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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
“MODELACION CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA A
PARTIR DE BEBIDAS GASEOSAS CADUCADAS”
TRABAJO DE TITULACIÓN, MODALIDAD PROYECTO DE
INVESTIGACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA
QUÍMICA
AUTOR: KATHERYN MABEL CAMPOVERDE NOLIVOS
QUITO
2017
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
MODELACIÓN CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA A
PARTIR DE BEBIDAS GASEOSAS CADUCADAS
TRABAJO DE TITULACIÓN, MODALIDAD PROYECTO DE
INVESTIGACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA
QUÍMICA
AUTOR: KATEHRYN MABEL CAMPOVERDE NOLIVOS
TUTOR: INGENIERO ANDRÉS FERNANDO DE LA ROSA MARTÍNEZ
QUITO
2017
iii
©DERECHOS DE AUTOR
Yo, KATHERYN MABEL CAMPOVERDE NOLIVOS en calidad de autor del trabajo
de titulación, modalidad proyecto de investigación: MODELACIÓN CINÉTICA DE
LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DE BEBIDAS GASEOSAS CADUCADAS,
autorizo a la Universidad Central del Ecuador hacer uso de todos los contenidos que me
pertenecen o parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o
de investigación.
Los derechos que como autor me corresponde, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
Asimismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
En la ciudad de Quito, a los 29 días del mes marzo de 2017.
______________________________
Katheryn Mabel Campoverde Nolivos
C.C.: 1717984106
iv
APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, De la Rosa Martínez Andrés Fernando, en calidad de tutor del trabajo de titulación,
modalidad PROYECTO DE INVESTIGACIÓN, titulado: MODELACIÓN CINÉTICA
DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DE BEBIDAS GASEOSAS
CADUCADAS, elaborado por la estudiante KATHERYN MABEL CAMPOVERDE
NOLIVOS de la Carrera de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería Química de la
Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo reúne los requisitos y méritos
necesarios en el campo metodológico y en el campo epistemológico, para ser sometido a
la evaluación por parte del jurado examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO,
a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación
determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito, a los 29 días del mes marzo de 2017.
___________________________________
Firma del Tutor
Ing. Andrés de la Rosa
C.C.: 0401120027
v
DEDICATORIA
A Cristinita que es mi
inspiración y mi razón de vivir.
A mis queridos padres
por creer en mí y
dejarme la mejor herencia
mi educación.
vi
AGRADECIMIENTOS
La Facultad de Ingeniería Química, por ser la casa del conocimiento.
A mi tutor Ing. Andrés de la Rosa, por su apoyo y constante dedicación para la
transcripción de este manuscrito.
A la Dra. Carolina Montero por creer en mí, y ser mi guía durante este proyecto.
Al Dr. Pablo Araujo por su oportuna y acertada guía, por las sugerencias y críticas que
han sido muy valiosas para mi trabajo.
A todos los profesores que, en ésta etapa, supieron impartir sus conocimientos para mi
crecimiento profesional.
A mis padres, Ximena y Patricio que siempre estarán para brindarme su amor infinito,
les agradezco por ser mi lumbrera en este camino y enseñarme a luchar las batallas de la
vida.
A mis hermanos Mariuxi, Andreita y Michael por los momentos de felicidad que hemos
compartido, me enseñaron lo valiosa que es la familia.
A mi hermosa y adorada hija Cristinita por brindarme su amor puro, su apoyo en todos
los momentos difíciles, su alegría en los momentos de tristeza, su dulzura día a día me
enseño que lo más valioso es amar lo que haces, mi razón de vivir.
A mi enamorado Joffre por todo su amor durante toda mi vida universitaria, me enseñó
que la paciencia y la esperanza son lo último que se pierden.
vii
CONTENIDO
pág.
LISTA DE TABLAS ...................................................................................................... xii
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... xiv
LISTA DE ANEXOS .................................................................................................... xvi
RESUMEN ................................................................................................................... xvii
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
1. MODELACIÓN CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN ALCOHOLICA ............ 3
1.1 Fermentación alcohólica ......................................................................................... 3
1.1.1. Tipo de Microorganismo. ....................................................................................... 4
1.1.2. Factores que afectan la rapidez de crecimiento ...................................................... 4
1.1.3. Nutrición de levaduras…. ....................................................................................... 5
1.2 Cinética de la fermentación ..................................................................................... 6
1.2.1. Cinética de crecimiento microbiano. ...................................................................... 7
1.2.2. Cinética de consumo de sustrato.. .......................................................................... 8
1.2.3. Cinética de obtención de producto ......................................................................... 9
1.2.4. Rendimiento de biomasa y producto. ..................................................................... 9
1.3 Modelado cinético de la fermentación .................................................................. 10
1.3.1. Cinética de Monod. .............................................................................................. 11
1.3.2. Cinética de Tessier................................................................................................ 12
viii
1.3.3. Cinética de Moser.. ............................................................................................... 13
1.3.4. Polymath 6.1. ........................................................................................................ 13
2. BEBIDAS GASEOSAS AZUCARADAS CADUCADAS ....................................... 15
2.1. Tiempo de vida útil. ................................................................................................. 15
2.2. Componentes de las bebidas. ................................................................................... 16
3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL ....................................................................... 18
3.1. Diseño experimental para la fermentación de bebidas gaseosas caducadas ............ 18
3.1.1. Descripción del medio de cultivo. ........................................................................ 18
3.1.2. Descripción del proceso de fermentación.. ........................................................... 19
3.2. Materiales y equipos ................................................................................................ 22
3.2. Sustancias y reactivos .............................................................................................. 23
3.3. Procedimiento .......................................................................................................... 25
3.3.1. Análisis de la materia prima ................................................................................. 25
3.3.2. Preparación del medio de cultivo ......................................................................... 25
3.3.4. Fermentación alcohólica ....................................................................................... 27
3.3.5. Determinación de biomasa ................................................................................... 27
3.4. Diagrama de flujo .................................................................................................... 29
3.5. Datos experimentales ............................................................................................... 30
3.5.1. Condiciones iniciales de la mezcla ....................................................................... 30
3.5.2. Datos para calcular densidad de la mezcla ........................................................... 30
3.5.3. Datos de los estándares de Mc Farland para calcular la biomasa ......................... 31
3.5.4. Datos para graficar la curva de calibración para biomasa .................................... 31
3.5.5. Datos del monitoreo de formación de etanol mediante densimetría. ................... 32
3.5.6. Datos del monitoreo de consumo de azúcares reductores mediante titulación. ... 33
3.5.7. Datos del monitoreo de generación de biomasa. .................................................. 35
ix
4. CÁLCULOS ............................................................................................................... 37
4.1. Cálculo el número de microorganismos para definir el pH previo………………….
a la fermentación..... ....................................................................................................... 37
4.1.1. Cálculo modelo de la cantidad de microorganismos presentes para el pH=3,5. .. 37
4.1.2. Cálculo de la masa de la mezcla de gaseosas caducadas ...................................... 38
4.2. Balance de masa para el proceso de evaporación.. .................................................. 39
4.2.1. Cálculo modelo para el caso C = 12°Brix ............................................................ 39
4.2.2. Planteo de ecuaciones ........................................................................................... 40
4.3. Cálculo de la concentración de formación de etanol. .............................................. 41
4.3.1. Cálculo modelo de la concentración de etanol para el caso A ............................. 41
4.4. Cálculo de la concentración de azúcares reductores presentes en la mezcla ………
por titulación. .................................................................................................................. 41
4.4.1. Cálculo modelo de la concentración de azúcares reductores para el caso A ........ 41
4.4.2. Cálculo modelo para conversión de consumo de azúcares reductores caso A ..... 42
4.5. Cálculo de la cantidad de levadura necesaria para fermentar .................................. 42
4.5.1. Cálculo modelo de la concentración de levadura para 2% de levadura ............... 42
4.5.2. Cálculo modelo de la concentración de levadura para 4% de levadura ............... 43
4.6. Cálculo de la cantidad de nutrientes necesarios para la levadura.. .......................... 43
4.6.1. Cálculo modelo para fosfato de amonio caso A ................................................... 43
4.6.2. Cálculo modelo para sulfato de potasio caso A .................................................... 43
4.6.3. Cálculo modelo para sulfato de magnesio caso A ................................................ 43
4.6.4. Cálculo modelo para sulfato de zinc caso A......................................................... 44
4.7. Cálculos para determinación de biomasa por espectrofotometría ........................... 44
4.7.1. Curva de calibración por el método Mc Farland .................................................. 44
4.7.2. Cálculo modelo de la biomasa para el caso A ...................................................... 44
4.8. Ajuste del modelo cinético que caracteriza el proceso de fermentación……………
alcohólica de las bebidas gaseosas caducadas.. .............................................................. 45
x
4.8.1. Cálculo modelo de la velocidad de reacción experimental para el caso A. .......... 46
4.9. Cálculo modelo para determinar los parámetros µmax y Ks mediante…………….
la linealización de la ecuación de Monod. ...................................................................... 47
4.10. Cálculo de la tasa de rendimiento de biomasa/sustrato, producto/biomasa…………
y producto/sustrato ( ). ..................................................................... 49
5. RESULTADOS .......................................................................................................... 51
5.1. Resultados de la cantidad de microorganismos para cada pH ensayado ................. 51
5.2. Resultados de densidad ............................................................................................ 51
5.3. Resultados de conversión de consumo de sustrato .................................................. 52
5.3.1. Resultados para conversión de consumo de sustrato casos A, C, E, G, I ............. 52
5.3.2. Resultados para conversión de consumo de sustrato casos B, D, F, H, J ............. 52
5.4. Diagramas de conversión de sustrato en función del tiempo todos los casos ......... 53
5.4.1. Diagrama de conversión de sustrato en etanol en función del tiempo para………
2% de levadura casos: A, C, E, G, I ............................................................................... 53
5.4.2. Diagrama de conversión de sustrato en etanol en función del tiempo para……..
4% de levadura casos: B, D, F, H, J ............................................................................... 53
5.5. Resultados de etanol ................................................................................................ 54
5.6. Resultados de consumo de azúcares reductores ...................................................... 55
5.7. Resultados de generación de biomasa ..................................................................... 57
5.8. Diagramas de producción de etanol en función del tiempo..................................... 59
5.8.1. Diagrama de la concentración de etanol para los casos: A, C, E, G, I ................. 59
5.8.2. Diagrama de la concentración de etanol para los casos: B, D, F, H, J ................. 59
5.9. Diagramas de consumo de sustrato.. ....................................................................... 60
5.9.1. Diagrama de consumo de sustrato para los casos: A, C, E, G, I .......................... 60
5.9.2. Diagrama de consumo de sustrato para los casos: B, D, F, H, J .......................... 60
5.10. Diagramas de generación de biomasa.. ................................................................. 61
xi
5.10.1. Diagrama de generación de biomasa en función del tiempo para los casos: …….
A, C, E, G, I.... ................................................................................................................ 61
5.10.2. Diagrama de generación de biomasa en función del tiempo para los casos: …….
B, D, F, H, J.... ................................................................................................................ 62
5.11. Ecuación cinética experimental de la concentración de sustrato en función……..
del tiempo.... ................................................................................................................... 62
5.12. Resultados de velocidad de reacción para los casos B, I y J ................................. 62
5.13. Resultados de los parámetros cinéticos Ks y y velocidades de……………
reacción de las ecuaciones de Monod, Tessier y Moser con simulador Polymath 6.1. .. 64
5.14. Resultados de velocidad de reacción en función del tiempo.. ............................... 65
5.14.1. Modelado cinético de la velocidad de reacción en función del tiempo…………...
para los casos A y B con las ecuaciones: Monod, Tessier y Moser ............................... 66
5.14.2. Modelado cinético de velocidad de reacción en función del tiempo para los…….
casos I y J con las ecuaciones: Monod, Tessier y Moser ............................................... 67
6. DISCUSIÓN ............................................................................................................... 68
7. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 71
8. RECOMENDACIONES ............................................................................................ 74
CITAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 75
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 78
ANEXOS ........................................................................................................................ 80
xii
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1. Composición de cenizas de una biomasa de S. cerevisiae......................... 5
Tabla 2. Velocidad de reacción para los diferentes modelos cinéticos..................... 14
Tabla 3. Valor nutricional de las bebidas gaseosas caducadas para las levaduras.... 16
Tabla 4. Componentes de la mezcla de bebidas gaseosas caducadas ...................... 16
Tabla 5. Datos de generación de Unidad Formadora de Colonias de………….......
Saccharomyces C. en el medio de cultivo agar – bebidas gaseosas caducadas........
31
Tabla 6. Masa de picnómetro y de la mezcla de bebidas caducadas........................ 31
Tabla 7. Estándares de Mc Farland para calcular la biomasa …………………… 32
Tabla 8. Número de bacterias, transmitancia y absorbancia para graficar ………..
la curva de calibración..............................................................................................
32
Tabla 9. Datos de etanol formado en % volumen/volumen (%V/V)........................ 33
Tabla 10. Continuación de datos de etanol formado en %................................
volumen/volumen (%V/V)…....................................................................................
34
Tabla 11. Datos de volumen de tíosulfato de sodio consumido de azúcares............ 35
Tabla 12. Continuación de datos de volumen de tiosulfato de sodio consumido.....
en la titulación para determinar la concentración de azúcares reductores................
36
Tabla 13. Datos de generación de biomasa en % de transmitancia.......................... 35
Tabla 14. Continuación de datos de generación de biomasa en % de......................
transmitancia.............................................................................................................
37
Tabla 15. Linealización de la ecuación de Monod................................................... 48
Tabla 16. Cuantificación de unidad propagadora de levadura en cada ml............... 52
Tabla 17. Densidad de las mezclas a diferentes °Brix.............................................. 52
Tabla 18. Conversión de consumo de sustrato al 2% para los casos A, C, E, G, I... 53
xiii
Tabla 19. Conversión de consumo de sustrato al 4% para los casos B, D, F, H, J... 53
Tabla 20. Concentración de etanol en g/l ................................................................. 55
Tabla 21. Continuación de concentración de etanol en g/l....................................... 56
Tabla 22. Concentración de consumo de azúcares reductores en g/l........................ 56
Tabla 23. Continuación de concentración de consumo de azúcares reductores.......
en g/l..........................................................................................................................
57
Tabla 24. Concentración de generación de biomasa en g/l....................................... 58
Tabla 25. Continuación de concentración de generación de biomasa en g/l............ 59
Tabla 26. Ecuación Cinética experimental de concentración de biomasa................ 63
Tabla 27. Ecuación de velocidad de reacción experimental..................................... 63
Tabla 28. Velocidad de reacción con las ecuaciones de Monod, Tessier y .............
Moser caso B.............................................................................................................
63
Tabla 29. Velocidad de reacción con las ecuaciones de Monod, Tessier y..............
Moser caso I..............................................................................................................
64
Tabla 30. Velocidad de reacción con las ecuaciones de Monod, Tessier y..............
Moser caso J..............................................................................................................
64
Tabla 31. Parámetros cinéticos Ks y con las ecuaciones de Monod..............
Tessier y Moser.........................................................................................................
65
Tabla 32. Resultados de rendimientos...................................................................... 65
Tabla 33. Resultados de los modelos cinéticos y el coeficiente de correlación....... 66
xiv
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1. Ruta de la fermentación alcohólica...….………………………………... 3
Figura 2. Información necesaria para predecir lo que hace un reactor…………..... 7
Figura 3. Fases de la división celular……………………………………………... 8
Figura 4. Curva general de crecimiento microbiano……………………………… 9
Figura 5. Representación de la Ecuación de Hanes Woolf……………………….. 13
Figura 6. Diseño experimental de medio de cultivo para identificar el pH ………
para la fermentación de bebidas gaseosas caducadas…………………...................
18
Figura 7. Diseño experimental para la fermentación alcohólica de bebidas ………
gaseosas caducadas………………………………………………….......................
21
Figura 8. Diagrama de flujo del proceso de modelación cinética de la …………...
fermentación alcohólica a partir de bebidas gaseosas caducada …..........................
30
Figura 9. Diagrama de flujo del proceso de evaporación……………………......... 40
Figura 10. Curva de calibración de Mc Farland...….…………………………… 45
Figura 11. Concentración de biomasa en función del tiempo Caso A...…………... 47
Figura 12. Linealización de la ecuación de Monod para el caso A ………………. 49
Figura 13. Rendimiento de biomasa en función del producto caso A ……………. 50
Figura 14. Rendimiento de producto en función de la biomasa caso A…………… 50
Figura 15. Eficiencia producto en función del sustrato …………………………...
(Cp-Cpo = f (Cso-Cs))……………………………………………………………..
51
Figura 16. Conversión de sustrato para 2% de levadura casos: A, C, E, G, I .…..... 54
Figura 17. Conversión de sustrato para 4% de levadura casos: B, D, F, H, J..….... 54
Figura 18. Concentración de etanol en función del tiempo para los casos: .............
A, C, E, G, I ……………………………………………….....................................
60
xv
Figura 19. Concentración de etanol en función del tiempo para los casos:..............
B, D, F, H, J ………………………..……………………………...........................
60
Figura 20. Consumo de sustrato en función del tiempo casos: A, C, E, G,………..
I ……………………………………………………………………........................
61
Figura 21. Consumo de sustrato en función del tiempo casos: B, D, F, H, J ……... 61
Figura 22. Generación de biomasa en función del tiempo para los casos: ............
A, C, E, G, I …………………………………………………...……………........
62
Figura 23. Generación de biomasa en función del tiempo para los casos: B, D,......
F, H, J ………………………………………………………………………….......
62
Figura 24. Velocidad de reacción de biomasa en función del tiempo caso A.….. 67
Figura 25. Velocidad de reacción de biomasa en función del tiempo caso B ….. 67
Figura 26. Velocidad de reacción de biomasa en función del tiempo caso I …….. 68
Figura 27. Velocidad de reacción de biomasa en función del tiempo caso J …….. 69
xvi
LISTA DE ANEXOS
pág.
Anexo A. Norma Inen 1529 para el ensayo de conteo de microorganismos……… 81
Anexo B. Método de Mettler Toledo para determinar Azúcares reductores……… 87
Anexo C. Método de Mc Farland para cuantificar microorganismos………… 88
Anexo D. Resultados en Polymath modelo de Monod caso A……………………. 92
Anexo E. Resultados en Polymath modelo de Tessier caso A……………………. 93
Anexo F. Resultados en Polymath modelo de Moser caso A……………………... 94
Anexo G. Mezcla de Bebidas gaseosas caducadas antes y después de la…………
fermentación…………………………………………………………………….....
95
Anexo H. Diluciones para siembra en el medio gaseosas caducadas-agar………... 96
Anexo J. Fotografía del Biorreactor marca News Bronsweak……………….......... 97
Anexo K. Fotografías del equipo densito T50 y toma de muestras de etanol.......... 98
Anexo L. Resultados de exámenes fisicoquímicos y DOQ de gaseosas
caducadas………………………………………………………………..................
99
xvii
MODELACION CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA A
PARTIR DE BEBIDAS GASEOSAS CADUCADAS
RESUMEN
Estudio de los modelos cinéticos de Monod, Tessier y Moser, para determinar cuál es el
que mejor se ajusta a la reacción de fermentación alcohólica de bebidas gaseosas
caducadas, utilizando la levadura comercial Saccharomyces cerevisiae.
Para lo cual se prepararon mezclas considerando la concentración de azúcares de las
bebidas (Coca Cola %34, Fioravanti fresa 34% y Sprite 32%). Mediante el cultivo en
placa agar-mezcla se estableció el pH de 5,5 al cual se tuvo el mayor crecimiento de
levadura. Durante la fermentación se mantuvieron constantes el pH y la temperatura de
30°C, estudiando el efecto de las variables, porcentaje de levadura 2 y 4%, y °Brix de
mezclas sin evaporación 10°Brix y con evaporación 12, 14, 16 y 18°Brix.
Periódicamente se evaluó la formación de etanol (densitometría), consumo de azúcares
reductores (titulación Fehling) y crecimiento de levadura (turbidimetría) durante 12
horas de fermentación.
Se obtuvo la mayor concentración de etanol de 89,72 g/L y rendimiento etanol/sustrato
de 0,49 a las siguientes condiciones: 18°Brix, pH 5,5 y 4% de levadura. Los datos
experimentales se ajustaron a los tres modelos cinéticos, estableciendo el mejor ajuste al
modelo de Moser con un coeficiente de correlación de 0,92.
PALABRAS CLAVES: /CINÉTICA/FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA/ ALCOHOL
ETÍLICO/MODELOS MATEMÁTICOS/BEBIDAS GASEOSAS
CADUCADAS/MODELO DE MOSER/
xviii
KINETIC MODEL OF ALCOHOLIC FERMENTATION FROM SOFT DRINK
EXPIRED
ABSTRACT
Study of the kinetic models of Monod, Tessier and Moser, to determine which best fits
the alcoholic fermentation reaction of expired gaseous beverages, using the commercial
yeast Saccharomyces cerevisiae.
For that, mixtures were prepared considering the sugar concentration of the beverages
(Coca Cola% 34, Fioravanti strawberry 34% and Sprite 32%). By means of the agar-
mixture plate culture the pH of 5.5 was set at which the highest yeast growth was
obtained. During the fermentation, the pH and temperature of 30 ° C were kept constant
by studying the effect of the variables, percentage of yeast 2 and 4%, and ° Brix of
mixtures without evaporation 10 ° Brix and with evaporation 12, 14, 16 and 18 ° Brix.
Formation of ethanol (densitometry), consumption of reducing sugars (Fehling titration)
and yeast growth (turbidimetry) during 12 hours of fermentation were evaluated
periodically.
The highest concentration of ethanol of 89.72 g / L and ethanol / substrate yield of 0.49
was obtained under the following conditions: 18 ° Brix, pH 5.5 and 4% yeast. The
experimental data were adjusted to the three kinetic models, establishing the best fit to
the Moser model with a correlation coefficient of 0.92.
KEY WORDS: /KINETICS/ALCOHOLIC FERMENTATION/ETHYL
ALCOHOL/MATHEMATICAL MODELS/DRIED GAS DRINKS/MOSER MODEL/
1
INTRODUCCIÓN
El desarrollo de tecnologías para el cambio de la matriz productiva ha incrementado el
uso de etanol debido a una amplia aplicación en la industria como: desinfectante,
disolvente para lacas, base para elaborar perfumes, aditivo a la gasolina, entre otras. Por
lo que su utilización, ha promovido la búsqueda de generar nuevas fuentes de biomasa
para la producción de este componente.
Las principales fuentes de obtención de etanol se enfocan en fermentar gran variedad de
alimentos con poder nutricional como la caña de azúcar, remolacha o maíz, que por su
nivel de azúcares son aptas para dicho proceso, involucrando el uso de extensiones de
cultivo y el uso desmesurado de pesticidas, causando el deterioro del suelo. Una
alternativa para producir etanol, es utilizar materiales residuales como las bebidas
gaseosas caducadas que poseen un alto potencial de azúcares necesarios para la
fermentación y cuando estas expiran normalmente son desechadas al alcantarillado
causando un importante impacto ambiental.
Según datos reportados por la empresa Arca Ecuador S. A. en el año 2015, el consumo
de bebidas gaseosas se ha incrementado en un 16.7% de la producción, comercializando
325 millones de litros cada año y, aproximadamente el 70% de este valor corresponden
a gaseosas azucaradas con una concentración de 9 a 12° Brix. (Inca, 2016)
Esta elevada producción conlleva simultáneamente que las bebidas, después de tres
meses cumplan con la fecha de caducidad y los comerciantes las desechen al
alcantarillado constituyendo un problema económico por pérdida financiera, y
medioambiental debido a la carga orgánica que éstas registran con un DQO de 109.750
mg O2/L. (OSP, 2017)
2
Algunos casos, la empresa canjea el producto caducado por otro nuevo por lo que en un
5% de la producción total retorna a la planta industrial, logrando alcanzar un volumen
de 16 millones de litros por año de bebidas caducadas las cuales siguen un tratamiento
de aguas implicando un alto costo de producción. (Sánchez Ó. , 2007)
En Argentina, (Comelli, Raúl; Seluy, Lisandro; Isla, Miguel, 2016) han demostrado una
alternativa que permite lograr una disminución de la contaminación ambiental con la
fermentación alcohólica de bebidas gaseosas de descarte mediante levaduras,
transformándose los azúcares presentes en biomasa, dióxido de carbono y etanol.
Actualmente en el Ecuador, no se han realizado investigaciones referentes a la
producción de etanol a partir de gaseosas caducadas, tomando en cuenta que las
formulaciones de las bebidas para cada país son diferentes; el presente trabajo se enfoca
en la modelación cinética de la fermentación alcohólica a partir de la mezcla de tres
tipos de bebidas gaseosas caducadas provenientes de la empresa Arca Continental S. A.
Para establecer el modelo cinético es necesario evaluar los parámetros cinéticos que
definen el crecimiento microbiano puesto que son las herramientas básicas para escalar
los procesos microbiológicos, permiten predecir el desarrollo de la fermentación y
evaluar los rendimientos de este proceso. Los parámetros son: la velocidad especifica de
crecimiento máxima (µmax), la constante de afinidad por el sustrato (Ks) y los
coeficientes de rendimiento (Ys/x, Yp/x y Yp/s). (Zapata, Hoyos, & Quinchía, 2005)
Se analiza las muestras obtenidas de la fermentación alcohólica de gaseosas caducadas
monitoreando la producción de etanol mediante densitometría, el consumo de azúcares
reductores mediante titulación de Fehling y el crecimiento de levaduras mediante
turbidimetría, generando un modelo cinético que interprete el fenómeno de la
fermentación de gaseosas caducadas. Los datos experimentales se ajustaron a tres tipos
de modelos cinéticos: Monod, Tessier y Moser observando el mejor ajuste de los datos
experimentales con respecto a las ecuaciones cinéticas propuestas mediante el análisis
del coeficiente de determinación (R2), además se realizó un análisis de rendimientos
para seleccionar el mejor proceso de producción de etanol mediante fermentación.
3
1. MODELACIÓN CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN ALCOHOLICA
1.1 Fermentación alcohólica
Es un proceso anaerobio, originado por la actividad de ciertos microrganismos entre
ellos la Saccharomyses cerevisiae, que transforma los monosacáridos en etanol y gas
carbónico. (Campbell & Reece, 2010)
Figura 1. Ruta de la fermentación alcohólica
La fermentación en condiciones anaerobias se compone de la glucólisis que oxida el
azúcar a dos moléculas de piruvato mediante la producción de dos moléculas de
Adenosin trifosfato (ADP) por cada fosforilación y transfiriendo electrones del
Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH). El piruvato se convierte a etanol por dos
pasos, el primero libera CO2 a partir del piruvato que se convierte en el compuesto de
dos carbonos de acetaldehído y en el segundo paso, el acetaldehído es reducido por el
NADH a etanol para generar NAD+ necesaria para la glucólisis. (Ward, 1991)
Realizando un balance energético total la fermentación puede expresarse:
C6H12O6 + 2ADP + 2NAD+
+ 2H3PO4 → 2piruvato + 2ATP + 2NADPH2 1
2 piruvato + 2NADPH2 → 2CH3CH2OH + 2CO2 + 2NAD+ 2
C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 → 2CH3CH2OH + 2CO2+ 2ATP 3
4
Una forma simplificada de representar el proceso anterior es con la reacción 4, en el que
a productos (P) se incluyen a CO2, agua, biomasa, etanol y la reacción 5, se representa
de manera general a la producción de etanol sin considerar a las células. (Fogler, 2004)
S sustrato + X células → X más células + P productos 4
C6H12O6 →2C2H5OH + 2CO2 5
Para que el proceso de fermentación se dé exitosamente es necesario tomar en cuenta
algunos aspectos importantes como: tipo de microorganismo adecuado para este
proceso, factores que afectan la velocidad de crecimiento, así como todos los
requerimientos nutricionales del microorganismo necesarios para su buen desarrollo.
1.1.1. Tipo de Microorganismo. - No todas las levaduras presentan la misma
resistencia al etanol, la más idónea es la de la familia de las Saccharomyces. (Leveau &
Bouix, 2000). Es preferible escoger una levadura que sea fácil de conseguir en el
mercado, a bajos precios, capaz de producir y tolerar altas concentraciones de alcohol
hasta un 20% v/v como la Saccharomyces cerevisiae. (Mora, 2014)
1.1.2. Factores que afectan la rapidez de crecimiento. – Los factores que afectan la
rapidez de crecimiento son: la concentración de sustrato, pH, temperatura, inhibición
por producto y nutrición de las levaduras.
Concentración de sustrato. – La fermentación alcohólica suele ser satisfactoria a
una concentración del 10 al 18% de azúcares, aunque a veces se emplean
concentraciones demasiado altas como de 22% (Rios del Risco, Fajardo, & Perez
M, 2005) causando la inhibición de las levaduras debido al alto esfuerzo osmótico
impuesto hacia las células, el cual causa deshidratación, problemas disfuncionales y
la rapidez de crecimiento disminuye. (Scragg, 1997)
Temperatura. - Como todas las reacciones químicas, el crecimiento microbiano es
afectado por la temperatura. En este caso, la levadura S. cerevisiae es un
microorganismo mesófilo y las condiciones óptimas para su crecimiento se ubican
entre 20 y 37°C donde un aumento excesivo de la temperatura, aumenta la tasa de
mortalidad debido a la desnaturalización de las proteínas (Mora, 2014) y en una
5
baja temperatura los mecanismos de la célula son afectados en el transporte del
sustrato hacia fuera y dentro de la célula, por lo que la biomasa decae a
temperaturas extremas. Siendo la temperatura óptima a 30°C con la máxima
velocidad de reacción. (Haenh, Bioquímica de las Fermentaciones, 1991)
pH. - Los microorganismos tienden a crecer en un intervalo limitado de pH. En
general los microorganismos que toleran pH ácidos, como la S. cerevisiae, son
microorganismos acidófilos es decir que no toleran pH alcalinos, y su pH óptimo se
encuentra entre 3.5 hasta 5.5 (Silva Tubón, 2014)
Inhibición por producto. - Cuando la concentración de etanol está produciéndose en
exceso (20%v/v), el metabolismo celular del microorganismo se detiene,
interfiriendo en la multiplicación de células y deteniendo la velocidad de reacción
del microorganismo por el producto. (Ward, 1991)
1.1.3. Nutrición de levaduras. – El medio de cultivo debe aportar los elementos
nutritivos necesarios para que la ruta metabólica de la levadura S. cerevisiae funcione y
la síntesis celular sea favorable en presencia de sustancias como carbono, nitrógeno,
fósforo, potasio, magnesio y zinc. (Leveau & Bouix, 2000)
El carbono. - Sirve como una fuente de energía y como material para la
multiplicación de las células. (Ospina & Palacios, 1994)
El nitrógeno. - Influye directamente sobre la biomasa acelerando el crecimiento
durante la fase exponencial, lo que produce una sobrepoblación de células de
levadura (Fajardo Castillo & Sarmiento Forero, 2007) y una conversión rápida en la
célula con el mínimo de etapas de crecimiento (Leveau & Bouix, 2000) entre las
fuentes de nitrógeno para los microorganismos están las amidas, úrea, y sales
amónicas como sulfato o fosfato diamónico. (Ospina & Palacios, 1994)
El fósforo. - Interviene en la formación de hexosas fosfato y de triosas para la
formación de etanol. El potasio estimula la fermentación y las levaduras la
consumen dos veces más en este proceso. (Jones & Greendfields, 1984)
El magnesio. - Está implicado en el buen funcionamiento del metabolismo de la
levadura como en la estructura celular, y una carencia de éste conlleva a una
producción de ácido acético. (Leveau & Bouix, 2000)
6
El zinc. - Es indispensable en la glucólisis porque estimula la acción del magnesio.
(Leveau & Bouix, 2000)
En anaerobiosis, los elementos que son necesarios añadir para una biomasa de S.
cerevisia, es alrededor de un 10% de sus cenizas, este medio debe aportar el conjunto de
elementos que la levadura utilizará para su crecimiento. A partir de los valores de la
Tabla 1 se calculan las cantidades de las sales añadidas a los medios de cultivo. (Leveau
& Bouix, 2000)
Tabla 1. Composición de cenizas de una biomasa de S. cerevisiae
(Leveau & Bouix, 2000)
Elementos Cantidad (g por 100 g de Materia Seca)
Potasio 2,2
Fósforo 1,6
Magnesio 0,270
Zinc 0,012
1.2 Cinética de la fermentación
La cinética química en un biorreactor, es el estudio de la velocidad de reacción,
considerando todos los factores que influyen sobre ella y explicando la causa de la
magnitud del fenómeno. El biorreactor es el lugar donde se realiza el cultivo y se
diseñan con el fin de obtener un producto a partir de materiales no elaborados tal que
asegure un ambiente uniforme y adecuado para el microorganismo. (Levenspiel, 2004)
Figura 2. Información necesaria para predecir el funcionamiento de un reactor
7
Para dimensionar un biorreactor se toman en cuenta algunos aspectos generales como si
la reacción es isotérmica, reversible o irreversible, homogénea o heterogénea, de orden
mayor o igual que cero (Fogler, 2004) y también se deben tomar en cuenta aspectos
bioquímicos tales como los parámetros cinéticos de crecimiento microbiano (µmax, Ks)
y los coeficientes de rendimiento (Y s/x, Y p/x y Yp/s) que permitirán diseñar un
sistema de cultivo continuo, batch o batch-alimentado dependiendo de los flujos de
entrada y salida del reactor, (Merchuk, 2006) además un efecto positivo del análisis de
los parámetros cinéticos, es disminuir los tiempos de fermentación, aumentar los
rendimientos y la productividad industrial. (Zapata, Hoyos, & Quinchía, 2005)
1.2.1. Cinética de crecimiento microbiano. – Un cultivo microbiano en reactor Batch
imita una reacción en forma de S hasta la fase estacionaria y decrece luego de ella, es
decir que la velocidad de crecimiento en un tiempo dado, es proporcional a la
concentración de células ya presentes durante ese tiempo. (Stainer, Ingraham, Wheelis,
& Painter, Microbiológia 2 Ed, 1999)
(1)
Dónde:
rx = velocidad de crecimiento de la célula, g/l*h
µ = rapidez específica de crecimiento, s-1
Cx = concentración de células, g/l.
Cuando en un medio de crecimiento se inocula con microorganismos, ocurren una
secuencia de eventos llamada ciclo de crecimiento celular, el cual se puede describir en
la Figura 4. (Agatángelo, 2007)
8
Figura 4. Curva general de crecimiento microbiano
a) La fase de adaptación o lag. - Representa un periodo de adaptación de la levadura
a las nuevas condiciones nutricionales y ambientales, en esta fase no existe
aumento del número de células y la velocidad de crecimiento es cero. (Sánchez A.
M., 2011)
b) La fase exponencial o logarítmica. - Es aquella donde la síntesis de todos los
nutrientes celulares aumenta a una velocidad constante de modo que la población
de células se duplica en intervalos regulares empleando los nutrientes de manera
eficiente. (Agatángelo, 2007)
c) La fase estacionaria. - Indica que el crecimiento puede estar ocurriendo, pero está
equilibrado por la rapidez de muerte por agotamiento de los nutrientes disponibles,
la velocidad neta de crecimiento es cero como resultado del agotamiento de los
nutrientes. (Fogler, 2004)
d) La fase de muerte celular. - Es la fase de declinación debido a los subproductos
tóxicos en condiciones ambientales difíciles, durante esta fase la desaparición
puede volverse más alta que la rapidez de crecimiento, y disminuye la densidad de
las células. (Agatángelo, 2007)
1.2.2. Cinética de consumo de sustrato. – La velocidad de consumo de sustrato
dependerá de la concentración de nutrientes existentes en el medio y de las condiciones
empleadas para el crecimiento celular como temperatura, pH, entre otros. (Mora, 2014)
Ésta cinética es análoga a la cinética de crecimiento microbiano, pero se adiciona el
término de rendimiento del consumo de sustrato con respecto a la generación de
biomasa (Ys/x).
9
(2)
Dónde:
- velocidad de consumo del sustrato, g/l*h
= rendimiento de consumo de sustrato/formación de células.
1.2.3. Cinética de obtención de producto. – Como la cinética de consumo de sustrato,
se plantea una cinética de generación de producto como una consecuencia del
crecimiento celular obteniendo el producto del rendimiento del producto con respecto al
crecimiento del microorganismo.
(3)
Dónde:
velocidad de generación de producto, g/l*h
= rendimiento de formación de producto/formación de células.
1.2.4. Rendimiento de biomasa y producto. – Estos son parámetros muy importantes,
debido a que, en el proceso fermentativo se busca aumentar el rendimiento de biomasa y
la producción de etanol. Los rendimientos representan la relación entre: la biomasa
formada con respecto al sustrato consumido ( ); el producto obtenido con respecto al
sustrato consumido ( ) y la biomasa formada con respecto al producto formado
( ). (Peña & Arango, 2009)
(4)
(5)
(6)
Es posible representar el metabolismo celular de la levadura Saccharomyces cerevisiae
mediante una herramienta computacional Mbt Tool (Metabolism based on
10
Termodymnamics), basada en la eficiencia de la transferencia de energía entre los
procesos anabólicos y catabólicos representando para el proceso de producción de
etanol mediante fermentación, la unión de dos reacciones como son: la síntesis de
biomasa a partir de la glucosa y la síntesis de etanol a partir de biomasa de piruvato.
(Araujo Granda, Gras, & Ginovart, MbT-Tool: An open-access tool based on
Thermodynamic Electron Equivalents Model to obtain microbial-metabolic reactions to
be used in biotechnological process, 2016)
C6H12O6+0.094NH4+2.25HCO-3 → 0.094C6.33H10.21O3.53N+2.16CH3COCOO
−+1.17 CO2+3.59 H2O 6
CH3COCOO−+0.047 NH4+1.325 H2O → 0.047C6.33H10.21O3.53N+0.734+CH3CH2OH+0.283CO2+0.953HCO3 7
1.3 Modelado cinético de la fermentación
Hay muchas leyes para la velocidad de crecimiento celular, sin embargo, Nielsen &
Villadsen en 1994 dan como definición de modelo cinético para la descripción de un
proceso microbiano lo siguiente: “La correlación verbal o matemática entre velocidades
y concentración de reactantes/productos, los cuales son insertados en balances de
materia y permiten la predicción del grado de conversión de sustratos y el rendimiento
de productos individuales en otras condiciones de operación.”
Investigaciones en procesos fermentativos han resultado en un alto número de diferentes
ecuaciones que describen el crecimiento microbiano. La más famosa de ellas es la
expresión propuesta por Monod. (Monod, 1949) Aunque cada uno de estos modelos
puede ser descrito por una ecuación flexible, la falta de consistencia con los datos
experimentales ha conducido a desarrollar ecuaciones alternas como las propuestas por
Tessier y Moser, entre otras. (Fogler, 2004)
11
1.3.1. Cinética de Monod. - Monod fue el primero en investigar el efecto de la
concentración de sustrato sobre la rapidez de crecimiento, y encontró que la velocidad
específica de crecimiento de las células durante las fases de crecimiento y
desaceleración depende de la concentración de nutrientes existentes en el medio, se
denomina sustrato limitante y es la fuente de carbono. (Monod, 1949)
La expresión más empleada es la ecuación de Monod para crecimiento exponencial:
(7)
Dónde:
velocidad de crecimiento de la célula, g/l*h
µmax = rapidez específica de crecimiento máxima, s-1
Ks = parámetro que representa la concentración de sustrato a la mitad de su velocidad
máxima (µmax), g/l
Cx = concentración de células, g/l.
Cs = concentración de sustrato, g/l.
Monod asumió que un único sustrato esencial es el factor limitante del crecimiento
microbiano además que la ecuación no se puede aplicar a niveles bajos de sustrato y no
toma en cuenta cambios de sustrato en las fases de latencia, estacionaria y de muerte. Si
el crecimiento se ve inhibido por concentraciones altas de producto se deben añadir
otros términos para tener en cuenta estos efectos. (Monod, 1949)
Un método para evaluar los parámetros (µmax y Ks) de la ecuación de Monod es
linealizarla consiguiendo la ecuación de Lineweaver Burk. (Lineweaver & Burk, 1988)
(
)
(8)
Para un mejor ajuste de los datos experimentales, se han creado otras ecuaciones en la
que se multiplica la ecuación de Lineweaver Burk por la concentración de sustrato,
obteniendo la ecuación lineal de Hanes Woolf haciendo que el error experimental se
minimice. (Hanes, 1932) Estudios de (Dowd & Riggs, 1965) comparan tres diferentes
12
linealizaciones de la ecuación de Monod las ecuaciones de: Lineweaver Burk (1/
versus 1/Cs), Hanes Wolf (Cs/ versus S) y Eadie Hofstee ( versus /Cs),
consiguiendo una mejor interpretación de los parámetros µmax y Ks con la ecuación de
Hanes como la figura 5 a continuación. (Dowd & Riggs, 1965)
(
)
(9)
Figura 5. Representación de la Ecuación de Hanes Woolf
Una representación gráfica de Hanes de Cs/ versus Cs, produce una línea recta con
pendiente 1/µmax, abscisa al origen es el equivalente a Ks/ donde la velocidad de
crecimiento depende de la concentración del sustrato.
1.3.2. Cinética de Tessier. - La cinética propuesta por Tessier, asume un crecimiento
de células limitado dependiendo solo por la concentración de sustrato, se representa a
continuación:
* (
)+ (10)
Esta ecuación describe los mismos parámetros que la ecuación de Monod, aunque
descritos de otra manera debido a la falta de consistencia con los datos experimentales
por lo que se condujo a desarrollar ecuaciones alternas como la ecuación (10). (Trejos,
Alzate, & Gómez García, 2009) Mientras la ecuación de Monod fue inspirada por la
expresión de velocidad enzimática deducida por Michaelis-Menten, esta ecuación de
13
Tessier es puramente empírica tomando un punto de partida diferente, es decir,
utilizando el concepto de deficiencia de crecimiento. (Atkinson, 2010)
1.3.3. Cinética de Moser. – En la práctica, al estar en crecimiento bajo concentraciones
reducidas de ciertos nutrientes, es posible que la población de microorganismos
modifique su estructura genética con el fin de adaptarse a este tipo de situación y al
convivir en la misma población diferentes tipos de células (mutadas y no mutadas), es
posible que llegue a establecerse cierto grado de cooperación entre especies.
A consecuencia de todo ello, se produce una mejora en el proceso de reproducción
celular. Moser propuso un nuevo modelo cinético empírico que incluye los efectos
adaptativos y cooperativos de la población microbiana en su crecimiento mediante la
adición de un parámetro “n” a la ecuación. (Moser, H., 1958) La expresión matemática
es la siguiente:
(11)
Esta ecuación mantiene la misma forma que la cinética de Monod, pero añade un
parámetro “n” que si es mayor a 1 indica que dichos efectos se producen, mientras que
para “n” igual a 1, el proceso se adapta a la cinética de Monod. Finalmente, un valor del
parámetro inferior a 1 es sinónimo de efectos inhibitorios en el sistema. (Moser, H.,
1958)
1.3.4. Polymath 6.1. - Es un programa computacional que permite aplicar técnicas de
análisis numérico eficaces durante la resolución de las ecuaciones cinéticas empleando
una regresión no lineal, se puede obtener estimaciones de los parámetros cinéticos
µmax, Ks y “n” expresadas en las ecuaciones anteriormente. (Shacham, Cutlip, & Elly,
2006) Para validar el modelo cinético a escoger, se determina mediante el valor del
coeficiente de correlación (“R2”) que se utiliza con frecuencia para juzgar si el modelo
representa correctamente los datos experimentales lo que implica que, si el coeficiente
de correlación es cercano a 1, el modelo de regresión es correcto. (Annuar, Tan,
Ibrahim, & Ramachandran, 2008)
14
En resumen, se tienen las diferentes velocidades de reacción para cada uno de los
modelos cinéticos. En la Tabla 2 se puede observar la simplicidad de la ecuación de
Monod a diferencia de las ecuaciones restantes Tessier y Moser, que poseen mínimo
dos o más parámetros ajustables.
Tabla 2. Velocidad de reacción para los diferentes modelos cinéticos
Velocidad de
reacción
Modelo
Monod (
) - *(
) + [(
) ]
Tessier [ (
) ] [ (
)] [ (
)]
Moser
[
] [
]
15
2. BEBIDAS GASEOSAS AZUCARADAS CADUCADAS
Existe una gran variedad de sustratos empleados para la fermentación alcohólica, esto se
debe a que el componente principal de cada materia prima es la fuente de carbono
necesaria para la producción de etanol. En el mercado se puede encontrar varias
materias primas con esta fuente de carbono tales como las uvas, caña de azúcar, melaza,
entre otros. (Garzón Castaño & Hernández Londoño, 2009)
Un sustrato novedoso y que puede ser usado como fuente de carbono son las bebidas
gaseosas caducadas que generalmente son elaboradas a base de agua purificada, gas
carbónico (CO2), acidificantes, colorantes, conservantes, y principalmente de azúcar,
que cumplen con una fecha de caducidad o una fecha de consumo preferente. Son
consideradas como alimentos semiperecibles, es decir, que solo se modifican sus
propiedades organolépticas como color, sabor, olor y/o textura, no son nocivas para la
salud, pero si son desechadas, son altamente contaminantes para el medio ambiente.
Como todo alimento, estas bebidas tienen un tiempo de vida útil que es el período de
tiempo durante el cual, el alimento mantiene los parámetros específicos de calidad.
(Licata, 2015)
2.1. Tiempo de vida útil
El tiempo de vida útil de las bebidas gaseosas se ve afectado por los carbohidratos que
contienen pues son susceptibles al deterioro provocado por hongos y levaduras, para
evitar esto se adiciona gas carbónico y preservantes para detener dicho crecimiento,
constituyendo un factor importante puesto que poseen estabilidad aún expiradas y solo
en caso de una mala conservación éstas pueden cambiar su color, olor y sabor. (Carrillo,
2007)
16
Las bebidas gaseosas no poseen valor nutricional, (Moreiras, Carbajal, Cabrera, &
Cuadrado, 2013) y al ser desechadas al alcantarillado, contaminan al medio ambiente
debido a la alta carga orgánica que poseen. En la Tabla 3 menciona el valor nutricional
de las bebidas caducadas que aprovecharían las levaduras para su crecimiento, y la
demanda química de oxígeno (DQO) como índice de contaminación por oxígeno.
Tabla 3. Valor nutricional de las bebidas gaseosas caducadas para las levaduras
(OSP, 2017)
Valor por litro de bebida
Hidratos de carbono, Brix 10
Nitrógeno, mg/l 24,6
Fósforo, mg/l 38,6
Potasio, mg/l 24,9
DQO, mg O2/l 109.750
2.2. Componentes de las bebidas
El análisis de los componentes de las bebidas caducadas proporciona un índice
cualitativo de la presencia de agentes inhibidores, la Tabla 4 resume los componentes de
la mezcla de las mismas.
Tabla 4. Componentes de la mezcla de bebidas gaseosas caducadas
Componentes de bebidas gaseosas caducadas
Conservantes Regulador de
acidez
Acidulantes Colorantes Otros
Sorbato de
Potasio
Ácido fosfórico Gluconato
de Sodio
Colorante
Amarillo #5
Agua
Benzoato de
Sodio
Ácido cítrico Goma
Xantana
Colorante
Amarillo # 6
Azúcar
Ácido Tartárico Colorante
Rojo #40
Cafeína
Citrato de
Sodio
Colorante
Caramelo
Saborizantes
Naturales
Fuente: Etiquetas de ingredientes de bebidas gaseosas (Coca Cola, Sprite, Fioravanti
fresa)
17
A continuación, se describe los componentes de las bebidas gaseosas caducadas que
influyen en el crecimiento microbiano:
Azúcar. – Las bebidas caducadas poseen un alto contenido de azúcares los cuales
son importantes para la fermentación, mediante su oxidación genera una fuente de
energía para las células y sirve de alimentación para las levaduras. (McGilvery,
1977)
Agua. - El agua es el componente que se encuentra en mayor proporción en las
bebidas gaseosas, frecuentemente se utiliza agua destilada, para evitar el contenido
de minerales, (Licata, 2015) y es el medio para que las levaduras puedan fermentar.
Conservantes. – Son compuestos químicos capaces de detener el deterioro de los
alimentos debido al crecimiento de microorganismos (bacterias, mohos, levaduras) y
son empleados para la conservación de los alimentos. (Ardame & Rincones, 2008)
Los conservantes empleados para las bebidas carbonatadas de interés son benzoato
de sodio y sorbato de potasio y la concentración máxima permitida por las Normas
Ecuatorianas Inen 1101.2008, de ácido benzoico, sórbico y su sal de sodio y potasio,
es de 600 mg/litro solos o en combinación. (Inen, 2008)
Se estudió este comportamiento mediante diferentes reactores y cada uno con
distintas concentraciones de cada conservante, por eso Theumer en 2014 concluyó
que: “El ácido benzoico produjo una fuerte inhibición de la fermentación alcohólica
comparado con el ácido sórbico, a todos los valores de pH estudiados a excepción
del pH 5,5 en un medio símil gaseosa.” (Theumer, 2014)
18
3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
3.1. Diseño experimental para la fermentación de bebidas gaseosas caducadas
3.1.1. Descripción del medio de cultivo. – Con el fin de determinar la concentración
inhibitoria en microorganismo (CIM) provocada por los conservantes propios de las
gaseosas como el sorbato de potasio y benzoato de sodio, se preparan una serie de
placas en medio Gaseosa-Agar adicionando los suplementos alimenticios para la
levadura tales como fosfato de amonio (NH4)2HPO4(s), sulfato de magnesio Mg(SO4) (s),
sulfato de zinc Zn(SO4) (s) y sulfato de potasio K(SO4) (s) inoculados a una temperatura
de 30°C durante 48 horas. La inoculación se practica en “gota” mediante un asa
calibrada que dispense 0,001-0,002 ml con el fin de comprobar en qué pH hubo mayor
crecimiento de microorganismos viables para la fermentación. (Martos et al, 1997)
Para el desarrollo de la parte experimental se realizó medios de cultivo bebidas gaseosas
caducadas-agar a diferentes pH, por triplicado para identificar el mejor pH previo al
proceso de fermentación, su arreglo factorial es: 5x3= 15 repeticiones
Figura 6. Diseño experimental de medio de cultivo para identificar el pH para la
fermentación de bebidas gaseosas caducadas
Dónde:
MBGC: mezcla de bebidas gaseosas caducadas
MBGC °Brix= 10
Medio de
Cultivo en
placa
por triplicado
pH1 = 3,5
pH2 = 4
pH3 = 4,5
pH4 = 5
pH5 = 5,5
19
3.1.2. Descripción del proceso de fermentación. - Formular una mezcla sin
evaporación C1 y otras con evaporación para obtener las diferentes concentraciones de
azúcares C2, C3, C4 y C5, las mismas que se trabajaron con dos diferentes
concentraciones de levadura Tipo 1 y Tipo 2, 2%p/v y 4%p/v respectivamente,
procediendo con la misma alimentación que el medio de cultivo, temperatura de 30°C,
regulando a un pH de 5,5 con soluciones de ácido cítrico 0,1 molar y bicarbonato de
sodio 0,2 molar para conseguir el caso con mayor consumo de azúcares reductores
totales y alcanzar la mejor concentración de producto.
La fermentación se lleva a cabo en un biorreactor marca New Brunswick de vidrio, dos
litros de capacidad, dotado de un potenciómetro para monitoreo de pH, sensor de
temperatura para mantener la temperatura constante de 30°C, agitador para mantener
una mezcla uniforme, serpentín interno para intercambio de calor, chaqueta de
calentamiento, válvula anti retorno y una toma de muestra al vacío que asegura la
esterilidad y anaerobiosis del sistema.
En el proceso de fermentación se tomó muestras cada hora y media para monitorear la
generación de biomasa mediante espectrofotometría, el consumo de los azúcares
reductores mediante reactivo de Fehling (Mwesigye & Barford, 2006) y monitoreo de
la producción de etanol mediante densímetro automático.
Determinación de biomasa por turbidimetría. – Se cuantifica la concentración de
levaduras mediante turbidimetría la cual es una técnica analítica basada en la
dispersión de la radiación de partículas en suspensión de una solución. La
turbidimetría en levaduras se puede cuantificar utilizando los estándares de turbidez
de Mc Farland que se utilizan para estandarizar el número aproximado de levaduras
en una suspensión líquida comparando con la turbidez de una suspensión de prueba
con la turbidez de un estándar de Mc Farland. Los estándares de Mc Farland se
preparan añadiendo cloruro de bario al ácido sulfúrico para obtener un precipitado
se sulfato de bario. Mediante el ajuste de los volúmenes de estos dos reactivos, se
pueden preparar patrones de diferentes grados de turbidez para representar varias
concentraciones diferentes de bacteria. (Wickerham, 1951)
20
Determinación de azúcar reductor por titulación de Fehling. - Cualquier azúcar
que tenga un grupo aldehído o sea capaz de formarlo en solución, es un azúcar
reductor, las bebidas gaseosas caducadas contienen azúcares reductores, por tanto,
reaccionan con sulfato de cobre alcalino (II) para formar un precipitado de óxido de
cobre (I). A la muestra de azúcares se le añaden soluciones de Fehling A y B (A:
sulfato de cobre. B: hidróxido de sodio y tartrato mixto de potasio y sodio). El
Cobre (II) excedente que no ha reaccionado se reduce mediante yoduros, y se genera
una cantidad de yodo. Este yodo se valora con tiosulfato de sodio mediante la
indicación por electrodo de Redox con anillo de platino. (Toledo, 2012)
Determinación de etanol por densitometría. - Un método de cuantificación de
etanol es mediante densímetros automáticos que aplican el principio de medición del
tubo en U oscilante solo necesitan unos mililitros de muestra, lo que facilita
considerablemente su obtención. El ajuste equilibrado de la temperatura de la
muestra se logra gracias al termostato incorporado con gran rapidez y se controlan
mediante el densímetro. (Toledo, 2012)
Para llevar a cabo la fermentación alcohólica, el diseño factorial se realizó con la
influencia de dos factores: °Brix y porcentaje de levadura y de acuerdo a la literatura
revisada, se tomaron las mejores condiciones nutricionales en las que la levadura,
Saccharomyces cerevisiae, se desarrolla para convertir los azúcares en etanol.
Para proceder a la fermentación se realizaron tres réplicas que equivale a 30 muestras a
ser analizadas de manera que se determina la influencia que tienen estos dos factores
sobre el rendimiento de etanol con un arreglo factorial de: 5x2=10xn 10x3= 30
repeticiones
21
Figura 7. Diseño experimental para la fermentación alcohólica de bebidas gaseosas
caducadas
Dónde:
C1 = concentración de 10 °Brix
C2 = concentración de 12 °Brix
C3 = concentración de 14 °Brix
C4 = concentración de 16 °Brix
C5 = concentración de 18 °Brix
1 = concentración de levadura al 2%
2 = concentración de levadura al 4%
Mn = muestra obtenida
n = número de réplicas
J
C5
C3
C4
Sustrato pH=5,5 T=30°C
sin evaporación
con evaporación
C1
1
2
A
B
C
D
E
F
G
H
I
1
1
1
1
C2
2
2
2
2
22
3.2. Materiales y equipos
3.2.1. Medio de Cultivo
Placas Petri
Autoclave
Asa calibrada
Tubos de ensayo (R = 10 ml)
Gradilla
Mechero
Micro pipeta (R = 100 l) (Ap = ± 1 l)
Puntas para pipeta (R = 5 ml) (Ap = ± 0,2 ml)
Potenciómetro (R = 0-14) (Ap = ± 0,01)
Incubadora
Matraces (R = 500 ml) (Ap = ± 50 ml)
3.2.2. Fermentación
Biorreactor
Autoclave T = 121°C P = 14 psi
Balanza Analítica: (R = 320g) (Ap = ± 0,0001g)
Termómetro (R = -10 a 110°C) (Ap = ± 1°C)
Potenciómetro (R = 0 a 14) (Ap = ± 0,01)
Pipeta (R = 2 ml) (Ap = ± 0.5 ml)
Refractómetro (R = 80°Brix) (Ap = ± 0.25 °Brix)
Picnómetros (R = 25ml)
Vasos de precipitación (R = 1000 ml) (Ap = ± 50 ml)
Probeta (R =250 ml) (Ap = ± 2 ml)
Agitador
Reverbero
Vidrio reloj
23
3.2.3. Determinación de azúcares reductores
Vasos de precipitación (R = 50 ml) (Ap = ± 20 ml)
(R = 100 ml) (Ap = ± 25 ml)
Pipetas (R = 5 ml) (Ap = ± 0,1 ml)
(R = 1 ml) (Ap = ± 0,1 ml)
(R = 2 ml) (Ap = ± 0,5 ml)
Pera
Reverbero
Bureta (R = 25 ml) (Ap = ± 0,1 ml)
Refractómetro (R = 80°Brix) (Ap = ± 0,25 °Brix)
3.2.4. Determinación de biomasa
Espectrofotómetro (V = 12 voltios) (I = 3,2 amperios)
Tubos de ensayo (R = 10 ml)
Gradilla
3.2.5. Determinación de Etanol
Quitasato
Papel filtro
Bomba al vacío (R = -1 a -15 bar) (Ap = ± 0,02 bares)
Densito T50 (R = 100%) (Exactitud = ± 1,0 %)
Vasos de precipitación (R = 50 ml) (Ap = ± 10 ml)
3.2. Sustancias y reactivos
3.2.1. Medio de Cultivo
Agar Nutritivo
24
Levadura Saccharomyses cerevisiae.
Ácido cítrico 0,1 molar, C6H8O7(s)
Carbonato de Sodio 0,2 molar, NaHCO3(s)
Mezcla de bebidas gaseosas caducadas.
Fosfato de amonio, (NH4)2HPO4(s).
Sulfato de Magnesio, Mg(SO4) (s).
Sulfato de Zinc, Zn(SO4) (s).
Sulfato de Potasio, K(SO4) (s).
3.2.2. Fermentación
Levadura Saccharomyses cerevisiae.
Mezcla de bebidas gaseosas azucaradas caducadas en diferentes proporciones Coca
cola (34%), Sprite (32%)., Fioravanti Fresa (34%).
Bicarbonato de Sodio 0,2 molar, NaHCO3(s) para regular el pH.
Ácido cítrico 0,1 molar, C6H8O7(s) para regular el pH.
Fosfato de amonio, (NH4)2HPO4(s) como fuente nutritiva de Nitrógeno y Fósforo para
la levadura.
Sulfato de Magnesio, Mg(SO4) (s) como fuente de Magnesio para la levadura.
Sulfato de Zinc, Zn(SO4) (s) como fuente de Zinc para la levadura.
Sulfato de Potasio, K(SO4) (s) como fuente de Potasio para la levadura.
3.2.3. Determinación de azúcares reductores
Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O) (s) para preparar reactivo de Fehling A.
Hidróxido de sodio (NaOH)(s) para preparar reactivo de Fehling B.
Tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6.4H2O) (s) para preparar reactivo de Fehling B.
Agua destilada (H2O) (l).
Ácido sulfúrico al 10% v/v (H2SO4) (ac).
Yoduro de potasio al 10%v/v (KI)(ac).
Tiosulfato de Sodio 0,1 molar (Na2S2O3) (ac).
Muestra de bebidas gaseosas caducadas y fermentada.
25
3.2.4. Determinación de biomasa
Agua destilada (H2O) (l).
Muestra de bebidas gaseosas fermentadas.
Cloruro de Bario 1,175% BaCl*2H2O(ac) para preparación del Estándar de Mc
Farland
Ácido sulfúrico 1% H2SO4 (ac) para preparación del Estándar de Mc Farland
3.2.5. Determinación de Etanol
Agua destilada.
Muestra de bebidas gaseosas caducadas fermentadas.
3.3. Procedimiento
3.3.1. Análisis de la materia prima
3.3.1.1. Preparar mezclas con tres tipos de bebidas gaseosas caducadas Coca Cola,
Fioravanti Fresa y Sprite debido su alto contenido de azúcares y dosificar en
diferentes proporciones, en función de la concentración de azúcar, es decir:
Coca Cola (48%), Fioravanti Fresa (48%) y Sprite (42%)
3.3.1.2. Analizar los ingredientes de la mezcla de bebidas gaseosas caducadas.
3.3.1.3. Determinar la cantidad de nitrógeno, fósforo y potasio presentes en las bebidas
para suplementar a la levadura.
3.3.1.4. Realizar un medio de cultivo a diferentes pH con la mezcla de bebidas gaseosas
caducadas para determinar el pH de trabajo.
3.3.2. Preparación del medio de cultivo
3.3.2.1. Preparar un litro de la solución de mezcla de bebidas gaseosas caducadas sin
evaporación (10 °Brix) y añadirle la alimentación correspondiente.
26
3.3.2.2. Colocar 200 ml de la mezcla en 5 matraces etiquetadas con diferente pH: 3,5; 4;
4,5; 5; 5,5.
3.3.2.3. Regular el pH de cada matraz según corresponda con el ácido cítrico.
3.3.2.4. Añadir el agar para cada caso y dejar hervir hasta que el agar se haya disuelto
en la mezcla, inmediatamente esterilizar todos los materiales a utilizarse.
3.3.2.5. Mantener los matraces a baño maría herméticamente tapados a 40 °C.
3.3.3. Siembra para el medio de cultivo en placa
3.3.3.1. Pesar asépticamente una porción de levadura: 10 g.
3.3.3.2. Añadir el diluyente: 90 ml de agua peptonada en dilución 1/10 en un matraz,
ésta será la solución madre.
3.3.3.3. Realizar las diluciones seriadas decimales a partir de la solución madre y coloc
arlos en tubos de ensayo: 1/10-1
; 1/10-2
; 1/10-3
; 1/10-4
; 1/10-5
; 1/10-6
y 1/10-7
.
3.3.3.4. Ejecutar el medio de cultivo de recuento en placa.
3.3.3.5. Preparar 1 litro de mezcla de bebidas gaseosas y añadir los reactivos como
fuente alimenticia para las levaduras.
3.3.3.6. Separar 200 ml de mezcla en 5 matraces y ajustar a los diferentes pH con ácido
cítrico.
3.3.3.7. Colocar la cantidad de agar necesaria para cada caso con el fin de solidificar el
medio y hervir durante 20 minutos.
3.3.3.8. Esterilizar todos los materiales y soluciones a 1,5 Pascal de presión durante 15
minutos a 120°C.
3.3.3.9. Esterilizar el medio ambiente con la ayuda de un mechero.
3.3.3.10. Colocar 25 ml del medio de cultivo en cada caja Petri creando un ambiente
estéril con un mechero, hacerlo por triplicado y dejar enfriar.
3.3.3.11. Cultivar con el asa calibrada cada caja Petri con la dilución de 1*10-7
en forma
de estrías.
3.3.3.12. Etiquetar a todas las cajas Petri con cada pH y el tiempo en el que fueron
sembradas.
3.3.3.13. Incubar las levaduras durante 48 horas a una temperatura de 30°C.
27
3.3.4. Fermentación alcohólica
3.3.4.1. Medir volúmenes en igual proporción de cada gaseosa (Coca Cola, Sprite,
Fioravanti Fresa).
3.3.4.2. Retirar el gas carbónico presente en la mezcla con un agitador.
3.3.4.3. Determinar la densidad por el método del picnómetro a temperatura ambiente.
3.3.4.4. Evaporar la mezcla hasta obtener el grado Brix requerido (12, 14, 16, 18).
3.3.4.5. Tomar 30 ml y determinar la densidad de la mezcla concentrada con el
picnómetro.
3.3.4.6. Esterilizar los materiales y la mezcla utilizando una autoclave.
3.3.4.7. Colorar la fuente nutritiva para la levadura.
3.3.4.8. Regular el pH de la mezcla al valor de 5.5 con ácido cítrico 0.1 M y bicarbonato
de sodio 0.2 M.
3.3.4.9. Determinar la cantidad de azúcares reductores.
3.3.4.10. Colocar la levadura.
3.3.4.11. Separar el 20% de la mezcla para activar la levadura durante 30 minutos a
30°C.
3.3.4.12. El 80% restante colocarla en el biorreactor para que se estabilice a la
temperatura deseada.
3.3.4.13. Mezclar la levadura activada y la mezcla en el biorreactor.
3.3.4.14. Tomar muestras cada hora y media para monitoreo de azúcares reductores,
biomasa y etanol.
3.3.4.15. La fermentación termina cuando no exista producción de gas carbónico en el
biorreactor.
3.3.4.16. Cuantificar el contenido de etanol en las muestras.
3.3.5. Determinación de biomasa
3.3.5.1. Preparar la solución de ácido sulfúrico añadiendo a 90 ml de agua destilada 1
ml de ácido sulfúrico concentrado utilizando una pipeta.
3.3.5.2. Preparar la solución de cloruro de bario pesando 1.175 g de cloruro en un vidrio
reloj a un matraz y diluir con agua destilada a 100 ml.
28
3.3.5.3. Adicionar cantidades crecientes de cloruro de bario en ácido sulfúrico en cada
tubo enumerado de acuerdo a la tabla 7.
3.3.5.4. Encender el espectrofotómetro 30 minutos antes del análisis
3.3.5.5. Agitar vigorosamente cada tubo de ensayo con cada solución.
3.3.5.6. Leer el % de transmitancia para cada muestra en el espectrofotómetro a una
longitud de onda de 915 nm.
3.3.5.7. Transformar el % de transmitancia a absorbancia.
3.3.5.8. Realizar la curva de calibración Absorbancia = f (concentración).
3.3.5.9. Encontrar la ecuación de la curva de calibración y despejar la concentración.
3.3.5.10. Tomar 1 ml de la muestra problema y diluir en 9 ml, si está muy turbia hacer
más diluciones y tomar en cuenta en los cálculos.
3.3.5.11. Transformar el % de transmitancia a absorbancia.
3.3.6. Determinación de azúcares reductores
3.3.6.1. Tomar 10 ml de la muestra del biorreactor
3.3.6.2. Filtrar con papel filtro en la bomba a vacío.
3.3.6.3. Tomar 1 ml de la muestra fermentada, diluir a 1°Brix.
3.3.6.4. Añadir en un matraz de 100 ml, 5 ml de Fehling A, 5 ml de Fehling B, 40 ml de
agua destilada y 2 ml de la muestra de 1 °Brix.
3.3.6.5. Hervir durante 2 minutos exactamente y enfriar a temperatura ambiente.
3.3.6.6. Añadir 10 ml al 10% v/v de ácido sulfúrico (H2SO4) (ac) y 10 ml al 10%v/v de
yoduro de potasio (KI)(ac)
3.3.6.7. Titular con tiosulfato de Sodio 0,1 molar (Na2S2O3) (ac).
3.3.6.8. Calcular la cantidad de azúcar reductor en la mezcla en %p/p.
3.3.7. Determinación de etanol
3.3.7.1. Tomar 10 ml de muestra del biorreactor
3.3.7.2. Filtrar cada muestra
3.3.7.3. Destilar toda la muestra
3.3.7.4. Medir el %V/V de etanol en el densímetro.
29
3.4. Diagrama de flujo
Figura 8. Diagrama de flujo del proceso de modelación cinética de la fermentación alcohólica a partir de bebidas gaseosas
caducada
Monitoreo
de etanol Modelado
cinético Muestreo
Materia Prima
(Bebidas gaseosas
caducadas mezcla)
Análisis fisicoquímico
y azúcares reductores
de la mezcla de
gaseosas caducadas
Desgasificación
Ajuste de
pH
ácido cítrico
NaHCO3
Evaporación Esterilización
Enfriamiento
Fermentación
Inoculación
levadura
Filtración Monitoreo de
biomasa y
azúcares
reductores
H2O
(vap)
Biorreactor
T=120°C; t=30min
T=30°C
T=30°C; t=15min
20%sustrato
80%sustrato T=30°C; t=12horas
NH4PO
3,
K(SO4) MgSO
4
Zn(SO4)
CO2(gas)
∞
30
3.5. Datos experimentales
3.5.1. Condiciones iniciales de la mezcla
Tabla 5. Datos de generación de Unidad Formadora de Colonias de Saccharomyces C.
en el medio de cultivo agar – bebidas gaseosas caducadas
Réplicas
pH
Número de colonias contadas
1 2 3
3,5 1 4 2
4 2 3 1
4,5 4 6 7
5 5 6 11
5,5 12 15 14
3.5.2. Datos para calcular densidad de la mezcla
Tabla 6. Masa de picnómetro y de la mezcla de bebidas caducadas
Réplicas
Masa, (g) 1 2 3
M1 23,26 23,26 23,25
M2 47,86 47,82 47,83
M3-1 48,90 48,88 48,99
M3-2 49,07 49,12 48,90
M3-3 53,75 48,90 48,89
M3-4 49,48 54,16 49,58
M3-5 49,68 49,72 49,67
Dónde:
M1 = Masa del picnómetro vacío
M2 = Masa del picnómetro + agua destilada
M3-1 = Masa del picnómetro + mezcla de bebidas gaseosas con 10 °Brix (Casos A y B)
31
M3-2 = Masa del picnómetro + mezcla de bebidas gaseosas con 12 °Brix (Casos C y D)
M3-3 = Masa del picnómetro + mezcla de bebidas gaseosas con 14 °Brix (Casos E y F)
M3-4 = Masa del picnómetro + mezcla de bebidas gaseosas con 16 °Brix (Casos G y H)
M3-5 = Masa del picnómetro + mezcla de bebidas gaseosas con 18 °Brix (Casos I y J)
3.5.3. Datos de los estándares de Mc Farland para calcular la biomasa
Tabla 7. Estándares de Mc Farland para calcular la biomasa (Wickerham, 1951)
N Estándar Mc
Farland
BaCl2• 2H2O (1.175%),
ml
H2SO4 (1%),
ml
No. De bacterias
(108) /ml
1 0,5 0,5 99,5 1,5
2 1 1 99,0 3
3 2 2 98,0 6
4 3 3 97,0 9
5 4 4 96,0 12
6 5 5 95,0 15
7 6 6 94,0 18
8 7 7 93,0 21
3.5.4. Datos para graficar la curva de calibración para biomasa
Tabla 8. Número de bacterias, transmitancia y absorbancia para graficar la curva
de calibración
Estándar Mc Farland No. De bacterias Transmitancia Absorbancia
Ufc*(108) /ml %, 915 nm 915 nm
0,5 1,5 31,799 0,4971
1 3 29,136 0,5354
2 6 12,668 0,8972
3 9 9,636 1,0158
4 12 5,321 1,274
5 15 4,531 1,3436
6 18 2,079 1,6819
7 21 1,474 1,8318
32
3.5.5. Datos del monitoreo de formación de etanol mediante densimetría. - Las
condiciones para el monitoreo de producción de etanol durante el proceso de fermentación
son: volumen de la mezcla de un litro a una temperatura constante de 30°C, un pH de 5,5,
el tiempo = 0 representa el tiempo inicial de fermentación
Tabla 9. Datos de etanol en % volumen/volumen (%V/V)
Condición de 2% de levadura Condición de 4% de levadura
N Tiempo °Brix Caso Réplicas, %v/v etanol Caso Réplicas, %v/v etanol
horas E1 E2 E3 E1 E2 E3
1 0
10
A
0 0 0,0
B
0 0 0,0
2 1,5 0,53 0,80 0,4 1,00 0,96 0,9
3 3 0,90 1,20 0,9 1,40 1,60 1,3
4 4,5 1,58 1,90 1,1 2,50 2,80 2,4
5 6 1,93 2,40 1,5 3,40 3,21 3,1
6 7,5 2,55 2,85 2,2 3,60 3,70 3,5
7 9 3,03 3,30 2,6 3,90 4,00 3,7
8 10,5 3,50 3,80 3,6 4,40 4,46 4,2
9 12 3,90 4,20 3,8 5,20 5,00 5,1
1 0
12
C
0,00 0,00 0,0
D
0,00 0,00 0,0
2 1,5 0,95 1,13 1,2 1,77 2,40 2,0
3 3 1,51 1,58 1,8 2,79 3,23 2,8
4 4,5 2,57 2,68 3,1 4,90 4,43 3,9
5 6 3,03 3,40 3,9 5,74 5,69 5,7
6 7,5 4,72 5,05 5,2 7,20 7,40 7,3
7 9 6,04 6,22 6,6 6,80 7,10 7,0
8 10,5 6,85 7,20 7,3 6,50 6,80 6,7
9 12 6,15 6,45 6,5 6,30 6,60 6,8
1 0
14
E
0,00 0,00 0,0
F
0,00 0,00 0,0
2 1,5 0,89 1,41 1,2 2,42 2,31 2,9
3 3 2,27 2,33 2,3 3,73 3,48 3,5
4 4,5 4,00 4,05 4,0 4,99 5,37 5,4
5 6 5,10 5,60 5,3 5,71 5,40 6,1
6 7,5 5,60 6,00 5,9 7,41 7,67 7,8
7 9 6,00 6,45 6,3 8,50 8,10 8,2
8 10,5 6,82 7,18 6,8 8,20 7,70 8,1
9 12 7,70 8,03 8,0 8,00 7,30 7,8
33
Tabla 10. Continuación de datos de etanol en % volumen/volumen (%V/V)
Condición de 2% de levadura Condición de 4% de levadura
N Tiempo °Brix Caso Réplicas, %v/v etanol Caso Réplicas, %v/v etanol
Horas E1 E2 E3 E1 E2 E3
1 0
16
G
0,00 0,00 0,0
H
0,00 0,00 0,0
2 1,5 2,80 3,73 1,8 2,90 3,35 3,2
3 3 2,83 4,43 3,4 4,20 4,80 4,5
4 4,5 4,23 5,57 4,9 5,63 6,33 5,9
5 6 6,36 7,27 6,8 6,54 7,51 6,7
6 7,5 7,12 8,87 7,4 7,80 8,57 8,5
7 9 7,50 9,30 8,5 9,40 10,01 9,7
8 10,5 8,30 9,40 8,8 9,80 10,70 10,4
9 12 8,75 8,40 8,7 10,90 11,10 11,0
1 0
18
I
0,00 0,00 0,0
J
0,00 0,00 0,0
2 1,5 2,38 1,99 1,8 4,90 5,80 5,3
3 3 4,77 4,27 4,2 7,60 7,80 7,6
4 4,5 6,47 5,81 5,8 8,00 8,45 8,3
5 6 8,00 7,85 7,1 8,95 9,50 9,1
6 7,5 9,50 8,90 8,9 9,45 9,90 9,6
7 9 10,20 9,90 9,5 10,15 10,70 10,3
8 10,5 9,62 9,67 9,6 11,10 11,50 11,4
9 12 9,50 8,60 7,7 10,67 10,87 10,2
3.5.6. Datos del monitoreo de consumo de azúcares reductores mediante titulación. -
Las condiciones para el monitoreo del consumo de azúcares reductores en el proceso de
fermentación son: volumen de la mezcla de un litro a una temperatura constante de 30°C ,
un pH de 5,5, el tiempo = 0 representa el tiempo inicial de fermentación
34
Tabla 11. Datos de volumen de tiosulfato de sodio consumido en la titulación para
determinar la concentración de azúcares reductores
2%Levadura 4%Levadura
tiempo Réplicas, volumen en ml Réplicas, volumen en ml
N horas °Brix Caso V1 V2 V3 Caso V1 V2 V3
1 0
10
A
16,7 16,9 16,8
B
16,7 16,9 16,8
2 1,5 17,5 17,6 17,5 17,9 18,2 18,0
3 3 18,2 18,4 18,4 19,4 19,4 19,4
4 4,5 19,7 19,7 19,6 20,6 20,6 20,6
5 6 20,9 20,9 20,9 21,8 21,8 21,9
6 7,5 22,0 22,0 21,9 22,7 22,8 22,7
7 9 22,7 22,7 22,7 23,3 23,3 23,3
8 10,5 23,5 23,5 23,4 23,7 23,7 23,7
9 12 23,6 23,5 23,6 23,9 24,0 23,9
1 0
12
C
10,9 11,2 11,0
D
11,2 11,2 10,9
2 1,5 12,9 12,8 12,7 14,7 14,5 14,6
3 3 13,7 14,5 14,2 17,2 14,5 17,4
4 4,5 16,4 16,4 16,4 19,0 19,0 19,0
5 6 17,8 17,8 17,9 20,5 20,5 20,4
6 7,5 19,4 19,4 19,6 21,7 21,8 21,8
7 9 20,9 20,7 20,9 22,8 22,4 22,8
8 10,5 21,5 22,5 22,0 23,3 22,8 23,1
9 12 22,2 22,9 23,1 23,5 23,3 23,4
1 0
14
E
9,2 9,4 9,3
F
9,3 9,2 9,6
2 1,5 12,6 12,0 12,5 15,4 16,0 15,6
3 3 13,9 13,7 14,0 17,6 18,1 17,8
4 4,5 15,9 15,7 15,8 19,9 20,3 20,2
5 6 17,2 17,4 17,1 22,0 22,0 22,1
6 7,5 19,5 19,5 19,5 22,6 22,8 22,7
7 9 20,7 20,7 20,8 22,7 23,1 22,8
8 10,5 22,0 22,1 22,1 23,1 23,2 22,9
9 12 22,7 22,4 22,6 23,3 23,2 23,4
1 0
16
G
5,3 5,1 5,5
H
5,4 5,0 5,3
2 1,5 10,1 10,3 10,2 12,4 12,1 12,4
3 3 13,7 13,2 13,4 15,0 15,0 15,2
4 4,5 13,8 14,4 14,2 18,3 18,1 18,2
5 6 16,1 15,7 16,0 20,5 20,1 20,3
6 7,5 18,5 18,3 18,2 22,4 22,4 22,3
7 9 19,2 19,5 19,2 22,8 22,7 22,8
8 10,5 21,6 21,4 21,5 22,9 22,7 22,9
9 12 22,2 22,3 22,0 23,1 23,2 23,0
35
Tabla 12. Continuación de datos de volumen de tiosulfato de sodio consumido en la
titulación para determinar la concentración de azúcares reductores
2%Levadura 4%Levadura
tiempo Réplicas, volumen en ml Réplicas, volumen en ml
N horas °Brix Caso V1 V2 V3 Caso V1 V2 V3
1 0
18
I
4,8 4,8 4,5
J
4,8 4,8 4,5
2 1,5 10,5 10,3 10,2 10,5 10,3 10,2
3 3 13,7 13,6 13,7 13,7 13,6 13,7
4 4,5 15,3 14,5 15,0 15,3 14,5 15,0
5 6 16,0 15,6 16,0 16,0 15,6 16,0
6 7,5 17,0 16,8 17,1 17,0 16,8 17,1
7 9 19,4 19,7 19,4 19,4 19,7 19,4
8 10,5 20,1 20,1 20,1 20,1 20,1 20,1
9 12 21,7 21,6 21,9 21,7 21,6 21,9
3.5.7. Datos del monitoreo de generación de biomasa. - Las condiciones para el proceso
de fermentación son: volumen de la mezcla de un litro a una temperatura constante de
30°C, un pH de 5,5 y el tiempo = 0 representa el tiempo inicial de fermentación
Tabla 13. Datos de generación de biomasa en % de transmitancia
2%lev g/l de Biomasa 4%lev g/l de Biomasa
N tiempo °Brix Caso Repeticiones, % de
Transmitancia
Caso Repeticiones, % de Transmitancia
horas T1 T2 T3 T1 T2 T3
1 0
10 A
30,67 30,60 30,62
B
30,67 30,60 30,62
2 1,5 29,31 29,44 29,69 29,31 29,44 29,69
3 3 28,09 28,01 28,23 28,09 28,01 28,23
4 4,5 25,78 25,61 25,91 25,78 25,61 25,91
5 6 21,52 21,34 21,67 21,52 21,34 21,67
6 7,5 16,62 16,56 16,82 16,62 16,56 16,82
7 9 12,62 12,47 12,67 12,62 12,47 12,67
8 10,5 12,20 12,14 12,30 12,20 12,14 12,30
9 12 12,30 12,21 12,38 12,30 12,21 12,38
36
Tabla 14. Continuación de datos de generación de biomasa en % de transmitancia
2%lev g/l de Biomasa 4%lev g/l de Biomasa
N tiempo °Brix Caso Repeticiones, % de Transmitancia Caso Repeticiones, % de Transmitancia
horas T1 T2 T3 T1 T2 T3
1 0
12
C
25.76 25.89 25.92
D
18.06 17.13 17.34
2 1,5 25.13 25.36 25.18 17.05 16.02 16.42
3 3 24.00 24.06 24.13 16.03 15.29 15.66
4 4,5 21.62 22.03 22.53 13.74 12.89 13.61
5 6 18.28 18.60 18.36 10.51 9.73 10.09
6 7,5 14.26 14.29 14.26 7.69 7.17 7.51
7 9 10.83 10.87 10.63 6.13 5.75 5.94
8 10,5 10.04 10.26 10.18 5.66 5.30 5.60
9 12 10.39 10.33 10.31 5.56 5.19 5.56
1 0
14
E
25,76 25,89 25,92
D
18,06 17,13 17,34
2 1,5 25,13 25,36 25,18 17,05 16,02 16,42
3 3 24,00 24,06 24,13 16,03 15,29 15,66
4 4,5 21,62 22,03 22,53 13,74 12,89 13,61
5 6 18,28 18,60 18,36 10,51 9,73 10,09
6 7,5 14,26 14,29 14,26 7,69 7,17 7,51
7 9 10,83 10,87 10,63 6,13 5,75 5,94
8 10,5 10,04 10,26 10,18 5,66 5,30 5,60
9 12 10,39 10,33 10,31 5,56 5,19 5,56
1 0
16
G
25,51 23,82 24,40
F
16,03 15,06 16,15
2 1,5 25,04 23,37 23,57 15,98 14,92 7,65
3 3 23,45 21,42 23,36 15,11 14,25 14,29
4 4,5 18,77 17,58 17,53 11,80 11,13 11,78
5 6 14,48 14,32 13,22 8,11 7,62 7,87
6 7,5 11,60 11,82 11,94 6,04 5,66 5,83
7 9 8,57 8,89 8,24 4,49 4,21 4,49
8 10,5 7,43 6,94 7,35 4,09 3,62 4,16
9 12 7,29 6,94 7,07 3,97 3,70 3,95
1 0
18
I
22,26 20,92 21,54
H
12,41 11,69 12,30
2 1,5 21,46 20,32 21,39 12,15 12,21 12,32
3 3 20,51 18,95 20,42 11,75 11,30 11,90
4 4,5 16,70 15,40 17,11 10,16 9,68 9,63
5 6 12,90 12,53 12,24 7,31 6,90 6,97
6 7,5 9,04 9,03 9,40 5,52 5,03 5,27
7 9 7,29 6,90 6,96 3,95 3,93 3,85
8 10,5 6,41 6,58 5,53 3,36 3,41 3,34
9 12 6,48 6,06 6,05 3,32 3,29 3,24
37
4. CÁLCULOS
4.1. Cálculo el número de microorganismos para definir el pH previo a la
fermentación
Con una dilución de 1/10-7
, se cultivó las levaduras empleando el método de recuento en
placa y se cuantificó con el Contador de Microorganismos.
4.1.1. Cálculo modelo de la cantidad de microorganismos presentes para el pH=3,5. -
Los cálculos están basados en la Norma Inen 1529-1991 de Control microbiológico de los
alimentos. Mohos y levaduras viables. Recuentos en placa por siembra en profundidad.
Anexo A
( ) (13)
Dónde:
N= número de unidades propagadoras de levaduras en cada 0.002ml de muestra
∑C= suma de las colonias contadas en todas las placas ensayadas
n1= número de placas contadas de la dilución seleccionada
n2= número de placas contadas de la segunda dilución seleccionada
d= dilución de la cual se obtuvieron los recuentos
V= volumen del inóculo sembrado en cada placa
( ( ))
Ufc de levaduras/ml
38
Mediante un medio de cultivo de bebidas gaseosas caducadas-agar se escogió el mejor
resultado del crecimiento del microorganismo a un pH de 5,5.
Cálculo de la densidad inicial de la mezcla de gaseosas caducadas sin evaporación
mediante el método del picnómetro.
Cálculo modelo para densidad caso A sin evaporación:
(14)
1,042 g/ml
Cálculo modelo para densidad caso C con evaporación:
(15)
1,049 g/ml
4.1.2. Cálculo de la masa de la mezcla de gaseosas caducadas
Cálculo modelo para la masa caso A sin evaporación:
(16)
39
Cálculo modelo de la masa para el caso C con evaporación:
(17)
4.2. Balance de masa para el proceso de evaporación
Con el balance de masa se obtiene la concentración de los azúcares requeridos para 1 litro
de mezcla final.
4.2.1. Cálculo modelo para el caso C = 12°Brix
Figura 9. Diagrama de flujo del proceso de evaporación
Sustancia % x
Agua 100 1
Azúcar 0 0
Total 100 1
Sustancia % x
Agua 90 0,9
Azúcar 10 0,1
Total 100 1
Sustancia % x
Agua 88 0,88
Azúcar 12 0,12
Total 100 1
Evaporación
Mezcla de bebidas
gaseosas caducadas
Evaporado
Concentrado
1.000 ml
40
4.2.2. Planteo de ecuaciones
Balance General:
10
Balance para el agua:
11
Balance para el azúcar:
12
Reemplazando valores se tiene:
(1) ( )
(2) ( )
De (2)
De (1)
Se calcula el volumen necesario para evaporar la muestra de bebidas caducadas
(18)
41
4.3. Cálculo de la concentración de formación de etanol
Para calcular los g/l de etanol es necesario utilizar la densidad del etanol puro ρ etanol =
0,789 g/ml
4.3.1. Cálculo modelo de la concentración de etanol para el caso A
( )
( )
4.4. Cálculo de la concentración de azúcares reductores presentes en la mezcla por
titulación
Los cálculos se realizaron con respecto al método de Mettler Toledo para cuantificación de
azúcares reductores por titulación. Anexo B
4.4.1. Cálculo modelo de la concentración de azúcares reductores para el caso A
( )
(19)
(20)
Dónde:
Ba = ml de tiosulfato de sodio consumidos con la muestra en blanco,
V1 = ml de tiosulfato de sodio consumidos con la mezcla,
c = concentración de tiosulfato de sodio, 0.1 molar
M = peso molecular de la glucosa, g/mol
z = equivalente molar en la ecuación estequiométrica
m = cantidad de muestra a titular
42
f = factor de conversión
Volumen de tiosulfato de sodio consumido con la mezcla en blanco = 24,46 ml
Volumen de tiosulfato de sodio consumido con la mezcla de bebidas gaseosas = 16, ml
( )
( ) (
) (
)
4.4.2. Cálculo modelo para la conversión de consumo de azúcares reductores caso A
Tiempo: 1,5 horas ( ) (21)
(22)
= 0,09
4.5. Cálculo de la cantidad de levadura necesaria para fermentar
4.5.1. Cálculo modelo de la concentración de levadura para 2% de levadura
(23)
43
4.5.2. Cálculo modelo de la concentración de levadura para 4% de levadura
(24)
4.6. Cálculo de la cantidad de nutrientes necesarios para la levadura
Con las Tablas 1 y 3 se tiene referencia de los valores del suplemento alimenticio que
necesita la levadura.
En base a ello se calcula las cantidades de cada sal que requiere para el medio
fermentativo.
4.6.1. Cálculo modelo para fosfato de amonio caso A
( )
( ) ( )
( ) ( )
( ) ( )
4.6.2. Cálculo modelo para sulfato de potasio caso A
( )
( )
( )
( )
4.6.3. Cálculo modelo para sulfato de magnesio caso A
( )
( )
44
( )
4.6.4. Cálculo modelo para sulfato de zinc caso A
( )
( )
( )
4.7. Cálculos para determinación de biomasa por el método de espectrofotometría
4.7.1. Curva de calibración por el método Mc Farland
Figura 10. Curva de calibración de Mc Farland
4.7.2. Cálculo modelo de la biomasa para el caso A
La ecuación de la curva de calibración absorbancia= f (concentración celular) es:
(25)
Absorvancia = 7E-08 ufc/ml + 0,4173
R² = 0,9855
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
1,800
2,000
0,00E+00 5,00E+08 1,00E+09 1,50E+09 2,00E+09 2,50E+09
Ab
sorv
anci
a
Concentración de levadura, ufc*10^8/ml
Absorvancia=f(concentración)
45
Despejando la concentración de células se tiene:
(26)
Para el tiempo = 0
( ) (27)
( )
Reemplazando la absorbancia se tiene:
4.8. Ajuste del modelo cinético que caracteriza el proceso de fermentación alcohólica
de las bebidas gaseosas caducadas
Para este trabajo se escogieron los modelos de crecimiento microbiano de Monod debido a
su amplia utilización, de Moser por que se ha encontrado que se adapta mejor a los datos
experimentales al comienzo o al final de la fermentación, y Tessier debido a su ajuste más
46
cercano a la velocidad de reacción, utilizando una regresión de una función no lineal en el
simulador Polymath 6.1 se pueden estimar los valores de los parámetros cinéticos.
Después de un análisis de los datos experimentales, se realizó el modelamiento matemático
del proceso fermentativo, calculando los parámetros µmax (velocidad máxima de
crecimiento microbiano) y Ks (afinidad del sustrato con el microorganismo). El modelado
cinético se referirá a los mejores casos de conversión con evaporación y sin evaporación
con respecto a la mayor obtención de etanol: Casos A, B sin evaporación, J e I con
evaporación. Los cálculos modelos se referirán al caso A
4.8.1. Cálculo modelo de la velocidad de reacción experimental para el caso A.
Condiciones: 10°Brix sin evaporación, pH= 5,5, 2% levadura.
Figura 11. Concentración de biomasa en función del tiempo Caso A
Cálculo de la velocidad de reacción:
(28)
Derivando la ecuación se tiene:
Cx = 0,0005*t5 - 0,0149*t4 + 0,1528*t3 - 0,5086*t2 +
0,735*t + 2,7548
R² = 0,9965
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
Conce
ntr
ació
n d
e cé
lula
s, g
l
Tiempo, horas
Cx=f(tiempo) CASO A
47
(
) ( ) ( ) ( ) (
) ( ) (29)
(
) ( ) ( ) ( ) ( )
(30)
Para t=0 (
) g/l*h
4.9. Cálculo modelo para determinar los parámetros µmax y Ks mediante la
linealización de la ecuación de Monod
Al reemplazar la ecuación de Monod en la ecuación de velocidad de reacción se puede
linealizar la expresión obteniendo la ecuación de Hanes Woolf multiplicada por la
concentración de células se tiene Cx*Cs/rx en función
de (Cs):
(31)
(32)
(33)
(34)
(
)
(35)
Con los datos experimentales se obtienen una ecuación de la forma y = a*x + b, con ellos
se puede encontrar la pendiente (a) y el término independiente (b).
48
Tabla 15. Linealización de la ecuación de Monod
tiempo Cx Cs rx exp Cx/rx Cx*Cs/rx
horas g/l g/l g/l*h horas hora*g/l
0 1,381 68,954 0,56 2,453 169,139
1,5 1,616 62,469 0,59 2,728 170,432
3 1,912 55,099 0,66 2,882 158,806
4,5 2,452 42,989 0,72 3,424 147,212
6 3,572 32,040 1,21 2,944 94,330
7,5 5,155 22,521 1,55 3,328 74,956
9 6,896 15,617 1,77 3,906 61,006
10,5 7,083 9,056 2,09 3,394 30,733
12 7,042 8,182 1,35 5,224 42,742
Figura 12. Linealización de la ecuación de Monod para el caso A
Dónde:
m =
= 2,969 b =
= 16,532
Ks = 16,532*0,3709
h-1
Ks = 6,1320 g/l
Cx*Cs/rx = 2,696*Cs + 16,532
R² = 0,955
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Cx*C
s/rx
, g*h
/l
Cs, g/l
CASO A: Linealización de la ecuación de
Monod
49
Reemplazando valores, la velocidad de reacción expresada para Monod es:
, g/l*h (36)
A partir de la Linealización de la ecuación de Monod se obtienen las constantes Ks y ,
con ellas se encuentra la velocidad de reacción para cada modelo cinético con el simulador
Polymath 6.1.
4.10. Cálculo de la tasa de rendimiento de biomasa/sustrato, producto/biomasa y
producto/sustrato ( ).
Se calculan a partir de las pendientes de la resta de cada una de las eficiencias a obtener
Figura 13. Rendimiento de biomasa en función del producto caso A
(Cx-Cxo) = 0,1021(Cp-Cpo) - 0,7027
R² = 0,9391
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60 70
Cx-C
xo
, g/l
Cp-Cpo, g/l
CASO A: Y x/s
50
Figura 14. Rendimiento de producto en función de la biomasa caso A
Figura 15. Eficiencia producto en función del sustrato (Cp-Cpo = f (Cso-Cs))
Las pendientes corresponden a los rendimientos , por tanto, los valores de
rendimiento para biomasa/sustrato, producto/biomasa y producto/sustrato son:
Caso A:
Rendimiento Biomasa/Sustrato:
Rendimiento Biomasa/Producto:
Rendimiento Producto/Sustrato:
Cx-Cxo = 0,2176(Cp-Cpo) - 0,7053
R² = 0,9357
0,0
1,5
3,0
4,5
6,0
7,5
0 10 20 30 40
Cx
-Cx
o g
/l
Cp-Cpo, g/l
CASO A: Y x/p
(Cp-Cpo) = 0,4635(Cso-Cs) - 0,2146
R² = 0,9786
0,0
5,5
11,0
16,5
22,0
27,5
33,0
0,0 10,5 21,0 31,5 42,0 52,5 63,0 73,5
Cp-C
po,
g/l
Cso-Cs, g/l
CASO A: Yp/s
51
5. RESULTADOS
5.1. Resultados de la cantidad de microorganismos para cada pH ensayado
Tabla 16. Cuantificación de unidad propagadora de levadura en cada ml
pH N,
Ufc/ml
3,5 1,17E+10
4 1,00E+10
4,5 2,83E+10
5 3,67E+10
5,5 6,83E+10
Por lo tanto, el pH a utilizar en la fermentación de bebidas gaseosas caducadas es el de 5,5
5.2. Resultados de densidad
Tabla 17. Densidad de las mezclas a diferentes °Brix
Réplicas
densidad,
(g/ml) 1 2 3
ρ 3-1 1,042 1,042 1,046
ρ 3-2 1,049 1,051 1,042
ρ 3-3 1,240 1,042 1,042
ρ 3-4 1,066 1,256 1,070
ρ 3-5 1,074 1,076 1,074
52
5.3. Resultados de conversión de consumo de sustrato
5.3.1. Resultados para conversión de consumo de sustrato para los casos A, C, E, G, I
Tabla 18. Conversión de consumo de sustrato al 2% para los casos A, C, E, G, I
Conversión 2%
t, horas 10 brix 12 brix 14 brix 16 brix 18 brix
Caso A C E G I
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
1,5 0,09 0,13 0,20 0,26 0,29
3 0,20 0,23 0,30 0,43 0,45
4,5 0,38 0,40 0,43 0,46 0,52
6 0,54 0,51 0,52 0,55 0,57
7,5 0,67 0,63 0,67 0,68 0,62
9 0,77 0,73 0,75 0,73 0,75
10,5 0,87 0,82 0,84 0,84 0,78
12 0,88 0,87 0,87 0,88 0,86
5.3.2. Resultados para conversión de consumo de sustrato para los casos B, D, F, H, J
Tabla 19. Conversión de consumo de sustrato al 4% para los casos B, D, F, H, J
Conversión 4%
t, horas 10 brix 12 brix 14 brix 16 brix 18 brix
Caso B D F H J
0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
1,5 0,16 0,26 0,42 0,37 0,49
3 0,34 0,46 0,56 0,51 0,59
4,5 0,50 0,59 0,71 0,67 0,77
6 0,66 0,70 0,84 0,78 0,86
7,5 0,77 0,80 0,88 0,89 0,90
9 0,85 0,87 0,90 0,91 0,93
10,5 0,90 0,90 0,91 0,92 0,95
12 0,94 0,92 0,92 0,93 0,95
53
5.4. Diagramas de conversión de sustrato en función del tiempo para todos los casos
5.4.1. Diagrama de conversión de sustrato en etanol en función del tiempo para 2%
de levadura casos: A, C, E, G, I
Figura 16. Conversión de sustrato para 2% de levadura casos: A, C, E, G, I
5.4.2. Diagrama de conversión de sustrato en etanol en función del tiempo para 4%
de levadura casos: B, D, F, H, J
Figura 17. Conversión de sustrato para 4% de levadura casos: B, D, F, H, J
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12
con
ver
sió
n
Tiempo, horas
Conversión de sustrato al 2%
10 brix 12 brix 14 brix 16 brix 18 brix
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
con
ver
sió
n
Tiempo, horas
Conversión de sustrato al 4%
10 brix 12 brix 14 brix 16 brix 18 brix
54
5.5. Resultados de etanol
Tabla 20. Concentración de etanol en g/l
Condición de 2% de levadura Condición de 4% de levadura
N Tiemp
o
°Brix Caso Réplicas, g/l etanol Caso Réplicas, g/l etanol
horas E1 E2 E3 E prom E1 E2 E3 Eprom
1 0
10
A
0,00 0,00 0,00 0,00
B
0,00 0,00 0,00 0,00
2 1,5 4,15 6,31 2,96 4,47 7,89 7,59 7,10 7,53
3 3 7,10 9,47 7,10 7,89 11,05 12,65 10,47 11,39
4 4,5 12,47 14,99 9,05 12,17 19,73 22,09 18,88 20,23
5 6 15,20 18,94 11,78 15,31 26,83 25,36 24,46 25,55
6 7,5 20,15 22,46 17,62 20,07 28,40 29,19 27,62 28,40
7 9 23,88 26,04 20,30 23,41 30,77 31,56 29,19 30,51
8 10,5 27,62 29,98 28,40 28,67 34,72 35,19 33,14 34,35
9 12 30,77 33,14 29,98 31,30 41,03 39,45 40,24 40,24
1 0
12
C
0,00 0,00 0,00 0,00
D
0,00 0,00 0,00 0,00
2 1,5 7,53 8,89 9,07 8,50 13,98 18,94 15,51 16,14
3 3 11,94 12,47 14,20 12,87 21,98 25,51 22,35 23,28
4 4,5 20,25 21,15 24,46 21,95 38,66 34,97 31,03 34,89
5 6 23,87 26,83 30,77 27,16 45,29 44,86 45,29 45,14
6 7,5 37,24 39,82 41,03 39,36 56,81 58,39 57,60 57,60
7 9 47,65 49,07 52,07 49,60 53,65 56,02 55,23 54,97
8 10,5 54,02 56,81 57,60 56,14 51,29 53,65 52,86 52,60
9 12 48,50 50,86 51,29 50,21 49,71 52,07 53,65 51,81
1 0
14
E
0,00 0,00 0,00 0,00
F
0,00 0,00 0,00 0,00
2 1,5 7,05 11,10 9,47 9,21 19,09 18,20 22,73 20,01
3 3 17,94 18,36 18,15 18,15 29,45 27,46 27,87 28,26
4 4,5 31,56 31,98 31,77 31,77 39,34 42,35 42,61 41,43
5 6 40,24 44,18 41,82 42,08 45,07 42,61 48,13 45,27
6 7,5 44,18 47,34 46,55 46,03 58,49 60,50 61,39 60,12
7 9 47,37 50,92 49,49 49,26 67,07 63,91 64,70 65,22
8 10,5 53,81 56,65 54,02 54,83 64,70 60,75 63,91 63,12
9 12 60,75 63,33 62,91 62,33 63,12 57,60 61,54 60,75
55
Tabla 21. Continuación de concentración de etanol en g/l
Condición de 2% de levadura Condición de 4% de levadura
N Tiempo °Brix Caso Réplicas, g/l etanol Caso Réplicas, g/l etanol
horas E1 E2 E3 Eprom E1 E2 E3 Eprom
1 0
16 G
0,00 0,00 0,00 0,00
H
0,00 0,00 0,00 0,00
2 1,5 22,09 29,47 14,20 21,92 22,88 26,46 25,25 24,86
3 3 22,35 34,99 26,83 28,06 33,14 37,87 35,51 35,51
4 4,5 33,40 43,93 38,66 38,66 44,44 49,97 46,55 46,99
5 6 50,18 57,34 53,65 53,72 51,60 59,29 53,07 54,65
6 7,5 56,18 69,96 58,39 61,51 61,54 67,60 66,73 65,29
7 9 59,18 73,38 67,07 66,54 74,17 78,96 76,53 76,55
8 10,5 65,49 74,17 69,43 69,70 77,32 84,42 82,06 81,27
9 12 69,01 66,28 68,64 67,98 86,00 87,58 86,79 86,79
1 0
18 I
0,00 0,00 0,00 0,00
J
0,00 0,00 0,00 0,00
2 1,5 18,78 15,67 13,94 16,13 38,66 45,76 41,82 42,08
3 3 37,62 33,65 32,87 34,71 59,96 61,54 60,33 60,61
4 4,5 51,03 45,81 45,81 47,55 63,12 66,70 65,49 65,10
5 6 63,12 61,91 56,28 60,44 70,59 74,96 71,80 72,45
6 7,5 74,96 70,22 70,22 71,80 74,53 78,11 75,74 76,13
7 9 80,48 78,11 74,96 77,85 80,06 84,42 81,27 81,92
8 10,5 75,94 76,27 75,69 75,97 87,58 90,74 89,95 89,42
9 12 74,96 67,85 60,75 67,85 84,21 85,74 80,48 83,48
5.6. Resultados de consumo de azúcares reductores
Tabla 22. Concentración de consumo de azúcares reductores en g/l
Condición de 2% de levadura Condición de 4% de levadura
N Tiempo °Brix Caso Réplicas, g/l Azúcar reductor Caso Réplicas, g/l Azúcar reductor
horas A1 A2 A3 Aprom A1 A2 A3 Aprom
1 0
10
A
69,58 68,25 69,03 68,95
B
69,55 68,24 69,25 69,01
2 1,5 62,85 62,25 62,31 62,47 59,18 56,09 58,23 57,83
3 3 55,99 54,91 54,40 55,10 45,49 45,94 45,85 45,76
4 4,5 42,90 42,67 43,40 42,99 34,34 34,43 34,87 34,55
5 6 32,36 32,06 31,69 32,04 23,97 23,82 23,15 23,65
6 7,5 22,55 22,32 22,69 22,52 15,97 15,34 15,57 15,63
7 9 15,59 15,78 15,49 15,62 10,67 10,33 10,61 10,53
8 10,5 8,99 9,00 9,18 9,06 6,96 6,98 6,98 6,97
9 12 8,03 8,52 8,00 8,18 4,65 4,02 4,65 4,44
56
Tabla 23. Continuación de concentración de consumo de azúcares reductores en g/l
Condición de 2% de levadura Condición de 4% de levadura
tiempo Réplicas, g/l Azúcar reductor Réplicas, g/l Azúcar reductor
N horas °Brix Caso A1 A2 A3 Aprom Caso A1 A2 A3 A prom
1 0
12
C
122,59 120,25 121,66 121,50
D
120,59 120,59 122,59 121,25
2 1,5 104,68 106,25 105,98 105,64 88,56 90,54 88,66 89,25
3 3 97,76 90,15 92,55 93,49 65,54 90,54 63,45 73,18
4 4,5 73,26 73,00 72,70 72,98 49,21 49,46 48,86 49,18
5 6 59,97 60,10 59,46 59,84 35,94 36,28 36,61 36,28
6 7,5 45,82 45,79 43,66 45,09 24,71 24,16 23,69 24,18
7 9 32,27 33,84 32,27 32,79 15,23 18,33 14,80 16,12
8 10,5 26,65 17,42 22,39 22,15 10,47 14,83 12,56 12,62
9 12 20,78 14,44 12,17 15,80 8,66 10,26 9,22 9,38
1 0
14
E
138,24 136,58 137,25 137,36
F
137,52 139,52 136,26 137,77
2 1,5 107,52 113,39 108,64 109,85 82,37 77,74 80,65 80,25
3 3 96,25 97,85 94,65 96,25 62,15 57,74 60,97 60,29
4 4,5 77,52 79,58 78,52 78,54 41,24 38,02 39,25 39,50
5 6 66,25 64,52 66,84 65,87 22,55 22,52 21,47 22,18
6 7,5 45,18 45,34 44,94 45,15 16,68 15,11 15,83 15,87
7 9 33,77 34,52 33,30 33,87 15,57 12,49 15,03 14,36
8 10,5 22,43 21,21 21,48 21,71 12,40 11,48 14,08 12,65
9 12 16,09 19,08 17,02 17,40 10,54 11,41 10,05 10,66
1 0
16
G
178,66 177,69 177,00 177,78
H
177,25 179,02 178,25 178,18
2 1,5 133,25 130,25 132,59 132,03 112,07 113,39 112,50 112,65
3 3 100,30 103,59 102,62 102,17 88,17 86,46 86,20 86,94
4 4,5 99,66 92,57 95,25 95,83 57,46 58,46 58,73 58,22
5 6 78,25 80,54 79,20 79,33 37,20 39,66 38,99 38,62
6 7,5 55,25 56,13 58,15 56,51 18,94 18,91 19,99 19,28
7 9 48,65 45,21 49,22 47,69 15,56 16,02 15,89 15,83
8 10,5 26,87 28,54 27,58 27,67 14,96 15,83 14,11 14,97
9 12 20,84 19,59 22,54 20,99 12,81 11,34 13,33 12,49
1 0
18
I
182,58 183,25 185,69 183,84
J
185,27 182,67 184,75 184,23
2 1,5 129,80 131,59 132,37 131,25 74,33 76,28 74,29 74,97
3 3 100,24 101,02 99,50 100,25 59,58 59,69 58,78 59,35
4 4,5 85,41 92,89 87,65 88,65 42,77 42,87 42,42 42,69
5 6 78,27 82,48 78,54 79,76 26,57 26,07 25,45 26,03
6 7,5 69,25 71,00 68,35 69,54 18,02 18,59 19,62 18,74
7 9 46,52 44,57 46,98 46,02 12,56 12,02 12,90 12,50
8 10,5 40,25 40,93 40,57 40,59 9,25 9,01 9,26 9,18
9 12 25,26 26,99 24,21 25,49 9,25 8,02 9,90 9,06
57
5.7. Resultados de generación de biomasa
Tabla 24. Concentración de generación de biomasa en g/l
Condición de 2% de levadura Condición de 4% de levadura
N tiempo °Brix Caso Réplicas, g/l biomasa Caso Réplicas, g/l biomasa
horas B1 B2 B3 Bprom B1 B2 B3 Bprom
1 0
10 A
1,37 1,39 1,38 1,38
B
2,85 2,70 2,73 2,76
2 1,5 1,65 1,63 1,57 1,62 3,12 3,03 3,24 3,13
3 3 1,92 1,93 1,89 1,91 3,47 3,32 3,57 3,45
4 4,5 2,45 2,49 2,42 2,45 4,42 4,29 4,53 4,42
5 6 3,57 3,62 3,53 3,57 6,13 6,18 6,21 6,17
6 7,5 5,17 5,19 5,10 5,15 8,20 8,15 7,82 8,06
7 9 6,88 6,95 6,86 6,90 9,47 9,36 9,57 9,47
8 10,5 7,09 7,12 7,04 7,08 9,86 9,79 10,13 9,93
9 12 7,04 7,09 7,00 7,04 10,08 9,99 9,99 10,02
1 0
12 C
2,45 2,42 2,41 2,43
D
4,66 4,99 4,91 4,85
2 1,5 2,61 2,55 2,59 2,58 5,01 5,40 5,25 5,22
3 3 2,89 2,88 2,86 2,88 5,40 5,69 5,54 5,54
4 4,5 3,54 3,42 3,29 3,42 6,35 6,75 6,41 6,50
5 6 4,58 4,47 4,55 4,54 8,01 8,50 8,27 8,26
6 7,5 6,12 6,11 6,12 6,12 9,95 10,38 10,10 10,15
7 9 7,83 7,81 7,94 7,86 11,36 11,75 11,55 11,56
8 10,5 8,30 8,17 8,21 8,23 11,85 12,27 11,92 12,02
9 12 8,09 8,12 8,13 8,11 11,97 12,40 11,97 12,11
1 0
14 E
2,51 2,94 2,79 2,75
F
5,40 5,78 5,35 5,51
2 1,5 2,63 3,06 3,01 2,90 5,41 5,84 9,99 7,08
3 3 3,04 3,60 3,06 3,23 5,76 6,13 6,11 6,00
4 4,5 4,42 4,82 4,84 4,70 7,30 7,66 7,31 7,42
5 6 6,03 6,10 6,59 6,24 9,62 10,01 9,81 9,81
6 7,5 7,41 7,28 7,22 7,31 11,45 11,85 11,67 11,66
7 9 9,29 9,05 9,52 9,29 13,29 13,68 13,29 13,42
8 10,5 10,17 10,59 10,23 10,33 13,86 14,62 13,76 14,08
9 12 10,29 10,59 10,48 10,45 14,06 14,48 14,09 14,21
58
Tabla 25. Continuación de concentración de generación de biomasa en g/l
Condición de 2% de levadura Condición de 4% de levadura
N tiempo °Brix Caso Réplicas, g/l biomasa Caso Réplicas, g/l biomasa
horas B1 B2 B3 Bprom B1 B2 B3 Bprom
1 0
16
G
3,36 3,75 3,56 3,56
H
6,98 7,35 7,04 7,13
2 1,5 3,59 3,93 3,61 3,71 7,11 7,09 7,03 7,08
3 3 3,87 4,36 3,89 4,04 7,32 7,56 7,24 7,38
4 4,5 5,14 5,65 4,99 5,26 8,23 8,52 8,56 8,44
5 6 6,75 6,93 7,07 6,91 10,27 10,62 10,57 10,49
6 7,5 8,95 8,96 8,71 8,87 12,01 12,59 12,30 12,30
7 9 10,29 10,63 10,57 10,50 14,08 14,12 14,24 14,15
8 10,5 11,09 10,92 12,00 11,34 15,10 15,00 15,13 15,08
9 12 11,02 11,43 11,44 11,29 15,17 15,21 15,31 15,23
1 0
18
I
3,67 3,66 3,70 3,68
J
7,16 7,59 7,36 7,37
2 1,5 3,80 3,85 3,83 3,83 7,43 7,71 7,42 7,52
3 3 4,13 4,12 4,24 4,16 7,72 8,02 7,82 7,85
4 4,5 5,61 5,69 5,57 5,63 9,15 9,59 9,21 9,32
5 6 8,10 8,00 8,01 8,04 11,62 11,93 11,62 11,73
6 7,5 9,71 9,89 9,95 9,85 13,36 13,71 13,56 13,54
7 9 11,71 11,96 11,38 11,68 15,11 15,54 15,28 15,31
8 10,5 11,51 11,86 11,56 11,64 15,76 16,06 16,03 15,95
9 12 11,99 11,59 11,65 11,74 16,10 16,39 15,84 16,11
59
5.8. Diagramas de producción de etanol en función del tiempo
En estas gráficas se puede observar que la producción de etanol en las dos condiciones de
levadura
5.8.1. Diagrama de la concentración de etanol para los casos: A, C, E, G, I
Figura 18. Concentración de etanol en función del tiempo para los casos: A, C, E, G, I
5.8.2. Diagrama de la concentración de etanol para los casos: B, D, F, H, J
Figura 19. Concentración de etanol en función del tiempo para los casos: B, D, F, H, J
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
Eta
no
l, g
/l
Tiempo, horas
Concentración de etanol al 2%
10 °brix 12 °brix 14 °brix 16 °brix 18 °brix
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
Eta
no
l, g
/l
Tiempo, horas
Concentración de etanol al 4%
10 °brix 12 °brix 14 °brix 16 °brix 18 °brix
60
5.9. Diagramas de consumo de sustrato
Se realizó dos diagramas para el fin de comparar el consumo de sustrato para cada uno de
los casos, notando un consumo igualitario para todos los casos.
5.9.1. Diagrama de consumo de sustrato para los casos: A, C, E, G, I
Figura 20. Consumo de sustrato en función del tiempo casos: A, C, E, G, I
5.9.2. Diagrama de consumo de sustrato para los casos: B, D, F, H, J
Figura 21. Consumo de sustrato en función del tiempo casos: B, D, F, H, J
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
Azú
car
red
uct
or,
g/m
l
Tiempo, horas
Concentración de azúcar al 2%
10 °brix 12 °Brix 14 °brix 16 °brix 18°brix
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
Azú
car
red
uct
or,
g/m
l
Tiempo, horas
Concentración de azúcar al 4%
10 °brix 12 °Brix 14 °brix 16 °brix 18°brix
61
5.10. Diagramas de generación de biomasa
Se realizó dos diagramas para el fin de comparar el desempeño del crecimiento microbiano
para cada uno de los casos, notando una mejor producción de biomasa con 4% de
concentración de levadura.
5.10.1. Diagrama de generación de biomasa en función del tiempo para los casos: A,
C, E, G, I
Figura 22. Generación de biomasa en función del tiempo para los casos: A, C, E, G, I
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
Bio
mas
a, g
/l
Tiempo, horas
Concentración de biomasa al 2%
10 °brix 12 °brix 14 °brix 16 °brix 18 °brix
62
5.10.2. Diagrama de generación de biomasa en función del tiempo para los casos: B,
D, F, H, J
Figura 23. Generación de biomasa en función del tiempo para los casos: B, D, F, H, J
5.11. Ecuación cinética experimental de la concentración de sustrato en función del
tiempo
Tabla 26. Ecuación Cinética experimental de concentración de biomasa
Caso Ecuación cinética de biomasa en función del tiempo
A Cx = 0,0005t5 – 0,0149t
4 + 0,1528t
3 – 0,5086t
2 + 0,735t + 2,7548
B Cx = 0,0003t5 – 0,0096t
4 + 0,1093t
3 – 0,4003t
2 + 0,5628t + 1,4626
I Cx = 0,0006t5 – 0,0182t
4 + 0,1705t
3 – 0,4573t
2 + 0,4497t + 3,6789
J Cx = 0,0004t5 – 0,0129t
4 + 0,1183t
3 – 0,2577t
2 + 0,2041t + 7,3856
Tabla 27. Ecuación de velocidad de reacción experimental
Caso Ecuación cinética experimental
A dCx/dt = 0,0025t4 – 0,0596t
3 + 0,4584t
2 – 1,0172t + 0,735
B dCx/dt = 0,0015t4 – 0,0384t
3 + 0,3279t
2 – 0,8006t + 0,5628
I dCx/dt = 0,0003t4 – 0,0728t
3 + 0,5115t
2 – 0,9146t + 0,4497
J dCx/dt = 0,0020t4 – 0,0516t
3 + 0,3549t
2 – 0,5154t + 0,2041
5.12. Resultados de velocidad de reacción para los casos B, I y J
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
Bio
mas
a, g
/l
Tiempo, horas
Concentración de biomasa al 4%
10 °brix 12 °brix 14 °brix 16 °brix 18 °brix
63
Tabla 28. Velocidad de reacción con las ecuaciones de Monod, Tessier y Moser caso B
tiempo rx exp rx Monod Excel rx Monod Polymath rx Tessier rx Moser
horas g/h*l g/h*l g/h*l g/h*l g/h*l
0 0,318 0,29 0,33 0,30 0,29
1,5 0,341 0,32 0,36 0,34 0,33
3 0,362 0,35 0,39 0,37 0,36
4,5 0,420 0,44 0,47 0,47 0,46
6 0,613 0,60 0,60 0,62 0,62
7,5 0,773 0,74 0,69 0,72 0,74
9 0,728 0,81 0,69 0,71 0,75
10,5 0,584 0,76 0,58 0,58 0,59
12 0,366 0,66 0,45 0,42 0,35
Tabla 29. Velocidad de reacción con las ecuaciones de Monod, Tessier y Moser caso I
tiempo rx exp rx Monod Excel rx Monod polymath rx Tessier rx Moser
horas g/h*l g/h*l g/h*l g/h*l g/h*l
0 0,20 0,60 0,58 0,55 0,54
1,5 0,37 0,60 0,58 0,56 0,56
3 0,62 0,62 0,60 0,60 0,60
4,5 0,82 0,82 0,79 0,80 0,80
6 1,15 1,15 1,11 1,13 1,12
7,5 1,36 1,36 1,32 1,35 1,35
9 1,44 1,44 1,39 1,41 1,43
10,5 1,42 1,38 1,33 1,34 1,36
12 1,05 1,15 1,11 1,06 1,00
Tabla 30. Velocidad de reacción con las ecuaciones de Monod, Tessier y Moser caso J
tiempo rx exp rx Monod Excel rx Monod polymath rx Tessier rx Moser
horas g/h*l g/h*l g/h*l g/h*l g/h*l
0 0.20 2,17 1,37 1,39 1,42
1,5 0.45 2,15 1,38 1,42 1,45
3 1.39 2,18 1,43 1,48 1,51
4,5 2.35 2,39 1,66 1,76 1,79
6 2.88 2,72 2,02 2,17 2,23
7,5 2.91 2,86 2,26 2,40 2,50
9 2.62 2,80 2,42 2.44 2,53
10,5 2.12 2,54 2,39 2,24 2,09
12 1.89 2,55 2,41 2,25 2,08
64
5.13. Resultados de los parámetros cinéticos Ks y y velocidades de reacción de
las ecuaciones de Monod, Tessier y Moser con simulador Polymath 6.1
En las tablas 25, 25 y 27 indican los parámetros, rendimientos y velocidad de reacción para
cada ecuación cinética propuesta considerando solo los casos A y B sin evaporación y los
casos J e I con evaporación con fines comparativos.
Tabla 31. Parámetros cinéticos Ks y con las ecuaciones de Monod, Tessier y
Moser
Monod experimental
° Brix 10 18
Caso unidad A B I J
µmax h-1
0,371 0,109 0,180 0,234
Ks g/l 6,132 2,959 20,728 9,239
Monod Polymath
° Brix 10 18
Caso A B I J
µmax h-1 0,359 0,133 0,175 0,200
Ks g/l 4,143 8,802 21,762 9,683
Tessier
° Brix 10 18
Caso A B I J
µmax h-1 0,309 0,108 0,149 0,185
Ks g/l 5,447 8,924 27,460 13,572
Moser
° Brix 10 18
Caso A B I J
µmax h-1 0,301 0,106 0,150 0,193
Ks g/l 620,328 43,773 654,533 902,087
n ---- 3,846 2,064 2,090 3,075
Tabla 32. Resultados de rendimientos
CASO A CASO B CASO I CASO J
Y x/s 0,101 0,124 0,067 0,109
Y x/p 0,212 0,241 0,143 0,160
Y p/s 0,464 0,524 0,448 0,493
65
Tabla 33. Resultados de los modelos cinéticos y el coeficiente de correlación
Velocidad de reacción rx
Casos A B I J R2
Monod
experimental
-----
Monod
Polymath
0,882
Tessier
( (
))
( (
))
( (
))
( (
))
0,791
Moser
( ( ))
( ( ))
( ( ))
( ( ))
0,917
Para los diferentes modelos cinéticos se determinó el mejor ajuste de la ecuación cinética
experimental con las ecuaciones cinéticas teóricas mediante el valor del coeficiente de
determinación (R2) establecido para predecir cuál es el modelo que mejor interpreta el
fenómeno de la fermentación de bebidas gaseosas caducadas
5.14. Resultados de velocidad de reacción en función del tiempo
La velocidad de reacción experimental debe ajustarse gráficamente con alguna ecuación en
particular, es en ese caso que el proceso de fermentación está representado por una cinética
microbiana.
66
5.14.1. Modelado cinético de la velocidad de reacción en función del tiempo para los
casos A y B con las ecuaciones: Monod, Tessier y Moser
Figura 24. Velocidad de reacción de biomasa en función del tiempo caso A
Figura 25. Velocidad de reacción de biomasa en función del tiempo caso B
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
Vel
oci
dad
de
reac
ció
n,
g/h
*L
Tiempo, horas
CASO A: Velocidad de reacción =f(tiempo)
rx experimental rx Monod Excel rx Monod Polymath rx Tessier rx Moser
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
Vel
oci
dad
de
reac
ció
n,
g/h
*L
Tiempo, horas
CASO B: Velocidad de reacción biomasa =f(tiempo)
rx exp rx Monod Excel rx Monod Polymath rx Tessier rx Moser
67
5.14.2. Modelado cinético de velocidad de reacción en función del tiempo para los
casos I y J con las ecuaciones: Monod, Tessier y Moser
Figura 26. Modelado cinético de reacción de biomasa en función del tiempo caso I
Figura 27. Modelado cinético de reacción de biomasa en función del tiempo caso J
0,00
0,50
1,00
1,50
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
vel
oci
dad
de
reac
cio
ón
, g/h
*L
Tiempo, horas
CASO I: Velocidad de reacción biomasa =f(tiempo)
rx exp rx monod excel rx monod polymath rx tessier rx moser
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12 13,5
vel
oci
dad
de
reac
ció
n, g/l
*h
Tiempo, horas
CASO J: Velocidad de reacción biomasa =f(tiempo)
rx exp rx monod excel rx monod polymath rx tessier rx moser
68
6. DISCUSIÓN
Se escogieron tres tipos de gaseosas caducadas para el proceso de fermentación debido
a que por ser las más dulces, son las más vendidas en el mercado por lo tanto se
encontrarán en mayor cantidad, por esta razón éste estudio se basó en la mezcla de
bebidas gaseosas con respecto a la concentración de azúcares de las mismas, mas no se
tomó en cuenta el tiempo de expiración de cada botella, debido a que la fábrica Arca
Continental enviaba todas las bebidas caducadas que existían en diferentes tiempos.
En comparación con el análisis de todos los valores de pH expuestos en la tabla 16, se
indica que el mayor crecimiento microbiano obtenido fue en un pH de 5,5 debido a que
bajo este valor las células de levadura no logran la esporulación por la presencia de
inhibidores como son: el sorbato de potasio y benzoato de sodio prevenientes de los
ácidos sórbico y benzoico debido a que detienen el crecimiento microbiano en el
interior celular y conducen a una pérdida de transporte de nutrientes.
Los resultados obtenidos de consumo de sustrato de la figura 20 muestran que los
azúcares no se han consumido totalmente debido a que existe mayor cantidad de
alimento y menor cantidad de microorganismos por lo tanto el azúcar no se consume
totalmente y los microorganismos tardan más tiempo en llegan a su fase exponencial.
La figura 21 denota un mayor consumo de sustrato, debido a que, con mayor cantidad
de levadura, la velocidad de reacción es más rápida y las levaduras llegan a la fase
estacionaria en menor tiempo obteniendo mayor conversión de sustrato.
Para obtener mayor concentración de sustrato (18 °Brix) y la mayor concentración de
etanol (95,5 g/l) fue necesario concentrar la mezcla de bebidas gaseosas caducadas
mediante evaporación, lo que implica un gasto energético, económico y de tiempo para
el proceso.
69
El método del espectrofotómetro que se utilizó para determinar el crecimiento
microbiano no es tan exacto, debido a que mide el total de células viables y no viables
por turbidimetría, pero a pesar de ello se pudo evidenciar como la levadura fue
adaptada al medio e incrementar su biomasa a través del consumo de sustrato y
formación de etanol.
El método de cuantificación de azúcares reductores no es muy confiable debido a que
pueden existir errores aleatorios generados al momento de distinguir el punto de
equivalencia de la titulación.
Se cuantificó la demanda química de oxígeno (DQO) antes y después del proceso de
fermentación a 18 °Brix y se obtuvo los valores 109.750 mg/l y 106.300 mg/l
respectivamente, esto significa que la DQO se redujo en un 5,6 % esto indica que las
levaduras no necesitan de tanta cantidad de oxígeno para realizar sus primeras
funciones metabólicas.
En las figuras 18 y 19 se observa que se produjo mayor concentración de etanol (89,42
g/l de etanol) en menos de 12 horas con la condición de 4% de levadura, esto se debe a
que, a mayor cantidad de levadura empleada, se obtiene mayor concentración de etanol
en menor tiempo que con la concentración de 2% de levaduras con un valor de 77,85
g/l.
En la tabla 32 se indica que, los valores de los parámetros de µmax y Ks difieren para
todos los modelos cinéticos propuestos, esto se debe a que dependen de la ecuación
cinética utilizada por esta razón las figuras de velocidad de reacción en función del
tiempo (24, 25, 26 y 27), demuestran qué cinética es la que mejor ajusta a los datos
experimentales siendo para todos los casos la cinética de Moser.
Todas las ecuaciones se ajustaron mejor a la ecuación cinética de Moser debido a que
el coeficiente de correlación (R2) proporcionó resultados cercanos a la unidad.
70
El porcentaje de etanol obtenido no fue muy alto como lo esperado, debido a que para
el caso J, si se hubiese empleado mayor tiempo de fermentación las levaduras hubieran
alcanzado a producir mayor cantidad de etanol y biomasa.
La utilización de un Biorreactor para el proceso de fermentación asegura que el sistema
sea totalmente anaerobio, con la ventaja de controlar que la temperatura, y el pH sean
constantes pero la agitación no, y debido a esto se generaba altas revoluciones en
diferentes intervalos de tiempo, corriendo el riesgo de lisis celular.
Los valores del parámetro Ks (902,1 g/l) utilizando levadura Saccharomyces cerevisiae
con la ecuación de Moser son notablemente grandes comparados con los valores
registrados en la fermentación de bebidas gaseosas utilizando Saccharomyces bayanus
(65,535 g/l) y la ecuación de Andrews esto se debe que, a pesar de disponer azúcares
simples fácilmente fermentables, los refrescos contienen varios compuestos que afectan
al metabolismo de las levaduras en diferente proporción, como son los conservantes y
es posible que esto afecte al crecimiento de la levadura y se refleje en el valor de Ks.
71
7. CONCLUSIONES
Se concluye que se puede aprovechar los residuos provenientes por el descarte de las
embotelladoras que contienen carbohidratos y una alta demanda química de oxígeno de
109.750 mg O2/l, para producir un subproducto de valor agregado como el etanol
mediante fermentación anaerobia con levaduras.
La levadura Saccharomyces cerevisiae presenta un mayor crecimiento microbiano a un
pH de 5,5 en comparación con un pH más bajo pues en este medio, una alta acidez
destruye a la membrana celular de las levaduras provocando lisis celular.
La relación de masa de levadura con respecto a la masa del sustrato con mayor
concentración de etanol 89,42 g/l, fue de 0,109 correspondiente para el caso J.
La fermentación de bebidas gaseosas caducadas permite obtener etanol, con una
concentración de azúcares de 18°Brix, un pH de 5,5, temperatura de 30°C durante 12
horas, su rendimiento fue de 0,49 en referencia al sustrato consumido.
El modelo establecido de Moser para el proceso fermentativo indica que no existe
inhibición por parte del producto y se puede incrementar la concentración de los
azúcares hasta 22°Brix para monitorear su velocidad de reacción y poder obtener
mayor cantidad de etanol.
Se obtuvo mayor rendimiento de biomasa en azúcares (Ys/x) y de etanol en azúcares
(Yp/s) en los casos B y J esto es reflejo de haber utilizado una mayor concentración de
sustrato y microorganismos para la experimentación.
72
El consumo de sustrato de los azúcares reductores no se ha consumido en su totalidad
por lo que es necesario incrementar el tiempo de reacción para el aprovechamiento
total de los azúcares fermentables, como se cita en literaturas que la fermentación se la
realiza por lo menos por 48 horas, con ello se obtendrían mejores rendimientos.
Se comprobó que la velocidad de reacción de microorganismo teórico coincide con las
figuras experimentales obteniendo un buen ajuste al modelo cinético determinado.
(Fogler, 2004) pp. 434
Se comprueba que la ecuación de Moser ajusta de mejor manera a los datos
experimentales y se comprueba con los valores del coeficiente de correlación (R2)
Todos los casos de velocidad de reacción experimental se ajustan con la cinética de
Moser debido a que esta ecuación se aproxima más a la realidad que con otros
modelos cinéticos.
Los valores experimentales obtenidos de µmax =0,193 h-1
, para el caso J fueron
consistentes con los valores reportados para el crecimiento de Saccharomyces
cerevisiae en azúcares simples como glucosa y fructosa que fue de 0,186h-1
, pero para
los valores obtenidos experimentalmente de Y x/s = 0,109 g biomasa/g sustrato con
respecto a los reportados 0,66 g biomasa/g sustrato, no fueron semejantes por falta de
tiempo de fermentación. (Birol, Doruker, Kirdar, Onsan, & Ulgen, 1998), (Mwesigye
& Barford, 2006)
Los valores del parámetro Ks determinado para el caso J (902,1 g/l) fueron superiores
en comparación a los valores reportados en la literatura (Birol et al, 1998) con el valor
de 0,39 g/l y esto es debido a que los refrescos contienen conservantes que afectan el
metabolismo celular.
Los valores del orden de reacción (n=3,075) obtenidos de la cinética de Moser son
mayores que 1 lo que indica que no existe inhibición producida por el producto ni
producida por el sustrato.
73
El proceso de evaporación, influye en los valores de velocidad máxima de crecimiento
microbiano (µmax) determinados, mas no influye en el modelado cinético puesto que
los datos experimentales se ajustan a la ecuación de Moser.
La descarga del efluente de bebidas gaseosas caducadas al alcantarillado generaría una
alta contaminación ambiental ya que según la tabla 9 del Anexo 1 del Libro VI del
Texto Unificado de Legislación Secundaria del Ministerio de Ambiente: Norma de
Calidad Ambiental y de Descarga de Efluentes al Recurso Agua indica que la
demanda química de oxígeno permisible para descarga al sistema de alcantarillado
público es de 500 mg/l.
74
8. RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar el modelado cinético para un biorreactor en tanque continuo o
CSTR para observar si se puede llegar a obtener mayor conversión y producción de
etanol.
Estudiar la influencia que tienen las diferentes fuentes nutritivas para la levadura
durante la fermentación
Realizar un estudio comparativo entre la levadura Saccharomyces cerevisiae y
Zymomona Movilis, con el fin de comparar la concentración final de etanol obtenido.
Realizar un estudio de la influencia de las diferentes fuentes de nitrógeno de las
bebidas caducadas en el rendimiento de la levadura Sacharomyces cerevisiae.
Estudiar si el tiempo de caducidad de cada bebida influye en el proceso fermentativo.
Rectificar el etanol obtenido para posterior obtención de etanol de segunda generación.
Realizar un estudio estadístico de todas las bebidas caducadas existentes en el mercado
tanto con gas y sin gas de todas las empresas productoras de bebidas.
Se recomienda prolongar el tiempo de fermentación para estudiar todo el proceso de
fermentación tomando en cuenta la fase estacionaria del proceso.
Se aconseja realizar un estudio económico que permita evidenciar si es factible la
implementación de una planta productora de etanol de segunda generación a partir de
las bebidas gaseosas caducadas y si su proceso es rentable.
75
CITAS BIBLIOGRÁFICAS
Agatángelo. (2007). Estudio del Comportamiento Cinético de Microorganismos de Interés
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80
ANEXOS
81
ANEXO A
Norma Inen 1529 para el ensayo de conteo de microorganismos
82
ANEXO A
Continuación
83
ANEXO A
Continuación
84
ANEXO A
Continuación
85
ANEXO A
Continuación
86
ANEXO A
Continuación
87
ANEXO B
Método de Mettler Toledo para determinar Azúcares reductores
88
ANEXO C
Método de Mc Farland para cuantificar microorganismos
89
ANEXO C
Continuación
90
ANEXO C
Continuación
91
ANEXO C
Continuación
92
ANEXO D
Resultados en Polymath modelo de Monod caso A
93
ANEXO E
Resultados en Polymath modelo de Tessier caso A
94
ANEXO F
Resultados en Polymath modelo de Tessier caso A
95
ANEXO G
Mezcla de Bebidas gaseosas caducadas antes y después de la fermentación
96
ANEXO H
Diluciones para siembra en el medio bebidas gaseosas caducadas-agar
97
ANEXO J
Fotografía del Biorreactor marca News Bronsweak
98
ANEXO K
Fotografías del equipo densito T50 y toma de muestras de etanol
99
ANEXO L
Resultados de exámenes fisicoquímicos y DOQ de gaseosas caducadas
100
ANEXO L
Continuación
Exámenes de DQO de la mezcla de refrescos caducados después de la fermentación
