-
1
MAESTRA EN CIENCIAS, REA BIOTECNOLOGA
RIZOBACTERIAS Y HONGOS MICORRZICOS COMO AGENTES DE CONTROL
BIOLGICO DEL DAMPING-OFF EN PLNTULAS DE
Carica papaya L.
Tesis que para obtener el grado de Maestro en Ciencias, rea
Biotecnologa
P r e s e n t a
LUIS GUILLERMO HERNNDEZ MONTIEL
Asesor Interno: Dr. Sergio Aguilar Espinosa
Asesor Externo: M.C. Andrs Adolfo Muoz Garca
Tecomn, Colima, Mxico Febrero, 2004
UNIVERSIDAD DE COLIMA
-
2
N D I C E
Pgina INDICE DE CUADROS
INDICE DE FIGURAS
RESUMEN......................................................................................................
1
ABSTRACT....................................................................................................
2
I. INTRODUCCIN
......................................................................................
3
2.1. Hiptesis
...............................................................................................
5
2.2. Objetivo general
................................................................................
5
2.2.1. Objetivo especifico
................................................................
5
III. REVISIN DE LITERATURA
......................................................................
6
3.1. El cultivo de papayo (Carica papaya L) ........... 6 3.1.1.
Damping-off, principal enfermedad en semillero ................
7
3.1.1.1. Fusarium sp. causante del damping-off . 8 3.1.1.2.
Desarrollo de la enfermedad 10 3.1.1.3. Control de la enfermedad .
11
3.2. Rizobacterias y hongos micorrzicos con capacidad de
proteccin en las plantas
..............................................................
12
3.2.1. Mecanismos de proteccin de las rizobacterias en las
plantas
...................................................................................
12
3.2.1.1. Las rizobacterias y sus metabolitos implicados
en el control biolgico de enfermedades ...........
13
3.2.2. Mecanismos de proteccin de los hongos micorrzicos
en las plantas
.......................................................................
17
3.3. Interaccin entre PGPR y HMA
......................................................... 19 3.3.1.
Efecto de las rizobacterias en la fisiologa de los HMA ........ 19
3.3.2. Efecto de los HMA en poblaciones de rizobacterias
........... 22
3.4. Efecto de la inoculacin dual de PGPR y HMA en las plantas
.... 23 IV. MATERIALES Y MTODOS
.....................................................................
27
4.1. Trabajo en laboratorio
......................................................................
27 4.1.1. Aislamiento de Pseudomonas fluorescentes
......................... 27 4.1.2. Pruebas para la seleccin de la
mejor cepa de
Pseudomonas fluorescentes
..............................................................
27
-
3
4.1.2.1. Antibiosis in vitro de Pseudomonas fluorescentes
Vs. hongos fitopatgenos
..........................................
27
4.1.2.2. Identificacin de rizobacterias productoras de
cido cianhdrico (HCN)
............................................
28
4.1.2.3. Produccin e identificacin de siderforos .............
28 4.1.3. Seleccin e identificacin de la especie de
Pseudomonas que logro el mayor rango de inhibicin
contra los hongos fitopatgenos
...........................................
29
4.1.4. Concentraciones bacterianas y cuantificacin de
unidades formadoras de colonias (UFC)
..............................
29
4.1.5. Preparacin del inoculo de HMA
........................................... 30 4.1.5.1. Propagacin
de los HMA ............................................. 30
4.1.5.2. Clareo y tincin de races
............................................ 30
4.1.5.3. Porcentaje de colonizacin micorrzica
.................... 31 4.1.6. Aislamiento de hongos fitopatgenos
causantes del
damping-off en plantas de Carica papaya L
......................
31
4.1.6.1. Induccin de la enfermedad
.................................... 31
4.1.6.2. Aislamiento e identificacin de fitopatgenos
causantes del damping-off
.......................................
32
4.2. Trabajo en invernadero
.....................................................................
32 4.2.1. Ubicacin del rea experimental
........................................... 32 4.2.2. Material
vegetal
........................................................................
32 4.2.3. Sustrato utilizado
.......................................................................
33
4.3. Fase experimental
..............................................................................
33 4.3.1. Experimento 1. Dosis respuesta de plantas de papayo
inoculadas con la mejor cepa de Pseudomonas
fluorescentes
.............................................................................
33
4.3.1.1. Variables evaluadas en el experimento dosis-
respuesta rizobacteria-papayo
.................................
I) Altura y numero de hojas
........................................
34
34
II) Unidades formadoras de colonias (UFC) ............. 35 III)
rea foliar y biomasa .............................................
35
4.3.2. Experimento 2. Susceptibilidad de plntulas de Carica
-
4
papaya L al ataque de hongos fitopatgenos causantes
del damping-off
.......................................................................
35
4.3.2.1. Variables a evaluar durante el desarrollo del
experimento de la susceptibilidad de Carica
papaya L al ataque de hongos fitopatgenos ......
36
I) ndice de severidad y necrosis ...............................
36 4.3.3. Experimento 3. Efecto de la inoculacin dual de
Pseudomonas fluorescentes y HMA en el control
biolgico del damping-off en plntulas de Carica
papaya L
...................................................................................
37
4.3.3.1. Variables a evaluar en el experimento sobre
inoculacin dual de Pseudomonas fluorescentes y
HMA en el control biolgico del damping-off en
plntulas de Carica papaya L
..................................
39
I) Altura y numero de hojas
........................................ 39
II) Unidades formadoras de colonias (UFC) ............. 39 III)
rea foliar y biomasa .............................................
39 IV) ndice de severidad y necrosis .............................
40 V) Por ciento de colonizacin micorrzica ............... 40
V. RESULTADOS
..........................................................................................
41
5.1. Seleccin de Pseudomonas
............................................................. 41
5.1.1. Aislamiento de Pseudomonas fluorescentes y su
capacidad de inhibir el crecimiento de fitopatgenos
del suelo
....................................................................................
41
5.1.2. Rizobacterias con capacidad de producir cido
cianhdrico
................................................................................
43
5.1.3. Sideroforo producido por la rizobacteria seleccionada
.... 43 5.1.4. Identificacin de la especie de Pseudomonas
seleccionada
..........................................................................
44
5.2. Identificacin de los hongos causantes del damping-off
en
plntulas de Carica papaya
.............................................................
45
5.3. Respuesta de plntulas de papayo var. Maradol a la
inoculacin con diferentes concentraciones de Pseudomonas
-
5
putida
...................................................................................................
46 5.3.1. Altura y nmero de hojas
......................................................... 46 5.3.2.
rea foliar y biomasa fresca y seca
....................................... 48 5.3.3. Dinmica
poblacional de P. putida y P. fluorescens de la
rizosfera de plntulas de papayo
............................................
49
5.4. Efecto de diferentes concentraciones de Fusarium
oxysporum
en la susceptibilidad de plntulas de papayo var. Maradol en
vivero
..................................................................................................
50
5.4.1. ndice de Severidad y necrosis
............................................. 50 5.5. Efecto de la
inoculacin dual de HMA y P.putida en plantas de
papayo para el control biolgico del damping-off
....................
52
5.5.1. Altura y nmero de hojas
...................................................... 52 5.5.2.
rea foliar y biomasa fresca y seca
..................................... 54 5.5.3. ndice de severidad
y necrosis .............................................. 55 5.5.4.
Evaluacin de la colonizacin de HMA y P. putida en
plntulas de papayo
.............................................................
57
VI. DISCUSIN
.............................................................................................
59
6.1. Pseudomonas fluorescentes y su capacidad de inhibir in
vitro el
crecimiento de Fusarium oxysporum y Pythium sp
.........................
59
6.2. Efecto de diferentes concentraciones de Pseudomonas
putida
y P. fluorescens en el crecimiento y desarrollo de plntulas
de
papayo var. Maradol
.........................................................................
61
6.3. Respuesta de plntulas de papayo var. Maradol a
diferentes
concentraciones de Fusarium oxysporum
....................................
64
6.4. Efecto de la inoculacin dual de HMA y P. putida en
plantas
de papayo para controlar Fusarium oxysporum agente causal
del damping-off
................................................................................
67
VII. CONCLUSIONES
...................................................................................
74
VIII. LITERATURA CITADA
............................................................................
75
-
6
NDICE DE CUADROS Pgina
Cuadro 1 Participacin de los principales municipios
productores de papaya en el Estado de Veracruz
(SAGARPA, 1999)
6 Cuadro 2 Efecto de microorganismos del suelo sobre el ciclo
de
vida de los HMA (Fitter y Garbaye, 1994)
20 Cuadro 3 Anlisis de las propiedades fsico-qumicas del
sustrato
que se empleo en el desarrollo de los experimentos
33 Cuadro 4 Descripcin de los tratamientos para el
experimento
dosis-respuesta
34
Cuadro 5 Descripcin de los tratamientos para evaluar que
concentracin de conidias de Fusarium oxysporum
enfermaban a plntulas de papayo de damping-off
36
Cuadro 6 Escala propuesta por St-Arnaud et al. (1994) para
evaluar la severidad del damping-off en plantas de
Carica papaya L.
37
Cuadro 7 Escala propuesta por St-Arnaud et al. (1994) para
evaluar necrosis causado por damping-off en plantas
de Carica papaya L.
37
Cuadro 8 Descripcin de los tratamiento para el experimento
final
38 Cuadro 9 Halo de inhibicin en mm cuantificado en
diferentes
medios con rizobacterias y F. oxysporum
42 Cuadro 10 Halo de inhibicin en mm cuantificado en
diferentes
medios con rizobacterias y Pythium sp.
42 Cuadro 11 Produccin de biomasa fresca y seca de plntulas
de
papayo inoculadas con rizobacterias
49 Cuadro 12 Produccin de biomasa fresca y seca de plntulas
de
papayo inoculadas con microorganismos
55
-
7
Cuadro 13 Porcentaje de colonizacin micorrizca evaluado en
plantas de papayo a los 36 y 72 das despus de la
inoculacin (ddi) con HMA, P. putida y F. oxysporum
57
Cuadro 14 Unidades formadoras de colonias (UFC)
cuantificadas
en plantas de papayo inoculadas con HMA, P. putida
y F. oxysporum
58
-
8
NDICE DE FIGURAS Pgina
Figura 1 Caractersticas morfolgicas microscpicas del
gnero Fusarium (Nelson et al., 1983)
9 Figura 2 Modelo propuesto sobre la absorcin de fierro por
Pseudomonas fluorescentes (Elad y Chet, 1987; Morris
et al., 1992)
14
Figura 3 Espectro de absorcin realizado para la
identificacin
del siderforo producido por Pseudomonas sp.
(rizobacteria nmero tres), la cual es antagonista a F.
oxysporum y Pythium sp.
44
Figura 4 Cuantificacin de altura y nmero de hojas de
plntulas de papayo inoculadas con diferentes
concentraciones de Pseudomonas putida y P.
fluorecens
47
Figura 5 rea foliar de plntulas de papayo cuantificada a los
54 das despus de inoculadas las rizobacterias (P.
putida y P. fluorecens) con diferentes
concentraciones. Las barras con la misma letra son
estadsticamente iguales (P
-
9
Figura 9 rea foliar de plntulas de papayo cuantificada a los
72 das despus de inoculados los microorganismos
(HMA, P. putida y F. oxysporum). Las barras con la
misma letra son estadsticamente iguales (P
-
10
RESUMEN
Para evaluar el efecto protector entre rizobacterias (PGPR) y
hongos
micorrzicos (HMA) sobre la severidad del damping-off en papayo,
se
aislaron 56 rizobacterias nativas. De las cuales se
seleccionaron con base a
la produccin de pigmento amarillo-verdoso 8, evaluando su
capacidad
antagnica in vitro contra Fusarium oxysporum y Pythium sp.,
sobresaliendo
la rizobacteria nmero 3 con halos de inhibicin de hasta 10
mm,
identificndose como Pseudomonas putida, la cual se inoculo en
plntulas
de papayo bajo diferentes dosis (109, 108, 106 y 104 celmL)
utilizando una P.
fluorescens (A9) de referencia, obteniendo diferencias
significativas (Tukey,
P
-
11
ABSTRACT
In order to know the protective effect between rhizobacterial
(PGPR) and
mycorrhizal fungi (HMA) on severity damping-off in papaya, 56
native
rhizobacterias were isolated, selecting them bases on the
yellow-greenish
pigment production 8, evaluating their antagonistic capacity in
vitro
against Fusarium oxysporum and Pythium sp., excelling
rhizobacteria 3 with
halos inhibition of up to 10 mm, identifying Pseudomonas putida,
as
inoculated in plants of papaya under different doses (109, 108,
106 and 104
celmL) using P. fluorescens (A9) from reference, obtaining
significant
differences (Tukey, P
-
12
I. INTRODUCCIN
En el mercado mundial el cultivo del papayo (Carica papaya L.),
se
considera un frutal de importancia econmica por su alta
rentabilidad y la
gran aceptacin de sus frutos (PROFRUTA, 1999). Este cultivo se
desarrolla
de manera adecuada en lugares donde la precipitacin pluvial
oscila
entre 1500 a 2000 mm anuales, siendo las plantas jvenes
(desarrolladas
durante etapa de vivero) las que requieren ms agua que las
plantas
adultas, sin embargo, este cultivo es muy sensible a contenidos
de
humedad altos en el suelo, lo que ocasiona retrasos en el
desarrollo
durante las diferentes etapas fenolgicas, ocasionando pudricin
de races
e inclusive la prdida total (Arrieta y Carrillo, 2002).
De entre los hongos que causan las enfemedades fungosas que
originan
importantes prdidas al nivel de vivero destacan los gneros:
Fusarium,
Pythium, Rhizoctonia, Phytophthora, entre otros, los cuales
invaden el
sistema radicular de las plantas, obstruyendo principalmente los
vasos
vasculares, ocasionando amarillamiento de hojas y estras
necrticas de
color marrn en la base del tallo a nivel del suelo, originado
un
ahorcamiento denominado comnmente damping-off secadera de
los viveros, el cual trae como consecuencia la muerte de las
plantas,
originando prdidas importantes en esta etapa del cultivo
(Nishina et al.,
2000).
Tradicionalmente el control de estos patgenos se lleva a cabo
con dos
mtodos; el primero de ellos se basa en la utilizacin de
fungicidas (como
benlate, manzate, captan, entre otros), los cuales se aplican en
intervalos
de cada siete das durante el lapso que dura la planta en ese
estadio,
elevando los costos de produccin del cultivo (Latorre, 1999;
Yage, 1999),
y el segundo que es el ms utilizado hasta ahora, sobre todo en
tierras ms
-
13
o menos infestadas por estos patgenos, es la desinfeccin del
suelo con
fumigantes de amplio espectro. El bromuro de metilo ha sido
el
desinfectante ms eficaz pero su aplicacin es cara y, como ya
es
conocido por todos, por los problemas medio ambientales y de
residuos
que produce, tras el protocolo de Montreal, existe el acuerdo de
restringir
su utilizacin progresivamente hasta el ao 2005 en que estar
prohibido su
uso (Monera, 1999).
Ante tales casos existe el aprovechamiento de ciertas tecnologas
con un
alta grado cientfico que pueden ofrecer soluciones a estos
problemas, las
cuales se encuentran ntimamente ligadas a la produccin agrcola
sin
causar algn dao a la naturaleza (Torres, 1996), es decir,
mantiene un
equilibrio entre el suelo, biota y medio ambiente (Vandermeer,
1995). La
biotecnologa que se utiliza en estos procesos involucra el
manejo de
agentes microbianos capaces de fijar nitrgeno atmosfrico,
bacterias
promotoras del crecimiento vegetal, hongos micorrzicos,
agentes
antagnicos en el control biolgico de plagas y enfermedades de
las
plantas, siendo factible de esta manera la disminucin de
agroqumicos y
funguicidas, contribuyendo a la sostenibilidad de los sistemas
productivos y
del entorno ecolgico (Ferrera-Cerrato, 1995).
El control biolgico de enfermedades de las plantas se ha
practicado
mediante la inoculacin de estos microorganismos en la rizosfera
con el fin
de mejorar la sanidad y la productividad de los cultivos, entre
los
sintetizados biolgicos producidos por estos organismos se
encuentran los
sideroforos, cido cianhdrico y antibiticos, destacando a las
bacterias y
hongos, como los dos grupos mas importantes antagnicos a
fitopatgenos (Barea, 1998), por lo que su utilizacin de manera
conjunta
posiblemente integren una serie de mecanismos beneficiosos de
defensa
-
14
que repercutirn en la sanidad vegetal de las plantas, por lo que
este tipo
de interacciones microbiolgicas pueden ser objetivos principales
a
abordar en el campo de la investigacin agrcola (Azcn, 2000),
basndose en este hecho donde las interacciones entre
microorganismos
benficos del suelo pueden potencializar su accin protegiendo a
las
plantas contra patgenos del suelo, se planteo en este trabajo
de
investigacin la siguiente hipotesis y objetivos:
2.1. Hipotesis
Si las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) y
los hongos
micorrzicos arbusculares (HMA) ejercen un papel como agentes de
control
biolgico de manera individual, entonces la accin conjunta
incrementara
su eficiencia, disminuyendo la severidad del damping-off en
plntulas de
papayo.
2.2. Objetivo general
Conocer el efecto conjunto entre rizobacterias promotoras del
crecimiento
vegetal (PGPR) y hongos micorrzicos arbusculares (HMA) en la
disminucin
de la severidad del damping-off en plntulas de papayo.
2.2.1. Objetivo especfico
Cuantificar el efecto conjunto entre rizobacterias promotoras
del
crecimiento vegetal (PGPR) y hongos micorrzicos arbusculares
(HMA) en el
control biologico del damping-off ocasionado por Fusarium
oxysporum en
plntulas de papayo.
-
15
III. REVISIN DE LITERATURA 3.1. El cultivo de papayo (Carica
papaya L)
Se estima que la produccin mundial de frutas tropicales para el
ao 2000
fue de 61.4 millones de toneladas, de las cuales, la papaya
aport cerca
de 8.4 millones de toneladas, siendo Amrica Latina y el Caribe
los
principales productores de esta fruta con cerca de la mitad de
la
produccin mundial. Mxico es uno de los principales pases
productores
de esta fruta con mas de 361,274 toneladas, ocupando el Estado
de
Veracruz el primer lugar con aproximadamente 239,890 toneladas
(66.4%
de la produccin nacional) seguido por los estados de Jalisco
y
Michoacn con 39,647 y 37,330 toneladas, respectivamente (FAO,
2001).
Los principales municipios productores dentro de la entidad
veracruzana
son Paso de Ovejas, Puente Nacional, Manlio F. Altamirano y
Soledad de
Doblado, con cerca del 60% de la produccin de este estado
(Cuadro 1)
(SAGARPA, 1999).
Cuadro 1. Participacin de los principales municipios productores
de papaya en el Estado de Veracruz (SAGARPA, 1999).
Municipio Superficie sembrada (ha)
Produccin (ton) Participacin (%)
Paso de Ovejas 2313 81480 23.24
Tierra Blanca 1990 16377 4.67
Puente Nacional 1860 65380 18.65
Soledad de Doblado 1147 28600 8.16
Manlio F, Altamirano 1112 29650 8.46
Cotaxtla 572 14352 4.09
Actopan 549 16840 4.80
Isla 410 24600 7.02
Otros 3779 73375 20.91
-
16
Sin embargo y a pesar que la produccin de papaya origina
importantes
divisas para los principales pases productores del mundo en vas
de
desarrollo como Mxico, Brasil, Nigeria, Tanzania y Zaire; los
niveles de
tecnologa para su manejo son inadecuados sobre todo para el
control de
plagas y enfermedades, maleza y manejo poscosecha del fruto, los
cuales
representan perdidas importantes para el cultivo desde el
semillero hasta
campo (Malo y Campbell, 1994; Smith et al., 1995). Por lo que
toda
investigacin que se pueda realizar en el mbito regional, estatal
y
nacional en nuestro pas para coadyuvar en estos problemas
importantes
que disminuyen la produccin, aumentara notablemente los
rendimientos
que ayudarn a lograr un dominio en la produccin de esta fruta en
el
mercado mundial, trayendo grandes beneficios tanto para Veracruz
como
para Mxico (Gheno, 1998).
3.1.1. El damping-off, principal enfermedad en semillero
Unos de los problemas ms importantes que atacan al cultivo del
papayo
(Carica papaya L) en semillero es la enfermedad conocida
como
damping-off, secadera o mal del talluelo, que es causada por
patgenos
del suelo como Fusarium sp., Phytophthora sp., Pythium sp.,
Rhizoctonia sp.,
entre otros, todos ellos ocasionan pudriciones de raz y tallo,
surgiendo
sntomas alarmantes ya que la destruccin de estos rganos es tan
rpida
y letal que da como resultado la muerte de las plantas (Saldaa
et al.,
1985; Venette y Gross, 1992; Snchez, 1994).
Estos hongos son parsitos no obligados que viven, se desarrollan
y
propagan en el suelo, comnmente localizados en climas tropicales
donde
la humedad del suelo es ideal para su crecimiento y
desarrollo,
reproducindose por medio de micelio o conidios (Agrios,
1998).
-
17
3.1.1.1. Fusarium sp. causante del damping-off
El inters de los patlogos por Fusarium sp. empieza en los aos
80s,
debido a su amplio espectro de ataque principalmente en
plantas
vasculares de inters agronmico, las cuales destrua en poco
tiempo
(Kistler, 1997). Dentro de este tipo de hongo imperfecto, las
especies ms
importantes que causan marchitamiento vascular, pudriciones a
las
semillas, plntulas (ahogamiento), pudriciones de raz, tallos
inferiores,
tubrculos, coronas y bulbos, son Fusarium solani, F. roseum y F.
oxysporum,
destacando este ultimo por su gran agresividad, atacando
diversos cultivos
como caf, pltano, caa de azcar, papayo, pastos, la mayora de
las
hortalizas anuales y herbceas perennes de ornato, entre otros
(Gonzlez,
1989; Ocamb y Comedla, 1994; Rekah et al., 1999).
Pertenece a la Divisin Ascomycota, Clase Euascomycetes,
Orden
Hypocreales y Familia Hypocreaceae. Se propaga por el suelo en
forma de
micelio, en ocasiones por esporas, conidios o esclerocios, los
cuales son
llevados por el agua, viento, herramienta agrcola, trasplantes,
semillas o
esquejes de plantas infectadas y algunas veces por insectos,
sobreviviendo
por meses o incluso aos dependiendo del tipo de suelo y de
las
condiciones ambientales (Gordon et al. 1992; Freeman et al.,
2002).
Su marcada variabilidad en cuanto a sus caractersticas
fisiolgicas y
morfolgicas explica su capacidad para colonizar diversos
nichos
ecolgicos diseminados por todo el mundo, actualmente la mayora
de
estas especies estn clasificadas con base a sus caractersticas
macro y
microscpicas del cultivo como el tipo de clamidosporas,
monofialide,
conidias, macroconidias, entre otros (Figura 1), siendo su
morfologa la
clave para su identificacin, debido a que su forma es constante
y estable
-
18
cuando el hongo crece en substratos naturales y/o condiciones
estndar
(Monzn y Rodrguez, 1999).
Figura 1. Caractersticas morfolgicas microscpicas del gnero
Fusarium
(Nelson et al., 1983) De las diversas especies de Fusarium, la
especie oxysporum es la mas
comn debido a que su distribucin es universal, se asla como
saprfito
del suelo y de numerosas plantas (cereales, soja, algodn,
papayo,
pltano, cebolla, papa, manzana, etc.), como fitopatgeno
causa
grandes prdidas econmicas, sus microconidias son ovoides o en
forma
de rin, con un tamao de 5-12 x 2,3-3,5 m y, ocasionalmente, con
uno o
dos tabiques. Nacen de monofilides laterales, cortas y anchas,
afiladas
hacia la punta, con collaretes poco definidos, solitarias o
ramificadas. Las
microconidias pueden formar masas (simulan cabezas) pero
nunca
cadenas. Las macroconidias tienen de uno a cinco septos. Su
tamao es
de 23-54 x 3-4,5 m. Tienen forma de media luna, ligeramente
curvadas,
clula basal
microconidias
macroconidias
clamidosporas
polifialides
esporodoquia
Monofialide con cadena de microconidias
Monofialide con microconidias en masa
clula apical
-
19
con pared fina y delicada. Su clula apical es afilada y la clula
basal con
forma de pie pero pueden tener ambos extremos afilados. En la
mayora
de los cultivos las clamidosporas son abundantes. Son grandes,
hialinas, de
pared lisa o rugosa y pueden observarse aisladas o en parejas,
intercalares
o terminales (Nelson et al., 1994; Monzn y Rodrguez, 1999).
Este hongo se presenta en regiones templadas y clidas, ya sea en
los
trpicos y subtrpicos, principalmente en suelos arcillosos, con
pobre
aireacin, mal drenaje y una humedad muy alta, llegando a ser
menos
dainos o raros en climas fros, puede sobrevivir en el suelo por
tiempo
indefinido, haciendo su control casi imposible o ineficiente,
siendo la forma
ms efectiva el uso de variedades vegetales resistentes las
cuales se
pueden mantienen por un periodo largo de tiempo sin ser
afectadas por
este tipo de patgenos del suelo (Smiley y Uddin, 1992;
Gracia-Garza y
Fravel, 1998; Baird y Carling, 1998).
3.1.1.2. Desarrollo de la enfermedad
La forma de invadir de este fitopatgeno empieza cuando los
tubos
germinales de las esporas o el micelio existente en el suelo
penetra por la
raz o por alguna herida al nivel de las races de las plantas,
propagndose
dentro de la corteza de la raz, llegando a los vasos xilmicos,
donde se
mantiene en ese sitio viajando a travs de ellos de forma
ascendente
hacia toda la planta. El micelio se ramifica y produce
microconidios, los
cuales causan una obstruccin de los vasos, dando como resultado
una
alteracin en un volumen mnimo de agua disponible para las hojas
y
funcionamiento de la planta, trayendo como consecuencia cierre
de los
estomas, hojas marchitas y la muerte del resto de la planta
(Smith et al.,
1992; Skovgaard et al., 2001).
-
20
3.1.1.3. Control de la enfermedad
Los problemas causados por este tipo de enfermedades del suelo
en el
cultivo de papayo ha sido siempre una de las limitaciones ms
importantes
en su manejo, tradicionalmente el control de estos
organismos
fitopatgenos se ha basado en la utilizacin de plaguicidas
sumamente
txicos, los cuales a travs de los aos permanecen activos por
tiempos
indefinidos en el suelo, trayendo como consecuencia un problema
de
contaminacin ambiental en perjuicio tanto para el agroecosistema
como
para la salud del hombre (Rodrguez-Kabana, 1990; Lloyd, 1992;
Hamm,
2001).
Actualmente existen alternativas de manejo de los cultivos
mediante la
biotecnologa aplicada la cual ofrece soluciones a estos
problemas
mediante el aprovechamiento de ciertas tecnologas con un alto
grado
cientfico, las cuales se encuentran ntimamente ligadas a la
produccin
agrcola sin causar algn dao a la naturaleza (Torres, 1996),
manteniendo
un equilibrio entre el suelo, biota y medio ambiente
(Vandermeer, 1995).
Involucrando en estos procesos el manejo de agentes
microbianos
capaces de fijar nitrgeno atmosfrico, bacterias promotoras
del
crecimiento vegetal, hongos micorrzicos, agentes antagnicos en
el
control biolgico de plagas y enfermedades de las plantas,
produccin de
compostas y vermicompostas, siendo factible de esta manera
la
disminucin de agroqumicos y plaguicidas, contribuyendo a la
sostenibilidad de los sistemas productivos y del entorno
ecolgico (Ferrera-
Cerrato, 1995; Jonson y Dileone, 1999). Aunque en Mxico es poco
el uso
de agentes microbianos contra patgenos de plantas
(Zavaleta-Meja,
1996), el control biolgico se ha practicado mediante el empleo
de
-
21
bacterias y hongos los cuales han demostrado ser altamente
eficientes en
el control de estos organismos (Barea, 1998).
3.2. Rizobacterias y hongos micorrzicos con capacidad de
proteccin en las plantas
Dentro de la gama de microorganismos que habitan en el suelo
e
interactan con las plantas existen algunos grupos con capacidad
para
controlar e inhibir a fitopatgenos, destacando a las
rizobacterias (PGPR) y
los hongos micorrzicos arbusculares (HMA) como los
organismos
antagnicos ms importantes encontrados en el suelo, ya que a
travs de
los aos se ha reportado que estos organismos son capaces de
proteger a
las plantas mediante contra diversos patgenos del suelo como
Phytium
sp., Phytophthora sp., Rhizoctonia sp., Fusarium sp., entre
otros (Azcn-
Aguilar y Barea, 1996a; Rosales et al., 1995; Wei et al., 1996;
Barea, 1998;
Raupach y Kloepper, 1998).
Sin embargo generalmente el uso de rizobacterias y hongos
micorrzicos en
las plantas como agentes de control biolgico ha sido de
manera
individual por lo que si se llegaran a inocular de manera
simultnea estos
dos microorganismos en las plantas probablemente se pudieran
generar
una serie de mecanismos beneficiosos que repercutiran en la
sanidad
vegetal, considerando estas interacciones objetivos principales
de
investigacin a abordar en ambientes naturales y agrcolas (Hamel,
1996;
Larkin et al., 1998; Azcn, 2000; Mar et al., 2000).
3.2.1. Mecanismos de proteccin de las rizobacterias en las
plantas
Kloepper y Schroth (1978) clasificaron a las rizobacterias como
PGPR (plant
growth promoting rhizobacteria, por sus siglas en ingles) o
rizobacterias
-
22
promotoras del crecimiento vegetal, la cual segn Schroth y
Hancock
(1982) definieron como un organismo con alta agresividad para
colonizar a
las races de las plantas, siendo este proceso de colonizacin el
que
desplazaba eficientemente a otros microorganismos del suelo
ejerciendo
un control de fitopatgenos del suelo.
Sin embargo a travs de los aos las investigaciones han
demostrado que
estos no solo desplazan de manera eficiente a otros organismos
sino que
tambin pueden generar diferentes vas de proteccin para las
plantas
mediante la produccin de metabolitos como los siderforos,
cido
cianhdrico (HCN), antibiticos (como el
2,4-Diacetilfloroglucinol) e incluso
reportes recientes indican que las rizobacterias inducen un
sistema de
resistencia (ISR) en las plantas, que hace que estas puedan
sobrevivir al
ataque de diversos patgenos del suelo (Bagnasco et al., 1998;
Zehnder et
al., 2000; Park y Kloepper, 2000; Mavrodi et al., 2001; Whipps,
2001).
3.2.1.1. Las rizobacterias y sus metabolitos implicados en el
control biolgico de enfermedades
Ambrosi et al. (2000) y Mercado-Blanco et al. (2001), mencionan
que la
eliminacin principalmente de patgenos por las rizobacterias se
debe a la
produccin de siderforos que estos microorganismos sintetizan
cuando
existe una baja cantidad de fierro en el suelo, estos
metabolitos son
compuestos de bajo peso molecular afines al ion Fe+ (Telford y
Raymond,
1997) que permite atraparlo y absorberlo a travs de una
membrana
receptora, esta produccin esta regulada por tres genes; el sid B
que se
encarga de bio-sintetizar el sideroforo, el sid U que lo absorbe
y el sid R el
que regula la entrada y salida del compuesto (OSullivan y OGara,
1992)
(Figura 2).
-
23
Figura 2. Modelo propuesto sobre la absorcin de fierro por
Pseudomonas fluorescentes (Eland y Chet, 1987; Morris et al.,
1992)
Una vez que el fierro ingresa a la bacteria este es convertido
de ion Fe+ a
Fe2+ por medio de una reaccin enzimtica de xido-reduccin, el
cual
una vez reducido lo utiliza para su crecimiento y desarrollo
(Kloepper,
1993). Al atrapar (quelar) la rizobacteria a este
micronutrimento del suelo
hace que este elemento no este disponible para otros
microorganismos
que carezcan del sistema de asimilacin, o bien que su sideroforo
posea
una menor afinidad por el fierro, lo que asegura que la
rizobacteria sea la
nica capaz de asimilarlo limitando as el crecimiento de otros
organismos,
ejerciendo de esta manera el control biolgico de
enfermedades
importantes como Fusarium sp. (Duijff et al., 1999; Landa et
al., 2001),
Pythium sp., Rhizoctonia sp. (Mahaffee y Backman, 1993; Rankin y
Paulitz,
1994), y Phytophthora sp., (Liu et al., 1995). Siendo las
Pseudomonas
fluorescentes las que particularmente expresan un potencial
como
Fe3+
Cromosoma
Sideroforo fluorescente
Fe2+
+
__
Activador +
Represor
sid B sid U sid R
Membrana receptora sideroforo-fierro
-
24
agentes de control biolgico al ser productoras de diversos
siderforos
como pseudobactinas, ferribactinas, pioverdinas, pioquelinas,
tioforminas,
entre otros (Andriollo et al., 1992; Cook, 1993; Raaijmakers et
al., 1995;
Monne-Lloccoz et al., 1996; Duffy y Dfago, 1999; Boer et al.,
1999).
Otro de los compuestos microbianos que producen las
rizobacterias es el
cido cianhdrico (HCN) (Schippers, 1988), el cual juega un papel
muy
importante como supresor de fitopatgenos del suelo, sin embargo
esta
inhibicin de otros microorganismos tambin afecta el crecimiento
de las
races de las plantas (Bakker y Schipper, 1987; Voisard et al.,
1989; strom,
1991; Kunz et al., 1998).
Sin embargo este efecto negativo algunas veces puede ser
beneficioso
para las plantas, debido a que el HCN inhibe la oxidacin del
citocromo
en el proceso de respiracin, el cual a su vez retrasa la
oxidacin de
electrones NADH en la mitocondria reduciendo los niveles de
respiracin,
haciendo que las plantas sufran de estrs lo que hace modificar
su
metabolismo permitindole generar mecanismos de resistencia
sistemica
que la ayudan indirectamente a tolerar el ataque de
fitopatogenos del
suelo (Wei et al., 1991; Kloepper et al., 1997 y Pieterse et
al., 2001).
Las rizobacterias pueden inducir alteraciones en la fisiologa de
la planta,
haciendo que se incrementen las defensas induciendo un sistema
de
resistencia en las plantas (Leeman et al., 1995; Hoffland et
al., 1996; Han et
al., 2000). Las diferencias de la resistencia sistmica inducida
(RSI) como
antagonista en comparacin con un mecanismo de control biolgico
son
los siguientes:
-
25
a) La accin de la RSI esta basada en el mecanismo de defensa de
la
planta que puede ser activada o inducida por agentes externos,
mientras
que los antagonistas tienen una funcin directa en el control
biolgico de
agentes patgenos por medio de antibiticos, sideroforos y
cido
cianhdrico (HCN) o como competidores de nutrientes (Wei et al.,
1996;
Chen et al., 1999a)
b) La RSI una vez expresada, activa un potencial mltiple de
mecanismos
de defensa como lo es el incremento de la actividad de
citocininas,
protenas, cido saliclico, produccin de sustancias
antimicrobianas de
bajo peso molecular (ejemplo las fitoalexinas) (Rosales et al.,
1995; Chen et
al., 1999b) y la formacin de biopolmeros de proteccin (ejemplo
la
lignina, celulosa y glicoprotenas) (Bloemberg y Lugtenberg,
2001) y,
c) Un aspecto importante de la RSI es el amplio espectro de
patgenos
que puede controlar con solo inducir este sistema, en pepino
controlaron
trece patgenos (entre hongos, bacterias y virus) que
ocasionaban
necrosis en las hojas, mientras que un organismo antagonista
generalmente no puede disminuir el ataque de diversos
patgenos
(Kloepper et al., 1992; Pieterse et al., 2001).
Finalmente algunas rizobacterias principalmente del gnero
Pseudomonas
sp. tienen la capacidad de producir antibiticos los cuales
estn
involucrados directamente con la inhibicin de otros
microorganismos del
suelo, como ejemplo de estos compuestos tenemos al poliquetido
2,4-
Diacetilfloroglucinol (DAPG), omicina, fenazina, pirrolnitrina,
pioluteorina,
entre otros, los cuales han mostrado ser altamente eficiente en
el control
biolgico de fitopatgenos (Handelsman y Stabb, 1996; Raaijmakers
et al.,
-
26
1999; Schnider-Keel et al., 2000; Mavrodi et al., 2001;
Monne-Loccoz et al.,
2001; Notz et al., 2001).
3.2.2. Mecanismos de proteccin de los hongos micorrizicos en las
plantas
Los hongos micorrzicos arbusculares (HMA) han sido reportados
como
microorganismos que ejercen un efecto supresivo contra patgenos
que
causan enfermedades en las races de las plantas (Azcon-Aguilar y
Barea,
1996b; Trotta et al., 1996, Larsen y Bodker, 2001). Algunos
autores
mencionan que estos mecanismos de control biolgico estn
relacionados
con cambios en la morfologa, fisiologa y bioqumica del
hospedero, las
alteraciones morfolgicas se reportan que estn relacionadas con
la
lignificacin de la pared celular de las plantas, donde resulta
difcil la
penetracin del tejido por los patgenos del suelo (Cordier et
al., 1998),
fisiolgicamente el incremento en la concentracin de fsforo y
potasio en
los tejidos de las plantas, hacindolas menos susceptibles a
las
enfermedades del suelo (Graham, 1983) y finalmente
bioqumicamente,
por que la asociacin micorrzica eleva los contenidos de
aminocidos
(como la arginina y fenilaminas), fenoles, ligninas, flavonoides
(fitoalexinas)
y enzimas como la quitinasa, encontrados algunos de ellos tanto
en el rea
foliar como en el sistema radical desencadenan con esto un
sistema de
resistencia en las plantas lo que les permite resistir el ataque
de los
patgenos del suelo (Sieverding, 1991; Scharff et al., 1997;
Benabdellah et
al., 1998; Dais et al., 1998; Fusconi et al., 1999; Slezack et
al., 1999).
Al respecto Young y Hwang (1994), reportan que la resistencia de
las
plantas hacia el ataque de los fitopatgenos se debe en gran
medida a la
presencia de protenas dentro del hospedero, las cuales tienen un
papel
importante en el impedimento del desarrollo de la enfermedad
hacia los
tejidos vegetales de las plantas. Sin embargo Gianinazzi-Pearson
et al.,
-
27
(1996) y David et al. (1998), encontraron que los hongos
micorrizicos
pueden suprimir la presencia de protenas dentro del hospedero.
Por su
parte Shaul et al. (1999), analizan si esta interferencia en la
activacin de
protenas se restringe solo a la zona infectada o colonizada, por
lo que es
importante conocer si estos endfitos inducen o suprimen la
expresin de
los mecanismos asociados a la resistencia de las plantas.
En los ltimos aos los investigadores se han enfocado en la
bsqueda de
los genes que estan ntimamente ligados con la expresin de la
defensa de
las plantas micorrizadas hacia el ataque de los fitopatgenos,
incluyendo
los genes que codifican enzimas hidrolticas como las quitinasas
y -1,3-
glucanasas (Lambais y Mehdy, 1995; Blee y Anderson, 1996; Pozo
et al.,
1999). La induccin de estas enzimas por los HMA han tomado
mayor
atencin debido a su posible implicacin en la regulacin de la
simbiosis
hongo-hospedero y a la proteccin de las plantas (Azcon-Aguilar y
Barea,
1996c; Dumas-Gaudot et al., 1996; Lambais y Med, 1996; Pozo et
al., 1998).
Ambas, quitinasas y -1,3-glucanasas son compuestos biolgicos
con
diferentes formas y caractersticas qumicas, actividades
enzimaticas,
localizacin celular y propiedades antifngicas las cuales pueden
estar
expresadas en diferentes rganos y tejidos de las plantas, estas
enzimas
juegan un papel importante en la hidrlisis de la pared celular
de los
hongos fitopatgenos, considerndose importantes en los mecanismos
de
defensas de las plantas contra estos hongos (Simmons, 1994; Kim
y Hwang,
1997).
Caron (1989) y Cordier et al., (1996), sealan que otro de los
mecanismos
por el cual los HMA pudiera ejercer una influencia en los
patgenos del
suelo, es debido a que al penetrar a las races de la planta
hospedera
otorga una proteccin contra la penetracin de las hifas o micelio
de otros
hongos especialmente los fitopatgenos, obstaculizando sus
procesos de
-
28
infeccin hacia la raz inhibiendo su crecimiento y por
consecuencia
disminuyendo su capacidad de invasin hacia la planta. Otro
mecanismo
indirecto que pudiera beneficiar a las plantas micorrizadas
contra el
ataque de los patgenos es su mejora en la nutricin, ya que una
vez que
las plantas estn colonizadas por estos microorganismos estas
presentan un
mayor crecimiento y desarrollo que aquellas no inoculadas,
debindose
principalmente a que esta simbiosis incrementa la capacidad de
las races
para absorber fsforo y otros iones poco mviles del suelo como el
cobre,
zinc, magnesio, azufre, manganeso, cloro, hierro, calcio,
nitrgeno, boro y
molibdeno (Cooper, 1984; Chen et al., 1999; Hawkins et al.,
1999; Jakobsen
et al., 2001).
3.3. Interaccin entre PGPR y HMA 3.3.1. Efecto de las
rizobacterias en la fisiologa de los HMA
En aos recientes se ha encontrado que las rizobacterias juegan
un papel
muy importante en el desarrollo y crecimiento de los HMA,
influyendo de
manera directa en la germinacin de espora (Mayo et al., 1986;
Paulitz y
Linderman, 1989; Wilson et al., 1989), estimulacin del
crecimiento del
micelio externo, incremento en el establecimiento de los HMA en
el
hospedero, entre otros, sin embargo tambin pueden inhibir o
aumentar el
nmero de estos propgulos infectivos en la rizosfera y el
porciento de
colonizacin de las plantas (Daniels y trappe, 1980; Gryndler y
Vostka,
1996; Toro et al., 1997; Budi et al., 1999; Vostka y Gryndler,
1999).
Linderman (1988) y Frey-Klett et al., (1999), comentan que
el
establecimiento y colonizacin de los HMA sobre el hospedero
aumenta
significativamente cuando estos dos microorganismos son
inoculados de
manera dual en las plantas, incrementando la eficiencia de estos
endofitos
-
29
en las plantas. Por su parte Azcon (1987), reporta resultados
parecidos al
mencionar que las rizobacterias tienen un efecto directo en el
incremento
de la colonizacin del hospedero y germinacin de las esporas, un
ejemplo
de esto es lo encontrado por Fester et al., (1999) cuando la
colonizacin
micorrzica alcanzada solo con Glomus intraradices fue de 20%,
mientras
que la co-inoculacin con Pseudomonas fluorescens, Rhizobium
leguminosarum y Agrobacterium rhizogenes aument la colonizacin
en un
40%, 50% y 60%, respectivamente.
Singh y Kapoor (1999), encontraron resultados similares cuando
los
porcentajes de colonizacin aumentaron en plantas de trigo que
fueron
inoculadas en forma conjunta con PGPR y HMA (Glomus sp.),
incrementndose tambin los contenidos de nitrgeno, fsforo y
biomasa
total en las plantas. Por su parte Fitter y Garbaye (1994),
explican que el
efecto principalmente de las rizobacterias sobre los HMA est en
el ciclo
de vida de estos ltimos (Cuadro 2).
Cuadro 2. Efecto de microorganismos del suelo sobre el ciclo de
vida de los HMA (Fitter y Garbaye, 1994)
Fase Proceso Efecto Microorganismo Germinacin de
esporas
Qumico Inhibitorio Bacteria
Colonizacin Interaccin Estimulacin Bacteria
Cobertura hifal Incierto Inhibitorio Hongos y nematodos
Crecimiento hifal Incierto Desconocido Invertebrados
Esporulacin Desconocido Estimulacin Bacteria
Azcon y Barea (1985) y Gryndler et al., (1995), reportan que el
uso de
esporas desinfectadas de HMA dan como resultado un desarrollo
nulo por
parte de estos endfitos, lo que sugiere que la microflora
bacteriana
contenida en la superficie de la espora es importante para el
desarrollo del
-
30
hongo tanto en el suelo como en la raz. Resultados que
concuerdan con
los reportados por Schreiner y Koide (1993), quienes
desinfectaron esporas
de Glomus etunicatum con el antibitico estreptomicina, las
cuales fueron
inoculadas en plantas de lechuga, encontrando que el efecto de
la
desinfeccin de la espora trajo como consecuencia una disminucin
en el
crecimiento del hospedero, baja absorcin de fsforo y poca
colonizacin
de este endofito, lo que sugiere que al eliminar los
microorganismos
(principalmente bacterias) adheridos a la superficie de la
espora disminuye
la respuesta de los HMA en sus procesos de colonizacin de la
raz.
Bianciotto et al., (1996), revelan que existen bacterias que
habitan
intercelularmente dentro de las esporas de los HMA, las cuales
viven, se
reproducen y se mueven desde el interior de las esporas hasta el
micelio
cuando estas llegan a germinar, por lo que estos organismos
son
considerados importantes como componentes del citoplasma de los
HMA
y para el establecimiento de estos endfitos en las plantas.
Sin embargo algunas veces estas interacciones no funcionan como
lo cita
Marschner y Crowley (1996b), donde encontraron que la interaccin
entre
cepas de Pseudomonas fluorescens, Glomus deserticola y
Glomus
intraradices disminuy el porcentaje de colonizacin para la
primera
especie de HMA, as mismo la interaccin entre estos
microorganismos
redujo la poblacin de rizobacterias hasta en un 50%. Hodge
(2000), por su
parte comenta que se puede reducir la germinacin de esporas,
la
produccin de micelio y el porcentaje de colonizacin. Lo que
sugiere que
el antagonismo o sinergismo de esta interaccin entre HMA y PGPR
esta
dado por el contacto fsico de estos microorganismos en la
rizosfera de las
plantas y por el tipo de especie que acompaa esta interaccin
(McAllister
et al., 1994; Requena et al., 1997; Ravnskov et al., 1999a).
-
31
3.3.2. Efecto de los HMA en poblaciones de rizobacterias
Olsson et al. (1996) y Andrade et al., (1998) proponen que las
interacciones
entre rizobacterias y HMA en la rizosfera pueden tener efectos
de inhibicin
hasta estimulacin de la esporulacin para el caso de los
hongos
micorrizicos y mayor cantidad de unidades formadoras de colonias
(UFC)
para el caso de las rizobacterias. No obstante los hongos
micorrizicos no
solo influyen en la cantidad de rizobacterias que existen en el
suelo, sino
que tambin tienen un efecto directo en el establecimiento y
colonizacin
de estos microorganismos en las races de las plantas (Azcn y
Barea,
1996).
Por su parte Krishna et al., (1982), Paulitz y Linderman (1989),
Christensen y
Jakobsen (1993), Amora-Lozano et al., (1998), encontraron que
la
presencia de estos hongos endfitos asociados a las rizobacterias
tuvo un
impacto importante en el aumento y actividad de las poblaciones.
Sin
embargo, el nmero de ellas puede disminuir considerablemente
debido a
la afinidad entre los HMA y la(s) especie(s) que compongan
las
poblaciones bacterianas en la rizosfera, pueden verse afectadas
si existe
un retraso en el proceso de colonizacin de los HMA como tambin
la
etapa de inoculacin de los microorganismos en las plantas. Por
ejemplo
algunas poblaciones de Pseudomonas sp. generalmente se ven
disminuidas por la colonizacin de los hongos micorrizicos,
debido a que las
races micorrizadas disminuyen la cantidad y composicin de los
exudados
radicales, influyendo en la densidad poblacional y en el estado
fisiolgico
de la bacteria en la rizosfera (Dixon et al., 1989; Posta et
al., 1994;
Marschner y Crowley, 1996).
Meyer y Linderman (1986) observaron una mayor poblacin de
bacterias
anaerobias facultativas en la rizosfera de plantas de trbol
colonizadas
-
32
con el hongo micorrzico Glomus fasciculatum en comparacin
con
plantas de maz micorrizadas con el mismo hongo. Por su parte
Schreiner et
al. (1997), aislaron y cuantificaron diferentes grupos
bacterianos (gram-
negativos y gram-positivos) en plantas de soya cuando estas
fueron
inoculadas con diferentes hongos micorrzicos (Glomus etunicatum,
G.
mosseae y Gigaspora rosea), estos resultados parecen indicar que
la
hifosfera de estos hongos (definida como elvolumen de suelo que
se
encuentra influenciado por el micelio externo de los hongos
micorrzicos)
influye sobre ciertos grupos de bacterias, cuantificando mayor
poblacin
cuando el micelio era menos extenso (caso particular de G.
etunicatum) e
incrementando estos niveles poblacionales para las
gram-positivas cuando
los niveles de fsforo en el suelo eran bajos.
Los efectos donde se benefician estos dos microorganismos
pudieran
deberse a la competencia de carbono en la rizosfera (Jonson et
al., 1997),
aunque tambin pudiera existir otros mecanismos por los que la
inhibicin
entre HMA y rizobacterias se puede dar, por ejemplo: (1) la
influencia de los
hongos sobre la cantidad de carbono que las plantas pueden
derivar y
que pueden ser utilizadas por las comunidades microbianas
(Garland,
1996), (2) competencia por espacio (Ames et al., 1984), (3) las
condiciones
desfavorables fsicas y qumicas del suelo y (4) las poblaciones
predadoras
del suelo (Andrade et al., 1998).
3.4. Efecto de la inoculacin dual de PGPR y HMA en las
plantas
Subba et al. (1985), encontraron que la doble inoculacin de HMA
y PGPR,
increment significativamente el porciento de colonizacin de
estos
endfitos en plantas de cebada, al mismo tiempo que se aument
de
manera significativa la biomasa y el grano total en un 132% y
125%,
respectivamente en comparacin con las plantas no inoculadas.
-
33
Singh y Kapoor (1998), encontraron incrementos significativos
cuando
inocularon plantas de Vigna radiata con rizobacterias
solubilizadoras de
fsforo (Bacillus circulans) y HMA (G. fasciculatum),
incrementando la
entrada de fsforo y nitrgeno en los tejidos de la planta,
mejorando
significativamente la nutricin en las plantas inoculadas con
estos dos
microorganismos en comparacin a las dems plantas, adems los
valores
mas altos de colonizacin micorrzica (88%) se encontraron en las
plantas
inoculadas de manera dual con estos dos microorganismos.
Azcon (1989), reporta un efecto benfico cuando plantas de
jitomate
fueron inoculadas con PGPR y HMA, incrementndose el peso areo
(88%)
y el contenido de nitrgeno (47%), fsforo (70%) y potasio (47%),
con
relacin a las plantas sin inocular, adems de aumentar el
porcentaje de
colonizacin micorrizica hasta en un 50% mas en comparacin a
la
inoculacin con solo HMA. Resultados similares fueron reportados
por
Gryndler y Hrselov (1998), donde plantas de maz inoculadas
con
bacterias diazotrficas y Glomus fistulosum incrementaron su
contenido de
fsforo en un 16%, por su parte Singh y Kapoor (1999),
obtuvieron
incrementos del 68% en la concentracin de fsforo y nitrgeno en
plantas
de trigo inoculadas con Bacillus circulans y Glomus sp. 88 con
relacin a las
plantas sin inocular.
En otro estudio realizado por Bopaiah y Khader (1989),
encontraron que los
niveles de peso seco y hmedo en pimienta negra se incrementaron
tras su
inoculacin con Azospirillum sp. y HMA, llegando a tener un
incremento en
altura de hasta 63 cm en relacin a las plantas testigo,
resultados que
comprueban que puede ser mejor utilizar una mezcla de
microorganismos
capaces de interrelacionarse entre s, que utilizarlos por
separado.
Resultados similares fueron reportados por Pandwar (1991),
encontrando
-
34
que al inocular trigo con PGPR y HMA, increment el peso, tamao
y
rendimiento de grano (hasta en 16%) en comparacin con las
plantas
testigo.
Hflich et al., (1994), sealan que la inoculacin de manera
conjunta con
HMA y rizobacterias como Rhizobium sp. y Pseudomonas sp. tienen
un
efecto positivo en el crecimiento de las plantas, lo cual hace
necesario
analizar a fondo las interacciones entre microorganismos-planta
y sus
efectos en la produccin de hormonas, competencia por espacio en
la
raz, factores climticos, qumicos y fsicos del suelo y clima y su
importancia
en el crecimiento de las plantas.
Gryndler et al,. (1995), encontraron que plantas de maz
inoculadas de
manera dual con bacterias y HMA (G. fasciculatum) incrementaron
el
porcentaje de colonizacin micorrizica (en un 88%) y el contenido
de
fsforo (117%) y magnesio (13%) en los tejidos de las plantas.
Por su parte
Kim et al. (1998), encontraron que doble inoculacin con PGPR
(Enterobacter agglomerans) y HMA (G. etunicatum) estimularon
significativamente el peso fresco del follaje (13.49 g) y el
contenido de
fsforo (3.40 mg) y nitrgeno (60.31 mg) en los tejidos de plantas
de tomate
inoculadas con estos dos organismos comparadas con las plantas
sin
inocular.
Staley et al., (1992), al inocular plantas de alfalfa y trbol
con P. fluorescens
y HMA encontraron que el crecimiento en altura fue un 23% ms que
el
testigo. As mismo, lograron observar que obtuvieron decrementos
en la
cantidad de biomasa cuantificada, con los tratamientos
rizobacteria y
hongo. Esto pudiera deberse a que Pseudomonas produce
sustancias
fngicas que debieron minimizar la colonizacin de los HMA, lo que
estos
-
35
autores proponen que en futuras investigaciones se estudie los
efectos de
las PGPR sobre los estados iniciales de colonizacin de los HMA,
para
entender as, el concepto del manejo de las interacciones
microbianas y su
efecto en el crecimiento de las plantas.
Dhillion (1992), encontr resultados similares al inocular HMA
y
Pseudomonas sp. en plantas de arroz, observando una reduccin en
la
colonizacin micorrzica cuando se inoculaba al mismo tiempo con
la
rizobacteria, no obstante el tratamiento donde fueron inoculados
estos dos
microorganismos fue el ms alto en cuanto a produccin de biomasa
(2.79
g) y concentracin de fsforo (0.33 g) y nitrgeno (1.90 g) en los
tejidos de
las plantas. Ravnskov et al., (1999b), observaron incrementos
del 85% en la
biomasa radical y acumulacin de fsforo (de 0.67 mg) en plantas
de
pepino inoculadas con P. fluorescens (cepa DF57) y G.
intraradices,
adems que las poblaciones bacterianas que se contabilizaron
se
incrementaron cuando estuvo presente el hongo micorrzico (en un
2.16 x
107 UFC) en comparacin a la poblacin que se cuantifico donde
solo
estuvo la bacteria (1.55 x 107 UFC)
Azcn (1993), seala que los tiempos de inoculacin de las PGPR y
HMA
puede ser de tres formas: 1) bacterias y hongos de manera
simultnea, 2)
despus de la colonizacin micorrzica y 3) en forma repetida,
dependiendo su supervivencia de la calidad y cantidad de
exudados
radicales. Por su parte Bashan (1986), comenta que los tiempos
de
inoculacin son importantes para la obtencin de un mayor
beneficio en
la planta, reportando una mejor respuesta del hospedero en
semilla y
plantas jvenes que en plantas adultas.
-
36
IV. MATERIALES Y MTODOS
4.1. Trabajo en Laboratorio
4.1.1. Aislamiento de Pseudomonas fluorecentes nativas
Se tomaron al azar muestras de aproximadamente 500 g en campo de
la
rizosfera de plantas de papayo, las cuales se mezclaron para
obtener una
muestra compuesta (Roberts y Henry, 2001) que se ocup como
sustrato
para la germinacin de semillas de papayo, mismas que 20 das
despus
de su emergencia se ocuparon para tomar muestras de 25 g de
races las
cuales se lavaron con agua destilada estril, se maceraron y
agitaron por
cinco minutos, realizando diluciones decimales que se sembraron
en
placas con medio de Agar Soya Tripticasa (AST) adicionado con
8-
Hidroxiquinolina, incubndose durante 48 horas a 28 C, las
colonias ms
abundantes fueron seleccionadas y conservadas en viales a
una
temperatura ambiente y en completa oscuridad (Muoz, 1993;
Mahaffee y
Kloepper, 1997; Quadt-Hallmann et al., 1997).
4.1.2. Pruebas para la seleccin de la mejor cepa de Pseudomonas
fluorecentes 4.1.2.1. Antibiosis in vitro Pseudomonas fluorescentes
Vs. Hongos fitopatgenos
Para conocer la capacidad de antibiosis de las rizobacterias
se
seleccionaron para este ensayo a Pythium sp. y Fusarium
oxysporum, los
cuales fueron propagados en placas con medio: AST, AST +
Peptona, PDA
y V-8 en presencia y ausencia de cloruro frrico (20 ppm),
incubndose tres
placas (como repeticin) por medio de cultivo durante 2 das a
temperatura ambiente y en completa oscuridad, posteriormente
se
-
37
estriaron las rizobacterias a una distancia de 2 cm de los
fitopatgenos,
nuevamente fueron incubadas en oscuridad durante 72 horas,
la
existencia de halo de inhibicin se cuantific en milmetros
(Axelrood et al.,
1996; Sturz et al., 1998; Cottyn et al., 2001).
Los datos obtenidos fueron analizados empleando el programa
MSTAT y
cuando se presentaron diferencias significativas entre los
tratamientos se
aplic la prueba de Tukey (P
-
38
4.1.3. Seleccin e identificacin de la especie de Pseudomonas que
logr el mayor rango de inhibicin contra los hongos fitopatgenos
Una vez realizada la prueba de antibiosis se eligi la
rizobacteria que
mayor halo de inhibi logr contra los dos fitopatgenos,
identificando la
especie segn Klinge (1960), Katoh y Itoh (1983), Fulghum (1994)
y el
manual de Bergeys (1994), los cuales toman como base para la
identificacin de las especies de Pseudomonas caracteres
morfolgicos y
bioqumicos muy especficos para cada una de ellas.
4.1.4. Concentraciones bacterianas y cuantificacin de unidades
formadoras de colonias (UFC)
Las concentraciones rizobacterianas utilizadas en los
experimentos (109, 108,
106 y 104 clulasmL-1 de medio) fueron preparadas de la siguiente
manera;
la primera concentracin fue ajustada por medio de un
espectrofotmetro
marca Milton (Modelo 20D) a una absorbancia de 1, la cual fue
tomada
como base para realizar diluciones decimales para ajustar las
dems
concentraciones (Reddy et al., 1994; Glick et al., 1997),
aplicando de cada
concentracin 1 mL por planta (Enebak et al., 1998).
Para la cuantificacin de unidades formadoras de colonias (UFC)
se utiliz
el mtodo de dilucin para cuenta en placa realizando cinco
repeticiones
por cada una de estas (Burr et al., 1978; Suslow y Schroth,
1982; Chiarini et
al., 1998), haciendo dos evaluaciones a las 24 y 48 horas
posteriores a su
incubacin.
-
39
4.1.5. Preparacin del inculo de HMA
4.1.5.1. Propagacin de los HMA
El inculo micorrzico que se emple fue el complejo denominado
MTZ-1,
compuesto por las especies; G. intraradices, G. mosseae, G.
geosporum y
Gigaspora sp., proporcionado por el Laboratorio de Biotecnologa
de la
Facultad de Ciencias Agrcolas, Campus Xalapa de la
Universidad
Veracruzana, el cual tena un 80% de infectividad (determinado
por las
tecnicas que en el inciso 4.1.5.2. y 4.1.5.3. se describen) al
momento de la
inoculacin de las plantas y contaba con 12.5 esporas por gramo
de
sustrato seco.
4.1.5.2. Clareo y tincin de races
El clareo y tincin de races se realiz mediante la tcnica
propuesta por
Phillips y Hayman (1970), lavando las races que se tomaron como
muestra
de las plantas de papayo con abundante agua, se cortaron en
fragmentos de aproximadamente un centmetro y se colocaran en
frascos
segn los tratamientos agregndoles KOH al 10% hasta cubrir las
races, se
metieron en autoclave durante aproximadamente 15 minutos a 10
libras
de presin, inmediatamente despus se sacaron y se les retir el
KOH
enjuagndolas con agua destilada y agregndoles HCl al 0.1N
dejndolas
reposar cinco minutos, transcurrido ese tiempo se elimin el cido
y sin
enjuagar se cubrieron con azul tripano al 0.05% colocando los
frascos en
autoclave por cinco minutos a 121 C, pasado este lapso el
colorante se
elimin y las races se mantuvieron en cido lctico hasta su
observacin.
-
40
4.1.5.3. Porciento de colonizacin micorrzica
Para la evaluacin de las races micorrizadas se utiliz la tcnica
de
McGonigle et al. (1990), utilizando para esta metodologa un
microscopio
marca Nikon modelo PFX con un aumento de 200X equipado con
una
retcula ocular en forma de cruz, estimando el porciento de
colonizacin
cuando el eje de la retcula tocaba cualquier estructura como
hifa,
vescula o arbusculo en 100 observaciones. Los conteos realizados
se
expresaron en porcientos mediante la siguiente formula:
Nmero de intersecciones colonizadas % de colonizacin = 100 X
-------------------------------------------------------------
Nmero total de intersecciones observadas
Los datos obtenidos en los ensayos realizados fueron
analizados
empleando el programa MSTAT y cuando se presentaron
diferencias
significativas entre las plantas colonizadas de los tratamientos
se aplico la
prueba de Tukey (P< 0.05).
4.1.6. Aislamiento de hongos fitopatgenos causantes del
damping-off en
plantas de Carica papaya L
4.1.6.1. Induccin de la enfermedad
Se tomaron al azar muestras en campo de aproximadamente 500 g de
la
rizosfera de plantas de papayo, las cuales se mezclaron para
obtener una
muestra compuesta (Roberts y Henry, 2001), que se ocup como
sustrato
para la germinacin y emergencia de plntulas de papayo,
manteniendo
el sustrato a capacidad de campo para propiciar una alta
humedad
relativa para el desarrollo ptimo de hongos fitopatogenos
causantes del
damping-off.
-
41
4.1.6.2. Aislamiento e identificacin de fitopatgenos causantes
del
damping-off
Se aislaron los hongos de las plantas enfermas en placas con
medio de
papa-dextrosa-agar (PDA) suplementado con tetraciclina (15
mL/L),
incubndose durante 20 das a 30 C en completa oscuridad (Ocamb
y
Kommedahl, 1994; St-Arnaud et al., 1994; Raaijmakers et al.,
1995; St-Arnaud
et al., 1997).
Su identificacin fue de acuerdo a lo propuesto por Domsch et
al., (1980),
Nelson et al., (1983) y Nelson et al., (1994), los cuales toman
como base sus
caractersticas morfolgicas. Para el experimento donde fue
evaluado el
nmero de conidias se utiliz un hematocitmetro ajustando las
concentraciones a 3, 5 y 7 conidias por gramo de suelo seco
(Reddy et al.,
1994).
4.2. Trabajo en Invernadero
4.2.1. Ubicacin del rea experimental
El trabajo de invernadero se llev a cabo en el campo
experimental La
Bandera de Actopan, Veracruz, localizado a 360 m.s.n.m. a una
Latitud
Norte de 19 27' 30'' y Longitud Oeste de 96 64' 20'' (Vazquez et
al., 1992).
4.2.2. Material vegetal
Las semillas que se emplearon para todos los experimentos fueron
de
papayo var. maradol las cuales se adquirieron en la compaa
Western
Sedd, International B.V., Holanda, desinfectndose antes de ser
utilizarlas
con hipoclorito de sodio al 10% (Berger et al., 1996).
-
42
4.2.3. Sustrato utilizado
El sustrato que se utilizo para todos los experimentos fue una
mezcla de
suelo y arena (1:1) la cual previamente fue esterilizada con
Basamid (a una
dosis de 40 g/m2), el cual ha mostrado ser un fumigante del
suelo sin
residualidad y altamente eficiente (Lpez-Aranda et al., 2001;
Melgarejo et
al., 2001). El anlisis del suelo lo realiz el Laboratorio de
Alta Tecnologa de
Xalapa (LATEX), el cual report los siguientes resultados:
Cuadro 3. Anlisis de las propiedades fsico-qumicas del sustrato
que se
empleo en el desarrollo de los experimentos
Determinaciones Resultados Textura (Arena) 68 % Textura (Limo)
11 % Textura (Arcilla) 21 % Densidad Aparente 1.13 g/mL Color 5 YR
5/1 pH 7.8 Materia orgnica 2.2 % Nitrgeno orgnico 0.11 % Nitrgeno
de nitratos 53.20 mg/kg Fsforo 70.0 mg/kg Potasio 0.80 me/100 g
Sodio 55.9 me/100 g Calcio 33.1 me/100 g Magnesio 1.8 me/100 g
Azufre 17 ppm Hierro 6 ppm Zinc 1.9 ppm Manganeso 14.4 ppm
4.3. Fase experimental
4.3.1. Experimento 1. Dosis respuesta de plantas de papayo
inoculadas con la mejor cepa de Pseudomonas fluorecentes Una vez
seleccionada la bacteria que mejor controlo a los fitopatgenos
in
vitro se realiz un ensayo de dosis respuesta, inoculando con
diferentes
-
43
concentraciones a las plntulas de papayo, utilizando la cepa
aislada de
maz A9 de Pseudomonas fluorescens como referencia, las
concentraciones se detallan a continuacin:
Cuadro 4. Descripcin de los tratamientos para el experimento
dosis-
respuesta
Tratamiento Rizobacteria Dosis (celulasmL-1)
Clave
1 Aislamiento de Pseudomonas sp. 109 Pp9 2 Aislamiento de
Pseudomonas sp. 108 Pp8 3 Aislamiento de Pseudomonas sp. 106 Pp6 4
Aislamiento de Pseudomonas sp. 104 Pp4 5 Pseudomonas fluorescens,
A9 109 Pf9 6 Pseudomonas fluorescens, A9 108 Pf8 7 Pseudomonas
fluorescens, A9 106 Pf6 8 Pseudomonas fluorescens, A9 104 Pf4 9
Control Ninguna C
El diseo experimental empleado tuvo un arreglo completamente al
azar
(Reyes, 1990) con nueve tratamientos y siete repeticiones y como
unidad
experimental una planta, los datos obtenidos fueron
analizados
empleando el programa MSTAT y cuando se presentaron
diferencias
significativas entre las plantas de los tratamientos se aplic la
prueba de
Tukey (P< 0.05) para separar las medias y determinar la
existencia de
mnima significancia estadstica entre los tratamientos.
4.3.1.1. Variables evaluadas en el experimento dosis-respuesta
rizobacteria-papayo
I) Altura y nmero de hojas
La altura de las plantas fue cuantificada en centmetros a partir
de la base
hasta la punta del tallo, el nmero de hojas fue contabilizado
sin tomar en
cuenta las hojas cotiledonales, las mediciones para estas dos
variables
-
44
tuvieron una periodicidad de cada nueve das a partir de la
inoculacin
de los microorganismos.
II) Unidades formadoras de colonias (UFC)
Las unidades formadoras de colonias se cuantificaron por medio
del
mtodo sealado en el inciso 4.1.4., contabilizando las UFC con
una
periodicidad de cada nueve das a partir de la inoculacin de
las
rizobacteras hasta el final del experimento (54 das despus de
la
inoculacin), por cada dilucin se realizaron tres
repeticiones.
III) rea foliar y biomasa
La determinacin de estas dos variables fue al final del
experimento (54
das despus de la inoculacin), utilizando el programa UTHSCSA
Image
Tool para la evaluacin en cm2 del rea foliar, para la biomasa en
fresco
(peso follaje y raz) se emple una balanza digital Swiss Quality
(Modelo
125ASCS) utilizando como unidad de medida los gramos, para el
caso de
la biomasa en seco, el material vegetal fresco se meti en una
estufa a 70
C durante tres das, evaluando el peso hasta que este fue
constante (Toro
et al., 1997; Shishido y Chanway, 1998; Zhu et al., 2000).
4.3.2. Experimento 2. Susceptibilidad de plntulas de Carica
papaya L al ataque de hongos fitopatgenos causantes del
damping-off
Una vez aislado e identificado el hongo patgeno causante del
damping-
off (Fusarium oxysporum) en plntulas de papayo, se realiz un
ensayo
para determinar la concentracin de conidios (Reddy et al., 1994)
con la
que se manifiesta la sintomatologa de esta enfermedad (Cuadro
5).
-
45
Cuadro 5. Descripcin de los tratamientos para evaluar que
concentracin de conidias de Fusarium oxysporum enfermaban a
plntulas de papayo de damping-off
Tratamiento Patgeno Concentracin 1 Fusarium oxysporum 3
conidios/g de suelo seco 2 Fusarium oxysporum 5 conidios/g de suelo
seco 3 Fusarium oxysporum 7 conidios/g de suelo seco 4 Control
Ninguna
Una vez inoculadas las plantas con el patgeno estas se
mantuvieron en
una cmara hmeda con una temperatura controlada de 28 2 C,
manteniendo el sustrato con una humedad entre el 80% y 85% dando
las
condiciones mas favorables para el desarrollo de la
enfermedad
(Hannusch y Boland, 1996; Landa et al., 2001).
El diseo experimental tuvo un arreglo completamente al azar
(Reyes 1990)
con cuatro tratamientos y siete repeticiones y tres unidades
experimentales
por cada repeticin, los datos obtenidos fueron analizados
empleando el
programa MSTAT y cuando se presentaron diferencias
significativas entre
las plantas de los tratamientos se aplic la prueba de Tukey
(P< 0.05) para
separar las medias y determinar la existencia de mnima
significancia
estadstica entre los tratamientos.
4.3.2.1. Variables a evaluar durante el desarrollo del
experimento de la susceptibilidad de Carica papaya L al ataque de
hongos fitopatgenos I) Severidad y necrosis
Para la evaluacin de la severidad y necrosis se utilizaron las
escalas
propuestas por St-Arnaud et al., (1994), que indican lo
siguiente:
-
46
Cuadro 6. Escala propuesta por St-Arnaud et al. (1994) para
evaluar la severidad del damping-off en plantas de Carica papaya
L.
Escala Severidad 1 El tallo presenta de 0-1 manchas necrticas 2
El tallo presenta de 2-3 manchas necrticas 3 El tallo presenta de
4-5 manchas necrticas 4 El tallo presenta de 6-10 manchas necrticas
5 El tallo presenta 1/3 de la superficie daada
Cuadro 7. Escala propuesta por St-Arnaud et al. (1994) para
evaluar necrosis causado por damping-off en plantas de Carica
papaya L.
Escala Necrosis 1 Dao en la raz menor al 1% 2 Dao en la raz del
1 al 3% 3 Dao en la raz del 4 al 5% 4 Dao en la raz del 6 al 10% 5
Dao en la raz mayor del 10%
Para conocer el ndice se utiliz la metodologia propuesta por
Dugassa et
al. (1996), en lacual se toman como base las escalas antes
citada y se
utiliza la formula siguiente:
ndice de severidad (IS%) = ( (nxb / NxB) x 100
Donde:
n = Nmero de plantas de la misma clase
b = Clase
N = Nmero total de plantas medidas
B = Nmero total de clases
4.3.3. Experimento 3. Efecto de la inoculacin dual de
Pseudomonas fluorescentes y HMA en el control biolgico del
damping-off en plntulas de Carica papaya L
Una vez determinada la concentracin de respuesta tanto de la
rizobacteria como del hongo fitopatgeno, se inocularon plntulas
de
-
47
Carica papaya con la mejor concentracin de Pseudomonas sp. (104
cel.
mL-1), hongos micorrzicos arbusculares (10 g por planta) y
Fusarium
oxysporum (7 conidios/g de suelo seco), plantendose los
siguientes
tratamientos:
Cuadro 8. Descripcin de los tratamientos para el experimento
final Tratamiento Descripcin Clave
1 Pseudomonas sp. 104 celulasmL-1 P4 2 Pseudomonas sp. 109
celulasmL-1 P9 3 HMA H 4 Pseudomonas sp. 104 celulasmL-1 + F.
oxysporum
P4F
5 Pseudomonas sp. 109 celulasmL-1 + F. oxysporum P9F 6 HMA + F.
oxysporum HF 7 Pseudomonas sp. 104 celulasmL-1 + HMA P4H 8
Pseudomonas sp. 109 celulasmL-1 + HMA P9H 9 Pseudomonas sp. 104
celulasmL-1 + HMA + F.
oxysporum P4HF
10 Pseudomonas sp. 109 celulasmL-1 + HMA + F. oxysporum
P9HF
11 F. oxysporum F 12 Control C
Las plantas inoculadas con el patgeno se mantuvieron en una
cmara
hmeda con una temperatura controlada de 28 2 C, manteniendo
el
sustrato con una humedad entre el 80% y 85% dando las
condiciones mas
favorables para el desarrollo de la enfermedad (Hannusch y
Boland, 1996;
Landa et al., 2001). El diseo experimental tuvo un arreglo
completamente
al azar (Reyes, 1990) con doce tratamientos y cinco repeticiones
y tres
unidades experimentales por repeticin, los datos obtenidos
fueron
analizados empleando el programa MSTAT y cuando se
presentaron
diferencias significativas entre las plantas de los tratamientos
se aplico la
prueba de Tukey (P< 0.05) para separar las medias y
determinar la
existencia de mnima significancia estadstica entre los
tratamientos.
-
48
4.3.3.1. Variables a evaluar en el experimento sobre inoculacin
dual de Pseudomonas fluorescentes y HMA en el control biolgico del
damping-off en plntulas de Carica papaya L
I) Altura y nmero de hojas
La altura de las plantas fue cuantificada en centmetros a partir
de la base
hasta la punta del tallo, el nmero de hojas fue contabilizado
sin tomar en
cuenta las hojas cotiledonales, las mediciones para estas dos
variables
tuvieron una periodicidad de cada nueve das a partir de la
inoculacin
de los microorganismos.
II) Unidades formadoras de colonias (UFC)
Las unidades formadoras de colonias se cuantificaron por medio
del
mtodo sealado en el inciso 4.1.4., determinndose las UFC a los
32 das
despus de la inoculacin de las rizobacterias y al final del
experimento.
III) rea foliar y biomasa
La determinacin de estas dos variables fue al final del
experimento (63
das despus de la inoculacin), utilizando el programa UTHSCSA
Image
Tool para la evaluacin en cm2 del rea foliar, para la biomasa en
fresco
(peso follaje y raz) se empleo una balanza digital Swiss Quality
(Modelo
125ASCS) utilizando como unidad de medida los gramos, en el caso
de la
biomasa en seco se utilizo una estufa calibrada a 70 C, hasta
alcanzar un
peso constante (Toro et al., 1997; Zhu et al., 2000)..
-
49
IV) Severidad y necrosis
Para la evaluacin de la severidad y necrosis se utilizaron las
escalas
propuestas por St-Arnaud et al. (1994) (ver 4.3.2.1.1.),
cuantificando estas
variables hasta el final del experimento.
V) Porciento de colonizacin micorrzica
El nivel de colonizacin se determin a los 32 das despus de
la
inoculacin de los hongos micorrzicos y al final del experimento,
la tcnica
de clareo y tincin que se utiliz se describe en el inciso
4.1.5.3. y para
calcular el porcentaje de colonizacin se ocup la formula
descrita en el
inciso 4.1.5.4.
-
50
V. RESULTADOS
5.1. Seleccin de Pseudomonas
5.1.1. Aislamiento de Pseudomonas fluorescentes y su capacidad
de inhibir el crecimiento de fitopatgenos del suelo
Cincuenta y seis rizobacterias fueron aisladas de la rizosfera
de Carica
papaya L. a partir del medio AST suplementado con
8-Hidroxiquinolina, de
las cuales solo ocho produjeron pigmento fluorescente
amarillo-verdoso el
cual es muy caracterstico del genero Pseudomonas, sobre todo
cuando
se crecen en medios con poco fierro disponible como el que se
utiliz en
este experimento.
Solo las ocho rizobacterias fluorescentes se probaron en este
caso, debido
a que se buscaba aislar una especie nativa de Pseudomonas
con
capacidad antagnica contra hongos fitopatgenos causantes del
damping-off, logrando todos los organismos aislados inhibir en
todos los
medios de cultivo probados, el crecimiento de F. oxysporum y
Pythium sp.,
siendo la mas sobresaliente para estos dos casos la
rizobacteria
catalogada con el nmero tres.
Cuando se realiz el anlisis de varianza, ste report
diferencias
significativas (P
-
51
Cuadro 9. Halo de inhibicin en mm cuantificado en diferentes
medios con rizobacterias y F. oxysporum
Nmero de aislamiento
Halo de inhibicin (mm)
AST AST + Fierro
AST + Peptona
AST + Peptona + Fierro
V-8 V-8 + Fierro
PDA PDA + Fierro
1 4.1 cd 3.9 b 3.9 b 3.1 c 0 c* 0 b* 0 b* 0 b* 2 3.9 d 4.1 b 3.2
c 4.2 b 0 c 0 b 0 b 0 b 3 11.1 a 10.1 a 11.2 a 9.2 a 7 a 6 a 4 a 3
a 4 3.1 de 4.1 b 3.2 c 3.1 c 0 c 0 b 0 b 0 b 5 5.1 b 4.2 b 4.1 b
4.1 b 3 b 2 b 0 b 0 b 6 4.1 cd 3.2 bc 3.1 c 3.2 c 0 c 0 b 0 b 0 b 7
2.9 e 3.1 c 3.1 c 4.2 b 0 c 0 b 0 b 0 b 8 4.9 bc 4.2 b 4.2 b 4.1 b
3 b 2 b 0 b 0 b
Pr > F 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
0.0001 C.V. (%) 6.81 7.14 3.68 6.19 7.28 4.03 5.07 5.14 Valores con
la misma letra son estadsticamente iguales (P F 0.0001 0.0001
0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 C.V. (%) 12.13 7.31 7.00
9.10 4.96 4.87 5.83 4.34 Valores con la misma letra son
estadsticamente iguales (P
-
52
Con estos resultados se procedi a la seleccin de la
rizobacteria
fluorescente tomando como base el mayor halo de inhibicin hacia
en los
dos fitopatgenos en la mayora de los medios de cultivo probados,
para
posteriormente ser identificada y probada en plntulas de papayo
en
invernadero.
5.1.2. Rizobacterias con capacidad de producir cido
cianhdrico
Del total de rizobacterias aisladas cuarenta y uno de ellas no
produjeron
este compuesto, siendo las quince restantes las que sintetizaron
el cido
cianhdrico (HCN) en diferentes intensidades.
Siendo solo cinco rizobacterias las que produjeron este
compuesto de
manera fuerte, debido a la coloracin marrn que lograron cambiar
en la
tira de papel filtro que se introdujo en el medio de cultivo
donde estaban
creciendo, y diez organismos lograron producirlo de forma
moderada
(cambio de color anaranjado), destacando dentro de estas ltimas
a dos
cepas fluorescentes catalogadas como nmeros 5 y 8.
5.1.3. Siderforo producido por la rizobacteria seleccionada
Una vez caracterizadas las rizobacterias se seleccion la nmero
tres,
determinndole el tipo de siderforo que produca mediante
lecturas
espectrales. Cuantificando su pico mximo de absorcin en una
longitud
de onda entre 400-410 nm a una absorbancia de 0.224, para lo
cual segn
Teintze et al., (1981), est clasificado como del tipo
pseudobactina las
cuales poseen en sus molculas porciones de tipo catecol e
hidroxamato
(Figura 3).
-
53
0
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15
0.18
0.21
0.24
0 70 140 210 280 350 420 490 560 630 700
Longitud de onda (nm)
Ab
sorv
an
cia
Figura 3. Espectro de absorcin realizado para la identificacin
del siderforo producido por Pseudomonas sp. (rizobacteria nmero
tres), la cual es antagonista a F. oxysporum y Pythium sp.
Este tipo de sideroforo es muy caracterstico del genero
Pseudomonas, el
cual generalmente este implicado en el control biolgico de
hongos
patgenos del suelo causantes de enfermedades en las plantas.
5.1.4. identificacin de la especie de Pseudomonas
seleccionada
Una vez seleccionada la rizobacteria nmero tres, se determin que
el
gnero al que pertenece este microorganismo es Pseudomonas debido
a
que produjo pigmentacin amarillo-verdoso en el medio Agar
Cetrimida, el
cual es especfico para la deteccin de este gnero. Se prob que
esta
rizobacteria no estuviera contaminada por otros hetertrofos
(Enterobacterias), para esto se estro en medio Agar Bilis Rojo
Violeta,
Pico mximo: 400-410 nm
-
54
presentando reaccin como lactosa negativa, lo que demuestra no
estar
contaminada debido a que no produjo pigmentos de color rojo o
naranja.
Una vez identificado el gnero de Pseudomonas se procedi a
determinar
la especie a la cual perteneca, resultando ser putida, debido a
que no
creci en los medios de cultivo P-3 y P-4, los cuales se utilizan
para la
diferenciacin de especies entre P. fluorecens y P. putida mismos
que
utilizan como fuente de carbono a la trehalosa y mio-inositol
(Manual de
Bergeys, 1994). Posteriormente, la P. putida se sembr en el
medio NZCYM
y se puso a crecer a una temperatura de 4 C para la
identificacin del
biovar, el cual result ser del tipo B, debido a que creci bajo
estas
condiciones donde el tipo A no crece.
Concluidas todas las pruebas bioqumicas se determin que la
rizobacteria
seleccionada y catalogada como la numero tres, se identific
como
Pseudomonas putida Biovar B.
5.2. Identificacin de los hongos causantes del damping-off en
plntulas de Carica papaya
El hongo aislado de las races de plntulas de papayo resulto ser
Fusarium
oxysporum, el cual present colonias blanquecinas-prpuras con
micelio
areo abundante,mismo que llegaba a cubrir toda la cpsula de
Petri en
un perodo de 6 a 7 das. Este micelio se observ hialino y
septado,
observndose la presencia de; a) Microconidias: abundantes, de
forma
ovalada, sin septas, con dimensiones de 5.75 14.6 m X 2.5 5.20
m. b)
Macroconidias: de forma ovalada, con dimensiones de 20.8 31 m X
2.6
5.0 m; con 1 a 5 septas. c) Clamidiosporas: de forma redonda,
paredes
oscuras y gruesas, con un dimetro de 5.20 12 m, abundantes en
la
-
55
medida que el medio de cultivo tiende a deshidratarse lo que
indica su
funcionalidad como estructura de resistencia (Domsch et al.,
1980).
5.3. Respuesta de plntulas de papayo var. Maradol a la
inoculacin con diferentes concentraciones de Pseudomonas putida
5.3.1. Altura y nmero de hojas
El anlisis de varianza estableci diferencias significativas
(Tukey, P
-
56
Figura 4. Cuantificacin de altura y nmero de hojas de plntulas
de papayo inoculadas con diferentes concentraciones de Pseudomonas
putida y P. fluorescens
0
2
4
6
8
10
12
14
0 9 18 27 36 45 54Das despues de la inoculacin
Nm
ero
de h
ojas
Pp9 Pp8 Pp6Pp4 Pf9 Pf8Pf6 Pf4 C
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 9 18 27 36 45 54Dias despues de la inoculacin
Altu
ra (
cm
)
Pp9 Pp8 Pp6 Pp4 Pf9
Pf8 Pf6 Pf4 C
Das despues de la inoculacin
-
57
5.3.2. rea foliar y biomasa fresca y seca
Al final del experimento (54 das despus de la inoculacin) las
plntulas de
papayo inoculadas con las Pseudomonas putida y fluorescens
mostraron
un efecto superior a las plantas control (tratamiento C) para la
variable
rea foliar (Figura 5), existiendo diferencias significativas
(Tukey, P
-
58
Siendo las inoculadas con la dosis de 104 celmL-1 (tratamiento
Pp4) las que
mejor biomasa produjeron, con incrementos de follaje y raz
fresco en un
198% y 162%, y biomasa seca de follaje y raz en un 283% y 162%,
en
relacin a las plantas del tratamiento C (sin inocular).
Cuadro 11. Produccin de biomasa fresca y seca de plntulas de
papayo inoculadas con rizobacterias
Tratamiento Peso fresco follaje (g)
Peso fresco raz (g)
Peso seco follaje (g)
Peso seco raz (g)
Pp9 1.18 b 0.78 abcd 0.15 cd 0.16 bc Pp8 1.15 b 0.81abc 0.17 bc
0.18 ab Pp6 1.20 b 0.85 ab 0.17 bc 0.18 ab Pp4 1.52 a 0.92 a 0.23 a
0.21 a Pf9 1.34 ab 0.86 a 0.19 b 0.16 bc Pf8 0.79 c 0.65 bcd 0.11
de 0.11 cd Pf6 0.87 c 0.61 cd 0.11 de 0.10 cd Pf4 0.69 cd 0.57 d
0.09 ef 0.09 d C 0.51 d 0.35 e 0.06 f 0.08 d Pr > F 0.0001
0.0001 0.0001 0.0001 C.V. (%) 10.06 14.84 10.11 11.24
Valores con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey,
P
-
59
Figura 6. Dinmica poblacional de P.putida y P. fluorecens en la
rizosfera de plntulas de Carica papaya L evaluado durante 54
das.
5.4. Efecto de diferentes concentraciones de Fusarium oxysporum
en la susceptibilidad de plntulas de papayo var. Maradol en vivero
5.4.1. ndice de Severidad y necrosis El anlisis estadstico para
estas dos variables mostr diferencias
significativas (Tukey, P
-
60
Figura 7. Dinmica de severidad y necrosis evaluadas en plantas
de Carica papaya inoculadas con diferentes concentraciones de
conidios de Fusari
