Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
i
UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE QUIMICA
ESTUDIO DE LA GENERACIÓN DE COLOR CARAMELO EN SISTEMAS GLUCOSA-FRUCTOSA Y AMONÍACO
Caracas, abril, 2009
Trabajo especial de grado presentado ante la ilustre Universidad Central de Venezuela por la Br Noroska Salazar para optar al título de Licenciada en Química
ii
Los abajo firmantes asignados por la Universidad Central de Venezuela, como integrantes del jurado examinador del trabajo Especial de Grado titulado: “ESTUDIO DE LA GENERACIÓN DE COLOR CARAMELO EN SISTEMAS GLUCOSA FRUCTOSA Y AMONÍACO”. Presentado por la Br. Noroska Salazar, certificamos que este trabajo cumple con los requisitos exigidos por nuestra Magna Casa de Estudios para optar por el título de Licenciado en Química.
Dr. Andrés Escalona, Dr Julio Herrera
(Directores)
Dra Rosa Amaro Dra Adriana Bravo
Nombres y Apellidos Nombres y Apellidos
(Jurado) (Jurado)
iii
INDICE GENERAL
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................... 1
RESUMEN ....................................................................................................................... 2
1 INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 4
2 Marco teórico ............................................................................................................... 5
2.1 Color Caramelo .......................................................................................................... 5
2.2 Clasificación del color caramelo y su uso en la industria alimenticia .......................... 5
2.2.1 Clases de color caramelo ...................................................................................................... 5
2.2.2 Estabilidad del color caramelo y su uso en la industria ............................................... 6
2.3 Reacción de caramelización o degradación de azúcares a altas temperaturas ......... 8
2.3.1 Factores que afectan la velocidad de pardeamiento durante la caramelización ................................................................................................................................... 12
2.4 Reacción de Maillard ................................................................................................ 13
2.4.1 Pasos de la reacción de Maillard ...................................................................................... 16
2.4.1.1 Etapa inicial: Condensación, enolización, rearreglo de Amadori y Heyns 16
2.4.1.2 Etapa intermedia: Deshidratación de azúcares para formar compuestos α dicarbonilos, HMF, reductonas y pigmentos ........................................................ 20
2.4.1.3 Etapa Final: retroaldolización, condensaciones aldólicas y la degradación de Strecker ........................................................................................................... 23
2.5 Reacción de agua amoniacal con azúcares reductoras ........................................... 26
2.5.1 Mecanismos de reacción entre azúcares reductoras y agua amoniacal .............. 26
2.5.2 Importancia de los Imidazoles durante la elaboración de color caramelo clase III (E150): ................................................................................................................................................. 30
2.6 Factores que afectan la velocidad de pardeamiento ................................................ 31
iv
2.7 Melanoidinas ............................................................................................................ 39
2.7.1Cuantificación de las melanoidinas ................................................................................... 44
2.7.2 Factores que afectan la composición de las melanoidinas y sus estructuras hipotéticas ........................................................................................................................................... 45
2.7.2.1 pH, Temperatura y tiempo ........................................................................ 45
2.7.2.2 Tipo de azúcares reductoras .................................................................... 47
2.7.2.3Relación azúcar-aminocompuesto ............................................................ 48
2.8 Metodos cromatográficos ........................................................................................ 49
2.9 Métodos de tratamiento de muestra ......................................................................... 51
3 Objetivos de la investigación ................................................................................... 53
3.1 Objetivo General ...................................................................................................... 53
3.2 Objetivos Específicos ............................................................................................... 53
4 Metodología Experimental ........................................................................................ 54
4.1 Métodos .................................................................................................................... 56
4.1.1 Medidas de color ............................................................................................... 56
4.1.2 Actividad de agua (aw) ....................................................................................... 56
4.1.3 Efecto de la actividad de agua inicial sobre la intensidad de oscurecimiento. ... 59
4.1.4 Efecto del cambio de pH inicial sobre la intensidad de oscurecimiento ............... 59
4.1.4.1 Efecto del pH inicial sobre la actividad de agua ....................................... 60
4.1.5 Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la intensidad de oscurecimiento .................................................................................................................................. 60
4.1.5.1 Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la actividad de agua ............................................................................................................................. 61
4.1.6 Efecto de la temperatura sobre la intensidad de oscurecimiento ........................... 61
4.1.6.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua ................................ 61
4.1.7 Nitrógeno libre en los colorantes ...................................................................................... 61
v
4.1.8 Análisis por electroforesis. .................................................................................................. 62
4.1.9 Optimización de azúcar invertida, seguimiento del HMF y formación de 4-metilimidazol ...................................................................................................................................... 62
4.1.9.1 Optimización del Azúcar invertida ............................................................ 62
4.1.9.2 Seguimiento del HMF ............................................................................... 62
4.1.9.3 Formación de 4-metilimidazol ................................................................... 63
4.2 Determinación de compuestos de aroma .......................................................................... 63
5 Resultados y discusión ............................................................................................ 64
5.1 Optimización de la reacción de inversión para la formación de azúcares reductoras ..................................................................................................................................................................... 64
5.2 Factores que afectan la intensidad de oscurecimiento ............................................. 66
5.2.1 Efecto de la actividad de agua y el pH sobre la intensidad de oscurecimiento . 66
5.2.1.1 Efecto de la actividad de agua inicial sobre la intensidad de oscurecimiento ..................................................................................................... 70
5.2.2 Efecto del pH sobre la intensidad de oscurecimiento no enzimático .................... 74
5.2.2.2 Efecto del pH sobre la actividad de agua ................................................. 75
5.2.3 Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la intensidad de color ..... 77
5.2.3.1 Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la actividad de agua ............................................................................................................................. 82
5.2.4 Efecto de la temperatura en la intensidad de oscurecimiento no enzimático ..... 85
5.2.4.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua ................................ 89
5.2.5 Nitrógeno libre durante la formación de color ............................................................... 93
5.3 Determinación de HMF ............................................................................................. 95
5.4 Formación de 4 metil-imidazol .................................................................................. 96
5.5 Electroforesis ............................................................................................................ 98
5.6 Determinación de compuestos de aroma ................................................................. 99
vi
6 Conclusiones ........................................................................................................... 104
ANEXOS ...................................................................................................................... 107
7 REFERENCIAS ......................................................................................................... 111
vii
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 .- Características de los tipos de color caramelo ................................................. 6
Tabla 2 .- Porcentaje de azúcar acíclica en función del cambio de pH .......................... 37
Tabla 3.- Cambios en la composición de las melanoidinas variando tiempo, pH, y temperatura .................................................................................................................... 46
Tabla 4.- Cambio en la cantidad de nitrógeno incorporado a la molécula variando el azúcar reductora ............................................................................................................ 47
Tabla 5.- Cambio en la composición de melanoidinas variando la relación molar glucosa-glicina ................................................................................................................ 49
Tabla 6. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a pH 10,65 .............................................................................................................................. 56
Tabla 7. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a pH 5,06 ................................................................................................................................ 57
Tabla 8. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a pH 7,06 ................................................................................................................................ 58
Tabla 9. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto relación molar sacarosa/nitrógeno ......................................................................................................... 60
Tabla 10. Variación del contenido de azúcares durante la reacción de inversión de sacarosa (75% p/p), 100ºC. .......................................................................................... 64
Tabla 11 Variación del contenido de azúcares durante la reacción de inversión de sacarosa (82% p/p), 100ºC. .......................................................................................... 65
Tabla 12. Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: pH inicial (10,65 ± 0,07), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno. ......................................................... 67
Tabla 13.Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: pH inicial (5,06 ± 0,05), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno. ............................................................ 67
viii
Tabla 14. Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: pH inicial (7,06 ± 0,08), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno.. ........................................................ 68
Tabla 15.Efecto de la temperatura y pH sobre la velocidad media de formación de color luego de 5 horas, para pH 10,65, 7,06 y 5,06 ................................................................ 89
Tabla 16. Efecto de la temperatura y pH sobre el cambio de velocidad media de actividad de agua luego de 5 horas, para pH 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 ............................................................................................... 92
Tabla 17. Compuestos identificados en el perfil de volátiles de los tres colores caramelos preparados. ................................................................................................. 101
ix
INDICE DE FIGURAS
Figura 1.- Estructuras hipotéticas de las melanoidinas formadas durante la reacción de caramelización. ................................................................................................................ 9
Figura 2.- Reacciones que ocurren durante la caramelización ....................................... 10
Figura 3.- 1,2 y 2,3 enolización de glucosa y formación de HMF (5-Hidroximetilfurfural), HDF (hidroxidimetilfuranona) y HAF(2-hidroxiacetilfurano) vía 3 y 4 deoxiosulosa Precursores de la caramelización. ................................................................................. 11
Figura 4.- Esquema de reacción Glucosa/ Glicina adaptado de Tressl (1995) AMP (Productos avanzados de Maillard), 3DH (3-Deoxyaldocetosa), 1DH (1-deoxy-2,3 dicetosa, 4DH (4-deoxy-2,3dicetosa) ............................................................................. 15
Figura 5.- Condensación y enolización de la glucosa para la formación de la glucosilamina, y subsecuente rearreglo de la misma para la formación de Amadori ..... 17
Figura 6.- Esquema general del rearreglo de Heyns ...................................................... 17
Figura 7.- Rearreglo de Amadori en medio básico ......................................................... 18
Figura 8.- Rearreglo de Amadori en medio ácido ........................................................... 19
Figura 9.- Rearreglo de Heyns en medio básico ............................................................ 19
Figura 10.- Rearreglo de Heyns en medio ácido ............................................................ 20
Figura 11.- Producción de α dicarbonilos: 1-Deoxy-2.3-hexodisulosa, 1-amino-1,4-dideoxy-2,3hexodiolosa, 3-deoxy-2hexosulosa .............................................................. 21
Figura 12.- Producción de HMF a partir de la 3-deoxy-2hexosulosa, y algunos de los productos por los cuales es reprimido en presencia de aminas primarias ..................... 22
Figura 13.- Formación de reductonas ............................................................................ 23
Figura 14.- Derivados de las azúcares, que pueden dar compuestos coloreados ......... 24
Figura 15.- Productos de retroaldolización: compuesto coloreados ............................... 24
Figura 16.- Algunos ácidos productos de la reacción de Maillard .................................. 24
x
Figura 17.- Degradación de Strecker y formación de amoníaco .................................... 25
Figura 18.- Producción de Pirazinas por la formación previa de glucosilamina y fructosilamina ................................................................................................................. 27
Figura 19.- Producción de Imidazoles por la formación previa de la glucosilamina y fructosilamina ................................................................................................................. 28
Figura 20.- Formación de imidazoles por fragmentación de moleculas ......................... 29
Figura 21.- Reacción de compuestos dicarbonilos con amoníaco ................................. 30
Figura 22.- Intensidad de color en función de la actividad de agua (oscurecimiento no enzimático) ..................................................................................................................... 33
Figura 23.- Efecto de la relación molar azúcar-aminoácido sobre la reacción de oscurecimiento, D glucosa-glicina relación A 1:1.5, B 1:1, C 2:1, D: 10:1, contenido de agua 65%, temperatura 65ºC. ........................................................................................ 34
Figura 24.- Efecto del pH sobre el oscurecimiento, (L) lisina, (AR) arginina, (G) glucosa, calentado a 121ºC durante 10 min. ................................................................................ 36
Figura 25.- Melanoidinas de bajo peso .......................................................................... 40
Figura 26.- Formación de una macromolécula (melanoidina) ........................................ 41
Figura 27.- Hipótesis de una macromolécula (melanoidina) .......................................... 42
Figura 28.- Esquema de formación: polímeros con nitrógeno, y polímeros sin nitrogeno ....................................................................................................................................... 43
Figura 29.- Formación de melanoidinas de bajo peso molecular, sin contenido de nitrógeno. ....................................................................................................................... 44
Figura 30. Velocidad media de formación de color a 100 ºC en función de la actividad de agua inicial para una condición de pH 10,65, 5,06 y 7,06 y una relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno. ........................................................................................................ 69
Figura 31. Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a pH (10,65±0,07), relación molar 3,3:1 sacarosa/ nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC ............... 71
Figura 32 Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a pH (5,06±0,05), relación molar 3,3:1 sacarosa/ nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC ............... 72
xi
Figura 33. Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a pH (7,06±0,08), relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC ................ 73
Figura 34. Efecto del pH sobre la formación de color, RM 3,3:1 sacarosa/nitrógeno, Temperatura 100ºC ........................................................................................................ 74
Figura 35.Efecto del pH sobre la actividad de agua durante las reacciones de formación de color a 100ºC. La relación molar sacarosa/nitrógeno fue 3,3:1. ............................... 76
Figura 36. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la formación de color, a pH 10,65, y 100ºC de temperatura. ................................................................................ 78
Figura 37. . Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la formación de color, a pH 5,06, y 100ºC de temperatura ................................................................................ 79
Figura 38. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la intensidad de oscurecimiento no enzimático, a pH 7,06, y 100ºC de temperatura. .............................. 81
Figura 39. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y pH 10,65 ........................................................ 83
Figura 40. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y pH 5,06. ......................................................... 84
Figura 41 Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y pH 7,06. ......................................................... 85
Figura 42 Efecto de la temperatura sobre la formación de color pH 10,65, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 ............................................................................................... 86
Figura 43 Efecto de la temperatura sobre la formación de color pH 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 ............................................................................................... 87
Figura 44 Efecto de la temperatura sobre la formación de color pH 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 ............................................................................................... 88
Figura 45 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a y pH 10,65. relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 .................................... 90
Figura 46 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a pH 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 ........................................ 91
xii
Figura 47 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a pH 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 ....................................... 92
Figura 48 Consumo de nitrógeno a través del tiempo, pH 10,65, 7,06 y 5,06 relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1, 100ºC ......................................................................... 93
Figura 49 Variación de pH a través del tiempo, pH 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 y 100ºC. ................................................................................ 94
Figura 50 Variación de HMF en función del tiempo a pH 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y 100ºC ........................................................................ 95
Figura 51 Variación de la concentración de 4-metilimidazol en función del tiempo a pH 5,06, 10,65 y 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 y 100ºC ........................... 97
Figura 52 Electroforesis. Condiciones de reacción pH 10,65; 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/nitrógeno 3,3:1 y 100ºC ........................................................................ 99
Figura 53 Perfil de volátiles de los caramelos preparados a diferentes pH. ................. 102
xiii
Dedicatorias
A mi papá Oscar Salazar el mejor hombre del mundo, gracias mi viejito lindo por
estar ahí en todas mis etapas por llevarme de la mano, por tus consejos, por tu
paciencia, por enseñarme cada día un poco más de la vida, soy lo que soy por ti,
GRACIAS eres mi vida!, tu junto a mi mama son mi ejemplo de lucha, Te amo
A mi mamita bella Norka de Salazar por enseñarme a tener tolerancia por todo el
apoyo por entender mis sacrificios, por acompañarme todas las noches de trasnocho,
por todo el ánimo que me brindabas junto a mi padre cada vez que decaía y por darme
un poquito de toda tu energía mental positiva para que todo saliera como lo queremos y
como Dios nos lo permitió, te amo mamita.
A mi tía Nadeska mi segunda madre, este logro es tuyo también me llevaste de la
mano desde mi nacimiento, nunca me dejaste solita viviste junto a mis padres cada
etapa de mi vida ayudándome a crecer cada día mas. Eres una excelente mujer este es
solo el comienzo de muchos triunfos familiares, vamos pa lante tía!
A mi perrita perla maría a ti por llenarme de alegría cada día cada que el estress y
la preocupación me contagiaba
Gracias Dios por darme no cantidad de familia sino CALIDAD este logro es de ustedes.
Los ama su hija Noroska Salazar
xiv
Agradecimientos
A mi Dios, por darme la vida, una familia tan maravillosa, gracias mi Señor por
guiar mis pasos, por llenarme de sabiduría entendimiento y ganas de luchar cada día. A
ti este título.
A mi alma mater la Universidad Central de Venezuela, por brindarme la oportunidad de
cursar mis estudios superiores, y dejarme conocer tanta gente maravillosa. A la
profesora Inés Tovar por creer en mí!
A mis amigos inseparables mi Glo!, Alexis, Omar, Virginia, Christian, Héctor,
Jenireé a todos gracias por ser la familia que uno puede escoger, por formar parte de
este logro y por acompañarme en cada etapa que fuimos superando, este es solo el
comienzo de miles de triunfos los quiero.
A Empresas Polar por permitirme realizar mi trabajo especial de grado, por
brindarme conocer personas tan especiales como Adriana Bravo, Graciela Troncone (mi
madre) gracias Graciela por no atenerte a ser solo mi supervisora, gracias por guiarme
en cada paso, gracias por el apoyo, gracias por ser una gran amiga, gracias por
adoptarme!, Lorena Reverol, Carlos Prazuela, Paula Guerra gracias por creer en mí, por
ayudarme a crecer en mi ámbito profesional, y sobre todo por hacerme cada día mas
ameno el laboratorio. A las amigas bellas, Marianela Conde, Odry Vivas, Genesis
Carrillo, Myriam Montbrum, Raquel Rodriguez, Katheryn Zambrano todos ustedes son lo
máximo de la gerencia de soporte científico, los quiero!
. A mis tutores Julio Herrera y Andrés Escalona, por ser guías principales de este
proyecto de investigación, por todos los conocimientos impartidos, gracias por las
nuevas enseñanzas.
1
LISTA DE ABREVIATURAS
aw : actividad de agua
CLAR: Cromatografía Liquida de Alta Resolución
DAD: Detector de arreglo de diodos
EFS: Extracción en fase solida
GM: Cromatografía gases-masas
HMF: 5-hidroximetilfurfural
RM: relación molar
SDS: Poliacrilamida gel electroforesis (sodia dodecil sulfato)
TEMED: N,N,N,N tetrametilendiamina
Vawm: Velocidad media de actividad de agua
VCm: Velocidad media de formación de color
VFm4MEI: Velocidad media de formación del 4-metil imidazol
VHMFm: Velocidad media de formación de 5-hidroximetilfurfural
4MeI: 4-metilimidazol
2
RESUMEN El color caramelo es un colorante aplicable en bebidas malteadas. El objetivo de este
proyecto es el estudio de los factores que afectan la formación de color tales como aw,
RM sacarosa/nitrógeno, pH y temperatura, para ello se optimizó la formación de
azúcares reductoras, se medió HMF y 4-metil-imidazol. Se determinó la concentración
de nitrógeno libre, determinación de pesos moleculares y aislamiento de compuestos
aromáticos la metodología fue: para la formación de color se hicieron medidas de
absorbancia y el factor respuesta fue intensidad de color EBC, se hizo un seguimiento
del precursor HMF, 4-metilimidazol y optimización de azúcares reductoras por CLAR,
pesos moleculares por electroforesis y los compuestos aromáticos por GM, los
resultados fueron los siguientes: Mayor porcentaje de azúcares reductoras a los diez
minutos de inversión. La aw dio un efecto significativo para las tres condiciones de pH
de estudio (10,65±0,07, 7,06±0,08 y 5,06±0,05), se obtuvo un máximo de VCm mientras
se varió la aw del sistema, a menor pH la mayor VCm se encontró a mayor aw La
intensidad de oscurecimiento para aquellas reacciones con aw ≥ a la optima fueron
aumentando progresivamente, mientras que para aquellas reacciones con aw < a la
optima la formación de color parece detenerse luego de las primeras horas de reacción.
Para sistemas de pH 7,06±0,08 y 5,06±0,05, se observó una solidificación después de 7
horas de reacción. Solo en sistemas de pH 10,65±0,07 se obtuvieron altos valores de
intensidad de color. La VCm es mayor para pHs 7,06±0,08 y 5,06±0,05. En los sistemas
de pH 7,06±0,08 y 5,06±0,05 se obtiene una mayor Vawm. A mayor RM
sacarosa/nitrógeno la intensidad de color es mayor. Disminuir la RM sacarosa/nitrógeno
a condiciones de pHs 7,06±0,08 y 5,06±0,05 conduce a una formación de sólidos en un
mayor tiempo de reacción, al igual que disminuir la temperatura. La Vawm para
diferentes RM sacarosa/nitrógeno a pH 10,65±0,07 es diferente, mientras que. La Vawm
para diferentes RM sacarosa/nitrógeno a pH 7,06±0,08 y 5,06±0,05 es igual. Una mayor
temperatura produce mayor intensidad de color, para 15ºC aumentados a condiciones
de pH 10,65±0,07 se obtuvo una intensidad de color 3 veces mayor y para condiciones
3
de pH 7,06±0,08 y 5,06±0,05 se obtuvo una intensidad de color 4 veces mayor. Una
mayor temperatura bajo las condiciones de estudio conlleva a una Vawm entre 2 y 3
veces mayor. A condiciones de pH 7,06±0,08 y 5,06±0,05 el consumo de nitrógeno es
incompleto. La formación de HMF se favorece a pHs bajos. La formación de 4-
metilImidazol se favorece a condiciones de pH básico. El compuesto 4-metilimidazol se
produce en las primeras horas de reacción hasta llegar a un máximo luego del cual
comienza a consumirse y disminuye en el tiempo. Los pesos moleculares tienen un
rango de 10.000 y 75.000Da, el compuesto furfural es mayoritario a pHs menores,
mientras que compuesto como ác. acético, 1-hidroxi-acetona y el 2-acetil furano,
aumentan con el pH, el 2-metil-benzofurano disminuye.
4
1 INTRODUCCIÓN El color caramelo es un colorante de gran interés para la industria de alimentos
debido a que su uso se ha extendido a muchos productos, tanto alimentos como
bebidas. Existen varios tipos de color caramelo, los cuales difieren en sus dos
propiedades fundamentales: potencial de tinción (intensidad de color que aporta al
producto) y carga eléctrica de las moléculas coloreadas en solución. La aplicación de
los diferentes tipos de color caramelo en los sistemas alimenticios y bebidas, depende
tanto de los requerimientos sensoriales del producto (intensidad del color y en algunos
aporte de sabor) como de la compatibilidad del colorante con el pH del producto, para
evitar floculaciones y precipitaciones. La aplicación de un color caramelo a un producto
específico puede requerir de cambios en las propiedades del mismo la cual se logra a
través del control de la reacción que lleva a la formación de los compuestos de color.
La reacción de formación de color caramelo es conocida por el hombre desde
hace mucho tiempo. La receta tradicional llamada caramelización es utilizada en todo el
mundo tanto a nivel casero como industrial.
El primer estudio de la reacción de formación de color fue realizada por Louis
Maillard en 1912, quien demostró que el calentamiento de los alimentos producía la
degradación de los azúcares la que conllevaba a la formación de compuestos de
aroma, color y sabor, perdiendo además valor nutritivo.
El color caramelo es ampliamente utilizado en la industria de bebidas,
especialmente en la fabricación de cervezas oscuras, refrescos, maltas entre otras, en
los cuales juegan un papel muy importante al aportar su color y aroma característicos
El objetivo de este proyecto estará orientado hacia el estudio de los factores que
afectan la formación de color caramelo con la finalidad de generar un producto aplicable
en bebidas malteadas.
5
2 MARCO TEÓRICO
2.1 Color Caramelo Los colores caramelos se utilizan para dar color en alimentos y bebidas. Este no
es más que el resultado del tratamiento térmico controlado de hidratos de carbono, por
lo general, jarabe de azúcar invertida (glucosa y fructosa) en la presencia de ácidos
sales, o álcalis1. Según la FDA (Food and Drug Administration ) es un producto amorfo
que va desde un color amarillo pálido hasta un pardo profundo2, y tiene un olor a azúcar
quemada y un sabor un tanto amargo.
Entre las propiedades que deben tener estos colorantes, según la FDA, es tener
alto grado de pureza (grado alimenticio) y ser solubles en agua3, inertes, y físicamente
estables cuando se almacenan adecuadamente, así como también debe ser totalmente
estériles4.
2.2 Clasificación del color caramelo y su uso en la industria alimenticia
2.2.1 Clases de color caramelo
El comité de expertos en aditivos alimenticios (JECFA) de la Organización para la
Agricultura y la Alimentación (FAO) y de la Organización Mundial de la Salud (OMS),
dividió el color caramelo en cuatro clases dependiendo de los sustratos utilizados y su
uso en la industria4.
• Clase I: Es el elaborado por un proceso equivalente al de caramelización, se
lleva a cabo manteniendo las azúcares a altas temperaturas, con o sin álcalis o
ácidos presentes, no contiene ni amonio ni compuestos con sulfitos, su manera
de elaboración genera una carga coloidal ligeramente negativa4.
• Clase II: Es preparado por el calentamiento de las azúcares con o sin ácidos o
álcalis en la presencia de compuestos que contienen sulfito, el amonio no es
utilizado4, y el sulfito brinda en este tipo de caramelo una carga coloidal negativa.
6
• Clase III: Se prepara por calentamiento de las azúcares con o sin ácidos o
álcalis, en presencia de amonio o sales de amonio, compuestos que tengan
sulfito no son utilizados4, el Ion amonio brinda a este tipo de caramelo una fuerte
carga coloidal positiva.
• Clase IV: Preparado por calentamiento de las azúcares con o sin ácidos o álcalis
en presencia de ambos compuestos tanto amonio como sulfito4, sin embargo
contiene más sulfito que amonio, por su forma de preparación este caramelo
tiene una carga coloidal negativa.
La siguiente tabla resume las características de los cuatro tipos de color caramelo:
Tabla 1 .- Características de los tipos de color caramelo2
*Absorbancia de una solución de caramelo en agua al 0,1 % (p/v), medida en un celda de 1 cm a
610 nm y expresada en base sólida total2
# El porcentaje de nitrógeno se refiere al incorporado en las moléculas del colorante y el libre debe
ser cero
2.2.2 Estabilidad del color caramelo y su uso en la industria
Las moléculas del color caramelo poseen carga positiva o negativa dependiendo
de los reactantes utilizados durante su producción, siendo la mayoría de carga
negativa. Una de las propiedades fundamentales de estos colorantes es su estabilidad
Parámetro Tipo I Tipo II Tipo III Tipo IV
Intensidad de color* 0.01-0.12 0.06-0.10 0.08-0.36 0.10-0.60
Nitrógeno total #(%) <0.1 <0.2 1.3-6.8 0.5-7.5
Sulfuro Total (%) <0.3 1.0-3.5 <0.3 1.4-10.0
Carga coloidal Negativa Negativa Positiva Negativa
Punto Isolectrico - - 5-7 0,5-2
7
coloidal, la cual depende de su punto isoeléctrico. El punto isoeléctrico es el pH en el
cual la carga coloidal del color caramelo es neutra.
La estabilidad coloidal es una característica del color caramelo y en muchas
aplicaciones determina qué producto debe ser utilizado. Por ejemplo los refrescos
necesitan un caramelo con un punto isoeléctrico por debajo del pH de esta bebida, el
refresco tiene un pH aproximadamente de 3 y el color caramelo útil para evitar
floculaciones en el mismo es el clase IV de carga negativa que tiene un punto
isoeléctrico generalmente entre 0.5 y 22, además es compatible con bebidas de bajo
pH5
El color caramelo clase I es exigido en colas para dar al producto un color hacia el
rojizo o amarillo, por tener una ligera carga negativa es estable en este tipo de
productos solo si la bebida tiene un pH por debajo de 3.52. También es usado para dar
una atractiva luz amarilla en la leche, y es útil como rocío de azúcares en las galletas y
para bebidas que contengan un alto porcentaje de alcohol5, además de que su manera
de preparación le permite tener mayor producción de compuestos de sabor6
Por su parte el color caramelo clase II es usado también para bebidas de alto
contenido de alcohol especialmente que tengan extractos vegetales5 debido a su carga
negativa y así asegurar la compatibilidad del colorante en su matriz.
La malta es la bebida de la excepción ya que posee requerimientos especiales.
El pH del producto final es aproximadamente 42 y para evitar floculaciones se necesita
un caramelo con un punto isoeléctrico mayor a éste6 es decir, que al pH de la malta las
moléculas de colorante se encuentren cargadas positivamente y no precipiten, y el
único colorante de carga positiva es el color caramelo clase III que además tiene un
punto isoeléctrico que está alrededor de 5 y 7. Adicionalmente entre las exigencias del
producto está el requerir un fuerte potencial de tinción. En este sentido, el amoníaco y
sobre todo el uso de las sales de amonio mejoran el potencial de tinción del caramelo.
Sin embargo, la principal desventaja de este método de preparación es la posible
8
formación de 4-metilimidazol, conocido como un agente neurotóxico. Para mejorar el
potencial de tinción y disminuir la producción de 4-metilimidazol, han sido descritos
procedimientos tales como, la adición de óxido de magnesio en cantidades catalíticas o
la adición de aminoácidos en forma libre o de sales, que permiten producir un caramelo
cáustico con un alto grado de tinción6.
Además de esto el color caramelo ayuda a proteger los sabores del producto del
deterioro causado por la luz, en cervezas por ejemplo2. También en bebidas sin alcohol
como el refresco, entre la fase acuosa y los taninos o terpenos (saborizantes), materia
vegetal que está cargadas negativamente2, un colorante con esta misma carga coloidal
ayudaría como agente emulsionante.
2.3 Reacción de caramelización o degradación de azúcares a altas temperaturas
Es el método más antiguo para producir color y sabor en los alimentos. En la
reacción de caramelización las azúcares se someten a temperaturas mayores de 120º
C y un pH entre 3 y 9. La aparición del color pardo oscuro es debido a la formación de
polímeros mejor conocidos como melanoidinas. El mecanismo de esta reacción no se
conoce en su totalidad ya que es una reacción bastante compleja, que ocurre en varias
etapas y no se conocen todos los intermediarios de este proceso7.
Las melanoidinas son compuestos de alto peso molecular que se forman por la
polimerización de 5-hidroximetilfurfural (HMF) y 2-hidroxiacetilfurano (HAF). Se sugiere
que los compuestos coloreadas tienen las siguientes estructuras:
9
Figura 1.- Estructuras hipotéticas de las melanoidinas formadas durante la reacción de caramelización7.
La secuencia de reacción de la caramelización viene dada por la degradación del
azúcar, y contiene los siguientes pasos: enolización, conocida como el rearreglo de
Brujin van Eckenstein, deshidratación, β-eliminación, una descarboxilación, reacción
retro aldólica, luego una condensación aldólica y por último una reacción radical. La
enolización es considerada la parte inicial de la reacción ya que seguida a ella se dan el
resto de las reacciones antes mencionadas, que pueden degradar las azúcares para
continuar reaccionando y dar compuestos heterocíclicos que contengan oxigeno así
como también compuestos carbocíclicos vía condensación aldólica. La secuencia de
reacciones de caramelización se muestra en la siguiente figura:
10
Figura 2.- Reacciones que ocurren durante la caramelización7
11
La reacción procede principalmente vía 1,2 o 2,3 enolización del azúcar y por β-
eliminación de agua llevando así a la formación de las 1, 3 y 4-hexosulosas. La
ciclización intramolecular y luego la deshidratación puede dar una extensa gama de O-
heterociclos entre ellos furanos y pironas7, obteniendose compuestos como HMF, HAF
e hidroxidimetilfuranona (HDF). Es importante destacar que las reacciones de
deshidratación generan aproximadamente el 40% del peso de agua del sistema7. La
figura 3 muestra la reacción de formación de los precursores de las melanoidinas.
Figura 3.- 1,2 y 2,3 enolización de glucosa y formación de HMF (5-Hidroximetilfurfural), HDF (hidroxidimetilfuranona) y HAF(2-hidroxiacetilfurano) vía 3 y 4 deoxiosulosa7 Precursores de la caramelización.
12
La reacción de caramelización puede ser seguida por la aparición de HMF7. Se ha
observado que mientras haya una mayor degradación de fructosa y glucosa mayor será
la concentración de este intermediario.
2.3.1 Factores que afectan la velocidad de pardeamiento durante la caramelización
La caramelización es afectada por parámetros tales como el pH, la concentración
del sustrato (azúcar) y la temperatura.
• pH: El efecto del pH sobre la caramelización depende directamente de los reactivos
de partida, por ejemplo, cuando el reactivo es un disacárido como la sacarosa,
maltosa etc., el proceso es acelerado a pH bajos7 para lograr hidrolizar rápidamente
la sacarosa y así producir las azúcares reductoras fructosa y glucosa necesarias
para producir el complejo de reacciones siguientes.
Por otra parte cuando se trata directamente con monosacáridos es diferente y
depende del grado de degradación del mismo a las nuevas condiciones de pH. Por
ejemplo en un estudio de la velocidad de pardeamiento de una solución de glucosa
en estado líquido, se observó que la reacción tuvo un aumento con el incremento del
pH y a valores de temperatura media, dicho experimento fue realizado con glucosa
sola a 100º C y un rango de pH desde 4 a 128. A medida que el pH del medio
aumentó, la tasa de pardeamiento era mayor8. Se ha reportado que cuanto más alta
es la basicidad del medio donde se encuentra la solución de azúcar, mayor es la
intensidad del pardeamiento8. Los más altos niveles de degradación de glucosa se
produjeron durante los primeros minutos de ebullición de la solución a un pH de
aproximadamente 11. Lo cual indica el alto grado de destrucción de la glucosa a 100º
C en condiciones alcalinas8
• Concentración: La concentración del jarabe es muy importante y altos valores de
este a una temperatura por encima de la ambiente y pH neutro fue estudiado como
13
parámetro importante. En soluciones muy concentradas de sacarosa se tiene un leve
retraso en la degradación de la misma. Sin embargo luego de una fase inicial de
demora, el contenido de sacarosa desciende rápidamente produciendo las azúcares
reductoras para luego disminuir la fructosa, glucosa y comenzar a formar el
intermediario HMF, así como también pudo ser identificado el 5-metilfurfural por
cromatografía liquida de alta eficiencia.9.
Se sugiere que este cambio de fase en cuanto a la demora de la degradación del
contenido de sacarosa se deba principalmente a un efecto catalítico natural durante
la reacción de caramelización ya que a medida que transcurre la misma se forman
ácidos débiles, acelerando de esta manera dicha reacción y degradando la sacarosa
hacia la formación de fructosa y glucosa8. Esto es consistente con lo mencionado
anteriormente en la aceleración del proceso de caramelización (con disacáridos) a
pHs bajos. Sin embargo en sistemas donde haya una reducción extrema de agua
(alta concentración de azúcar) se minimiza la movilidad molecular afectando de igual
manera la cinética de reacción9.
• Temperatura: El efecto de la temperatura acelera significativamente la
caramelización ya que afecta la cinética de reacción. Este efecto se traduce en la
dependencia de los parámetros cinéticos hacia la temperatura, y puede ser
expresada ampliamente con la “Ecuación de Arrhenius”9, a mayor temperatura mayor
movimiento de moléculas, al incrementarse la energía cinética se incrementa la
velocidad de reacción.
2.4 Reacción de Maillard La reacción de Maillard es responsable de la formación de compuestos de aroma,
sabor y color en los alimentos, además durante esta reacción se generan una amplia
gama de productos importantes para el valor nutritivo de los alimentos, así como
también la formación de compuestos tóxicos y mutagénicos10
14
La reacción de condensación entre grupos carbonilo y grupos amino, comúnmente
llamada reacción de oscurecimiento no enzimático o reacción de Maillard, ha sido
objeto de revisión durante muchos años. Las primeras investigaciones acerca de la
reacción de azúcares reductoras con aminoácidos fue hecha en el año 1912 por
Maillard11. Posteriormente Amadori reportó dos productos de reacción, que describió
como los isómeros estables e inestables11. Más tarde se mostró luego que la
glucosilamina producto de la reacción entre el compuesto amino y el carbonilo (el
isómero inestable) es formado primero y sufre un rearreglo hasta formar una
aminocetona (el isómero estable).En la literatura se reporta que las mismas reacciones
correspondientes a las cetonas con aminoácidos, dan como resultado la formación de
aminoaldosas, los cuales mas tarde contribuyeron al entendimiento de la fase temprana
de la reacción de Maillard11
A pesar de los muchos resultados que se han tenido a través del tiempo todavía
no es posible presentar un esquema completo de la reacción de Maillard. Como datos
tenemos solo pocos productos de reacción que han sido aislados e identificados. Estos
productos que han sido caracterizados son preponderablemente aquellos que son
estables y no han sufrido mayores cambios a través del tiempo en la reacción o durante
el aislamiento del mismo. Cada compuesto puede servir como indicador de los pasos
de la reacción de Maillard. Sin embargo algunas dificultades son encontradas durante
el aislamiento de intermediarios, estos son presentados en muy pocas cantidades
durante la reacción, los cuales cumplen un papel muy importante en la producción del
oscurecimiento y de las sustancias de alto peso molecular (melanoidinas).
La reacción de Maillard de aminoácidos con azúcares reductoras difiere de la
reacción con aminas de la siguiente manera
• El grupo α-amino reacciona fácilmente con compuestos α-dicarbonilo, además los
mismos están propensos a la oxidación y descarboxilación a través de la
degradación de Strecker11
15
Por lo tanto el esquema de reacción para ambas reacciones es el mismo (figura 4).
Lo que se trata de ilustrar con este esquema es el hecho de que los intermediarios
clave para la formación de melanoidinas son los 1-,3- y 4- deoxyosulosas, además de
que a pH mayores de 7 se ven favorecidos los compuestos que dan sabor.
Figura 4.- Esquema de reacción Glucosa/ Glicina adaptado de George Njoroge (1989)11 AMP (Productos avanzados de Maillard), 3DH (3-Deoxyaldocetosa), 1DH (1-deoxy-2,3 dicetosa, 4DH (4-deoxy-2,3dicetosa)
16
2.4.1 Pasos de la reacción de Maillard
2.4.1.1 Etapa inicial: Condensación, enolización, rearreglo de Amadori y Heyns12
• Condensación y enolización: Los grupos aminos que son nucleófilos fuertes
reaccionan con el grupo carbonilo del azúcar, para la formación de la glucosilamina,
esto es mostrado en la figura 5.
• Rearreglo de Amadori y Heyns: Las glucosilamina de aminoácidos o aminas
alifáticas son usualmente detectadas en muy pequeñas cantidades, ellas pueden
sufrir un rearreglo vía aminoenol y así formar el rearreglo de Amadori.
Entre las azúcares reductoras con las que se trabajará tenemos la fructosa por esto
es relevante mencionar el rearreglo de Heyns que es mostrado en la figura 6, se
puede asumir que los compuestos de Amadori y Heyns se descomponen de forma
paralela13. Existen reportes de que ambos rearreglo son dado tanto a pH ácido
como básico, esto es ilustrado en las figuras 7, 8, 9 y 10
17
Figura 5.- Condensación y enolización de la glucosa para la formación de la glucosilamina, y subsecuente rearreglo de la misma para la formación de Amadori13
Figura 6.- Esquema general del rearreglo de Heyns13
Glucosa Glucosilamina
Imina Rearreglo de Amadori
Fructosa Fructosilamina
Rearreglo de Heyns
18
Figura 7.- Rearreglo de Amadori en medio básico16
D-Glucosilamina
1-Amino-1-deoxy-α-D-Fructopyranosa (Rearreglo de Amadori)
19
Figura 8.- Rearreglo de Amadori en medio ácido16
Figura 9.- Rearreglo de Heyns en medio básico16
D-Fructosilamina
2-Amino-2-deoxy-α-D-glucopyranosa (Rearreglo de Heyns)
20
Figura 10.- Rearreglo de Heyns en medio ácido16
2.4.1.2 Etapa intermedia: Deshidratación de azúcares para formar compuestos α dicarbonilos, HMF, reductonas y pigmentos12
• Producción de compuestos α dicarbonilos: Los compuestos α dicarbonilos son
los más reactivos y los intermediarios más importantes en la formación de color
aroma y sabor en la reacción de Maillard, la formación de estos es producto de las
seguidas reacciones antes mencionadas y son mejor ilustradas en la figura 11.
21
Figura 11.- Producción de α dicarbonilos: 1-Deoxy-2.3-hexodisulosa, 1-amino-1,4-dideoxy-2,3hexodiolosa, 3-deoxy-2hexosulosa13
• Producción de 5-hidroximetilfurfural (HMF): el HMF es un producto secundario
que es utilizado comúnmente en la caramelización para el seguimiento de la
reacción, este se da a través del intermediario 3-deoxy-2hexosulosa, sin embargo
su aparición se puede ver en gran medida reprimida por aminas primarias para
obtener en su lugar pirroaldehídos y pirididiumbetainas, la aparición de estos
1-Deoxy-2.3-hexodisulosa 1-amino-1,4-dideoxy-2,3hexodiolosa
Rearreglo vía enediol
Rearreglo de Amadori
Rearreglo vía aminoenol 3-deoxy-2hexosulosa
22
últimos y el poco rendimiento del HMF demuestra que la incorporación de los amino
compuesto toma parte como precursores de la reacción de Maillard13, esto es
mostrado en la siguiente figura.
Figura 12.- Producción de HMF a partir de la 3-deoxy-2hexosulosa, y algunos de los productos por los cuales es reprimido en presencia de aminas primarias16
Se ha reportado en la literatura que la formación de HMF está relacionada con el pH
a valores bajos se da la formación de furfural (proveniente de pentosas) y de 5-
hidroximetilfurfural, HMF (proveniente de hexosas), y a altos valores de pH
predomina la formación de furanonas22.
5-hidroximetil-2-furfural (HMF)3-deoxy-2hexosulosa
Pirroaldehído Piridinium
23
• Formación de Reductonas: Son un grupo de derivados de los carbohidratos los
cuales tienen un grupo carbonilo vecinal a un grupo enediol, estas se caracterizan
por tener un fuerte poder reductor en medio acido aun a bajas temperaturas, sin
embargo su estructura no es conocida con certeza, es probable que estas
reductonas puedan sufrir reacciones de oscurecimiento y dar un aporte a este
mucho más rápido que las azucares comunes, la formación de reductonas puede
ser mejor ilustrado en la figura 13 , dichas reacciones pertenecen a la clase
oxidativa, sin embargo esto no quiere decir que se excluirán de las otras reacciones
por el contrario son un aporte al oscurecimiento, aunque todo compuesto carbonilo
broncea mucho más rápido en presencia de un amino compuesto.
Figura 13.- Formación de reductonas16
2.4.1.3 Etapa Final: retroaldolización, condensaciones aldólicas y la degradación de Strecker
En la etapa final se llevan a cabo reacciones que llevan a la formación de
aldehídos y N-heterociclos a elevadas temperaturas donde se genera dióxido de
carbono y se forman las melanoidinas.12
1-Deoxy-2.3-hexodisulosa Acetilfomoina Reductona
24
• Retroaldolización y condensaciones aldólicas: Muchas azúcares o derivados de
ellas pueden sufrir retroaldolización, y estas a su vez reacciones de condensación,
que forman compuestos coloreados13, esto es ilustrado en las figuras 14 y 15.
HCHO HOH2C-CHO OHC-CHO H3C-CO-CH2OH
HOH2C-CO-CH2OH H3C-CO-CO-CH3 H3C-CO-COCH2OH
Figura 14.- Derivados de las azúcares, que pueden dar compuestos coloreados13
Figura 15.- Productos de retroaldolización: compuesto coloreados13
Estos productos de retroaldolización pueden de cierta manera acelerar la reacción
de Maillard, debido a que poseen una alta reactividad en reacciones de
condensación. Sin embargo los mismo se dan muy lentos cuando entre los
productos de partida está un disacárido esto se debe a que la retroaldolización solo
se puede dar luego de la hidrólisis y rompimiento del grupo glucósido13. La
retroaldolización está envuelta también en la formación de ácidos tales como el
acido β-hidroxipropionico y el acido láctico que en conjunto con las reductonas son
las responsables de la disminución del pH durante el transcurso de la reacción,
estos producto son mostrados a continuación.
Figura 16.- Algunos ácidos productos de la reacción de Maillard16
Acido β-hidroxipropionico Acido láctico.
25
• Degradación de Strecker: es una de las reacciones más importantes asociadas con
la formación de compuestos de aroma, la cual involucra transferencia de un grupo
amino desde un α-aminoácido, vía base de shiff como intermedio para formar un
compuesto α-dicarbonílico, la base de shiff se descarboxila y después de una
hidrólisis se genera un aldehído y un aminocarbonílico. El aldehído formado posee
un átomo de carbono menos que el aminoácido de partida y el compuesto α-
aminocarbonílico, esto es ilustrado en la figura 17, estos productos son altamente
reactivos y puede condensar con otra molécula similar para generar heterociclos de
nitrógeno13
Figura 17.- Degradación de Strecker y formación de amoníaco13
La importancia de la degradación de Strecker reside en el hecho de que los
aminoácidos pueden proporcionar amoníaco y aldehídos13 al igual que pueden
continuar reaccionando a través de condensaciones acelerando de esta manera la
reacción de Maillard. Todos estos intermediarios y compuestos formados son altamente
reactivos y pueden participar en nuevas reacciones con los grupos aminos,
posteriormente en una fase avanzada dar una serie de reacciones que llevan incluidas
ciclaciones, deshidrataciones, reordenamientos, isomerizaciones y condensaciones las
cuales conducen a la formación de los polímeros y co-polímeros llamados
melanoidinas.
26
2.5 Reacción de agua amoniacal con azúcares reductoras Como es bien conocido las azúcares reaccionan con agua amoniacal para
producir compuestos heterocíclicos en bajo rendimiento. Los productos de reacción de
mono y disacáridos con soluciones concentradas de amonio dependen de tres factores:
(1) el tiempo en que la reacción procede, (2) la temperatura de reacción y (3) el
catalizador usado14 .
Las reacciones de azúcares con agua amoniacal se asemejan a las reacciones de
azúcares con aminas (Maillard) en medio alcalino15 , los productos de estas azúcares
cuando se calientan en presencia de amoniaco forman muchos compuestos
substituidos como imidazoles, pirazinas y pocas piridinas16.
A bajas temperaturas y a menor tiempo de reacción la D-glucosa, D-fructosa
reaccionan con agua amoniacal para dar como resultado un polímero de alto peso
molecular de color oscuro llamado melanoidinas16 ,como mínimo 15 compuestos son
formados de una simple azúcar16 . A elevadas temperaturas estas azúcares reaccionan
mucho más rápido trayendo consigo en su mayoría productos como imidazoles y
pirazinas 16
2.5.1 Mecanismos de reacción entre azúcares reductoras y agua amoniacal
• Mecanismo de formación de pirazinas e imidazoles: ya que el rearreglo de
Amadori y Heyns se lleva a cabo en pH alcalino en base a esto se proponen dos
teorías (a) la previa formación de la glucosilamina y el rearreglo de Amadori y
Heyns (b) el mecanismo de fragmentación
(a)Formación previa de la glucosilamina-fructosilamina para luego dar el rearreglo
de Amadori y Heyns, este mecanismo de reacción es ilustrado en la figura 18
27
Figura 18.- Producción de Pirazinas por la formación previa de glucosilamina y fructosilamina16
28
Figura 19.- Producción de Imidazoles por la formación previa de la glucosilamina y fructosilamina16
Esta hipótesis consta en la formación de 2-amino-2-deoxy-D-glucosa o de D-fructosa
y amoníaco, sin una fragmentación anterior de moléculas de azúcar. Luego la
29
condensación de estos productos con una segunda molécula de 2-amino-2-deoxy-D-
glucosa o con una molécula de 1-amino-1-deoxy-D-fructosa las cuales podrían dar
pirazinas, también se puede observar que la D-glucosilamina y la D-fructosilamina
son considerados intermediarios en la formación de compuestos heterocíclicos como
los imidazoles substituidos16los aportes que se tienen sobre esta consideración son
los siguientes (a) El aislamiento de 2-amino-2deoxy-D-glucosa de la reacción de D-
glucosa y D-fructosa con amoniaco a bajas temperaturas. (b) El aislamiento de D-
glucosylamina de la reacción de D-glucosa con amoníaco a bajas temperaturas y a
altas temperaturas. (c) El aislamiento 2-Amino-2-deoxy-D-glucosa y amoníaco a
bajas temperaturas durante 6 meses con un buen rendimiento de pirazinas. (d) Las
pirazinas, se han sintetizado por la condensación de dos moléculas de 1-amino-1-
deoxy-D-fructosa o de 2-amino-2-deoxy-D-glucosa y también son obtenidas de la
condensación de 2-amino-2-deoxy-D-glucosa.
(b) Mecanismo de fragmentación: Para la formación de imidazoles, en la literatura se
propone que una molécula de D-glucosa se descompone para dar dos moléculas de
D-glyceraldehido16.En apoyo a este mecanismo de formación de los imidazoles se
tiene que los mismos son comúnmente formados de compuestos α-dicarbonilos. Esto
es ilustrado en la siguiente figura
Figura 20.- Formación de imidazoles por fragmentación de moleculas16
• Reacción de los compuestos dicarbonilos con amoníaco: Este rearréglo de tipo
bencílico es el resultado de la acción del medio alcalíno sobre el compuesto
30
dicarbonilo16. La reacción del intermediario carbonílico con amoníaco ocurre
rapidamente y, por lo tanto, la formación de imidazoles se da a continuación
Figura 21.- Reacción de compuestos dicarbonilos con amoníaco16
2.5.2 Importancia de los Imidazoles durante la elaboración de color caramelo clase III (E150):
El color caramelo se considera como un componente natural de la dieta alimenticia
ya que puede formarse cuando cientos de alimentos se cocinan o sacarosa se calienta,
sin embargo durante la producción del color caramelo clase III aparecen compuestos
substituidos con nitrógeno de los cuales se considera en promedio que 20% son
pirazinas y 10% imidazoles17, como se mostro en la reacción entre dicarbonilos y
amoniaco hay casi una exclusiva aparición del 4(5)-metillimidazol, este compuesto es
un señal del progreso de esta reacción, y ha sido mostrado como el más toxico entre
todos los imidazoles a través de pruebas de toxicidad, en la literatura se reportan
experimentos donde se impartía una dosis oral diaria de caramelo clase III a conejos,
ratones y polluelos17, las pirazinas por su parte resultaron ser leves depresores del
sistema inmunológico17.
Una relación del grado alimenticio del color caramelo clase III marco que los
productos comerciales contienen de 50-500ppm de 4(5) metilimidazol determinado por
CLAR17. Se ha demostrado que los rendimientos de imidazol aumentan linealmente con
31
el incremento de la relación molar amoníaco-glucosa18. La European Commision
especificó como límite contenido para el color caramelo clase III 200mg/Kg de 4-
Metilimidazol6 referido a un color de 20000 unidades EBC, para una ingesta diaria de
250 mg/Kg por peso corporal18.
2.6 Factores que afectan la velocidad de pardeamiento La velocidad de reacción del oscurecimiento no enzimático se ve afectada por las
condiciones en las que se desarrolla. Una lista de procedimientos fueron sugeridos para
el control de la reacción de Maillard 19.
(a) Aumento de la temperatura.
(b) Aumento de la actividad de agua.
(c) Aumento del pH.
(1)Temperatura: En una revisión bibliográfica se encuentra que bajo la mayoría de las
condiciones de almacenamiento (T<60° C), el oscurecimiento puede ser modelado
como un orden de reacción cero. Por otro lado a temperaturas altas (T>80° C) el
oscurecimiento puede seguir una reacción de primer orden, aumentando hasta alcanzar
un máximo19. Mostrando además que la energía de activación para el oscurecimiento
predomina por encima de 32ºC19. En general, el oscurecimiento es sensible a la
temperatura, por cada 10°C que incrementamos, asciende sobre unas cuatro u ochos
veces la velocidad de oscurecimiento.
Además se reporta que el papel de la temperatura difiere acorde al criterio
escogido, es decir, oscurecimiento o pérdida del amino compuesto. Por ejemplo en un
sistema glucosa-glicina calentado por una hora a 90° C y otro por 9 horas a 70° C se
obtuvo la misma perdida de glicina, pero el primero tiene el doble de absorbancia que el
de este último. Esto indica que la naturaleza exacta de la cantidad de oscurecimiento
producido es diferente a 70° C comparado con el que ocurre a 90° C19.
32
Ahora bien, esto demuestra la degradación significante de la glucosa a estas altas
temperaturas, dependiendo de la temperatura la glucosa desaparece variablemente
durante el calentamiento la cual es mucho más rápida en presencia de un grupo
amino20, de la misma manera se manifiesta la pérdida del grupo amino al calentarse a
altas temperaturas tanto con glucosa como en ausencia de la misma; a pesar de ser
más rápido en el primer caso ya que solo una ligera pérdida de aminoácidos se produce
cuando esta se calienta sola.20
(2) Actividad de agua: El agua es el constituyente predominante en la mayoría de los
alimentos y sirve como medio para que las reacciones químicas se lleven a cabo,
remover parte de ella en un sistema azúcar-aminocompuesto incrementaría la
concentración de azúcares, retardando también muchas reacciones3.
La actividad de agua, aw se puede definir como lo siguiente:
aw = P/P0 P= Presión de vapor parcial del alimento medida a una
temperatura T
P0= Presión de vapor saturada del agua pura a una
temperatura T
Esta división es llamada presión de vapor relativa, dicha igualdad se basa en
condiciones ideales (soluto ideal en solución diluida) y en equilibrio termodinámico. Los
alimentos suelen no estar en estas condiciones, por esto la ecuación debe tomarse solo
como una aproximación, la presión de vapor tiene una dependencia con la temperatura,
pudiéndose determinar cuantitativamente aplicando la ecuación de Clausius-Clapeyron
modificada de la siguiente forma:
dln aw = - ∆H
d(1/T) R
33
Donde T es la temperatura absoluta, R es la constante de gases ideales y el ∆H es el
calor isosterico neto de sorcion de agua en la muestra. Reorganizando esta ecuación
observamos que se comporta como una la línea recta3. Entonces es evidente que la
representación grafica del ln aw versus 1/T (a contenido de agua constante) es lineal,
esto también ocurre con el ln P/P0 versus 1/T.
La reacción de oscurecimiento como una función de la aw sigue el mismo patrón
de curvas con un mínimo y un máximo Como es mostrado a continuación19.
Figura 22.- Intensidad de color en función de la actividad de agua (oscurecimiento no enzimático)19
En general, la tasa de oscurecimiento incrementa desde el estado seco como
actividad de agua hasta llegar a un máximo sobre la cual el oscurecimiento decrece. El
principio físico se basa en que la movilidad de los solutos se ve gravemente limitada por
una difusión cada vez menor, creando una resistencia que reduce la movilidad de las
moléculas debido a una alta viscosidad de azúcar a valores de actividad de agua muy
bajas21. Por el contrario a valores más altos de actividad de agua los solutos se
movilizaran y reaccionarán con facilidad, sin embargo si el valor de actividad de agua es
muy alto los solutos son totalmente disueltos causando así una disminución en la
velocidad de reacción19
34
La actividad de agua disminuye la energía de activación20, sin embargo existe un
compromiso entre la cantidad de agua inicial en el sistema azúcar- aminocompuesto ya
que el agua es una producto de condensación en varios pasos de la reacción de
oscurecimiento por lo tanto también puede producir un efecto inhibidor diluyendo los
reactantes de tal manera que disminuye la velocidad de reacción.
(3) Efecto de la relación azúcar- amino compuesto: en un estudio reportado por
sobre el desarrollo de color en mezclas D-glucosa-glicina, en un sistema con 65% de
agua que se encontraban almacenadas a 65° C, se probaron relaciones de D-glucosa-
glicina desde 10:1 hasta 1:5. Los datos mostraron una marcada dependencia sobre la
proporción relativa de aminoácidos en base a la cantidad de azúcar. El desarrollo de
color era acelerado con proporciones desde 1:1 y 1:5, es decir, aquellas donde la
proporción azúcar-aminoácido eran iguales hasta una relación donde la cantidad de
aminoácido se encontraba en exceso, el oscurecimiento fue mayor. Estos resultados se
muestran a continuación19.
Figura 23.- Efecto de la relación molar azúcar-aminoácido sobre la reacción de oscurecimiento, D glucosa-glicina relación A 1:1.5, B 1:1, C 2:1, D: 10:1, contenido de agua 65%, temperatura 65ºC.19
(4) Efecto del tipo de aminoácido: En la literatura se ha reportado el efecto del tipo de
aminoácido en una mezcla 1:1 de D-glucosa/ mezcla de aminoácidos, sobre la cantidad
de oscurecimiento. Una comparación fue hecha entre nueve diferentes aminoácidos
que son conocidos por su frecuente existencia en alimentos. Los resultados indicaron
35
que tanto la L-arginina y el ácido 4-aminobutirico tienen la más intensa y rápida
formación de color seguida de la glicina, alanina, serina y L-prolina19. La lisina es a menudo reportada como el aminoácido más reactivo de la reacción
de Maillard. Esta hipótesis es basada en que la lisina tiene dos grupos aminos
disponibles sobre la molécula19. En otro estudio sobre la formación de productos de
Maillard en alimentos, el triptofano fue el más reactivo seguido de la serina y treonina,
sin embargo este conflicto resulta ser explicado porque la reactividad de diferentes los
aminoácidos dependen también del pH, de esta manera se espera que los aminoácidos
reaccionen similarmente a un rango de pH pero esto no puede ser necesariamente la
misma respuesta bajo otras condiciones de pH.19
(5) Efecto del pH: La reacción de Maillard es considerablemente influenciada por el pH
del sistema22.En un estudio que comprendía un sistema azúcares reductoras-
aminoácidos el desarrollo de color muestra una dependencia que resulto ser una curva
en forma de campana19. Como un ejemplo, se ha reportado el estudio de un sistema
modelo que contiene diferentes combinaciones de dos aminoácidos y dos azucares
reductoras. Ellos encontraron que la reacción de Maillard tiene un aumento de
intensidad sobre un valor de pH de 10.0 y luego disminuyo a muy altos valores de pH.19
36
Figura 24.- Efecto del pH sobre el oscurecimiento, (L) lisina, (AR) arginina, (G) glucosa, calentado a 121ºC durante 10 min.19
El incremento del oscurecimiento durante la reacción de Maillard se intensifica
cuando se aumenta el pH. Además el pH afecta a la energía de activación de la
reacción de pardeamiento, el bajar el pH aumenta la energía de activación para la
formación de las melanoidinas23 Hay que tomar en cuenta que durante la reacción de
Maillard se producen ácidos débiles y reductonas, ya antes mencionadas que a su vez
disminuyen el pH, cuando el mismo no es controlado tiende a disminuir la tasa de
pardeamiento.
La razón de porque decrece la intensidad el color a pH mayores de 10.0 podría
deberse al pequeño número de protones disponibles, los cuales son necesarios en los
primeros pasos de la reacción de Maillard 19. Por otra parte el hidróxido actúa como un
catalizador tanto en la deshidratación como la degradación de las reacciones que
impliquen reducciones de azúcares20.Como es de esperarse la intensidad de
pardeamiento es mayor con el aumento de la basicidad. Esto se debe a que la pérdida
de grupos aminos a pH altos es menor por lo cual pueden servir mejor como
catalizadores en la generación de pardeamiento8.
Una explicación sobre la perdida de grupos aminos a pH bajos y su efecto en la
reacción es la forma de equilibrio de protonación y no protonación del grupo amino.
37
NH3+ ------------- NH2 + H+
A pH menores de siete 50% del grupo amino se encuentra en su forma protonada,
impidiendo así el efectivo transporte de electrones, es por esto que a pHs menores de
siete la velocidad de pardeamiento es menor. Otra causa por la que disminuye la
velocidad a bajos pH se le puede atribuir a el nivel de forma acíclica o reductora de las
azúcares lo cual también influye en la cinética de oscurecimiento19.En la literatura se
reporto la determinación de la concentración de forma acíclica de diferentes azucares
reductoras en un rango de pH de 6.5 a 7.5.
Tabla 2 .- Porcentaje de azúcar acíclica en función del cambio de pH19
Con el incremento del pH aumenta la concentración del azúcar reductora en su
forma acíclica. La reacción de mutarotación que toma lugar cuando las azúcares
reductoras están disueltas en agua u otro solvente, es importante por el
comportamiento que pueden tener las mismas. Las azúcares cuando están disueltas en
agua sufren muchas transformaciones particularmente en presencia de ácidos o álcali.
La mayoría de los estudios agregaron que la ínter conversión cíclica de los mismos
procede vía un intermediario central el cual es el azúcar en su forma ceto o aldehído,
este equilibrio de reacción es el siguiente.
Azúcar pH
6.5 7.0 7.5
D-Glucosa 0.012 0.022 0.040
D-Galactosa 0.070 0.085 0.140
D-Manosa 0.040 0.065 0.110
D-Xylosa 0.100 0.130 0.360
pH > 7
38
Se ha encontrado en la literatura que cuanto más alto es el nivel de azúcares en
su forma acíclica en solución más rápida será la tasa de pardeamiento19.La
transformación de la forma acíclica envuelve la transferencia de protones desde el
solvente usado que usualmente es agua, por sus propiedades es el más favorable entre
cualquier otro solvente19
(6) Cinética de reacción: En un estudio sobre la cinética de reacción de
oscurecimiento no enzimático en un sistema azúcar-aminoácido, (glucosa-glicina) se
estudió la pérdida de uno con respecto al otro, la cual es seguida por una cinética de
primer orden en cada una, y de segundo orden en total.24 La cantidad de azúcares reductoras sugiere que pueda tener un factor importante
en la formación de la reacción de oscurecimiento de Maillard, en general se dice que un
exceso de azucares reductoras sobre la cantidad de amino compuesto, promueve el
oscurecimiento24.
Tres de cuatro estudios determinaron que la velocidad de reacción de Maillard fue
mayor cuando la glucosa estuvo en exceso, pero se estuvo en desacuerdo con la
relación de máxima velocidad lograda por el exceso de esta. Lo mismo ocurrió cuando
el aminoácido se mantuvo en exceso24.
Por su parte la formación de melanoidinas puede ser descrita como una reacción
de pseudo-cero-orden y de primer orden 24. La reacción de pardeamiento no enzimático
α-pyranosa
Forma acíclica
Β-pyranosa
α-furanosa β-furanosa
39
demostró gráficamente que aumentaba con el incremento de glicina y lo mismo ocurre
con el de glucosa. Esto indica que no hay diferencia entre la velocidad de reacción en
sistemas de diferentes concentraciones tanto de glicina como de glucosa.24
2.7 Melanoidinas
En la etapa final de las reacciones de caramelización (Maillard y la simple
degradación de azucares a altas temperaturas) hay un desarrollo de color oscuro
llamado melanoidinas, sin embargo muy poco se conoce sobre la química natural de
estos compuestos formados, lo que se mantiene hasta ahora son solo hipótesis25 .
Estos productos coloreados pueden ser divididos según su formación en tres
grupos; las melanoidinas que poseen un bajo peso molecular, estas estructuras
comprenden de 2-5 anillos unidos25. La importancia de estos polímeros de bajo peso
molecular también fue estudiado en un sistema glucosa-alanina donde solo habían
trazas de compuestos con un peso (> 3000 Da) esto significa que la causa de color se
debió exclusivamente a las fracciones de bajo peso molecular, la explicación a esto se
debe a que hay muchos sistemas donde los grupos aminos están más bloqueados que
otros, por lo tanto prefieren otras vías de degradación principalmente Strecker,
conduciendo así a la formación de polímeros de bajo peso molecular que igualmente
producen color.28 estas estructuras se muestran a continuación
40
Figura 25.- Melanoidinas de bajo peso26
Para los de alto peso molecular, aproximadamente unos cientos de Daltons, se
mantiene la hipótesis de que esta formación de melanoidinas provienen de la co-
polimerización de las primeras subunidades formadas27. Por otro lado, en la literatura se
informa que la parte predominante de los productos de reacción eran de alto peso
molecular (> 50000 Da), y que este aumento del peso molecular ocurrió de forma
paralela con la intensidad de oscurecimiento sin embargo esto depende de las
condiciones de reacción28.
La hipótesis de formación de este polímero se basa en que el monómero pueda ser el
compuesto de Amadori, por lo cual el mismo puede crecer por perdida de moléculas de
agua lo cual es obligatorio en este proceso. De la misma manera la pirolisis de este
polímero trae consigo la formación de productos tales como pirazinas, pirroles, piridinas,
furanos, etc. Acorde con esto los productos de Amadori pueden polimerizar por adición
de un nucleófilo como reacciones de grupos aminos hacia el carbonilo y la fracción de
una segunda molécula, seguir la deshidratación para formar el zwiterion (polímero I),
este puede perder una molécula de hidrógeno para formar el polímero IIa, o someterse
a una trasferencia intramolecular para formar un derivado neutro IIb el cual puede
convertirse en un derivado conjugado III. (Figura 26)
R= H
X= O, N
41
Figura 26.- Formación de una macromolécula (melanoidina)30.
Luego de esto en su mayoría forman furanos, pirroles y anillos que contienen
nitrógenos éter de metilo y/o grupos hidroxilos y algunos con aminoácidos, sin embargo
se debe tener en cuenta que los aminoácidos en si ya son de alto peso molecular, la
figura hipotética de las melanoidinas se muestra a continuación30
42
Figura 27.- Hipótesis de una macromolécula (melanoidina)28
El tercero modelo fue descrito en la literatura donde se encuentra que mucho de estos
compuestos coloreados son productos de retroaldolizaciones y deshidrataciones de las
azúcares las cuales pueden ser o no atacadas por proteínas y otros amino
compuestos29. Esta hipótesis se basa en que el esqueleto principal es formado en los
primeros pasos de la reacción de Maillard, condensación, aldolización y algunas
reacciones que estas puedan tener con los aminocompuestos29 para formar las
melanodinas sin contenido alguno de nitrógeno, además se identificaron estructuras
intactas de hidratos de carbono provenientes de una hidrólisis ácida, esto indica que no
todas las azúcares se degradan inevitablemente para formar heterociclos tales como
furanos y pirroles29
43
Glicina + Glucosa
Intermediario de Amadori Polímero con nitrógeno
Glicina
Glucosona
3-Deoxyglucosona Polímero sin nitrógeno
1-Deoxyglucosona
Figura 28.- Esquema de formación: polímeros con nitrógeno, y polímeros sin nitrogeno30
Asignando a las 3- o 1-deoxyglucosonas como intermediarios se explica la falta de
nitrógeno en las melanodinas formadas durante la reacción de Maillard dicho esquema
de formación para estos polímeros es mostrado en la figura 28, quienes indican la alta
presencia de oxígeno y carbono produciendo mayoritariamente furanos por la presencia
de el enlace glucosídico. Estos polímeros tienen una composición similar a la glucosa.
Esto es una muestra de los compuestos los cuales son ilustrados en la siguiente figura:
44
Figura 29.- Formación de melanoidinas de bajo peso molecular, sin contenido de nitrógeno.
2.7.1Cuantificación de las melanoidinas
El mecanismo de formación de las melanoidinas no está plenamente comprendido
ya que sus estructuras son en gran parte desconocidas, por ello resulta difícil cuantificar
estos compuestos. Sin embargo esta cuantificación es necesaria cuando se trata de
predecir u optimizar el oscurecimiento en alimentos procesados.
Según Lambert-Beer y su ecuación (A=ε*c*l), existe una relación lineal directa entre la
absorbancia (A) y la concentración (C), a través del coeficiente de absortividad molar
(ε). Estudios previos han demostrado que es posible relacionar la absorbancia de las
melanoidinas con el numero de moléculas de azúcar incorporados en el mismo. Para
ello solo falta el coeficiente de extinción molar que se determino en un sistema glucosa-
glicina y otros aminoácidos, donde la glucosa se etiqueto con 14C, y el coeficiente de
extinción se mantuvo constante durante todo el tiempo de calentamiento29. Una de las
45
ventajas de este enfoque es que el coeficiente de extinción molar de las melanoidinas
puede ser sencillamente expresado en términos de la concentración de glucosa
convertidos en el compuesto coloreado.
De esta manera la relación entre el oscurecimiento y la cantidad de azúcar
incorporada en la melanoidina es claramente lineal así que el coeficiente de extinción
puede deducirse de la pendiente de esta recta29, y aplicando la ley de Lambert -Beer se
obtiene un aproximación de la concentración de melanoidinas en un sistema azúcares
reductoras-aminoácidos.
La intensidad de oscurecimiento de estas mezclas de reacción es determinada
comúnmente por espectrofotometría a 420nm y cuando es necesario las muestras son
diluidas en agua, si no son diluidas se mide la absorbancia directa del color caramelo y
con el coeficiente de extinción molar se puede expresar en moles de azúcar
incorporados en las melanoidinas, esto da una información cualitativa en términos de
color, pero esta no estará relacionada en términos cuantitativos a la concentración
molecular del polímero sino de las pérdidas de azúcar para formarlo.
2.7.2 Factores que afectan la composición de las melanoidinas y sus estructuras hipotéticas Tanto las materias primas, así como las condiciones de reacción tienen una fuerte
influencia sobre la composición de las melanoidinas, estas pueden determinar el tipo de
estructuras que se formaran durante la reacción de Maillard y de esta manera los
precursores de las melanoidinas
2.7.2.1 pH, Temperatura y tiempo
Las melanoidinas son generalmente conocidas como un grupo muy similar a los
compuestos de Amadori, de hecho los mismo son encontrados junto con los
aminoácidos y el HMF como producto remanente en las mismas; incluso aminoácidos
han sido reportados sin cambios30. Con incremento del tiempo de reacción y
46
temperatura, el contenido total de carbono incrementa más que el de nitrógeno, así se
promueve el carácter aromático y la insaturación de la melanoidina31
La cantidad de nitrógeno incorporado en la molécula difiere significantemente
según las condiciones de reacción por ejemplo, en un sistema de aminoácidos en la
literatura se reporta que la cantidad de aminocompuestos que se incorpora al polímero
incrementa con el decrecimiento de la temperatura resultando así una baja relación
C/N. Obteniendo que un bajo valor de C/N se da cuando decrece tanto el pH como la
temperatura27.
Otro microanálisis arrojó datos sobre las melanoidinas donde se fueron variando
las condiciones de reacción para así observar la composición elemental de los
polímeros y como pueden ser influenciados por la temperatura, pH y tiempo esto es
mostrado en la siguiente tabla
Tabla 3.- Cambios en la composición de las melanoidinas variando tiempo, pH, y temperatura30
La temperatura influye sobre las propiedades aromáticas de las melanoidinas y
sobre su relación C/N, lo que se observa en esta tabla es que a bajas temperaturas
aumenta la cantidad de aminoácido incorporado en la molécula, mientras que a
diferentes pH este cambio en la relación C/N no es muy apreciable.
El pH también afecta en la variación de punto isoeléctrico de las melanoidinas 31,
en un sistema se trabajaron con tres condiciones, en una solo había formación de
Datos del microanálisis en % (elementos) de melanodinas relación molar glucosa/glicina 1:1 variando condiciones de reacción
Condiciones de reacción
C N H O C/N
170ºC/20min 53,42 4,26 4,26 37,61 12,5396
100ºC/10h/pH 5 55,58 6,97 5,38 32,07 7,9741
100ºC/10h/pH7 49,05 6,12 5,25 39,57 8,0147
60ºC/160h/pH5 43,02 6,94 4,78 45,25 6,1988
47
melanoidinas sin control de pH, en otro el pH fue controlado con un buffer de fosfato y
en el ultimo simplemente se agrego bicarbonato de sodio al inicio de la reacción para
garantizar un alto pH al principio de la misma.
La melanoidina mas estable fue aquella donde se controlo el pH mediante un
buffer de fosfato, las etiquetas de punto isoeléctrico estuvieron dentro de rango de pH
mucho menor que aquellas donde no se controlo. Además en la que se controlo el pH
con buffer de fosfato se obtuvo la máxima coloración, esto se le atribuye al fosfato ya
que puede servir como catalizador acelerando la formación del compuesto de
Amadori31.
2.7.2.2 Tipo de azúcares reductoras
La composición elemental de las melanoidinas producidas en mezclas de
reacción difiere marcadamente si se usan pentosas (ribosa) o hexosas (glucosa,
fructosa). Lo que se conoce en un sistema azúcar-aminoácido es que el caso de las
ribosas, más de 4 moles de azúcar son incorporados dentro de la melanoidina, por mol
de aminoácido, tomando en cuenta que para hacer estas comparaciones se necesitan
las mismas condiciones de reacción, mientras que solo la mitad de moles de las
hexosas participan (2 moles de azúcar por cada mol de aminoácido)31, esto indica que
para tener melanoidinas con alto contenido de nitrógeno la lactosa y la sacarosa son
útiles, como es mostrado en la siguiente tabla
Tabla 4.- Cambio en la cantidad de nitrógeno incorporado a la molécula variando el azúcar reductora30
Datos del microanálisis de melanodinas en % (elementos) relación molar carbohidratos/glicina 1:1
Azúcar C N H O C/N
Ribosa 50,28 2,41 6,28 41,03 24,1825
Glucosa 53,42 4,26 5,38 37,31 12,5339
Fructosa 47,39 5,00 6,42 41,19 7,3816
48
Esta diferencia se podría explicar por la reactividad de las azúcares. La
composición fundamental de las melanoidina es influenciada principalmente por la
cantidad molar de reactantes.
En algunos reportes se ha hecho el intento de describir la estructura de los
mismos usando 13C y 15N-CP-MAS y espectroscopia de RMN, donde la formación fue
monitoreada con la ayuda de aminoácidos y azúcares etiquetados, la técnica donde se
etiqueta el carbono sirve para saber los aminoácidos incorporados y la técnica de
nitrógeno etiquetado para observar la formación de pirroles y grupos amida, sin
embargo describir la estructura resulta ser bastante complejo.
2.7.2.3Relación azúcar-aminocompuesto
Datos interesantes de en un microanálisis en un modelo glucosa/glicina produciendo
melanoidinas con diferentes concentraciones molares son mostrados en la siguiente
tabla
49
Tabla 5.- Cambio en la composición de melanoidinas variando la relación molar glucosa-glicina30
Incluso un exceso de glicina (2:8) en el sistema de reacción puede afectar
significativamente la composición molar del polímero. En presencia de un exceso de
azúcar, es muy probable que los productos de reacción sean de bajo peso molecular.
2.8 Métodos cromatográficos Compuestos como el 4-metilimidazol y 5-hidroximetilfurfural pueden ser determinados
de forma cromatográfica, de la misma manera se realizo una separación de pesos
moleculares (electroforesis) para los colorantes obtenidos y por ello se presenta una
pequeña revisión de este tema.
Cromatografía de gases: Esta es una técnica de separación que consiste en volatilizar
la muestra la cual se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución
se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte, a diferencia de otros métodos
cromatográficos, la fase móvil no interacciona con el analito; su única función es la de
transportar el analito a través de la columna, en la cromatografía gas-solido la retención
de los analitos se realiza en una fase estacionaria solida, como consecuencias de la
adsorción física22.
Microanálisis elemental de la composición de melanoidinas variando la relación molar glucosa/glicina
Relación molar C N H O C/N
8:2 50,23 4,15 6,19 39,34 12,1036
1:1 53,42 4,26 5,39 37,61 12,5396
2:8 47,81 3,50 6,21 42,48 13,66
50
La cromatografía de gases también puede ser acoplada a un espectrómetro de masas
de barrido rápido. El caudal de las columnas capilares en general es suficientemente
bajo como para que la salida de la columna pueda introducirse directamente en la
cámara de ionización de un espectrómetro de masas. Su rapidez y alta sensibilidad son
especialmente ventajosas para su aplicación.
Cromatografía liquida de alta eficiencia (CLAR): De los métodos de separación este
es el mas ampliamente utilizada; la razón de su popularidad es debido a su sensibilidad,
su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas y su método de análisis
mucho más rápido, así como su idoneidad para la separación de especies no volátiles o
termolábiles, puede separar compuestos que sean solubles en líquidos que pueden ser
usadas como fase móvil a diferencia de la cromatografía de gases que los
componentes de la muestra necesitan no ser volátilizados32.
Cromatografía en fase normal: fases estacionarias de elevada polaridad y fase móvil
un disolvente apolar32.
Cromatografía en fase inversa: fase estacionaria no polar con frecuencia trata de un
hidrocarburo, y la fase móvil con frecuencia es altamente polar32.
Cromatografía de exclusión de iones: esta técnica no es necesariamente una
cromatografía iónica debido a que son especies neutras y no iones los que se separan,
la fase estacionaria es una resina de intercambio catiónico en su forma ácida y la
elución se lleva a cabo mediante una disolución diluida de ácido. La columna analítica
va seguida de la columna supresora que esta rellena con una resina de intercambio
catiónico. Los protones del eluyente se intercambian por los iones que quedan
atrapados en la columna32
Isoelectroenfoque: El isoelectroenfoque consiste en la migración de moléculas
cargadas en solución por la exposición de un campo eléctrico sobre un soporte
gelificado en el que se ha establecido un gradiente de pH. Cada molécula migra y
51
queda enfocada en aquella porción del gradiente de pH cuyo valor es su punto
isoeléctrico y forma allí una banda estacionaria bien definida33
Electroforesis: es una técnica de separación que se basa en la migración diferencial
(en sentido y velocidad) de partículas cargadas (analitos) en un campo eléctrico
establecido al efecto, es decir, en un gradiente de potencial. La electroforesis en geles
tales como poliacrilamida como medio de soporte proporciona una inestimable
resolución, particularmente para proteínas, incluyen la combinación de una reducción
de la difusión por la malla del gel y la acción separadora de la cromatografía en gel
(tamiz molecular) al cual se le aplica el voltaje adecuado, esto en presencia de un
tampón y patrones de peso molecular; las proteínas quedan enfocadas en el rango de
peso molecular correspondiente a las mismas33.
2.9 Métodos de tratamiento de muestra Para el aislamiento de 5-hidroximetilfurfural se utilizó la extracción en fase solida la
cual es una potente y simple técnica, al mismo tiempo, rápida y económica. Esta se
aplica pasando una disolución que contiene analito(s) sobre una fase solida (o fase
estacionaria) que lo(s) adsorbe específicamente. La fase solida suele estar compactada
en el fondo de una pequeña columna (3-20mL). Despees de la adsorción, los analitos
se eluyen con una pequeña cantidad de otro disolvente extractor, con el que
interaccionan más fuertemente que con la fase estacionaria. Por lo tanto la EFS no solo
consigue un cambio de matriz del analito, sino que reduce el volumen de muestra34
Es más eficiente que la extracción liquido/liquido además de ser mucho más
rápida, los cartuchos de C18 para extracción en fase reversa son ideales para separar
compuestos polares de los no polares, los pasos para el uso de estos cartuchos son los
siguientes:
Activación: El primer paso es la activación en la que se utiliza un solvente
orgánico para "humidificar" la fase. Con fases hidrofóbicas (p. ej. C18) se usa un
solvente polar, como el metanol34.
52
Acondicionamiento: La fase estacionaria con el mismo solvente de la matriz de
la muestra, por ejemplo, con matrices acuosas el solvente es agua. El
acondicionamiento permite "alinear" la fase estacionaria lejos de la superficie de la
sílice, permitiendo la interacción entre el analito y la fase estacionaria. Cualquier
solvente orgánico residual se elimina en esta etapa, asegurando que los componentes
de interés sean retenidos en la parte superior de la columna.
Retención: Las interacciones entre las moléculas de la muestra y la fase
estacionaria controlan la retención en el adsorbente del cartucho. Para maximizar las
interacciones la muestra (A=analitos + M=matriz) deben cargarse en el adsorbente del
cartucho a aproximadamente 3 ml/min. Este caudal puede controlarse mediante una
válvula en la estación de vacío. Los componentes de matriz y los contaminantes han de
retenerse en el adsorbente del cartucho mientras que los componentes de interés
deben eluirse o viceversa.
Micro extracción en fase solida: Se basa en la absorción de compuestos sobre
una fase absorbente emplazada en el extremo de una micro jeringa modificada, las
cuales se desorben posteriormente en el inyector de un cromatografo de gases o
líquidos. La extracción se puede realizar por inmersión directa de la fibra en la muestra
liquida, o por el espacio de cabeza (un sistema cerrado, donde la fibra se encuentra
suspendida sobre la muestra). La principal ventaja de esta técnica es que elimina la
utilización de disolventes y usa poca mano de obra; sus inconvenientes son que
requiere tiempos largos, que la extracción es reproducible, pero no necesariamente
cuantitativa, y que para cada muestra debe estudiarse los efectos de la matriz35.
53
3 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
3.1 Objetivo General
• Estudiar los factores que afectan la formación de color caramelo clase III: actividad
de agua, pH, relación molar azúcar-nitrógeno y temperatura, con la finalidad de
comprender el efecto de los mismos sobre la intensidad de oscurecimiento.
3.2 Objetivos Específicos
• Optimizar la formación de azúcares reductoras a partir de sacarosa, con la finalidad
de obtener la mayor disponibilidad de las mismas para la formación de compuestos
de color.
• Estudiar el efecto de los factores que afectan la formación de color: pH, relación
molar azúcar-nitrógeno, temperatura y actividad de agua.
• Establecer metodologías analíticas para el seguimiento de la formación de color a
través de la medición del precursor HMF.
• Determinar la cantidad de nitrógeno libre en el color caramelo.
• Evaluar la formación de 4-metil imidazol en los colorantes obtenidos.
• Determinar los pesos moleculares de los compuestos de color con la finalidad de
establecer a que producto se le mediría punto isoeléctrico
• Determinar los compuestos de aroma que son productos de reacción
54
4 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Equipos:
• Medidor de actividad de agua (Aqualab serie 3 3TE, Decagon Paw Kit)
• Unidad de Electroforesis mini protean II electrophoresis cell, BIO RAD
• Visiprep Solid Phase Extraction Vacum Supelco
• pHmetro (Thermo Scientific Orion 3-Star, Thermo Electron Corporation)
• Espectrofotómetro UV-Visible Hewlett Packard 8453, lámparas de Deuterio y
Wolframio y un detector de diodos en serie
• Destilador (Bϋchi Auto Kjeldahl Unit K- 370, Buchi/switzerlarnd)
• Cromatografo líquido, equipo Waters LC module plus 410, detector de Índice de
refracción. AUFS 3. columna YMC-Pack PA, (4.6 mm x 250 mm, S-5 m Waters),
otro sistema con un detector UV Waters 2475, columna Aminex HPX-87H, 300mm x
7.8mm (BioRad), y por ultimo un sistema con un detector UV-DAD- 310/nm, Waters
996, columna LiChroCART 100RP-18.5mm HP 50833, Chromolith RP-18e 100mmx
4.6mm id Merck · 1.02129.0001 (2 columnas unidas)
• Cartuchos de extracción en fase solida LC18 de 3mL (Supelco, Sigma-Aldrich)
• Cromatografía de gases, equipo HP-6890N, detector de masas HP-5973N fase no
polar (HP-5MS, 30 m de largo x 0,25 mm de diámetro interno x 0,25 mm de espesor
de fase estacionaria)
• Fibra de micro extracción en fase solida: fase combinada Divinilbenceno / Carboxen
/ Polidimetilsiloxano (DVB /CAR /PDMS), Supelco
Reactivos:
• Sacarosa (Azúcar común marca Montalbán)
• Acido sulfúrico 98% p/p (EMD grado alimenticio)
• Hidróxido de amonio 25%p/v (Rieldel-de Haën sigma aldrich)
• Agua destilada
55
• Agua desionizada 18 Ω/cm-1
• Sulfato de amonio (Merck KGaA 99%)
• Patrones para medir actividad de agua (KCl 0,5m aw 0,984; NaCl 6m aw 0,760; LiCl
8,57m aw 0,500) aqualab water activity meter decagon, verification Standars devices
• Óxido de magnesio (Merck, Darmstadt 97%)
• Ácido bórico (Sigma Chemical 99%)
• Hidróxido de sodio (Merck, KGaA, Darmstadt 99%)
• Patrones para electroforesis 200-10KDa (Precision Plus Protein Dual Color
Standars BIO RAD)
• Dodecanesulfonato de sodio (Merck, Darmstadt 99%)
• Fosfato potásico (Merck, Darmstadt 99%)
• Metanol 98% (Merck , Darmstadt 99,8%)
• 2-metilImidazol (Merck , Darmstadt 99%)
• Etanol(Merck , Darmstadt 99,9%)
• Acrilamida (BIO RAD laboratorios, 99%)
• Helio (AGA)
• Acetonitrílo (J.T Baker HPLC, 99, 90%)
• Persulfato de amonío (BIO RAD laboratorios, 99%)
• TEMED (sigma Chemical 99%)
• SDS (BIO RAD laboratorios, 99%)
• Tris HCl 0,5M y 0,8M (BIO RAD laboratorios, 99%)
• Glicina (BIO RAD laboratorios, 99%)
• β mercapto etanol (BIO RAD laboratorios, 99%)
• Azul de comassie (BIO RAD laboratorios R-2500, 99%)
56
4.1 Métodos
4.1.1 Medidas de color El seguimiento de la formación de color se realizó en un espectrofotómetro UV-
Visible, debido a la alta viscosidad de la muestra la intensidad de color fue expresada
según los manuales cerveceros37, en unidades EBC, por lo tanto su tratamiento se llevó
de la siguiente manera: Se pesó la muestra en una balanza analítica (aproximadamente
0,5g), y se le agrego agua destilada hasta llegar a un volumen de 500mL, la solución se
homogenizó, y se realizó la medición en una celda de cuarzo de 1cm a una λ= 430nm
El cálculo EBC fue EBC= Abs430 *25 * Factor de dilución36.
4.1.2 Actividad de agua (aw) Se realizaron curvas de actividad de agua para las tres condiciones de pH que se
estudiaron 5,06 ± 0,05, 7,06 ± 0,08 y 10,65 ± 0,07 graficando la velocidad media de
formación de color en función de la actividad de agua, para realizar estas curvas se
escogieron ocho puntos los cuales variaban en sus concentraciones iniciales de
sacarosa, para observar este efecto se dejó fijo siempre la cantidad en gramos de
sacarosa y se comenzó a variar la cantidad de agua en forma continua. Seguidamente
la actividad de agua es medida al principio y final de la reacción. Para su medición se
peso (0,5 – 1 g) se coloco en una bandeja para medir actividad de agua, y se introdujo
en el bloque de sensor del equipo. Se esperó aproximadamente 5 minutos para que se
generara la medida.
Tabla 6. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a pH 10,65
CONDICIONES DATOS
Sacarosa (%) 50 65 70 73 77 82 87 90
Sacarosa (g) 140 140 140 140 140 140 140 140
Agua (g) 140 75 60 50 40 30 20 15
57
Ácido sulfúrico (μL para la
inversión de azúcar)
92.4 92.4 92.4 92.4 92.4 92.4 92.4 92.4
Hidróxido de amonio (mL) 9.4 9.4 9.4 9.4 9.4 9.4 9.4 9.4
Temperatura ºC para la
inversión de azúcar
100 100 100 100 100 100 100 100
Temperatura ºC para la
formación de color
100 100 100 100 100 100 100 100
Relación molar azúcar:
nitrógeno 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1
Peso total de la solución (g) 289.4 224.4 209.4 199.4 189.4 179.4 169.4 164.4
Tabla 7. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a pH 5,06
CONDICIONES DATOS
Sacarosa (%) 50 65 70 73 77 82 87 90
Sacarosa (g) 140 140 140 140 140 140 140 140
Agua para la inversión (g) 120 60 35 30 25 20 15 10
Agua donde se disolvió el
sulfato de amonio (g)
20 15 25 20 15 10 5 5
Agua total utilizada en el proceso (g)
140 75 60 50 40 30 20 15
Ácido sulfúrico (μL
para la inversión de
azúcar)
92.4 92.4 92.4 92.4 92.4 92.4 92.4 92.4
58
Sulfato de amonio (g) 8.133 8.133 8.133 8.133 8.133 8.133 8.133 8.133
Temperatura ºC para la
inversión de azúcar
100 100 100 100 100 100 100 100
Temperatura ºC para la
formación de color
100 100 100 100 100 100 100 100
Relación molar azúcar:
nitrógeno 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1
Peso total de la solución
(g) 288.133 223.133 208.133 198.133 188.133 178.133 168.133 163.133
Tabla 8. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto de la actividad de agua a pH 7,06
CONDICIONES DATOS
Sacarosa (%)
50 65 70 73 77 82 87 90
Sacarosa (g) 140 140 140 140 140 140 140 140
Agua para la inversión (g) 120 60 35 30 25 20 15 10
Agua donde se disolvió
el sulfato de amonio (g) 20 15 25 20 15 10 5 5
Agua total utilizada en el proceso
(g) 140 75 60 50 40 30 20 15
Ácido sulfúrico (μL
para la inversión de
azúcar)
92.4 92.4 92.4 92.4 92.4 92.4 92.4 92.4
Sulfato de amonio (g)
5.067 5.067 5.067 5.067 5.067 5.067 5.067 5.067
59
Hidróxido de amonio (mL) 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7
Temperatura ºC para la
inversión de azúcar
100 100 100 100 100 100 100 100
Temperatura ºC para la formación de color
100 100 100 100 100 100 100 100
Relación
molar azúcar:
nitrógeno
3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1 3.3:1
Peso total
de la solución g
288.767 223.767 208.767 198.767 188.767 178.767 168.767 163.767
Estas condiciones se realizaron por triplicado para cada pH.
4.1.3 Efecto de la actividad de agua inicial sobre la intensidad de oscurecimiento.
Se evaluó el efecto de la actividad de agua inicial sobre el oscurecimiento para
cada pH 10,65 ± 0,07, 5,06 ± 0,05 y 7,06 ± 0,08 realizando mediciones de color a través
del tiempo, con una relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y 100ºC temperatura
4.1.4 Efecto del cambio de pH inicial sobre la intensidad de oscurecimiento
Se evaluaron tres condiciones de pH inicial para las soluciones de jarabe invertido
y aminocompuesto 5,06 ± 0,05, 7,06 ± 0,08 y 10,65 ± 0,07 para ellos se emplearon
diferentes fuentes de nitrógeno, primeramente sulfato de amonio para obtener un pH de
5,06, luego una mezcla de sulfato de amonio e hidróxido de amonio para lograr el
efecto inicial de un buffer a pH 7,06 y por último hidróxido de amonio quien aportaba un
pH de 10,65, a través de estas condiciones se realizaron curvas de cinética intensidad
de color EBC en función del tiempo. La actividad de agua inicial se ajusto para cada pH
al nivel correspondiente de VCm máxima optimizada por medio del efecto de la
60
actividad de agua, la relación molar utilizada fue 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y 100ºC de
temperatura.
Las medidas de pH se hicieron tomando siempre la misma cantidad de jarabe
invertido aproximadamente 0.1 g y se llevó a 100mL de solución con agua destilada, el
pH de esta mezcla se midió directamente con el pHmetro.37
4.1.4.1 Efecto del pH inicial sobre la actividad de agua
Se evaluó el efecto del pH sobre la actividad de agua a condiciones de pH
5,06±0,05, 7,06±0,08 y 10,65±0,07 midiendo la actividad de agua a través del tiempo,
los sistemas evaluados para los tres pH correspondieron a la actividad de agua inicial
donde se encontró máxima VCm, la relación molar utilizada fue 3,3:1
sacarosa/nitrógeno y 100ºC de temperatura.
4.1.5 Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la intensidad de oscurecimiento
Se evaluó el efecto de la relación molar a las tres condiciones de pH respectivos
para así realizar curvas de cinética de reacción, Intensidad de color EBC en función del
tiempo, las relaciones molares azúcar: nitrógeno que se evaluaron fueron las
siguientes: 3.3:1, 33:1 y 330:1. La actividad de agua inicial se ajusto para cada pH al
nivel correspondiente de VCm máxima, a una temperatura de 100ºC, los datos fueron
los siguientes:
Tabla 9. Condiciones de trabajo para el estudio del efecto relación molar sacarosa/nitrógeno
pH 10,65 RM
3,3:1 RM 33:1
RM 330:1 pH 7,06
RM 3,3:1
RM 33:1
RM 330:1 pH 5,06
RM 3,3:1
RM 33:1
RM 330:1
Sulfato de
amonio (g) - - -
Sulfato de
amonio (g) 5,06 0,506 0,0506
Sulfato de
amonio (g) 8,133 0,813 0,081
Hidróxido
de amonio
(mL)
9,4 0,94 0,094
Hidróxido
de amonio
(mL)
3,7 0,370 0,037
Hidróxido
de amonio
(mL)
- - -
61
4.1.5.1 Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la actividad de agua
Se evaluó el efecto de la relación molar sobre la actividad de agua a condiciones
de pH 5,06±0,05, 7,06±0,08 y 10,65±0,07 midiendo la actividad de agua a través del
tiempo, los sistemas evaluados para los tres pH correspondieron a la actividad de agua
inicial donde se encontró máxima VCm, a 100ºC de temperatura.
4.1.6 Efecto de la temperatura sobre la intensidad de oscurecimiento
Se evaluó el efecto de la temperatura a las tres condiciones de pH 10,65, 7,06 y
5,06 para así realizar curvas de cinética de reacción, Intensidad de color EBC en
función del tiempo, las temperaturas de trabajo evaluadas fueron: 100ºC y 85ºC. La
actividad de agua inicial se ajusto para cada pH al nivel correspondiente de VCm
máxima, y la relación molar utilizada fue 3,3:1 sacarosa/nitrógeno.
4.1.6.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua
Se evaluó el efecto de la temperatura sobre la actividad de agua a condiciones de
pH 5,06±0,05, 7,06±0,08 y 10,65±0,07 midiendo la actividad de agua a través del
tiempo, los sistemas evaluados para los tres pH correspondieron a la actividad de agua
inicial donde se encontró máxima VCm, la relación molar se ajusto a 3,3:1
sacarosa/nitrógeno.
4.1.7 Nitrógeno libre en la molécula
Se realizó a través de método de Kjeldahl, para aquellos sistemas con relación molar
sacarosa/nitrógeno 3,3:1; 100ºC de temperatura, la actividad de agua inicial se ajusto
para cada pH a la optima donde se obtuvo la VCm máxima
Nitrógeno libre:
Se pesó la muestra en una balanza analítica (aproximadamente 0.5 g), se
colocaron en un tubo de vidrio Büchi y se le agrego óxido de magnesio (0.6 g), etanol
(3 mL) y agua destilada (30 mL). El tubo se coloco en él, la muestra es neutralizada
62
con hidróxido de sodio (50mL, 33%) el amoníaco libre es arrastrado por vapor hasta el
recipiente de titulación. A esta solución se le añadió ácido bórico en exceso (50 mL,
4%) el cual reacciona con el amoníaco generando amonío e ión borato. El ión borato es
titulado con ácido sulfúrico (0,1 N). El contenido de amoníaco libre se expresó en mol/g
de muestra de nitrógeno38.
4.1.8 Análisis por electroforesis.
Las melanoidinas fueron sometidas a una previa electroforesis, para aquellos
sistemas con relación molar sacarosa/nitrógeno 3,3:1; 100ºC de temperatura, la
actividad de agua inicial se ajusto para cada pH a la optima donde se obtuvo la VCm
máxima, se prepararon los geles de resolución y apilamiento, se utilizó un gel de 15%
de poliacrilamida, se realizó el tratamiento de muestra con β mercapto etanol y azul de
comassie, se colocaron patrones de peso molecular, el campo eléctrico tuvo un valor
inicial de 80 V hasta 150V durante una hora.
4.1.9 Optimización de azúcar invertida, seguimiento del HMF y formación de 4-metilimidazol
4.1.9.1 Optimización del Azúcar invertida
Para la separación cromatográfica se utilizó un equipo de cromatografía liquida a
una temperatura de columna 25ºC y un detector de Índice de refracción. Se usó una
columna fase normal. La separación se realizó de forma isocrática y la fase móvil
consistió en una mezcla de solvente (v/v): solución de acetonitrílo en agua (75:25)39. El
flujo utilizado fue 0.8 mL/min. Las azúcares eluyen con la fase móvil quedando
retenidos compuestos de menor polaridad tales como las melanoidinas formadas
durante la caramelización.
4.1.9.2 Seguimiento del HMF
Para la separación del HMF de las melanoidinas en las muestras de caramelo se
pesó 1g de la misma, se llevó a un volumen de 10mL con agua destilada se
63
homogeneizó la mezcla, se tomo 1mL y se pasó por un cartucho de C18 donde todas
las melanoidinas formadas durante la reacción quedaron retenidas dejando pasar el
HMF, al cual se le realizaron lavados con 3mL de acetonitrílo: agua (10:90). Para la
separación cromatográfica de HMF se utilizó un equipo de cromatografía líquida, una
temperatura de columna de 55ºC, un detector UV. La detección se realizó a 283 nm. Se
utilizó una columna de intercambio iónico. La separación se realizó isocraticamente y la
fase móvil consistió en una solución de H2SO4 0.01N (v/v). A un flujo de 0.6 mL/min
4.1.9.3 Formación de 4-metilimidazol
Las condiciones de cromatografía liquida fueron el equipo anterior a una
temperatura del horno de 40ºC, la detección se realizó a 310/nm. La columna es de
fase reversa. La separación se realizó isocraticamente y la fase móvil consistió en tres
solventes (v/v): A: solución de dodecanesulfonato de sodio (0.005M) B: KH2PO4 (0.2M)
y C: metanol (98%), a proporciones de 42,5%, 25% 32,5% respectivamente, se utilizó 2-
metilImidazol como estándar interno. El flujo de trabajo fue 1mL/min40.
4.2 Determinación de compuestos de aroma
Para el aislamiento de los compuestos aromáticos se utilizó una fibra de micro
extracción en fase solida, la cual se limpia previamente de impurezas a (250ºC). Se
tomaron 10mL de la muestra y se agregó en viales de 40 mL, los cuales se cerraron
con tapas provistas de un septum. Se esperó que la muestra alcanzara el equilibrio
durante 15 min. y luego se muestreo con la fibra expuesta durante 25 min a 25°C en el
espacio confinado, para la desorcion de los analitos se coloco en el puerto de inyección
por 9min, se uso una temperatura del puerto de inyección de 250ºC modo splitless, el
programa de calentamiento del horno fue: Tinic. 40°C (3 min.), 6.5 °C/min hasta 200°C,
35°C/min. Hasta 250°C (1 min.). El gas de arrastre utilizado fue He, a una velocidad
lineal de 42 cm./s, la temperatura del cuadrupolo fue 150°C. El rango de masas 35-550
u.m.a y la temperatura de la cámara de ionización: 230°C, el flujo fue constante 1.3
mL/min
64
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Optimización de la reacción de inversión para la formación de azúcares reductoras
Se ha reportado en la literatura (A. Kaanane and T. P. Labuza, 1989)19 que cuanto
mayor es el porcentaje de azúcares en solución más rápida será la tasa de
pardeamiento. En esta sección se optimizó la reacción de hidrólisis de sacarosa a partir
de dos concentraciones de la misma 75 y 82% p/p, partiendo de una misma cantidad
de sacarosa (140 g), con el agua se adicionó el ácido sulfúrico manteniéndose la
relación molar sacarosa ácido de 240,58:1. La hidrólisis de sacarosa se llevó a cabo a
(100±1) ºC y se estudió, mediante CLAR el contenido de glucosa, fructosa y sacarosa
en función del tiempo. Los resultados obtenidos se presentan en las tablas 9 y 10, los
análisis se realizaron por duplicado
Tabla 10. Variación del contenido de azúcares durante la reacción de inversión de sacarosa (75% p/p), 100ºC.
Tiempo (min) Concentración ± s mg/mL Concentración ± s (mmoles/mL)
Glucosa± s Fructosa± s Sacarosa± s Glucosa± s Fructosa± s Sacarosa± s
0 23,98±0,02 7,67±0,06 1,78±0,03 0,13±0,02 0,04±0,06 0,01±0,03
10 27,04±0,06 7,63±0,06 0 0,15±0,06 0,04±0,06 0
20 23,59±0,08 7,15±0,02 0 0,13±0,08 0,03±0,02 0
30 7,69±0,05 5,89±0,03 0 0,04±0,05 0,03±0,03 0
65
Tabla 11 Variación del contenido de azúcares durante la reacción de inversión de sacarosa (82% p/p), 100ºC.
Se observó que a los 10 minutos la sacarosa reaccionó completamente. La
glucosa estuvo siempre en mayor proporción que la fructosa, lo cual es indicativo de
una menor reactividad. A medida que transcurrió el tiempo, la cantidad de azúcares
reductoras disminuyeron. Según Kroh,19707, las azúcares reductoras pueden
reaccionar en medio ácido, sin necesidad de alguna fuente de nitrógeno, para formar
color vía caramelización.
En este trabajo, los estudios de formación del color en presencia de nitrógeno
amoniacal se llevaron a cabo con soluciones de sacarosa invertida durante 10 min.
Tiempo (min) Concentración ± s mg/mL Concentración ± s (mmoles/mL)
Glucosa± s Fructosa± s Sacarosa± s Glucosa± s Fructosa± s Sacarosa± s
0 20,10±0,03 8,57±0,03 1,57±0,03 0,11±0,03 0,04±0,03 0,004±0,003 10 26,34±0,05 6,72±0,03 0 0,14±0,05 0,04±0,03 0 20 22,79±0,06 6,44±0,09 0 0,12±0,06 0,04±0,09 0 30 18,94±0,09 6,58±0,02 0 0,11±0,09 0,04±0,02 0
66
5.2 Factores que afectan la intensidad de oscurecimiento
5.2.1 Efecto de la actividad de agua y el pH sobre la intensidad de oscurecimiento
El efecto de la actividad de agua en la formación de compuestos de color se
evaluó modificando la concentración inicial de sacarosa manteniendo la relación molar
sacarosa/nitrógeno a 3,3:1. La generación del color se estudió a tres condiciones de pH
iniciales (10,65± 0,07, 5,06± 0,05 y 7,06± 0,08). La temperatura de las reacciones fue
(100±1) °C. La actividad de agua se midió al inicio y al final de la reacción de formación
del color. Para las reacciones a pH inicial de 10,65±0,07 la fuente de nitrógeno fue el
hidróxido de amonio, las de pH 5,06±0,05 se realizaron con sulfato de amonio y las de
pH 7,06±0,08 con una mezcla de hidróxido de amonio-sulfato de amonio. Las
reacciones se replicaron 3 veces.
Los resultados para cada pH se muestran en las Tablas 11, 12 y 13 y en forma
combinada en la Figura 30. Para realizar comparaciones se estimó la velocidad de
formación del color media (VCm). En este trabajo la VCm está estimada a partir de la
intensidad de color alcanzada al final de un lapso dado de reacción menos la intensidad
de color a los 30 minutos iniciales, dividido por el tiempo respectivo. Los datos se
sometieron al análisis estadístico ANOVA, el cual mostró que valores de VCm mayores
a 26 EBC/h pueden considerarse diferentes con p< 0.05.
67
Tabla 12. Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: pH inicial (10,65 ± 0,07), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno. Las reacciones se repitieron 3 veces
Tabla 13.Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: pH inicial (5,06 ± 0,05), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno. Las reacciones se repitieron 3 veces
Sacarosa
(% p/p)
Color promedioa alcanzado ± s
(EBC) Tiempo de
reacción (h)
VCm ± s
(EBC/h)
aw ± 0.003
Inicial
aw ±0.003
Final
50 5950 ± 2 57 104 ± 3 0,916 0,999
65 9125 ± 20 57 160 ± 35 0,899 0,999
70 21067 ± 18 57 369 ± 20 0,714 0,879
73 22513 ± 20 57 395 ± 11 0,686 0,824
77 23152 ± 23 57 406 ± 8 0,598 0,808
82 24844 ± 27 57 435 ± 9 0,531 0,769
87 19851 ± 9 57 347 ± 9 0,508 0,748
90 17598 ± 8 57 307 ± 10 0,493 0,744
Sacarosa
(% p/p)
Color promedioa alcanzado ± s
(EBC) Tiempo de
reacción (h)
VCm ± s
(EBC/h)
aw ± 0.003
Inicial
aw ±0.003
Final
50 768 ± 15 9 85 ± 10 0,935 0,999
65 10756 ±53 9 1180 ± 73 0,887 0,999
70 11923 ± 55 7 1699 ± 65 0,712 0,889
68
Tabla 14. Efecto de la concentración inicial de sacarosa sobre la formación del color y actividad de agua. Condiciones de reacción: pH inicial (7,06 ± 0,08), temperatura (100 ± 1) ºC y relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno. Las se hicieron por triplicado.
73 2284 ± 43 5 1257 ± 53 0,684 0,839
77 1504 ± 12 5 451 ± 14 0,587 0,825
82 1254 ± 45 5 295 ± 21 0,527 0,779
87 1254 ± 73 5 243 ± 12 0,504 0,763
90 978 ± 54 5 186 ± 3 0,488 0,759
Sacarosa
(% p/p)
Color promedioa alcanzado ± s
(EBC) Tiempo de
reacción (h)
VCm ± s
(EBC/h)
aw ± 0.003
Inicial
aw ±0.003
Final
50 1211 ± 17 9 132 ± 63 0,924 0,999
65 1871 ± 26 9 205± 21 0,889 0,999
70 7515 ± 38 9 832± 15 0,712 0,895
73 10610 ± 37 7 1511± 59 0,684 0,837
77 3061 ± 25 5 605 ± 20 0,585 0,823
82 2604 ± 19 5 504± 25 0,525 0,775
87 2040 ± 32 5 385± 25 0,506 0,761
90 1538 ± 9 5 284± 15 0,485 0,755
69
El pH y la actividad de agua inicial afectaron significativamente la VCm. A pH
10,65 la VCm máxima fue 435 ± 9 EBC/h obtenida a aw 0,531 ± 0,003, mientras que a
pH 5,06 la VCm máxima fue 1699 ± 65 EBC/h pero a aw 0,712 ± 0,006, y a pH 7,05 la
VCm máxima alcanzó 1511 ± 59 EBC/h a aw 0,684 ± 0,004. Por lo cual se encontró
que a valores de pH menor de 10,65 la VCm máxima aumenta y se obtiene a valores
mayores de actividad de agua. El aumento en la VCm máxima con la disminución del
pH sugiere un efecto catalítico de los protones sobre la formación del color, dado que la
relación sacarosa nitrógeno fue constante.
Figura 30. Velocidad media de formación de color a 100 ºC en función de la actividad de agua inicial para una condición de pH 10,65, 5,06 y 7,06 y una relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno.
70
Los valores relativamente bajos de VCm a aw altos puede explicarse porque los
reactantes se encuentran muy diluidos y reaccionan lentamente (Karl Eichner and
Marcus Karel, 1972)21. Por otra parte, la velocidad de formación de color pasa por un
máximo a medida que disminuye la aw, a consecuencia de la disminución de la
movilidad de los reactantes. El aumento en aw al cual se observa la VCm máxima con la
disminución del pH es por lo tanto probable debido a una disminución en el coeficiente
de difusión.
5.2.1.1 Efecto de la actividad de agua inicial sobre la intensidad de oscurecimiento
De la misma manera se realizaron curvas de cinética de intensidad de color para
estas tres condiciones de pH, en la figura 31 se observa el comportamiento para un
valor de pH 10,65, figura 32 para un valor de pH 5,06 y figura 33 para un valor de pH
7,06.
71
Figura 31. Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a pH (10,65±0,07), relación molar 3,3:1 sacarosa/ nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC
En el sistema a pH 10,65 se observó un aumento en el oscurecimiento durante las
primeras 5 horas de reacción, luego el oscurecimiento se hace más lentamente. Para
los sistemas con mayor actividad de agua, 0,916 y 0,899, el color prácticamente no se
incrementa después de las primeras cinco horas. En las reacciones con actividades de
agua menores a 0,531 el incremento del color fue hasta las 25 horas aproximadamente.
En las soluciones con actividades de agua entre 0,531 y 0,598, la reacción de
oscurecimiento continúa hasta las 57 horas.
72
Figura 32 Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a pH (5,06±0,05), relación molar 3,3:1 sacarosa/ nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC
En los sistemas a 5,06 y 7,06 se observó que los tiempos de reacción fueron al
menos 6 veces menores que los tiempos de reacción a pH 10,65. En esos sistemas las
reacciones no se pudieron prolongar porque la mezcla se solidificaba y se tornaba
negra con olor desagradable. Al sólido se le hicieron pruebas de solubilidad en ácido y
base resultando ser insolubles. En los sistemas de menor pH y cuyas actividades de
agua eran menores al correspondiente máximo de formación de color (aw alrededor de
0,712), se observó solidificación entre las cinco horas de reacción y sin embargo no
llegaron a generar una alta intensidad de color. La VCm en las primeras cinco horas fue
relativamente baja (480 ± 8EBC/h) para los sistemas con aw ≥ 0,713, la VCm alcanzó
(4747± 86 EBC/h) luego de esas cinco horas de reacción.
73
Figura 33. Efecto de la actividad de agua sobre la formación de color a pH (7,06±0,08), relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y a una temperatura de (100±1) ºC
En este sistema se observó que a actividades de agua menores al
correspondiente máximo de formación de color (aw alrededor de 0,684), se observó
solidificación entre las cinco horas de reacción y sin embargo no llegaron a generar una
alta intensidad de color. La VCm en las primeras cinco horas en los sistemas con aw ≥
0,684 fue 1355 ± 26EBC/h. Por otra parte, la VCm alcanzó 1900 ± 37EBC/h luego de
esas cinco horas de reacción.
74
5.2.2 Efecto del pH sobre la intensidad de oscurecimiento no enzimático
En la sección anterior se estudió el efecto de la actividad de agua en la VCm para
tres valores de pH, con la finalidad de hallar los niveles máximos de VCm en función de
la actividad de agua (Figura 30). En esta sección se evalúa el efecto del pH sobre la
intensidad de color, ya que éste es uno de los objetivos del presente estudio. Para ello
se muestra en la Figura 34 la variación del color en función del tiempo de reacción para
los tres pH estudiados a la aw donde se encontró máxima VCm.
Figura 34. Efecto del pH sobre la formación de color, RM 3,3:1 sacarosa/nitrógeno, Temperatura 100ºC
75
Como podemos observar únicamente a pH 10,65 se pueden alcanzar intensidades
de color mayores a 12.000 EBC, pues a pHs 5,06 y 7,06 las soluciones se solidificaban
después de las 7 horas de reacción. Se puede observar además que las VCm de las
reacciones a pHs 5,06 (1696 ± 65 EBC/h) y 7,06 (1511 ± 59 EBC/h) son mayores que a
pH 10,65 (1014 ± 5 EBC/h) en las primeras 7 horas de reacción. En el caso de la curva
a pH 10,65 pueden distinguirse tres VCm. La primera desde el inicio de la reacción
hasta las 10 horas aproximadamente, la cual es la mayor de todas (1037 ± 13EBC/h).
La segunda entre las 10 y las 30 horas (568±9EBC/h), y finalmente una VCm al cabo de
las 30 horas en la cual se observa muy poca formación de color (138 ± 7EBC/h). En el
caso de la reacción a pH 5,06, se pueden observar sólo dos etapas En las primeras 5
horas la reacción es más lenta con VCm 481 ± 4EBC/h, luego de 5 horas la velocidad
de reacción se hizo mayor 4747 ± 86 EB C/h. Esta velocidad permaneció hasta las 7
horas cuando comenzó el proceso de solidificación. La reacción a pH 7,06 durante las
primeras 5 horas tiene una VCm de 1355 ± 26EBC/h, luego de esas primeras horas de
reacción la VCm aumenta hasta 1900 ± 37EBC/h. Estos cambios diferentes en los VCm
según el pH sugieren cambios en los mecanismos de reacción.
5.2.2.2 Efecto del pH sobre la actividad de agua
Se ha reportado en la literatura (Kroh, 1994)7 que uno de los primeros pasos de
las reacciones de caramelización es la deshidratación, aproximadamente el 40% en
peso del agua del sistema se forma en el transcurso de la reacción, hacer un
seguimiento de la cantidad de agua que se forma en el medio es un indicativo del
progreso de la misma. En la figura 36 se realizó una cinética de actividad de agua para
las tres condiciones de pH. Para realizar comparaciones se estimó la Velocidad de
cambio en la actividad de agua media (Vawm) calculada a partir de la aw final menos la
aw inicial entre el tiempo de reacción.
76
Figura 35.Efecto del pH sobre la actividad de agua durante las reacciones de formación de color a 100ºC. La relación molar sacarosa/nitrógeno fue 3,3:1.
Se puede observar que a pH 10,65 el aumento en la actividad de agua durante la
reacción de formación de color tuvo una Vawm mucho menor (0,004 ± 0,003 aw/h) que a
pH 5,06 (0,025 ± 0,003 aw/h) y 7,06 (0,026 ± 0,003 aw/h). Estos resultados indican que
los procesos de deshidratación son favorecidos a mayor concentración de protones. Es
interesante resaltar que Vawm son muy similares a pH 5,06 y 7,06. Esto pareciera
sugerir que otro factor además del pH está jugando un papel importante en la catálisis
del paso de deshidratación de la reacción de formación de color.
77
5.2.3 Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la intensidad de color
Se ha demostrado en la literatura que un aumento en la relación molar del amino
compuesto respecto al azúcar reductor, lleva a un incremento en la intensidad de color
del producto formado, en sistemas de reacción de glucosa y glicina a 65°C y pH neutro
(A. Kaanane, 1989)19. Sin embargo, el efecto de la relación molar azúcar reductor y
amoníaco en la formación de color no ha sido estudiado hasta ahora en la literatura.
Uno de los subproductos que se forman en la reacción de formación de color
cuando se utiliza amoníaco como fuente nitrógeno es el 4metil-imidazol, un compuesto
neurotóxico el cual aumenta linealmente con la cantidad de amoníaco (Roger Wood,
2004)18 por lo que se busca generar un color caramelo con la mínima cantidad de
nitrógeno incorporado.
Con la finalidad de estudiar el efecto de la relación molar azúcar: amoníaco se
realizaron reacciones adicionales, relaciones molares 33:1 y 330:1. Los sistemas
evaluados mantuvieron una concentración de azúcar que correspondió al máximo en la
curva de velocidad media de formación de color en función de la actividad de agua (Ver
Sección 5.2.1).
78
Figura 36. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la formación de color, a pH 10,65, y 100ºC de temperatura.
Como podemos observar, con una relación molar de 3,3:1 se alcanzó la máxima
intensidad de oscurecimiento, mientras que a una relación diez veces menor la
intensidad de color alcanzada es 4 veces menor lo cual es consistente con lo expuesto
por A. Kaanane, 198919 en sus sistemas azúcar- aminoácidos. Por otra parte a una
relación molar 100 veces menor no se aprecia formación de color.
Cabe la pena destacar que en el sistema con una relación molar 3,3:1 la reacción
de oscurecimiento se inicia desde la primera hora de reacción, mientras que en el
sistema con relación molar 33:1, la reacción de oscurecimiento se retrasa hasta
después de las 10 horas.
79
La segunda condición de estudio del efecto de la relación molar
sacarosa/nitrógeno se realizó a pH 5,06, los resultados se muestran en la Figura 37
C
Como podemos observar en la Figura 37, para una relación molar 3,3:1 se alcanza
la máxima intensidad de oscurecimiento, para una relación molar 10 veces menor la
intensidad de color es 5 veces más pequeña y para una relación molar 100 veces
menor la intensidad de color es 6 veces menos. Sin embargo es muy importante
destacar que la máxima intensidad en el sistema 3,3:1 se alcanza a las 7 horas,
mientras que en los sistemas 33:1 y 330:1 la máxima intensidad de color se alcanza a
las 24 horas. Si se comparan las intensidades al cabo de 7 horas, el sistema a una
relación molar de 3,3:1 reacciona 20 veces más rápido que el sistema 33:1 Es
Figura 37. . Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la formación de color, a pH 5,06, y 100ºC de temperatura
80
interesante resaltar que la intensidad de color alcanzada a pH 5,06 con una relación
molar de 330:1 (6015±41EBC) fue muy similar a la alcanzada a pH 10,65 con relación
33:1 (7892±26 EBC).
La cinética de formación del color a pH 5,06 presentó un aumento de la velocidad
de reacción en la etapa final, a diferencia de lo encontrado a pH 10,65 en la cual la
velocidad disminuyó. Para la relación 3,3:1 y al cabo de las primeras 5 horas, la VCm
fue 481 ± 4 EBC/h mientras que al final la VCm fue 4747 ± 86 EB C/h . Para una
relación molar de 33:1 se encontró al cabo de las 7 horas una VCm de 97 ± 6 EBC/h y
al final la VCm fue 486 ± 15 EBC/h hasta solidificarse. Finalmente para una relación de
330:1 se distinguió una VCm en las primeras 7 horas de 96 ± 3 EBC/h y luego la VCm
aumentó a 312 ± 12 EBC/h hasta la formación de sólidos.
El efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno a pH 7,06 se muestra en Figura 38.
81
Como podemos observar en la figura 38, al igual que a los otros pHs para una
relación molar 3,3:1 se alcanza la máxima intensidad de oscurecimiento, para una
relación molar 10 veces menor la intensidad de color es 3 veces más pequeña y para
una relación molar 100 veces menor la intensidad de color es 4 veces menor. Sin
embargo es muy importante destacar que la máxima intensidad en el sistema 3,3:1 se
alcanza a las 7 horas, mientras que en los sistemas 33:1 y 330:1 la máxima intensidad
de color se alcanza a las 24 horas. Si se comparan las intensidades al cabo de 7 horas,
el sistema a una relación molar de 3,3:1 reacciona 10 veces más rápido que el sistema
33:1.
La cinética de formación de color a pH 7,05 también presentó un aumento de la
velocidad de reacción en la etapa final. Para la relación 3,3:1y al cabo de las primeras 5
Figura 38. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la intensidad de oscurecimiento no enzimático, a pH 7,06, y 100ºC de temperatura.
82
horas, la VCm fue 1355 ± 26 EBC/h mientras que al final la VCm fue 1900 ± 37 EBC/h.
Para una relación molar de 33:1 se encontró al cabo de las 7 horas una VCm de 212 ±
19 EBC/h y al final la VCm fue 158 ± 5 EBC/h hasta solidificarse. Finalmente para una
relación de 330:1 se distinguió una VCm menor en las primeras 7 horas de 120 ± 8
EBC/h y luego la VCm disminuyo a 99 ± 4 EBC/h hasta la formación de sólidos.
5.2.3.1 Efecto de la relación molar sacarosa/nitrógeno sobre la actividad de agua
Los mecanismos aceptados para la formación de color a partir de azúcares
reductoras contienen pasos de deshidratación de ellas y sus intermediarios, los cuales
podrían dar origen al aumento de la actividad de agua. A continuación se presenta los
resultados de evaluar el efecto de las relaciones molares sacarosa/nitrógeno sobre los
cambios de la actividad de agua durante la formación del color a 100 ºC, VCm máxima
y a los pH 10,65 (Figura 39), 5,06 (Figura 40) y pH 7,06 (Figura 41).
83
.
La cantidad de nitrógeno en el sistema de reacción cumple un rol importante en el
paso de la deshidratación en la reacción de Maillard a pH 10,65, para una relación
molar 3,3:1 se obtiene una Vawm de 0,004 ± 0,003 aw/h siendo esta dos veces mayor
que a una relación molar 33:1 y 20 veces más que a una relación molar 330:1.
Figura 39. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y pH 10,65
84
A pH 5,06 y 7,06 las Vaw son similares como independientes del contenido de
nitrógeno que si fue el caso a pH 10,65, el aumento en la deshidratación se produjo en
las primeras 7 horas Vawm de 0,003 ± 0,001 aw/h, luego disminuyo hasta 0,0010 ±
0,00020 aw/h momento en que se solidifica.
Figura 40. Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y pH 5,06.
85
El aumento en la deshidratación se produjo en las primeras 7 horas Vawm de
0,003 ± 0,001 aw/h, luego disminuyo hasta 0,0010 ± 0,00020 aw/h hasta solidificarse.
5.2.4 Efecto de la temperatura en la intensidad de oscurecimiento no enzimático
Como se ha reportado en la literatura la energía de activación para el
oscurecimiento disminuye por encima de 32ºC, generalmente la intensidad de
oscurecimiento es sensible a la temperatura, por cada 10ºC incrementados asciende
entre unas cuatro u ocho veces la intensidad de oscurecimiento (A. Kaanane, 1989)19.
Figura 41 Efecto de la relación molar sacarosa/ nitrógeno sobre la actividad de agua, durante la formación de color a 100 ºC y pH 7,06.
86
En esta sección se muestra los cambios obtenidos en la formación del color a 100ºC y
85ºC. La relación molar sacarosa / nitrógeno se mantuvo a 3,3:1 El efecto se evaluó a
los pH 10,65 (Figura 42), 7,06 (Figura 44). y 5,06 (Figura 45) La actividad de agua
inicial se ajusto para cada pH al nivel correspondiente de VCm máxima (Ver Sección
5.2.1).
A pH 10,65 la máxima intensidad de color (24844 ± 27 EBC) se alcanza a una
temperatura de 100ºC, siendo ella 3 veces mayor a la intensidad de color que se
alcanza a 85ºC (9356 ± 8 EBC), lo cual es consistente con lo expuesto por A. Kaanane,
198919. Adicionalmente se observó a 100ºC, en las primeras 5 horas de reacción, una
VCm mayor (1006 ± 15 EBC/h) que a 85 ºC (25 ± 3 EBC/h). A 85 ºC la VCm máxima
(177 ± 11 EBC/h) se encontró después de las 5 h de reacción (Tabla 14)
Figura 42 Efecto de la temperatura sobre la formación de color pH 10,65, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1
87
Por otra parte, a pH 7,06 la máxima intensidad de color (10610 ± 37 EBC)
también se alcanzó a una temperatura de 100ºC, mientras que a 85 ºC la intensidad de
color fue 4 veces menor (3016 ± 5 EBC) Igualmente se encontró a 100 ºC, en las
primeras 5 horas de reacción, que la VCm fue mayor (1355 ± 9 EBC/h) comparada a 85
ºC (15 ± 4 EBC/h). A 85 ºC la VCm máxima (117 ± 9 EBC/h) se encontró también
después de las 5 horas de reacción (Tabla 14).
Figura 43 Efecto de la temperatura sobre la formación de color pH 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1
88
Finalmente, a pH 5,06 encontramos la máxima intensidad de color (11923 ± 55
EBC) también a 100ºC, mientras que a 85 ºC la intensidad de color fue en este caso 4
veces menor (3010 ± 25 EBC). Adicionalmente se encontró a 100 ºC, en las primeras 5
horas de reacción, que la VCm fue mayor (480 ± 8 EBC/h) comparada a 85 ºC (19 ± 3
EBC/h). A 85 ºC la VCm máxima (116 ± 8 EBC/h) se encontró después de las 5 horas
de reacción (Tabla 14) a lo igual que los otros dos pH estudiados.
Figura 44 Efecto de la temperatura sobre la formación de color pH 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1
89
Tabla 15.Efecto de la temperatura y pH sobre la velocidad media de formación de color luego de 5 horas, para pH 10,65, 7,06 y 5,06
VCm después de 5 horas de reacción (EBC/h) pH 100 ºC 85 ºC
10,65 380 ± 15 177±11
7,06 1900±37 117±9
5,06 4747 ± 86 116±8
5.2.4.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua
En esta sección se quiso evaluar el efecto de la temperatura en la velocidad del
deshidratación de las azúcares y sus derivados durante la caramelización. Para ello se
determinó la actividad de agua a los pH 10,65 (Figura 45), 5,06 (Figura 46),y 7,06
(Figura 47). Las condiciones de actividad de agua iniciales correspondieron a las que
produjeron la máxima VCm (Ver Sección 5.2.1)
90
Como podemos observar la temperatura es un factor determinante en la
deshidratación del sistema (Tabla 15). A todos los pH se observó un aumento en la
Vawm al aumentar de 85 ºC a 100 ºC. Al pH 10,65 el incremento fue de 2 veces,
mientras que a los pH 5,06 y 7,06 el incremento fue de 3 veces. Lo cual sugiere a su
vez que el efecto de la temperatura depende del pH. Es notable que a 85 ºC no se
encontró diferencias significativas en la Vawm.
Figura 45 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a y pH 10,65. relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1
91
.
Figura 46 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a pH 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1
92
Tabla 16. Efecto de la temperatura y pH sobre el cambio de velocidad media de actividad de agua luego de 5 horas, para pH 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1
Vaw en las primeras 7 horas de reacción (aw/h) pH 100 ºC 85 ºC
10,65 0,039±0,002 0,015 ± 0,006
7,06 0,030±0,001 0,015 ± 0,008
5,06 0,030±0,001 0,015 ± 0,008
Figura 47 Efecto de la temperatura sobre la actividad de agua, durante la formación de color a pH 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1
93
5.2.5 Nitrógeno libre durante la formación de color
Se midió el consumo de nitrógeno a través del tiempo con el método de Kjeldahl.
Los sistemas evaluados mantuvieron una concentración de azúcar que correspondió al
máximo en la curva de velocidad media de formación de color en función de la actividad
de agua (Ver Sección 5.2.1)
Es evidente que el mecanismo de reacción para las tres condiciones de pH es
diferente. Se observó un consumo acelerado de nitrógeno que se le incorpora al jarabe
azucarado a pH 10,65. Por su parte los caramelos formados a pH 5,06 y 7.06 se
caracterizaron por no consumir todo el nitrógeno añadido. A menor pH la concentración
Figura 48 Consumo de nitrógeno a través del tiempo, pH 10,65, 7,06 y 5,06 relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1, 100ºC
94
de la especie NH3 disminuye (El Hassan, 2008)20 lo cual justificaría la menor reactividad
encontrada. Sin embargo es probable también que la menor reactividad sea
consecuencia de una disminución en la concentración de las especies participantes de
las reacciones nucleofílicas observadas a pH 10,65. Es importante señalar que en el
transcurso de la reacción hay formación de reductonas y ácidos débiles que disminuyen
el pH del sistema. Por ejemplo, en este trabajo encontramos que al pH inicial de 10,65
(figura 49), donde el nitrógeno se consumió por completo a las 4 horas, el pH de la
solución a este tiempo bajó a 7,23, mientras que a condiciones de pH inicial 7,06 en 4
horas el pH de la solución resultó 5,23 y a condiciones de pH 5,06 fue 4,09.
Figura 49 Variación de pH a través del tiempo, pH 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 y 100ºC.
95
5.3 Determinación de HMF
La reacción de caramelización puede ser seguida por la aparición de HMF.
Segun Kroh, 19947 se ha observado que mientras haya una mayor degradación de
fructosa y glucosa mayor será la concentración de este intermediario.
Los análisis de HMF se realizaron durante la formación del color a los pH de
10,65,7,06 ,y 5,06, teniendo como actividad de agua inicial los niveles correspondientes
a la VCm máximas (Ver Sección 5.2.1). Los resultados se pueden observar en la figura
50. Para la comparación, se estimaron las velocidades de formación de HMF media
(VHMFm) siendo esta la concentración de HMF al final de un lapso dado de reacción
menos la concentración inicial entre el tiempo.
Figura 50 Variación de HMF en función del tiempo a pH 10,65, 7,06 y 5,06, relación molar 3,3:1 sacarosa/nitrógeno y 100ºC
96
Al tiempo cero cuando se añadió la fuente de nitrógeno se detectó la presencia de
HMF, lo cual es probablemente consecuencia del proceso de inversión de la sacarosa a
temperatura ambiente. Con el comienzo del calentamiento a 100 ºC el nivel de HMF
disminuyó hasta un punto desde el cual comienza a aumentar progresivamente. Para
un pH 5,06 se observa un cambio a la VHMFm de 69458 ± 44 mmol HMF/h a la
primera hora de reacción. A pH 7,06 el cambio de VHMFm fue a 16053±54 mmol
HMF/h, ocurrido a partir de 6 horas. A pH 10,56 se observaron dos cambio en la
VHMFm, al principio de la reacción no hay formación importante de HMF. Entre las 6 y
las 9 horas de reacción la VHMFm fue de 47202 ± 71 mmol HMF/h y luego la VHMFm
disminuyó a 4891 ± 26 mmol HMF/h.
Fran Ledl and Erwin Scheicher, 199013 exponen que el HMF se produce a pHs
ácidos, lo cual es consistente con los resultados encontrados en este trabajo.
5.4 Formación de 4 metil-imidazol En la reacción entre dicarbonilos y amoniaco hay casi una exclusiva aparición del
4-metillimidazol, este compuesto es un indicativo del avance de esta reacción, y ha sido
mostrado como un agente neurotóxico (Roger Wood, 2004)18.
Los análisis de 4-metil-imidazol se realizaron durante la formación del color a los
pH de 10,65, 7,06, y 5,06, teniendo como actividad de agua inicial los niveles
correspondientes a la VCm máximas (Ver Sección 5.2.1)
Para realizar comparaciones se estimó la Velocidad media de formación de 4metil-
imidazol (VFm4MeI) siendo esta la concentración de 4MeI al final menos la
concentración inicial de 4MeI entre el tiempo de seguimiento de la reacción. Los
resultados obtenidos sobre la concentración de 4 metil-Imidazol en el tiempo se pueden
observar en la figura 51
97
En la figura 51 se puede observar que la máxima formación de imidazoles se produce a
pH básico que según Kort, 197016 esto puede explicarse debido a que la reacción de
Maillard con agua amoniacal y elevadas temperaturas trae consigo en su mayoría
productos como imidazoles, pirazinas y pocas piridinas por ello en las primeras horas
de reacción se obtiene una formación de 4-metilimidazol al cabo de 1 hora de 6,86
4MeI/h, luego de este tiempo se observa un consumo en el 4 metil-imidazol esto podría
explicarse según la literatura (Carline M. J, 2002)28 una de las hipótesis para la
formación de melanoidinas son la previa formación de anillos de 2 o 4 miembros en su
mayoría piridinas e imidazoles los cuales pueden polimerizar entre si y generar
melanoidinas de alto peso molecular e intensidad de color, para un pH de 7,06 se
observa un comportamiento similar, al principio una VFm4MeI elevada 2,70 4MeI/h) y
Figura 51 Variación de la concentración de 4-metilimidazol en función del tiempo a pH 5,06, 10,65 y 7,06, relación molar sacarosa/ nitrógeno 3,3:1 y 100ºC
98
luego un consumo del mismo es importante recordar que el buffer para trabajar a pH
neutro se formo de sulfato de amonio-hidróxido de amonio.
Por otra parte para un pH 5,06 no hay formación apreciable de 4metil-imidazol.
Si se realiza la conversión para determinar la cantidad de 4-metilimidazol referido a un
color de 20000 unidades EBC se obtiene una concentración final en un sistema de pH
inicial de 10,65 de 73mg/Kg; 7,06 53mg/Kg y para un sistema de pH inicial 5,06 <
0,001mg/Kg resultando estar los tres sistemas por debajo del límite establecido para un
color caramelo clase III, recordando que el límite es 200mg/Kg de 4-metilimidazol
referido a un color de 20000 EBC.
5.5 Electroforesis Los sistemas evaluados por electroforesis mantuvieron una concentración de azúcar
que correspondió al máximo en la curva de velocidad media de formación de color en
función de la actividad de agua (Ver Sección 5.2.1). , relación molar azúcar/nitrógeno
3,3:1 y 100ºC de temperatura
Los resultados se observan en la Figura 52
99
Como se puede observar para los tres sistemas de reacción no se obtiene un
compuesto mayoritario al cual se le pueda realizar medición de punto isoeléctrico, por el
contrario se observa un rango bastante amplio de compuestos, los cuales tendrán a su
vez un extenso rango de puntos isoeléctricos razón por la cual se sugirió no realizar el
isoelectroenfoque, el peso molecular esta alrededor de 10.000 y 75.000 Da
5.6 Determinación de compuestos de aroma Se ha reportado en la literatura que los compuestos de aroma difieren según el pH
inicial del sistema de reacción, a pHs mayores de 7 se ven favorecidos los compuestos
que dan sabor, mientras que a pHs menores se favorecen los compuestos que dan un
agradable aroma al color caramelo (F. George Njoroge, 1989)11, los sistemas evaluados
Figura 52 Electroforesis. Condiciones de reacción pH 10,65; 7,06 y 5,06, relación molar sacarosa/nitrógeno 3,3:1 y 100ºC
100
mantuvieron una relación molar sacarosa/nitrógeno 3,3:1, 100ºC y teniendo como
actividad de agua inicial los niveles correspondientes a la VCm máximas (Ver Sección
5.2.1)
Los resultados se muestran en la siguiente tabla
101
Tabla 17. Compuestos identificados en el perfil de volátiles de los tres colores caramelos preparados.
tr (min.)a Compuesto % Área
5,06 7,06 10,65
1.20 Acetaldehido 0.13 0.08 0.14
1.34 Acetona 2.48 0.52 0.72
1.39 Ácido fórmico 8.80 5.48 7.19
1.66 2,3-butanodiona 1.62 1.34 0.71
1.76 Ácido acético 5.11 5.28 13.09
2.21 1-hidroxi-acetona 0.06 0.19 0.97
2.56 2,3-pentanodiona 0.89 0.85 1.28
2.72 2,5-dimetil-furano - - 0.14
5.00 Dihidro-2-metil-3(2H)-furanona 0.43 0.46 1.15
5.40 Metil pirazina - 5.07 4.26
5.81 Furfural 61.79 60.15 49.40
6.84 5-metil- 2(5H)-furanona 1.34 0.79 0.38
8.09 2-acetil furano 3.46 5.63 8.86
8.32 2,3-dimetil pirazina - 0.11 0.42
8.96 5-metil- 2(3H)-furanona 0.22 0.07 0.22
9.61 5-metil-2 furaldehido 9.54 8.37 8.69
9.89 3,4-piridina diamina - 0.10 -
13.27 2-metil-benzofurano 0.31 0.12 -
102
Figura 53 Perfil de volátiles de los caramelos preparados a diferentes pH.
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.000
1000000
2000000
3000000
4000000
1.135 1.202 1.342
1.38
1.656
1.81
2.203 2.55 2.72 4.99 5.42
5.79
6.86
8.08
8.30 8.97
9.60
9.956 10.67
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.000
1000000
2000000
3000000
4000000
Tiempo-->
pH 7,06
1.112 1.138 1.204 1.320
1.34
1.39
1.564
1.654 1.703 1.802
2.224 2.55 2.58 4.98
5.43
5.48
5.83
6.84
8.07
8.320 8.96
9.60
9.898 10.02610.66
13.28
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.000
1000000
2000000
3000000
4000000
Abundancia
1.136 1.205
1.34
1.39
1.554 1.657 1.706 1.767
2.231 2.55 2.51 5.002 5.50
5.81
6.85 8.09
8.97
9.61
10.04010.66 13.28
pH 10,65
pH 5,06
103
Como podemos observar el compuesto mayoritario en estas fracciones de volátiles es
el furfural y corresponde al 60% en muestras a pH 5,06 y 7,06, pero es menor en la
muestra a pH 10,65 (49%), lo cual es consistente con lo encontrado en la literatura,
bajos valores de pH se relacionan con una alta concentración de furfural (Kroh, 1994)7.
También hay que destacar que compuestos como el ácido acético, 1-hidroxi-acetona y
el 2-acetil furano; entre otros; tuvieron una mayor proporción cuando el pH aumento,
mientras que el 2-metil-benzofurano tiene un comportamiento contrario, resultados
igualmente consistentes con lo expuesto por Kroh, 19947 altos valores de pH conllevan
a una mayor concentración de furanonas
A través de este estudio llegamos a la conclusión de que a nivel industrial la condición
más viable para realizar un caramelo con alto poder de tinción es realizar un caramelo
con pH inicial de 10,65, si además se trabaja a una temperatura considerable por
ejemplo 100ºC y una actividad de agua inicial correspondiente a la velocidad media de
formación de color máxima (82% Sacarosa), sin embargo por la previa formación de
compuestos neurotóxicos tales como el 4-metilimidazol se debe trabajar con una
relación molar sacarosa/nitrógeno alta, es decir, donde la sacarosa se encuentre en
exceso lo cual lleva a una concentración de 4-metilimidazol por debajo del límite
establecido, cabe destacar que trabajar a pHs altos causa una formación de
compuestos que le atribuyen al colorante un aroma a tostado y ácido (acido acético, 1-
hidroxi-acetona, 2-acetil furano, Dihidro-2-metil-3(2H)-furanona), además de formarse
compuestos de sabor agradables, por otro lado trabajar a menores pHs el tiempo de
reacción lo determina la solidificación del producto, la velocidad media de formación de
color es mucho mayor, no hay formación apreciable de compuestos neurotóxicos lo cual
garantiza la inocuidad del producto, produce compuestos de aroma bastante agradable
asociados con el aroma a caramelo tales como 2,3-butanodiona, 5-metil- 2(5H)-
furanona, 2-metil-benzofurano, acetona pero los compuestos de sabor son bastante
desagradables. Los compuestos de sabor apreciados concuerdan con los resultados
expuestos en la literatura por George Njoroge (1989)11
104
6 CONCLUSIONES
• El mayor porcentaje de azúcares reductoras durante la hidrólisis de la sacarosa se
obtiene diez minutos después de la reacción de inversión.
• La aw dio un efecto significativo para las tres condiciones de pH de estudio
(10,65±0,07, 7,06±0,08 y 5,06±0,05), se obtuvo un máximo de VCm mientras se
varió la aw del sistema y se observó que a menor pH la mayor VCm se encontró a
actividades de agua mayores
• La intensidad de oscurecimiento para aquellas reacciones con aw ≥ a la optima para
las tres condiciones de pH fueron aumentando progresivamente, mientras que para
aquellas reacciones con aw< a la optima la formación de color parece detenerse
luego de las primeras horas de reacción.
• Para sistemas de pH 7,06 ± 0,08 y 5,06 ± 0,05, se observó una solidificación
después de 7 horas de reacción por lo cual la reacción se tuvo que detener
• Solo en sistemas de pH 10,65 ± 0,07 se obtuvieron altos valores de intensidad de
color
• La VCm es mayor para los sistemas de pHs 7,06 ± 0,08 y 5,06 ± 0,05, los protones
causan un efecto catalítico sobre la formación de color.
• En los sistemas de pH 7,06 ± 0,08 y 5,06 ± 0,05 se obtiene una mayor Vawm, es
decir, el primer paso de las reacciones de caramelización se acelera bajo estas
condiciones.
• A mayor relación molar sacarosa/nitrógeno la intensidad de color alcanzada es
mayor
105
• Disminuir la relación molar sacarosa/nitrógeno a condiciones de pHs 7,06 ± 0,08 y
5,06±0,05 conduce a una formación de sólidos en un mayor tiempo de reacción.
• para diferentes relaciones molares sacarosa/nitrógeno a pH 10,65 ± 0,07 la Vawm
difiere, mayor concentración de nitrógeno causa una Vawm mayor.
• para diferentes relaciones molares sacarosa/nitrógeno a pH 7,06 ± 0,08 y 5,06 ±
0,05 la Vawm es igual, es independiente de la cantidad de nitrógeno en el medio.
• Una mayor temperatura produce una mayor intensidad de color, para 15ºC
aumentados a condiciones de pH 10,65 ± 0,07 se obtuvo una intensidad de color 3
veces mayor y para condiciones de pHs 7,06 ± 0,08 y 5,06±0,05 se obtuvo una
intensidad de color 4 veces mayor.
• Disminuir la temperatura (15ºC) a condiciones de pHs 7,06 ± 0,08 y 5,06±0,05
conduce a una formación de sólidos en un mayor tiempo de reacción
• Una mayor temperatura a pH 10,65 ± 0,07 conlleva a una Vawm 2 veces mayor ,
mientras que a pHs 7,06 ± 0,08 y 5,06±0,05 la Vawm es 3 veces mayor
• A condiciones de pH 7,06 ± 0,08 y 5,06 ± 0,05 el consumo de nitrógeno por parte
del jarabe azucarado es incompleta
• La formación de HMF se favorece a pHs bajos, es decir a medida que el caramelo
se hace acídico.
• La formación de 4-metilImidazol se favorece a condiciones de pH básico > 7
• El compuesto 4-metilimidazol se produce en las primeras horas de reacción hasta
llegar a un máximo luego del cual comienza a consumirse y disminuye en el tiempo.
• El peso molecular de los compuestos de color oscila entre 10.000 y 75.000Da razón
por la cual no se le pudo determinar punto isoeléctrico a un compuesto mayoritario.
106
• A medida que el pH del medio aumenta se favorece la formación de ácido acético,
1-hidroxi-acetona, Dihidro-2-metil-3(2H)-furanona, 2-acetil furano
• A pHs menores se favorece la formación de Acetona, 2,3butanodiona, 5-metil-
2(5H)-furanona, 2-metil-benzofurano.
• El furfural es el compuesto mayoritario a pHs 7,06 ± 0,08 y 5,06 ± 0,05 (60%),
mientras que a pH 10,65 ± 0,07 su formación fue menor (49%)
107
ANEXOS
CROMATOGRAMA DE HMF
CROMATOGRAMA DE AZUCARES GLUCOSA Y FRUCTOSA
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
MV
0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
1000,00
1200,00
1400,00
Minutes1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00 16,00 17,00 18,00 19,00 20,00
108
COMPUESTOS AROMATICOS PRESENTES EN EL COLOR CARAMELO
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
2200000
2400000
2600000
2800000
3000000
3200000
3400000
3600000
3800000
4000000
4200000
4400000
4600000
4800000
5000000
5200000
5400000
5600000
5800000
6000000
6200000
Time-->
Abundance
TIC: CPCOLORCARAMELOPHACIDO.D\data.msTIC: CPCOLORCARAMELOPHNEUTRO.D\data.ms
109
One-way ANOVA: VCm versus tratamiento pH 10,65 Source DF SS MS F P tratamiento 7 304890 43556 167,44 0,000 Error 16 4162 260 Total 23 309052 S = 16,13 R-Sq = 98,65% R-Sq(adj) = 98,06% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+------- 50 3 104,00 3,00 (-*-) 65 3 160,00 35,00 (-*-) 70 3 369,00 20,00 (-*-) 73 3 395,00 11,00 (-*) 77 3 406,00 8,00 (-*-) 82 3 435,00 9,00 (-*) 87 3 347,00 9,00 (-*-) 90 3 307,00 10,00 (-*-) --+---------+---------+---------+------- 100 200 300 400 Pooled StDev = 16,13
One-way ANOVA: b versus a pH 5,06 Source DF SS MS F P a 7 7834281 1119183 672,27 0,000 Error 16 26637 1665 Total 23 7860918 S = 40,80 R-Sq = 99,66% R-Sq(adj) = 99,51% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+---------+ 50 3 85,0 10,0 (*) 65 3 1180,0 73,0 (*) 70 3 1699,3 65,5 (*) 73 3 1257,0 53,0 (*) 77 3 451,0 14,0 (*) 82 3 295,0 21,0 (*) 87 3 243,0 12,0 (*) 90 3 186,0 3,0 (*) ---------+---------+---------+---------+ 500 1000 1500 2000 Pooled StDev = 40,8
110
One-way ANOVA: d versus c pH 7,06 Source DF SS MS F P c 7 4191905 598844 482,95 0,000 Error 16 19839 1240 Total 23 4211744 S = 35,21 R-Sq = 99,53% R-Sq(adj) = 99,32% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --------+---------+---------+---------+- 50 3 132,0 63,0 (*) 65 3 208,3 16,3 (*) 70 3 832,0 15,0 (*) 73 3 1511,0 59,0 (*) 77 3 605,0 20,0 (*) 82 3 502,7 27,0 (-*) 87 3 385,0 25,0 (*) 90 3 284,0 15,0 (*) --------+---------+---------+---------+- 400 800 1200 1600 Pooled StDev = 35,2
111
7 REFERENCIAS
1 United States Patent number 4.614.662, Fast cook-continous process for production of ammonia caramel color. Sep 30, 1986, Setlur R. Ramaswamy, Louisville, Ky. 2 Gabriel J. Lauro, Frederick John Francis et al, “Natural Food Colorants, Science and Technology”, Institute of Food Technology Continiung Education Committee, 2000 3Owen r. Fennema “Quimica de los alimentos”. 2da edición. Editorial Acribia, S.A Zaragoza (España), 1973 774-775 4 Encyclopedia of Food and color additives. George A. Burdock, (1996) 456-457 5 Fransisco Delgado-Vargas “Natural Colorants for Food and Nutraciatical Uses” Editorial CRC, Press, 2002
6 Carmen Socaciu. Food Colorants: Chemical and Functional Properties Press, 2007 7 Lothar W. Kroh. Caramelisation in Food and beverages, Food Chemistry, vol 51 (1994) 373-379 8 El Hassan Ajandouz and Antoine Puigserver. Noenzymatic Browning Reaction of Essential Amino Acids: Effect of pH on Caramelization and Maillard Reaction Kinetics. J. Agric. Food Chem., vol 47,(1999) 1786-1793 9 Mafalda Quintas, Carla Guimarẳes, Joẳo Baylina, Teresa R.S. Brandẳo, Cristina L.M Silva. Multiresponse modelling of the caramelisation reaction. Innovative Food Science and Emerging Technogies, vol 8 (2007) 306-315 10 Franz Ledl, Jakob Beck et al. Chemical pathways of the Maillard Reaction. The Maillard Reaccion in Aging, diabetes, and Nutrition (1989). 23-42 11 F. George Njoroge and Vicent M. Monnier. The chemistry of the Maillard reaction under physiological conditions: a review. The Maillard reaction in Aging, diabetes, and Nutrition (1989). 85-107 12 John e. Hodge. Dehydrated foods. Chemistry of Browning Reaction in Model Systems. Aggricultural and food chemistry, vol1, No15, (1953). 928-940 13 Fran Ledl and Erwin Scheicher. New Aspect of the Maillard Reaction in Foods and in the Human Body. Angewandte Cheme. Vol 29 No6, (1990). 565-706
112
14 M.R. Grimmett, Rev. Pure Appl. Chem, 15, 101 (1965) 15 Owen R. Fennema “Principles of Food Science”. Editorial Fennema. 1975 16 M. J. Kort Reaction of free Sugars with aqueous ammonia. Advan. Carbohyd. Chem.. Biochem. Vol 25(1970) 311-349 17International programme on chemical safety wold heatl organization, toxicological evaluation of some food colours, enzymes, flavour, enhancers, thickening agents, and certain food additives, wold health organization geneva 1975
18 Roger Wood Analytical Methods for Food Additives por Woodhead Publishing, 2004 19 A. Kaanane and T. P. Labuza The Maillard reaction in foods. The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition (1989) 301-327 20 El Hassan Ajandouz, Veronique Desseaux, Sanna Tazi, Antoine Pigserver. Effects of temperature and pH on the kinetics of caramelisation, protein cross-linking and Maillard reactions in aqueous model system. Food chemistry.(2008). 1244-1252 21 Karl Eichner and Marcus Karel. The influence of Water Content and Water Activity on the Sugar-Amino Browning Reaction in Model Systems Under Various Conditions. J. Agr. Food Chem, Vol 20, No 2, (1972) 218-223 22 Simona M. Monti, Richard G. Bailey y Jennifer M. Ames. The influence of pH on the non-volatile reaction products of aqueous Maillard model systems by HPLC with diode array detection. Food Chemistry. Vol 62, (1998), 369-375 23 Sang-Hee Oh, You-Seok Lee, Jae-Hun Kim et al. Effect of pH on non-enzymatic browning reaction during γ-irradiation processing using sugar-glycine solution. Food Chemistry, vol 94 (2006) 420-427 24 Wendy M. Baisier and Theodore P. Labuza. Maillard Browning Kinetics in a Liquid Model system. Journal of Agricultural and food chemistry, vol 40, No 5 (1992). 707-713 25 Jennifer M. Ames, Anton Apriyantono. Low Molecular weigth coloured compounds formed in xylose-lysine model systems, Food Chemistry 42 (1993) 121-127 26 Roland Tressl, George T. Wondrak, and Leif. A Gaber, Pentoses and Hexoses as Sources of New Melanoidins-like Maillard Polymers (2002)
113
27 Sandra Mundt and Bronislaw L. Wedzicha. Comparative Study of the Composition of Melanoidins from Glucose and Maltose. J. Agric. Food. Chem., vol 52, (2004) 4256-4260 28 Carline M. J. Brands, Bronek L. Wedzicha, and Martinus et al. Quantification of Melanodin Concentration in Sugar-Casein Systems. J. Food Chem, vol 50, (2002) 1178-1183 29 Sara I.F.S. Martins, Martinus A.J.S van Boekel. Melanoidins extinction coefficient in the glucose/glycine Maillard reaction, Food chemistry 83 (2003) 135-142 30 B. Cämmerer & L. Kroh. Investigation of the influence of reaction conditions on the elementary composition of melanoidins. Food Chemistry, vol 53. (1995) 55-59 31 Eun Jung Kwak, Young Soon Lee et al. Effect of pH control on the intermediates and melanoidins of nonenzymatic browning reaction. Lebensm-Wiss. U. Technol. Vol 38 (2005) 1-6 32 Skoog, “Analisis Instrumental” quinta edicion Mc Graw Hill, 2001 33 Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. Cox, Claudi M. Cuchillo Foix, Josep (trad.) Vendrell i Roca, “Principio de Bioquimica”Publicado por Omega, 1995 34 Sanchez Miguel “Tecnicas analíticas de contaminantes quimicos” ediciones Diaz de Santos, 2001 35 Soriano jose miguel, “Micotoxinas en alimentos” ediciones Diaz de Santos, 2001 36 Metodos de Analisis Cerveceros, tomo I, ALAFACE (2000); capitulo 4.1.4.2.8.2, modificado 37 COVENIN 1315-79, Alimentos . determinación de pH (Acidez Ionica), Norma Venezolana 38 Food Chemical codex 3era Edicion, 1981 39 Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists – AOAC – (1990) 15th edition. USA. AOAC 982.14. 40 Rober A. Wiks, Mary W. Johson, Agus J. Shingler, J. Agric. Food Chem, Vol 25, No 3,(1977) pag. 605-608
114