi aktivasi suatu

reaksi kimia. Reaksi kimia ada

membutuhkan energi atau


3/10

mengeluarkan energy (Abraham,

1998).

Pengukuran aktivitas amilase dan

glukanase dilakukan berdasar kepada

kemampuan enzim tersebut dalam

mengurai substrat (polisakarida)

menjadi monosakarida dalam bentuk

gula pereduksi, pada satuan waktu

tertentu. Akurasi pengukuran dapat

dicapai bila proses deteksi gula

pereduksi berlangsung optimum.

Reagen DNS yang digunakan dalam

mengukur gula pereduksi terdiri dari

asam dinitrosalisilat, garam Rochelle

dan natrium hidroksida (Murray,

1992).

Faktor-faktor yang dapat

mempengaruhi fungsi :

Suhu

Oleh karena reaksi kimia itu dapat

dipengaruhi suhu maka reaksi

menggunakan katalis enzim dapat

dipengaruhi oleh suhu. Di samping itu,

karena enzim adalah suatu protein

maka kenaikan suhu dapat

menyebabkan denaturasi dan bagian

aktig enzim akan terganggu sehingga

konsentrasi dan kecepatan enzim

berkurang.

pH

Umumnya enzim efektifitas

maksimum pada pH optimum, yang

lazimnya berkisar antara pH 4,5-8.0.

Pada pH yang terlalu tinggi atau terlalu

rendah umumnya enzim menjadi non

aktif secara irreversibel karena

menjadi denaturasi protein.

Konsentrasi enzim

Seperti pada katalis lain, kecepatan

suatu reaksi yang menggunakan enzim

tergantung pada konsentrasi enzim

tersebut. Pada suatu konsentrasi

substrat tertentu, kecepatan

reaksibertambah dengan bertambahnya

konsentrasi enzim.

Konsentrasi substrat

Hasil eksperimen menunjukkan bahwa

dengan konsentrasi substrat akan

menaikkan kecepat reaksi. Akan tetapi,

pada batas tertentu tidak terjadi

kecepatan reaksi, walaupn konsenrasi

substrat diperbesar.


4/10

Zat-zat penghambat

Hambatan atau inhibisi suatu reaksi

akan berpengaruh terhadap

penggabungan substrat pada bagian

aktif yang mengalami hambatan.

Suatu enzim hanya dapat bekerja

spesifik pada suatu substrat untuk

suatu perubahan tertentu. Misalnya,

sukrase akan menguraikan rafinosa

menjadi melibiosa dan fruktosa,

sedangkan oleh emulsin, rafinosa

tersebut akan terurai menjadi sukrosa

dan galaktosa (Alison, 2013).

Pati yang juga merupakan simpanan

energi di dalam sel-sel tumbuhan ini

berbentuk butiran-butiran kecil

mikroskopik dengan berdiameter

berkisar antara 5-50 nm. Pati

umumnya akan terbentuk dari dua

polimer molekul glukosa yaitu amilosa

(amylose) dan amilopektin

(amylopectin). Amilosa merupakan

polimer glukosa rantai panjang yangtidak bercabang sedangkan

amilopektin merupakan polimer

glukosa dengan susunan yang

bercabangcabang (Abraham, 1998).

Pati merupakan polimer yang tersusun

dari unit satuan α-D-glukosa yang

dihubungkan oleh ikatan α-1,4

glikosidik dan ikatan α-1,6 glikosidik

pada percabangan rantainya. Secara

alami, pati merupakan campuran dari

amilosa dan amilopektin yang kedua-

duanya merupakan suatu polimer dari

α-D-glukosa (Andrew, 2005).

Metode

• Gelatinasi Pati Larut

400mL pati larut 1% ditambah pada

50mL aquadest dan dibiarkan

mendidih dalam beaker dan diaduk.

Telah digenapkan hingga 100mL air.

Larutan pati yang tergelatinisasi

dibiarkan untuk dingin pada suhu

kamar.

• Pembuatan Kurva Standar Pati

(Duplo)

2.5mL larutan stok telah diisi ketabung reaksi, dengan 1.75mL dapar

fosfat 0.1mL pH 5.6 dan 0.75mL

Aquadest. Campuran reaksi diambil,

dan dipindah ke tabung reaksi lain


5/10

berisi 1.5mL HCL 10% dan reaksi

dihentikan. Setelah itu, ditambahkan

1.5mL indikator (larutan iodin-kalium

iodida). Dibaca absorbansinya pada

620nm. Seterusnya, disediakan blanko,

dengan komposisi yang sama dengan

campuran reaksi, kecuali tanpa

penambahan indikator.

• Uji aktivitas amilase pada variasi

suhu (duplo)

Tabung telah diisi 2.5mL larutan stok

dan 1.75mL dapar fosfat,0.1mL pH 5.6

dan 0.75mL ekstrak amilase.

Campuran diinkubasi pada

27,37,47,57, dan 67oC selama 30

menit. 1mL campuran diambil dandimasukkan ke tabung reaksi lain yang

berisi 3mL HCl 10% untuk hentikan

reaksi. Setelah itu, ditambahkan 3mL

indikator (larutan iodin-kalium iodida).

Dibaca absorbansi pada 620nm,

konsentrasi pati terhidrolisis dikali

dengan faktor pengenceran. Blanko

disediakan. Jumlah pati terhidrolisis

per waktu ditentukan dari kurva

standar (substrat) terhadap absorbansi.

• Uji Amilase pada Variasi pH

(duplo)

Tabung reaksi telah diisi 2.5mL

larutan stok, 1.75mL dapar pH 3.5,

4.5, 5.6, 7.5, 9.5, dan 0.75mL ekstrak

amilase. Campuran telah diinkubasi

pada suhu 370C selama 30 menit. 1mL

dari camuran dipindah ke tabung

reaksi lain berisi 3mL HCl 10% untuk

hentikan reaksi. 3mL indikator

ditambahkan (larutan iodium-kalium

iodida). Absorbansi dibaca dengan620nm. Blanko telah disediakan. Pati

terhidrolisis per waktu ditentukan dari

kurva standar konsentrasi pati

(substrat) terhadap absorbansi.


6/10

Data Pengamatan

a. Kurva Kalibrasi Baku

TabungVolume Pati

(ml)

Volume Aquades

(ml)Absorbansi

Konsentrasi

(µg/ml)

1 0 1 0.072 0

2 0.2 0.8 0.184 4

3 0.4 0.6 0.752 8

4 0.6 0.4 0.872 12

5 0.8 0.2 0.917 16

6 1 0 1.096 20

b. Hasil Pengujian Sampel

No fraksi Sample Perlakuan AbsorbansiKonsentrasi

(µg/ml)

1 i 37 C & pH 3.5 1.997 35.3954

ii 37 C & pH 5.6 1.8 31.6855

iii 47 C & pH 5.6 1.861 32.8342

2 i 37 C & pH 3.5 1.823 32.1186

ii 37 C & pH 5.6 1.673 29.2938

iii 47 C & pH 5.6 1.901 33.5876

3 i 37 C & pH 3.5 1.835 32.3446

ii 37 C & pH 5.6 1.607 28.0508

iii 47 C & pH 5.6 1.701 29.8211


7/10

y = 0.0531x + 0.1175

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 5 10 15 20 25

A b s o r b a n s i

Konsentrasi µg/ml

Kurva Kalibrasi Baku

Baku

Kurva Kalibrasi

Grafik

a. Kurva Kalibrasi Baku

Perhitungan

Rumus: y = 0.0531x + 0.1175

No Fraksi 1

i. y = 0.0531x + 0.1175

1.997 = 0.0531x + 0.1175

x = 35.3954

ii. y = 0.0531x + 0.1175

1.8 = 0.0531x + 0.1175

x = 31.6855

iii. y = 0.0531x + 0.1175

1.861 = 0.0531x + 0.1175

x = 32.8342

No Fraksi 2

i. y = 0.0531x + 0.1175

1.823 = 0.0531x + 0.1175

x = 32.1186

ii. y = 0.0531x + 0.1175

1.673 = 0.0531x + 0.1175

x = 29.2938

iii. y = 0.0531x + 0.1175

1.901 = 0.0531x + 0.1175

x = 33.5876

No Fraksi 3

i. y = 0.0531x + 0.1175

1.835 = 0.0531x + 0.1175

x = 32.3446

ii. y = 0.0531x + 0.1175

1.607 = 0.0531x + 0.1175

x = 28.0508

iii. y = 0.0531x + 0.1175

1.701 = 0.0531x + 0.1175

x = 29.8211


8/10

Pembahasan

Pada percobaan ini, telah

dilakukan pengujian aktivitas enzim

amilase dengan menggunakan metode

Caraway – Somogyl. Metode ini

menggunakan larutan iodin/kalium

iodide sebagai indikator. Enzim

amilase yang digunakan adalah enzim

yang terdapat dalam ekstrak pepaya

dan aktivitas enzim tersebut dilakukan

terhadap larutan pati dengan

menggunakan variasi suhu dan pH.

Variasi suhu yang digunakan adalah

37OC dan 47

OC sementara variasi pH

yang digunakan adalah pH 3.5 dan pH

5.6.

Enzim tersusun dari protein

campuran protein sehingga

membentuk senyawa organik yang

bermolekul besar. Enzim juga dikenali

sebagai biokatalisator yang berfungsi

untuk mempercepat jalannya reaksi

metabolisme. Contohnya, enzimamilase merupakan enzim yang dapat

memutuskan ikatan glikosidik (alpha

1-4) di antara satuan glukosa yang

membentuk polimer, seperti pati. Pati

terdiri atas amilosa dan amilopektin,

yang tersusun atas satuan glukosa

rantai lurus dan rantai bercabang. Hasil

hidrolisis pati oleh amilase adalah

glukosa yang merupakan

monosakarida. Biasanya enzim

amilase terdapat di dalam tubuh

manusia yaitu pada saluran pencernaan

di mulut.

Pada percobaan ini, aktivitas

enzim amilase telah dilakukan

terhadap larutan pati dengan

mereaksikan ekstrak dengan larutan

pati yang konsentrasinya telah

diketahui. Hasil aktivitas enzim

dibandingkan dengan kurva standar

konsentrasi larutan pati yang berbeda

dan diukur dengan menggunakan alat

spectroscopy HPLC pada panjang

gelombang 620nm. Nilai absorbansi

dapat menentukan konsentrasi sisa

larutan pati yang tidak terhidrolisis

dengan dibandingkan dengan kurva

baku dan mengguna kan rumus y =

bx+a.

Reaksi ini dihentikan dengan

menggunakan larutan HCl dengan

merusakkan struktur enzim sehingga


9/10

fungsi enzim dapat dihambat. Larutan

Kalium Iodide berfungsi sebagai

indikator dengan adanya perubahan

warna yang terjad yaitu larutan pati

yang ditetesi larutan KI akan menjadi

warna biru dan setelah terurai menjadi

glukosa akan menjadi tidak berwarna.

Terdapat 3 fraksi yang

digunakan yaitu fraksi 1, 2 dan 3. Pada

setiap fraksi, telah dibuat 3 sample

dengan menggunakan variasi suhu dan

pH. Sample 1 yaitu dengan

menggunakan variasi suhu pada 37oC

dan pH 3.5, sample 2 dengan

menggunakan variasi suhu 37oC dan

pH 5.6 sementara sample 3 dengan

menggunakan variasi suhu 47oC dan

pH 5.6. Pada fraksi 1, sample 1 dengan

absorbansi sebanyak 1.997 yang

menunjukkan konsentrasi sebanyak

35.3954 µg/ml, sample 2 dengan



31.6855 µg/ml dan sample 3 dengan



32.8342 µg/ml. Pada fraksi 2, sample 1

dengan absorbansi sebanyak 1.823

yang menunjukkan konsentrasi

sebanyak 32.1186 µg/ml, sample 2



sebanyak 29.2938 µg/ml dan sample 3


µg/ml yang menunjukkan konsentrasi

sebanyak 33.5876 µg/ml. Pada fraksi

3, sample 1 dengan absorbansi

sebanyak 1.835 yang menunjukkan

konsentrasi sebanyak 32.3446 µg/ml,

sample 2 dengan absorbansi sebanyak

1.701 yang menunjukkan konsentrasi

sebanyak 29.8211 µg/ml dan sample 3



sebanyak 28.0508 µg/ml.

Berdasarkan data hasil

pengamatan, dapat diketahui dimana

enzim amilase dapat berkerja dengan

baik dan optimal pada suhu 37oC dan

pH 5.6. Data yang diperoleh adalah

cocok dibandingkan dengan literature.

Oleh itu, suhu tersebut merupakan

suhu normal tubuh manusia yaitu 37oC

dan pH 5.6 merupakan pH yang

mendekati netral seperti air liur

manusia.


10/10

Daftar Pustaka

Abraham Blenk , 1998, Enzymatic

Method for Determining Amylase

Activity (Amylase Activity Assay),

available online at:

http://www.sigmaaldrich.com/technica

ldocuments/protocols/biology/amylase

-activity-assay-kit Access on 24/04/15

Alison Evert, 2013, Proteins,

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/e

ncy/article/002467.htm

Andrew Mock, 2005, Amylase activity

in Malt, available online at:

http://www.phadebas.com/areas-of-

use/alimentary/amylase-in-malt

Access on 24/04/15

Murray Bender, 1992, Harper's

Illustrated Biochemistry, London : Mc

Graw Hill.

Shanbagh, 1990, Prep Manual

Biochemistry, India : Elsetier ltd

Documents

Uji Aktivitas Amilase (Kelompok 1) Biokimia