Uji Endotoxin ( Uji Pirogen)

Endotoxin

• Apa itu endotoksin?

• Endotoksin berasal dari mana?

• Mengapa hal itu menjadi penting?

Endotoxin

Endotoksin adalah :

a lipopolysaccaride

Endotoxin

Berasal dari membran sel bakteri gram negatif

Endotoxin

Mengapa endotoksin sangat penting, karena berkaitan dengan

• pirogen

• bertahan dalam proses sterilisasi

Uji Endotoxin

• Produk apa saja yang diuji?

• Bagaimana uji ini dilaksanakan?

Endotoxin Testing

Produk apa saja yang diuji?

• injeksi and peralatan medis

dimana akan kontak dengan darah atau larutan spinal.

• Termasuk, bahan baku, air dalam proses monitoring

Uji Endotoxin

Bagaimana pelaksanaan uji Endotoksin?

• Uji pirogen dengan kelinci

• LAL test

Uji pirogen dengan kelinci

• Metode standar pada abad 20

• Bahan diinjeksikan pada telinga

LAL Test

• Dikembangkan pada 1960’s by Drs. Bang and Levin

• Berdasarkan pada reaksi clotting darah horseshoe crab dengan endotoxin

• Lebih cepat, ekonomis, lebih sensitif dibanding uji pirogen menggunakan kelinci.

LAL

• Limulus - jenis kepiting

• Amebocyte - sel darah kepiting dimana zat aktifnya telah diderivatisasi

• Lysate - adalah komponen yang ditetapkan dengan pemisahan amebocytes dari plasma kemudian dilysis

Pengambilan darah kepiting Horseshoe

Darah kepiting Horseshoe

Jenis Uji LAL

• Gel Clot

• Turbidimetric

• Colorimetric

Metode Gel Clot

• Metode Original

• The official “referee test”

• Spesimen diinkubasi dgn LAL yang diketahui sesitivitasnya. Formasi gel clott postif untuk endotoxin.

Metode Turbidimetric • Sebuah metode kinetik

• Spesimen diinkubasi dgn LAL bersamaan dengan kecepatan peningkatan dalam turbidimetri atau waktu pengambilan untuk mencapai turbiditas kemudian diukur dengan spektrofotometri dan dibandingkan dengan standar.

Metode Colorimetric

• Endotoxin mengkatalisis aktivasi proenzim dalam LAL dimana akan mengikat substrat tidak berwarna menjadi endoproduk yang berwarna sehingga dapat diukur secara spektrofotometri dibanding kurva standar

• Can be kinetic or endpoint

Colorimetric Reaction

Endotoxin

1. Proenzyme → Enzyme

Enzyme

2. Substrate → Peptide + p-NA

Comparison of Methods

Gel Clot Chromogenic

Endpoint

Chromogenic

Kinetic

Turbidimetric

Semi-

quantitative

Quantitative Quantitative Quantitative

Simple Least expensive,

Requires 37 degree bath

Requires

spectrophotometer

or plate reader

Requires

incubating plate or tube reader

Requires

incubating plate or tube reader

Manually read and recorded

Can be automated,

allows electronic

data storage

Can be automated,

allows electronic

data storage

Can be automated,

allows electronic

data storage

Sensitive down

to 0.03 EU/ml

Sensitive down

to 0.1 EU/ml

Sensitive down

to .005 EU/ml

Sensitive down

to .001 EU/ml *

* (Sensitivities vary by reagent manufacturer, instrumentation and testing conditions)

Steps in Chromogenic Endpoint Procedure

• Read SOP (reagents are prepared)

• Label tubes and make dilutions of stock standard

• Pipette blanks, standards & unknowns into prewarmed plate following template

• Start timer as LAL is added to first well.

Add quickly with repeat pipettor to all wells being used & mix.

• At T = 10 mins add prewarmed chromogenic substrate in same manner as above

• At T = 16 mins. Add stop reagent in same manner as above

• Read plate

Template

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Notes

• Peralatan gelas, tip dan air hrs bebas endotoksin

• Temperatur dan waktu adalah kritikal point