Embed Size (px)
Citation preview
Universidad de ColimaFacultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
Septiembre del 2006Tecomán, Colima, México
PATOGENICIDAD, VARIABILIDAD MORFOLÓGICA Y GENÉTICA DE Colletotrichum acutatum SIMMONDS DE
CÍTRICOS EN MÉXICO
DOCTORADO EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA
PRESENTA:
MARIO OROZCO SANTOS
TESIS
QUE PRESENTA PARA OBTENER EL GRADO DEDOCTOR EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA
ASESORES
SALVADOR GUZMÁN GONZÁLEZLAVERN W. TIMMER
Universidad de ColimaFacultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
Septiembre del 2006Tecomán, Colima, México
PATOGENICIDAD, VARIABILIDAD MORFOLÓGICA Y GENÉTICA DE Colletotrichum acutatum SIMMONDS DE
CÍTRICOS EN MÉXICO
DOCTORADO EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA
REVISORES
TESIS
DR. ELPIDIO PEÑA BELTRÁNDR. ROBERTO LEZAMA GUTIÉRREZ
DR. OSCAR REBOLLEDO DOMÍNGUEZDR. JUAN PABLO MARTÍNEZ SORIANO
DR. JOSÉ JOAQUIN VELAZQUEZ MONREAL
i
CONTENIDO
Página
CUADROS Y FIGURAS .........................................................................................................
RESUMEN ...............................................................................................................................
ABSTRACT .............................................................................................................................
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................
II. REVISIÓN DE LITERATURA ...........................................................................................
2.1. Importancia de los cítricos en México ..........................................................................
2.2. Colletotrichum spp ........................................................................................................
2.2.1. Importancia ...........................................................................................................
2.2.2. Nomenclatura .................................................................................................
2.2.3. Síntomas y rango de hospederos .........................................................................
2.2.4. Proceso de infección de Colletotrichum ...............................................................
2.2.5. Análisis molecular de Colletotrichum ...................................................................
2.3. Antracnosis en cítricos .................................................................................................
2.3.1. Importancia de antracnosis ...................................................................................
2.3.2. Síntomas ...............................................................................................................
2.3.3. Etiología ...............................................................................................................
2.3.4. Epidemiología .......................................................................................................
2.3.5. Manejo de la enfermedad ......................................................................................
III. MATERIALES Y METODOS ...........................................................................................
3.1. Sitio experimental .........................................................................................................
3.2. Patogenicidad de Colletotrichum acutatum y C. gloeosporioides.................................
3.2.1. Aislamiento de Colletotrichum spp.......................................................................
3.2.2. Obtención de cultivos monospóricos....................................................................
3.2.3. Conservación de los aislamientos .........................................................................
3.2.4. Inóculo...................................................................................................................
3.2.5. Pruebas de patogenicidad.......................................................................................
3.3. Caracterización morfológica de aislamientos de Colletotrichum spp............................
3.4. Caracterización genética de Colletotrichum spp...........................................................
3.4.1. Aislamientos de Colletotrichum spp. ..................................................................
v
viii
ix
1
4
4
5
5
6
7
14
20
26
26
27
29
30
32
35
35
35
35
37
37
38
38
40
41
41
ii
3.4.2. Reproducción de micelio.......................................................................................
3.4.3. Extracción del DNA.............................................................................................
3.4.4. Reacciones de PCR-RAPDs.................................................................................
3.4.5. Visualización de los productos.............................................................................
3.4.6. Análisis de patrones RAPDs.................................................................................
IV. RESULTADOS..................................................................................................................
4.1. Patogenicidad de Colletotrichum acutatum y C. gloeosporioides.................................
4.2. Caracterización morfológica de aislamientos de Colletotrichum spp...........................
4.2.1. Características en medio de cultivo papa-dextrosa-agar.......................................
4.2.2. Características de conidias y apresorios de aislamientos de Colletotrichum spp..
4.2.3. Crecimiento en medio de cultivo papa-dextrosa-agar...........................................
4.3. Caracterización genética de Colletotrichum spp...........................................................
4.3.1. Análisis genético de Colletotrichum spp en cítricos.............................................
4.3.2. Análisis genético de la raza KLA y PFD de Colletotrichum acutatum.................
4.3.3. Análisis genético de la raza KLA de Colletotrichum acutatum............................
V. DISCUSIÓN........................................................................................................................
5.1. Patogenicidad de Colletotrichum acutatum y C. gloeosporioides.................................
5.2. Caracterización morfológica de aislamientos de Colletotrichum spp............................
5.3. Caracterización genética de Colletotrichum spp...........................................................
VI. CONCLUSIONES..............................................................................................................
VII. LITERATURA CONSULTADA.......................................................................................
42
42
43
44
45
46
46
46
46
50
51
54
54
56
59
65
65
66
69
76
77
v
CUADROS Y FIGURAS
Cuadro Página 1 2 3 4 5 6
Figuras 1 2 3 4 5
Relación de aislamientos de Colletotrichum spp colectados en tres especies de cítricos en regiones productoras de México............................................................ Secuencia de los inicadores decámeros RAPDs utilizados para la amplificación de segmentos de ADN del hongo Colletotrichum spp afectando cítricos en México . ............................................................ ..................................................... Patogenicidad de aislamientos de Colletotrichum spp de diferente origen geográfico en México, sobre flores de tres especies de cítricos ............................. Características morfológicas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de Colletotrichum spp de diferentes regiones citrícolas de México... Características morfológicas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de Colletotrichum spp colectados en cítricos en México................... Crecimiento en medio de cultivo papa dextrosa agar de aislamientos de Colletotrichum spp colectados en cítricos de diferente origen geográfico en México.................................................................................................................... Características de las colonias desarrolladas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de las razas PFD y KLA de Colletotrichum acutatum y el aislamiento de C. gloeosporioides. Las colonias son originadas de una espora de cada raza. Colonias de 14 días de edad a 27 °C...................................................... Conidios de las razas KLA y PFD de C. acutatum, y de C. gloeosporioides (C.g.), causantes de antracnosis del limón mexicano, caída de fruto pequeño y antracnosis de frutos en postcosecha, respectivamente........................................... Apresorios de las razas KLA y PFD de C. acutatum, y de C. gloeosporioides (C.g.), causantes de antracnosis del limón mexicano, caída de fruto pequeño y antracnosis de frutos en postcosecha, respectivamente.......................................... Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de seis aislamientos del hongo Colletotrichum acutatum aislado de limón mexicano, naranja Valencia y limón Persa y un aislamiento de C. gloeosporioides (C.g.) aislado como saprofito de limón mexicano............................................................. Dendrograma derivado del análisis de agrupamiento UPMGA generado por los patrones de bandeo de marcadores RAPDs con 6 aislamientos de Colletotrichum acutatum aislado de tres hospederos de cítricos (limón mexicano, naranja
39
44
47
49
52
53
48
50
51
55
vi
6 7 8 9
10
Valencia y limón Persa) y un aislamiento de C. gloeosporioides de limón mexicano .......................................................... ...................................................... Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de aislamientos del hongo Colletotrichum acutatum aislado de limón mexicano, naranja Valencia y limón Persa en diferentes entidades productoras en México.... Dendograma derivado del análisis de agrupamiento UPMGA generado por los patrones de bandeo de marcadores RAPDs con 18 aislamientos de Colletotrichum acutatum aislado de tres hospederos de cítricos (limón mexicano, naranja Valencia y limón Persa) en diferentes entidades productoras en México. .......................................................... ................................................... Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de aislamientos del hongo Colletotrichum acutatum aislado de limón mexicano en diferentes entidades productoras en México. ......................................................... Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de aislamientos del hongo Colletotrichum acutatum aislado de limón mexicano en diferentes entidades productoras en México. ......................................................... Dendograma derivado del análisis de agrupamiento UPMGA generado por los patrones de bandeo de marcadores RAPDs con 25 aislamientos de Colletotrichum acutatum aislado de limón mexicano en diferentes entidades productoras en México.......................................................... .................................
57
58
60
61
63
64
vii
RESUMEN
Los cítricos son afectados por el hongo Colletotrichum spp, causante del complejo de antracnosis:
del limón mexicano, caída de fruto pequeño y de frutos en postcosecha. La identificación de
especies de Colletotrichum se ha basado principalmente en sus características morfológicas,
especialización del hospedero y modo de parasitismo. La aplicación de marcadores moleculares a la
taxonomía de hongos ha clarificado relaciones entre muchas especies. Los objetivos del presente
trabajo fueron: 1) Evaluar la patogenicidad de diferentes aislamientos de Colletotrichum acutatum
colectados en México sobre tres especies citrícolas: limón mexicano, limón Persa y naranja
Valencia, y 2) Caracterizar morfológica y genéticamente las poblaciones de C. acutatum en cítricos
procedentes de las regiones productoras de la costa del Océano Pacífico y Golfo de México. Se
utilizaron aislamientos de Colletotrichum acutatum (KLA) obtenidos de hojas o flores afectadas de
limón mexicano (Citrus aurantifolia) en ocho estados productores: Colima, Michoacán, Jalisco,
Nayarit, Guerrero, Oaxaca, Tamaulipas y Veracruz. Asimismo, se colectaron aislamientos de C.
acutatum (PFD) de flores afectadas de limón Persa (C. latifolia) y naranjo Valencia (C. sinensis) en
Veracruz, Tabasco y Tamaulipas. Además, se colectó un aislamiento de C. gloeosporiodes de
ramillas muertas de limón mexicano. Los aislamientos fueron analizados genéticamente mediante la
técnica RAPDs (DNA Polimórfico Amplificado al Azar). En medio de cultivo papa dextrosa agar
(PDA), todos los aislamientos de la raza KLA produjeron colonias de color blanco grisáceo de lento
crecimiento, mientras que la raza PFD presentó colonias de color naranja de lento crecimiento. El
hongo C. gloeosporioides registró colonias de color gris de rápido crecimiento. La raza KLA fue
patogénica a flores de limón mexicano, limón persa y naranja Valencia, en cambio la raza PFD
infectó solo a limón persa y naranja Valencia. El aislamiento de C. gloeosporioides no fue
patogénico a flores de las tres especies citrícolas. El perfil de bandas de DNA en los aislamientos de
la raza KLA fueron casi similares entre ellos y diferentes al perfil de bandas en los aislamientos de
la raza PFD de naranja Valencia y limón Persa. El aislamiento de C. gloeosporioides presentó un
patrón de bandas muy diferente a los registrados por KLA y PFD. El análisis de agrupamiento
generó dos grupos: uno formado por C. gloeosporioides y otro por C. acutatum. El grupo de C.
acutatum se integró por dos subgrupos; uno correspondiente a los aislamientos de la raza KLA y el
otro a la raza PFD. El análisis filogenético de los aislamientos de la raza KLA colectados en
diferentes entidades citrícolas de México registraron una reducida variabilidad genética.
viii
ABSTRACT
The fungi Colletotrichum spp affects the citrus crop, causing the anthracnose complex: of key lime,
postbloom fruit drop and of postharvest fruit. The identification of species of Colletotrichum has
been based mainly using morphological characteristics, specialization of the host and mode of
parasitism. Application of molecular markers to fungal taxonomy has clarified relationships among
many fungi species. The objectives of the present work were: 1) evaluate the pathogenicity of
different isolations of Colletotrichum acutatum collected in citrus growing regions of Gulf of
Mexico and Pacific Ocean. The pathogeniciy was evaluated on three citrus species: Mexican lime,
Persian lime and Valencia orange, and 2) characterize morphological and genetically the populations
of C. acutatum in citrus from the citrus growing regions of the coast of the Pacific Ocean and Gulf
of Mexico. Isolations of C. acutatum (KLA) were obtained from affected tissues (leaves or flowers)
of Mexican lime (Citrus aurantifolia) in eight citrus-growing states of Mexico: Colima, Michoacan,
Jalisco, Nayarit, Guerrero, Oaxaca, Tamaulipas and Veracruz. Isolates of C. acutatum (PFD) were
obtained from affected flowers of Persian lime (C. latifolia) and Valencia orange (C. sinensis) in
Veracruz, Tabasco and Tamaulipas. One more isolate of C. gloeosporioides from dead shoots of
Mexican lime was obtained. The isolates were genetically analyzed by RAPD (Random Amplified
Polimorphic DNA). In cultures medium on potato dextrosa agar (PDA), all the isolations of the race
KLA produced colonies white grayish of slow growth, while the race PFD presented colonies
orange of slow growth. The fungi C. gloeosporioides registered colonies of gray color of fast
growth. The race KLA was pathogenic to flowers of Mexican lime, Persian lime and Valencia
orange, while the race PFD only infected Persian lime and Valencia orange. The isolation of C.
gloeosporioides was not pathogenic to flowers of the three citrus species. The profile of DNA bands
with the isolations of the race KLA was almost similar among them and different to the profile of
bands with the isolations of the race PFD. The isolation of C. gloeosporioides presented a pattern of
bands very different to the registered for KLA and PFD. The cluster analysis generated two groups:
one formed by C. gloeosporioides and another for C. acutatum. The group of C. acutatum was
integrated for two subgroups; one corresponding to the isolations of the race KLA and the other to
the race PFD. The phylogenetic analysis of the isolations of the race KLA collected in different
citrus growing states of Mexico registered a reduced genetic variability.
1
I INTRODUCCION
Las plantas están expuestas al ataque de diversos patógenos que ocasionan enfermedades. La
clase de organismos que afectan a los vegetales es muy diversa e incluye virus, fitoplasmas,
bacterias, hongos, nematodos, protozoarios y plantas parásitas (Baker et al. 1997; Dangl y Jones,
2001). Las enfermedades causadas por hongos patógenos, representan uno de los factores limitantes
para la producción de los cultivos (Trigriano et al. 2004), muchas de las cuales son causadas por el
género Colletotrichum, el cual posee numerosas especies de importancia económica en regiones
agrícolas de clima tropical, subtropical y templado (Jeffries et al. 1990; Bailey y Jeger, 1992;
Freeman et al. 1998; Peres et al. 2005). Una de las especies más patogénicas de este género es
Colletotrichum acutatum J.H. Simmonds, la cual causa antracnosis en cultivos como almendra,
aguacate, durazno, zarzamora, mango, pasiflora, olivo, fresa y cítricos (Freeman et al. 1998;
Wharton et al. 2004; Peres et al. 2005).
En el caso de los cítricos, el hongo Colletotrichum spp causa las enfermedades conocidas
como antracnosis (Jeffries et al. 1990; Timmer et al. 1994). Este grupo de enfermedades lo
constituyen la caída de fruto pequeño (citrus postbloom fruit drop), antracnosis del limón mexicano
y antracnosis en postcosecha (Timmer et al. 1994). En el pasado, la causa de la caída de fruto
pequeño fue atribuída a un aislamiento del hongo C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz.
que produce una colonia de color naranja de lento crecimiento en medio de cultivo (Agostini et al.
1992; Sonoda y Pelosi, 1988). En el caso de la antracnosis del limón mexicano, inicialmente se
atribuyó al hongo Gloeosporium limetticola Clausen y posteriormente fue asociada a una raza de C.
gloeosporioides (Sutton, 1980). Actualmente, se conoce que la raza de color naranja de lento
crecimiento (PFD) y la raza que produce antracnosis del limón mexicano (KLA) corresponden al
hongo C. acutatum (Brown et al. 1996) y que el hongo que produce la antracnosis de postcosecha
corresponde a C. gloeosporioides (Agostini et al. 1992). Asimismo, se sugirió que los aislamientos
de limón mexicano y caída de fruto pequeño tienen un ancestro común (Brown et al. 1996), lo cual
fue descartado en estudios recientes (Perez et al. 2003).
Inicialmente se consideró que la raza KLA que afectaba únicamente al limón mexicano.
Ahora, se conoce que también puede infectar a otras especies, como es el caso de naranja (C.
2
sinensis (L) Osbeck) y limón persa (C. latifolia Tan), en las cuales ocasiona necrosis de flores y
caída de fruto pequeño. Otros cítricos, como la toronja puede ser atacada por este hongo (Agostini et
al. 1992; Timmer et al. 1994). La raza PFD de C. acutatum puede ocasionar caída de fruto pequeño
en naranja, limón persa y toronja, mientra que C. gloeosporioides produce antracnosis de frutos en
postcosecha (Timmer et al. 1994).
La raza KLA que produce la antracnosis del limón mexicano está ampliamente diseminada
en las regiones con clima trópical seco, es altamente patogénica y tiene períodos cortos de
incubación, provocando graves pérdidas año con año, las cuales se estiman hasta un 40-50% de la
producción de invierno (Garza y Medina, 1984) y su control depende de numerosas aplicaciones de
fungicidas (8 a 12 aspersiones) durante la época de lluvias, representando un riesgo de resistencia
del hongo a los fungicidas de acción sistémica.
Además, la raza KLA tiene la habilidad de infectar a un mayor número de tejidos vegetales
en comparación a la raza PFD, ya que la primera es capaz de causar síntomas en brotes, hojas, flores
y frutos en su hospedante principal, mientras que la raza PFD es patogénica únicamente a flores.
Asimismo, existen marcadas diferencias en patogenicidad a especies citrícolas y diferencias en
características culturales de las colonias. En la costa del Océano Pacífico, bajo condiciones de
campo se ha observado que la raza KLA de C. acutatum afecta solo a limón mexicano y no se han
observado síntomas en limón Persa y toronja. En cambio los aislamientos de limón mexicano de
Florida pueden afectar a limón Persa y naranjas (Agostini et al. 1992).
Existen pocos estudios comparativos en morfología, patogenicidad y genética de poblaciones
del hongo C. acutatum en cítricos. Agostini et al. (1992) estudiaron caracteristicas morfologicas y
patogénicas de algunos aislamientos de las razas KLA y PFD de C. acutatum y de C.
gloeosporioides. Ellos describieron información morfológica sobre conidios (área, perímetro y
forma), apresorios (longitud y ancho) y setas (presentes en medio de cultivo y tejido hospedante), así
como el efecto de la temperatura sobre el desarrollo de las colonias y la patogenicidad de
aislamientos sobre tres especies de cítricos. Sin embargo, únicamente trabajaron con cinco
aislamientos de la raza KLA y no incluyeron estudios genéticos. Además, las características de las
3
colonias fueron descritas con pocos parámetros. Por otra parte, se han reportado algunos avances
preliminares en genética de poblaciones entre las razas KLA y PFD (Peres et al. 2003).
En México, la raza PFD es epidémica en naranja, toronja y limón Persa en la región trópico
húmeda de los estados de Veracruz y Tabasco, en cambio la raza KLA es importante en limón
mexicano en las áreas de trópico seco en Jalisco, Colima, Michoacán, Guerrero y Oaxaca. En base a
la información presentada, son evidentes las diferencias en patogenicidad y morfología entre ambas
razas, lo que hace suponer una constitución genética diferente. Sin embargo, hasta el momento no
existen estudios que asocien estos parámetros con la estructura genética de las poblaciones de las
razas KLA y PFD de C. acutatum. Los estudios de variabilidad genética en poblaciones de C.
acutatum permitiran inferir aspectos sobre su biología (tipo de reproducción), capacidad evolutiva y
puede ser un indicativo de la coevolución con su hospedante. Asimismo, puede ayudar a predecir los
riesgos de resistencia a fungicidas y a explicar las diferencias en patogenicida y características
morfológicas entre las dos razas y las dos especies de hongos.
Con base a lo anterior se plantea la hipotesis de que existe variación morfológica, patogénica
y genética entre las poblaciones de las razas KLA y PFD del hongo C. acutatum procedentes de la
región productora de limón mexicano de la costa del Océano Pacífico y la región productora de
naranja y limón Persa de la costa del Golfo de México.
Para dar respuesta a la hipotesis propuesta se plantearon los objetivos siguientes:
1. Evaluar la patogenicidad de aislamientos de la raza KLA y PFD del hongo C. acutatum
colectados en cítricos de los estados productores del Golfo de México y Océano Pacífico, sobre
tres especies citrícolas: limón mexicano, limón Persa y naranja Valencia.
2. Caracterizar morfológicamente las poblaciones de la raza KLA y PFD de C. acutatum en cítricos
procedentes de las regiones citrícolas de la costa del Océano Pacífico y Golfo de México.
3. Determinar la variabilidad genética de poblaciones de la raza KLA y PFD de C. acutatum
procedentes de las regiones citrícolas de la costa del Océano Pacífico y Golfo de México
mediante la técnica RAPDs (ADN Polimórfico Amplificado al Azar).
4
II REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Importancia de los cítricos en México
México ocupa el sexto lugar como productor de cítricos en el ámbito mundial con una
superficie cultivada de aproximadamente 490,000 hectáreas y un volumen de producción de 4.98
millones de toneladas de fruta. La naranja es la especie citrícola más importante con 73 % de la
superficie cultivada a escala nacional, seguida por los limones (limón mexicano, persa y verdadero)
con 26 % y la mandarina y toronja con 1.5 y 1.4 %, respectivamente. Las principales regiones
citrícolas de México se localizan en el noreste del país, costas del Golfo de México, península de
Yucatán y en la vertiente del Pacífico en la planicie costera del noroeste (Sonora) y en las costas de
Jalisco, Colima, Michoacán, Guerrero y Oaxaca, así como en el Valle de Apatzingán, Mich.
(SAGARPA, 2004).
En el caso de limón mexicano [Citrus aurantifolia Christm. (Swingle)], México es el primer
productor en el mundo. Para el año 2004 se registró una superficie de 95,511 hectáreas con una
producción cercana a las 1.25 millones de toneladas anuales y un valor de la producción de 2,053
millones de pesos (SAGARPA. 2004). Las principales áreas productoras de limón mexicano se
localizan en la región costera de los estados de Jalisco, Colima, Michoacán, Guerrero y Oaxaca. Este
cítrico se adapta ampliamente a las áreas que presentan características de clima tropical seco, en
donde predomina un amplio período de secas (7 a 8 meses) y una época lluviosa corta (4 a 5 meses).
La precipitación ocurre principalmente en el verano y fluctúa entre 700 a 1,200 mm anuales,
temperatura media anual de 26 a 28 ºC y de 0 a 400 metros sobre el nivel del mar. La agroindustria
del limón mexicano es una fuente valiosa de riqueza para los estados dedicados a su cultivo, ya que
alrededor de ella existe una importante infraestructura en empaques, plantas industrializadoras,
empresas de servicios e insumos y talleres de armado de cajas para el empaque de fruta (Medina et
al. 2001). Existen aproximadamente 9,700 productores en el ámbito nacional y se estima que genera
18 millones de jornales/año, dando empleos para más de 25 mil familias en la atención a huertos,
empaques, industrias y en la comercialización de la fruta fresca (Conalim, 2006).
5
2.2 Colletotrichum spp
2.2.1 Importancia
Colletotrichum es un género importante de hongos que está conformado por 39 especies
(Sutton, 1992) que causan antracnosis o tizones en una amplia gama de cultivos agrícolas y plantas
ornamentales (Bailey y Jeger, 1992; Latunde-Dada, 2001). Estas enfermedades se encuentran
distribuídas a escala mundial y ocasionan pérdidas económicas en pre y postcosecha en regiones
tropicales, subtropicales y de clima templado (Jeffries et al. 1990; Bailey y Jeger, 1992; Dodd et al.
1992; Freeman et al. 1998; Latunde-Dada, 2001; Wharton y Diéguez-Uribeondo, 2004; Peres et al.
2005). Sus hospedantes incluyen una gran diversidad de cultivos anuales como leguminosas (fríjol,
soya, chícharo y leguminosas forrajeras) (Lenné, 1992), gramíneas (maíz y sorgo) (Nicholson, 1992;
Casela y Frederiksen, 1993; Bergstrom y Nicholson, 1999), solanáceas (tomate, chile y papa)
(Dillard, 1992), cucurbitáceas (melón, sandía y pepino) (Sitterly y Keinath, 1996) y rosáceas (Fresa)
(Freeman et al. 1998; Denoyes-Rothan et al. 2005). Asimismo, diversas especies de Colletotrichum
se han reportado afectando un gran número de cultivos perennes como aguacate, plátano, cítricos,
café, mango, papaya, pasiflora, guayaba, guanábana, cacao, hule, manzana, durazno y almendro
(Jeffries et al. 1990; Dodd et al. 1992; Waller, 1992; Freeman et al. 1998; Waller y Bridge, 2000;
Biggs y Miller, 2001; Afanador-Kafuri et al. 2003), así como cultivos industriales: algodón, caña de
azúcar y tabaco (Waller, 1992).
Con frecuencia, la infección por Colletotrichum es la causa directa de enfermedades de las
plantas; sin embargo, el hongo se presenta también como saprofito o invasor secundario de tejidos
en decadencia. Las pérdidas causadas por antracnosis ocurren principalmente como una reducción
directa de la cantidad y calidad del producto cosechado (Jeffries et al. 1990; Bailey y Jeger, 1992;
Dodd et al. 1992; Waller, 1992; Freeman et al. 1998; Latunde-Dada, 2001). El patógeno ataca
frecuentemente más de una parte de la planta, ocasionando enfermedades separadas que pueden
interactuar durante el ciclo del cultivo; éstas se pueden agrupar de acuerdo al tejido primario que es
infectado: 1) enfermedades de brotes y hojas, 2) enfermedades de flores y 3) enfermedades de
frutos. En el caso de antracnosis en frutos, existen dos tipos: una que afecta frutos en desarrollo en
condiciones de campo (precosecha) y otra que daña frutos maduros durante el almacén
6
(postcosecha) (Waller, 1992). La habilidad de Colletotrichum para causar infecciones latentes o
quiescentes lo han agrupado entre los patógenos más importantes en postcosecha. Las especies de
este hongo se presentan principalmente en tejidos aéreos de las plantas; sin embargo, ciertos órganos
bajo el suelo pueden ser afectados, tales como raíces y tubérculos (Freeman et al. 1998). El cultivo
de mango (Ploetz, 1994) y limón mexicano (Timmer, 2000b) son ejemplos donde varios órganos
(hojas, flores y frutos) son infectados por la enfermedad, en donde el inóculo de una fuente infecta a
otro.
2.2.2 Nomenclatura
El nombre científico de un organismo es la clave para la búsqueda de su literatura y también
es importante para muchos aspectos de la ciencia de la cual forma parte. Los micólogos, biólogos y
fitopatólogos requieren de precisión en la aplicación de nombres a los hongos que trabajan, con el
propósito de lograr una comunicación efectiva (Sutton, 1992). Colletotrichum es un género
notoriamente variable, sobre el cual existen muchas preguntas fundamentales relacionadas con su
taxonomía, evolución, origen de variación, especificidad hospedera y mecanismos de patogenicidad
(Bryson et al. 1992; Cannon et al. 2000).
Colletotrichum y su teleomorfo Glomerella (estado perfecto, subdivisión Ascomycotina) han
sido implicados en numerosas enfermedades de las plantas en muchas regiones agrícolas del mundo
(Latunde-Dada, 2001). Es un hongo anamórfo (imperfecto) que pertenece a la subdivisión
Deuteromycotina, clase Deuteromicetes, subclase Coelomycetidae, orden Melaconiales y forma
Melaconiaceae (Sutton, 1992). El género Colletotrichum fue establecido por Corda en 1831 para
referirse a hongos caracterizados por conidios fusiformes, curvos e hialinos y acérvulos con setas
(Jeffries et al. 1990; Sutton, 1992). En el pasado, los sistemas de identificación de Colletotrichum se
basaron en criterios morfológicos y culturales o una combinación de ambos. Sin embargo, fue
notorio que estos parámetros, tienen muchas limitaciones, ya que algunos nombres de especies del
hongo que están asignados a colecciones y aislamientos carecen de la precisión requerida. Existen
especies difíciles para identificarse con estos criterios; tal es el caso de C. gloeosporioides y C.
dematium. Por otra parte, C. lindemuthianum posee al menos nueve razas y el nombre únicamente
de la especie es de ayuda limitada para los fitopatólogos en términos de que tan específico o no
específico es el taxón a un hospedante particular, ya sea cultivar, variedad, especie o familia. La
7
morfología del hongo por si sola no permite la identificación de razas a un nivel fisiológico (Sutton,
1992).
El número de claves taxonómicas disponibles para identificar especies de Colletotrichum es
limitado. En la actualidad se aceptan 39 especies de Colletotrichum descritas en el trabajo de Sutton
(1992). Su descripción está basada en las características culturales de la colonia en medio de cultivo,
presencia o ausencia de setas, teleomorfo y formas especiales en caso de existir, tamaño y forma de
los conidios y apresorios.
Los métodos tradicionales para identificar especies de Colletotrichum se han basado
principalmente en diferencias morfológicas tales como el color de la colonia, tamaño y forma de los
conidios, temperatura óptima para su desarrollo, presencia o ausencia de setas y existencia del
estado teleomorfo (Agostini et al. 1992; Sutton, 1992; Freeman et al. 1998; Lardner et al. 1999). Sin
embargo, debido a la influencia ambiental sobre la estabilidad de su morfológía y a la existencia de
formas intermedias, estos criterios no siempre son adecuados para la diferenciación confiable de las
especies (Freeman et al. 1998). Las características morfológicas combinadas con el uso de
marcadores moleculares ha permitido clarificar la relación existente entre diferentes grupos
morfológicos de Colletotrichum (Brown et al. 1996; Freeman et al. 1998; Lardner et al. 1999;
Afanador-Kafuri et al. 2003; Moriwaki et al. 2003; Cano et al. 2004; Ford et al. 2004).
2.2.3 Síntomas y gama de hospedantes
El hongo causante de la antracnosis puede atacar diversos tejidos de las plantas, dependiendo
de la especie de Colletotrichum y el hospedante. En maíz, la antracnosis es una enfermedad de
importancia mundial, causada por C. graminicola (Ces.) G.W. Eils. que puede infectar todas las
partes de la planta y provocar síntomas en cualquier momento del ciclo de vida del cultivo
(Nicholson, 1992; Bergstrom y Nicholson, 1999; Bergstrom y Nicholson, 2000). Las formas más
comunes de antracnosis en maíz son el tizón foliar y pudrición del tallo. El primero, en ataques
severos restringe el crecimiento y desarrollo normal de genotipos altamente susceptibles es su etapa
juvenil y puede muchas veces ocasionar su muerte. Los síntomas consisten en lesiones ovales y con
frecuencia presentan anillos concéntricos. En plantas adultas, aparecen lesiones individuales
rodeadas por un halo amarillento, las cuales llegan a coalescer y forman grandes extensiones de
8
tejido necrosado. Las hojas senescentes son más susceptibles a la enfermedad. La presencia de
acérvulos en las lesiones es un signo característico de la enfermedad (Bergstrom y Nicholson, 1999;
Bergstrom y Nicholson, 2000). El síntoma predominante de la antracnosis en tallo es una
decoloración de la corteza, llegando a desarrollar lesiones de color negro. En tallos verdes, el hongo
ocasiona diferentes síntomas: 1) infecciones sistémicas a través de heridas, en donde la corteza
permanece de color verde y parece sana, mientras que el tejido interno está dañado. 2) infecciones
en la corteza del tallo con decoloraciones, pero sin registrar una evidente infección sistémica
(Bergstrom y Nicholson, 1999; Bergstrom y Nicholson, 2000).
En la familia de las leguminosas se han reportado nueve especies de Colletotrichum en
regiones tropicales y templadas. Estas especies incluyen: C. capsici (H. Sydow) E. Butler & Bisby,
C. coccodes (Wallr.) Hughes, C. crassipes (Speg.) Arx, C. dematium (Pers.) Grove, C. destructivum
O’Gara, C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., C. lindemuthianum (Sacc. & Moore) Br. & Cav.,
C. trifolii Bain & Essary y C. truncatum (Schw.) Andrus & Moore. Las principales especies de
Colletotrichum que atacan leguminosas de grano son: C. lindemuthianum, C. truncatum, C.
destructivum y C. gloeosporioides. El primero afecta frijol, chícharo de vaca y algunas leguminosas
de grano pequeño de los géneros Phaseolus y Vigna, soya y chícharo. C. truncatum posee un amplia
rango de hospedantes, entre los que se citan: soya, chícharo de vaca, fríjol lima, cacahuate y lentejas.
C. destructivum infecta afecta soya y lenteja y finalmente C. gloeosporioides se reporta en chícharo,
soya y cacahuate. Otras especies de Colletotrichum afectan leguminosas forrajeras: C. trifolii en
trébol rojo y cultivos forrajeros del género Medicago y Trifolium; C. gloeosporioides sobre lupino y
otros forrajes; C. truncatum es común en algunas leguminosas forrajeras, pero generalmente es
menos dañino que C. gloeosporioides (Lenné, 1992).
La antracnosis del fríjol es causada por C. lindemuthianum y representa una de las
principales enfermedades de esta leguminosa en las regiones tropicales de América Latina y Este de
África (Lenné, 1992; Mahuku et al. 2002). Los síntomas se presentan como lesiones de color café
obscuro a negro sobre los pecíolos y venas de las hojas. En los tallos se observan lesiones hundidas
que pueden circundar la planta, mientras que en las vainas aparecen cancros de apariencia hundida,
coloración café rosado y delimitados por bordes café rojizo. En condiciones húmedas, la masa de
esporas de color rosa escurre de los acérvulos en las lesiones de las vainas. Otros patógenos de
9
menor importancia afectando el cultivo del fríjol son: C. truncatum, C. dematium y Colletotrichum
sp. (Lenné, 1992).
En chícharo de vaca (Vigna unguiculata) se reportan tres especies de Colletotrichum como
patógenos de importancia económica. La antracnosis causada por C. lindemuthianum afecta
principalmente el tallo de las plantas y es más dañino cuando se establece como monocultivo. Las
otras dos especies, C. capsici (H. Sydow) E. Butler & Bisby y C. truncatum causan lesiones de color
café en pecíolos, venas de las hojas, tallos, pedúnculos y vainas (Lenné, 1992).
La antracnosis de la soya (Glycine max) es una enfermedad importante en condiciones
tropicales. El hongo C. truncatum es la especie más común afectando a este cultivo. Otras especies
incluyen C. destructivum, C. Gloeosporioides y C. capsici (Lenné, 1992).
C. gloeosporioides causa antracnosis en especies de Stylosanthes, una leguminosa forrajera
subtropical y tropical distribuida de manera natural en Centro y Sudamérica (Lenné, 1992;
Chakraborty et al. 1997a). Esta enfermedad es una de las mayores limitaciones para la producción
de forraje de S. guianensis, la cual es la especie más importante en Australia, Sudamérica y China.
Los síntomas se caracterizan por lesiones café obscuras a negras que causan necrosis o tizones sobre
las hojas, tallos y brotes terminales. En ataques severos pueden provocar una defoliación intensa y
muerte de la planta. Bajo condiciones húmedas, las lesiones obscuras son frecuentemente cubiertas
por masas de esporas naranja rosado (Lenné, 1992; Chakraborty, 1997).
El cultivo de la fresa es afectado por Colletotrichum, causando daños en todos los órganos de
la planta: corona, fruto, estolón, peciolo, hoja, flor, yema y raíces. Se han reportado cuatro especies
asociadas con la antracnosis de la fresa: C. fragariae Brooks, C. acutatum, C. gloeosporioides y C.
dematium (Howard et al. 1992; Denoyes y Baudry, 1995; Denoyes-Rothan et al. 2005).
El hongo C. coccodes causa la mancha negra en papa, enfermedad ampliamente distribuida
en áreas productoras del mundo. Estudios en invernadero, mostraron que el patógeno puede reducir
el rendimiento total entre un 19 a 32% (Johnson, 1994; Tsror (Lahkim), 1999). Se conoce como
mancha negra por la abundancia de esclerosios color negro que se producen sobre los tubérculos,
10
estolones, raíces y tallos. El patógeno causa pudrición de los órganos subterráneos de la planta, así
como un amarillamiento y marchitamiento del follaje. La enfermedad puede causar declinamiento
temprano de plantas, decoloración de tubérculos y reducción en rendimiento (Dillard, 1992). C.
coccodes también es capaz de infectar al fruto de jitomate, produciendo al principio pequeñas
manchas acuosas, circulares y ligeramente hundidas. Con el tiempo, la lesión se incrementa de
tamaño, llega a ser más profunda y la porción central se ennegrece, presentando acérvulos con
masas de esporas de color salmón. El hongo es capaz de infectar tanto frutos verdes como maduros
(Dillard, 1987; Dillard, 1992).
La antracnosis de las cucurbitáceas afecta el follaje y frutos de sandía, melón y pepinos en
regiones con clima húmedo. La enfermedad es causada por C. orbiculare (Berk. & Mont.) Arx
(sinónimo de C. lagenarium (Pass.) Ellis & Halst.), la cual produce lesiones sobre hojas, pecíolos,
tallos y frutos. En hojas de melón y pepino, las lesiones usualmente aparecen cerca de las venas, de
forma circular, color café ligero a rojizo y pueden alcanzar más de un centímetro de diámetro. Las
hojas pueden distorsionarse y el centro de la lesión se agrieta o se cae, originando la apariencia de
“tiro de munición”. En climas húmedos, los frutos próximos a madurar presentan lesiones circulares,
hundidas y de apariencia acuosa, que se tornan negras y se cubren con masas de esporas. En sandía,
las lesiones foliares son café a negras con márgenes irregulares y asociados con las venas de las
hojas. Los frutos jóvenes pueden presentar manchas negras que provocan aborto o malformación
(Sitterly y Keinath, 1996).
El aguacate es afectado por C. gloeosporioides que ocasiona pudrición y caída de frutos,
además de reducir la vida de anaquel durante al almacenamiento y transporte (Dodd et al. 1992). El
hongo infecta hojas, tallos y frutos jóvenes. Los síntomas en hojas senescentes ocurren como
manchas de color café y distribuidas al azar. En frutos previos a la cosecha, ocurren dos tipos de
síntomas: uno consiste de lesiones pequeñas localizadas alrededor de las lenticelas sobre la cáscara
que reducen su calidad y provocar su caída. El otro consiste de grandes áreas dañadas en forma
dispersa sobre la cascara del fruto que resultan de la infección a través de la alimentación de insectos
o daños mecánicos. Los síntomas que ocurren después de la cosecha resultan de infecciones
quiescentes que se desarrollan después de que los frutos maduran. Cuando la fruta madura e inicia a
ablandarse las lesiones se deprimen. Además, aparecen manchas café ligero en la fruta, las cuales
11
aumentan de tamaño rápidamente y cambian a un color café obscuro o negro. El daño se expande de
una forma hemisférica de la pulpa del fruto hacia la semilla. Si los frutos se almacenan en un
ambiente húmedo, se presenta una masa viscosa de esporas de coloración rosada sobre su superficie
(Dodd, et al. 1992; Prusky, 1994).
La antracnosis del mango ocurre en todas las regiones productoras del mundo y es
importante donde existen períodos prolongados de lluvia y alta humedad relativa (Dodd et al. 1992).
Es causada por C. gloeosporioides y provoca daños en panículas florales, hojas y frutos. En las hojas
aparecen pequeñas manchas de color café obscuro que llegan a coalescer y formar lesiones
irregulares de aproximadamente un centímetro de diámetro. Estas lesiones viejas pueden secarse y
caer. En inflorescencias, los síntomas inician como pequeñas manchas oscuras que al unirse
producen necrosis de flores y frutos pequeños. En ataques severos, todos los botones florales de una
panícula pueden ser dañados. En frutos verdes se desarrollan pequeñas manchas café, las cuales se
desarrollan hasta después de la cosecha, siendo el daño más importante en postcosecha. Al inicio de
la maduración, se observan lesiones irregulares de color café obscuro a negro, pudiendose formar en
cualquier parte de su superficie, pero es común que se formen patrones en forma de lagrimeo que se
extienden del pedicelo hacia la parte inferior de los frutos. Estas lesiones al inicio son son
superficiales y cuando llegan a cubrir parte de la superficie se desarrollan hasta 5 mm hacia el
interior de la pulpa. Generalmente, aparecen grandes áreas afectadas llegandose a formar masas de
esporas de color naranja a rosado sobre la superficie de los frutos afectados (Ploetz, 1994).
La antracnosis del plátano es de distrubución mundial y se considera una importante
enfermedad de este frutal. Esta es causada por C. musae (Berk. & M.A. Curtis) Arx (sinónimo de
Gloeosporium musarum Cooke & Massee) e infecta frutos de la mayoría de los cultivares de mesa.
Los síntomas en frutos maduros (amarillentos) se presentan como manchas de color café, hundidas y
cubiertas con masas de esporas de color naranja o salmón. Las lesiones aumentan de tamaño al
avanzar la maduración y pueden eventualmente coalescer. En las punta del fruto, se desarrolla una
pudrición que llega a descomponer la pulpa completa. En frutos verdes, los síntomas se desarrollan
sobre heridas producidas en su cáscara. Las lesiones maduras son de color café obscuro a negro,
forma de lenteja o diamante y un tamaño superior a los 8 x 13 cm. Los frutos enfermos maduran
más rápidamente que los frutos sanos (Jones y Slabaugh, 1994)
12
La papaya es hospedera de la antracnosis de frutos en postcosecha en muchas regiones
tropicales y subtropicales (Dodd et al. 1992). Esta enfermedad causada por C. gloeosporioides
produce síntomas en forma de manchas redondas, hundidas y acuosas en frutos maduros, las cuales
llegan a medir hasta cinco centímetros de diámetro. En el centro de las lesiones de forman masas
conidiales de color naranja rosado que son frecuentemente producidas en un patrón de anillos
concéntricos. Otro tipo de síntomas consiste en manchas irregulares a circulares, de 1 a 10
centímetros de diámetro, ligeramente deprimidas y de color café rojizo. Estas tipo de daño se conoce
coma “mancha de chocolate” y al madurar la fruta crecen rápidamente (arriba de 20 centímetros)
para formar lesiones de apariencia circular y hundidas (Dickman, 1994).
La antracnosis en bayas de café es causada por C. coffeanum Noack, C. kahawae Waller &
Bridge y C. gloeosporioides que representan la mayor amenaza para su producción en el mundo, ya
que pueden ocasionar pérdidas hasta un 70 a 80% (Masaba y Waller, 1992; Chen et al. 2005). La
enfermedad infecta tanto bayas verdes como maduras y ocasionalmente provoca daños en hojas. El
hongo se presenta desde la formación de flores hasta que la fruta madura. Sin embargo, la mayor
pérdida ocurre cuando infecta bayas verdes. Existen dos tipos de síntomas en las bayas: lesiones
activas y roñosas. Las primeras inician como pequeñas manchas hundidas de color obscuro, las
cuales avanzan rápidamente hasta cubrir toda la superficie. En condiciones de alta humedad, se
produce una masa de esporas de color rosado sobre la superficie de la lesión. El hongo penetra el
interior de la baya y destruye los granos, dejando los frutos secos y momificados. Las lesiones de
aspecto roñoso son normalmente de color canela pálido, ligeramente hundidas y con frecuencia
tienen anillos concéntricos con incipientes acérvulos negros y esporulación escasa. Este tipo de
daño, no afecta el crecimiento ni el rendimiento de grano (Masaba y Waller, 1992).
En cítricos se presenta un grupo de enfermedades conocidas como antracnosis, las cuales se
caracterizan por la caída de fruto pequeño en naranja y otros cítricos, antracnosis del limón
mexicano y antracnosis en postcosecha (Timmer et al. 1994; Timmer y Brown, 2000). La caída de
fruto pequeño y la antracnosis del limón mexicano son causadas por C, acutatum (Brown et al.
1996), mientras que la antracnosis de postcosecha se atribuye a C. gloeosporioides (Agostini et al.
1992; Timmer et al. 1994; Timmer y Brown, 2000). La antracnosis del limón mexicano afecta
13
únicamente tejidos jóvenes, que pueden ser brotes vegetativos, flores y frutos pequeños (Timmer,
2000b; Timmer y Brown, 2000), mientras que la caída de fruto pequeño se presenta en flores de
naranjas, toronja y limón persa (Timmer et al. 1994; Timmer, 2000a).
En el cultivo del té ocurre una enfermedad conocida como tizón café, es causada por G.
cingulata y se presenta en muchas regiones del mundo; sin embargo, raramente produce daños de
importancia económica. Su severidad es mayor cuando sepresentan condiciones que predisponen a
los tejidos a la infección del hongo. Estas condiciones son: heridas, estrés por altas o bajas
temperaturas y plantas sujetas a inundaciones o daño por otros patógenos y plagas. Las hojas
jóvenes o con heridas son más comúnmente atacadas y la enfermedad daña directamente la parte que
se cosecha de la planta: las hojas más jóvenes y la punta de los brotes (Waller, 1992).
La antracnosis del tabaco está asociada a C. tabacum Boning que puede ser sinónimo de C.
gloeosporioides. La enfermedad es un problema serio en los almácigos, causando manchas de color
café pálido en los cotiledones, las cuales se desarrollan hasta causar un marchitamiento general de
las plantas. El patógeno puede causar distorsión de las hojas y lesiones cancerosas de color café
sobre las nervaduras y los tallos de plantas adultas (Waller, 1992).
La pudrición roja de la caña de azúcar es causada por C. falcatum Went (teleomorfo
Glomerella tucumanensis (Speg) Arx & Muller), el cual está muy relacionado con C. graminicola,
pero su gama de hospedantes y otras características de ambos patógenos son notablemente diferentes
para considerarlos como especies separadas. El hongo infecta los trozos de caña para siembra
provocando pudriciones al germinar y a las cañas en el campo les ocasiona un debilitamiento y
marchitamiento. En la cutícula de las cañas, se desarrolla una típica pudrición roja con manchas o
lesiones de color blanco causando la muerte de la planta. La esporulación del hongo ocurre bajo
condiciones húmedas, tanto en la parte interna como externa de la cañas enfermas. La infección
ocurre por las yemas y raíces en los nudos y es favorecida por heridas y daños causados por insectos
barrenadores. El patógeno puede permanecer latente en los entrenudos y se activa cuando la caña es
plantada (Waller, 1992).
14
Asimismo, el hongo C. gloeosporioides es capaz de afectar otros cultivos tropicales como la
pasiflora o fruta de la pasión (Passiflora edulis), guayaba (Psidium guajava) y guanábana (Annona
muricata). En la pasiflora causa tizón en plántulas, cáncer de frutos, antracnosis en hojas e
infecciones quiescentes en fruta sin madurar. En guayaba, puede infectar los frutos; sin embargo, el
síntoma más común es el tizón de los brotes vegetativos durante períodos lluviosos (Dodd et al.
1992). En el cultivo de cacao (Theobroma cacao), el hongo también causa enfermedades en el
follaje y en las mazorcas (Chandra Mohanan et al. 1989), mientras que en el cultivo del hule (Hevea
brasiliensis) provoca caída de hojas en árboles adultos (Dodd et al. 1992). La antracnosis de la yuca
(Manihot esculenta) es causada también por C. gloeosporioides y se considera una enfermedad del
tallo que causa cáncer, muerte descendente y defoliación (Hahn y Keyser, 1985). Finamente, C.
acutatum y C. gloeosporioides son capaces de infectar durazno, manzana, almendro y nogal
(Bernstein et al. 1995; Freeman et al. 1998; Biggs y Miller, 2001).
2.2.4 Proceso de infección de Colletotrichum
Los procesos típicos de infección de las especies de Colletotrichum involucran una secuencia
común de eventos, entre los que se pueden mencionar: 1) el arribo del conidio a la superficie de la
planta, 2) su adhesión a estas superficies, 3) germinación del conidio, 4) producción de un apresorio,
5) penetración de la epidermis de la planta, 6) crecimiento y colonización de los tejidos de la planta
y 7) producción de acervulos y esporulación (Jeffries et al. 1990; Bailey et al. 1992; Bergstrom y
Nicholson, 1999; Perfect et al. 1999; O’Connell et al. 2000; Prusky et al. 2000). El conocimiento de
éstos, permite desarrollar estrategias de manejo del patógeno mediante el diseño de modelos de
predicción y el empleo de prácticas agrícolas apropiadas.
Fuentes de inóculo y arribo al hospedante. La fuente de inóculo más importantes de las especies
de Colletotrichum son los conidios que se forman en una estructura llamada acérvulo, los cuales se
encuentran encapsulados en una sustancia mucilaginosa soluble en agua que es esencial para
asegurar su supervivencia y diseminación (Nicholson, 1992; Bergstrom y Nicholson, 1999). Este
mucílago contiene inhibidores de la germinación de los conidios y una variedad de enzimas que
pueden funcionar como protector de los mismos a la desecación, a las temperaturas extremas, a los
rayos ultravioleta y a los metabolitos tóxicos de la planta (Lax et al. 1985; Nicholson, 1992).
Asimismo, actúa como un antidesecante y ayuda a su supervivencia en períodos de sequía. Los
15
conidios permanecen viables durante semanas o meses, aun a 45% de humedad relativa; sin
embargo, en ausencia del mucílago, pierden su viabilidad en pocas horas (Nicholson y Moraes,
1980). Existe información limitada sobre el efecto antidesecante del mucílago. Al madurar las
estructuras reproductivas bajo condiciones de sequía, el mucílago forma un deposito costroso que
cubre un grupo de esporas; éstas pueden sobrevivir como una masa seca y ser diseminadas por las
corrientes de aire (Bergstrom y Nicholson, 1999). En cambio, los conidios de los acérvulos jóvenes
son diseminados por las gotas de agua (Nicholson y Moraes, 1980; Maden et al. 1996).
Algunos componentes del mucílago que aseguran la supervivencia del patógeno son
sustancias de bajo peso molecular, solubles en agua y que funcionan como un inhibidor de la
germinación de los conidios (Lax et al. 1985). Este inhibidor presente en el compuesto mucílaginoso
se ha caracterizado como mycosporine-alanine (Leite y Nicholson, 1992), el cual previene la
germinación de las esporas dentro de los acérvulos. Cuando las gotas de agua impactan un acérvulo,
los conidios son diseminadas (Maden et al. 1996) y el mucílago soluble en agua que los rodea viene
impregnado en la solución. Cuando la concentración de mycosporine-alanine es baja, el efecto
inhibidor es nulo y los conidios son capaces de germinar. Este mecanismo asegura que únicamente
germinarán cuando sean diseminados fuera de los acérvulos y sean depositados en un sitio
apropiado de infección sobre la superficie de un hospedante (Bergstrom y Nicholson, 1999).
Adhesión de la espora. La primera característica esencial para una patogénesis exitosa es la
adhesión de los propágulos a la superficie de la planta (Hamer et al. 1988). El contacto de la espora
con la superficie del hospedante es vital para el inicio de la interacción planta-hongo. Los conidios
de Colletotrichum spp. son diseminados por el salpique de las gotas de agua y se adhieren
rápidamente a la cutícula del tejido vegetal (Jeffries et al. 1990; Perfect et al. 1999), lo cual
involucra muchas interacciones hidrofóbicas, tal y como sucede en muchos hongos patógenos de las
plantas (Nicholson, 1992; Mercure et al. 1994). Una vez que los conidios tienen contacto con la
superficie hidrofóbica foliar, inician a liberar un material para adherirse fuertemente a la cutícula
(Mercure et al. 1994). Estas moléculas adhesivas son sustancias preformadas en la superficie de la
espora, tal y como se ha demostrado en C. lindemuthianum (O’Connell et al. 1996). Por otra parte,
los conidios están cubiertos por una capa de material fibroso formada por glicoproteínas que
16
contribuyen a la hidrofobicidad de su superficie y podría estar involucrada en la adhesión rápida a la
superficie de la planta (Hughes et al. 1999; Hutchison et al. 2002).
Germinación de la espora y formación del apresorio. El hongo Colletotrichum forma una
estructura de infección especializada llamada apresorio para realizar la infección del hospedante
(Zulfiqar et al. 1996; Byrne et al. 1997; Bechinger et al. 1999; Money, 1999; Latunde-Dada, 2001;
Wharton et al. 2001; Uhm et al. 2003) Los conidios de Colletotrichum perciben señales (tanto
físicas como químicas) de la superficie de la planta que activan su germinación y la formación del
apresorio (Perfect et al. 1999). En la interacción C. gloeosporioides-aguacate, ambos eventos son
accionados por la presencia de una capa cerosa que cubre la superficie del hospedante, siendo esta
señal específica, ya que las ceras de otras plantas no sustituyen la de este frutal (Podila et al. 1993).
En otras asociaciones de C. gloeosporioides y C. musae con frutos climatéricos, la germinación y
formación del apresorio se estimula con la producción de etileno y de esta manera, las esporas que
se establecen sobre frutos en desarrollo son capaces de germinar y penetran después de ser activadas
por la señal que emite la cera; sin embargo, permanecen latentes hasta que éstos maduran y es
cuando la infección puede ocurrir (Kolattukudy et al. 1995).
La germinación de los conidios ocurre en un período de 12 a 48 horas y el tubo germinativo
que se desarrolla antes de formar un apresorio terminal tiene una longitud de 10 a 20 m). La
formación del apresorio es una característica del género Colletotrichum (Jefries et al. 1990) y es
esencial para que ocurra la infección (Bailey et al. 1992). Sin embargo, existen excepciones que no
requieren la formación de esta estructura para la penetración del hospedante; tal es el caso de C.
acutatum que penetra directamente los pétalos de las flores de cítricos (Zulfiqar et al. 1996).
Durante la germinación del conidio, se produce un septo en muchas especies; excepto en C.
lindemuthianum y C. lagenarium (orbiculare) (O’Conell et al. 1992). Los apresorios con frecuencia
son sésiles, se forman al final del tubo germinativo en las puntas de las ramificaciones miceliales
(Bailey et al. 1992). Cuando jóvenes son ligeramente pigmentados o hialinos y con el tiempo sus
paredes son gruesas y pigmentadas de melanina. La morfología del apresorio de una especie es
constante dentro de un rango de variación limitado. En algunas especies, al madurar son de forma
globosa a oval, o bien lobular. (Jeffries et al. 1990).
17
El apresorio inicia a diferenciarse cuando el crecimiento del tubo germinativo conidial se
detiene y su punta se abulta y se delimita por un septo. Su maduración involucra la formación de un
poro de penetración en la base de la célula, la deposición de nuevas capas de la pared y la secreción
de materiales mucilaginosos, así como el subsecuente deposito de melanina en una capa de la pared
celular (Bailey et al. 1992). En C. lindemuthianum, el poro de penetración es rodeado de un cono
apresorial en forma de embudo que se forma en la capa interna de la pared celular. Esta estructura
carece de quitina o melanina y esta ligada al el pico de penetración. En otras especies de
Colletotrichum, este cono no se forma; sin embargo, la pared celular forma un denso anillo
alrededor del poro. En resumen, el proceso involucra la emergencia del pico de penetración a través
del poro y la penetración de la cutícula de la planta y su pared celular; lo cual involucra una
combinación de fuerzas mecánicas producidas por la presión de turgencia y degradación enzimática
(Perfect et al. 1999).
En C. graminicola, al formarse el apresorio secreta una sustancia adhesiva que lo une a la
superficie de la planta (Sugui et al. 1998) y después de 15 a 18 horas su pared es melanizada,
completando así su diferenciación y madurez (Byrne et al. 1997; Howard, 1997). La adhesión del
apresorio asegura que el patógeno permanece en contacto con el hospedante por el tiempo necesario
para la penetración y también conserva a la hifa en un sitio donde la penetración puede realizarse
con éxito. Su formación está asociada a la secreción de un material mucilaginoso que lo rodea, el
cual puede estar involucrado en la protección del apresorio contra temperaturas extremas y/o a la
desecación, tal y como sucede en el proceso de adhesión (Bailey et al. 1992; Latunde-Dada, 2001).
Penetración de la superficie del hospedante. Los mecanismos de penetración de Colletotrichum
han sido tema de diversas investigaciones. Se ha reportado que existen diferentes modos de
penetración: por aberturas naturales (estomas), heridas o penetración directa de la cutícula de las
plantas; siendo esta última la forma más común (Bailey et al. 1992). La infección a través de las
heridas es poco común; sin embargo, es esencial en algunas enfermedades como la pudrición de la
corona y antracnosis del fruto de plátano (Agrios, 1997). Para muchas especies de Colletotrichum,
especialmente aquellas que atacan tejido vegetativo joven, la habilidad para penetrar directamente la
cutícula es de gran relevancia. La penetración ocurre después de la formación del apresorio y se han
18
propuesto tres mecanismos: 1) aquella basada en una fuerza mecánica, 2) en secreción de enzimas
que degradan la cuticula y 3) una combinación de ambos procesos (Bailey et al. 1992).
La penetración del hospedante ocurre después de que el apresorio madura y es melanizado.
La presencia de este pigmento, permite el desarrollo de una presión hidrostática alta dentro de la
estructura apresorial, lo cual facilita la penetración a la pared celular del hospedante (Howard, 1997;
Jacobson, 2000). Contrariamente, C. graminicola penetra por medio de un poro apresorial sin
melanizar, del cual emerge una hifa de infección y ejerce una fuerte presión de turgencia para
invadir la pared celular del hospedante (Howard et al. 1991; Bechinger et al. 1999). Posteriormente,
se forma una vesícula infectiva que establece el estado biotrófico del hongo durante un período corto
de tiempo. Esta vesícula no penetra la membrana del plasma del hospedante; más bien la membrana
es invaginada alrededor de la vesícula y con el tiempo se forma una hifa primaria externa del
hospedante. Esta forma de crecimiento permite que el hongo tenga mayor asceso a los nutrientes del
hospedante y pueda crecer biotroficamente por 24 a 36 horas hasta su penetración al interior de las
células del hospedante y establecer su estado necrotrofo (Bergstrom y Nicholson, 1999).
Infección y colonización de tejidos. Durante la colonización de plantas hospederas, los hongos
exhiben dos formas principales de nutrición: 1) biotrofía, en donde los nutrientes son obtenidos de
células hospederas vivas y 2) necrotrofía, en la cual son adquiridos de células muertas invadidas por
el patógeno (Perfect et al. 1999). Estas dos estrategias son utilizadas por algunas especies del género
Colletotrichum, las cuales exhiben un proceso de infección que comprende dos fases: una inicial
asintomática, donde el patógeno se establece en el tejido hospedante y es seguido por una segunda
fase destructiva visible. Durante la fase asintomática, el patógeno puede invadir células sin
ocasionar su muerte (Bailey et al. 1992).
Las especies de Colletotrichum utilizan principalmente dos estrategias de infección:
colonización intramural subcuticular y colonización intracelular (Bailey et al. 1992). Los estados de
infección son muy similares en ambos tipos de infección: el conidio se adhiere al tejido hospedante,
germina sobre la superficie de la planta, produce el tubo germinativo y después se desarrolla para
formar un apresorio, el cual penetra directamente la cutícula. Después de la penetración, los
patógenos intramurales subcuticulares se desarrollan debajo de la cutícula mediante la formación de
19
una red intramural de hifas, ocurriendo antes de su diseminación a través del tejido con hifas inter e
intracelulares y de ocasionar la muerte del tejido al avanzar la dispersión micelial (Bailey et al.
1992; Bergstrom y Nicholson, 1999). En este tipo de interacción no existe un estado biotrófico.
Algunos ejemplos de patógenos intramurales subcuticulares son: C. capsici sobre algodón (Roberts
y Snow, 1984) y chícharo de vaca (Bailey et al. 1992). La mayoría de las especies de Colletotrichum
presentan el segundo tipo de estrategia de infección (colonización intracelular), siendo variable el
tiempo del estado biotrófico, el cual puede estar ausente en muchas interacciones. Un ejemplo de
este proceso de infección ocurre en C. lindemuthianum sobre fríjol. Después de la penetración, la
hifa fungal crece en el interior de la célula (entre las membranas del plasma y las paredes celulares
de la planta) sin penetrar los protoplastos del hospedante. Después de colonizar una o más células, la
hifa intracelular biotrófica da lugar a la hifa necrotrófica secundaria (O’Connell et al. 1985; Bailey
et al. 1992). Este hongo inicialmente se alimenta de células vivas y posteriormente cambia a un
estado necrotófrico, considerandose que pertenece al tipo biotrofo facultativo o hemibiotrófico. En
muchas interacciones del hongo Colletotrichum se desconoce si está presente un estado biotrófico.
Sin embargo, es importante que durante la colonización intracelular (biotrófica o no), la planta
hospedera al parecer no reconoce al patógeno y no se da una respuesta específica de resistencia
(Perfect et al. 1999). Algunos ejemplos de diferentes estados biotróficos incluyen las interacciones
entre C. lindemuthianum y frijol (O’Connell et al. 1985) y C. truncatum en chícharo (O’Connell et
al. 1993).
El estado necrotrófico de especies de Colletotrichum ha sido estudiado en el modelo C.
lindemuthianum-frijol. En esta interacción. la necrotrofía está ligada a un incremento en la expresión
de enzimas que degradan la pared celular del hospedante (Wijesundera et al. 1989). Estas
evidencias, demuestran la importancia de las enzimas que degradan la pared celular durante la
infección del hospedante. Asimismo, las enzimas tienen una función importante en el estado
necrotrófico de la interacción y en la aparición de síntomas (Perfect et al. 1999). La naturaleza del
cambio del estado biotrófico a necrotrófico en las interacciones hemibiotróficas ha sido motivo de
debate durante muchos años. Existen diferentes eventos que pueden marcar el inicio de la fase
necrotrófica destructiva. La interfase patógeno-hospedante formada en esta interacción se considera
no especializada en comparación a las interfaces formadas por biotrofos obligados. Esto puede
limitar la efectividad de la hifa intracelular en la adquisición de nutrientes o en el mantenimiento de
20
la viabilidad de la célula del hospedante y de ese modo la necrotrofía es inducida para incrementar la
cantidad de nutrientes disponibles (Green et al. 1995).
Cuando los tejidos de las plantas han sido colonizados por Colletotrichum, ya sea por
infecciones intramurales o intercelulares, el crecimiento del patógeno cambia a un clásico
comportamiento necrotrófico. La fase necrotrófica es responsable de la presencia de síntomas de
tizón y antracnosis, típicos de especies de Colletotrichum. Durante este estado, el patógeno crecen
extensivamente en el interior de las células, en las paredes y en los espacios intercelulares de los
tejidos hospedantes (Bailey et al. 1992).
2.2.5 Análisis molecular de Colletotrichum
La identificación segura de hongos fitopatógenos es esencial para todos los aspectos de la
fitopatología, desde la investigación fundamental de su biología hasta el control de la enfermedad
que ellos causan (McCartney et al. 2003). La identificación tradicional de especies de
Colletotrichum se ha basado principalmente en características morfológicas, especialización del
hospedante y modo de parasitismo (Agostini et al. 1992; Sutton, 1992; Lardner et al. 1999). Sin
embargo, la especialización del hospedante para fines de identificación y descripción de especies
puede conducir a los investigadores a no considerar la especiación basada en otras diferencias
genéticas (Sutton, 1992). La separación taxonómica de algunos aislamientos de Colletotrichum es
incierta cuando se toman únicamente los criterios clásicos de morfología de esporas, tamaño y
patotipo de hospedantes (O’neill et al. 1997).
En la actualidad, el uso de la tecnología basada en el ADN ha permitido contar con nuevas
herramientas para la investigación de la variación genética y de los genes que controlan la
patogenicidad y especificidad en hongos fitopatógenos. Una de las aplicaciones iniciales de esta
tecnología en la fitopatología ha sido la revisión de relaciones taxonómicas de grupos de hongos
causantes de enfermedades en plantas (Michelmore y Huelbert, 1987). El uso de los marcadores
moleculares en los estudios de taxonomía de hongos ha clarificado las relaciones entre muchas taxas
fungales que eran pobremente entendidas con base a únicamente su morfología. Esto es
especialmente importante, debido a que un entendimiento de la identidad y complejidad genética de
una población de un patógeno que infecta a un hospedante en particular, es esencial para el
21
establecimiento de estrategias de manejo efectivas contra la enfermedad (Manners et al. 1992;
Sunnucks, 2000; McCartney et al. 2003; Milgroom y Peever, 2003).
La genética de poblaciones es un tema que se relaciona con la determinación de la extensión
y el patrón de variación genética en las poblaciones con el objetivo de entender sus procesos
evolutivos que afectan el origen y mantenimiento de la variación genética (Milgroom y Fry, 1997).
El conocimiento de la estructura genética de las poblaciones de hongos fitopatógenos proporciona
información sobre aspectos de taxonomía, biología (tipo de reproducción) e historia de vida
(capacidad evolutiva), lo cual permite diseñar estrategias de manejo de la enfermedad (McDonald,
1997). Además, es una herramienta útil para el desarrollo y manejo de la resistencia genética en los
ecosistemas agrícolas (McDonald, 1999).
Los hongos de las plantas con frecuencia muestran una especialización patogénica con
respecto a las especies y los cultivares hospedantes específicos. En los ambientes naturales y los
agrícolas, esta especialización es dinámica, ya que pueden aparecer rápidamente nuevas razas con
un rango de hospedantes diferente. Una descripción molecular de las diferencias genéticas entre
razas fungales proporcionan las bases para investigaciones posteriores de los mecanismos que
generan la variación genética en este hongo (Manners et al. 1992). Las especies de Colletotrichum
presentan una considerable variación patogénica y morfológica, lo cual ha ocasionado dificultades
para su clasificación al usar unicamente caracteres morfológicos (Johnston y Jones, 1997; Sutton,
1980). Las especies de este hongo infectan un amplio rango de hospedantes y son importantes
económicamente. Actualmente, las relaciones genéticas de Colletotrichum y otros grupos de hongos
fitopatógenos se están clarificando con el apoyo de los marcadores moleculares (Mitchelmore y
Hulbert, 1987; Samuels y Siefert, 1995; Johonston y Jones, 1997; Denoyes-Rothan et al. 2003;
Martinez-Culebras et al. 2003; Wharton y Diéguez-Uribeondo, 2004).
Los métodos tradicionales de identificación de especies, subespecies y razas de
Colletotrichum presentan diversas dificultades. Prueba de ello, es la identificación de razas de C.
lindemuthianum mediante cultivares diferenciales de fríjol. El medio ambiente, el número de
esporas y las condiciones de incubación pueden variar considerablemente de un laboratorio a otro.
Además, la subjetividad durante la evaluación de síntomas puede conducir a una clasificación
22
errónea y a desacuerdos en la clasificación de la misma raza por diferentes grupos de investigación
(Mesquita et al. 1998). En los últimos años, los métodos moleculares han sido empleados
exitosamente para diferenciar poblaciones de Colletotrichum en diversos hospedantes (Brown et al.
1996; Johonston y Jones, 1997; Freeman et al. 1998). El uso de marcadores moleculares en
combinación con características morfológicas, culturales y biológicas permiten obtener una
identificación más precisa sobre la taxonomía de hongos (Johonston y Jones, 1997; Latunde-Dada,
2001; Talhinhas et al. 2002; Moriwaki et al. 2003; Cano et al. 2004).
El análisis de isoenzimas es una técnica usada para determinar variación genética en
poblaciones de hongos (Bonde et al. 1993). Esta herramienta permitio caracterizar aislamientos de
C. guaranicola Albuquerque, demostrando la existencia de variaciones en su patrón electroforético,
lo cual indica la ocurrencia de diversidad fenotípica entre aislamientos del hongo (de Melio et al.
1997).
El uso de la técnica para la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con iniciadores
arbitrarios (microsatélites o secuencias repetidas) ha sido usado para agrupar aislamientos de
Colletotrichum spp. en especies o genotipos separados en comparación al agrupamiento hecho por la
taxonomía clásica. Se usaron 39 aislamientos de C. acutatum, C. fragariae y C. gloeosporioides, los
cuales causan antracnosis en el cultivo de la fresa. El uso de PCR-ap permitió agrupar los
aislamientos del hongo en especies o genotipos diferentes. En la mayoría de los casos, el análisis de
los aislamientos con esta técnica correspondió con precisión a la identificación morfotaxonómica
clásica (Freeman y Rodríguez, 1995).
Johonston y Jones (1997) usaron datos de la secuencia del ADN ribosomal (ADNr),
características culturales y morfológicas para clarificar relaciones entre aislamientos de
Colletotrichum asociados a pudriciones de frutos. El empleo de las caracteres culturales y
morfológicos identificaron 16 grupos de aislamientos de C. coccodes, C. musae, C. orbiculare, C.
acutatum, C. gloeosporioides y Glomerella miyabeana. Asimismo, el análisis de las secuencias del
ADNr permitió separar genéticamente los aislamientos en cuatro grandes grupos.
23
La técnica del Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLPs) ha
sido usada ampliamente para estudiar la población genética de especies de Colletotrichum. Esta
herramienta ha permitido desarrollar marcadores genéticos robustos y eficiente para cuantificar la
diversidad genética del hongo C. graminicola, agente causal de la antracnosis del sorgo. Además, es
capaz de examinar la estructura genética en una población de campo y evaluar a través del tiempo
los cambios en las frecuencias de alelos y genotipos. RFLPs demostró que la tendencia genética y el
flujo de genes no fue una gran contribución a la estructura genética, en cambio la reproducción
asexual tuvo un efecto significativo (Rosewich et al. 1998).
También la tecnología del Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos Amplificados
(AFLP) se ha empleado para evaluar los niveles de variación genómica entre C. trifolii y
aislamientos altamente agresivos de Colletotrichum, causante de la antracnosis en alfalfa. El uso de
esta técnica molecular confirmó la taxonomía de los patógenos que atacan a este cultivo y
proporcionó evidencias que las especies de Colletotrichum pueden ser diferenciadas por esta
herramienta. En este estudio se concluye que la técnica AFLP es útil para la identificación de
aislamientos dentro de géneros de hongos complejos, debido a su capacidad de generar un gran
número de polimorfismos y la consistencia de amplificación del PCR. La ventaja de la técnica
AFLP comparada con los análisis RAPDs y RFLPs consisten en que es rápida, relativamente barata,
altamente reproducible, genera una alta frecuencia de polimorfismos AFLP y requiere solamente
pequeñas cantidades de ADN (O’Neill et al. 1997).
Asimismo, los marcadores RAPDs han tenido una gran aceptación en estudios de relaciones
taxonómicas y genética de poblaciones, ya que esta tecnología de PCR es relativamente fácil de
implementarse, es más rápida y económica que otras técnicas moleculares. Además, requiere
solamente pequeñas cantidades de ADN y en vez de iniciadores complementarios para secuencias
conocidas (como en el PCR normal), se usan oligonucleotidos sintéticos generados al azar con 9 a
12 bases como puntos de inicio para polimerasas de ADN (Williams et al. 1990; Winter y Kahl,
1995). El uso de RAPDs se ha utilizado como herramienta para la clasificación de razas de C.
lindemuthianum. La amplificación por PCR del ADN de diferentes aislamientos del hongo produjo
bandas identificadas para un grupo de razas (Mesquita et al. 1998). Con esta misma técnica, fue
factible identificar grupos de C. acutatum y separar especies entre C. acutatum y C. gloeosporioides
24
(Denoyes-Rothan et al. 2003). Además, fue posible determinar las relaciones genéticas entre
aislamientos de C. gloeosporioides colectados en plantas enfermas de fresa con aislamientos de
hospedantes no cultivados (Xiao et al. 2004). En general, el empleo de RAPDs ha sido eficiente para
detectar diferencias entre aislamientos de diferentes especies del hongo y formas especiales. Esta
técnica permitió diferenciar aislamientos de C. gloeosporioides f. sp. malvae de otras especies o
formas especiales de Colletotrichum (Kutcher y Mortensen, 1999) y separó aislamientos de C.
trifolii, C. lindemuthianum, C. destructivum y C. gloeosporioides (Mackie e Irwin, 1998).
Resultados similares fueron obtenidos por Ford et al. (2004), quienes con RAPDs separaron
especies del hongo y aislamientos de hospedantes.
La combinación de características patogénicas y moleculares aporta información valiosa para
identificar razas y detectar variabilidad genética en patotipos de hongos fitopatógenos. González et
al. (1998) usó cultivares diferenciales y marcadores moleculares (RAPDs y AFLP) para analizar
aislamientos de C. lindemuthianum colectados en dos regiones geográficamente diferentes de
México. El uso de diferenciales permitió identificar 10 razas o patotipos del hongo en 59
aislamientos analizados. Las diferencias en las poblaciones del patógeno reflejaron las diferencias en
el germoplasma usado y las prácticas agrícolas empleadas en cada región. Por otra parte, la técnica
AFLP resultó más eficiente que RAPDs en el estudio de las poblaciones del hongo. Las distancias
genéticas basadas en los datos de AFLP y la producción de un dendrograma demostraron dos niveles
de asociación: 1) los aislamientos del hongo fueron clasificados en dos grandes grupos de acuerdo al
tipo de cultivar o sistema de cultivo del cual se originaron y 2) los aislamientos pudieron ser
clasificados en pequeños subgrupos generalmente asociados con la localización geográfica de la que
fueron obtenidos.
En otro estudio, 138 aislamientos de C. lindemuthianum procedentes de diversos países del
continente Americano fueron caracterizados en 41 razas con base a su virulencia a cultivares
diferenciales de fríjol. Además, el uso de marcadores moleculares confirmó la gran diversidad
genética que existe en las poblaciones de este hongo. Con marcadores RAPDs se separó el total de
aislamientos en 15 grupos. El agrupamiento con el dendrograma no se relacionó con la localización
geográfica o con el grupo de genes del hospedante del cual el aislamiento fue obtenido. Asimismo,
no hubo congruencia entre el dendrograma obtenido de RAPDs con el de virulencia, lo que indica
25
que este hongo al parecer no está altamente estructurado a un grupo de genes específicos de
Phaseolus vulgaris (Balardin et al. 1997).
Un estudio realizado con hospedantes diferenciales del hongo C. gloeosporioides, causante
de la antracnosis en diversas especies de leguminosas forrajeras tropicales, demostró que existe un
extenso rango de variación patogénica en la población global del patógeno. Asimismo, los
marcadores RAPDs identificaron una gran diversidad genética entre las poblaciones del hongo
procedentes del centro de diversidad patógeno-hospedante (América del Sur). Contrariamente, la
variación genética del patógeno fuera de su centro de diversidad (Australia) fue muy limitada. En
este trabajo no se detectó una relación estrecha entre los marcadores de virulencia con los
marcadores genéticos (Chakraborty et al. 1997a). Estudios similares con este patógeno confirmaron
la falta de asociación entre los genotipos RAPDs y las razas del patógeno, lo cual sugiere que las
razas se han originado de manera independiente dentro de cada grupo genético (Chakraborty et al.
1997b).
Otros estudios con RAPDs no detectaron variabilidad genética entre aislamientos de C.
gloeosporioides f. sp. malvae colectados en la maleza hoja de terciopelo (Abutilon theophrasti
Medic.) (Kutcher y Mortensen, 1999). Resultados similares han sido obtenidos con una colección de
aislamientos de C. trifolii, los cuales revelaron baja diversidad genética (< del 10% de disimilaridad)
(Mackie e Irwin, 1998) y con aislamientos de C. acuatum en tamarillo (Solanum betaceae cav.
Sendt) (Afanador-Kafuri et al. 2003). Esta falta de diversidad genética sugiere que los aislamientos
examinados representan un grupo homogéneo con un rango específico de hospedantes. Además,
puede ser una evidencia de que la recombinación sexual no ocurre en el área geográfica donde se
colectaron. La ausencia de reproducción sexual puede conducir a una baja diversidad genética según
Mackie e Irwin, (1998); Kutcher y Mortensen, (1999);
En conclusión, el uso de marcadores moleculares RAPDs es una herramienta vigente que
permite generar información sobre genética de poblaciones de hongos fitopatógenos y ayuda a
clarificar relaciones taxonómicas entre especies y razas o biotipos. Son especialmente útiles en
diferenciar linajes clonales para hongos que se reproducen asexualmente. Además, los RAPDs son
fáciles de interpretar debido a que están basados en la amplificación o no amplificación de
26
secuencias de ADN específico y que producen un set de datos binarios fáciles de registrarse en una
hoja de cálculo para su análisis (McDonald, 1997).
2.3 Antracnosis en cítricos
2.3.1 Importancia de antracnosis
Las enfermedades conocidas como antracnosis de los cítricos son causadas por hongos del
género Colletotrichum spp, consideradas un serio problema en regiones con características de clima
tropical y subtropical (Jeffries et al, 1990; Dodd et al. 1992). Este grupo lo constituyen las
enfermedades que causan la caída de fruto pequeño, antracnosis del limón mexicano y antracnosis
en postcosecha (Timmer et al. 1994; Timmer 2000a), de las cuales las dos primeras ocasionan daños
importantes en la producción de fruta en varias especies de cítricos (Timmer et al. 1994).
Caída de fruto pequeño. La caída de fruto pequeño afecta principalmente naranja, toronja y limón
Persa. Se reportó por primera vez en Belice en el año de 1959 (Fagan, 1979) y posteriormente se
detectó en 1968 en México. Actualmente, ocurre en la mayoría de las zonas productoras del estado
de Veracruz, Tamaulipas y Tabasco en la República Mexicana. Asimismo, se reporta en Florida,
E.U.A. (McMillan y Timmer, 1989; Timmer et al. 1994); Cuba, República Dominicana, Trinidad y
Jamaica en el Caribe (Timmer et al. 1994); Panamá, Guatemala, El Salvador y Costa Rica en
América Central; Argentina, Brasil, Colombia, Perú, Ecuador y Venezuela en Sudamérica
(McMillan, 1993). La enfermedad se presenta en regiones citrícolas que registran lluvias durante los
períodos de floración-fructificación. En ataques severos puede reducir el rendimiento en un 49% en
huertos de naranja Valencia. En México, en los últimos años ha cobrado una gran importancia,
llegando a ocasionar pérdidas hasta de un 70%. En Florida, se estima que alrededor de cinco a seis
frutos se pierden por cada 100 botones florales a causa de la enfermedad. Considerando que los
porcentajes de amarre de fruto para naranja Navel son de 1.5 a 2.0% y para naranja Valencia de 4 a
5%, las pérdidas ocasionadas por la enfermedad pueden llegar a más de 100 frutos por árbol
(Timmer y Zitko, 1995). Durante 1993, la caída de fruto pequeño fue un serio problema en Florida.
En algunas localidades se registraron pérdidas en rendimiento hasta de un 100% en naranja Navel,
mientras que en naranja Valencia fueron de un 20 a 50% (Timmer y Zitko, 1993b).
27
Antracnosis del limón mexicano. La antracnosis es el principal problema fitosanitario que afecta
los tejidos jóvenes de árboles de limón mexicano. La enfermedad es un factor importante que limita
la producción de esta especie citrícola en regiones donde coinciden las lluvias frecuentes con la
ocurrencia de brotes vegetativos y flores, así como con los estados iniciales de desarrollo de los
frutos (Timmer, 2000b). En México, la enfermedad se presenta en los estados de Colima, Jalisco,
Michoacán, Guerrero, Oaxaca y Tamaulipas (Garza y Medina, 1984). También se ha reportado en
algunas Islas del Caribe y Zanzíbar (Timmer, 2000b). En ataques severos, ocasiona la muerte de
tejidos jóvenes (brotes, hojas y flores) y caída de flores y frutos pequeños. Además, produce
lesiones en frutos en desarrollo, mismas que se manifiestan al momento de la cosecha, lo cual
demerita su calidad externa. En árboles adultos reduce el rendimiento y la calidad de la fruta,
mientras que en árboles jóvenes retrasa su desarrollo (Timmer, 2000b; Timmer y Brown, 2000). Los
daños de antracnosis (muerte de tejidos) en árboles de limón mexicano se presentan principalmente
durante la época de lluvias y su efecto en rendimiento está muy relacionado con la producción de los
meses de invierno (Diciembre a Marzo). En esta época, el precio de la fruta alcanza los valores más
altos en el mercado. La enfermedad puede ocasionar pérdidas de 40 a 60% de la producción invernal
en huertos sin control químico (Medina et al. 2001).
2.3.2 Síntomas
La enfermedad caracterizada por la caída del fruto pequeño afecta principalmente a naranjas
de los cultivares Valencia y Navel, así como al limón Persa y toronja. Se presenta durante el período
de floración principal que ocurre en los meses de febrero-marzo y es más severa en naranja dulce
que en toronja y limón Persa (Timmer et al. 1994). Los primeros síntomas de la enfermedad se
manifiestan en los pétalos como una necrosis acuosa de color naranja a café; los pétalos necrosados
quedan adheridos a la parte basal del disco floral con apariencia dura, seca y de color café rojizo. En
ataques severos, el patógeno afecta racimos florales enteros cuando las condiciones para su
desarrollo son favorables. Posteriormente, los frutos en desarrollo toman una coloración amarillenta
en la base, que avanza hasta cubrirlos por completo y ocasiona su caída cuando tienen
aproximadamente un centímetro de diámetro. El síntoma característico de esta enfermedad es que al
caer el fruto, tanto el pedúnculo como el receptáculo y cáliz permanecen adheridos a la rama
(McMillan, 1993; Timmer et al. 1994; Timmer, 2000a). Estas estructuras se conocen como
28
"tachuelas" en los estados citrícolas del Golfo de México. Las tachuelas están rodeadas por hojas
levemente distorsionadas y con nervaduras prominentes (Timmer et al. 1994), crecen más que lo
normal, pueden permanecer adheridas a las ramas por un año o más y no afectan la intensidad de
floración ni la producción de fruta de los años siguientes (Futch et al. 1989). Las flores y frutos
jóvenes que se encuentran cerca de flores afectadas también están propensas a caer antes del amarre
de fruta y formar tachuelas pesistentes. Estas observaciones sugieren que algunas fitohormonas
podrían estar involucradas en el desarrollo de estos síntomas (Timmer y Brown, 2000). Estudios
recientes han demostrado la habilidad de C. acutatum para producir ácido indol acético y
compuestos relacionados, lo cual puede contribuir parcialmente a incrementar los niveles de esta
fitohormona en las flores de cítricos infectadas (Chung et al. 2003). La abscisión del fruto
ocasionada por la enfermedad ocurre en la base del ovario, lo que contrasta con la abscisión
provocada por los procesos fisiológicos normales del árbol, la cual ocurre en la base del pedúnculo.
La antracnosis del limón mexicano afecta a brotes, flores y frutos jóvenes, cuando la
emergencia y desarrollo de éstos coincide con períodos lluviosos, provocando que en las partes
afectadas se observe una abundante esporulación con aspecto de polvillo color salmón, que
corresponde a las masas conidiales del hongo. Los brotes afectados se pueden marchitar y
eventualmente morir a partir de las puntas, en porciones que varían de uno a varios centímetros,
dependiendo de la severidad. En ataques fuertes, las hojas y brotes pueden ser dañados en su
totalidad. Cuando ésto ocurre, se observan brotes con síntomas de muerte descendente. Bajo
condiciones de daño medio, en las hojas jóvenes aparecen deformaciones y zonas muertas en el
borde o el ápice. Cuando la infección es poco severa o si las hojas están totalmente expandidas al
momento de la infección, sólo éstas llegan a ser afectadas en forma parcial, o bien ocasionar lesiones
cloróticas y deformación. Asimismo, en las hojas se observan pequeñas lesiones redondas de tamaño
pequeño, las cuales con el tiempo se llegan a necrosar. Estas lesiones en las hojas, con el tiempo
pueden caer produciendo un pequeño orificio ocasionando el síntoma típico de “tiro de munición”.
Los racimos florales pueden ser dañados en su totalidad por la enfermedad. Los botones afectados
pueden desprenderse sin haber abierto, mientras que las flores presentan una necrosis de color café
rojizo en los pétalos, los cuales permanecen adheridos al cáliz por algún tiempo junto con los frutos
pequeños. Al desprenderse los frutos infectados, algunas estructuras florales como el receptáculo,
cáliz y pedúnculo quedan adheridas a la rama y son conocidas como “tachuelas”. Este síntoma es
29
característico del daño de antracnosis en limón mexicano. Los frutos pueden ser atacados por la
enfermedad hasta un determinado estado de desarrollo, siendo la susceptibilidad directamente
proporcional a la edad. Entre más joven es el fruto, éste es más susceptible a antracnosis y la
resistencia se incrementa con la edad. Los frutos pequeños pueden caer o quedar momificados y
adheridos a la rama. Asimismo, los frutos afectados pueden permanecer en el árbol hasta su madurez
y las lesiones forman costras corchosas levantadas que pueden abarcar hasta la mitad de su
superficie. También es frecuente que el fruto se agriete al nivel de la lesión corchosa y deje al
descubierto las vesículas de jugo (Garza y Medina, 1984; Timmer, 2000b; Medina et al. 2001).
2.3.3 Etiología
Durante mucho tiempo, el causante de la caída de fruto pequeño fue atribuido a una raza del
hongo C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz. que produce en medio de cultivo una
colonia de color naranja de lento crecimiento (Agostini et al. 1992; Sonoda y Pelosi, 1988). Por otra
parte, La antracnosis del limón mexicano fue descrita originalmente por Clausen en 1912, su agente
causal fue atribuido al hongo Gloeosporium limetticola Clausen y posteriormente se consideró como
una forma de Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. (Sutton, 1980). Agostini et al.
(1992) caracterizaron dos razas involucradas en las enfermedades conocidas como caída de fruto
pequeño y antracnosis del limón mexicano. La primera se atribuyó a la raza SGO (colonias de color
naranja y lento crecimiento) de C. gloeosporioides y la segunda a la raza KLA (raza del limón
mexicano) del mismo hongo. Estudios posteriores con técnicas moleculares demostraron que ambas
razas corresponden a Colletotrichum acutatum Simmonds (Brown et al. 1996). C. acutatum produce
conidios hialinos, unicelulares que miden de 12 a 20 µm de largo por 4 a 6 µm de ancho y una
elevada proporción con un lado redondeado y otro fusiforme con relación a conidios con ambos
lados redondeados. Estas esporas se producen en estructuras llamadas acérvulos (Timmer 2000b).
Asimismo, forma apresorios redondeados y pequeños (Agostini et al. 1992).
Con relación a su patogenicidad, la raza que produce la antracnosis del limón mexicano
inicialmente se reportó que afectaba sólo a éste y que otras especies de cítricos eran inmunes
(Timmer, 2000b). Sin embargo, únicamente tejido vegetativo se había inoculado en los estudios
previos. Investigaciones posteriores han demostrado que la raza KLA produce todos los síntomas de
la caída de fruto pequeño al inocular flores de naranjo dulce y limón Persa. Contrariamente, la raza
30
SGO de color naranja de lento crecimiento procedente de pétalos de naranjo dulce afectados por la
caída de fruto pequeño sólo causan un ligero manchado clorótico en hojas de limón mexicano
(Agostini et al. 1992). De acuerdo a estos resultados, se pensó que la raza SGO pudo haberse
originado de la raza KLA y que la enfermedad caracterizada por la caída de fruto pequeño pudo ser
el resultado de la invasión a plantaciones de otras especies de cítricos por la raza KLA. El cultivo
del limón mexicano se encuentra distribuido en las regiones tropicales; sin embargo, en climas
húmedos está comúnmente confinado a plantaciones de traspatio debido a la severidad de la
antracnosis en este tipo de clima. Una vez introducida la raza KLA en huertos de naranjo dulce
puede causar la caída de fruto pequeño y posteriormente perder su patogenicidad al limón mexicano
(Agostini et al. 1992; Timmer et al. 1994). Actualmente se conoce que ambas razas pueden tener un
origen independiente según resultados con marcadores moleculares (Peres et al. 2003).
2.3.4 Epidemiología
La caída de fruto pequeño se presenta en regiones con lluvias durante el período de floración.
De acuerdo a Agostini y Timmer (1994), el ciclo de la enfermedad ocurre de la siguiente manera: los
conidios del hongo se producen de manera abundante en los acérvulos formados sobre los pétalos de
flores infectadas durante la primavera. Estos conidios son lavados por las gotas de agua de lluvia o
rocío y depositados en los tejidos vegetativos del árbol, en donde pueden germinar para formar
apresorios o permanecer sin germinar y ocasionar infecciones latentes. En ausencia de floración,
estos propágulos pierden viabilidad con el tiempo. Sin embargo, cuando se inicia la floración, los
pétalos que caen sobre la superficie de las hojas proporcionan algunas sustancias que estimulan la
germinación del apresorio para formar conidios, los cuales son diseminados hacia las flores nuevas
por el salpique de las gotas de agua de lluvia, reiniciando de esta manera el ciclo de la enfermedad.
Su daño es más severo y puede manifestarse de manera epidémica cuando se presentan lluvias,
períodos prolongados con alta humedad relativa y temperaturas bajas durante la floración y "amarre"
del fruto (Fagan, 1984; Agostini et al. 1993). La temperatura óptima para la germinación de la
espora es de 23 °C y el tiempo mínimo para la infección y germinación es de 12 a 18 horas. Si las
condiciones húmedas prevalecen, alrededor del 90 % de las flores pueden mostrar síntomas a los 3-4
días después de la infección. Sobre las flores afectadas se producen numerosos acérvulos, lo cual
incrementa drásticamente el número de esporas patogénicas dentro del árbol (Timmer, 2000a). Las
flores son resistentes al patógeno cuando los botones presentan de un estado de cabeza de alfiler a
31
botón en estado redondo y son susceptibles cuando se empiezan a elongar y son altamente
susceptibles una vez que se abren (Fagan, 1979). La enfermedad empieza a aparecer cuando el botón
floral tiene un centímetro de largo. El hongo C. acutatum sobrevive entre períodos de floración
como apresorios y/o infecciones latentes sobre las tachuelas adheridas, hojas y ramas (Agostini y
Timmer, 1994). Estudios recientes han demostrado que el número de tachuelas adheridas en ramas
de los años previos es el mejor indicador del potencial de la enfermedad en la próxima floración. La
evaluación de las tachuelas adheridas se realiza durante el mes de Enero en 12 ramas distribuidas
alrededor de los árboles, en las cuales es factible registrar hasta 338 tachuelas (Timmer y Zitko,
1995).
La antracnosis del limón mexicano se presenta con mayor severidad durante el período de
lluvias, temperaturas máximas de 31°C y mínimas de 24°C y con valores de humedad relativa
superior al 90 %. En condiciones del trópico seco, la lluvia es el factor más importante que se
relaciona con la incidencia y severidad de la enfermedad, sobre todo cuando ocurren precipitaciones
de dos a cinco días consecutivos (Garza y Medina, 1984; Medina et al. 2001). Los conidios de la
raza KLA de C. acutatum son liberados solamente cuando el acérvulo o la masa de conidios está en
contacto con el agua, ya que tanto las gotas de lluvia como del rocío los salpica y dispersa (Garza y
Medina, 1984). También pueden ser diseminados por insectos o herramientas de cultivo; sin
embargo, esta forma de dispersión tiene poca importancia en la epidemiología de la enfermedad. La
infección del hongo se lleva a cabo mediante la penetración directa en hojas, brotes, frutos y flores,
en donde el micelio crece intercelularmente y produce colapso y muerte de los tejidos. La raza KLA
tiene un período de incubación muy corto; después de la infección, los primeros síntomas pueden
observarse en 3 a 5 días. En las áreas afectadas se pueden observar masas de conidios de color rosa.
Los tejidos son más susceptibles cuando son jóvenes y la resistencia se incrementa con la edad. Las
hojas llegan a ser inmunes al ataque de la raza antracnosis del limón mexicano cuando completan su
expansión. El fruto es susceptible a la infección por C. acutatum desde su formación hasta que
alcanza un tamaño de 20 mm de diámetro (Timmer, 2000b).
Con frecuencia, la infección por Colletotrichum es la causa directa de enfermedades de las
plantas; sin embargo, el hongo se presenta también como un saprofito o invasor secundario de
tejidos en decadencia. Las pérdidas causadas por antracnosis ocurren principalmente como una
32
reducción directa de la cantidad y calidad del producto cosechado. El hongo ataca frecuentemente
más de una parte de la misma planta, lo que ocasiona enfermedades separadas que pueden
interactuar durante el ciclo del cultivo (Waller, 1992). Así el limón mexicano, es un ejemplo donde
varios órganos (brotes, hojas, flores y frutos) pueden ser infectados por la enfermedad y en donde el
inóculo de una fuente es capaz de infectar a otro (Garza y Medina, 1984; Timmer, 2000b). El ciclo
de vida de la raza KLA en limón mexicano es muy similar al de la raza SGO en naranja propuesto
por Agostini et al. (1992), Timmer et al. (1994); Timmer et al. (2000a) y Peres et al. (2005).
2.3.5 Manejo integrado de la enfermedad
El manejo integrado de enfermedades se define como una herramienta sustentable para el
combate de patógenos, mediante la combinación de métodos biológicos, culturales, físicos y
biológicos que minimice los riesgos económicos, de salud y ambientales (Hollier, 2004). El manejo
integrado de antracnosis contempla el uso de los diferentes métodos de control apoyado por el
conocimiento del cultivo (susceptibilidad a la enfermedad, interacción con el portainjerto, fenología,
órganos afectados y edad del huerto), de la enfermedad (especie del hongo, ciclo de la enfermedad,
reproducción, diseminación, período de incubación, fuente de inóculo y sobrevivencia) y del clima
(precipitación, temperatura, rocío, radiación solar y humedad relativa).
El control de la caída de fruto pequeño se basa principalmente en la aplicación de fungicidas
durante los períodos de lluvias frecuentes en la época de floración. Los fungicidas benomyl y
captafol han resultado efectivos para el control de la enfermedad (Timmer et al. 1994; Timmer y
Zitko, 1992). En condiciones favorables para el desarrollo del patógeno (lluvias, alta humedad
relativa y temperaturas bajas) durante la floración y cuando se espere un ataque fuerte de la
enfermedad se requiere un mayor número de aplicaciones de estos productos. Algunos estudios
realizados en Florida, indican que cuando la incidencia de la enfermedad es baja se requiere una
aplicación de fungicidas a media floración, o dos aplicaciones, una al inicio de la floración y otra a
media floración. En localidades o años con ataques severos son necesarias aplicaciones semanales o
cada 10 días. En todos los casos, los fungicidas utilizados fueron el benomyl y captafol. Estos
resultados indican que el número de aplicaciones de fungicidas más que el momento de aplicación
durante todo el período de floración parece ser el factor determinante para lograr un control
adecuado de la enfermedad (Timmer y Zitko, 1992). En caso de que los productores no dispongan
33
suficiente equipo terrestre para asperjar plantaciones extensas en un período de tiempo corto, una
alternativa viable son las aplicaciones aéreas. Se ha demostrado que las aspersiones con avión son
iguales de efectivas en el control de la caída de fruto pequeño que las aplicaciones con equipo
terrestre (Timmer y Zitko, 1991).
Con relación a la antracnosis en el cultivo del limón mexicano, el control químico es la alternativa
más común y eficaz para reducir los daños ocasionados; sin embargo, para obtener mejores
resultados, el uso de fungicidas debe ser apoyado con algunas prácticas culturales como son: poda,
adelanto de brotes vegetativos e inducción de floración, manejo de riego, fertilización y cosecha
oportuna de la fruta (Medina et al. 2001). Las prácticas de cultivo están orientadas a reducir las
condiciones favorables para el establecimiento y desarrollo del patógeno, inducir el vigor de los
árboles, establecer barreras físicas y/o eliminar fuentes de inóculo dentro de la plantación
(Moorman, 2004). En el caso del limón mexicano, algunas de estas labores están dirigidas a la
inducción de brotes y flores, los cuales serán protegidos contra antracnosis con aspersiones de
fungicidas y de esta manera tener posibilidades de producción en invierno. Además, es importante
realizar una supervisión periódica del huerto para identificar flujos vegetativos y florales, sobre todo
durante los meses de Julio a Octubre, época en la que se presenta la enfermedad con mayor
intensidad (Medina et al. 2001). La raza KLA tiene un período de incubación muy corto (hasta 3 a 5
días), lo que dificulta su control en campo; aunado al habito de crecimiento inherente del limón
mexicano, el cual emite brotes y flores la mayor parte del año que hace necesario realizar numerosas
aplicaciones de fungicidas para su combate, incrementando los costos de producción (Timmer,
2000b). Actualmente, el control de la enfermedad se realiza mediante la aspersión de los fungicidas
protectantes (mancozeb y captafol) y sistémicos (benomyl y azoxystrobin).
Se han realizado algunos intentos de control biológico de la raza SGO del hongo C. acutatum,
agente causal de la caída de fruto pequeño en cítricos. El control biológico consiste en el uso de
organismos naturales o modificados, genes o productos de genes que reducen los efectos de
organismos indeseables tales como patógenos de plantas y para favorecer organismos deseables
como los cultivos agrícolas. Las enfermedades de las plantas pueden ser controladas con
microorganismos vivos que son antagónicos a hongos fitopatógenos. Los mecanismos de control
biológico de patógenos de plantas incluyen antibiosis, parasitismo, competencia, resistencia
34
sistémica adquirida, portección cruzada e hipovirulencia (Ownley y Windham, 2004). Al respecto,
Kupper et al. (2003) evaluó el efecto de diferentes aislamientos de los antagonistas Bacillus subtilis
y Trichoderma spp. bajo condiciones de laboratorio y campo. Los resultados en árboles de naranja
dulce Cv. ‘Natal’, demostraron la efectividad de algunos tratamientos de B. subtilis y T.
aureoviridae en reducir el porcentaje de flores con síntomas de la enfermedad en comparación al
tratamiento testigo. Sin embargo, el corto período de incubación del patógeno desde la llegada del
conidio hasta el establecimiento de la infección limita la efectividad de los antagonistas por el
tiempo reducido en que C. acutatum permanece vulnerable.
35
III MATERIALES Y METODOS
En el presente estudio se evaluó la patogenicidad de dos razas (KLA y PFD) del hongo C.
acutatum y un aislamiento de C. gloeosporioides en tres especies de cítricos (limón mexicano, limón
Persa y naranja Valencia) con el propósito de determinar diferencias patogénicas entra aislamientos
de diferente origen geográfico. Por otra parte, se realizó una caracterización morfológica y genética
de aislamientos del hongo C. acutatum (raza KLA y PFD) colectados de hospedantes cítricos en las
regiones productoras de Citrus en México. Se incluyo un aislamiento saprofito del hongo C.
gloeosporioides en cítricos.
3.1 Sitio Experimental
El trabajo se realizó en dos sitios:
1). Las actividades de aislamiento de los hongos, obtención de cultivos monospóricos, conservación,
caracterización moroflógica y desarrollo de la técnica RAPDs se realizó en el Laboratorio de
Biotecnología en las instalaciones de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la
Universidad de Colima, localizado en el kilómetro 40 de la Carretera Colima-Manzanillo en el
municipio de Tecomán, Col. Su ubicación geográfica se situa a 18º 54’ longitud Norte y 103º 52’
latitud Oeste y 33 metros sobre el nivel del mar. El clima se considera cálido seco con una
precipitación promedio de 710 mm, temperatura media de 26 ºC y humedad relativa de 71% (SPP-
INEGI, 1995).
2). Las pruebas de patogenicidad con los aislamientos del hongo y el mantenimiento de las plantas
inoculadas se llevaron a cabo en las instalaciones del Campo Experimental Tecomán perteneciente
al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, ubicado en el kilómetro
35 de la carretera Colima-Manzanillo en el municipio de Tecomán, Col.
3.2 Patogenicidad de Colletotrichum acutatum y C. gloeosporioides.
3.2.1 Aislamiento de Colletotrichum spp
Se colectaron aislamientos de la raza KLA del hongo C. acutatum, causante de la antracnosis
del limón mexicano, de tejidos afectados (brotes, hojas y flores) de limón mexicano (Citrus
36
aurantifolia Christm. Swingle) en diferentes estados productores de México: Colima, Michoacán,
Jalisco, Nayarit, Guerrero, Oaxaca, Tamaulipas y Veracruz. Asimismo, se obtuvieron aislamientos
de la raza PFD (postbloom fruit drop) de C. acutatum, causante de la caída de fruto pequeño, de
flores afectadas de limón Persa (Citrus latifolia Tanaka) y naranja Valencia (C. sinensis L. Osbeck)
en los estados de Veracruz, Tabasco y Tamaulipas. Además, se colectó un aislamiento de C.
gloeosporiodes (que habita como saprofito o causante de la antracnosis en frutos en postcosecha) de
ramillas muertas de limón mexicano (Cuadro 1).
El procedimiento para aislar el hongo se basó en los métodos empleados por Agostini et al.
(1992) para C. acutatum en cítricos o por Manandhar et al. (1995) para C. capsici y C.
gloeosporioides en chile y adaptado para limón mexicano. Los aislamientos de C. acutatum se
obtuvieron a partir de trozos de tejido vegetal joven (hojas, brotes y flores) infectado por la
enfermedad. El tejido se desinfectó con hipoclorito de sodio al 5% durante dos min, se dejó secar en
trozos de papel filtro estéril (3 x 3 cm) en una campana de flujo laminar durante 10 min y fue
sembrado en cajas de petri con medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA). Se colocaron cuatro
trozos de tejido infectado por caja de petri. A los tres días después de la siembra, el hongo C.
acutatum mostraba características suficientes (color de la colonia, tipo de crecimiento del micelio y
velocidad de crecimiento) de acuerdo a Agostini et al. (1992) para diferenciarlo de algunos
contaminantes que se presentaron (Fusarium, Aspergillus, Penicullium y Curvularia). Una vez
identificadas las colonias típicas del hongo se procedió a tomar una porción de la punta de las hifas
para su purificación. Este paso se realizó dentro de la campana de flujo laminar y los trozos de PDA
con hifas fueron transferidos a cajas de petri con este medio de cultivo, depositando una colonia por
caja. Todos los aislamientos del hongo fueron incubados en la oscuridad a 27 °C durante siete días.
Este procedimiento para aislar el hongo es similar al empleado por Agostini et al. (1992). Para el
aislamiento de C. gloeosporioides habitando como saprofito en brotes se utilizó la metodología
empleada por Manandhar et al. (1995) para aislar C. capsici y C. gloeosporioides en el cultivo de
chile y adaptada para limón mexicano. Se colectaron brotes maduros de limón mexicano infectados
por antracnosis que presentaban muerte descendente de ramillas. Con la ayuda de un microscopio
estereoscópico se localizaron acérvulos maduros del hongo y mediante un pinchazo con una aguja
estéril, se colectaron conidios que fueron colocadas en 5 ml de agua destilada estéril. De esta
suspensión conidial se tomaron 0.5 ml y fueron depositados en PDA y distribuidos en todo el medio
37
de cultivo contenido en la caja de petri. Los conidios individuales germinados se seleccionaron con
la ayuda de un microscopio estereoscópico y transferidos nuevamente a PDA. Los aislamientos con
características de C. gloeosporioides fueron seleccionados y se mantuvieron en PDA a 27 °C
(Agostini et al. 1992).
Los aislamientos fueron tentativamente agrupados de acuerdo a su hospedante y a sus
características morfológicas según Agostini et al. (1992): 1) aislamientos de la raza KLA de C.
acutatum de lento crecimiento con pigmentación naranja intensa colectados en limón mexicano 2)
aislamientos de la raza PFD de C. acutatum (anteriormente considerada como raza SGO de C.
gloeosporioides) de lento crecimiento con abundante producción de masas conidiales de color
naranja obtenidos en naranja Valencia y limón Persa y 3) aislamiento de C. gloeosporioides
(anteriormente considerada raza FGG) de rápido crecimiento con producción de micelio con
pigmentación gris colectado como saprofito en limón mexicano.
3.2.2 Obtención de cultivos monospóricos
De cada aislamiento de Colletotrichum spp se obtuvo un cultivo a partir de un conidio con un
procedimiento similar al utilizado por Manandhar et al. (1995). Se tomaron colonias de ocho días de
edad desarrolladas en cajas de petri con papa-dextrosa-agar, en las cuales en su parte media (sitios
donde la colonia se desarrolló a los cuatro días) se depositaron 200 microlitros de agua destilada
estéril con una micropipeta estéril. El agua fue mezclada con el micelio y conidios con la ayuda de
una aguja de disección estéril; posteriormente se recuperó la solución con la misma micropipeta y
fue llevada a 5 ml de agua estéril. Se tomaron 500 microlitros de la suspensión conidial para
depositarlos en el centro de una caja de petri con PDA, la cual fue distribuida con una aguja de
disección en todo el medio de cultivo. Cada aislamiento fue incubado a 27 °C durante 24 horas. Con
la ayuda de un microscopio estereoscópico, de cada aislamiento se seleccionó un conidio individual
germinado y se transfirió a medio de cultivo papa-dextrosa-agar para mantenerse a 27 °C (Agostini
et al. (1992).
3.2.3 Conservación de los aislamientos
Los aislamientos del hongo Colletotrichum spp fueron conservados como suspensión
conidial en glicerol al 15% en agua bidestilada estéril, utilizando tubos de crioconservación
38
Eppendorf de 2 ml de capacidad, los cuales fueron mantenidos en un ultracongelador a –80 °C ±1
(Lardner et al. 1999; Weising et al. 1995). La conservación se realizó en las instalaciones del
Laboratorio de Biotecnología.
3.2.4 Inóculo
Se prepararon suspensiones conidiales en agua destilada estéril a partir de colonias del hongo
de 12 días de edad crecidos en papa-dextrosa-agar a 27 °C (Brown et al. 1996). Las cajas de petri
fueron inundadas con agua bidestilada estéril y con un pincel de cerdas finas se raspó la superficie
de la colonia para desprender el micelio y conidios del medio de cultivo. La suspensión conidial fue
transferida a 15 ml de agua destilada estéril. Los conidios se lavaron dos veces en agua bidestilada
estéril mediante centrifugación durante dos min a 3,000 rpm con la finalidad de remover el mucílago
que los cubre (Kim et al. 1999) y eliminar inhibidores de su germinación (Lax et al. 1985). Se
preparó una suspensión con 5 x 105 conidios por ml (Agostini et al. 1992).
3.2.5 Pruebas de patogenicidad
Se realizaron pruebas de patogenicidad con 12 aislamientos obtenidos de tres especies de
cítricos: limón mexicano, limón persa y naranja. Los aislamientos fueron seleccionados al azar,
procurando contar con un especímen de cada entidad citrícola: ocho de la raza KLA de C. acutatum
aislados de limón mexicano en Colima (A56LMCOL), Michoacán (A35LMMIC), Jalisco
(A13LMJAL), Nayarit (A25LMNAY), Guerrero (A04LMGRO), Oaxaca (A01LMOAX),
Tamaulipas (A54LMTAM) y Veracruz (A42LMVER); dos de la raza PFD de C. acutatum
obtenidos de naranja Valencia en Veracruz (A34NVVER) y Tabasco (A120NVTAB); uno de la raza
PFD de C. acutatum aislado de limón Persa en Veracruz (A43LPVER); y uno de C. gloeosporioides
obtenido como saprofito de ramillas muertas de limón mexicano en Colima (A62LMCOL) (Cuadro
1).
Se utilizaron plantas de limón mexicano de 18 a 24 meses de edad sobre patrón Macrofila (C.
macrophylla Western) y plantas de naranja Valencia y limón Persa de tres a cuatro años de edad
sobre Volkameriana (C. volkameriana). Las tres especies de cítricos fueron desarrolladas en bolsas
de plástico de color negro para vivero con dimensiones de 90 x 60 cm. Ee cada especie citrícola, se
inocularon de tres a cinco racimos florales por planta. Para cada aislamiento se prepararon
suspensiones de 5 X 105 conidios por ml (Agostini et al. 1992).
39
Cuadro 1. Relación de aislamientos de Colletotrichum spp colectados en tres especies de cítricos en regiones productoras de México.
Especie/aislamiento Hospedante Localidad/Municipio/Estado Tejido
Raza KLA de C. acutatum A12LMCOL A14LMCOL A15LMCOL A19LMCOL A56LMCOL A68LMCOL A74LMCOL A85LMCOL A88LMCOL A98LMCOL A99LMCOL A108MCOL A22LMNAY A13LMJAL A17LMJAL A20LMJAL A35LMMIC A36LMMIC A37LMMIC A38LMMIC A49LMMIC A04LMGRO A06LMGRO A07LMGRO A27LMGRO A28LMGRO A31LMGRO A02LMOAX A03LMOAX A05LMOAX A09LMOAX A46LMTAM A50LMTAM A51LMTAM A52LMTAM A53LMTAM A54LMTAM A55LMTAM A42LMVER
limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano
Marabasco, Manzanillo, Colima Caleras, Tecomàn, Colima Santiago, Manzanillo, Colima Tecomán, Tecomàn, Colima Madrid, Tecomàn, Colima Armería, Armería, Colima La Caja, Comala, Colima Ixtlahuacán, Ixtlahuacán, Colima Cerro de Ortega, Tecomàn, Colima Los Asmoles, Colima, Colima Loma de Juárez, Colima, Colima El Naranjo, Manzanillo, Colima El Tizate, Santiago Ixcuintla, Nayarit Miguel Hidalgo, La Huerta, Jalisco Cihuatlán, Cihuatlán, Jalisco Miguel Hidalgo, La Huerta, Jalisco San Vicente, Coahuayana, Michoacán San Vicente, Coahuayana, Michoacán El Ranchito, Coahuayana, Michoacán Apatzingán, Apatzingán, Michoacán Apatzingán, Apatzingán, Michoacán Las Vigas, San Marcos, Guerrero B. del Ejido, Coyuca de Benítez, Guerrero Localidad del 30, Acapulco, Guerrero Valle del Río, Coyuca de Benítez, Guerrero Valle del Río, Coyuca de Benítez, Guerrero Las Vigas, San Marcos, Guerrero San Juan del Progreso, Oaxaca San Juan del Progreso, Oaxaca Campo Experimental, Oaxaca Tuxtepec, Tuxtepec, Oaxaca Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Llera, Tamaulipas Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Martínez de la Torre, Veracruz
Hojas Hojas Hojas Flores Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Flores Flores Hojas Hojas Flores Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Flores Hojas Hojas Hojas Hojas
Raza PFD de C. acutatum A39NVTAB A40NVTAB A41NAVTAB A120NVTAB A125NVVER A47NVTAM A48NVTAM A43LPVER A121LPVER A123LPVER
naranja Valencia naranja Valencia naranja Valencia naranja Valencia naranja Valencia naranja Valencia naranja Valencia
limón Persa limón Persa limón Persa
Huimanguillo, Tabasco Huimanguillo, Tabasco Huimanguillo, Tabasco Huimanguillo, Tabasco Martínez de la Torre, Veracruz Padilla, Tamaulipas Cd. Victoria, Tamaulipas Martínez de la Torre, Veracruz Martínez de la Torre, Veracruz Martínez de la Torre, Veracruz
Flores Flores Flores Flores Flores Flores Flores Flores Flores Flores
C. gloeosporioides (saprofito) A62LMCOL
limón mexicano
Campo Experimental Tecomán, Colima
Hojas
40
El inóculo de cada aislamiento se aplicó con una botella atomizadora de 0.5 l de capacidad y
posteriormente fueron cubiertas con bolsas de plástico (cámara húmeda) durante 48 horas y se
asperjó agua destilada estéril a las flores de manera constante con el fin de conservar humeda su
superficie (Brown et al. 1996). Las plantas fueron mantenidas los primeros tres días a una
temperatura de 27 °C 4 y posteriormente se llevaron a una casa de malla a temperatura ambiente
(19 a 33 °C) (Agostini et al. 1992).
Para cada aislamiento del hongo se utilizaron tres plantas de cada especie citrìcola. Debido a
que la floración no fue uniforme en todas las especies, las inoculaciones se realizaron en las plantas
que presentaban racimos con las primeras flores abiertas. En cada ensayo, se incluyeron plantas
testigo asperjadas únicamente con agua destilada. A los 7-10 días después de la inoculación, para
cada aislamiento del hongo se determinó el porcentaje de flores enfermas mostrando los síntomas
característicos de caída de fruto pequeño en naranja Valencia y limón Persa, así como síntomas de
antracnosis en limón mexicano.
3.3 Caracterización morfológica de aislamientos de Colletotrichum spp
La caracterizaron de los diferentes aislamientos del hongo Colletotrichum spp se basó en el
aspecto de la colonia, comportamiento en medio del cultivo, morfología de los conidios y de los
apresorios. Se usaron 39 aislamientos de la raza KLA de C. acutatum colectado en diferentes
estados productores de México. Asimismo, se incluyeron siete aislamientos de la raza PFD de C.
acutaum de naranja Valencia y otros tres aislamientos PFD de limón Persa. Cuatro aislamientos
atípicos colectados en naranja Valencia y limón Persa y un aislamiento de C. gloeosporioides fueron
incluídos (Cuadro 1). De cada aislamiento se obtuvo un cultivo monospórico y se incubó a 27 °C ±1
en la oscuridad durante 10 días. Se tomaron características generales de la colonia (color, micelio
aéreo, plano, denso o escaso), color del micelio y crecimiento a través del tiempo. De cada
aislamiento del hongo se tomaron imágenes fotográficas.
Con el propósito de determinar el crecimiento de Colletotrichum spp a través del tiempo, de
cada aislamiento se obtuvieron colonias monósporicas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar que
fueron incubadas a 27 °C ±1 en la obscuridad. Para cada aislamiento, se utilizó una caja de petri
41
como unidad experimental en un diseño de bloques al azar con tres repeticiones. A los 3, 6 y 9 días
se tomaron lecturas del diámetro polar y acuatorial de las colonias para posteriormente determinar su
área total (Agostini et al. 1992). El análisis estadístico se realizó mediante el ANOVA y para la
comparación de medias se utilizó la prueba de Tukey al 95% de probabilidad.
Para evaluar las características de conidios y apresorios, se extrajo una suspensión conidial
(1 ml) de cada aislamiento desarrollado en medio líquido jugo V8 (3.6 g de carbonato de calcio más
165 ml de jugo V8 y aforado a un litro) a los 10 días de incubación en la oscuridad, temperatura de
27 °C ±1 y agitación continua a 125 rpm. La suspensión conidial fue centrifugada a 3,000 rpm
durante dos min y lavada en tres ocasiones con agua destilada estéril para eliminar el mucílago
adherido a los conidios. Para la inducir la formación de apresorios se utilizó la metodología de
Manandhar et al. (1995). De cada aislamiento se utilizó una concentración de 5 x 105 conidios/ml,
depositando tres gotas de 10 l en un portaobjeto de cristal. Las gotas de la suspensión conidial se
dejaron secar en una campana de flujo laminar y fueron incubadas en toallas húmedas y en la
oscuridad durante 48 horas a 23 °C ±1. Después de las 48 horas se tiño con lactofenol teñido con
fuchina básica y se evaluó la forma de los apresorios con un microscopio óptico con el objetivo
40X. En otro portaobjeto de cristal se colocaron tres gotas de 10 l y posteriormente fueron tratadas
con lactofenol y observadas al microscopio con el objetivo 40X para evaluar las siguientes
características (100 conidios/gota): conidios con ambos ápices redondeados y conidios con un ápice
redondeado y el otro fusiforme (Agostini et al. 1992).
3.4 Caracterización genética de Colletotrichum spp.
Los aislamientos del hongo Colletotrichum colectados en los diferentes estados productores
de cítricos en México fueron caracterizados genéticamente mediante la técnica RAPDs (Williams et
al. 1990; Winter y Kahl, 1995).
3.4.1 Aislamientos de Colletotrichum spp
Se utilizaron aislamientos de limón mexicano, limón Persa y naranja Valencia colectados en
diferentes entidades productoras de cítricos en México (Colima, Jalisco, Michoacán, Nayarit,
Tamaulipas, Guerrero, Oaxaca, Veracruz y Tabasco). Todos los aislamientos fueron obtenidos de
42
una espora individual según la metodología de Manandhar et al. (1995), la cual se describió
previamente.
3.4.2 Reproducción de micelio
El micelio de Colletotrichum spp fue reproducido según la metodología empleada por
González et al. (1998). Se utilizaron las muestras de los aislamientos conservados en glicerol al 15%
a – 80 °C 1. Los tubos con los aislamientos fueron descongelados a temperatura de laboratorio y
con una micropipeta se extrajeron 10 microlitros de cada uno de ellos, los cuales fueron depositados
en el centro de una caja de petri con medio de cultivo papa-dextrosa-agar y posteriormente
incubados a 27 °C 1. A los cinco días de desarrollo de la colonia, con un sacabocado se extrajo un
disco de 0.7 mm conteniendo micelio y medio de cultivo que fue llevado a 55 ml de una suspensión
con medió de cultivo líquido Papa Dextrosa (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) en matraces
Erlenmeyer de 250 ml de capacidad. El medio líquido se preparó utilizando 30 g de Papa Dextrosa
en un litro de agua bidestilada y esterilizado a 15 atmósferas de presión durante 15 min. Los
matraces con el medio líquido y la colonia del aislamiento se colocaron en un agitador a 125 rpm a
27 °C 1 en la oscuridad durante 15 días. Después de este tiempo, el micelio con el medio líquido
fue depositado en tubos para centrifuga y precipitado a 3,000 rpm. El sobrenadante fue desechado y
el micelio fue lavado con agua bidestilada y precipitado nuevamente. El micelio fue depositado en
frascos de cristal y posteriormente liofilizado durante 96 horas a –49 °C 1 y 47 x 10-3 mbares de
vacío con una liofilizadora digital (Lyph-Lock, Labconco, Inc). El micelio liofilizado fue
conservado a – 80 °C 1 hasta utilizarlo para la extracción de ADN.
3.4.3 Extracción del ADN
Se tomaron 100 g de micelio seco de cada uno de los aislamientos del hongo
Colletotrichum spp para la extracción del ADN, basado en el método descrito por Raeder y Broda,
(1985) y Weising y Kahl et al. (1997). El micelio liofilizado fue molido en presencia de nitrógeno
líquido con un mortero estéril hasta la obtención de un polvo fino. El polvo del micelio se transfirió
a un tubo Eppendorf estéril de 2 ml de capacidad que contenía 1 ml de una solución amortiguadora
de extracción (200 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, PVP 1% y 0.5% de sulfato
dodecyl de sodio) más 15 l de mercanoeptanol. La mezcla fue agitada vigorosamente e incubada
a baño María (65 °C) durante 30 min y con agitaciones constantes. Después de la incubación, se le
43
agregó un volumen igual de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1), se agitó y la mezcla fue
centrifugada a 12,000 g durante 20 min a 4 °C. Se extrajo el sobrenadante y a éste se le agregó un
volumen igual de cloroformo, se agitó suavemente y posteriormente fue centrifugado a 12,000 g por
10 min a 4 °C para separar las fases. El sobrenadante fue desechado, se precipitó con 0.6 vol de
isopropanol y se agitó suavemente. Para ayudar a la precipitación de ADN, a la fase acuosa
colectada se le agregó 0.1 vol de acetato de Sodio 3.0 M, pH 5.2. Los tubos fueron centrifugados a
4,000 g por 2 min a temperatura de laboratorio para la formación de la pastilla de ADN. La pastilla
fue lavada con Etanol al 70% (500 l), se precipitó y el sobrenadante se deshechó. Posteriormente,
fue secada al vacío durante 11 min en un equipo de secado (HetoDry Gel, Heto Lab Equipment).
Las pastillas de ADN se hidrataron con 200 l de agua destilada estéril y se resuspendieron a 45 °C
durante 15 min. Se agregaron 2 l de Rnasa en una concentración de 10 mg/ml para eliminar
posibles residuos contaminantes de ARN. La mezcla resultante fue incubada por una hora a 37 °C,
se agregó un volumen de fenol, se llevó a centrifugación a 12 000 g por 20 min a 4 °C y fue extraído
el sobrenadante. Se precipitó con dos volúmenes de etanol y 0.1 volumen de acetato de sodio.
Finalmente se peletizó a 4,000 g por 2 min, fue lavado tres veces con etanol al 70%, se secó al vacío
y finalmente fue resuspendido con 50 l de TE (Tris.EDTA).
3.4.4 Reacciones de PCR-RAPDs
Las reacciones de amplificación fueron realizadas en un Termociclador programable (Robo
cycler gradient 40, Stratagene) en el Laboratorio de Biotecnología de la FCBA. Cada mezcla de
reacción se realizó en un volumen final de 25 l conteniendo 50 ng de ADN templado, 2.5 mM
MgCl2, 1X de amortiguador de reacción para PCR, 200 M dNTP´s (Gibco BRL, Gaithersburg,
MD), 0.5 M de cada uno de los iniciadores y 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD) y dos gotas de aceite mineral (Sigma BioScience, St. Louis, MO) para evitar la
evaporación de la mezcla de reacción (Sambrook et al. 1989). Para el análisis de Colletotrichum spp
se utilizaron seis combinaciones de pares de iniciadores decámeros al azar con 60-70% de CG
(Cuadro 2); estas fueron: A que consistió en la combinación M04/M07; B, M04/H06; C, M04/A01;
D, M04/P13; E, A01/M07; F, P13/M07. En el caso de las dos razas de C. acutatum (KLA y SGO) y
la especie de C. gloeosporioides se utilizaron cinco combinaciones de pares de iniciadores para la
amplificación de segmentos de su ADN: A, B, C, D, y E. Por otra parte, para el análisis de los
aislamientos del hongo C. acutatum (raza SGO y KLA) colectado en diferentes entidades
44
productoras de México se usaron los siguientes combinaciones: B y F. Finalmente, los aislamientos
de la raza KLA de C. acutatum fueron también analizados con las combinaciones de iniciadores B y
F. P13/M07 y M04/H06. La secuencia de cada iniciador se presenta en el Cuadro 2. Las condiciones
de PCR consistieron en la desnaturalización inicial de 94 °C por 3 min, seguido por una
amplificación exponencial de 40 ciclos de 1 minuto a 94 °C (desnaturalización), 2 min a 35 °C
(acople), 1 minuto a 72 °C (extensión) y un ciclo final de amplificación de 1 min a 72°C. Esta
reacción fue utilizada con cada juego de iniciadores y para cada muestra de ADN correspondiente a
los aislamientos del hongo (Arnheim y Erlich, 1992; Williams et al. 1990; Winter y Kahl, 1995;
Rosewich y McDonald, 1994).
Cuadro 2. Secuencia de los iniciadores decámeros RAPDs utilizados para la amplificación de segmentos de ADN del hongo Colletotrichum spp afectando cítricos en México.
Codigo del inicador Secuencia
A01
H06
M04
M07
P13
5’- CAGGCCCTTC –3’
5’- ACGCATCGCA –3’
5’- GGCGGTTGTC –3’
5’- CCGTGACTCA –3’
5’- GGAGTGCCTC –3’
Fuente: Gene LinkTM. 140 Old Saw Mill River Road, Hawthorne, NY 10532, USA
3.4.5 Visualización de los productos
Los productos de amplificación y el marcador de peso molecular de 1 kb (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD) fueron separados por electroforesis en geles de agarosa (Ultrapure Agarose,
Gibco BRL, Gaithersburg, MD) al 1.2% preparados con una solución amortiguadora TAE (Tris 1M,
ácido acético, EDTA 0.5 M, pH 8.0) y corridos a 90V por 120 min. Los geles fueron teñidos por 15
min con una solución de bromuro de etidio (0.5 g/ml) según Sambroks et al. (1989). Las bandas de
los fragmentos de ADN en el gel fueron visualizadas bajo iluminación ultravioleta con un
transiluminador de rayos UV y fotografiado con un sistema de análisis de imágenes Eagle Eye I
(Stratagene).
45
3.4.6 Análisis de patrones RAPDs
Los geles de agarosa fueron fotografiados con el sistema Eagle eye I (Stratagene) y las
imágenes se almacenaron en un equipo de computo para su posterior uso. Las posiciones de las
bandas fueron visualizadas a simple vista y los parámetros de los fragmentos se transformaron
dentro de una matriz de carácter binario (1 por la presencia, 0 por la ausencia de una banda en una
posición en particular de la fotografía) y con la ayuda de la formula descrita por Nei y Li (1979): Sxy
= 2nxy /(n x + n y) se construyeron las matrices mediante el método de apareamiento simple. Donde:
nxy es el numero de fragmentos compartidos, y n x + n y son el numero de fragmentos en los aislados
x y y.,. Las distancias de matrices fueron utilizadas para elaborar dendrogramas con el programa S-
Plus 2000 utilizando el método del promedio vecino cercano y vecino lejano y el coeficiente de
confianza Felsenstein (bootstrap) con 3000 repeticiones.
46
IV. RESULTADOS
4.1 Patogenicidad de Colletotrichum acutatum y C. gloeosporioides
Los resultados de las pruebas de patogenicidad de once aislamientos de C. acutatum (ocho de
limón mexicano, dos de naranja Valencia y uno de limón Persa) y uno de C. gloeosporioides sobre
tres especies de cítricos se presentan en el Cuadro 3. Todos los aislamientos de la raza KLA de C.
acutatum colectados en Colima (A56LMCOL), Michoacán (A35LMMIC), Jalisco (A13LMJAL),
Nayarit (A25LMNAY), Guerrero (A04LMGRO), Oaxaca (A01LMOAX), Veracruz (A42LMVER)
y Tamaulipas (A54LMTAM) resultaron patogénicos a las tres especies citrícolas. La incidencia de
la enfermedad fluctuó entre 67 a 92% de flores afectadas en limón mexicano, 56 a 85% en limón
Persa y 62 a 85% en naranja Valencia. Los síntomas provocados fueron los típicos de antracnosis:
necrosis de color café rojizo en los pétalos. En cambio, los aislamientos de la raza PFD colectados
en naranja Valencia en Veracruz (A125NVVER) y Tabasco (A120NVTAB), así como de limón
Persa de Veracruz (A121LPVER) resultaron patogénicos a flores de naranja Valencia y limón Persa
(68 a 86% de flores enfermas), y no causaron síntomas de la enfermedad en flores de limón
mexicano. Por otra parte, C. gloeosporioides aislado como saprofito en brotes enfermos de limón
mexicano (A62LMCOL) no causó síntomas de la enfermedad en flores de las tres especies de
cítricos inoculadas.
4.2 Caracterización morfológica de aislamientos de Colletotrichum spp.
4.2.1 Características en medio de cultivo papa-dextrosa-agar
Del total de aislamientos del hongo Colletotrichum spp colectados en diferentes hospedantes
en entidades citrícolas de México se identificaron tres grupos: 1) aislamientos de antracnosis del
limón mexicano colectados en esta especie citrícola, 2) aislamientos que causan caída de fruto
pequeño en naranja dulce y limón persa, y 3) aislamiento saprofito que causa antracnosis de frutos
en postcosecha colectado en limón mexicano (Cuadro 4). En la Figura 1 se presentan las
características de las colonias desarrolladas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos
de referencia de las razas PFD y KLA de C. acutatum y del aislamiento de C. gloeosporioides.
47
Cuadro 3. Patogenicidad de aislamientos de Colletotrichum spp de diferente origen geográfico en México, sobre flores de tres especies de cítricos.
Patogenicidadz (% de flores enfermas)
Especie/aislamiento Hospedante/
Origen Limón
mexicano Limón Persa
Naranjo Valencia
C. acutatum A56LMCOL A35LMMIC A13LMJAL A25LMNAY A04LMGRO A01LMOAX A54LMTAM A42LMVER
C. acutatum A34NVVER A120NVTAB
C. acutatum A121LPVER
C. gloeosporioides A62LMCOL
Limón mexicano Colima Michoacán Jalisco Nayarit Guerrero Oaxaca Tamaulipas Veracruz
Naranja Valencia Veracruz Tabasco
Limón Persa Veracruz
Limón mexicano Colima
+ (80) + (89) + (70) + (68) + (73) + (92) + (84) + (67)
(0) (0)
(0)
(0)
+ (67) + (85) + (74) + (79) + (65) + (56) + (82) + (76)
+ (78) + (86)
+ (74)
(0)
+ (83) + (78) + (68) + (74) + (62) + (69) + (71) + (85)
+ (68) + (73)
+ (62)
(0)
z = + con síntomas de la enfermedad; - sin síntomas de la enfermedad.
Todos los aislamientos de C. acutatum colectados en limón mexicano en los estados de
Colima, Jalisco, Nayarit, Michoacán, Guerrero, Oaxaca, Tamaulipas y Veracruz presentaron
características morfológicas similares en medio de cultivo papa-dextrosa-agar. Las colonias del
hongo presentaron micelio algodonoso, compacto, de aspecto polvoriento y color blanco grisáceo.
Su aspecto general fue de color naranja ligero y en el centro se observaron masas conidiales
dispersas de color naranja a salmón (Cuadro 4). Estas características corresponden a la raza KLA de
C. acutatum que causa antracnosis del limón mexicano.
Los aislamientos de C. acutatum que causan caída de fruto pequeño y colectados en naranja
Valencia y limón Persa en Tamaulipas, Veracruz y Tabasco presentaron micelio escaso, ligeramente
algodonoso, distribuido de manera uniforme, en ocasiones de aspecto polvoriento y de color blanco.
El aspecto general de la colonia es de color naranja ligero, acentuándose más en la parte central
48
(Cuadro 4). Estas características corresponden a las descritas para la raza PFD que causa la caída de
fruto pequeño.
Figura 1. Características de las colonias desarrolladas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de las razas PFD y KLA de Colletotrichum acutatum y el aislamiento de C. gloeosporioides. Las colonias son originadas de una espora de cada raza. Colonias de 14 días de edad a 27 °C.
El aislamiento saprofito del hongo C. gloeosporioides colectado en brotes de limón
mexicano en el estado de Colima y desarrollado en medio de cultivo papa-dextrosa-agar registró
colonias con micelio aéreo, abundante y algodonoso, de color gris a blanco grisáceo. su aspecto
general es de color gris a gris obscuro. Este aislamiento presentó un mayor crecimiento en medio de
cultivo con relación a C. acutatum (Cuadro 4). Estas características son similares a las reportadas
para C. gloeosporioides, saprofito o causante de antracnosis en frutos de cítricos en postcosecha
(Agostini et al. 1992).
Cuadro 4. Características morfológicas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de Colletotrichum spp de diferentes regiones citrícolas de México.
Vista posterior
Vista anterior
PFD KLA C. gloeosporioides
49
Especie (hospedante)/aislamiento Características de la coloniaz
Antracnosis del limón mexicano Raza KLA de C. acutatum
A12LMCOL, A14LMCOL, A15LMCOL, A19LMCOL, A56LMCOL, A68LMCOL, A74LMCOL, A85LMCOL, A88LMCOL, A98LMCOL, A99LMCOL, A108MCOL, A22LMNAY, A13LMJAL, A17LMJAL, A20LMJAL, A35LMMIC, A36LMMIC, A37LMMIC, A38LMMIC, A49LMMIC, A04LMGRO, A06LMGRO, A07LMGRO, A27LMGRO, A28LMGRO, A31LMGRO, A02LMOAX, A03LMOAX, A05LMOAX, A09LMOAX, A46LMTAM, A50LMTAM, A51LMTAM, A52LMTAM, A53LMTAM, A54LMTAM, A55LMTAM, A42LMVER
Micelio aéreo, algodonoso y de aspecto compacto, polvoriento y de color blanco grisáceo. El aspecto general de la colonia es de color naranja ligero y en el centro se observan masas conidiales dispersas de color naranja a salmón. En la parte posterior, el centro de la colonia es de color naranja ligero a brillante, cuya tonalidad va disminuyendo conforme se acerca a la periferia. Ocasionalmente se forman puntos de color café a café obscuro en el área naranja.
Caída de fruto pequeño Raza PFD de C. acutatum
A39NVTAB, A41NAVTAB, A120NVTAB, A125NVVER, A121LPVER, A123LPVER
Micelio escaso, ligeramente algodonoso, distribuido de manera uniforme, en ocasiones de aspecto polvoriento y de color blanco. El aspecto general de la colonia es de color naranja ligero, acentuándose más en la parte central. Parte posterior de color naranja ligero con tonalidades café en el centro de la colonia. Se pueden formar algunos anillos concéntricos de color café.
Caída de fruto pequeño Raza KLA de C. acutatum
A40NVTAB, A43LPVER, A47NVTAM, A48NVTAM
Micelio de color blanco grisáceo, algodonoso y compacto, de aspecto polvoriento. En el centro de la colonia se observan masas conidiales dispersas de color naranja brillante distribuidas en anillos concéntricos o en forma irregular. La parte posterior es de color café ligero en el centro y con algunos puntos dispersos de color café que corresponden a las masas conidiales de la parte anterior. Es factible formarse algunos anillos concéntricos de color café. Este aislamiento es parecido morfológicamente a la raza que causa antracnosis del limón mexicano.
Antracnosis en postcosecha C. gloeosporioides
A62LMCOL
Micelio aéreo, abundante y algodonoso, de color gris a blanco grisáceo. El aspecto general de la colonia es de color gris a gris obscuro. Por el reverso, el centro de la colonia es gris obscuro con tonalidades de color rosa ligero. En los bordes la coloración es más tenue. Se observan pequeñas estructuras embebidas en el medio de cultivo, formando algunos anillos concéntricos.
z = Colonias de Colletotrichum spp de siete días de edad obtenidas de cultivos monospóricos.
50
4.2.2 Características de conidios y apresorios de aislamientos de Colletotrichum spp
Las características de los conidios y formas de los apresorios presentaron diferencias entre
los tres tipos de aislamientos de antracnosis del limón mexicano, caída de fruto pequeño y
antracnosis en postcosecha (Figura 2 y Cuadro 5).
Todos los aislamientos de la raza KLA de C. acutatum correspondientes a la antracnosis del
limón mexicano registraron conidios hialinos, unicelulares y una elevada proporción con un lado
redondeado y otro fusiforme (promedio de 77.6%) con relación a conidios con ambos lados
redondeados (promedio de 22.4%) en medio de cultivo papa-dextrosa-agar (Figura 2 y Cuadro 5).
Asimismo, los apresorios producidos fueron de forma redonda (Figura 3).
Los aislamientos de la raza PFD de C. acutatum presentaron mayor porcentaje de conidios
con un lado fusiforme y el otro redondeado (promedio 78.1%) en comparación a conidios
redondeados (promedio 21.9%) en medio de cultivo papa-dextrosa-agar (Figura 2 y Cuadro 5). Por
otra parte, al inducir germinación de conidios se formaron apresorios de forma clavada (Figura 3).
Figura 2. Conidios de las razas KLA y PFD de C. acutatum, y de C. gloeosporioides (C.g.), causantes de antracnosis del limón mexicano, caída de fruto pequeño y antracnosis de frutos en postcosecha, respectivamente. Conidios con un lado fusiforme ( ) y conidios con ambos lados redondeados ( ).
*
KLA PFD C.g.
*
* *
*
51
El aislamiento de C. gloeosporioides, causante de la antracnosis en postcosecha produjo una
alta proporción de conidios con ambos lados redondeados (Figura 2 y Cuadro 5), mientras que los
apresorios inducidos fueron de forma lobulada (Figura 3).
Figura 3. Apresorios de las razas KLA y PFD de C. acutatum, y de C. gloeosporioides (C.g.), causantes de antracnosis del limón mexicano, caída de fruto pequeño y antracnosis de frutos en postcosecha, respectivamente.
4.2.3 Crecimiento en medio de cultivo papa-dextrosa-agar
En este ensayo se comparó el crecimiento de diferentes aislamientos de Colletotrichum spp
colectados en varios hospedantes de cítricos y diferente origen geográfico (Cuadro 6). El aislamiento
A62LMCOL de C. gloeosporioides fue el que registró el mayor crecimiento a los 3, 6 y 9 días
después de la siembra. A los 9 días, presentó en promedio una colonia de 28.3 cm2, con un índice de
crecimiento diario de 3.14 cm2. El grupo de aislados de la raza PFD de C. acutatum obtenidos de
naranja Valencia y limón Persa (A39NVTAB, A40NVTAB, A48NVTAM y A43LPVER)
presentaron una ligera tendencia de mayor desarrollo que el grupo de la raza KLA de limón
mexicano. A los 9 días, su área fue de 15.8 a 18.0 cm2 y un índice de crecimiento diario de 1.76 a
2.00 cm2. Sin embargo, hubo algunos aislados de la raza PFD con un incremento similar a los de la
raza KLA (A123LPVER y A125NVVER) con un área de colonia de 15.8 a 15.9 cm2. Su índice de
crecimiento diario fue de 1.76 y 1.77 cm2, respectivamente. Los aislamientos de la raza KLA
colectados en los estados de Colima, Jalisco, Nayarit, Michoacán, Guerrero, Oaxaca, Veracruz y
Tamaulipas presentaron una ligera variación en la velocidad de desarrollo en medio de cultivo papa-
dextrosa-agar. El crecimiento en medio de cultivo a los 9 días fluctuó entre 14.8 a 17.3 cm2 con un
índice diario de 1.64 a 1.92 cm2.
KLA PFD C.g.
52
Cuadro 5. Características morfológicas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de Colletotrichum spp colectados en cítricos en México.
Especie/aislamiento
Hospedante
Forma conidial (%) Forma del apresorio Redondeadoy Fusiformez
Raza KLA de C. acutatum A12LMCOL A14LMCOL A15LMCOL A19LMCOL A56LMCOL A68LMCOL A74LMCOL A85LMCOL A88LMCOL A98LMCOL A99LMCOL A108MCOL A22LMNAY A13LMJAL A17LMJAL A20LMJAL A35LMMIC A36LMMIC A37LMMIC A38LMMIC A49LMMIC A04LMGRO A06LMGRO A07LMGRO A27LMGRO A28LMGRO A31LMGRO A02LMOAX A03LMOAX A05LMOAX A09LMOAX A46LMTAM A50LMTAM A51LMTAM A52LMTAM A53LMTAM A54LMTAM A55LMTAM A42LMVER
limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano limón mexicano
17 24 27 17 22 13 22 24 23 19 24 22 19 31 19 35 9 18 25 31 20 22 14 18 32 34 18 19 25 26 21 25 22 20 30 20 34 15 19
83 76 73 83 78 87 78 76 77 81 76 78 81 69 81 65 91 82 75 69 80 78 86 82 68 66 82 81 75 74 79 75 78 80 70 80 66 85 81
Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado
Raza PFD de C. acutatum A39NVTAB A40NVTAB A41NAVTAB A120NVTAB A125NVVER A47NVTAM A48NVTAM A43LPVER A121LPVER A123LPVER
naranja Valencia naranja Valencia naranja Valencia naranja Valencia naranja Valencia naranja Valencia naranja Valencia
limón Persa limón Persa limón Persa
21 25 31 21 13 10 23 15 28 35
79 75 69 79 87 90 77 85 72 65
Clavado Clavado Clavado Clavado Clavado Clavado Clavado Clavado Clavado Clavado
Raza KLA de C. acutatum A40NVTAB A47NVTAM A48NVTAM A43LPVER
naranja Valencia naranja Valencia naranja Valencia
limón Persa
22 19 26 17
78 81 74 83
Redondeado Redondeado Redondeado Redondeado
C. gloeosporioides A62LMCOL
limón mexicano
85
15
Lobulado
yConidios con ambos lados redondeados;
zConidios con un lado fusiforme y otro redondeado.
53
Cuadro 6. Crecimiento en medio de cultivo papa dextrosa agar de aislamientos de Colletotrichum spp colectados en cítricos de diferente origen geográfico en México.
Días de crecimiento (cm2) z Raza/Aislamiento Especie Hospedante 3 6 9
Raza KLA A14LMCOL A19LMCOL A64LMCOL A70LMCOL A74LMCOL A85LMCOL A99LMCOL A108LMCOL A13LMJAL A17LMJAL A20LMJAL A26LMJAL A25LMNAY A36LMMIC A49LMMIC A06LMGRO A29LMGRO A31LMGRO A02LMOAX A05LMOAX A09LMOAX A50LMTAM A52LMTAM A54LMTAM A42LMVER
Raza PFD A39NVTAB A40NVTAB A120NVTAB A125NVVER A48NVTAM A43LPVER A121LPVER A123LPVER
Aislamiento C.g. A62LMCOL
C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum
C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum
C. gloeosporioides
Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano Limón mexicano
Naranjo Valencia Naranjo Valencia Naranjo Valencia Naranjo Valencia Naranjo Valencia
Limón Persa Limón Persa Limón Persa
Limón mexicano
3.8 d
4.0 cd 4.4 bcd 4.2 bcd 4.1 bcd 4.0 cd
4.6 bcd 4.2 bcd 4.1 bcd 4.3 bcd 4.1 bcd 4.2 bcd 3.9 cd 4.0 cd 3.9 cd 4.0 cd
4.1 bcd 4.3 bcd 4.0 cd 3.8 d
4.1 bcd 4.0 cd
4.2 bcd 4.0 cd
4.5 bcd
4.7 bcd 4.1 bcd 4.0 cd 4.0 cd 4.9 bc 5.2 b
4.2 bcd 3.8 d
9.9 a
9.9 e
10.3 de 10.5 de 10.4 de
10.8 bcde 10.5 de
10.7 bcde 10.6 cde
10.7 bcde 10.6 cde 10.6 cde 10.4 de
10.6 cde 10.2 de 10.2 de
9.8 e 10.7 bcde 10.8 bcde 10.7 bcde
10.2 de 10.6 cde 10.5 de
10.8 bcde 10.4 de
10.7 bcde
11.9 bc
11.3 bcd 10.5 de 10.4 de
11.3 bcd 12.0 b
11.4 bcd 10.5 de
22.5 a
15.6 fg 15.9 efg 16.5 bcdef 16.3 defg 16.9 bcdef 16.1 defg 16.4 cdef 16.1 defg 17.3 bcde 17.1 bcdef 16.3 defg 16.7 bcdef 16.4 cdef 16.0 defg 15.8 efg 14.8 g 16.4 cdef 16.9 bcdef 16.2 defg 16.0 defg 16.4 cdef 16.2 defg 16.5 bcdef 15.9 efg 17.0 bcdef
18.0 b 17.6 bc 17.4 bcd 15.9 efg 17.2 bcde 17.9 bc 17.5 bcd 15.8 efg
28.3 a
z Crecimiento a partir de un conidio y desarrollado en papa-dextrosa agar a 27 °C en la obscuridad. Separación de medias según la prueba de Tukey al 95% de probabilidad.
54
4.3 Caracterización genética de Colletotrichum spp.
4.3.1 Análisis genético de Colletotrichum spp en cítricos
En la Figura 4 se presenta información del patrón de bandas del análisis genético con
marcadores RAPDs de seis aislamientos de C. acutatum aislado de limón mexicano, naranja
Valencia y limón Persa, y uno de C. gloeosporioides obtenido como saprofito en limón mexicano.
Se utilizaron cinco combinaciones de pares de iniciadores: A (M04/M07), B (M04/H06), C
(M04/A01), D (M04/P13) y E (A01/M07). El mayor número de fragmentos amplificados se obtuvo
con la combinación E con 6 a 15 bandas, seguido por la D con 10 a 12 bandas. Los pares de
iniciadores B y C registraron 7 a 8 y 5 a 8 bandas, respectivamente. Finalmente, la combinación A
produjo de 0 a 7 bandas. Los aislamientos de la raza KLA de Colima (A15LMCOL y
AL16LMCOL: carriles 2, 3, 9, 10, 16, 17, 26, 27, 33 y 34) tuvieron una buena amplificación y un
perfil RAPDs similar con cualquier juego de iniciadores; sin embargo, el mayor número de bandas
se logró con la combinación E y D. Por otra parte, los especímenes de la raza PFD de naranja
Valencia de Tabasco (A34NVTAB y A120NVTAB: carriles 4, 8, 11, 15, 18, 22, 30, 31, 37 y 38)
tuvieron un patrón y número de bandas similar (5 a 8) con cualquiera de los juegos de iniciadores
utilizados, a excepción del par de iniciadores A, con la cual se tuvieron únicamente tres bandas. Los
aislamientos de la raza PFD de limón Persa (A43LPVER y A115LPVER: carriles 5, 7, 12, 14, 19,
21, 28, 29, 35 y 36) de Veracruz produjeron de 0 a 4 bandas con la cobinación A. En cambio, con
los pares de iniciadores D y E se tuvieron 7-9 y 9-15 bandas, respectivamente. La combinación B y
C produjeron de 5 a 8 bandas. Con cualquiera de las combinaciones, se presentó un marcado
polimorfismo entre los dos especímenes (carril 5 vs. 7, 12 vs. 14, 19 vs. 21, 28 vs 29 y 35 vs 36). El
aislamiento de C. gloeosporioides (A62LMCOL: carriles 6, 13, 20, 32 y 39) presentó alrededor de
ocho bandas con cualquiera de las combinaciones de iniciadores, con excepción del D, en donde no
se produjo amplificación. El perfil RAPDs de los aislamientos de la raza KLA fue casi similar entre
ellos y diferentes al perfil de los aislamientos de la raza PFD. Por otra parte, C. gloeosporioides
presentó un patrón de bandas muy diferente a los aislamientos de PFD y KLA.
El dendrograma obtenido del análisis de ADN de los seis aislamientos del hongo C.
acutatum y uno de C. gloeosporioides, utilizando cinco combinaciones de iniciadores se presenta en
la Figura 5. El análisis de agrupamiento generó dos grupos: uno formado por el aislamiento de C.
55
gloeosporioides, causante de la antracnosis de postcosecha (grupo A) y el otro constituido por
aislamientos de las razas PFD y KLA de C. acutatum (grupo B). Entre ambas especies se registró
una disimilaridad del 68%. El grupo B se integró por dos subgrupos: raza KLA, causante de
antracnosis en limón mexicano (subgrupo C: A15LMCOL, AL16LMCOL y A43LPVER) y raza
PFD, causante de la caída de fruto pequeño en naranja Valencia (A34NVTAB y A120NVTAB) y
limón Persa (A115LPVER) (subgrupo D). La disimilaridad entre estos dos subgrupos fue del 49%.
Los dos aislamientos de la raza KLA de C. acutatum fueron genéticamente muy similares con una
disimilaridad del 5%. Los aislamientos de la raza PFD de C. acutatum congregaron como subgrupo
D y resultaron genéticamente muy similares entre el A115LPVER y A120NVTAB (H = 10%).
Asimismo, estos dos aislamientos tuvieron una disimilaridad del 23% con el aislamiento
A34NVTAB.
Sorpresivamente, un aislamiento de C. acutatum de limón persa (A43LPVER) presentó una
marcada similaridad genética (H = 12%) a los de la raza KLA de limón mexicano en el subgrupo C
y muy diferente a los aislamientos de la raza PFD clasificados en este dendrograma como subgrupo
D. Este aislamiento atípico de limón Persa presentó características morfológicas similares al grupo
de aislamientos de la forma que produce la antracnosis del limón mexicano (Cuadro 4).
4.3.2 Análisis genético de la raza KLA y PFD de Colletotrichum acutatum
El patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de aislamientos
del hongo Colletotrichum acutatum obtenidos en limón mexicano, naranja Valencia y limón Persa
se presenta en la Figura 6. La mayoría de los especímenes de la raza PFD colectados en limón Persa
y naranja Valencia (carriles 3-8, 13, 16, 19-21, 27-32, 33-40 y 43-45) tuvieron un perfil similar de
banadas de ADN con la combinación de inciadores B (M04/H06) y F (P13/M07). La excepción fue
un ejemplar de limón Persa (A34LPVER: carril 2 y 26) y dos aislamientos de naranja Valencia
(A47NVTAM y A48NVTAM: carriles 17, 18, 41 y 42) que tuvieron un patrón de bandas diferente
al registrado para el grupo de la raza PFD colectados en naranja Valencia y limón Persa y más
parecido al grupo de aislamientos de la raza KLA de limón mexicano. Los especímenes de la raza
KLA tuvieron un perfil polimórfico, ya que hubo algunos aislamientos que no amplificaron con
ambos juegos de iniciadores. Con el juego B no se logró amplificar los aislamientos de los carriles
56
11 y 15, mientras que con el juego F no se amplificó en los carriles 37 y 38. El resto de aislamientos
de este grupo tuvieron un patrón de bandas similar.
La información del dendrograma resultante del análisis de los patrones de bandas
polimorficas de ADN con los aislamientos de C. acutatum colectados en tres hospedantes (limón
mexicano, naranja Valencia y limón Persa) se presenta en la Figura 7. Los ejemplares de la raza
PFD obtenidos en limón Persa y naranja Valencia formaron un grupo bien definido (Grupo A),
mientras que los de la raza KLA, causando antracnosis del limón mexicano, junto con algunos
especímenes atípicos de limón Persa y naranjo Valencia formaron un grupo diferente (Grupo B). En
el Grupo A, algunos aislamientos de la raza PFD de limón Persa y naranjo Valencia (A114LPVER,
A115LPVER, A116LPVER, A121LPVER, A122LPVER, A123LPVER, A34NVTAB y
A39NVTAB) resultaron monomórficos (genéticamente similares). En el mismo grupo B, pero con
una dismimilaridad muy reducidas (H = 9%) se agruparon otros aislamientos de la raza PFD de
naranja Valencia (A124NVVER, A125NVTAB y A120NVTAB). En el Grupo A, los ejemplares de
la raza KLA de limón mexicano (A15LMCOL, A16LMCOL y A23LMCOL) fueron genéticamente
similares, en tanto que el aislamiento A56LMCOL tuvo una disimilaridad del 14% con los
anteriores. Los aislamientos atípicos de limón Persa colectados en Veracruz (A43LPVER) y naranja
Valencia en Tamaulipas (A47NVTAM y A48NVTAM) se agruparon en el grupo de la raza KLA
(Grupo B), registrando una disimilaridad del 4% con los aislamientos de limón mexicano.
4.3.3 Análisis genético de la raza KLA de Colletotrichum acutatum aislado de limón mexicano
en diferentes entidades citrícolas de México
En la Figura 8 se presentan los resultados del análisis genético con marcadores RAPDs de la
raza KLA del hongo Colletotrichum acutatum, causante de la antracnosis del limón mexicano. La
mayoría de los aislamientos procedentes de Colima (carril 4 y 6-9), Jalisco (11, 12 y 14), Michoacán
(carril 15-17), Guerrero (carril 18-21), Oaxaca (carril 22 y 26-28), Veracruz (carril 29) y Tamaulipas
(carril 30-33 y 35) tuvieron un patrón similar de bandas de ADN al usarse el juego de iniciadores F,
independientemente del origen de los ejemplares del hongo. Algunos especímenes del estado de
Colima (carril 2, 3 y 5), Jalisco (carril 13) y Tamaulipas (carril 34) no amplificaron con estos
iniciadores. El aislamiento A22LPNAY procedente del estado de Nayarit registró un perfil de
bandas polimórficas totalmente diferente al resto de los aislamientos.
57
Resultados similares al gel anterior fueron obtenidos con el juego de iniciadores B. La
mayoría de aislamientos de limón mexicano tuvieron un patrón parecido de bandas RAPDs sin
importar su origen geográfico (Figura 9). Los especímenes del estado de Colima (carril 3, 4 y 6-9),
Jalisco (11, 12 y 14), Michoacán (carril 15-17), Guerrero (carril 18-21), Oaxaca (carril 25-28,
Veracruz (carril 29) y Tamaulipas (carril 30-33 y 35) tuvieron un patrón similar de bandas. De la
misma forma algunos ejemplares del estado de Colima (carril 2 y 5), Veracruz (carril 29) y
Tamaulipas (carril 34) no amplificaron con estos iniciadores. El aislamiento A22LPNAY procedente
del estado de Nayarit registró un perfil de bandas RAPDs totalmente diferente al resto de los
aislamientos.
El dendrograma obtenido del análisis de ADN de los 25 aislamientos del hongo C. acutatum,
causante de la antracnosis del limón mexicano que fueron colectados en diferentes estados citrícolas
de México se presenta en la Figura 10. Con excepción del ejemplar A22LMNAY, el resto de los
especímenes formaron un grupo compacto con una disimilaridad que no superó valores del 20%. No
se registraron agrupamientos por región (Golfo de México y Océano Pacífico) o entidades
productoras, ya que algunos especímenes del estado de Jalisco (A26LMJAL), Michoacán
(A35LMMIC y A36LMMIC), Guerrero (A31LMGRO), Oaxaca (A01LMOAX Y A02LMOAX) y
Tamaulipas (A51LMTAM, A53LMTAM Y A54LMTAM) registraron más similitud genética que
otros ejemplares de la misma región o entidad. Este agrupamiento tuvo una disimilaridad del 4%
con aislamientos de Michoacán (A38LMMIC), Guerrero (A06LMGRO y A07LMGRO) Y Veracruz
(A42LMVER). En otros agrupamientos, los aislamientos de Colima (A56LMCOL, A57LMCOL,
A15LMCOL y A23LMCOL) tuvieron similaridad genética con uno de Tamaulipas (A50LMTAM),
mientras que algunos aislados de Oaxaca (A03LMOAX y A05LMOAX) resultaron similares a uno
de Tamaulipas (A52LMTAM).
El aislamiento A22LMNAY colectado en el estado de Nayarit resultó diferente
genéticamente al resto de la colección, registrando una disimilaridad arriba del 40%. Este ejemplar
al ser cultivado en medio de cultivo papa-dextrosa-agar presentó un crecimiento anormal y diferente
a las colonias de C. acutatum obtenidos de limón mexicano, lo cual indicaba que el especímen
estaba mezclado con otro microorganismo (posiblemente bacteria) y por lo tanto el ADN utilizado
en los RAPDs no era totalmente puro de C. acutatum.
58
V DISCUSION
5.1 Patogenicidad de Colletotrichum acutatum y C. gloeosporioides.
Los resultados de las pruebas de patogenicidad confirmaron que la raza KLA de C. acutatum
fue capaz de infectar flores de las tres especies de cítricos: limón mexicano, naranja Valencia y
limón Persa. En este estudio se confirmó que la raza KLA de C. acutatum está asociada a esta
enfermedad y que también es capaz de ocasionar los síntomas caracterizados por la caída de fruto
pequeño en flores de naranjo Valencia y limón Persa. Esto demuestra que la raza KLA no es
específica del su hospedante limón mexicano, tal y como lo reportó por primera vez Agostini et al.
(1992), quienes observaron que esta forma de antracnosis también causó síntomas de caída de fruto
pequeño en naranja Valencia y Limón Persa; así como posteriormente en naranja dulce Cv. Navel
(Brown et al. 1996).
Por otra parte, los aislamientos de la raza PFD de C. acutatum únicamente se desarrollaron
sobre sus hospedantes originales: naranja Valencia y limón Persa, pero no fueron patogénicos a
limón mexicano. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Agostini et al. (1992), quien
describió por primera vez las diferencias patogénicas entre las razas PFD y KLA afectando
diferentes especies de cítricos. En un principio, se consideró que la raza PFD de C. acutatum podría
ser una variante de los aislamientos KLA que han perdido su virulencia a limón mexicano y que este
último pudo haberse dispersado a los huertos de naranja dulce y limón Persa provenientes de árboles
de traspatio (Agostini et al. 1992; Timmer et al. 1994). Sin embargo, algunos avances recientes
sobre estudios genéticos entre ambas razas no demuestran evidencias que la raza PFD se haya
originado de la raza KLA, lo cual sugiere que ambas formas del hongo evolucionaron y se
dispersaron de manera independiente (Peres et al. 2003).
El hongo C. gloeosporioides, agente causal de la antracnosis de frutos en postcosecha y
también saprofito de tejidos de cítricos (Agostini et al. 1992), en este estudio fue incapaz de
producir síntomas en flores de limón mexicano, limón Persa y naranja Valencia, lo cual confirma los
resultados obtenidos por los autores antes citados.
59
Los resultados de este estudio demuestran la presencia de dos grupos de C. acutatum
patogénicamente diferentes en cítricos de México: la raza KLA que produce antracnosis del limón
mexicano y la raza PFD que ocasiona caída de fruto pequeño en limón Persa y naranja Valencia.
5.2 Caracterización morfológica de aislamientos de Colletotrichum spp.
Las características culturales y morfológicas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de los
aislamientos de Colletotrichum spp colectados en diferentes estados citrícolas de México
permitieron identificar tres formas de antracnosis: 1) raza KLA que ocasionan la antracnosis del
limón mexicano, 2) raza PFD que causan la caída de fruto pequeño y 3) aislamiento saprofito que
puede ocasionar antracnosis de frutos en postcosecha. Resultados similares obtuvo Agostini et al.
(1992) en la región citrícola de Florida, E.U.A.
Los aislamientos de la raza KLA presentaron colonias con micelio algodonoso, compacto, de
aspecto polvoriento y color blanco grisáceo. El aspecto general fue de color naranja ligero y en el
centro de la misma se observaron masas conidiales dispersas de color naranja a salmón. Estos
especímenes corresponden a la raza KLA de C. acutatum que causa antracnosis del limón mexicano,
la cual fue descrita por Agostini et al. (1992) como aislamiento de lento crecimiento con
pigmentación naranja intenso. Aun cuando, en su estudio no detallaron extensamente las
características de la colonia en medio de cultivo y trabajaron con pocos ejemplares, los autores
señalaron que existen marcadas diferencias en color de las colonias de cultivos aislados entre la raza
KLA y PFD.
Los especímenes de la raza PFD presentaron micelio escaso, ligeramente algodonoso, en
ocasiones de apariencia polvorienta y de color blanco. El aspecto general de la colonia fue de color
naranja ligero, acentuándose más en la parte central. Estas características corresponden a las
descritas como aislamiento naranja de lento crecimiento (SGO, slow-growing orange) asociado con
la enfermedad de la caída de fruto pequeño en postfloración (Fagan, 1979; Agostini et al. 1992;
Liyanage et al. 1992; Timmer et al. 1994; Sonoda y Pelosi, 1998).
Sorpresivamente, tres aislamientos de naranja Valencia (A40NVTAB, A47NVTAM y
A48NVTAM) y uno de limón persa (A43LPVER) presentaron características morfológicas
60
similares a la raza KLA de C. acutatum, por lo fueron agrupados en esta forma de antracnosis.
Previamente, se había propuesto que la raza PFD causante de la caída de fruto pequeño en naranja
dulce y limón Persa tenía su origen en la raza KLA del limón mexicano (Agostini et al. 1992; Brown
et al. 1996; Timmer et al. 1994). Sin embargo, estudios recientes no aportan evidencias que la raza
PFD haya surgido de la raza KLA (Peres et al. 2003), lo cual indica que estos especímenes
obtenidos de naranja Valencia y limón Persa fueron colectados en un estado contaminante o
patogénico provenientes de su hospedante limón mexicano.
Las colonias de C. gloeosporioides presentaron un rápido crecimiento y abundante micelio
aéreo, algodonoso, de color gris a gris obscuro. Sus características coinciden con C. gloeosporioides
descrita como aislamiento gris de rápido crecimiento (Agostini et al. 1992; Liyanage et al. 1992;
Sonoda y Pelosi, 1998; Timmer et al. 1994) y causante de la antracnosis de frutos de cítricos en
postcosecha (Timmer et al. 1998). El aislamiento de C. gloeosporioides presentó un mayor índice de
crecimiento de la colonia en medio de cultivo con relación a las razas KLA y PFD de C. acutatum.
Estas características de la colonia son comunes en C. gloeosporioides y coinciden con aislamientos
del hongo colectados en diferentes hospedantes y en distintas partes del mundo (Moriwaki et al.
2003; Ford et al. 2004)
La raza KLA y PFD de C. acutatum registraron una elevada proproción de conidios
unicelulares con un lado fusiforme, mientras que el aislamiento de C. gloeosporioides tuvo conidios
unicelulares, cilíndricos con ambos lados redondeados y no hubo diferencias notables en morfología
conidial entre aislamientos de la misma raza. Estos resultados coinciden con la descripción hecha
por Agostini et al. (1992), quien señaló que entre las razas KLA y PFD únicamente existen
pequeñas diferencias en tamaño conidial y que C. gloeosporioides produce de manera consistente
conidios más grandes que las razas de C. acutatum. Con respecto a la forma del apresorio, no hubo
variaciones notables entre cada una de las razas: la raza KLA y PFD de C. acutatum produjeron
apresorios redondeados y clavados, respectivamente, mientras que C. gloeosporioides tuvo
apresorios lobulados, lo cual coincide con el trabajo de Agostini et al. (1992).
Los resultados demostraron que la separación morfológica entra las razas KLA y PFD de C.
acutatum únicamente es factible realizarla mediante las características de la colonia en medio de
61
cultivo papa dextrosa agar. Contrariamente, usando parámetros como el índice de crecimiento de la
colonia, así como la forma de los conidios y apresorios no son una herramienta confiable para
separarlas. Por otra parte, para diferenciar las especies de C. acutatum con C. gloeosporioides en
cítricos se tuvieron más elementos. Las características de la colonia en medio de cultivo, su tasa de
crecimiento, la forma conidial y apresorial permitieron distinguirlos de manera confiable, los cual
demuestra la vigencia de algunos parámetros morfológicos y culturales para separar algunas
especies y razas en cítricos, al igual que lo reportaron Agostini et al. (1992). Más recientemente, el
uso de esta herramienta permitió la identificación de especies de Colletotrichum en el cultivo de
fresa (Denoyes y Baudry, 1995), ciruela de Martinica (Flacourtia inermis) (Jayasinghe y Fernando,
2004), lenteja (Ford et al. 2004) y diversos hospedantes (Afanador-Kafuri et al. 2003; Moriwaki et
al. 2003). Morfológicamente los grupos son reconocidos sobre las bases de pequeñas diferencias en
tamaño de los conidios y de ascosporas, así como por su apariencia en medio de cultivo. Tales
características son frecuentemente difíciles de describir en palabras y pueden cambiar después de
varios subcultivos o períodos extensos de almacenamiento en agar. Aunque estas dificultades han
conducido a varios autores a cuestionar la utilidad del uso de características culturales y
morfológicas para diferenciar la taxa Colletotrichum, se ha demostrado que cuando se usan con
cuidado, las técnicas morfológicas estándares pueden todavía ser informativas en las relaciones
dentro del género Colletotrichum (Lardner et al. 1999; Moriwaki et al. 2003; Jayasinghe y
Fernando, 2004; Ford et al. 2004).
Las especies de C. acutatum y C. gloeosporioides involucradas en el presente estudio
presentan una complejidad taxonómica, debido a que ambas poseen una amplia gama de
hospedantes y pueden ocurrir de manera simultanea en un hospedante determinado. Por su
heterogeneidad genotípica y fenotípica son consideradas especies acumulativas que se componen de
diversas poblaciones (Bailey y Jeger, 1992; Freeman et al. 1998) y comprenden varios grupos de
razas y biotipos (Lardner et al. 1999; Freeman et al. 2000; Afanador-Kafuri et al. 2003; Peres et al.
2005; Talhinhas et al. 2005). En este estudio fue evidente la separación morfológica de las dos
especies (C. acutatum y C. gloeosporioides) y de las dos razas de C. acutatum (KLA y PFD) en
cítricos. Para diferenciar C. gloeosporioides de C. acutatum se identificaron algunos marcadores
fenotípicos como velocidad de crecimiento, características de la colonia, forma de los conidios y de
62
apresorios, lo cual coincide con descriptores señalados por diversos autores (Agostini et al. 1992;
Sutton, 1992; Johnston y Jones, 1997; Talhinhas et al. 2002; Afanador-Kafuri et al. 2003).
5.3 Caracterización genética de Colletotrichum spp
El análisis mediante marcadores RAPDs de C. acutatum (raza KLA y PFD) y C.
gloeosporioides colectados en cítricos registró un marcado polimorfismo entre razas y especies. El
perfil RAPDs de los aislamientos de la raza KLA fue similar entre ellos y diferentes al perfil de la
raza PFD, pero C. gloeosporioides presentó un patrón de bandas muy diferente al que se obtuvo con
C. acutatum. El análisis de agrupamiento permitió separar C. gloeosporioides, causante de la
antracnosis de postcosecha de C. acutatum, agente causal de la antracnosis del limón mexicano y la
caída de fruto pequeño; asimismo, dentro del grupo de C. acutatum fue posible diferenciar la raza
KLA de la raza PFD. Estos resultados ayudan a clarificar relaciones taxonómicas entre ambas
especies de Colletotrichum en el cultivo de los cítricos, coincidiendo con estudios previos usando
esta misma técnica y que ha permitido dilucidar problemas taxonómicos entre C. acutatum y C.
gloeosporioides en fresa (Freeman et al. 1993; Denoyes-Rothan et al. 2003; Xiao et al. 2004).
También ha servido para determinar variaciones genéticas entre aislamientos de C. gloeosporioides
colectados en ocho especies de la leguminosa tropical Stylosanthes (Chakraborty et al. 1997b;
Kelemu et al. 1999), clasificación de razas de C. lindemuthianum en frijol (Mesquita et al. 1998) y
clarificar relaciones dentro del género Colletotrichum (Freeman y Rodríguez, 1995; Lardner et al.
1999; Ford et al. 2004). Otras herramientas moleculares basadas en el uso de iniciadores de PCR
específicos a especies (Brown et al. 1996) y en la variación del ADN en diferentes loci (Liyanage et
al. 1992), permitieron diferenciar C. acutatum (raza PFD) de C. gloeosporioides en cítricos.
De manera inesperada, un aislamiento de C. acutatum colectado en limón persa
(A43LPVER) presentó similaridad genética a la raza KLA de limón mexicano y muy diferente a la
raza PFD; este especímen atípico tuvo características morfológicas similares al grupo de la raza
KLA. Aunque en un principio se propuso que la raza PFD podría tener su origen en la raza KLA
(Agostini et al. 1992; Brown et al. 1996; Timmer et al. 1994), por lo que se pensó que este ejemplar
fue colectado en sus inicios evolutivos a la raza PFD. Sin embargo, estudios previos usando análisis
filogenéticos moleculares sugieren que no existen evidencias de que la raza PFD se haya originado
de la raza KLA (Peres et al. 2003), lo cual indica que el aislamiento A43LPVER pertenece a la raza
63
KLA y se colectó como un contaminante o saprofito en limón persa. Apoyando este resultado,
Johnston y Jones, (1997) indicaron que las especies de Colletotrichum que causan una enfermedad
diferente en un hospedante particular pueden ser encontrados como un invasor secundario
oportunístico sobre otros hospedantes.
De igual forma, el uso de RAPDs permitió separar la raza KLA de la PFD de C. acuattum,
confirmando la utilidad de esta técnica para diferenciar grupos de esta especie (Lardner et al. 1999;
Denoyes-Rothan et al. 2003), así como para detectar altos niveles de variabilidad genética y
separación de aislamientos de diferentes especies o formas especiales de Colletotrichum (Kutcher y
Mortensen, 1998).
El patrón de bandas RAPDs de aislamientos de la raza KLA de C. acutatum colectado en
limón mexicano en diferentes entidades citrícolas de México mostró un bajo polimorfismo.
Resultados similares han sido obtenidos por diversos investigadores, quienes trabajando con esta
misma técnica no fueron capaces de distinguir aislamientos de diferentes especies de
Colletotrichum, como es el caso de C. graminicola en diferentes hospedantes (Browning et al.
1999), C. gloeosporioides f. sp. malvae (Kutcher y Mortensen, 1998) y C. trifolii (Mackie e Irwing,
1998). Asimismo, los marcadores RAPDs no permitieron diferenciar aislamientos de la raza KLA de
C. acutatum de diferente origen geográfico en México, por lo que se registró una falta de correlación
entre distancias genéticas y geográficas, coincidiendo con reportes previos, en donde se señala que
la falta de correlación genética y el origen geográfico de Colletotrichum spp en el cultivo de fresa
puede atribuirse a una reciente dispersión de aislamientos a través de movimiento de plantas
(Denoyes-Rothan et al. 2003). En otros hongos como Blumeria graminis se han obtenido resultados
similares de falta de correlación entre variación genética y distancia geográfica (Wyand y Brown,
2003). Similarmente, Balardin et al. (1997) no encontraron congruencia en el agrupamiento del
fenograma RAPDs entre aislamientos de C. lindemuthianum del continente Americano con la
localización geográfica, pool de genes del hospedante y virulencia.
Estos resultados de baja variabilidad genética y la ausencia de polimorfismo entre
aislamientos de diferente origen geográfico señalan que las poblaciones de la raza KLA de C.
acutatum en México forman un grupo homogéneo con un origen común y reducida capacidad
64
evolutiva. Una de las causas más importantes de la baja de diversidad genética en los seres vivos se
atribuye a que la reproducción sexual no ocurre. En hongos fitopatógenos predomina la
reproducción asexual (Milgroon, 1996), la cual origina una progenie genéticamente idéntica a la de
sus padres (o casi idéntica si ocurre alguna mutación), lo que resulta una estructura de población
clonal (Chen y McDonald, 1996; Milgroon, 1996; Milgroon y Peever, 2003). Resultados similares
han sido observados en el hongo Magnaporthe grisea, cuya forma de reproducción principal es el
asexual, dando lugar a una estructura de población clonal (Talbot, 2002). El género Colletotrichum
comprende especies de hongos imperfectos (asexuales), cuyo teleomorfo (estado perfecto)
corresponde al género Glomerella (Agrios, 1988; Sutton, 1992), el cual es raro o nunca ha sido
observado (Bryson et al. 1992). En algunos casos, los peritecios pueden ser reproducidos en
laboratorio, como es el caso de C. lindemuthianum (Roca et al. 2003), C. gloeosporioides (Cisar et
al. 1994) y C. graminicola (Politis, 1975; Freeman et al. 1998); sin embargo, raras veces o nunca
han sido observados en la naturaleza (Bryson et al. 1992). En los aislamientos de las razas de C.
acutatum (KLA y SGO) y C. gloeosporioides (FGG) desarrolladas en medio de cultivo no se
observaron peritecios que indicaran la presencia del estado sexual, indicando que la ocurrencia de
recombinación sexual es poco probable o muy limitada. Similarmente, Agostini et al. (1992)
reportaron que no observaron la forma sexual con ninguno de los aislamientos estudiados (C.
gloeosporioides y razas PFD y KLA) en medio de cultivo y en los tejidos enfermos colectados en
campo, al igual que Freeman et al. (1998), quienes señalaron que en frutos de almendro afectados
por C. gloeosporioides y C. acutatum el estado sexual fue ausente.
La baja diversidad genética en un hongo determinado, tal y como resultó en la población de
la raza KLA de C. acuattum, posiblemente se deba a que los aislamientos examinados no se
reproducen sexualmente y provienen de un grupo homogéneo con un rango de hospedantes
específico. Este fenomeno ha sido reportado en poblaciones de C. graminicola en sorgo (Rosewich
et al. 1998), C. acutatum en lupino (Lupinus spp.) de diferentes países (Talhinhas et al. 2002), C.
gloeosporioides malvae (Kutcher y Mortensen, 1998), C. gloeoesporioides en almendro en Israel
(Freeman et al. 1996) y en tamarillo (Solanum betacea cav. Sendt) en Colombia (Afanador-Kafuri et
al. 2003). La diversidad genética de las poblaciones examinadas en este estudio fue baja, lo cual
indica que la recombinación sexual no ocurre o es muy limitada en el área geográfica donde se
obtuvieron los aislamientos, por lo que la deriva genética y el flujo de genes no son grandes
65
contribuidores a su estructura genética. En el caso de la raza KLA, los aislamientos fueron obtenidos
en los estados productores de cítricos más importantes en México, de tal forma que evidencian su
nula o escasa recombinación genética en el territorio nacional.
La raza KLA en limón mexicano tiene una actividad cíclica en el trópico seco de México y
posee un bajo número de generaciones comparado con otras enfermedades de cultivos tropicales,
como es el caso de M. fijiensis, causante de la sigatoka negra del banano (Marín et al. 2003). La
antracnosis del limón mexicano se presenta de manera epidémica durante la época de lluvias (Julio a
Octubre) y el resto del año puede sobrevivir como apresorios en hojas de limón mexicano. Esta baja
actividad del hongo a través del año puede influir a probabilidades reducidas de mutación, lo cual se
expresa en el bajo polimorfismo encontrado en las poblaciones de la raza KLA. A mayor número de
generaciones por año existen más probabilidades de mayor variabilidad genética, como sucede en
M. fijiensis (Marín, et al. 2003). El manejo de huertos es otra condición que determina las
probabilidades de encontrar poblaciones de hongos altamente variables. El cultivo de limón
mexicano se desarrolla con niveles tecnológicos de bajos a moderados, lo cual reduce la presión de
evolución de la raza KLA. En cultivos altamente tecnificados, existe tendencia a mayor presión
evolutiva de los patógenos (McDonalds, 1997).
Sin embargo, existen ejemplos de otras especies de Colletotrichum y otros géneros de
hongos con reproducción asexual que presentan una elevada variabilidad genética en sus
poblaciones, tal es el caso de de M. grisea (Talbot, 2002) y de C. sublineolum que presentan
recombinación genética a través de procesos parasexuales (Souza-Paccola et al. 2003). El ciclo
parasexual representa una fuente importante de variabilidad en hongos fitopatógenos y puede ser
responsable (al menos en parte) de la alta diversidad registrada en C. sublineolum y explicar la
aparición de nuevas razas fisiológicas (Souza-Paccola et al. 2003).
El hospedante, su manejo y el clima pueden tener una marcada influencia en la estructura
genética de la población de una especie de Colletotrichum. En el presente estudio, las poblaciones
de C. acutatum aisladas en limón mexicano fueron genéticamente diferentes a las poblaciones de C.
acutatum obtenidas de naranja Valencia y limón Persa, evidenciando el efecto del hospedante sobre
la variabilidad genotípica. Resultados similares fueron obtenidos con poblaciones de C.
66
lindemuthianum en frijol (González et al. 1998) y C. truncatum en lenteja (Ford et al. 2004), en
donde la variabilidad genética del hongo se pudo atribuir a las diferencias en el germoplasma y
hospedante usado. Una posible explicación para la diversidad genética encontrada entre aislamientos
de C. acutatum puede atribuirse a una respuesta adaptativa a la presión de selección ejercida por el
uso de diferentes hospedantes, lo cual selecciona diferentes genotipos del patógeno (Milgroom,
1995; Milgroom, 1996; Wyand y Brown, 2003).
La antracnosis del limón mexicano se reportó por primera vez a principios del siglo XX y es
un problema importante en el continente Americano (Timmer, 2000b). En México se presenta en la
región productora de este cítrico en las áreas costeras del Océano Pacífico (desde el estado de
Oaxaca hasta Jalisco), en donde predomina un clima tropical seco. En estas entidades, el cultivo de
limón mexicano se ha desarrollado como actividad comercial desde los años 20’s y la enfermedad
ha coexistido desde entonces con su hospedante. El 90% de la superficie citrícola de ésta región
corresponde a limón mexicano y el resto está dedicado a naranja dulce, toronja y limón Persa. Los
cítricos diferentes al limón mexicano se han establecido en los últimos 20 años, de tal manera que la
enfermedad ha coexistido en presencia con su hospedante principal por más de 80 años. Los huertos
de limón mexicano se establecieron por medio de semilla hasta principios de la década de los años
80’s y después de este tiempo se han ido sustituyendo con el uso de portainjertos. Aun cuando, la
reproducción fue por semilla, los cítricos poseen un elevado número de embriones nucelares que dan
origen a plantas provenientes de nucela. En este tipo de reproducción no existe fusión de gametos,
de tal forma que se considera un tipo de reproducción asexual. Con estos antecedentes, se asume que
las poblaciones de limón mexicano en la región son genéticamente uniformes o presentan poca
variabilidad genética por mutaciones esporádicas. Esta característica del hospedante principal de la
raza KLA, hace que el hongo no tenga presión evolutiva para poder adaptarse a diferentes genotipos.
Por otra parte, en el estado de Colima las primeras introducciones de limón mexicano datan de
principios del siglo XIX, ubicándolo como uno de los primeros productores de esta fruta. A partir de
1920, su cultivo se expandió significativamente (Oseguera-Velazquez, 1973). Colima ha sido
productor y distribuidor de planta para toda la región del trópico seco de México, por lo que es
factible encontrar huertos de limón mexicano en los diferentes estados productores con material
vegetativo procedente de Colima. Es casi seguro, que con las plantas también viajaron propágulos
del hongo, por lo que Colima fue un centro de distribución de la raza KLA en México. El hongo
67
Colletotrichum no presenta las características de patógenos que se dispersan naturalmente a largas
distancias por vía aérea para colonizar nuevos territorios que describen Brown y Hovmøller, (2002).
En este estudio se encontraron poblaciones de la raza KLA con baja variabilidad genética
distribuidas en diferentes ambientes: clima trópico seco, trópico húmedo y semiárido. La escasa
variabilidad genética es factible atribuirla a que la reproducción sexual del hongo es reducida,
coincidiendo con Timmer et al. (1994), quienes señalaron que el estado perfecto no es importante en
el ciclo de la enfermedad. Otro aspecto que puede influir en la reducida variabilidad genética es la
poca presión de evolución que tiene el patógeno, debido a que su principal hospedante es
genéticamente uniforme o con escasa heterogeneidad. En cada entidad productora el hongo se ha
mantenido estable con baja capacidad evolutiva.
El clima no posee un efecto marcado en la variabilidad del hongo, ya que se analizaron
aislamientos de diversos ambientes como trópico seco (Colima, Jalisco, Michoacán, Guerrero y
Oaxaca) trópico húmedo (Veracruz) y semiárido (Tamaulipas). El manejo del cultivo y en especial
el uso de fungicidas no aprovocan cambios importantes en la estructura genética de las poblaciones
de C. acutatum, ya que los aislamientos del hongo fueron colectados en huertos con diferente
manejo: con y sin aplicación de fungicidas, huertos con manejo adecuado, manejo deficiente y
huertos semiabandonados. La raza KLA ha coevolucionado muy lentamente con su hospedante
principal (limón mexicano), al existir poca o nula presión de selección del hospedante por su
reproducción asexual y por ende su marcada uniformidad genética.
En este estudio se aportan avances en patogenicidad, caracterización morfológica y genética
de C. acutatum en cítricos. Sin embargo, se requiere profundizar en aspectos de su biología y
genética de poblaciones del hongo. Falta conocer otras formas de sobrevivencia del patógeno en
cítricos, estudiando el papel de otros tejidos vivos o muertos (ramas, brotes y hojas) en la
sobrevivencia del hongo, así como determinar el efecto del clima y tiempo sobre la viabilidad de los
apresorios en hojas adheridas al árbol. Por otra parte, se requieren estudios de genética de
poblaciones con técnicas moleculares que proporcionen un mayor grado de polimorfismo y sean de
carácter codominante, como es el caso de AFLP, o bien estudios con ITS (espaciadores transcritos
interno)s o genes ribosomales ayudarían a resolver muchas preguntas genéticas. Asimismo, la
68
identificación de genes relacionados con la patogenicidas de ambas razas del hongo en las diferentes
especies de cítricos ayudarían a entender la interacción hospedante-patógeno de este patosistema.
Finalmente, los resultados obtenidos en el presente estudio permiten concluir la presencia de
dos especies de Colletotrichum afectando el cultivo de los cítricos en México: C. acutatum causando
antracnosis del limón mexicano (raza KLA) y caída de fruto pequeño (raza PFD), así como C.
gloeosporioides causando antracnosis de frutos en postcosecha. El uso de pruebas de patogenicidad
y características morfológicas permitió separar taxonomicamente las especies de Colletotrichum y
las razas de C. acutatum. Estos resultados demuestran la importancia y actual vigencia de las
herramientas tradicionales en la separación de especies y grupos en la taxonomía de hongos. Sin
embargo, la combinación de los métodos tradicionales (caracteres morfológicos) acompañado con
marcadores moleculares ha permitido la separación taxonómica de nuevas especies de
Colletotrichum (Moriwaki et al. 2003) y clarificado relaciones genéticas entre varios grupos
morfológicos de C. acutatum (Lardner et al. 1999; Talhinhas et al. 2003; Denoyes-Rothan et al.
2003; Talhinhas et al. 2005). Esta investigación confirma con herramientas moleculares (RAPDs)
aquellos resultados obtenidos con métodos tradicionales empleados por Agostini et al (1992) de
separar especies y razas de Colletotrichum, causante del complejo de antracnosis en el cultivo de los
cítricos.
69
VI CONCLUSIONES
1. Existe variación patogénica entre las razas KLA y PFD de C. acutatum colectados en
México sobre diferentes hospedantes de cítricos. La raza KLA infectó flores de limón
mexicano, naranja Valencia y limón Persa. En cambio, la raza PFD de C. acutatum
únicamente resultó patogénico a sus hospedantes originales: naranja Valencia y limón Persa.
2. Se detectó variabilidad morfológica entre poblaciones de C. acutatum en México: la raza
KLA produjo colonias de color blanco grisáceo de lento crecimiento, conidios fusiformes-
redondeados y apresorios de forma redonda; mientras que la raza PFD presentó colonias de
color naranja de lento crecimiento, coniidos fusiformes-redondeados y apresorios de forma
clavada.
3. La técnica RAPDs detectó una elevada variabilidad genetica entre las poblaciones de la raza
KLA y la raza PFD de C. acutatum, con disimilaridad del 68%; mientras que entre
aislamientos de una misma raza la variabilidad fue baja con disimilaridad del 20%.
70
VII LITERATURA CONSULTADA
Afanador-Kafuri, L., Minz, D., Maymon, M., and Freeman, S. 2003. Characterization of
Colletotrichum isolates from tamarillo, passiflora, and Mango in Colombia and identification
of a unique species from the genus. Phytopathology 93:579-587.
Agostini, J.P., and Timmer, L.W. 1994. Population dynamics and survival of strains of
Colletotrichum gloeosporioides on citrus in Florida. Phytopathology 82: 1377-1382.
Agostini, J.P., Gottwald, T.R., and Timmer, L.W. 1993. Temporal and spatial dynamics of
postbloom fruit drop in Florida. Phytopathology 82: 1377-1382.
Agostini, J.P., Timmer, L.W. and Mitchell, D. J. 1992. Morphological and pathological
characteristics of strains of Colletotrichum gloeosporioides from citrus. Phytopathology 82:
1377-1382.
Agrios, G. 1997. Plant Pathology. 4th ed. Academic Press. San Diego, CA, USA. 635 p.
Arnheim, N., and Erlich, H. 1992. Polymerase chain reaction strategy. Ann. Rev. Biochem. 61:131-
156.
Bailey, J.A., and Jeger, M.J. 1992. Colletotrichum: biology, pathology and control. CAB
International. Wallingford, U.K. 388 p.
Bailey, J.A., O’Connell, R.J., Pring, R.J. and Nash, C. 1992. Infection strategies of Colletotrichum
species. In: Colletotrichum: biology, pathology and control. Bailey, J.A. and Jeger, M.J.
(Eds.). p. 88-120. CAB International. Wallingford, U.K.
Baker, B., Zambryski, P., Staskawicz, B., and Dinesh-Kumar, S.P. 1997. Signaling in plant-microbe
interactions. Science 276:726-733.
71
Balardin, R.S., Jarosz, A.M., and Kelly, J.D. 1997. Virulence and molecular diversity in
Colletotrichum lindemuthianum from outh, Central, and North America. Phytopathology
87:1184-1191.
Bechinger, C., Giebel, K.-F., Schnell, M., Leiderer, P., Deising, H.B., and Bastmeyer, M. 1999.
Optical measurements fo invasive forces exerted by appressoria of a plant pathogenic
fungus. Science 285:1896-1899.
Bergstrom, G.C., and Nicholson, R.L. 1999. The biology of corn anthracnose: knowledge to exploit
for improved management. Plant Disease 83:596-608.
Bergstrom, G.C., and Nicholson, R.L. 2000. The biology of Colletotrichum graminicloa and maize
anthracnose. In: Colletotrichum: Host specificity, pathogenicity, and host-pathogen
interactions. Prusky, D., Freeman, S., and Dickman, M.B. (Eds.). p. 374-393. APS Press.
The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA. St. Paul, Minnesota,
USA.
Bernstein, B., Zehr, E.I., Dean, R.A., and Shabi, E. 1995. Characteristics of Colletotrichum from
peach, apple, pecan, and other hosts. Plant Disease 79:478-482.
Biggs, A.R., and Miller, S.S. 2001. Relative susceptibility of selected apple cultivars to
Colletotrichum acutatum. Plant Disease 85:657-660.
Bonde, M.R., Micales, J.A., and Peterson, G.L. 1993. The use of isozyme analysis for identification
of plant.pathogenic fungi. Plant Disease 77:961-968.
Brown, A.E., Sreenivasaprasad, S., and Timmer, L.W. 1996. Molecular characterization of slow-
growing orange and key lime anthracnose strains of Colletotrichum from citrus as C.
acutatum. Phytopathology 86:523-527.
72
Brown, J.K.M. and Hovmøller, M.S. 2002. Aerial dispersal of pathogens on the global and
continental scales and its impact on plant disease. Science 297:537-541.
Browning, M., Rowley, L.V., Zeng, P., Chandlee, J.M., and Jackson, N. 1999. Morphological,
pathogenic, and genetic comparisons of Colletotrichum graminicola isolates from poaceae.
Plant Disease 83:286-292.
Bryson, R.J., Caten, C.E., Hollomon, D.W., and Bailey, J.A. 1992. Sexuality and genetics of
Colletotrichum. In: Colletotrichum: biology, pathology and control. Bailey, J.A. and Jeger,
M.J. (Eds.). p. 27-46. CAB International. Wallingford, U.K.
Byrne, J.M., Hausbeck, M.K., and Hammerschmidt, R. 1997. Conidial germination and
appressorium formation of Colletotrichum coccodes on tomato foliage. Plant Disease
81:715-718.
Cannon, P.F., Bridge, P.D., and Monte, E. 2000. Linking the past, present, and future of
Colletotrichum systematics. In: Colletotrichum: Host specificity, pathogenicity, and host-
pathogen interactions. Prusky, D., Freeman, S., and Dickman, M.B. (Eds.). p. 1-20. APS
Press. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA. St. Paul,
Minnesota, USA.
Cano, J., Guarro, J., and Gené, J. 2004. Molecular and Morphological identification of
Colletotrichum species of clinical interest. Journal of Clinical Microbiology 42:2450-2454.
Casela, C.R., and Frederiksen, R.A. 1993. Survival of Colletotrichum graminicola sclerotia in
sorghum stalk residues. Plant Disease 77:825-827.
Chakraborty, S. 1997. Recent advances in studies of anthracnose of Stylosanthes. V. Advances in
research on Stylosanthes anthracnose epidemiology in Australia. Tropical Grasslands
31:445-453.
73
Chakraborty, S., Fernandes, C.D., Charchar, M.J. D’A, Kelemu, S., and Cameron, D.F. 1997a.
Biodiversity, epidemiology and virulence of Colletotrichum gloeosporioides. IV.
Epidemiology of Stylosanthes anthracnose at the centre of host-pathogen diversity. Tropical
Grasslands 31:408-416.
Chakraborty, S., Perrott, R., Ellis, N., and Thomas, M.R. 1997b. New aggressive Colletotrichum
gloeosporioides strains on Stylosanthes scabra detected by virulence and DNA analysis.
Plant Disease 83:333-340.
Chandra Mohanan, R., Kaveriappa, K.M., and Nambiar, K.K.N. 1989. Epidemiological studies of
Colletotrichum gloeosporioides disease on cocoa. Annals of Applied Biology 114:15-22.
Chen, H.Q., Cao, L.H., Dekkers, K.L., Rollins, J.A., Ko, N.J., Timmer, L.W., and Chung, K.R.
2005. A gene with domains related to transcription regulation is required for pathogenicity in
Colletotrichum acutatum causing key lime anthracnose. Molecular Plant Pathology 6:513-
525.
Chen, R.S., and McDonald, B.A. 1996. Sexual reproduction plays a major role in the genetic
structure of populations of the fungus Mycosphaerella graminicola. Genetics 142:1119-
1127.
Chen, Z., Liang, J., and Rodrigues, C.J. Jr. 2005. Colletotrichum gloeosporioides can overgrow
Colletotrichum kahawae on green coffee berries first inoculated wit C. kahawae.
Biotechnology Letters 27:679-682.
Chung, K.-R., Shilts, T., Li, W., and Timmer, L.W. 2002. Engineering a genetic transformation
system for Colletotrichum acutatum, the causal fungus of lime anthracnose and postbloom
fruit drop of citrus. FEMS Microbiology Letters 213:33-39.
74
Chung, K.-R., Shilts, T., Ertürk, Ü., Timmer, L.W., and Ueng, P.P. 2003. Indole derivatives
produced by the fungus Colletotrichum acutatum, causing lime anthracnose and postbloom
fruit drop of citrus. FEMS Microbiology Letters 226:23-30.
Cisar, C.R., Spiegel, F.W., TeBeest, D.O., and Trout, C. 1994. Evidence por mating between
isolates of Colletotrichum gloeosporioides with different hosts specificities. Current Genetic
25:330-335.
Conalim, 2006. http://www.conalim.com. Consulta el 9 de Agosto del 2006.
Correl, J.C., Guerber, J.C., Wasilwa, L.A., Sherill, J.F., and Morelock, T.E. 2000. Inter and intra-
species variation in Colletotrichum and mechanisms which affect population structure. In:
Colletotrichum: Host specificity, pathogenicity, and host-pathogen interactions. Prusky, D.,
Freeman, S., and Dickman, M.B. (Eds.). p. 146-179. APS Press. St. Paul, Minnesota, USA.
Dangl, J.L., and Jones, J.D.G. 2001. Plant pathogens and integrated defence responses to infection.
Nature 411:826-833.
de Melio, V.S., Gasparotto, L., and Menezes, M. 1997. Isoenzimatic avaliation of Colletotrichum
guaranicola. Arquivos de Biologia e Tecnologia 40:548-553.
Denoyes, B., and Baudry, A. 1995. Species identification and pathogenicity study of French
Colletotrichum strains isolated from strawberry using morphological and cultural
characteristics. Phytopathology 85:53-57.
Denoyes-Rothan, B., Guérin, G., Délye, C., Smith, B., Minz, D., Maymon, M., and Freeman, S.
2003. Genetic diversity and pathogenic variability among isolates of Colletotrichum species
from strawberry. Phytopathology 93:219-228.
Denoyes-Rothan, B., Guérin, G., Lerceteau-Köhler, E., and Risser, G. 2005. Inheritance of
resistance to Colletotrichum acutatum in Fragaria x ananassa. Phytopathology 95:405-412.
75
Dickman, M.B. 1994. Anthracnose (Papaya). In: Compendium of tropical fruit diseases. Ploetz,
R.C., Zentmyer, G.A., Nishijima, W.T., Rohrbach, K.G., and Ohr, H.D. (Eds.) p. 58-59. APS
Press. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA.
Dillard, H.R. 1987. Tomato anthracnose. Diseases of Tomato. Vegetable crops. Cornell Cooperative
Extension. Cornell University. Fact sheet. Page 735.70.
Dillard, H.R. 1992. Colletotrichum coccodes: the pathogen and its hosts. In: Colletotrichum:
biology, pathology and control. Bailey, J.A. and Jeger, M.J. (Eds.). p. 225-236. CAB
International. Wallingford, U.K.
Dodd, J.C., Estrada, A., and Jeger, M.J. 1992. Epidemiology of Colletotrichum gloeosporioides in
the tropics. In: Colletotrichum: biology, pathology and control. Bailey, J.A. and Jeger, M.J.
(Eds.). p. 308-325. CAB International. Wallingford, U.K.
Fagan, H.J. 1979. Postbloom fruit drop, a new disease associated with a form of Colletotrichum
gloeosporioides. Annals of Applied Biology 91:13-20.
Fagan, H.J. 1984. Postbloom fruit drop of citrus in Belize: I. Disease epidemiology. Turrialba
34(2):179-186.
Ford, R., Banniza, S., Photita, W., and Taylor, P.W.J. 2004. Morphological and molecular
discrimination of Colletotrichum truncatum causing anthracnose on lentil in Canada.
Australasian Plant Pathology 33:559-569.
Förster, H., and Adaskaveg, J.E. 1999. Identification of subpopulations of Colletotrichum acutatum
and epidemiology of almond anthracnose in California. Phytopathology 89:1056-1065.
Freeman, S. 2000. Genetic diversity and host specificity of Colletotrichum species on various fruits.
In: Colletotrichum: Host specificity, pathogenicity, and host-pathogen interactions. Prusky,
76
D., Freeman, S., and Dickman, M.B. (Eds.). p. 131-144. APS Press. St. Paul, Minnesota,
USA.
Freeman, S., and Rodriguez, R.J. 1995. Differentiation of Colletotrichum species responsible for
anthracnose of strawberry by arbitrarily primed PCR. Mycological Research 99:501-504.
Freeman, S., Katan, T., and Shabi, E. 1996. Characterization of Colletotrichum gloeosporioides
isolates from avocado and almond fruits with molecular and pathogenicity test. Applied and
Environmental Microbiology 62:1014-1020.
Freeman, S., Katan, T., and Shabi, E. 1998. Characterization of Colletotrichum species responsible
for anthracnose diseases of various fruits. Plant Disease 82:596-605.
Freeman, S., Pham, M. and Rodriguez, R.J. 1993. Molecular genotyping of Colletotrichum species
based on arbitrarily primed PCR, A + T-rich DNA, and nuclear DNA analyses. Experimental
Mycology 17:309-322.
Freeman, S., Shabi, E. and Katan, T. 2000. Characterization of Colletotrichum acutatum causing
anthracnose of anemone (Anemone coronaria L.). Applied and Environmental Microbiology
66:5267-5272.
Futch, S.H., Herb, J.W., and Sonoda, R.M. 1989. Effect of removal of persistent calyxes from navel
orange trees affected by postbloom fruit drop. Proc. Fla. State Hort. Soc. 102:4-5.
Garza, L.J.G. and Medina-U., V.M. 1984. Diseases of mexican lime Citrus aurantifolia [(Christm)
Swingle] in Mexico. Proc. Int. Soc. Citriculture 1:311-315.
González, M., Rodríguez, R., Zavala, M.E., Jacobo, J.L., Hernández, F., Acosta, J., Martínez, O.,
and Simpson, J. 1998. Characterization of Mexican isolates of Colletotrichum
lindemuthianum by using differential cultivars and molecular markers. Phytopathology
88:292-299.
77
Green, J.R., Pain, N.A., Cannell, M.E., Jones, G.L., Leckie, C.L., McCready, S., Mendgen, K.,
Mitchell, A.J., Callow, J.A., and O’Connell, R.J. 1995. Analysis of differentiation and
development of the specialised infection structures formed by biotrophic fungal plant
pathogens using monoclonal antibodies. Canadian Journal of Botany 73(Suppl.):S408-S417.
Hahn, S.K., and Keyser, J. 1985. Cassava: a basic food of Africa. Outlook on Agriculture 14:95-99.
Hamer, J.E., Howard, R.J., Chumley, F.G., and Valent, B. 1988. A mechanism for surface
attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science 239:288-290.
Hollier, C.A. 2004. Integrated pest management. Pages 337-344. In: Plant Pathology. Concepts, and
laboratory excercises. Trigiano, R.N., Windham, M.T., and Windham, A.S. (Eds.). CRC
Press. Boca Raton, Florida, USA. 413 p.
Howard, C.M., Maas, J.L., Chandler, C.K., and Albregts, E.E. 1992. Anthracnose of strawberry
caused by the Colletotrichum complex in Florida. Plant Disease 76:976-981.
Howard, R.J. 1997. Breaching the outer barriers–cuticle and cell wall penetration. p. 43-60. In: The
Mycota. Vol. V, Part A. Carroll, A., and Tudzynski, P. (Eds.). Springer-Verlag, Berlin.
Howard, R.J., Ferrari, M.A., Roach, D.H., and Money, N.P. 1991. Penetration of hard substrates by
a fungus employing enormous turgor pressures. Proceedings of the National Academy of
Science, USA 88:11281-11284.
Hughes, H.B., Carzaniga, R., Rawlings, S.L., Green, J.R., and O’Connell, R.J. 1999. Spore surface
glycoproteins of Colletotrichum lindemuthianum are reconigzed by a monoclonal antibody
which inhibits adhesion to polyestyrene. Microbiology 145:1927-1936.
78
Hutchison, K.A., Green, J.R., Wharton, P.S., and O’Connell, R.J. 2002. Identification and
localisation of glycoproteins in the extracellular matrices around germ-tubes and
appressoriaa of Colletotrichum species. Mycological Research 106:729-736.
Jacobson, E.S. 2000. Pathogenic roles for fungal melanins. Clinical Microbiological Reviews
13:708-717.
Javasinghe, C.K., and Fernando, T.H. 2004. Re-identification and characterization of pathogens
causing ugurassa (Flacourtia inermis) fruit anthracnose. Mycopathology 157:81-85.
Jeffries, P., Dodd, J.C., Jeger, M.J., and Plumbley, R.A. 1990. The biology of Colletotrichum
species on tropical fruit crops. Plant Pathology 39:343-366.
Johnson, D.A. 1994. Effect of foliar infectio caused by Colletotrichum coccodes on yield of Russet
Burbank potato. Plant Disease 78:1075-1078.
Johnston, P.R., and Jones, D. 1997. Relationships among Colletotrichum species from fruit-rots
assessed using rDNA sequences. Mycologia 89:420-430.
Jones, D.R. and Slabaugh, W.R. 1994. Anthracnose and fungal scald (Banana). In: Compendium of
tropical fruit diseases. Ploetz, R.C., Zentmyer, G.A., Nishijima, W.T., Rohrbach, K.G., and
Ohr, H.D. (Eds.) p. 4-5. APS Press. The American Phytopathological Society. St. Paul,
Minnesota, USA.
Kelemu, S., Skinner, D.Z., Badel, J.L., Moreno, C.X., Rodríguez, M.X., Fernandes, C.D., Charchar,
M.J., and Chakraborty, S. 1999. Genetic diversity in South American Colletotrichum
gloeosporioides isolates from Stylosanthes guianensis, a tropical forage legume. European
Journal of Plant Pathology 105:261-272.
Kim, K.D., Oh, B.J., and Yang, J. 1999. Differential interactions of a Colletotrichum
gloeosporioides isolate with green and red pepper fruits. Phytoparasitica 27:97-106.
79
Kolattukudy, P.E., Rogers, L.M., Li, D., Hwangs, C-S., and Flaishman, M.A. 1995. Surface
signalling in pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA 92:4080-
4087.
Kupper, K.C., Gimenes-Fernandes, N., and de Goes, A. 2003. Controle biológico de Colletotrichum
acutatum, agente causal da queda premature dos frutos cítricos. Fitopatologia Brasileira
28:251-257.
Kutcher, H.R., and Mortensen, K. 1999. Genotypic and pathogenic variation of Colletotrichum
gloeosporioides f. sp. malvae. Canadian Journal of Plant Pathology 21:37-41.
Lardner, R., Johnston, P.R., Plummer, K.M., and M.N. Pearson. 1999. Morphological and molecular
analysis of Colletotrichum acutatum sensu lato. Mycological Research 103(3):275-285.
Latunde-Dada, A.O. 2001. Colletotrichum: tales of forcible entry, stealth, transient confinement and
breakout. Molecular Plant Pathology 2:187-198.
Lax, A.R., Templeton, G.E., and Meyer, W.L. 1985. Isolation, purification, and biological activity
of a self-inhibitor from conidia of Colletotrichum gloeosporioides. Phytopathology 75:386-
390.
Leite, B., and Nicholson, R.L. 1992. Mycosporine-alanine: A self-inhibitor of germination from the
conidial mucilage of Colletotrichum graminicola. Experimental Mycology 16:76-86.
Lenné, J.M. 1992. Colletotrichum diseases of legumes. In: Colletotrichum: biology, pathology and
control. Bailey, J.A. and Jeger, M.J. (Eds.). p. 134-166. CAB International. Wallingford,
U.K.
Liyanage, H.D., McMillan, R.T. Jr., and Kistler, H.C. 1992. Two genetically distinct populations of
Colletotrichum gloeosporioides from citrus. Phytopathology 82:1371-1376.
80
Lu, G., Cannon, P.F., Reid, A., and Simmons, C.M. 2004. Diversity and molecular relationships of
endophytic Colletotrichum isolates from the Iwokrama forest reserve, Guyana. Mycol. Res.
108:53-63.
Mackie, J.M., and Irwin, J.A.G. 1998. Genetics and race variability of the lucerne-Colletotrichum
trifolii pathosystem in Australia. Australian Journal of Agricultural Research 49:713-722.
Madden, L.V., Yang, X., and Wilson L.L. 1996. Effects of rain intensity on splash dispersal of
Colletotrichum acutatum. Phytopathology 86:864-874.
Mahuku, G.S., Jara, C.E., Cajiao, C., and Beebe, S. 2002. Sources of resistance to Colletotrichum
lindemuthianum in the secondary gene pool of Phaseolus vulgaris and in crosses of primary
and secondary gene pools. Plant Disease 86:1383-1387.
Manandhar, J.B., Hartman, G.L., and Wang, T.C. 1995. Conidial germination and appressorial
formation of Colletotrichum capsici y C. gloeosporioides isolates from pepper. Plant Disease
79:361-366.
Manners, J.M., Masel, A., Braithwaite, K.S., and Irwin, J.A.G. 1992. Molecular analysis of
Colletotrichum gloeosporioides pathogenic on the tropical pasture legume Stylosanthes. In:
Colletotrichum: biology, pathology and control. Bailey, J.A. and Jeger, M.J. (Eds.). p. 250-
268. CAB International. Wallingford, U.K.
Marín, D.H., Romero, R.A., Guzmán, M., and Sutton, T.B. 2003. Black sigatoka: an increasing
threat to banana cultivation. Plant Disease 87:208-222.
Martinez-Culebras, P.V., Querol, A., Suarez-Fernandez, M.B., Garcia-Lopez, M.D., and Barrio, E.
2003. Phylogenetic relationships among Colletotrichum pathogens of strawberry and design
of PCR primers for their identification. Journal of Phytopathology 151:135-143.
81
Masaba, D., and Waller, J.M. 1992. Coffe berry diseases: the current status. In: Colletotrichum:
biology, pathology and control. Bailey, J.A. and Jeger, M.J. (Eds.). p. 237-249. CAB
International. Wallingford, U.K.
McCartney, H.A., Foster, S.J., Fraaije, B.A., and Ward, E. 2003. Molecular diagnostics for fungal
plant pathogens. Pest Management Science 59:129-142.
McDonald, B.A. 1997. The population genetic of fungi: tools and techniques. Phytopathology
87:448-453.
McDonald, B.A. 1999. The population genetics of plant pathogens and resistance breeding
strategies. Vortr. Pflanzenzüchtg. 46:235-244.
McDonald, B.A., Pettway, R.E., Chen, R.S., Boeger, J.M., and Martínez, J.P. 1995. The population
genetics of Septoria tritici (teleomorph Mycosphaerella graminicola). Canadian Journal of
Botany 73:292-301.
McMillan, R.T., Jr. 1993. An update on the incidence of postbloom fruit drop on 'Tahiti' limes in
south Florida. Proc. Fla. State Hort. Soc. 106:108-110.
McMillan, R.T. Jr. and Timmer, L.W. 1989. Outbreak of citrus postbloom fruit drop caused by
Colletotrichum gloeosporioides in Florida. Plant Disease 73:81.
Medina, U.V.M., Robles, G.M.M., Becerra, R.S., Orozco, R.J., Orozco, S.M., Garza, L.J.G.,
Ovando, C.M.E., Chávez, C.X. y Félix, C.F.A. 2001. El cultivo del limón mexicano.
INIFAP. Libro Técnico Num. 1. México. 188 p.
Mercure, E.W., Kunow, H., and Nicholson, R.L. 1994. Adhesion of Colletotrichum graminicola to
corn leaves: A requeriment for disease development. Physiological and Molecular Plant
Pathology 45:407-420.
82
Mesquita. A.G.G., Paula, T.J., Jr., Moreira, M.A., and de Barros, E.G. 1998. Identification of races
of Colletotrichum lindemuthianum with the aid of PCR-based molecular markers. Plant
Disease 82:1084-1087.
Michelmore, R.W., and Hulbert, S.H. 1987. Molecular markers for genetic analysis of
phytopathogenic fungi. Annual Review of Phytopathology 25:383-404.
Milgroom, M.G. 1995. Analysis of population structure in fungal plant pathogens. p. 213-229. In:
Disease analysis through genetics and biotechnology. Interdisciplinary bridges to improved
sorghum and millet crops. Leslie, J.F. and Frederiksen, R.A. (Eds.). Iowa State University
Press/Ames.
Milgroom, M.G. 1996. Recombinations and the multilocus structure of fungal populations. Annual
Review of Phytopathology 34:457-477.
Milgroom, M.G. and Fry, W.E. 1997. Contributions of population genetics to plant disease
epidemiology and management. In: Advances in Botanical Research Vol. 24. Academic
Press Limited. p. 1-30.
Milgroom, M.G. and Peever, T.L. 2003. Population biology of plant pathogens. The synthesis of
plant disease epidemiology and population genetics. Plant Disease 87:608-617.
Money, N.P. 1999. Fungus punches its way in. Nature 401:332-333.
Moriwaki, J., Sato, T., and Tsukiboshi, T. 2003. Morphological and molecular characterization of
Colletotrichum boninense sp. nov. from Japan. Mycoscience 44:47-53.
Nei, M., y W.-H Li. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of
restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 76: 5269-
5273.
83
Nicholson, R.L. 1992. Colletotrichum graminicola and the anthracnose diseases of maize and
sorghum. In: Colletotrichum: biology, pathology and control. Bailey, J.A. and Jeger, M.J.
(Eds.). p. 186-202. CAB International. Wallingford, U.K.
Nicholson, R.L., and Moraes, W.B.C. 1980. Survival of Colletotrichum graminicola: Importance of
the spore matrix. Phytopathology 70:225-261.
O’Conell, R.J., Bailey, J.A., and Richmond, D.V. 1985. Cytology and physiology of infection of
Phaseolus vulgaris by Colletotrichum lindemuthianum. Physiological and Molecular Plant
Pathology 27:75-98.
O’Conell, R.J., Nash, C., and Bailey, J.A. 1992. Lectin cytochemistry: A new approach to
understanding cell differentiation, pathogenesis and taxonomy in Colletotrichum. In:
Colletotrichum: biology, pathology and control. Bailey, J.A. and Jeger, M.J. (Eds.). p. 67-87.
CAB International. Wallingford, U.K.
O’Conell, R.J., Uronu, A.B., Waksman, G., Nash, C., Keon, J.P.R., and Bailey, J.A. 1993.
Hemibiotrophic infection of Pisum sativum by Colletotrichum truncatum. Plant Pathology
42:774-783.
O’Conell, R.J., Pain, N.A., Hutchison, K.A., Jones, G.L., and Green, J.R. 1996. Ultrastructure and
composition of the cell surfaces of infection structures formed by the fungal plant pathogen
Colletotrichum lindemuthianum. Journal of Microscopic 181:204-212.
O’Conell, R., Perfect, S., Hughes, B., Carzaniga, R., Bailey, J., and Green, J. 2000. Disecting the
cell biology of Colletotrichum infection processes. In: Colletotrichum: Host specificity,
pathogenicity, and host-pathogen interactions. Prusky, D., Freeman, S., and Dickman, M.B.
(Eds.). p. 57-77. APS Press. St. Paul, Minnesota, USA.
84
O’Conell, R., Herbert, C., Sreenivasaprasad, S., Khatib, M., Esquerré-Tugayé, M-T., and Dumas, B.
2004. A novel Arabidopsis-Colletotrichum pathosystem for the molecular dissection of
plant-fungal interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions 17:272-282.
O’Neill, N.R., van Berkum, P., Lin, J.J., Kuo,J., Ude, G.N., Kenworthy, W., and Saunders, J.A.
1997. Application of amplified restriction fragment length polymorphism for genetic
characterization of Colletotrichum pathogens of alfalfa. Phytopathology 87:745-750.
Oseguera-Velazquez, S. 1973. Tecomàn, ejemplo de desarrollo regional. México. Editora y
Distribuidora, S.A. p. 152-153.
Ownley, B.H., and Windham, M.T. 2004. Biological control of plant pathogens. Pages 327-336. In:
Plant Pathology. Concepts, and laboratory excercises. Trigiano, R.N., Windham, M.T., and
Windham, A.S. (Eds.). CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. 413 p.
Peres, N.A.R., Pever, T.L., Chung, K.R., and Timmer, L.W. 2003. Molecular characterization of
isolates of Colletotrichum acutatum causing postbloom fruit drop of citrus and key lime
anthracnose in the Americas. Proc. 8th Int. Cong. Plant Pathol. p. 346. Christchurch, New
Zealand.
Peres, N.A., Timmer, L.W., Adaskaveg, J.E., and Correll, J.C. 2005. Lifestyles of Colletotrichum
acutatum. Plant Disease 89:784-796.
Perfect, S.E., Hughes, H.B., O’Connell, R.J., and Green, J.R. 1999. Colletotrichum: a model genus
for studies on pathology and fungal-plant interactions. Fungal Genetics and Biology 27:186-
198.
Ploetz, R.C. 1994. Anthracnose (Mango). In: Compendium of tropical fruit diseases. Ploetz, R.C.,
Zentmyer, G.A., Nishijima, W.T., Rohrbach, K.G., and Ohr, H.D. (Eds.) p. 35-36. APS
Press. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA.
85
Podila, G.K., Rogers, L.M., and Kolattukudy, P.E. 1993. Chemical signals from avocado surface
wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides.
Plant Physiology 103:267-272
Politis, D.J. 1975. The identity and perfect state of Colletotrichum graminicola. Mycologia 67:56-
62.
Prusky, D. 1994. Anthracnose (Avocado). In: Compendium of tropical fruit diseases. Ploetz, R.C.,
Zentmyer, G.A., Nishijima, W.T., Rohrbach, K.G., and Ohr, H.D. (Eds.). p. 72-73. APS
Press. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA.
Prusky, D., Kobiler, I., Ardi, R., Beno-Moalem, D., Yakoby, N., and Keen, N.T. 2000. Resistance
mechanisms of subtropical fruits to Colletotrichum gloeosporioides. In: Colletotrichum:
Host specificity, pathogenicity, and host-pathogen interactions. Prusky, D., Freeman, S., and
Dickman, M.B. (Eds.). p. 232-244. APS Press. The American Phytopathological Society. St.
Paul, Minnesota, USA. St. Paul, Minnesota, USA.
Raeder, U., and Broda, P. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in
Applied Microbiology 1:17-20.
Roberts, R.G., and Snow, J.P. 1984. Histopathology of cotton boll rot caused by Colletotrichum
capsici. Phytopathology 74:390-397.
Roca, M.M.G., Davide, L.C., and Mendes-Costa, M.C. 2003. Cytogenetics of Colletotrichum
lindemuthianum (Glomerella cingulata f. sp. phaseoli). Fitopatologia Brasileira 28: 367-373.
Rodríguez, R.J., and Redman, R.S. 2000. Colletotrichum as a model system for defining the genetic
basis of fungal symbiotic lifestyles. In: Colletotrichum: Host specificity, pathogenicity, and
host-pathogen interactions. Prusky, D., Freeman, S., and Dickman, M.B. (Eds.). p. 114-130.
APS Press. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA. St. Paul,
Minnesota, USA.
86
Rosewich, U.L. and McDonald, B.A. 1994. DNA fingerprinting in fungi. Methods in Molecular and
Cellular Biology 5:41-48.
Rosewich, U.L., Pettway, R.E., McDonald, B.A., Duncan, R.R., and Frederiksen, R.A. 1998.
Genetic structure and temporal dynamics of a Colletotrichum graminicola population in a
sorgum disease nursery. Phytopathology 88:1087-1093.
SAGARPA, 2004. Sistema de Información Agropecuaria de Consulta (SIACON). Secretaría de
Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación. www.sagarpa.com.mx.
Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. 1989. Molecular cloning a laboratory manual, 2nd. ed.,
Cold Spring Harbor Laboratori Press, Cold Spring Harbor, New York.
Samuels, G.J., and Seifert, K.A. 1995. The impact of molecular characters on systematics of
filamentous ascomycetes. Annual Review of Phytopathology 33:37-67.
Sitterly, W.R., and Keinath, A.P. 1996. Anthracnose. In: Compendium of cucurbit diseases. Zitter,
T.A., Hopkins, D.L., and Thomas, C.E. (Eds.) p. 24-25. APS Press. The American
Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA.
Smith, H., Wingfield, M.J., and Coutinho, T.A. 1998. Eucalyptus die-back in South Africa
associated with Colletotrichum gloeosporioides. South African Journal of Botany 64:226-
228.
Sonoda, R.M., and Pelosi, R.R. 1988. Characteristics of Colletotrichum gloeosporioides from
lessions on citrus blossoms in the Indian River of Florida. Proc. Fla. State Hort. Soc. 101:36-
38.
Souza-Paccola, E.A., Fávaro, L.C.L., Casela, C.R., and Paccola-Meirelles, L.D. 2003. Genetic
recombination in Colletotrichum sublineolum. Journal of Phytopathology 151:329-334.
87
Sugui, J.A., Leite, B., And Nicholson, R.L. 1998. Partial characterization of the extracellular matrix
released onto hydrofobic surfaces by conidia and germlings of Colletotrichum graminicola.
Physiological and Molecular Plant Pathology 52:411-425.
Sunnucks, P. 2000. Efficient genetic markers for population biology. Tree 15(5):199-203.
Sutton, B.C. 1980. The Coelomycetes. Commonwealth Mycological Institute. Kew, London.
Sutton, B.C. 1992. The genus Glomerella and its anamorph Colletotrichum. In: Colletotrichum:
biology, pathology and control. Bailey, J.A. and Jeger, M.J. (Eds.). p. 1-26. CAB
International. Wallingford, U.K.
Talbot, N.J. 2002. Molecular variability studies of Magnaporthe grisea and their application in
disease control. In: The Mycota XI. Agricultural Applications. Kempken (Ed.) Springer-
Verlag Berlin Heidelberg. p. 153-169.
Talhinhas, P., Sreenivasaprasad, S., Neves-Martins, J., and Oliveira, H. 2002. Genetic and
morphological characterization of Colletotrichum acutatum causing anthracnose of lupins.
Phytopathology 92:986-996.
Talhinhas, P., Sreenivasaprasad, S., Neves-Martins, J., and Oliveira, H. 2005. Molecular and
phenotypic analyses reveal association of diverse Colletotrichum acutatum groups and low
level of C. gloeosporioides with olive anthracnose. Applied and Environmental
Microbiology 71:2987-2998.
Timmer, L.W. 2000a. Postbloom fruit drop. In: Compendium of citrus diseases. Second edition.
Timmer, L.W., Garnsey, S.M., and Graham, J.H. (Eds.). p. 21-22. APS Press. The American
Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA. St. Paul, Minnesota, USA.
88
Timmer, L.W. 2000b. Lime anthracnose. In: Compendium of citrus diseases. Second edition.
Timmer, L.W., Garnsey, S.M., and Graham, J.H. (Eds.). p. 22-23. APS Press. The American
Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA. St. Paul, Minnesota, USA.
Timmer, J.W., and Brown, G.E. 2000. Biology and control of anthracnose diseases of citrus. In:
Colletotrichum: Host specificity, pathogenicity, and host-pathogen interactions. Prusky, D.,
Freeman, S., and Dickman, M.B. (Eds.). p. 300-316. APS Press. The American
Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA. St. Paul, Minnesota, USA.
Timmer, L.W., and Zitko, S.E. 1991. Aerial applications of fungicide for control of postblooom
fruit drop. Citrus Industry 72:26-27.
Timmer, L.W. and Zitko, S.E. 1992. Timing of fungicide applications for control of postbloom fruit
drop of citrus in Florida. Plant Disease 76:820-823.
Timmer, L.W. and Zitko, S.E. 1993a. Relationships of environmental factors and inoculum levels to
the incidence of postbloom fruit drop of citrus. Plant Disease 77: 501-504.
Timmer, L.W. and Zitko, S.E. 1993b. Use of environmental factors and inoculum levels to predict
postbloom fruit drop incidence. Citrus Industry 74:4,5,7.
Timmer, L.W. and Zitko, S.E. 1995. Early season indicators of postbloom fruit drop of citrus and
the relationship of disease incidence and fruit production. Plant Disease 79: 1071-1020.
Timmer, L.W. and Zitko, S.E. 1996. Evaluation of a model for prediction of postbloom fruit drop of
citrus. Plant Disease 80:380-383.
Timmer, L.W., Agostini, J.P., Zitko, S.E., and Zulfiqar, M. 1994. Postbloom fruit drop, an
increasingly prevalent disease of citrus in the Americas. Plant Disease 78:329-334.
89
Timmer, L.W., Brown, G.E., and Zitko, S.E. 1998. The role of Colletotrichum spp. in postharvest
anthracnose of citrus and survival of C. acutatum on fruit. Plant Disease 82:415-418.
Toledo, C.R. 1970. Principales plagas y enfermedades que atacan a los cultivos más importantes
dentro de la jurisdicción de la Junta Regional de Sanidad Vegetal de Martínez de la Torre,
Ver. Secretaría de Agricultura y Ganadería. Boletín No. 5:1-68.
Torregrosa, C., Cluzet, S., Fournier, J., Huguet, T., Gamas, P., Prospéri, J-M., Esquerré-Tugayé, M-
T., Dumas, B., and Jacquet, C. 2004. Cytological, Genetic, and Molecular analysis to
characterize compatible and incompatible interactions between Medicago truncatula and
Colletotrichum trifolii. Molecular Plant-Microbe Interactions 17:909-920.
Trigiano, R.N., Windham, M.T., and Windham, A.S. (Eds.). 2004. Plant Pathology. Concepts, and
laboratory excercises. CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. 413 p.
Tsror (Lahkim), L., Erlich, O., and Hazanovsky, M. 1999. Effect of Colletotrichum coccodes on
potato yield, tuber quality, and stem colonization during sprim and autumn. Plant Disease
83:561-565.
Uhm, K.-H., Ahn, I.-P., Kim, S., and Lee, Y.-H. 2003. Calcium/calmodulin-dependent signaling for
prepenetration development in Colletotrichum gloeosporioides. Plant Disease 93:82-87.
Valerio, H.M., Resende, M.A., Weikert-Oliveira, R.C., and Casela, C.R. 2005. Virulence and
molecular diversity in Colletotrichum graminicola from Brazil. Mycopathologia 159:449-
459.
Waller, J.M. 1992. Colletotrichum diseases of perennial and other cash crops. In: Colletotrichum:
biology, pathology and control. Bailey, J.A. and Jeger, M.J. (Eds.). p. 167-185. CAB
International. Wallingford, U.K.
90
Waller, J.M., and Bridge, P.D. 2000. Recent advances in understanding Colletotrichum diseases of
some tropical perennial crops. In: Colletotrichum: Host specificity, pathogenicity, and host-
pathogen interactions. Prusky, D., Freeman, S., and Dickman, M.B. (Eds.). p. 337-345. APS
Press. The American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota, USA. St. Paul,
Minnesota, USA.
Weeds, P.L., Chakraborty, S., Fernandes, C.D., Charchar, M.J.d’A., Ramesh, C.R., Kexian, Y., and
Kelemu, S. 2003. Genetic diversity in Colletotrichum gloeosporioides from Stylosanthes
spp. at centers of origin and utilization. Phytopathology 93:176-185.
Weising K, and Kahl G. 1997. Hibridization-based microsatellite fingerprinting of plant and fungi.
In: Caetano.Anollés G y Gresshoff PM (Eds). DNA Markers; protocols. applications, and
Overviews. Wiley-VCH. New York.
Weising K, Nybom H, Wolf K, and Meyer W.1995. DNA fingerprint in plants and fungi. CRC
Press.
Wharton, P.S. and Diéguez-Uribeondo, J. 2004. The biology of Colletotrichum acutatum. Anales del
Jardín Botánico de Madrid 61:3-22.
Wharton, P.S., Julian, A.M., and O´Conell, R.J. 2001. Ultrastructure of the infection of Sorghum
bicolor by Colletotrichum sublineolum. Phytopathology 91:149-158.
Whiteside, J.O. 1988. Lime anthracnose. Pages 9-10. In: Compendium of citrus diseases. Whiteside,
J.O., Garnsey, S.M., and Timmer, L.W. (eds.). The American Phytopathological Society. St.
Paul, MN.
Wijesundera, R.L.C., Bailey, J.A., Byrde, R.J.W., and Fielding, A.H. 1989. Cell wall degrading
enzymes of Colletotrichum lindemuthianum: Their role in the development of bean
anthracnose. Physiological and Molecular Plant Pathology 34:403-413.
91
Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A., and Tingey, S.V. 1990. DNA
polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids
Research 18:6531-6535.
Winter, P., and Kahl, G. 1995. Molecular markers technologies for plant improvement. World
Journal of Microbiology & Biotechnology 11:438-448.
Wyand, R.A., and Brown, J.K.M. 2003. Genetic and forma specialis diversity in Blumeria graminis
of cereals and its implications for host-pathogen co-evolution. Molecular Plant Pathology
4:187-198.
Xiao, C.L., Mackenzie, S.J., and Legard, D.E. 2004. Genetic and pathogenic analyses of
Colletotrichum gloeosporioides isolates from strawberry and noncultivated hosts. Plant
Disease 94:446-453.
Zulfiqar, M., Brlansky, R.H., and Timmer, L.W. 1996. Infection of flower and vegetative tissues of
citrus by Colletotrichum acutatum y C. gloeosporiodes. Mycologia 88:121-128.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
(a) (b) (c) (d) (e)
Figura 4. Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de seis aislamientos del hongo Colletotrichumacutatum aislado de limón mexicano, naranja Valencia y limón Persa y un aislamiento de C. gloeosporioides (C.g.) aislado comosaprofito de limón mexicano. Carril 2-8, con la combinación de iniciadores M04/M07 (a); Carril 9-15, con M04/H06 (b): carril 16-22,con M04/A01 (c): carril 26-32, con M04/P13 (d): carril 33-39, con los iniciadores A01/M07 (e): carril 1, 24, 25, 40, marcador 1 kb: carril23, negativo. Carril 2, 3, 9, 10, 16, 17, 26, 27, 33, 34, aislamientos de limón mexicano en Colima; carril 4, 8, 11, 15, 18, 22, 30, 31, 37,38, aislamientos de naranja Valencia en Tabasco; carril 5, 7, 12, 14, 19, 21, 28, 29, 35, 36, aislamientos de limón Persa en Veracruz; carril6, 13, 20, 32, 39, aislamiento de C.g. de limón mexicano en Colima.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
(a) (b)
Figura 6. Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de aislamientos del hongo Colletotrichumacutatum aislado de limón mexicano, naranja Valencia y limón Persa en diferentes entidades productoras en México. Con lacombinación de iniciadores M04/H06 (a): carril 1, 23, marcador 1 kb; carril 2-8, aislamientos de limón Persa en Veracruz;carril 9-12, 14, 15, aislamientos de limón mexicano en Colima; carril 13, 16, 21, aislamientos de naranja Valencia en Tabasco;carril 17, 18, aislamientos de naranja Valencia en Tamaulipas; carril 19, 20, aislamientos de naranja Valencia en Veracruz; carril21, aislamiento de naranja Valencia en Tabasco; Carril 22, negativo. Con la combinación de iniciadores P13/M07 (b): carril 25,47, marcador 1 kb; carril 26-32, aislamientos de limón Persa en Veracruz; carril 33-36, 38, 39, aislamientos de limón mexicanoen Colima; carril 37, 40, 45, aislamientos de naranja Valencia en Tabasco; carril 41, 42, aislamientos de naranja Valencia enTamaulipas; carril 43, 44, aislamientos de naranja Valencia en Veracruz; carril 45, aislamiento de naranja Valencia en Tabasco;Carril 46, negativo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
Figura 8. Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de aislamientos del hongo Colletotrichum acutatumaislado de limón mexicano en diferentes entidades productoras en México. Combinación de iniciadores P13/M07. Carril 1, 24, 25, 36,marcador 1 kb; carril 2-9, aislamientos colectados en Colima; carril 10, aislamiento colectado en Nayarit; carril 11-14, aislamientoscolectados en Jalisco; carril 15-17, aislamientos colectados en Michoacán; carril 18-21, aislamientos colectados en Guerrero; carril 23,negativo; carril 22, 26-28, aislamientos colectados en Oaxaca; carril 29, aislamiento colectado en Veracruz; carril 30-35, aislamientoscolectados en Tamaulipas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
Figura 9. Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de aislamientos del hongo Colletotrichum acutatumaislado de limón mexicano en diferentes entidades productoras en México. Combinación de iniciadores M04/H06. Carril 1, 23, 24, 36,marcador 1 kb; carril 2-9, aislamientos colectados en Colima; carril 10, aislamiento colectado en Nayarit; carril 11-14, aislamientoscolectados en Jalisco; carril 15-17, aislamientos colectados en Michoacán; carril 18-21, aislamientos colectados en Guerrero; carril 22,negativo; carril 25-28, aislamientos colectados en Oaxaca; carril 29, aislamiento colectado en Veracruz; carril 30-35, aislamientoscolectados en Tamaulipas.
A15
LMC
OL
A16
LMC
OL
A34
NV
TA
B
A43
LPV
ER
A62
LMC
OL
A11
5LP
VE
R
A12
0NV
TA
B
0.0
0.2
0.4
0.6
60
10075
100
99
Dis
imila
ridad
Figura 5. Dendrograma derivado del análisis de agrupamiento UPMGA generado por los patrones de bandeo de marcadoresRAPDs con 6 aislamientos de Colletotrichum acutatum aislado de tres hospederos de cítricos (limón mexicano, naranja Valenciay limón Persa) y un aislamiento de C. gloeosporioides de limón mexicano. El grupo A corresponde a la raza FGG de C.gloeosporioides; grupo B a C. acutatum con subgrupo C de la raza KLA y subgrupo D de la raza SGO.
A B
C D
Figura 7. Dendrograma derivado del análisis de agrupamiento UPMGA generado por los patrones de bandeo de marcadoresRAPDs con 18 aislamientos de Colletotrichum acutatum aislado de tres hospederos de cítricos (limón mexicano, naranja Valenciay limón Persa) en diferentes entidades productoras en México. El grupo A corresponde a la raza SGO y el grupo B a la raza KLA.
A43
LPV
ER
A11
4LP
VE
R
A11
5LP
VE
R
A11
6LP
VE
R
A12
1LP
VE
R
A12
2LP
VE
R
A12
3LP
VE
R
A15
LMC
OL
A16
LMC
OL
A23
LMC
OL
A34
NV
TA
B
A56
LMC
OL
A39
NV
TA
B
A47
NV
TA
M
A48
NV
TA
M
A12
4NV
VE
R
A12
4NV
VE
R
A12
0NV
TA
B
0.0
0.2
0.4
0.6
61100 100 100 100 100 100 61 61100 6190 90
76
98
98Dis
imila
ridad
A B
A15
LMC
OL
A23
LMC
OL
A56
LMC
OL
A57
LMC
OL
A22
LMN
AY
A13
LMJA
L
A17
LMJA
L
A26
LMJA
L
AL3
5LM
MIC
A36
LMM
IC
AL3
8LM
MIC
A14
LMG
RO
AL0
6LM
GR
O
A07
LMG
RO
A31
LMG
RO
A01
LMO
AX
A02
LMO
AX
A03
LMO
AX
A05
LMO
AX
A42
LMV
ER
A53
LMTA
M
A50
LMTA
M
A51
LMTA
M
A52
LMTA
M
A54
LMTA
M
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
100 3664 38 62 62 4241 41 33 42 40 4055 51 40 40
37 51
30
19 5
97
Fig. 10. Dendrograma derivado del análisis de agrupamiento UPMGA generado por los patrones de bandeo de marcadoresRAPDs con 25 aislamientos de Colletotrichum acutatum aislado de limón mexicano en diferentes entidades productoras enMéxico.
