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UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS
ESCUELA DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
Trabajo Final de Graduación bajo la modalidad de Proyecto de Investigación
presentado a la Escuela de Tecnología de Alimentos para optar por el grado de
Licenciatura en Ingeniería de Alimentos
Extracción de aceite de semilla de mora (Rubus adenotrichos), utilizando
isopropanol como disolvente y evaluación de sus propiedades
fisicoquímicas, de calidad y estabilidad oxidativa
Elaborado por:
Vernny Julián Conejo Salazar
Carné: A91862
Ciudad Universitaria Rodrigo Facio
San José, Costa Rica
2016
iv
DEDICATORIA
A mi familia y amigos, por su apoyo incondicional.
v
AGRADECIMIENTOS
Al Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA) y a la Escuela de
Tecnología de Alimentos de la Universidad de Costa Rica.
Al proyecto “Valorización de los subproductos del procesamiento industrial de la guayaba
y la mora para la elaboración de ingredientes alimenticios funcionales” (B3-102),
financiado por la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica.
A Eduardo Thompson (quien confió en mí el desarrollo de este trabajo), por su guía, su
gran espíritu de compromiso, su apoyo y motivación. Por todas las enseñanzas brindadas,
su pasión por la investigación, paciencia y amistad.
A Hermes Alvarado, por su compromiso y aportes de ayuda para mejorar el trabajo, su
apoyo, sus valiosos consejos y amistad.
A Marvin Soto, por su valioso asesoramiento a lo largo de la investigación. Su compromiso
y ejemplo de excelencia.
A la empresa productos Ujarrás proveedora de la materia prima, especialmente a Orlando
Armijo por su compromiso.
Al personal de la planta piloto y los laboratorios del CITA: Fernando Camacho, Alonso
Contreras, Vanny Mora, Eduardo Calderón, Graciela Artavia y Carolina Cortés. Por su
amistad, y los innumerables aportes brindados para la realización del proyecto.
A Giovanni González, por su disposición y consejos de gran ayuda. A todo el personal de la
Escuela de Tecnología de Alimentos, por colaborar de alguna forma para llevar a cabo este
trabajo.
A Giselle Lutz, por la confianza y enseñanzas brindadas, su amistad y su aporte a mi
crecimiento tanto personal como profesional.
vi
A Beatriz, Alejandra, Silvia, Eugenia y Carlos, por su apoyo incondicional, por ayudarme a
crecer como persona y profesional, por las aventuras vividas, sus innumerables consejos,
acompañamiento y motivación a lo largo de esta etapa. No me alcanzan las palabras para
expresar cuánto los quiero.
A mis compañeros y compañeras de carrera, por las experiencias compartidas y por el
aporte que de alguna u otra forma me permitió culminar con éxito este proyecto.
A mis padres y hermana, pilares fundamentales en mi vida, por su amor y apoyo
incondicional.
vii
INDICE GENERAL
TRIBUNAL EXAMINADOR ............................................................................................. iii
DEDICATORIA .................................................................................................................. iv
AGRADECIMIENTOS ....................................................................................................... v
INDICE GENERAL ........................................................................................................... vii
ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................................ x
ÍNDICE DE CUADROS ..................................................................................................... xi
ABREVIATURAS .............................................................................................................. xii
RESUMEN ............................................................................................................................ x
1 JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS .................................................................................................................. 7
2.1 Objetivo general ....................................................................................................... 7
2.2 Objetivos específicos ............................................................................................... 7
3 MARCO TEÓRICO ..................................................................................................... 8
3.1 Generalidades de la mora ......................................................................................... 8
3.1.1 Aceite de semilla de mora ................................................................................ 8
3.2 Química de los lípidos ............................................................................................. 8
3.2.1 Ácidos grasos y triacilgliceroles ..................................................................... 10
3.3 Mecanismos de oxidación de lípidos ..................................................................... 13
3.3.1 Autooxidación lipídica ................................................................................... 14
3.3.2 Fotooxidación ................................................................................................. 16
3.3.3 Oxidación enzimática ..................................................................................... 17
3.3.4 Método de Schaal ........................................................................................... 18
3.4 Propiedades fisicoquímicas de los aceites ............................................................. 18
3.4.1 Índice de acidez .............................................................................................. 19
3.4.2 Índice de peróxidos ......................................................................................... 19
3.4.3 Coeficientes de extinción K232 y K270 ............................................................. 20
3.4.4 Índice de yodo ................................................................................................ 21
3.4.5 Índice de saponificación ................................................................................. 22
3.4.6 Color ............................................................................................................... 22
viii
3.4.7 Índice de refracción ........................................................................................ 23
3.4.8 Humedad y materia volátil ............................................................................. 24
3.4.9 Perfil de ácidos grasos .................................................................................... 24
3.4.10 Densidad ......................................................................................................... 25
3.4.11 Polifenoles totales ........................................................................................... 25
3.4.12 Tocoferoles ..................................................................................................... 25
3.4.13 Clorofilas ........................................................................................................ 26
3.5 Extracción de aceites ............................................................................................. 27
3.5.1 Extracción mecánica (prensado) ..................................................................... 28
3.5.2 Extracción con disolventes ............................................................................. 28
3.5.3 Disolventes alternativos .................................................................................. 31
3.5.4 Isopropanol como disolvente .......................................................................... 32
3.6 Emulsiones ............................................................................................................. 32
3.6.1 Métodos de separación de emulsiones............................................................ 33
4 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 35
4.1 Ubicación del proyecto .......................................................................................... 35
4.2 Materia prima ......................................................................................................... 35
4.2.1 Análisis químico del subproducto .................................................................. 35
4.3 Extracción del aceite .............................................................................................. 35
4.3.1 Secado del subproducto .................................................................................. 36
4.3.2 Molienda del subproducto seco ...................................................................... 37
4.3.3 Establecimiento del tiempo de extracción ...................................................... 37
4.3.4 Extracción con isopropanol ............................................................................ 37
4.3.5 Separación del extracto ................................................................................... 38
4.3.6 Evaporación del extracto ................................................................................ 39
4.3.7 Cuantificación del aceite extraído .................................................................. 39
4.3.8 Diseño experimental, condiciones de extracción y análisis estadístico.......... 39
4.3.9 Recuperación del aceite .................................................................................. 41
4.4 Análisis fisicoquímico y de calidad del aceite extraído ......................................... 43
4.4.1 Color ............................................................................................................... 44
4.4.2 Humedad y materia volátil ............................................................................. 44
4.4.3 Índice de yodo ................................................................................................ 44
ix
4.4.4 Índice de saponificación ................................................................................. 44
4.4.5 Densidad ......................................................................................................... 44
4.4.6 Índice de refracción ........................................................................................ 45
4.4.7 Índice de acidez .............................................................................................. 45
4.4.8 Índice de peróxidos ......................................................................................... 45
4.4.9 Composición de los ácidos grasos del aceite de semilla de mora .................. 45
4.4.10 Polifenoles totales ........................................................................................... 45
4.4.11 Tocoferoles ..................................................................................................... 45
4.4.12 Clorofilas ........................................................................................................ 46
4.4.13 Análisis de resultados ..................................................................................... 46
4.5 Evaluación de la estabilidad oxidativa del aceite .................................................. 46
4.5.1 Estabilidad oxidativa del aceite a 20 °C ......................................................... 46
4.5.2 Estabilidad oxidativa del aceite a 60 °C ......................................................... 46
4.5.3 Índice de peróxidos ......................................................................................... 47
4.5.4 Coeficientes de extinción (K232 y K270) .......................................................... 47
4.5.5 Análisis de resultados ..................................................................................... 47
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................. 48
5.1 Optimización de las condiciones de extracción del aceite de mora utilizando
isopropanol como disolvente ............................................................................................ 48
5.1.1 Caracterización del subproducto industrial de mora ...................................... 48
5.1.2 Secado del subproducto industrial de mora .................................................... 48
5.1.3 Molienda del subproducto industrial de mora ................................................ 49
5.1.4 Determinación de las condiciones óptimas para la extracción del aceite ....... 49
5.1.5 Optimización del proceso de extracción del aceite de mora .......................... 51
5.1.6 Proceso de separación del aceite extraído ...................................................... 56
5.2 Características fisicoquímicas y de calidad del aceite de mora ............................. 60
5.2.1 Análisis fisicoquímico del aceite de semilla de mora..................................... 60
5.2.2 Análisis de calidad del aceite de semilla de mora .......................................... 66
5.3 Evaluación de la estabilidad oxidativa del aceite .................................................. 69
6 CONCLUSIONES ....................................................................................................... 78
7 RECOMENDACIONES ............................................................................................. 80
8 REFERENCIAS .......................................................................................................... 81
9 ANEXOS ...................................................................................................................... 91
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura química del ácido linoleico (a.) y el ácido α-linolénico (b.). ..... ¡Error!
Marcador no definido.
Figura 2. Interpretación de los ejes de la escala CIE Lab. Fuente Sharma (2003). ............. 23
Figura 3. Estructura molecular del α-tocoferol. .................................................................. 26
Figura 4. Diagrama de los principales pasos durante una extracción con disolventes en
matrices alimentarias. Fuente: Aguilera (2003). .................................................................. 29
Figura 5. Sistema de extracción contra corriente de un aceite. Fuente: Mathaüs (2012). ... 31
Figura 6. Diagrama de flujo del proceso de extracción del aceite de semilla de mora
utilizando IPA como disolvente. .......................................................................................... 36
Figura 7. Diagrama del equipo utilizado para realizar las extracciones de aceite de semilla
de mora utilizando IPA como disolvente. ............................................................................ 38
Figura 8. Diagrama de flujo del proceso de separación del aceite del subproducto de mora
extraído con IPA como disolvente........................................................................................ 42
Figura 9. Rendimiento de extracción del aceite de mora en base seca con IPA, Rds = 4,00 g
IPA/g sustrato, T = 50 ºC, velocidad de agitación de 300 rpm para determinar el tiempo de
saturación del disolvente (n=1). ........................................................................................... 50
Figura 10. Gráfica de los residuos contra los valores predichos del modelo generado para
el rendimiento de extracción de aceite. ................................................................................ 54
Figura 11. Superficie de respuesta del efecto de la Rds y la temperatura sobre el Re del
aceite de semilla de mora con IPA. ...................................................................................... 55
Figura 12. Separación de las proteínas (precipitado blanco) con diferentes tratamientos,
testigo (derecha), pH 5 (izquierda). ...................................................................................... 59
Figura 13. Comportamiento de la oxidación del aceite de semilla de mora (R.
adenotrichos) expresado como índice de peróxidos y su desviación estándar durante
almacenamiento a 60 ºC (n=3). ............................................ ¡Error! Marcador no definido.
Figura 14. Comportamiento de la oxidación del aceite de mora (R. adenotrichos)
expresado como dienos (K232) y trienos (K270) conjugados durante almacenamiento y sus
respectivas desviaciones estándar a 60 ºC (n=3). ................. ¡Error! Marcador no definido.
Figura 15. Comportamiento de la oxidación del aceite de semilla de mora (R.
adenotrichos) expresado como índice de peróxidos y su desviación estándar durante
almacenamiento a 20 ºC (n=3). ............................................................................................ 72
Figura 16. Comportamiento de la oxidación del aceite de mora (R. adenotrichos)
expresado como dienos (K232) y trienos (K270) conjugados y sus desviaciones estándar
durante almacenamiento a 20 ºC (n=3). ............................................................................... 73
Figura 17. Estructuras de los tocoferoles presentes en el aceite de semilla de mora (R.
adenotrichos). Fuente: Papas (2006). ................................... ¡Error! Marcador no definido.
xi
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro I. Clasificación de los lípidos. ................................................................................ 10
Cuadro II. Ácidos grasos más comunes. ............................................................................. 11
Cuadro III. Valores máximos de los coeficientes de extinción definidos para diferentes
tipos de aceite de oliva.......................................................................................................... 21
Cuadro IV. Variables independientes y niveles para el diseño central compuesto rotable
empleado para optimizar las condiciones de extracción del aceite de mora. ....................... 39
Cuadro V. Diseño central compuesto rotable (DCCR) empleado para optimizar las
condiciones de extracción del aceite de semilla de mora. .................................................... 40
Cuadro VI. Influencia de la relación disolvente/sustrato y de la temperatura de extracción,
en el parámetro evaluado en la superficie de respuesta. ....................................................... 51
Cuadro VII. Estadísticos de ajuste y adecuación para el modelo generado para el optimizar
el rendimiento de extracción de aceite. ................................................................................ 52
Cuadro VIII. Comparación de los rendimientos de extracción de aceite en los puntos
óptimos obtenidos para la validación del modelo. ............................................................... 56
Cuadro IX. Rendimientos de extracción de aceite con diferentes tratamientos de
separación de proteínas para evaluar la separación del aceite (n=1). ................................... 58
Cuadro X. Parámetros fisicoquímicos que caracterizan a diferentes aceites comerciales. . 60
Cuadro XI. Características fisicoquímicas del aceite de mora extraído con isopropanol
(2n=3 y 1n=1). ....................................................................................................................... 61
Cuadro XII. Composición de ácidos grasos que componen los triacilgliceroles del aceite
de semilla de mora de diferentes especies determinados por espectrofotometría de gases. . 65
Cuadro XIII. Características de calidad del aceite de semilla de mora extraído con
isopropanol (n=3). ................................................................................................................ 67
Cuadro XIV. Variación del contenido tocoferoles en el aceite de mora (R. adenotrichos)
debido al tiempo de almacenamiento a 20 ºC. ...................................................................... 74
Cuadro XV. Actividad biológica de los tocoferoles. .......................................................... 76
xii
ABREVIATURAS
% m/m: porcentaje masa/masa.
1O2: oxígeno singulete.
3O2: oxígeno triplete.
AG: ácido gálico.
BH: base húmeda.
BS: base seca.
CIE: Commission Internationale d’
Eclairage.
CITA: Centro Nacional de Ciencia y
Tecnología de Alimentos.
DCCR: Diseño Central Compuesto
Rotable.
Eq: equivalente.
g: gravedad.
GC: cromatografía de gases.
HPLC: cromatografía líquida de alta
presión.
IPA: isopropanol.
K232: dienos conjugados.
K270: trienos conjugados.
M: molar.
mEq: miliequivalente.
msnm: metros sobre el nivel del mar.
MSR: Metodología de Superficie de
Respuesta.
p: probabilidad.
Pfa: probabilidad de la falta de ajuste.
PI: punto isoeléctrico.
PL: fosfolípido.
R2: coeficiente de determinación.
R2-adj: coeficiente de determinación
ajustado.
Re: rendimiento de extracción.
rpm: revoluciones por minuto.
Rds: relación disolvente/sustrato.
RTCA: Reglamento Técnico
Centroamericano.
TAG: triacilglicerol.
T: temperatura.
t: tiempo.
α: alfa.
β: beta.
ω: omega.
RESUMEN
Conejo Salazar, Vernny Julián.
Extracción de aceite de semilla de mora (Rubus adenotrichos), utilizando isopropanol
como disolvente y evaluación de sus propiedades fisicoquímicas y de calidad, y
estabilidad oxidativa.
Tesis Licenciatura en Ingeniería de Alimentos – San José, Costa Rica.
Vernny Julián C. S., 2016.
112 h. 17 il. 98 refs.
Se optimizaron las condiciones de extracción con el solvente isopropanol del aceite del
subproducto de mora por medio de la metodología de superficie de respuesta, utilizando
una velocidad de agitación de 300 rpm. El tiempo de proceso se fijó en 75 minutos
mediante una cinética de extracción. A partir del diseño anterior se seleccionaron las
siguientes condiciones: 39,5 ºC de temperatura y relación disolvente/sustrato 5,8 g IPA/g
sustrato. Se desarrolló el método de separación del aceite extraído con IPA, posterior a la
concentración del extracto a un 30 % de su masa inicial, añadiendo agua (12 % de la masa
del extracto concentrado) y ajustando el pH del extracto con una solución de NaOH a 5
para provocar la separación del aceite de la emulsión formada.
Se analizaron las características fisicoquímicas y de calidad del aceite de mora extraído. El
aceite extraído presentó 78,65 % de ácidos grasos polinsaturados, el 91 % de estos ácidos
grasos son esenciales (68 % linoleico y 23 % linolénico). Dichos valores están
estrechamente relacionados con el índice de yodo (159,5 cg I2/g TAG) y de saponificación
(189,0 mg KOH/g TAG). Además, el aceite fresco presentó valores aceptables para el
índice de acidez (2,00 mg KOH/g TAG) y oxidación (0,3 mEq peróxidos/kg TAG). Cabe
mencionar que el aceite presenta altos contenidos de agentes antioxidantes como:
tocoferoles (46,86 mg/g) y polifenoles (2,28 mg AG/100 g).
Por último, se evaluó la estabilidad oxidativa del aceite de mora utilizando el método de
Schaal. Se concluye que no se pueden utilizar los resultados obtenidos en el
almacenamiento a 60 ºC para predecir la estabilidad oxidativa del aceite a temperatura
ambiente, debido a que los componentes del aceite aceleran los procesos de oxidación a
i
altas temperaturas. Por otro lado, el aceite almacenado a temperatura ambiente resiste con
éxito la oxidación más de cien días debido a la acción de compuestos antioxidantes como
los tocoferoles, ya que se pudo apreciar una disminución de un 62,2 % en la concentración
(15,82 mg/g) de estos al final del período almacenado.
MORA, ACEITE, SUBPRODUCTO, RESIDUOS, DESECHOS, VALORIZACIÓN,
EXTRACCIÓN, ISOPROPANOL, ÁCIDOS GRASOS, TOCOFEROLES,
ANTIOXIDANTES, ESTABILIDAD OXIDATIVA.
Ing. Eduardo Thompson Vicente
Escuela de Tecnología de Alimentos
1
1 JUSTIFICACIÓN
En la última década, los consumidores han tomado conciencia de que los aceites vegetales
forman parte de una dieta saludable, debido al efecto positivo de los ácidos grasos
esenciales en la salud, y los beneficios de los componentes minoritarios como los
tocoferoles, esteroles, escualenos y carotenoides. Además, la demanda del mercado de
alimentos funcionales y nutracéuticos se ha ampliado en gran medida, lo que ha contribuido
a su consumo (Verhé y Van Hoed, 2010).
Según Verhé y Van Hoed (2010), en los últimos años ha surgido interés en los aceites
conocidos como especiales; dichos aceites se obtienen de algunas semillas y se caracterizan
por su aroma y sabor específicos, asociados con su origen y a un mínimo procesamiento. Su
valor nutricional es muy alto debido a la presencia de ácidos grasos esenciales (linoleico y
linolénico) en las proporciones adecuadas y a su contenido de tocoferoles, tocotrienoles,
esteroles y antioxidantes. Algunos de estos aceites especiales son producidos a partir de los
desechos del procesamiento de las uvas y algunas bayas, lo que conduce a una reducción en
los volúmenes de residuos. De esta manera, aceites obtenidos de semillas de uva y semillas
de bayas como arándano, frambuesa y mora se encuentran disponibles en el mercado.
Los aceites extraídos de semillas de plantas del género Rubus tienen una porción
importante de ácidos grasos esenciales y de compuestos antioxidantes, que son de gran
importancia desde el punto de vista nutricional (Van Hoed et al., 2009). Estos ácidos grasos
son esenciales, pues no pueden ser sintetizados por el organismo a partir de otros
compuestos por una vía metabólica y, por lo tanto, deben ser consumidos en la dieta.
En el caso específico del aceite de semillas de mora (variedad no indicada), se reporta un
contenido de ácidos grasos insaturados de un 78,74 %, compuesto en su mayoría por los
ácidos grasos esenciales linoleico de (61,22 %) y linolénico (17,60 %). Además, en dicho
aceite se encuentran compuestos antioxidantes como los tocoferoles y los tocotrienoles, que
contribuyen a la estabilidad oxidativa de los ácidos grasos principalmente los esenciales
(Van Hoed et al., 2009).
2
Por otro lado, Rodocaj et al. (2014) mencionan que el aceite obtenido de la mora especie
Rubus fruticosus L. es una excelente fuente de ácido linolénico (35 %) y ácido linoleico (55
a 58 %). Además, cuenta con la presencia de compuestos fenólicos, los cuales brindan
significativas propiedades antioxidantes y estabilidad oxidativa.
En Costa Rica, la variedad de mora que se emplea industrialmente para la elaboración de
jugos y conservas es la Rubus adenotrichos (Soto, 2010). De su procesamiento se genera
aproximadamente, un 24 % m/m de subproductos, donde la gran parte de este residuo
corresponde a las semillas (Soto, 2014).
Este subproducto de mora, que actualmente es desechado, tiene gran potencial en la
producción de aceite, ya que las semillas contienen alrededor de un 15,3 % de compuestos
lipídicos, y se ha encontrado que el aceite extraído posee un 91,25 %, de ácidos grasos
insaturados, formados casi en su totalidad por los ácidos grasos esenciales linoleico (66,0
%) y linolénico (18,4 %) (Soto, 2014).
Se debe recalcar que a pesar de conocerse la composición del aceite de las semillas de R.
adenotrichos, sus características fisicoquímicas no se encuentran descritas en publicaciones
científicas, como sí lo están para los aceites obtenidos de otras variedades de mora, por lo
que resulta interesante su estudio y caracterización con el fin de conocer y documentar el
valor de un subproducto de la agroindustria que puede tener un importante valor
nutricional.
Según Wakely y Wan (2005), diferentes sistemas de procesamiento son utilizados para la
extracción de aceite, entre ellos: prensado hidráulico, prensado con tornillo, prensado y
luego extracción con disolvente y extracción directa con disolvente. La selección del
método de procesamiento está usualmente dictada por el contenido de aceite de las materias
primas. Materiales con altos contenidos de aceite (≥ 34 %) como la canola, las semillas de
girasol, el germen de maíz y el maní usualmente utilizan el proceso de prensado previo y
luego una extracción con disolvente. Por otro lado, en el caso de semillas como la soya que
contienen menos de un 30 % de aceite, su extracción se lleva a cabo directamente con
disolventes.
3
La extracción del aceite por medio de disolventes es recomendada cuando se busca extraer
la mayor cantidad de aceite en la materia cruda dejando en ella un valor por debajo del 2 %,
es decir, el objetivo de la extracción con disolvente es remover la mayor cantidad del aceite
presente en la semilla (Matthäus, 2012).
En la industria tradicionalmente se ha utilizado hexano para la extracción de aceites; sin
embargo, la Enmienda de Aire Limpio de los Estados Unidos en 1990 incluyó al hexano
entre los 189 contaminantes ambientales y limitó su uso, ya que ocasiona problemas en el
sistema nervioso central y es altamente inflamable (Gallegos-Infante et al., 2003).
El uso del hexano en plantas de extracción de aceite de semillas oleaginosas puede afectar
negativamente el sistema nervioso central de los trabajadores y su uso en industrias de
pequeña capacidad hace que el proceso sea costoso debido a las altas pérdidas por
evaporación (Seth et al., 2007). Debido a esto, es de interés encontrar un disolvente
alternativo que reemplace al hexano con la misma eficacia y sin incrementar los costos de
extracción (Gallegos-Infante et al., 2003).
Johnson y Lusas (1983), mencionan que los triacilgliceroles presentan alta solubilidad en
alcoholes de cadena larga a elevadas temperaturas, y una baja solubilidad a temperatura
ambiente, características deseables porque la separación del aceite se podría llevar a cabo
por medio de separación de fases sin necesidad de evaporar.
Según Seth et al. (2010), el alcohol isopropílico (IPA, isopropanol, 2-propanol) es una
alternativa efectiva a la extracción de aceites con hexano, y en diferentes estudios se ha
utilizado para la obtención de aceite de matrices vegetales. Un ejemplo de ello es la
extracción del aceite de las semillas de algodón, donde se comparó el proceso con hexano y
el efectuado con diferentes mezclas acuosas de IPA obteniéndose rendimientos de
extracción muy similares. Además, se observó que al emplear mezclas de IPA-agua se
mejora la eficiencia de la extracción cuando se reduce su contenido de agua, debido a que
el aceite es más soluble en el disolvente puro (Zhang et al. 2002).
La extracción con IPA produce un aceite de alta calidad que requiere menos refinamiento y
usa menos energía; además, es un disolvente más seguro y presenta menor toxicidad que el
4
hexano (Seth et al., 2010), lo cual es debido a que el IPA presenta un punto de ebullición
mayor, por encima de los límites explosivos y la temperatura de autoignición del hexano.
La recuperación del IPA por destilación necesita mayor energía que en el caso del hexano;
sin embargo, la separación en frío es posible, ya que se ha encontrado que los aceites son
insolubles en mezclas de IPA-agua a temperatura ambiente, y se pueden separar por
métodos físicos como centrifugación. Este proceso ha sido utilizado en la extracción del
aceite de semilla de mostaza, donde la utilización del azeótropo IPA-agua 87 g/100 g como
disolvente permitió la separación del aceite en un extracto acuoso obtenido de
pretatamientos aplicados a las semillas (Ataya, 2010).
La extracción de aceites con mezclas acuosas de IPA se ha utilizado en múltiples
investigaciones, como por ejemplo la extracción de aceite de algodón (Grimsbi, 1984),
aceite de linaza (Kadivar, 2001), aceite de soya (Seth et al., 2007), aceite de mostaza
(Sinichi y Diosady, 2014) y aceite de colza (canola) (Li et al., 2014), por mencionar las más
relevantes.
Además, está bien establecido que el IPA y sus mezclas azeotrópicas producen un aceite
con mínimas concentraciones de factores antinutricionales y un menor contenido de aceite
residual en la torta después de la extracción (Baker y Sullivan, 1983; Gandhi et al., 2003;
Seth et al., 2010)
Entre los factores más importantes a considerar durante el proceso de extracción de aceite
mediante el uso de disolventes están: la relación del disolvente/sustrato (Rds), la
temperatura (T) y el tiempo (t) en el que se lleva a cabo el proceso. Establecer la cantidad
mínima de disolvente necesaria por unidad de masa de semillas para lograr una extracción
eficiente del aceite es importante pues se asocia directamente a los costos de producción y
al efecto ambiental de su manejo y disposición.
Según Matthaüs (2012), la temperatura es importante en la extracción ya que disminuye la
viscosidad del aceite y aumenta la solubilidad de este en el disolvente. Sin embargo,
también se sabe que la composición del extracto es afectada por la temperatura de
extracción. A pesar de que la mayor parte de los aceites está formada por triacilgliceroles,
5
algunos componentes minoritarios como fosfolípidos, clorofila, ácidos grasos libres,
pigmentos y productos de la degradación de las reacciones oxidativas son extraídos con el
disolvente, y sus cantidades se incrementan drásticamente con la temperatura.
La extracción del aceite no solo depende de la Rds y de la temperatura de extracción, sino
que también es afectada por el equilibrio entre la difusión del disolvente dentro de las
partículas del sustrato para disolver el aceite, y la difusión del aceite en disolución fuera de
las partículas, para lo cual es necesario cierto tiempo (Matthaüs, 2012); por ello, es de vital
importancia encontrar el balance entre el tiempo de extracción y el rendimiento de aceite
obtenido.
En la caracterización de un aceite es importante conocer su composición y su valor
nutricional, además de propiedades de calidad como su color, índice de acidez e índice de
peróxidos. Una de las variables de calidad más importantes de un aceite es su estabilidad
oxidativa, ya que se encuentra directamente correlacionada con la aparición y la interacción
de compuestos prooxidantes y antioxidantes (Matthäus, 2012).
Según Martínez et al. (2013), factores como la humedad, la temperatura, la luz y la
presencia del oxígeno durante el almacenamiento promueven el proceso de oxidación de los
aceites, generando olores y sabores desagradables que afectan su vida útil. Por otro lado, el
contenido de compuestos antioxidantes presentes en un aceite puede preservar su calidad en
el tiempo debido a la disminución de la oxidación lipídica. La estabilidad ante la oxidación
de un aceite, conocida como estabilidad oxidativa, es un parámetro de calidad de relevancia
del producto terminado, ya que permite determinar el deterioro que ocurre durante el
tiempo de almacenamiento y por lo tanto su vida útil.
El presente estudio se enmarca dentro de una temática de actualidad como es el
aprovechamiento de residuos de la agroindustria para obtener productos de valor agregado.
Tal es el caso del aceite que se encuentra en las semillas de mora, subproducto del
procesamiento de jugos y mermeladas, que por sus propiedades puede valorarse como un
ingrediente alimenticio. Es por ello que en el presente trabajo se evaluaron las condiciones
óptimas de extracción del aceite del subproducto industrial de mora empleando IPA, un
6
disolvente alternativo más amigable con el ambiente; además, se determinó su
composición, perfil de ácidos grasos, propiedades fisicoquímicas y su estabilidad oxidativa
con el fin de establecer sus características nutricionales y de calidad.
7
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Optimizar el proceso de extracción del aceite de semillas de mora, empleando isopropanol
como disolvente, para el posterior análisis de sus características fisicoquímicas y de
calidad, y estabilidad oxidativa.
2.2 Objetivos específicos
- Optimizar las condiciones del proceso de extracción del aceite del subproducto de
mora utilizando isopropanol como disolvente.
- Caracterizar las propiedades fisicoquímicas y de calidad del aceite de mora extraído.
- Evaluar la estabilidad oxidativa del aceite de mora obtenido durante el
almacenamiento.
8
3 MARCO TEÓRICO
3.1 Generalidades de la mora
Según Castro y Cerdas (2005), la variedad de mora de mayor cultivo en Costa Rica
corresponde a la mora vino (Rubus adenotrichos), y su cultivo se extiende en las partes
altas del país, entre los 1400-2500 msnm, específicamente en el cerro de la Muerte y sus
alrededores, la zona de los Santos y el cantón del Guarco.
El procesamiento de la mora en el país es realizado por empresas locales de elaboración de
productos congelados o tratados térmicamente, tales como jaleas, mermeladas, jugos y
pulpas. Esta industria genera alrededor de un 20 % de subproductos, donde la mayor parte
de este residuo corresponde a semillas que es desechado, generando un impacto negativo en
el ambiente (Castro y Cerdas 2005; Soto, 2014)
3.1.1 Aceite de semilla de mora
Según Soto (2014), las semillas de mora tienen gran potencial para la producción de aceite,
ya que contienen alrededor de un 15,3 % de compuestos lipídicos, y se ha encontrado que el
aceite extraído posee un 78,74 % de ácidos grasos insaturados, formados casi en su
totalidad por los ácidos grasos esenciales linoleico (66,00 %) y linolénico (18,40 %);
además, contiene ácido oleico (6,51 %), esteárico (3,88 %) y palmítico (3,87 %). Según
Okuyama (2000), es importante recalcar que la mayoría de los aceites vegetales tienen una
relación linoleico:linolénico en exceso de 6:1, mientras que proporciones de 2:1 son
consideradas actualmente como beneficiosas. En el aceite del subproducto de mora esta
relación en la fracción lipídica es de 3,6:1, lo cual puede considerarse como una relación
adecuada comparada con la de otros productos presentes en el mercado.
3.2 Química de los lípidos
Se denominan lípidos aquellos compuestos que son solamente solubles en compuestos
orgánicos e insolubles en agua y pueden, por tanto, separarse fácilmente de proteínas y
carbohidratos. A este grupo pertenecen tanto compuestos sencillos como complejos,
formados por diversos componentes que, aparte de su notable hidrofobicidad, y su
solubilidad en disolventes orgánicos poco polares carecen de una unidad estructural, ya que
9
dentro de esta clasificación se encuentran: ácidos grasos, ceras, fosfolípidos, esteroles, entre
otros compuestos (Belitz et al., 2009).
A pesar de su uso común, la definición basada en la solubilidad de los lípidos presenta
problemas obvios. Existen compuestos que podrían ser considerados lípidos, como los
ácidos grasos de cadenas muy cortas (1 o 2 carbonos) que son completamente miscibles en
agua e insolubles en disolventes no polares. Por ello, algunos investigadores han aceptado
la definición de lípidos según su solubilidad, excluyendo estrictamente los ácidos grasos
con cadenas de carbonos menores a tres, manteniendo al ácido butírico (4 carbonos)
solamente por su presencia en las grasas de productos lácteos (O’Keefe, 2008).
Existe un grupo de lípidos que cumple la función de tensoactivos, pues contienen en su
molécula grupos hidrófilos. Estos compuestos se diferencian de los lípidos neutros por ser
sustancias polares (anfifílicas). En el Cuadro I que se muestra a continuación, aparece la
clasificación doble de los lípidos según Belitz et al. (2009).
Los alimentos pueden contener cualquiera o todos estos compuestos lipídicos; sin embargo,
los triacilgliceroles (TAGs) y los fosfolípidos (PLs) son los más abundantes e importantes.
Los TAGs líquidos a temperatura ambiente son referidos como aceites y se encuentran
generalmente en plantas o productos marinos; mientras que los TAGs que son sólidos a
temperatura ambiente son denominados grasas, las cuales generalmente son de origen
animal (Shahidi y Wanasundara, 2008), aunque también se encuentran en semillas de
plantas tropicales como la palma aceitera, el coco y el cacao.
La importancia de los lípidos y su presencia en los alimentos se divide en tres aspectos: los
relativos a su calidad, a sus propiedades nutricionales y aquellos relacionados con su
actividad biológica. Por ser los más abundantes, las grasas y los aceites participan
directamente en la textura y lubricación de los alimentos. Otros lípidos presentes son
pigmentos, hormonas o vitaminas, en tanto que algunos forman parte de las membranas
celulares y del sistema de transporte de nutrimentos. También, forman los tejidos adiposos
que actúan como aislantes térmicos naturales en el ser humano y los animales, debido a que
son malos conductores del calor y mantienen estable la temperatura del organismo (Badui,
2013).
10
Cuadro I. Clasificación de los lípidos.
A. Clasificación según la característica “resto acilo”
I. Lípidos simples (insaponificables)
Ácidos grasos libres, lípidos isoprenoides (esteroides, carotenoides, monoterpenos y otros),
tocoferoles.
II. Acil-lípidos
(saponificables). Componentes
Mono, di y
triacilgliceroles. Ácidos grasos, glicerol.
Fosfolípidos
(fosfátidos). Ácidos grasos, glicerol o esfingosina, ácido fosfórico, base.
Glicolípidos. Ácidos grasos, glicerol o esfingosina, mono, di u oligosacáridos.
Diolípidos. Ácidos grasos, etano, propano o butanodiol.
Ceras. Ácidos grasos, alcoholes grasos.
Ésteres de esteroles. Ácidos grasos, esteroles.
B. Clasificación según característica “neutro-polar”
Lípidos neutros Lípidos polares (anfifílicos)
Ácidos grasos (> C12).
Glicerofosfolípidos
Gliceroglicolípidos
Esfingofosfolípidos
Esfingoglicolípidos.
Mono, di,
triacilgliceroles.
Esteroles, ésteres de
esteroles.
Carotenoides
Ceras
Tocoferoles
Fuente: Belitz et al. (2009).
Los lípidos tienen ciertas propiedades indispensables en la preparación y obtención de los
alimentos. Se destacan su comportamiento de fusión, su sabor agradable, y la capacidad
disolvente de ciertas sustancias sápidas y numerosos compuestos aromáticos. Estas
propiedades son de gran importancia para producir en los alimentos una determinada
consistencia, sensación bucal, aroma específico y una clara estabilidad del mismo. Además,
los alimentos se pueden preparar en medio oleoso a temperaturas elevadas (Belitz et al.,
2009), como en la operación unitaria conocida como fritura.
3.2.1 Ácidos grasos y triacilgliceroles
Los ácidos grasos son compuestos monocarboxílicos, usualmente formados por una cadena
alifática no ramificada. Esta definición es muy amplia e incluye todas las longitudes de
11
cadena. Sin embargo, los ácidos grasos naturales tienen longitudes entre 4-22 carbonos,
donde los más comunes son los de 18 carbonos. La estructura de los ácidos grasos naturales
es reflejo de su biosíntesis: las cadenas son construidas en unidades de dos carbonos y los
enlaces dobles cis son insertados en posiciones específicas relativas al carbono carboxílico.
Se conocen más de mil ácidos grasos, sin embargo, solo alrededor de 20 ácidos grasos se
encuentran extensamente en la naturaleza; de esos, el palmítico, oleico y linoleico
conforman aproximadamente el 80 % de los aceites y grasas más comunes (Scrimgeour y
Harwood, 2007).
Como se aprecia en el Cuadro II, los ácidos grasos se clasifican según su estructura en
saturados e insaturados. Los ácidos grasos saturados generalmente presentan un esqueleto
carbonado lineal y número par de átomos de carbono. Su temperatura o punto de fusión
aumenta con el peso molecular o largo de la cadena. Así, los ácidos grasos de 4-8 carbonos
son líquidos a 25 ºC, mientras que los que presentan de diez carbonos en adelante son
sólidos. Además, su solubilidad en agua es inversamente proporcional al peso molecular
(Badui, 2013).
Cuadro II. Ácidos grasos más comunes.
Nomenclatura Nombre Común
Ácidos Saturados
12:0 Ácido Laúrico
14:0 Ácido Mirístico
16:0 Ácido Palmítico
18:0 Ácido Esteárico
Ácidos Monoinsaturados
16:1 n-9 cis Ácido Palmitoleico
18:1 n-9 cis Ácido Oleico
18:1 n-9 trans Ácido Elaídico
Ácidos Poliinsaturados
18:2 n-9,12 all cis Ácido Linoleico
18:3 n-9,12,15 all cis Ácido α-Linolénico
18:3 n-6,9,12 all cis Ácido -Linolénico
20:4 n-5,8,11,14 all cis Ácido Araquidónico
20:5 n-5,8,11,14,17 all cis Ácido Eicosapentaenoico
22:5 n-7,10,13,16,19 all cis Ácido Docosapentaenoico
22:6 n-4,7,10,113,16,19 all cis Ácido Docosahexaenoico
Fuente: Lichtenstein (2013).
12
Según Badui (2013), a diferencia de los ácidos grasos saturados, los ácidos grasos
insaturados se encuentran conformados por cadenas mayores a los 16 carbonos. Su
temperatura de fusión disminuye al aumentar el número de enlaces dobles y siempre es
menor a la que presentan los ácidos grasos saturados de igual longitud de cadena. Existen
ácidos grasos monoinsaturados y polinsaturados denominados monoenoicos y polienoicos,
respectivamente.
La posición aislada del doble enlace, es decir, la separada por un puente metileno que
siempre tiene la configuración cis, ha conducido a su denominación como ácidos grasos
isolénicos. A diferencia de los ácidos grasos saturados, estos son líquidos a temperatura
ambiente. Las relaciones estructurales entre los ácidos grasos insaturados no conjugados,
obtenidos por biosíntesis, se ponen en manifiesto claramente cuando se indica la posición
del doble enlace a partir del grupo metilo terminal (grupo ω), y se clasifican en el mismo
grupo los ácidos que tienen igual la terminación respecto al metilo. Se obtienen así tres
familias (ω3, ω6 y ω9), cuyos componentes más frecuentes son ácidos grasos de 18
carbonos (Belitz et al., 2009).
El ácido linoleico, está presente en la mayoría de los aceites de origen vegetal, y es
abundante (> 50 %) en los obtenidos del maíz, girasol y soya, y excede el 70 % en el aceite
de cártamo. Por otro lado, el ácido α-linoleico se encuentra en la mayoría de aceites de
semillas, entre 8 a 10 % en los aceites de soya y de canola, y en más del 50 % en el aceite
de linaza (Scrimgeour y Harwood, 2007).
Figura 1. Estructura química del ácido linoleico (a.) y el ácido α-linolénico (b.)
O
OH
O
OH
a. b.
13
Los ácidos linoleico y α-linolénico mostrados en la Figura 1, no pueden ser sintetizados por
el cuerpo humano, y se denominan ácidos grasos esenciales, ya que son necesarios para la
formación de membranas biológicamente activas. Además, a partir del ácido α-linolénico se
sintetizan en el cuerpo los ácidos eicosapentenoico y docosahexaenoico, los cuales
desempeñan importantes funciones biológicas (Belitz et al., 2009).
Los triacilgliceroles son el principal componente de los aceites y grasas comestibles, y
están compuestos por tres ácidos grasos esterificados en una molécula de glicerol. Las
propiedades físicas de los triacilgliceroles son determinadas por el tipo de ácidos grasos
presentes y la posición que estos ocupan en la molécula de glicerol. De los tres carbonos
que componen esta molécula, solo el central permite una estereoquímica distinta del enlace
con el ácido graso. Los triacilgliceroles con tres ácidos grasos idénticos, son denominados
como simples y son excesivamente raros en la naturaleza. Por el contrario, los
triacilgliceroles con dos o tres ácidos grasos distintos se denominan triacilgliceroles mixtos
(Lichtenstein, 2013).
El punto de fusión de los triacilgliceroles está determinado por las características físicas y
la posición de los ácidos grasos esterificados al glicerol: su longitud de cadena, número,
posición y conformación de los dobles enlaces; y la posición estereoquímica (Lichtenstein,
2013). Generalmente, los aceites a diferencia de las grasas son líquidos a temperatura
ambiente debido a la composición de sus ácidos grasos (Arvanitoyannis et al., 2009).
3.3 Mecanismos de oxidación de lípidos
Factores externos e internos, tales como: la luz, el calor, presencia de iones metálicos o
metaloproteínas, afectan la estabilidad de los aceites, lo que resulta en un incremento en la
formación de radicales que subsecuentemente afecta sus características sensoriales. La
rancidez puede ser causada por el oxígeno presente en la atmósfera o por reacciones de
hidrólisis. La rancidez oxidativa es uno de los factores que afectan la calidad de los aceites
vegetales y las grasas, aunque puede ser minimizada por bajas temperaturas, poca
exposición a la luz o con la eliminación del oxígeno por medio de atmósferas modificadas.
De hecho, no siempre es sencillo inhibir la rancidez oxidativa, pues puede ocurrir inclusive
14
a bajas temperaturas (Wagner y Elmadfa, 2011). En algunos casos, en los aceites
alimenticios comerciales se emplean aditivos antioxidantes como las terbutilhidroquinonas
(TBHQ), que inhiben la rancidez oxidativa y aumentan la estabilidad y vida útil de los
aceites.
El estudio de la oxidación de los lípidos ha sido limitado, por el hecho de que se presentan
mezclas complejas que contienen componentes minoritarios que pueden catalizar o inhibir
la oxidación; aparte del hecho de que los productos primarios de la oxidación son reactivos
y se convierten fácilmente en productos secundarios. Los productos primarios de la
oxidación lipídica son hidroperóxidos alílicos, donde el enlace doble original de estos
compuestos se isomeriza de la posición cis a la trans. Estos hidroperóxidos son inestables y
se descomponen en distintos productos secundarios. Entre ellos se incluye el rearreglo de
productos con peso molecular similar, rupturas que generan compuestos de cadena corta
como aldehídos y ácidos, y la dimerización que resulta en compuestos con alto peso
molecular (Knothe et al., 2007).
Muchos métodos han sido desarrollados para evaluar el deterioro por oxidación, los cuales
están relacionados con la medición de la concentración de los compuestos primarios y
secundarios de la oxidación o ambos. Los más utilizados son el índice de peróxidos, el
índice de p-anisidina, la determinación espectrofotométrica en la zona ultravioleta (UV) y
la cromatografía de gases (Arvanitoyannis et al., 2009).
3.3.1 Autooxidación lipídica
La autooxidación es una reacción radicalaria, con estados típicos de iniciación, propagación
y terminación. En el paso inicial:
𝑅𝐻 + 𝐼 • → 𝑅 • + 𝐼𝐻
Donde I • corresponde al agente iniciador. La oxidación directa de los lípidos está impedida
por los espines opuestos de 3O2 en el estado fundamental del lípido. Este obstáculo puede
ser sobrepasado por la presencia de iniciadores como trazas de metales, peróxidos o
hidroperóxidos presentes como impurezas. La formación del radical alquilo y la
15
deslocalización resultante del electrón impar es la causa de la migración del doble enlace
observados en los productos hidroperóxidos primarios (Knothe et al., 2007).
En el paso de propagación, dado un suplemento adecuado de oxígeno, la reacción entre los
radicales alquilo y el oxígeno molecular ocurre rápidamente y son formados los radicales
peroxilo.
𝑅 • + 𝑂2 → 𝑅𝑂𝑂 •
𝑅𝑂𝑂 • + 𝑅𝐻 → 𝑅𝑂𝑂𝐻 + 𝑅 •
Estos radicales peroxilo (ROO•), reaccionan con otras moléculas produciendo los
hidroperóxidos (ROOH) y nuevos radicales libres que contribuyen a la reacción en cadena
con otra molécula de oxígeno (Arvanitoyannis et al., 2009).
La reversibilidad es una característica de las reacciones de adición de oxígeno, lideradas
por la β-fragmentación del enlace adyacente al enlace entre carbono y oxígeno de los
radicales peroxilos. Varias reacciones de terminación son posibles, ya que los
hidroperóxidos pueden sufrir homólisis, provocada por radicales peroxilo o alquilo, los
cuales también pueden reaccionar. De esta forma, es posible el seguimiento de la reacción:
𝑅𝑂 • + 𝑅𝐻 → 𝑅𝑂𝐻 + 𝑅 •
𝑅𝐶𝐻(𝑂 •)𝑅´ → 𝑅´𝐶𝐻𝑂 + 𝑅 •
Mientras la formación de alcoholes remueve especies reactivas, los aldehídos insaturados
pueden ser inestables. La reacción de radicales alquilo, alcoxi y peroxilo provocan la
formación de productos denominados dímeros:
𝑅𝑂𝑂 • + 𝑅𝑂𝑂 • → 𝑅𝑂𝑂𝑅 + 𝑂2
𝑅𝑂 • + 𝑅 • → 𝑅 − 𝑂 − 𝑅
𝑅𝑂𝑂 • + 𝑅 • → 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠
𝑅 • + 𝑅 • → 𝑅 − 𝑅 (𝑑í𝑚𝑒𝑟𝑜𝑠)
16
La rapidez de la reacción en cadena disminuye tras alcanzar un máximo. Los radicales en
juego reaccionan entre sí eliminándose y dando lugar a la formación de productos no
radicales de estabilidad muy variada, entre los que se encuentran compuestos monoméricos
con funciones ceto, hidro, epoxi, entre otros, además de compuestos poliméricos. La
compleja distribución final de los productos depende de muchas variables que determinan
la rapidez relativa de las reacciones entre radicales y la posterior oxidación de los
compuestos formados de baja estabilidad (Dobarganes et al., 2006).
La reacción de autooxidación usualmente requiere un tiempo de inducción, durante el cual
la reacción es lenta. Una etapa más rápida de oxidación sobreviene luego. El propósito de
los compuestos antioxidantes es prolongar el tiempo de la reacción de iniciación (Knothe et
al., 2007).
3.3.2 Fotooxidación
La fotooxidación implica la reacción directa del oxígeno activado, 1O2 con ácidos
insaturados y la subsecuente formación de hidroperóxidos. En el estado triplete (dos
electrones desapareados en el campo magnético), el oxígeno no es muy reactivo con los
compuestos insaturados. La fotooxidación implica la reacción entre un doble enlace y un
oxígeno singulete altamente reactivo, producido a partir de un oxígeno triplete ordinario
por la luz en presencia de un sensibilizador, como la clorofila, eritrosina o azul de metileno
(Arvanitoyannis et al., 2009).
La reacción de fotooxidación se diferencia de la autooxidación, y debido a la alta
electrofilicidad del 1O2; esta reacción es más rápida y sin período de inducción. Sin
embargo, los hidroperóxidos formados por fotooxidación pueden servir como iniciadores
para la reacción de autooxidación. Otra diferencia es que la fotooxidación no es una
reacción en cadena, porque la reacción entre el doble enlace y el 1O2 ocurre por inserción
del oxígeno (Knothe et al., 2007).
Es importante recalcar que la fotooxidación no es afectada por los antioxidantes
adicionados para prevenir la autooxidación, pero sí es inhibida por los extintores de 1O2
17
presentes de manera natural en el aceite, tales como el β-caroteno y el α-tocoferol
(Dobarganes et al., 2006).
3.3.3 Oxidación enzimática
En los alimentos y microorganismos existen lipasas ampliamente distribuidas que actúan en
los triacilgliceroles. Los ácidos grasos insaturados que se liberan en la lipólisis, cuando se
encuentran emulsionados en agua, modifican el sabor de algunos alimentos, pues en
pequeñas concentraciones producen una sensación amarga picante. Además, estos ácidos
pueden autooxidarse u oxidarse enzimáticamente generando sustancias altamente olorosas
o sápidas. Las lipasas hidrolizan solamente los triacilgliceroles que se encuentran
emulsificados, ya que son activas en la interfase agua/lípido. Estas se presentan, entre otros
alimentos, en la leche, semillas oleaginosas, cereales, frutas, hortalizas y en el tracto
intestinal. Es importante mencionar que cuando se trituran semillas oleaginosas es difícil
evitar que ocurra una ligera hidrólisis enzimática (Belitz et al., 2009).
En numerosas plantas y también en algunos tejidos animales existe una enzima, la
lipooxigenasa, que cataliza la oxidación de ciertos ácidos grasos insaturados a
hidroperóxidos, compuestos que también son productos de la autooxidación. Generalmente
las lipooxigenasas son globulinas, que contienen un átomo de hierro en el sitio activo, y
como se mencionó convierte los ácidos grasos insaturados como el ácido linoleico a
hidroperóxidos. Estos sufren fragmentación para dar compuestos de cadena corta, que
presentan olores marcados (Arvanitoyannis et al., 2009).
La reacción de la lipooxigenasa se diferencia de la reacción de autoxidación por las
características de la catálisis enzimática, tales como la especificidad de sustrato,
selectividad de la peroxidación, presencia de un pH óptimo, sensibilidad ante el calor y una
la mayor rapidez de reacción en el intervalo de temperatura entre 0-20 ºC (Belitz et al.,
2009).
18
3.3.4 Método de Schaal
El método de la AOCS Cg 5-97, también conocido como la prueba de estabilidad en estufa
de Schaal, es una prueba utilizada para simular el tiempo real de envejecimiento de los
aceites; y como mencionan Douny et al. (2016), la prueba de estabilidad en estufa de
Schaal, es un método utilizado para simular el tiempo real de envejecimiento de los aceites
comestibles. Este método consiste en el calentamiento de una muestra de aceite a 50-60 °C
en una estufa. El punto final de la oxidación puede ser detectado por análisis sensorial o
químico (índice de peróxidos, índice de ácido tiobarbitúrico). Debido a que esta prueba
utiliza temperaturas relativamente bajas, el aceite se expone a un estrés oxidatico medio.
Los resultados obtenidos en la prueba de Schaal se correlacionan bien con las predicciones
actuales de vida útil para los aceites (Verleyen et al., 2005).
En la literatura, múltiples autores han mostrado que los parámetros de oxidación medidos
durante el envejecimiento del aceite a 60 ºC y a una temperatura cercana a la temperatura
ambiente se encuentran ligados linealmente.
Debido al incremento en la temperatura, la tasa de oxidación también aumenta, y por ello
un día de almacenamiento a estas condiciones (aproximadamente 60 ºC) es equivalente a un
mes a temperatura ambiente (Aparicio y Harwood, 2013). Es importante mencionar que se
ha encontrado una buena correlación de los resultados obtenidos por este método con los
estudios de estabilidad en tiempo real.
3.4 Propiedades fisicoquímicas de los aceites
La caracterización fisicoquímica de los lípidos provee información acerca del valor
calórico, así como de otras propiedades, incluyendo identidad, calidad nutricional y
seguridad de los lípidos con respecto al contenido de colesterol y ácidos grasos saturados.
El análisis de los lípidos es requerido usualmente para determinar la composición y
estructura del lípido extraído de los alimentos. Estos pueden ser analizados para determinar
el tipo de lípidos presentes, sean saturados e insaturados (Shahidi y Wanasundara, 2008).
19
Es importante mencionar que la cuantificación de las características de calidad como el
índice de yodo, índice de saponificación, índice de refracción, contenido de ácidos grasos
libres, estabilidad oxidativa, entre otras, son requeridas para determinar el valor en el
mercado y una potencial aplicación de los aceites y las grasas.
3.4.1 Índice de acidez
El índice de ácidos grasos libres o índice de acidez refleja la cantidad de ácidos grasos
hidrolizados a partir de los triacilgliceroles. Se define como los miligramos de hidróxido de
potasio necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres presentes en un gramo de la
grasa o el aceite (Nielsen, 2010).
Según Yildirim (2009), los ácidos grasos libres se presentan normalmente en los aceites
durante el proceso de formación de los triacilgliceroles. También, ocurre un aumento
progresivo en la acidez debido a la acción de las enzimas lipasas, presentes naturalmente en
los alimentos, las cuales ayudan a la separación de los ácidos grasos de la molécula del
triacilglicerol. Es importante mencionar que este proceso se puede llevar a cabo debido a
lipasas generadas por microorganismos presentes por un mal manejo del producto.
El índice de acidez es una medida de la calidad del aceite, y refleja los cuidados en la
producción y el almacenamiento del aceite. De acuerdo con la Comisión de la Unión
Europea en 1991, para un aceite de oliva extra virgen el valor máximo de acidez es 1,6
g/100 g (Yildirim, 2009).
3.4.2 Índice de peróxidos
El índice de peróxidos se define como los miliequivalentes de peróxido por kilogramo de
grasa o aceite. Se determina adicionando un exceso de yoduro de potasio, el cual reacciona
con los peróxidos presentes en la muestra de aceite. El yodo liberado se cuantifica por
medio de una valoración con tiosulfato de sodio, empleando almidón como indicador. La
cantidad calculada de yoduro de potasio requerido para reaccionar con el peróxido presente
en la muestra, es utilizada para calcular el índice de peróxidos (Nielsen, 2009).
20
El índice de peróxidos sirve como indicador de la calidad del aceite. A pesar de que no
distingue entre los diferentes ácidos insaturados que se sometieron a oxidación y que no
brinda información de los productos secundarios de la oxidación formados por la
descomposición de los hidroperóxidos, generalmente el índice de peróxidos se emplea
como un indicador del nivel de oxidación primario del aceite (Lalas, 2008).
El cambio en los valores de este índice a lo largo del tiempo exhibe una etapa de inducción,
donde al inicio ocurre un empinado incremento de los peróxidos, que luego decrece
conforme la oxidación lipídica procede. Los hidroperóxidos se descomponen tan rápido
como se forman, por tanto, un aceite de baja calidad va a presentar períodos cortos de
inducción (Lalas, 2008).
3.4.3 Coeficientes de extinción K232 y K270
Según Yildirim (2009), la determinación de los coeficientes de extinción en la región
ultravioleta es necesaria para determinar el estado de oxidación de los aceites. La absorción
a las longitudes de onda específicas de 232 nm y 270 nm está relacionada con la formación
de dienos y trienos conjugados en el aceite, debido a la oxidación o al proceso de
refinamiento. Compuestos de oxidación como los dienos conjugados contribuyen al
aumento en el coeficiente K232, mientras que productos secundarios de la oxidación lipídica
(aldehídos, cetonas y otros) aumentan el K270.
La magnitud del cambio en dichos coeficientes no se puede relacionar fácilmente con el
grado de oxidación; sin embargo, los cambios en el espectro ultravioleta que se producen
en la muestra de aceite a través del tiempo pueden ser usados como mediciones relativas de
oxidación. A pesar de que se han encontrado buenas correlaciones entre la concentración de
dienos conjugados y el índice de peróxidos, el método tiene menos especificidad y
sensibilidad que este último, ya que los carotenoides absorben en la misma región del
espectro y pueden afectar los resultados (Lalas, 2008).
A continuación (Cuadro III), se muestran los valores máximos de los coeficientes K para
diferentes tipos de aceite de oliva establecidos por la Comisión de la Unión Europea.
21
Cuadro III. Valores máximos de los coeficientes de extinción definidos para diferentes
tipos de aceite de oliva.
Tipo de Aceite de Oliva Coeficientes de Extinción (mL/g·cm)
K232 K270
Extra virgen ≤ 2,50 ≤ 0,20
Virgen ≤ 2,60 ≤ 0,25
Refinado ≤ 3,40 ≤ 1,20
Pulpa de oliva refinada ≤ 5,50 ≤ 2,50
Pulpa de oliva ≤ 5,30 ≤ 2,00
Fuente: Yildirim (2009).
3.4.4 Índice de yodo
El índice de yodo es un parámetro que indica el grado de insaturaciones, definido como los
centigramos de yodo absorbido por un gramo de lípido. En el ensayo, la muestra se coloca
con una cantidad conocida de yodo u otro agente halogenante adicionado en exceso, el cual
reacciona con los dobles enlaces. Posteriormente, una disolución de yoduro de potasio se
agrega para reducir el exceso del agente halogenante a yodo libre. Este yodo liberado es
valorado con una disolución estandarizada de tiosulfato de sodio utilizando almidón como
indicador. La cantidad de yodo que reaccione con los dobles enlaces es usada para calcular
el índice de yodo, y con este el grado de insaturaciones (Nielsen, 2009).
La determinación del índice de yodo brinda una medida razonable de los lípidos
insaturados, si los dobles enlaces no se encuentran conjugados con otros, o con el oxígeno
del carbonilo. Además, la determinación se debe llevar a cabo en ausencia de la luz durante
cierto período, una vez que se agrega el agente halogenante (Shahidi y Wanasundara,
2008). A partir de la reacción descrita anteriormente se han desarrollado relaciones
matemáticas a partir de las cantidades de ácidos grasos insaturados presentes en el aceite
para obtener una aproximación muy acertada del índice de yodo, como la descrita por Ku y
Mu (2008).
22
3.4.5 Índice de saponificación
El proceso de saponificación consiste en el tratamiento de los lípidos neutros con álcali, que
produce su hidrólisis y separación del glicerol de los ácidos grasos. El índice de
saponificación está definido como la cantidad de álcali necesaria para saponificar una
cantidad específica de grasa o aceite, expresado como miligramos de hidróxido de potasio
requerido para saponificar un gramo de muestra, y proporciona una aproximación de la
masa molecular de la muestra (Shahidi y Wanasundara, 2008).
Este parámetro se determina mediante la adición de un exceso de hidróxido de potasio
alcohólico a la muestra y posteriormente la mezcla se calienta hasta que se saponifique el
lípido. El hidróxido de potasio que no reacciona se valora con una disolución estándar de
ácido clorhídrico, utilizando fenolftaleína como indicador, y la cantidad calculada de
hidróxido de potasio que reaccionó es utilizada para determinar el índice de saponificación
(Nielsen, 2009).
3.4.6 Color
El color es una propiedad sensorial que tiene una fuerte influencia en la aceptación de los
alimentos, ya que contribuye de manera decisiva en la percepción inicial que se puede
adquirir de la condición de madurez, grado de procesamiento y otras características de los
alimentos (Yildirim, 2009).
Según Lalas (2008) y Yildirim (2009), el color característico de un aceite puede variar de
acuerdo al tipo de procesamiento y grado de oxidación, ya que dichos fenómenos generan
compuestos complejos (mencionados anteriormente) que van a provocar un ligero
oscurecimiento. Es importante mencionar que, en el caso de los aceites vírgenes, su color
más oscuro se debe a la presencia de pigmentos provenientes de la matriz de donde fueron
extraídos, tales como clorofilas y carotenoides.
La apariencia de un aceite puede ser indicador de un problema de calidad que esté
ocurriendo durante el procesamiento. El método CIE Lab es un modelo alternativo utilizado
23
para la evaluación del color establecido por la Commission Internationale d’Eclairage
(CIE) en 1976 (Yildirim, 2009).
Según Sharma (2003), la escala CIELab es un estándar internacional para las mediciones de
color, y corresponde a un modelo cromático que utiliza los parámetros L*, a* y b* para la
descripción paramétrica del color. Tal como se aprecia en la Figura 2, en dicha escala el eje
L* (luminosidad) va de arriba hacia abajo y su máximo valor es 100, que significa reflexión
perfecta, mientras que el mínimo es 0, e indica negro. Los parámetros a* y b* no presentan
límites numéricos: un valor de a* negativo es verde y un a* positivo es rojo, mientras que
un valor b* positivo es amarillo y un b* negativo es azul.
Figura 2. Interpretación de los ejes de la escala CIE Lab. Fuente Sharma (2003).
3.4.7 Índice de refracción
El índice de refracción de un lípido, es definido como la relación entre la velocidad de la
luz en el vacío y la velocidad de la luz en el lípido a una temperatura específica. Esta
relación permite medir la pureza de los lípidos y puede ser usada para identificarlos. El
índice de refracción es determinado por medio de un refractómetro, usualmente a una
temperatura de 20-25 ºC para aceites y a 40 ºC para las grasas, las cuales generalmente a
esa temperatura se encuentran en estado líquido. El índice de refracción es directamente
24
proporcional al índice de yodo, por tanto, también se utiliza para reportar el grado de
hidrogenación de un aceite (Shahidi y Wanasundara, 2008).
3.4.8 Humedad y materia volátil
El contenido de humedad y materia volátil en un aceite se determina por termogravimetría,
donde una masa conocida de la muestra se calienta a una presión reducida hasta alcanzar
masa constante.
La humedad puede contaminar una grasa o aceite de diferentes formas, como condensación,
o adición intencional durante el procesamiento. La presencia de humedad en un aceite
puede inducir la hidrólisis y provocar un aumento en el contenido de ácidos grasos libres,
además de generar sabores desagradables. Durante la medición de la humedad en los
aceites o grasas, la pérdida de masa corresponde también a una parte de compuestos
volátiles que se pierden por acción del calor (O’Brien, 2009).
3.4.9 Perfil de ácidos grasos
El perfil de ácidos grasos de un aceite o grasa permite conocer cuales ácidos grasos
específicos componen la materia lipídica de la muestra, así como los porcentajes en que se
encuentran presentes. Según Dijkstra et al. (2007) la técnica más utilizada para determinar
los ácidos grasos que componen un aceite es la cromatografía de gases (GC) con detector
de ionización de llama. Es un método robusto y con alta precisión donde los ácidos grasos
pueden ser identificados con certeza, a través de sus tiempos relativos de retención en la
columna cromatográfica. Antes de realizar el análisis, los ácidos grasos son derivatizados a
compuestos no polares, comúnmente a su respectivo éster metílico, utilizando una
disolución de trifluoruro de boro o ácido sulfúrico en metanol. El orden de elusión de estos
ésteres metílicos se relaciona directamente con las interacciones entre la cadena alifática del
respectivo ácido graso y la columna.
25
3.4.10 Densidad
La densidad se define como la masa por unidad de volumen. La industria aceitera alrededor
del mundo utiliza diferentes unidades de medición. A pesar de que la densidad no parece
una propiedad importante para los tecnólogos, es importante en el comercio ya que el aceite
es vendido con base en su peso, pero medido en volumen. La densidad no es la misma para
todos los aceites y depende de la composición de los ácidos grasos y de los componentes
menores, así como de la temperatura (Arvanitoyannis et al., 2009).
3.4.11 Polifenoles totales
Según Dai et al. (2009), los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios de las
plantas y son considerados como compuestos de interés debido a su capacidad antioxidante
y sus potenciales funciones beneficiosas en la salud humana tales como la reducción del
cáncer, enfermedades cardiovasculares y otras patologías. Por su naturaleza, la mora
presenta altos contenidos de estos compuestos, y se espera que puedan estar presentes
también en el aceite.
Choe et al. (2005), mencionan que los compuestos fenólicos como los lignanos en aceite de
sésamo mejoran su estabilidad oxidativa a pesar de contener altas proporciones de ácidos
grasos poliinsaturados. Además, se ha encontrado evidencia de que los compuestos
fenólicos presentes en el aceite de oliva actúan como antioxidantes en la primera etapa de
oxidación debido a que atrapan los radicales libres y forman quelatos con los metales.
Los compuestos fenólicos comúnmente encontrados en frutas y vegetales son los ácidos
hidroxibenzoicos, ácidos hidroxicinámicos, los taninos hidrolizables como elaginatos,
flavonoides, proantocianinas y antocianinas (Vasco et al., 2009).
3.4.12 Tocoferoles
Los tocoferoles son los antioxidantes más importantes en los aceites, y su contenido varía
según el cultivo, tipo de procesamiento y almacenamiento del aceite. Se conoce una serie
26
de tocoferoles (α, β, γ y δ) que se diferencian en el número y posición de los grupos metilo
en el anillo bencénico (Belitz et al., 2009).
Los tocoferoles constituyen lo que conocemos como vitamina E, y según Herrera et al.
(2005) el isómero que presenta mayor actividad biológica es el α-tocoferol (ver Figura 3).
Entre sus funciones biológicas se destaca la propiedad antioxidante que impide o dificulta
la peroxidación lipídica.
Figura 3. Estructura molecular del α-tocoferol.
Los tocoferoles compiten con los aceites polinsaturados por los radicales peroxilo, ya que
estos reaccionan más rápido con este radical (104-109 L mol-1s-1) que los lípidos (10-60 L
mol-1s-1). Son antioxidantes muy eficientes debido a que una molécula de tocoferol puede
proteger aproximadamente 103-108 moléculas de ácidos grasos poliinsaturados. Los
tocoferoles pueden transferir un átomo de hidrógeno de los 6 grupos hidroxilo del anillo
cromático, con ello eliminando los radicales peroxilo, con generación de radicales
tocoferoxilo, los cuales son más estables por sus estructuras de resonancia que los radicales
peroxilo (Choe et al., 2005).
El contenido de tocoferoles se determina por medio de cromatografía líquida de alta
eficacia (HPLC), comparando las señales características con los tiempos de retención de los
patrones para cada isómero.
3.4.13 Clorofilas
Las clorofilas son pigmentos conformados por un anillo porfirínico con un ión de magnesio
y un extremo alifático denominado fitol. La mayoría de aceites extra vírgenes presentan
O OH
27
altas concentraciones de clorofilas, las cuales son eliminadas en procesos de purificación
como el blanqueamiento y refinamiento (Mathäus, 2012).
La clorofila es un fuerte prooxidante por efecto catalítico de la luz, ya que se genera 1O2, el
cual puede iniciar la oxidación de los aceites; una vez que el 1O2 es formado se llevan a
cabo reacciones que generan hidroperóxidos (Smouse, 1995). Los productos de la
degradación de las clorofilas, feofitinas y feofórbidos, también pueden actuar como
sensibilizadores, generando 1O2 en presencia de la luz y el oxígeno. Las feofitinas presentan
mayor poder sensibilizador que las clorofilas, pero menor que los feofórbidos (Choe et al.,
2005).
Las clorofilas se determinan midiendo la absorción a 630 nm, 670 nm y 710 nm del aceite
en una disolución en ciclohexano al 1 % m/v (Dimic et al., 2012).
3.5 Extracción de aceites
Belitz et al. (2009), mencionan que la extracción de aceite en materias primas vegetales se
lleva a cabo a partir de frutos o semillas oleaginosas. Los frutos oleaginosos de mayor
importancia económica para la obtención de aceite son la oliva y la palma aceitera,
mientras que a nivel industrial se extrae aceite de semillas de leguminosas (soya y maní),
coco, palma, cacao, algodón, girasol, colza, sésamo, mostaza y del germen de cereales
(trigo, maíz y arroz).
Según Ataya (2010), los aceites de semillas oleaginosas tienen condiciones específicas de
extracción que dependen de sus características. Primero se analiza el contenido de agua
presente en las semillas y luego se secan por debajo de un 10-12 % de humedad antes de ser
almacenadas, para retardar el aumento de ácidos grasos libres. En el caso de algunas
semillas, es necesaria una reducción de tamaño previa que facilite la eliminación de la
cáscara, aumente el área superficial y mejore la extracción del aceite (Chandrasekaran y
Shine, 2013).
Según Chandrasekaran y Shine (2013), las cáscaras de las semillas, presentan bajo
contenido de aceite (menos del 1 %), son fibrosas y su proporción varía según el tipo de
28
semilla. La mayoría de las semillas necesitan ser separadas de su cáscara externa para
facilitar la extracción de aceite mediante prensado. Si no se remueven completamente,
reducen el rendimiento de extracción por absorción o retención de aceite en la torta. Según
Ataya (2010), la eliminación total de la cáscara de la semilla no es deseable durante una
extracción con disolventes, porque su presencia facilita la percolación.
3.5.1 Extracción mecánica (prensado)
En la actualidad, el 98 % de la producción mundial de aceite se lleva a cabo mediante
extracción con disolventes, pero aceites especiales como el aceite de oliva extra virgen y el
aceite de colza virgen, producidos en zonas rurales, utilizan el proceso de prensado o un
prensado previo a la extracción con disolventes (Mathaüs, 2012).
En la extracción mecánica las semillas molidas se acondicionan para obtener un producto
homogéneo que pasa por una prensa de tornillo sin fin donde a elevadas presiones y en un
solo paso se lleva a cabo la separación del aceite (Madrid et al., 1997).
Según Mathaüs (2012), la tecnología de prensado con tornillo es interesante para semillas
oleaginosas con altos contenidos de aceites, donde no es un problema dejar cierto
porcentaje de aceite en el residuo; este método es utilizado solamente en gran escala, donde
no es posible reducir el contenido de aceite a menos de un 5 % en la torta prensada. Desde
el punto de vista económico, este proceso no es rentable para la extracción de aceite. Sin
embargo, esta técnica tiene las ventajas de baja inversión y costos de mantenimiento,
además se asegura un aceite de mayor calidad.
3.5.2 Extracción con disolventes
La extracción con disolventes es recomendada si es necesario reducir el contenido de aceite
en la materia prima por debajo del 2 %, lo que significa que el objetivo principal de este
proceso es remover el mayor contenido de aceite como sea posible de la matriz. En la
mayoría de los casos, el hexano es utilizado como disolvente. Sin embargo, el empleo de
este producto presenta algunas desventajas a considerar por su potencial peligro: es
altamente inflamable y las mezclas de aire y hexano son explosivas, lo cual implica riesgos
29
de incendio y explosión si la planta no cuenta con las medidas apropiadas (Mathaüs, 2012);
además, como ya se mencionó el hexano es causante de enfermedades en el sistema
nervioso central. Por ello, en 1990 la Enmienda de Aire Limpio de los Estados Unidos
incluyó al hexano en la lista de 189 contaminantes ambientales y desde entonces ha
limitado su uso.
Según Aguilera (2003), durante el proceso de extracción la concentración del soluto (en
este caso el aceite) dentro del sólido varía de forma inestable: donde una serie de pasos
ocurren durante el período de interacción entre el soluto contenido en la matriz y el
disolvente, afectando la separación. Estos pasos se representan con detalle en la Figura 4.
Figura 4. Diagrama de los principales pasos durante una extracción con disolventes en
matrices alimenticias. Fuente: Aguilera (2003).
Con la ilustración que se presenta en la figura anterior se puede explicar el mecanismo de
extracción con disolventes en una matriz sólida. Primero ocurre la entrada del disolvente,
luego se solubiliza el soluto, y por eso, da paso a la ruptura de algunos componentes
estructurales, tras lo cual inicia el transporte de los solutos disueltos a la superficie de la
matriz. Estos solutos disueltos migran de la superficie de la matriz al disolvente, que está en
constante movimiento, para finalmente llevar a cabo la separación y descarga del sólido y
el extracto.
30
La microestructura de la matriz sólida juega un rol importante en la tasa y calidad del
proceso de extracción en los alimentos, y entre los aspectos fundamentales que ocurren
durante una extracción cabe destacar el proceso de difusión. La difusión molecular es el
proceso por el cual las moléculas son transportadas de una parte del sistema a otro por un
movimiento aleatorio, como resultado de un gradiente de concentración. Durante la
lixiviación del sustrato, el interior del sólido no puede ser agitado y la turbulencia no ocurre
en los pequeños poros capilares, dejando la difusión molecular como el principal
mecanismo de transporte hacia la fase líquida. En algunos casos, el flujo del soluto al
disolvente puede ocurrir debido a la presión, las fuerzas de capilaridad o por ruptura
mecánica de la matriz celular (Aguilar, 2003).
Según O’Brien (2009), cuando el disolvente entra en contacto con la torta y se empieza a
calentar, se reduce la viscosidad del aceite y esto permite su difusión. No obstante, la
cantidad de aceite extraído depende del tamaño de partícula o del proceso previo al que
hayan sido sometidas las materias primas.
Durante el curso de la extracción, el material extraíble varía en calidad y composición. El
material extraído inicialmente está compuesto mayoritariamente por triacilgliceroles.
Conforme la extracción avanza se incrementa la cantidad de otros materiales extraídos,
tales como fosfolípidos, clorofila, ácidos grasos libres, pigmentos y productos de la
degradación oxidativa (Wan, 1997; Mathaüs, 2012). Por lo tanto, el tiempo de extracción
va a ser determinante en la composición del extracto al aceite/disolvente, llamada micela.
Comúnmente, la extracción del sustrato con disolvente es realizada utilizando un proceso
continuo en contracorreinte, donde el sustrato y el disolvente se mueven en direcciones
opuestas, de forma que el disolvente puro entra en contacto con el sustrato al cual ya se le
ha extraído aceite en etapas previas; este método es el más eficiente para reducir el
contenido de aceite al mínimo en el sustrato. Durante el proceso, el sustrato es puesto en
contacto con el disolvente varias veces y después de cierto tiempo de ajuste de equilibrio se
separa del sustrato como se aprecia en la Figura 5. En cada paso, la cantidad de aceite es
reducida en la torta, pero no es posible remover todo el disolvente del mismo sustrato y
siempre queda cierta cantidad de aceite remanente (Mathaüs, 2012).
31
Figura 5. Sistema de extracción contra corriente de aceite. Fuente: Mathaüs (2012).
Existe también la extracción del aceite en lote, pero este método es menos utilizado debido
a que disminuye la eficiencia de la extracción y se obtiene una torta con alto contenido
residual de aceite.
3.5.3 Disolventes alternativos
Según Gallegos-Infante et al. (2003), en la industria se ha utilizado ampliamente el hexano
para la extracción de aceites. Sin embargo, en 1990 la Enmienda de Aire Limpio de los
Estados Unidos lo incluyó entre los 189 contaminantes ambientales, ya que ocasiona
problemas en el sistema nervioso central y además es altamente inflamable. Por tanto, es
importante encontrar un disolvente diferente o alternativo que pueda reemplazar al hexano
con la misma eficacia y sin incrementar los costos de extracción.
Según Johnson y Lusas (1983), para la elección de un disolvente alternativo al hexano, se
deben considerar varios requerimientos; tales como la posibilidad de utilizar el equipo
existente o que se tenga un bajo costo de reequipamiento, rentabilidad de las operaciones
que resulten de los cambios, la capacidad de extracción del disolvente, los costos
energéticos, el rendimiento del producto y el valor del producto en el mercado.
Los aspectos anteriores se encuentran estrechamente relacionados con las propiedades
fisicoquímicas del disolvente; preferiblemente, alta solubilidad de los triacilgliceroles a
elevadas temperaturas.
32
3.5.4 Isopropanol como disolvente
Según Seth et al. (2010), el alcohol isopropílico (IPA, isopropanol, 2-propanol) es una
alternativa efectiva a la extracción de aceites con hexano, y gran cantidad de estudios lo han
utilizado en la obtención de aceites de matrices vegetales; por ejemplo, en la extracción del
aceite de semillas de algodón (Zhang et al., 2002). Además, el IPA produce un aceite de
alta calidad que requiere menos refinamiento, por tanto, usa menos energía, es un
disolvente más seguro y presenta menor toxicidad que el hexano.
El IPA es más seguro que el hexano debido a que tiene un punto de ebullición mayor, bajos
límites de explosión y menor temperatura de autoignición. La mayor desventaja de utilizar
IPA es que se requiere mayor energía para recuperar el disolvente que en el proceso
tradicional utilizando hexano, y la solubilidad del aceite con este disolvente es más baja que
con el hexano (Ataya, 2010).
Según Ataya (2010), a pesar que la destilación del IPA es más costosa energéticamente
respecto al hexano, la separación del aceite y un azeótropo IPA/agua (87,7 % m/m) por
medio de enfriamiento es posible. Mediante una extracción en caliente se solubiliza la
mayor cantidad de aceite en el IPA; posteriormente, bajando la temperatura del extracto
disolvente/aceite, la solubilidad de este disminuye y consecuentemente se forman dos fases,
la superior rica en IPA mientras que la inferior con alta concentración de aceite.
3.6 Emulsiones
Una emulsión es una suspensión de una fase líquida en otra, las cuales son inmiscibles. Una
de las fases existe dispersa en forma de gotículas suspendidas en la fase continua, y hay una
capa interfacial entre ambos componentes, la cual está ocupada en algunos casos por
material tensoactivo (Belitz et al., 2009).
Durante la extracción de los aceites es muy común la formación de emulsiones debido a la
afinidad de estos compuestos con el disolvente y el agua presente en la matriz. Como es
conocido, el aceite y el agua no coexisten cómodamente debido a la energía superficial de
la interfase aceite/agua, y por ello generalmente forman dos fases insolubles. Debido a la
33
tensión superficial entre el agua y el aceite, en cualquier emulsión que se forme se buscará
minimizar la energía interfacial, haciendo que el área entre el aceite y el agua sea lo más
pequeña posible. En ausencia de un agente tensoactivo ocurre la coalescencia de las
gotículas de aceite, generando la separación de capas separadas de aceite y agua. Por otro
lado, la presencia de agentes tensoactivos reduce la tensión superficial entre las fases y
reduce la coalescencia, pero no la elimina del todo (Dalgleish, 2003).
Según Ataya (2010), las moléculas surfactantes o tensoactivas son anfifílicas, es decir, que
poseen dominios hidrofóbicos e hidrofílicos. Por tanto, una parte del surfactante se disuelve
en la grasa y la otra parte en la fase acuosa. Ejemplos de surfactantes son las proteínas,
como la albúmina de huevo, la miel, los alcoholes cetílicos, los polisorbatos y los
fosfolípidos, entre otros compuestos.
3.6.1 Métodos de separación de emulsiones
La rapidez con la que una emulsión se rompe, y el mecanismo por el cual este proceso
ocurre, depende de su composición y de la microestructura existente, así como de las
condiciones del medio y de los cambios que experimenta en el tiempo; por ejemplo,
variaciones de temperatura, agitación mecánica, cambios en pH y fuerza iónica
(McClements, 2004; Belitz et al., 2009).
Según Ataya (2010), después de un proceso de extracción de aceite en un medio acuoso, se
necesita un proceso de desemulsificación para obtener el aceite puro. Procesos como el
calentamiento y la centrifugación no son considerados eficientes para la separación de las
emulsiones, mientras que la operación de congelar y descongelar el extracto emulsificado
genera mejores rendimientos de recuperación. En el caso de la presencia de emulsificantes
de naturaleza proteica, un método importante, que produce la desestabilización del medio,
es el ajuste del pH utilizando un ácido, para llevar las proteínas a su punto isoeléctrico, lo
que permite separaciones de hasta un 100 % de aceite puro. Existe también la posibilidad
de adición de sales, pero limita la utilización de extracto acuoso y se generan más
desperdicios.
34
Es importante recalcar que se han desarrollado procesos para romper emulsiones mediante
la adición de mezclas de dos o más disolventes volátiles miscibles; donde al menos uno de
ellos debe ser soluble en agua y el otro en el aceite. Los disolventes usualmente más usados
son el IPA y el ciclohexano mezclados en igual volumen; después de añadirlos a la
emulsión, luego de cierto tiempo, ocurre la separación del aceite y el agua en dos fases.
Cabe mencionar que ambos disolventes se pueden recuperar por destilación para ser
reutilizados (Li et al., 1977).
35
4 MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Ubicación del proyecto
El secado y almacenamiento del subproducto de mora se realizó en la Planta Piloto del
Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA). La extracción del aceite y
las pruebas de caracterización fisicoquímica y de calidad del mismo se llevaron a cabo en
los laboratorios de química de la Escuela de Tecnología de Alimentos y del CITA, ubicados
en la Ciudad Universitaria Rodrigo Facio de la Universidad de Costa Rica.
4.2 Materia prima
El subproducto utilizado consistió principalmente de semillas, y se obtuvo de la operación
del despulpado de la mora. Este fue suministrado por la empresa Productos Ujarrás, la cual
procesa jaleas y mermeladas de frutas, ubicada en el cantón de La Unión, provincia de
Cartago.
4.2.1 Análisis químico del subproducto
Se determinó el contenido de humedad y de lípidos del subproducto de mora. El primer
parámetro se determinó según el método AOAC 920.151 (2005a) para frutas frescas y
jugos, mientras que para la determinación de lípidos se utilizó el método AOAC 920.39
(2005b) empleando un extractor tipo Soxhlet con hexano como disolvente y separando el
aceite del extracto utilizando presión reducida por medio de un rotavapor R-124 (Büchi,
Alemania).
4.3 Extracción del aceite
La extracción del aceite del subproducto de mora se realizó según el proceso establecido en
pruebas preliminares (ver Figura 6), el cual se explica con más detalle seguidamente.
36
Figura 6. Diagrama de flujo del proceso de extracción del aceite de semilla de mora
utilizando IPA como disolvente (T: temperatura, t: tiempo y Rds: Relación
disolvente/sustrato).
4.3.1 Secado del subproducto
La operación de secado del subproducto se efectuó en un secador industrial de cabina de
convección con aire caliente a 50 °C (The National Drying Machinery Company Inc.,
Pennsylvania). Se utilizaron bandejas de secado con marco metálico, malla plástica y
orificios de tamaño uniforme, sobre las cuales se colocó una malla de poliéster con orificios
de aproximadamente 1 mm con una carga de 3,5 kg/m2 del producto, para evitar que el
material seco atravesara los orificios de la bandeja. Se secó el subproducto hasta alcanzar
una humedad final entre 10 y 12 g agua/100 g subproducto. El subproducto seco fue
empacado en bolsas de polietileno de alta densidad y se almacenó en refrigeración.
Subproducto de mora
RECIBO
SECADO
Aire caliente, 50 °C, H = 6-10 %
MOLIENDA
Ultracentrífugo, 12000 rpm, 2 mm
malla
EXTRACCIÓN
Extractor 0,8 L, T, t, Rsd
IPA
Aceite mora
EVAPORACIÓN
Rotavap, 14 kPa, 40 °C
Torta (sólidos) CENTRIFUGACIÓN
3000 g, 10 °C, 5 min
37
4.3.2 Molienda del subproducto seco
Para permitir el contacto entre la matriz y el disolvente durante la extracción del aceite se
redujo el tamaño de partícula de las semillas de mora secas a valores inferiores a 500 μm
utilizando un molino ultracentrífugo Twister (Retsch, Alemania) con una malla de
separación de 2 mm y operado a 12 000 rpm. El producto molido fue empacado en bolsas
de polietileno de alta densidad y se almacenó en refrigeración.
4.3.3 Establecimiento del tiempo de extracción
Se definió el tiempo de extracción aproximado mediante la ejecución y análisis de una
cinética de extracción del aceite donde se utilizaron las condiciones intermedias definidas
arbitrariamente de temperatura y relación disolvente/sustrato (Rds) (50 °C y 4,00 g IPA/g
sustrato) y con una agitación a 300 rpm (determinada en pruebas preliminares como la
velocidad de agitación en la que se lograban mantener todas las partículas suspendidas
dependiendo de la Rds). La carga inicial de 2000 g de sustrato/disolvente se dejó un tiempo
45 minutos requeridos para alcanzar la temperatura de extracción de 50 ºC. A partir de este
momento se tomaron muestras de aproximadamente 100 g en períodos de 10 minutos la
primera hora, luego en períodos de 15 minutos, hasta completar los 180 minutos de
proceso. La extracción se realizó en un bioreactor de 2 L Bio-Flo New Brunswick
(Eppendorf, Alemania) con agitación continua con propela tipo Rushton. Las muestras se
obtuvieron del bioreactor, sin detener la agitación, mediante un sistema de succión, de
manera que se obtuviera un producto de composición homogénea. A cada muestra se le
determinó el contenido de aceite siguiendo el proceso de extracción que se especifica en la
Figura 6. Con los resultados obtenidos se construyó una gráfica de variación de la
concentración de aceite en función del tiempo, con la cual se estableció el tiempo de
extracción promedio, como aquel a partir del cual la concentración de aceite obtenido no
varió respecto al tiempo de extracción.
4.3.4 Extracción con isopropanol
La extracción se llevó a cabo con isopropanol 99,5 % en un recipiente cerrado de 0,8 L de
capacidad, tal y como se aprecia en la Figura 7, que cuenta con control de temperatura y un
38
sistema con agitación Eurostar (IKA, Alemania) con propela tipo Rushton a 300 rpm que
permite la interacción completa y un mezclado homogéneo entre el sustrato seco y
disolvente.
Figura 7. Diagrama del equipo utilizado para realizar las extracciones de aceite de
semilla de mora utilizando IPA como disolvente.
4.3.4.1 Temperatura de extracción
Se evaluaron temperaturas de extracción entre los 30 °C y 60 °C, que aseguran la calidad
química del aceite obtenido (Martínez et al., 2013).
4.3.4.2 Relación disolvente/sustrato (Rds)
Se evaluaron proporciones de sustrato y disolvente, en un rango entre 3 a 6 (g disolvente/g
sustrato). En los diferentes tratamientos se mantuvo fija la carga total de la mezcla de
disolvente y subproducto molido en 600 g.
4.3.5 Separación del extracto
Finalizado el tiempo de extracción, se separó el disolvente del sustrato mediante
centrifugación a 3000 g durante 5 minutos a 10 °C, en un equipo modelo 5810 R
(Eppendorf, Alemania), tal y como se aprecia en la Figura 6.
Condensador
Baño de calentamiento
Termómetro
Sistema de agitación
39
4.3.6 Evaporación del extracto
Se utilizó un rotavapor R-124 (Büchi, Alemania) a una presión de 14 kPa donde el
disolvente ebulle a una temperatura de 40 °C, para separar el IPA completamente del
extracto disolvente-aceite.
4.3.7 Cuantificación del aceite extraído
Se determinó el contenido de aceite extraído por el IPA mediante la evaporación total de
este. Posteriormente se extrajo el aceite del sólido resultante (componentes solubilizados
por el IPA) utilizando hexano grado técnico; el extracto hexano:aceite se evaporó en un
rotavapor R-124 (Büchi, Alemania). El aceite obtenido se llevó a masa constante por
calentamiento en una estufa de convección de aire caliente a 40 ºC. Se determinó la masa
de aceite extraído y se calculó el rendimiento de extracción (Re) como la relación entre la
masa de aceite extraído y la masa del sustrato inicial.
𝑅𝑒 =𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 (𝑔)
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 (𝑔)∗ 100 (1)
4.3.8 Diseño experimental, condiciones de extracción y análisis estadístico
Se utilizó la metodología de superficie de respuesta (MSR), mediante un diseño central
compuesto rotable (DCCR) que permite ajustar un modelo de segundo orden. En el
experimento se evaluaron dos variables independientes o factores: la Rds y la temperatura
de extracción; las variables respuesta fueron el Re y los coeficientes K232, K270. Los factores
fueron codificados de -1,414 a 1,414, cada uno a cinco niveles (ver Cuadro IV). Se
mantuvo constante el tiempo de extracción en 75 minutos.
Cuadro IV. Variables independientes y niveles para el diseño central compuesto
rotable empleado para optimizar las condiciones de extracción del aceite de mora.
Condiciones
Niveles codificados
-1,414 -1 0 1 1,414
Niveles naturales
Temperatura (ºC) 30,0 34,4 45,0 55,6 60,0
Rds (g IPA/g sustrato) 3,00 3,44 4,50 5,56 6,00
40
El ámbito de variación de la temperatura se fijó con la idea de mantener la calidad de la
composición química del aceite extraído, por lo que se consideró aceptable una temperatura
máxima de 60 ºC para evitar el deterioro del extracto por temperaturas más altas. En
pruebas preliminares se determinó un Rds = 3,00 g IPA/g sustrato representa la cantidad
mínima de disolvente que permite una adecuada suspensión del sustrato, en tanto el límite
superior Rds = 6,00 g IPA/g sustrato se fijó tomando en cuenta que no es una cantidad de
disolvente excesiva para su manejo y disposición.
En el cuadro V que se muestra a continuación, se presenta el diseño experimental utilizado
para la optimización de los factores del proceso de extracción del aceite de semilla de mora
según lo establecido por Montgomery (2008). Dicho diseño consiste en 12 puntos
experimentales: cuatro puntos factoriales (codificados como -1 y 1), cuatro puntos axiales
(cuya distancia del centro del diseño es igual a ±√2, codificados como -1,414 y 1,414) y
cuatro repeticiones en el punto central (codificadas como 0).
Cuadro V. Diseño central compuesto rotable (DCCR) empleado para optimizar las
condiciones de extracción del aceite de semilla de mora.
Tratamiento
Factores
Variables codificadas Variables
Temperatura Rds Temperatura (ºC) Rds (g IPA/ g sustrato)
1 -1 -1 34,4 3,44
2 1 -1 55,6 3,44
3 -1 1 34,4 5,56
4 1 1 55,6 5,56
5 0 -1,414 45,0 3,00
6 0 1,414 45,0 6,00
7 -1,414 0 30,0 4,50
8 1,414 0 60,0 4,50
9 0 0 45,0 4,50
10 0 0 45,0 4,50
11 0 0 45,0 4,50
12 0 0 45,0 4,50
Para cada variable respuesta se propuso un modelo de segundo orden de la forma
𝑌 = 𝛽0 + 𝛽1 ∗ 𝑇 + 𝛽11 ∗ 𝑇2 + 𝛽2 ∗ 𝑅𝑠𝑑 + 𝛽22 ∗ 𝑅𝑠𝑑2 + 𝛽12 ∗ 𝑇 ∗ 𝑅𝑠𝑑 (2)
41
donde Y representa el valor de cada uno de los parámetros evaluados como variables
respuesta, β representa los coeficientes de regresión del modelo, mientras que T y Rds, la
temperatura de extracción del aceite y la relación sustrato disolvente.
Para cada variable analizada se determinaron los coeficientes de regresión del modelo y su
significancia. Posteriormente, se realizó un análisis de varianza, considerando únicamente
los coeficientes de regresión que resultaron significativos (p < 0,05), para determinar la
ecuación que modela el comportamiento de la variable. También, se evaluaron los
indicadores de ajuste y bondad del modelo, tales como: coeficiente de determinación (R2),
probabilidad de regresión y la probabilidad de la falta de ajuste. Es importante mencionar
que se evaluó la distribución de los residuos.
Para cada variable respuesta predicha por el modelo generado adecuadamente, se construyó
la gráfica de contorno que facilita la visualización de los resultados. Finalmente, se
optimizaron las condiciones de extracción respecto al porcentaje de extracción de aceite.
Dicho análisis estadístico descrito anteriormente se realizó por medio del paquete
estadístico Statistica 7 (StatSoft, USA).
La validación del modelo, se llevó a cabo realizando corridas para dos puntos
experimentales (por triplicado) con los valores de T y Rds correspondientes; los porcentajes
de grasa experimentales obtenidos para cada punto fueron comparados con sus respectivos
valores predichos por el modelo y su intervalo de confianza (α = 0,05) utilizando Microsoft
Office Excel 2010 (Microsoft, USA).
4.3.9 Recuperación del aceite
Como se mencionó anteriormente, la separación del aceite significó un reto tecnológico, ya
que durante el proceso se formaba una emulsión que impedía la separación eficiente y
completa del aceite, por lo que se decidió cuantificarlo mediante el uso de hexano.
Adicionalmente, se desarrolló el proceso completo de separación del aceite utilizando IPA
mostrado en la Figura 8, el cual será detallado a partir de la operación de concentración.
42
Figura 8. Diagrama de flujo del proceso de separación del aceite del subproducto de
mora extraído con IPA como disolvente (T: temperatura, t: tiempo y Rds: relación
disolvente/sustrato).
4.3.9.1 Concentración del extracto
Se utilizó un rotavapor R-124 (Büchi, Alemania) a una presión de 14 kPa donde el
disolvente ebulle a una temperatura de 40 °C, para concentrar el extracto disolvente-aceite
a un 30 % de su masa inicial. Se realizó esta concentración del extracto ya que, como se
determinó en pruebas preliminares, propicia una separación más eficiente del aceite,
además que permite la recuperación de una parte del disolvente puro.
Subproducto de mora
RECIBO
SECADO
Aire caliente, 50 °C, H = 6-10 %
MOLIENDA
Ultracentrífugo, 12000 rpm, 2 mm
malla
EXTRACCIÓN
Extractor 0,8 L, T, t, Rsd
IPA
SEPARACIÓN
Manual, 1 h reposo, pH = 5
12 % m/m de agua
+ NaOH
Aceite mora
EVAPORACIÓN
Baño agua, P ambiente, 60 °C, 1 h IPA
Aceite mora
CONCENTRACIÓN
Rotavap, 14 kPa, 40 °C, 30 % mi
Torta (sólidos) CENTRIFUGACIÓN
3000 g, 10 °C, 5 min
IPA CENTRIFUGACIÓN
3000 g, 10 °C, 5 min
43
4.3.9.2 Separación del aceite
Al extracto concentrado se le agregó agua destilada (12 g agua/100 g extracto) con una
ligera agitación manual, que generó la formación de una emulsión que impidió la
separación del aceite.
A partir de este fenómeno se plantearon por triplicado los siguientes tratamientos: el
primero consistió en la adición de 12 g agua/100 g extracto y una vez generada la emulsión
se ajustó el pH a un valor de 5 con NaOH 15 % m/m; en el segundo y tercer tratamiento se
agregaron disoluciones de NaCl al 1 % m/v y 5 % m/v, respectivamente y en la misma
cantidad que el agua agregada en el primer tratamiento.
Posteriormente, se dejó en reposo cada tratamiento durante 1 hora en refrigeración. Como
se mencionó, esta adición propicia la ruptura de la emulsión y la separación de fases; dicha
separación se aceleró por centrifugado en un equipo 5810 R (Eppendorf, Alemania) a 3000
g durante 5 minutos a 10 °C (segunda centrifugación) y se determinó la masa del aceite
separado así como su apariencia visual (clara o limpia).
4.3.9.3 Concentración del aceite extraído
El aceite extraído se separó por decantación, para luego someterlo a un proceso de
evaporación moderado en un baño de agua a 60 °C por 60 minutos, con el objetivo de
eliminar los restos de disolvente.
4.4 Análisis fisicoquímico y de calidad del aceite extraído
Una vez establecidas las condiciones óptimas para la extracción del aceite, dentro del rango
de operación estudiado, se realizaron extracciones de aceite siguiendo el proceso mostrado
en la Figura 8. Las extracciones se llevaron a cabo con una carga inicial de 10 kg en un
reactor Bio-flo New Brunswick (Eppendorf, Alemania) de 10 L de capacidad. El aceite
obtenido fue analizado para determinar las características fisicoquímicas y de calidad que
se detallan a continuación.
44
4.4.1 Color
Las mediciones de este parámetro se efectuaron en un colorímetro Color Flex EZ
(HunterLab, USA) con una fuente de iluminación D65 y un ángulo de visión de 10°. El
color fue expresado como una combinación de las coordenadas L*, a* y b*, según la escala
de color CIELab.
4.4.2 Humedad y materia volátil
Por medio del método 926.12 de la AOAC (2005c), se determinó el contenido de humedad
y materia volátil en el aceite. El fundamento del procedimiento radica en la pérdida de masa
de la muestra de aceite calentada a presión reducida en una estufa de vacío hasta obtener
una masa constante.
4.4.3 Índice de yodo
Se estimó mediante el método descrito por Ku y Mu (2008), que se basa en la relación
directa entre el valor de este parámetro y el contenido de ácidos grasos insaturados, con las
conversiones a las unidades respectivas para su comparación. El resultado de esta
propiedad se expresa en cg I2/g TAG.
4.4.4 Índice de saponificación
Se determinó mediante el método 920.160, Saponification Number of Oils and Fats
(AOAC, 2005e) y su valor se expresa como mg KOH/g TAG.
4.4.5 Densidad
Se determinó con el método Cc 10a-25 (AOCS, 1990), mediante picnometría a 20 °C, con
un frasco de vidrio con capacidad de 50 mL.
45
4.4.6 Índice de refracción
Este parámetro se determinó por el método de la AOAC 921.08 Index of Refraction of Oils
and Fats (AOAC, 2005f), utilizando un refractómetro de Abbé IT (ATAGO, Japón),
controlando la temperatura a 25 °C.
4.4.7 Índice de acidez
Se determinó con el método 940.28 Fatty Acids (Free) in Crude and Refined Oils (AOAC,
2012), donde este parámetro se expresa como mg KOH/g TAG.
4.4.8 Índice de peróxidos
Se determinó según el método AOAC 965.33 (2005g), y se reporta como mEq
peróxidos/kg TAG.
4.4.9 Composición de los ácidos grasos del aceite de semilla de mora
Para conocer el tipo de ácidos grasos que componen el aceite de mora se realizó un perfil
lipídico en el laboratorio de servicios analíticos del CITA. Dicho análisis siguió el método
P-SA-MQ-034, el cual se basa en los métodos AOAC 996.06 (2001) y AOCS Ce 1e-91
Fatty Acid Composition by Capillarity GC (2000).
4.4.10 Polifenoles totales
El contenido de polifenoles totales se determinó mediante el método P-SA-MQ-014 del
laboratorio de servicios analíticos del CITA (2016), basado en el procedimiento descrito
por Georgé et al., (2005). Utilizando espectrofotometría y el reactivo de Folin Ciocalteu, se
reporta el contenido de polifenoles como mg ácido gálico en 100 gramos de muestra.
4.4.11 Tocoferoles
Se cuantificó el contenido de tocoferoles en el aceite de mora utilizando el método descrito
por Firestone (2009) con las modificaciones realizadas por Cortés (2016), mediante
cromotagrafía líquida de alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés), donde se inyecta la
46
muestra diluida en IPA y se eluye de forma isocrática con una mezcla de metanol y agua
relación 95:5 % m/m. El análisis se efectuó a una presión de 7000 kPa, un flujo de 1
mL/min, a temperatura constante de 50 ºC durante 20 min. Las señales obtenidas tanto de la
muestra, así como los patrones fueron analizadas a una longitud de onda de 295 nm, y las
concentraciones para cada isómero se reportan como mg/g.
4.4.12 Clorofilas
El contenido de clorofila a y b se determinó mediante el método descrito por Pokorny et al.
(1985).
4.4.13 Análisis de resultados
Se reportó el promedio de cada parámetro fisicoquímico con intervalo de confianza del 95
%.
4.5 Evaluación de la estabilidad oxidativa del aceite
Se determinó la estabilidad oxidativa del aceite extraído evaluando sus propiedades de
calidad (índice de peróxidos y coeficientes de extinción) durante cierto tiempo de
almacenamiento a dos temperaturas.
4.5.1 Estabilidad oxidativa del aceite a 20 °C
Las muestras fueron almacenadas siguiendo el procedimiento descrito por Anwar et al.
(2007), a una temperatura de 20 ± 1 °C durante un período de 110 días, con las siguientes
modificaciones: las muestras de 20 g fueron almacenadas en botellas de vidrio ámbar y el
nivel de oxidación se evaluó periódicamente por triplicado, cada diez días.
4.5.2 Estabilidad oxidativa del aceite a 60 °C
Las muestras fueron almacenadas a 60 °C de acuerdo a la metodología descrita por
Chander (2010) y el método AOCS Cg 5-97, Oven Storage Test for Accellerated Aging of
Oils (1997), donde se evaluó el grado de oxidación a diferentes tiempos de
47
almacenamiento: 0, 2, 4, 6, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264 horas. Las
muestras consistieron de 20 g del aceite en botellas en vidrio ámbar y las mediciones se
efectuaron por triplicado.
Para ambas temperaturas, la estabilidad oxidativa del aceite se evaluó y monitoreó por
medio de los siguientes análisis:
4.5.3 Índice de peróxidos
Se determinó según el método AOAC 965.33, Peroxide Value of Oils and Fats (2005g). Se
utilizó como criterio límite de calidad un valor de 10 mEq peróxido/kg, tal y como
mencionan Oomah et al. (2000).
4.5.4 Coeficientes de extinción (K232 y K270)
Se midieron siguiendo los métodos analíticos descritos en la Regulación Europea EEC
2568/91 (2013). Estos consisten en medir la absorbancia a 232 nm y 270 nm de una
muestra de aceite diluida en ciclohexano grado espectrofotométrico.
4.5.5 Análisis de resultados
Las mediciones para cada parámetro evaluado se determinaron por triplicado; y se reportan
como los promedios en cada caso y su respectivo intervalo de confianza de un 95 %.
A partir de los datos experimentales se elaboraron gráficas de las cinéticas para cada índice
evaluado en el aceite; que fueron utilizadas para ver su comportamiento en el tiempo de
almacenamiento.
48
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Optimización de las condiciones de extracción del aceite de mora
utilizando isopropanol como disolvente
5.1.1 Caracterización del subproducto industrial de mora
En un lote de procesamiento de jaleas o mermeladas de mora, posterior a la operación de
despulpado específicamente, se genera un 17,4 g/100 g de subproducto. Este subproducto
industrial de mora está conformado en su totalidad por semillas y presentó un contenido de
humedad de 65,5 g/100 g BH, y posteriormente se secó hasta una humedad de (6,43 ± 0,03)
g/100 g BH, ideal para su procesamiento.
El subproducto seco presentó un contenido de compuestos lipídicos de un (12,7 ± 0,6)
g/100 g. Para otras semillas de especies de Rubus se reportan contenidos de aceite entre 10-
23 g/100 g BS (Johanson et al., 1997; Oomah et al., 2000). Este valor se considera
importante ya que según Soto (2014), es un aceite con alto contenido de ácidos grasos
esenciales en la proporción adecuada para el metabolismo humano.
5.1.2 Secado del subproducto industrial de mora
Como se mencionó en el apartado anterior, se llevó el subproducto industrial de mora hasta
una humedad de (6,43 ± 0,03) g/100 g BH mediante secado con aire caliente, ya que como
señala Mathaüs (2012), se ha demostrado en la industria aceitera que contenidos de
humedad por debajo del 9 g H2O/100 g se consideran ideales en las materias primas
(principalmente semillas), para llevar a cabo las operaciones de extracción sin dificultades
tecnológicas y para obtener un aceite con una mayor vida útil.
Es importante mencionar que, si se procesa una materia prima con alto contenido de
humedad (> 8 %), se le dificulta al disolvente penetrar los tejidos húmedos, lo cual
disminuye la eficiencia de la extracción. Aunado a lo anterior existen disolventes
higroscópicos, es decir, que absorben agua de la muestra y se saturan, provocando una
ineficiente extracción del aceite (Shahidi y Wanasundara, 2008).
49
A partir del subproducto industrial de mora, se obtuvo un rendimiento de 25,5 g/100 g de
subproducto seco.
5.1.3 Molienda del subproducto industrial de mora
Una vez deshidratado el subproducto se sometió a la operación de molienda, con el fin de
disminuir el tamaño de partícula. En el caso de las semillas oleaginosas, el aceite se
encuentra en el endospermo y para obtenerlo se utiliza la operación de descascarillado.
Según Mathaüs (2008), no todas las semillas oleaginosas son sometidas a un
descascarillado, ya que depende del tamaño de la semilla. Así, por ejemplo, esta operación
no se aplica a la colza, pues su proceso de descascarillado resulta demasiado costoso por
presentar semillas muy pequeñas. Considerando esto, se estableció que, en el presente caso
un descascarillado no es una operación viable, a nivel industrial, para la extracción del
aceite de las semillas de mora debido a su pequeño tamaño.
La eficiencia de extracción de los aceites a partir de materias primas secas depende de su
tamaño de partícula; por ello, se realiza una operación de reducción de tamaño de las
semillas que conlleva un incremento en el área superficial, lo que permite un mayor
contacto con el disolvente y mejora el proceso de extracción (Shahidi y Wanasundara,
2008). Por esto, se redujo el tamaño de partícula del subproducto seco mediante molienda a
valores por debajo de los 500 µm.
5.1.4 Determinación de las condiciones óptimas para la extracción del aceite
Desde el punto de vista ingenieril, la extracción sólido/líquido involucra la transferencia de
masa de una especie química (soluto), desde un sólido hacia un disolvente (Aguilera, 2003).
Es una operación donde intervienen dos fases (sólida y líquida), con muchos componentes,
y donde se presenta una transferencia de masa en estado inestable.
5.1.4.1 Establecimiento del tiempo de extracción
Inicialmente, se definió el tiempo de extracción empleando las condiciones de una Rds de
4,00 g IPA/g sustrato y una temperatura de 50 ºC con el propósito de conocer el equilibrio
50
de la extracción. Los resultados del rendimiento de aceite con respecto al tiempo de
extracción se muestran en la Figura 9.
Figura 9. Rendimiento de extracción del aceite de mora en base seca con IPA, Rds =
4,00 g IPA/g sustrato, T = 50 ºC, velocidad de agitación de 300 rpm para determinar el
tiempo de saturación del disolvente (n=1).
Como se aprecia en la Figura 9, el proceso de extracción fue analizado en función del
rendimiento de aceite extraído durante el tiempo. De la figura, se observa que el
rendimiento de extracción permanece prácticamente constante en valores cercanos a 9,5
g/100 g, luego de los 75 minutos de proceso, por lo que se decidió establecer este tiempo,
como el tiempo de extracción para el estudio de la optimización de las otras variables del
proceso. Cabe resaltar que el contenido de aceite extraído por el IPA resulta relativamente
alto, partiendo de que el subproducto de mora contiene (12,7 ± 0,6) g/100 g de aceite.
Asimismo, se puede apreciar en la Figura 9 que a partir de los 45 minutos la cantidad de
aceite extraído varía muy poco con respecto al tiempo. Cuando ocurre una saturación del
disolvente, consecuentemente disminuye la presión de difusión y por ende la capacidad de
extracción, provocando que el porcentaje de aceite presente un comportamiento
prácticamente constante a partir de los 45 minutos.
Se han desarrollado algunos modelos que permiten predecir los procesos de extracción
basados en la aplicación de la ley de Fick, donde se expresa que la difusividad varía con
Tiempo (min)
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
Ren
dim
ien
to d
e e
xta
cció
n
(g/1
00 g
)
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
51
respecto al líquido utilizado como disolvente. El principal reto y problema de estos modelos
es la complejidad de las microestructuras en los productos naturales, pues no permite su
aplicación (Xu y Diosady, 2003).
5.1.5 Optimización del proceso de extracción del aceite de mora
Una vez definido el tiempo de procesamiento, se eligieron las condiciones de extracción
óptimas de temperatura y Rds, por medio de la metodología de superficie de respuesta,
empleando un diseño central compuesto rotable (DCCR), tal y como se describe en el
apartado 4.3.8. de la metodología. El rango de respuesta del rendimiento de extracción del
aceite de mora bajo las distintas condiciones de extracción, según el espacio experimental
definido, se presenta en el Cuadro VI.
Cuadro VI. Influencia de la relación sustrato-disolvente y de la temperatura de
extracción, en el parámetro evaluado en la superficie de respuesta.
Tratamiento Variables Re
(g aceite/100 g sustrato BS) Temperatura (ºC) Rds (g IPA/g sustrato)
1 34,4 3,44 7,503
2 55,6 3,44 8,041
3 34,4 5,56 8,678
4 55,6 5,56 8,672
5 45,0 3,00 7,367
6 45,0 6,00 9,732
7 30,0 4,50 8,752
8 60,0 4,50 8,586
9 45,0 4,50 7,961
10 45,0 4,50 7,949
11 45,0 4,50 8,074
12 45,0 4,50 7,937
Es importante mencionar que los valores de los coeficientes de extinción no fueron
determinantes para la optimización, ya que en ambos parámetros el modelo resultó no ser
significativo (p > 0,05), por lo tanto, las variaciones de los coeficientes en cada tratamiento
no siguen una tendencia que permita predecir los rendimientos de extracción del aceite de
semilla de mora. Ver cuadro A.III de la sección de anexos.
52
Los parámetros estadísticos de ajuste y adecuación, coeficiente de determinación (R2: el
cual determina la calidad del modelo para replicar los resultados) y coeficiente de
determinación ajustado (R2-adj), la probabilidad del modelo (p), la probabilidad de la falta
de ajuste (pfa) y la distribución de los residuos se observan en el cuadro VII, para el modelo
generado para la variable Re.
Cuadro VII. Estadísticos de ajuste y adecuación para el modelo generado para el
optimizar el rendimiento de extracción de aceite.
R2 R2-adj p del modelo p de la falta de ajuste Distribución de los residuos
0,85 0,76 0,0052 < 0,0001 Aleatoria
Sun et al. (2006) y Kopper (2012), mencionan que el coeficiente de determinación (R2) es
definido como la razón de la variación explicada con respecto al total de la variación, y es
una medida del grado de ajuste del modelo; es decir, corresponde a la proporción de la
variabilidad en la respuesta que es explicada por el análisis de la regresión. Entre más se
aproxime el valor del coeficiente de determinación a la unidad, el modelo empírico se
ajusta mejor a los datos reales; por el contrario, entre más pequeño sea este, menores
relevancias tienen las variables dependientes en la explicación del comportamiento de la
variación en la respuesta.
Como se puede apreciar en el Cuadro VII, el coeficiente de determinación es cercano a
0,90. Según Çam y Aaby (2010) y Soto (2014), valores de R2 mayores a 0,90 o cercanos a
este valor indican que el modelo es capaz de explicar un alto porcentaje de las variaciones
de los resultados experimentales obtenidos. Además, se puede apreciar que el R2 y el R2-adj
resultan estar cercanos entre sí, lo cual indica que todos los términos utilizados en la
construcción del modelo fueron necesarios para construir el modelo correcto (Soto, 2014).
Según Kopper (2012), la probabilidad del modelo está asociada al valor de F de Fisher, el
cual compara la varianza debida a la regresión corregida por el promedio con la varianza
del residuo. Este valor representa la probabilidad de que ambas variables sean iguales, es
decir, de que el modelo no explique los datos más que el cálculo del promedio; y se busca
que sea pequeña, generalmente menor a 0,05.
53
De acuerdo con el Cuadro VI, los resultados obtenidos para Re se encontraron dentro de un
rango de (7,367-9,732) g/100 g BS. Además, el R2 del modelo fue de 85 % y la
probabilidad de la regresión fue significativa pues p = 0,0052. Según Soto (2014), un R2 a
partir de 85 % se considera aceptable, indicando que el modelo de la regresión explicó bien
los cambios observados.
La probabilidad de la falta de ajuste, está asociada al valor de F de Fisher que compara la
varianza de la falta de ajuste con la varianza del error experimental. Esta representa la
probabilidad de que las dos varianzas sean iguales, es decir, que la falta de ajuste del
modelo sea igual al error experimental; y se busca que sea lo más alta posible (Vaillant,
2011; Kopper, 2012). En este caso, se observa que el modelo generado presentó una falta
de ajuste (p < 0,05), por lo cual resultó de vital importancia analizar en conjunto los otros
parámetros (R2, R2-adj, p y distribución de residuos) para evaluar la adecuación del modelo.
El análisis de la gráfica de residuos contra los valores predichos para el rendimiento de
extracción de aceite (Figura 10) muestra una distribución aleatoria de los residuos, lo que
indica que el modelo es adecuado para predecir (Myers et al., 2009; Soto, 2014).
54
Figura 10. Gráfica de los residuos contra los valores predichos del modelo generado
para el rendimiento de extracción de aceite.
A continuación, se presenta la ecuación correspondiente al modelo generado para el
rendimiento de extracción del aceite, en la cual únicamente se incluyen los coeficientes de
los parámetros que resultaron significativos (p < 0,05). Ver análisis de varianza en el
cuadro A.IV de la sección de anexos.
𝑅𝑒 = 7,9805 + 0,6438 ∗ 𝑅𝑑𝑠 + 0,1879 ∗ 𝑅𝑑𝑠2 + 0,2479 ∗ 𝑇2 − 0,1361 ∗ 𝑇 ∗ 𝑅𝑑𝑠 (3)
Se encuentra que el factor Rds afecta significativamente el Re en términos lineales y
cuadráticos, además que se presentó una interacción negativa entre los efectos lineales de
los dos factores estudiados. Esto implica que con un aumento de los valores de Rds se
produce un aumento en rendimiento, en tanto que al aumentar la temperatura el rendimiento
es menor. En el caso de la temperatura, su efecto cuadrático fue el único que resultó
significativo.
Analizando lo anterior, se observa que el factor que ejerció mayor efecto en el rendimiento
del aceite extraído fue la Rds. En cuanto a los términos cuadráticos, la temperatura de
extracción tiene mayor efecto en la variable respuesta que la Rds, y la interacción entre los
factores lineales estudiados afecta negativamente el rendimiento del aceite.
55
En la Figura 11, se presenta la superficie de respuesta que muestra el efecto de la Rds y la
temperatura en el rendimiento de extracción del aceite obtenido del subproducto de mora
seco, la cual evidencia un aumento en la variable respuesta conforme se aumentó la Rds y la
temperatura, dentro de las condiciones experimentales evaluadas.
Este comportamiento coincide con lo esperado, debido a que cuando se aumenta la
temperatura, disminuye la viscosidad del aceite y aumenta la solubilidad en el disolvente
(Ataya 2010), que provocan que la velocidad de extracción aumente. Además, conforme
mayor sea la relación Rds mayor capacidad de extracción va a presentar el IPA, ya que se
encuentra en mayor proporción respecto al subproducto de mora seco.
Figura 11. Superficie de respuesta del efecto de la Rds y la temperatura sobre el Re del
aceite de semilla de mora con IPA.
A partir del modelo presentado en la Ecuación 3, se determinaron dos zonas óptimas (ver
Figura 11) donde se maximiza el Re del aceite: la primera se ubica en las coordenadas de
Rsd 5,8 g IPA/g sustrato y 39,7 ºC (a.); en tanto, que la otra zona óptima se encuentra en las
coordenadas 6,0 g IPA/ g sustrato y 60 ºC (b.).
56
Ambos puntos óptimos fueron elegidos para realizar la validación del modelo en el
laboratorio, que se llevó a cabo por triplicado para cada punto, y los resultados obtenidos se
compararon con los valores predichos tal y como se aprecia en el Cuadro VIII.
Cuadro VIII. Comparación de los rendimientos de extracción de aceite en los puntos
óptimos obtenidos para la validación del modelo.
Puntos de
Validación
Rds
(g/g)
T
(ºC)
Re (g aceite/100 g sustrato)
Valor predicho Valor experimental
Promedio IC
inferior
IC
superior Promedio
IC
inferior
IC
superior
a 5,8 39,7 9,23 8,96 9,50 9,17 8,86 9,34
b 6,0 60,0 9,49 8,77 10,21 9,66 9,46 9,74
IC: Intervalo de confianza. n = 3
Como se muestra en el cuadro VIII, en ambos puntos los valores experimentales coinciden
con los valores predichos por el modelo para el Re, lo cual indica que el modelo permite
predecir el porcentaje de extracción del aceite de mora con un nivel de confianza del 95 %
y se decide elegir las condiciones de extracción obtenidas en el punto a, tomando como
principal factor de decisión la temperatura de extracción. Según Wakely y Wan (2003),
durante la extracción con disolventes debe existir un control cuidadoso de la temperatura
para mantener la calidad de la proteína en la torta (en el caso de la soya), minimizar el daño
del aceite, maximizar la extracción del mismo y disminuir las pérdidas por la evaporación
del disolvente. Es importante mencionar, que una temperatura de extracción menor permite
un ahorro energético considerable.
5.1.6 Proceso de separación del aceite extraído
En esta parte, se evaluó y desarrolló el método de separación del aceite del extracto
isopropílico mostrado en la Figura 8, aprovechando las características de solubilidad del
disolvente. El IPA puro (> 95 %) disuelve de manera satisfactoria los lípidos presentes en
el subproducto de mora seco pero, según Ataya (2010), conforme se adiciona agua al
extracto IPA:aceite, la afinidad del aceite por el disolvente disminuye lo que genera una
separación efectiva de ambas fases. Sin embargo, no se esperaba que al adicionar el agua se
formara una emulsión, debido a la presencia de compuestos emulsionantes, que pueden ser
de naturaleza proteica.
57
Como previamente se mencionó, durante la extracción el IPA no sólo solubiliza el aceite,
sino también proteínas, fosfolípidos, azúcares y polifenoles presentes en la matriz. Es
importante recalcar que las proteínas presentan propiedades emulsificantes, debido a la
distribución de los residuos cargados e hidrofóbicos en su superficie. Por ello, el extracto
obtenido presenta una coloración morada y parte del aceite extraído se encuentra
emulsionado.
Según Soto (2014), el subproducto de mora seco contiene un (4,3 ± 0,4) g/100 g BS de
proteínas, valor que se encuentra cercano a lo reportado por Bushman et al. (2004) (6–7
g/100 g BS) para semillas de diferentes especies del género Rubus.
Según Kumar et al. (2003), la adición de disolventes orgánicos induce la separación de
algunas proteínas, producto de una disminución media en la constante dieléctrica, lo cual
disminuye el poder solvatante del agua sobre las proteínas cargadas e hidrofílicas; por esto,
la solubilidad de la proteína disminuye y se genera su precipitación. No obstante, al
adicionar agua al extracto isopropílico se generó una emulsión de apariencia lechosa, en
lugar de producirse la precipitación de las proteínas. Cabe resaltar que es posible que las
proteínas de la mora estuvieran solubilizadas en el IPA, y que al adicionar agua se generó
un cambio en la constante dieléctrica del medio y disminuyó la solubilidad del aceite,
propiciando la formación de una emulsión entre el aceite y el azeótropo debido a la acción
de las proteínas.
Según Kumar et al. (2003), un número considerable de grupos hidrofóbicos residen en la
superficie de algunas moléculas de proteínas, y que de estos grupos depende la solubilidad
de la molécula. Dicha propiedad puede ser cambiada drásticamente con las características
del disolvente, causando la precipitación de la proteína fuera del medio. Entre los agentes
que provocan la precipitación de las proteínas se incluyen: aniones y cationes inorgánicos,
por efecto del salado; y ácidos o bases, por precipitación isoeléctrica. Además, disolventes
orgánicos, como etanol, acetona, metanol y n-propanol; y polímeros no iónicos como los
polielectrolitos, junto al calor y el pH, también inducen la precipitación de algunas
proteínas.
58
Según Kumar et al. (2003), a pesar que el método más común para la precipitación de
proteínas consiste en la adición de sal, a bajas concentraciones de sal la solubilidad de las
proteínas usualmente incrementa, pero a altas concentraciones la solubilidad de las
proteínas disminuye bruscamente. La adición de sal en altas concentraciones disminuye las
repulsiones electrostáticas entre los grupos cargados de forma similar en la superficie de la
molécula y desestabiliza la estructura de las moléculas de agua alrededor de la proteína.
Los iones de sal compiten con las globulinas por el agua, y eventualmente y con
concentraciones suficientemente altas, despoja a estas de la capa acuosa.
Otro método empleado para la de precipitación de las proteínas consiste en modificar el pH
de la disolución; donde el efecto se debe a los diferentes puntos iónicos de la molécula de
proteína. En el punto isoeléctrico (pI) es donde la carga iónica neta de una proteína es cero,
las repulsiones electrostáticas son mínimas y se produce la formación de agregados debido
a que predominan las interacciones hidrofóbicas. Por ello, cuando se alcanza el pI en una
proteína, su solubilidad en el medio es mínima. Es importante mencionar que el pI es
diferente para diferentes proteínas, pero la mayoría de estas tienen valores pI muy cercanos
y en un rango de pH de 4 a 5. También, en una mezcla de diferentes proteínas, con
propiedades similares, estas coprecipitan y forman agregados (Kumar et al., 2003).
Por ello, se decidió evaluar la modificación del medio emulsionante por cambios en el valor
de su pH o por un aumento en la concentración iónica del medio. El pH se ajustó con una
disolución de NaOH a un valor de 5, que busca alcanzar el punto isoeléctrico (pI) de las
proteínas y donde su solubilidad es mínima. El aumento de la concentración iónica se
efectuó mediante la adición de NaCl al medio en dos concentraciones. El resultado de los
tratamientos realizados para evaluar la separación de la emulsión se detalla en el Cuadro IX.
Cuadro IX. Rendimientos de extracción* de aceite con diferentes tratamientos de
separación de proteínas para evaluar la separación del aceite (n=1).
Tratamiento Recuperación del aceite
(g/100 g BS)
Testigo (pH 4,1) 5,16
pH 5 5,79
NaCl
(% m/v)
1 5,13
5 5,77
*Realizada bajo condiciones de extracción óptimas: t=45 min, Rsd: 5,8 g IPA/g sustrato y T= 39.9 ºC
59
Como se aprecia en la Figura 12, al modificar el pH a un valor de 5 se genera un
precipitado blanco en el fondo del tubo, el cual corresponde a las proteínas que provocan la
emulsión entre la fase acuosa y lipídica dificultando la separación del aceite. En este caso,
se obtuvo una mayor recuperación de aceite que con los tratamientos con sal, con una
apariencia visual más clara y limpia.
Figura 12. Separación de las proteínas (precipitado blanco) con diferentes
tratamientos, testigo a pH 4,1 (derecha) y ajuste a pH 5,0 (izquierda).
De los tratamientos restantes, la adición de NaCl al 1 % m/v no propició la separación de
fases en la emulsión. Por otro lado, la disolución al 5 % m/v de NaCl generó una
precipitación de las proteínas al igual que el ajuste del pH de la emulsión a un valor de 5.
Como resultado de la evaluación, se escogió el ajuste del pH a 5 como método de
separación del aceite de mora, por encima de la adición de la disolución del NaCl al 5 %
m/v. Según O’Brien (2009), lo anterior se debe a que no solo se precipitan las proteínas con
la adición de NaOH, sino también ácidos grasos libres, fosfolípidos y demás impurezas,
obteniéndose un aceite más puro y estable ante eventuales procesos de oxidación. Es
importante mencionar que el uso de sal para la separación de las proteínas dificulta la
posible recuperación del disolvente.
60
5.2 Características fisicoquímicas y de calidad del aceite de mora
En este apartado se evaluaron las propiedades del aceite del subproducto de mora extraído
con las condiciones óptimas seleccionadas a partir del modelo obtenido de la superficie de
respuesta y etapa de separado o partición siguiendo el proceso desarrollado en la Figura 8.
5.2.1 Análisis fisicoquímico del aceite de semilla de mora
En el mercado existe gran variedad de aceites obtenidos a partir de distintas matrices, y las
características fisicoquímicas de dichos aceites se encuentran documentadas y partir de
ellas se conocen sus propiedades funcionales y sus posibles usos comerciales. En el cuadro
X se presentan los principales parámetros fisicoquímicos de algunos aceites importantes a
nivel industrial y nutricional.
Cuadro X. Parámetros fisicoquímicos que caracterizan a diferentes aceites.
Aceite Principal composición de
ácidos grasos (g/100 g)
Índice
refracción2
Índice de yodo
(cg I2/g TAG)
Índice de
Saponificación
(mg KOH/g TAG)
Uva
Linoleico 58,0-78,0
1,483 130-138 188-194 Oleico 12,0-28,0
Palmítico 5,5-11,0
Esteárico 3,0-6,0
Soya
Linoleico 50,0-57,0
1,476 118-139 189-195 Oleico 18,0-28,0
Palmítico 9,0-13,0
α-Linolénico 5,5-9,5
Linaza
α-Linolénico 52,0-58,0
1,482 170-203 188-196 Oleico 18,0-20,0
Linoleico 17,0
Oliva
Oleico 55,0-83,0
1,469 75-94 184-196 Palmítico 7,5-20,0
Linoleico 9,0
Coco
Laúrico 45,0-51,0
1,457 5-13 248-265 Mirístico 17,0-21,0
Palmítico 7,8-10,2
Oleico 5,4-9,9
Mora*
Linoleico 67,90
1,4742 ±
0,00032 159,51 189,0 ± 1,52 Oleico 12,36
α-Linolénico 10,75
Palmitico 4,12
Fuente: Lide (2008), *Presente estudio, 1n = 1, 2n = 2.
61
Tal y como se aprecia en el cuadro X, los aceites comerciales de diversas matrices
presentan características fisicoquímicas diferentes, las cuales se encuentran estrechamente
relacionadas con sus componentes mayoritarios. La información mostrada en este cuadro se
utilizará más adelante para analizar los parámetros fisicoquímicos del aceite de mora (R.
adenotrichos) obtenidos en el presente estudio.
Como se ya se ha mencionado, los aceites de semillas de uva y bayas son utilizados con
propósitos alimentarios y cosméticos, debido a que contienen ácidos grasos y otros
compuestos bioactivos, incluyendo vitaminas y antioxidantes, que agregan a sus
propiedades tecnológicas beneficios para la salud (Lampi y Heinonen, 2009). Es por esto,
que resulta de vital importancia conocer las propiedades fisicoquímicas y la composición
del aceite de mora extraído con IPA, ya que los componentes que puedan estar presentes en
el aceite son particulares debido a las propiedades del disolvente empleado en la extracción.
En el Cuadro XI, se exponen los resultados experimentales de los principales parámetros
fisicoquímicos del aceite semilla de mora variedad Rubus adenotrichos.
Cuadro XI. Características fisicoquímicas del aceite de mora extraído con isopropanol
(1n=1, 2n=3).
Parámetro Valor experimental
Densidad (g/mL) 0,9223 ± 0,00042
Humedad y materia volátil (g/100 g) 0,332 ± 0,0082
Polifenoles totales (mg AG/100 g) 2,281
Tocoferoles totales (mg/g) 46,861
Clorofila a (mg/g) 104,151
Clorofila b (mg/g) 15,901
Parámetros de color
L* 3,1 ± 0,12
a* 4,5 ± 0,32
b* 3,9 ± 0,22
TAG: Triacilglicerol, AG: Ácido gálico.
Según Ku y Mu (2008), un índice de yodo entre 130-200 cg I2/g TAG refleja que el aceite
tiene un alto grado de insaturaciones, una baja resistencia a la oxidación y menor vida útil;
además, implica la presencia de ácidos grasos polinsaturados, lo cual conlleva una relación
cercana entre este valor y la composición de ácidos grasos del aceite. Lo descrito
anteriormente, se respalda con los datos mostrados en el cuadro X, donde los aceites que
presentan un valor de índice de yodo mayor (aceite de linaza, uva y soya), son los que
62
exhiben una composición mayoritaria de ácidos grasos polinsaturados (linoleico y α-
linolénico), seguidos del aceite de oliva (compuesto principalmente por ácido oleico) y por
último el aceite de coco conformado por ácidos grasos saturados (laúrico y mirístico).
En comparación con el aceite de frambuesa (Rubus idaeus L.) [(152,6 ± 0,3) cg I2/g TAG]
(Sucurovic et al., 2009) y el aceite de las semillas de bobjunka (Rubus coreanus) (187,1 cg
I2/g TAG) (Ku y Mu, 2008), el índice de yodo del aceite de mora se encuentra entre los
valores de ambas variedades; esto aunado a lo descrito anteriormente indica que el aceite
obtenido de la variedad R. adenotrichos es un aceite con un alto nivel de insaturación.
Adicionalmente, el índice de yodo se relaciona directamente con la densidad del aceite,
pues la densidad de un aceite va a ser mayor conforme aumenta el grado de insaturaciones.
En comparación con el aceite de semillas de frambuesa reportado por Sucurovic et al.
(2009), ambos aceites presentan densidades muy similares a 20 ºC [(0,9263 ± 0,0001)
g/mL].
Como se puede apreciar, el índice de saponificación del aceite de mora (R. adenotrichos),
resulta ser un poco menor que el reportado para el aceite de semillas de frambuesa (R.
idaeus L.) y de bobjunka (R. coreanus), cuyos valores corresponden a (191 ± 0,1) mg
KOH/g TAG (Oomah et al., 2009) y (197,7 ± 4,6) mg KOH/g TAG (Ku y Mu, 2008)
respectivamente. Dichos valores son muy similares y se puede concluir que se encuentran
compuestos por ácidos grasos de cadena larga principalmente. Además, este índice es
también muy parecido al que muestran los aceites de uva, linaza, soya y oliva.
El índice de refracción reportado para el aceite de frambuesa (R. ideaus L.) a 25 ºC de
(1,4792 ± 0,0001) (Sucurovic et al., 2009), resulta muy similar al del aceite de mora. El
índice de refracción es un parámetro fisicoquímico que permite la identificación de las
sustancias, ya que todas poseen un valor particular y diferente asociado a su composición
química. Además, este es otro valor que se relaciona directamente con el número de
insaturaciones presentes en los ácidos grasos del aceite, ya que conforme aumenta el índice
de yodo en un aceite su índice de refracción aumenta. Dicha aseveración se respalda con los
datos mostrados en el cuadro X, donde el aceite de coco, que es el que presenta un menor
63
índice de yodo es el que muestra un índice de refracción levemente menor que los demás
aceites, mientras que aceites como el de uva y linaza son los poseen valores de índice de
refracción mayores a los demás.
Según Sucurovic et al. (2009), el contenido de humedad del aceite de frambuesa (R. ideaus
L.) es de menos de 0,10 g/100 g. Si se compara con el valor obtenido para el aceite de
mora, se consideran similares, tomando en cuenta que la extracción se realizó con IPA y,
debido a su polaridad intermedia, se pudo haber obtenido un aceite con un contenido de
humedad alto si se compara con el valor fijado como límite máximo según el RTCA
(2005), que corresponde a 0,10 g/100 g. Es importante mencionar que en este caso se
determinó el contenido de humedad junto con el de materia volátil, por lo que no se puede
asegurar que el valor determinado corresponda únicamente a agua.
Respecto al contenido de polifenoles, aceites extraídos mediante prensado en frío como el
de semillas de frambuesa roja (R. ideaus L.) y negra (R. occidentalis L.) presentan valores
de (58,10 ± 0,58) mg AG/g y (44,60 ± 0,52) mg AG/g respectivamente (Bushman et al.,
2004), cantidades muy superiores a los obtenidos en el aceite de mora. En este caso los
polifenoles presentan propiedades antioxidantes, pero son hidrosolubles y resultan más
afines al IPA, separándose completamente del aceite.
Por su naturaleza, los aceites de semillas de bayas presentan altos contenidos de
tocoferoles, y se ha encontrado una mayor cantidad de tocoferoles extraídos con hexano de
las semillas de frambuesa (970 µg/g aceite) comparado con la extracción por prensado en
frío (610 µg/g aceite). Esto se explica por la presencia de contaminantes no lipídicos de la
operación de prensado en frío, pues diluyen los tocoferoles en el aceite extraído (Lampi y
Heinonen, 2009). Es importante mencionar que los tocoferoles son afines a disolventes no
polares como el hexano.
Bushman et al. (2004), analizó el contenido tocoferoles totales en el aceite de cinco
variedades del género Rubus spp. Reportó que en el aceite de frambuesa (R. ideaus L.), el
contenido de tocoferoles totales fue de (33,000 ± 0,027) mg/100 g (es decir, 0,33 mg/g), un
valor que excede la cantidad encontrada en muchos granos de cereales y nueces.
64
En contraparte, el contenido de tocoferoles totales encontrado en el aceite de mora (46,86
mg/g), se encuentra muy por encima de este valor reportado para el aceite de frambuesa.
Según Oomah et al. (2000), los aceites con un alto contenido de tocoferoles pueden
prevenir enfermedades degenerativas; además, que son un factor que aumenta la estabilidad
oxidativa del aceite.
Se cuantificó en el aceite de mora un contenido de clorofilas totales de 120,05 mg/g, que
resulta ser un valor alto, si se parte de que, según Dimic et al. (2012), los aceites extraídos
con hexano, de semillas de mora (Rubus fructicosus L.) presentan un contenido de
clorofilas de 3,05-3,09 mg/g y el de semillas de frambuesa (R. idaeus L.) de 0,20-0,21
mg/g. Esta concentración tan alta de clorofilas se atribuye a la variedad las semillas de
mora utilizadas, ya que según Belitz et al. (2009), las clorofilas son lipofílicas gracias a la
presencia en su molécula del grupo fitol. Aunque se conoce que la clorofila b es más
soluble en disolventes ligeramente polares como el isopropanol, en el cuadro XI se puede
observar que el aceite de mora extraído presenta mayor contenido de clorofila a.
Oomah et al. (2000), menciona que el contenido de clorofilas provoca en el aceite un color
indeseable y promueve la oxidación de este, especialmente en presencia de la luz. Pero en
contraparte el contenido de clorofila se asocia con la presencia de magnesio, considerado
como un elemento vital para el cuerpo humano debido a su acción como componente y
activador de sistemas enzimáticos que producen fosfatos ricos en energía como el ATP,
ADP y AMP (Herrera et al., 2005).
Al determinar el color en el aceite de mora mediante la escala CIE L*a*b*, se obtuvieron
valores para los tres parámetros relativamente bajos. El aceite de mora presentó un valor de
L*, que indica la luminosidad de 3,1, en tanto que los aceites analizados por Dimic et al.
(2012), presentan valores de L* entre 16,84 - 16,94 para el aceite de mora (R. fructicosus
L.) y de 20,23 - 20,43 para el aceite de frambuesa (R. idaeus L.). Los valores bajos de L*
coinciden con la apariencia oscura del aceite, probablemente asociada con el contenido de
clorofilas anteriormente mencionado.
65
En relación con los parámetros a* y b*, el aceite de mora extraído con IPA presenta valores
de 4,5 y 3,9 respectivamente (ver cuadro XI). Si se compara con los aceites analizados por
Dimic et al. (2012), para el parámetro a* el aceite de mora (R. fructicosus L.) presenta
valores de 2,30-2,32; mientras que el aceite de frambuesa (R. idaeus L.) presenta valores
entre 3,23-3,63. Adicionalmente, para b* el aceite de mora presenta rangos de 0,90-0,99, en
tanto que para el aceite de frambuesa se reportan valores de 6,99-7,01.
Se puede afirmar que el aceite de mora (R. adenotrichos) presenta un color más rojo que los
otros aceites comparados, pero el aceite de frambuesa presenta una tonalidad más amarilla.
Los resultados también pueden estar influidos por las concentraciones de carotenoides, al
menos en el caso de a*, ya que estos compuestos presentan colores entre anaranjados y
rojos.
En cuadro XII, se muestra la concentración de los ácidos grasos de los principales en
diferentes aceites de género Rubus spp.
Cuadro XII. Composición de los principales ácidos grasos que componen los
triacilgliceroles del aceite de semilla de mora de diferentes especies determinados por
espectrometría de gases.
Ácido graso Contenido (g/100 g)
R. adenotrichos1 R. idaeus L.2 R. occidentalis L.2 R. coreanus3
Palmítico 16:0 4,12 2,4 1,9 1,55
Esteárico 18:0 2,64 0,9 0,8 0,65
Oleico 18:1(9) 12,36 - 0,1 8,04
Linoleico 18:2(9,12) 67,90 54,2 53,5 53,18
α-Linolénico 18:3(9,12,15) 10,75 29,7 31,2 29,36
Araquídico 20:0 1,19 0,4 0,4
Relación linoleico:linolénico 6,3:1 1,8:1 1,7:1 1,8:1
Fuente: 1 Presente estudio; 2 Bushman et al. (2004); 3 Ku y Mu (2008)
Los principales ácidos grasos que componen el aceite de semilla de mora (R. adenotrichos)
son el oleico, linoleico y linolénico, que corresponden a un 91 % del total del aceite,
composición muy similar a la del aceite de frambuesa (R. idaeus L.), el cual está
conformado por un 96 % de los ácidos grasos mencionados (Oomah et al., 2000). Cabe
mencionar que el aceite de frambuesa presenta un contenido de ácido linoleico similar al
del aceite de nuez (56-59 %), mientras que el aceite de mora (R. adenotrichos) presenta
66
aproximadamente un 68 %. Es importante recalcar que los demás aceites muestran
contenidos de ácidos linoleico y linolénico muy similares.
Al comparar la composición de los aceites de diferentes semillas del género Rubus spp. en
el Cuadro XII, se observa que el aceite de mora evaluado en esta investigación es el que
presenta mayor contenido de ácidos saturados, ácido oleico y ácido linoleico, y menor
contenido de ácido linolénico con respecto a los demás aceites referidos. Sin embargo, el
contenido de ácidos grasos polinsaturados del R. adenotrichos (78,65 %), es muy similar al
que presentan los aceites del género Rubus mostrados en el cuadro anterior. Según
Sucurovic et al. (2009), el aceite de semillas de frambuesa (R. ideaus L.) presenta un
contenido de ácidos grasos polinsaturados de 78,75 % que se considera como buen
nutriente. Sin embargo, un alto contenido de ácidos grasos polinsaturados provoca una baja
estabilidad del aceite, por su tendencia a sufrir reacciones de deterioro.
Sí se observa la relación de los ácidos grasos linoleico y linolénico, el aceite de mora (R.
adenotrichos) presenta un valor por encima de 6:1, el más alto en comparación con los
demás aceites, los cuales presentan relaciones menores a 2:1. Como menciona Okuyama
(2009), la mayoría de aceites vegetales presentan relaciones en exceso de 6:1, asociadas al
padecimiento de enfermedades coronarias, mientras que aceites con relaciones 2:1 son
considerados beneficiosos.
Soto (2014), obtuvo para el aceite de mora (R. adenotrichos) una relación de los ácidos
grasos linoleico y linolénico correspondiente a 3,6:1. Dicha diferencia con el aceite
analizado se puede atribuir a diferentes lotes de semillas de mora provenientes de
plantaciones sometidas a condiciones climáticas distintas e inclusive al uso de hexano como
disolvente en lugar de IPA.
5.2.2 Análisis de calidad del aceite de semilla de mora
El cuadro XIII, se muestran los valores para los diferentes parámetros de calidad evaluados
en el aceite extraído de semilla de mora (Rubus adenotrichos), utilizando IPA como
disolvente.
67
Cuadro XIII. Características de calidad del aceite de semilla de mora extraído con
isopropanol (n=3).
Parámetro Valor experimental
Índice de acidez (mg KOH/g TAG) 2,00 ± 0,01
Índice de peróxidos (mEq peróxidos/kg TAG) 0,3 ± 0,6
Coeficientes de extinción
(mL/g cm)
K232 2,5714 ± 0,0008
K270 0,885 ± 0,001
Cuando un aceite presenta un índice de acidez bajo (menor a 3,98 mg KOH/g TAG), su
calidad es mayor y las pérdidas por refinamiento disminuyen. Como se puede apreciar en el
Cuadro XII, el aceite de mora analizado presentó aproximadamente un índice de acidez de
(2,00 ± 0,01) mg KOH/g TAG. Por otra parte, el aceite de semillas de frambuesa (R. idaeus
L.) contiene (1,32 ± 0,01) % de ácidos grasos libres expresados como ácido oleico (2,62 mg
KOH/g TAG), el cual es considerado bajo ya que, según los estándares de calidad, los
aceites no refinados pueden tener un 2 % de ácidos grasos libres expresados como ácido
oleico (3,98 mg KOH/g TAG) (Sucurovic et al., 2009). Además, Dimic et al. (2012)
reporta para el aceite de R. fructicosus L. un índice de acidez de (6,85 ± 0,11) mg KOH/g
TAG. Por tanto, se puede asumir que el aceite de semilla de mora (R. adenotrichos) es más
estable y de mejor calidad que los demás.
No se detectaron peróxidos en el aceite de mora fresco (R. adenotrichos), lo cual podría
deberse al alto contenido de tocoferoles que presenta. Según lo reportado para el aceite de
frambuesa (R. idaeus L.) por Oomah et al. (2000), su índice de peróxidos es de 8,25 mEq
peróxidos/kg TAG, en tanto que Dimic et al. (2012) reportan para el aceite de R.
fructicosus L un contenido de (8,89 ± 0,12) mmol peróxidos/kg TAG (4,45 mEq
peróxidos/kg TAG). Es importante mencionar que estos aceites se encuentran por debajo
del valor recomendado para aceites vegetales, que debe ser menor a 10 mEq peróxidos/kg
TAG (Oomah et al., 2000).
El coeficiente de extinción K232 está relacionado con el grado primario de oxidación de un
aceite, por lo que se puede correlacionar directamente con la cantidad de peróxidos.
Además, el K232 es también indicador de la conjugación de los ácidos grasos
68
polinsaturados, mientras que el K270 está relacionado con los productos secundarios de
oxidación. Los dienos conjugados, representados por el coeficiente K232, se correlacionan
directamente con altos contenidos de ácido linolénico (Oomah et al., 2000).
El aceite de las semillas de bobjunka (R. coreanus) presenta un K232 de 2,48 mL/g cm y un
K270 de 0,64 mL/g cm, mientras que Oomah et al. (2000) indican que el aceite de
frambuesa (R. ideaus L.) tiene un K232 de (0,8370 ± 0,0003) mL/g cm, y en donde los
trienos no fueron detectados. Como se puede apreciar en el cuadro XIII, los coeficientes de
extinción del aceite de mora son muy similares a los del aceite de bobjunka (R. coreanus),
pero resultan mucho mayores si se comparan con los resultados mostrados para el aceite de
frambuesa (R. idaeus L.). Lo anterior, aunado a los resultados mostrados en el cuadro XII
nos indican que el aceite de mora presenta un mayor índice K232 el cual podría asociarse a
un alto contenido de carotenoides, ya que los aceites de bobjunka y frambuesa presentan
mayores contenidos de ácido α linolénico (similares entre sí) que el aceite en cuestión.
Cabe resaltar que, si se observa el índice de peróxidos, el que presenta el aceite de
frambuesa es mayor al del aceite de mora (R. adenotrichos), lo cual nos muestra que no se
puede juzgar el grado de deterioro de un aceite únicamente con los valores de los índices
K232 y K270, ya que como se ha mencionado en varias ocasiones compuestos como los
carotenoides y el ácido linolénico también absorben a estas longitudes de onda.
Según Lalas (2008), la magnitud de cambio en dichos coeficientes no se puede relacionar
fácilmente con el grado de oxidación, pero los cambios en el espectro ultravioleta que se
presentan en una muestra de aceite a través del tiempo pueden ser usados como indicadores
relativos de oxidación.
Según Yildirim (2009), la Comisión de la Unión Europea establece como valores máximos
de los coeficientes de extinción K232 y K270 a 2,50 mL/g cm y 0,20 mL/g cm,
respectivamente para el aceite de oliva. Se considera que estos valores no pueden ser
determinantes en el caso del aceite de mora ya que el aceite no contiene peróxidos y
además, presenta altos porcentajes de ácido linolénico.
69
Tiempo (h)
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300
Índ
ice d
e p
eróxid
os
(mE
q P
eróxid
os/
kg
TA
G)
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
5.3 Evaluación de la estabilidad oxidativa del aceite
La prueba de estabilidad de Schaal en estufa, es un método utilizado para simular el tiempo
real de envejecimiento de los aceites comestibles. Se ha encontrado una buena correlación
de los resultados obtenidos por este método con los estudios de estabilidad en tiempo real.
En la literatura, múltiples autores han mostrado que los parámetros de oxidación medidos
durante el envejecimiento del aceite a 60 ºC y a una temperatura cercana a la temperatura
ambiente se encuentran ligados linealmente (Douny et al., 2016).
La prueba de Schaal, que se realiza a 60 ºC, es más confiable que las pruebas llevadas a
cabo a más altas temperaturas debido a que esta reproduce cambios similares en la
oxidación observados a la temperatura ambiental de almacenamiento. Debido al incremento
en la temperatura, la tasa de oxidación también aumenta, y por ello un día de
almacenamiento a estas condiciones (aproximadamente 60 ºC) es equivalente a un mes a
temperatura ambiente (Aparicio y Harwood, 2013).
En la Figura 13, se puede apreciar el comportamiento presentado por el índice de peróxidos
en el aceite de mora (R. adenoctrichos) durante su almacenamiento a 60 ºC, por un tiempo
de 265 horas.
Figura 13. Comportamiento de la oxidación del aceite de semilla de mora (R.
adenotrichos) expresado como índice de peróxidos y su desviación estándar durante
almacenamiento a 60 ºC (n=3).
70
Como se ha mencionado, la oxidación de los aceites está influenciada por la energía de
reacción, el contenido de ácidos grasos, el tipo de oxígeno y componentes minoritarios
como metales, pigmentos, fosfolípidos, ácidos grasos libres, mono y diglicéridos,
compuestos térmicamente oxidados y antioxidantes. Todos estos compuestos pueden estar
presentes en el aceite de mora debido a la polaridad del IPA utilizado en su extracción.
Los productos primarios de la oxidación son los hidroperóxidos, que son relativamente
estables a temperatura ambiente y en ausencia de metales. Sin embargo, en presencia de
metales o altas temperaturas se descomponen rápidamente a radicales alcoxi y luego a
aldehídos, cetonas, ésteres, alcoholes e hidrocarburos de cadena corta (Choe et al., 2005).
Como se puede observar en la Figura 13, la formación de los peróxidos presenta un
aumento durante el almacenamiento a 60 ºC, y no se puede asegurar que el aceite haya
alcanzado el punto máximo de oxidación debido a que no se observó una disminución
notable en este parámetro.
Además, se observan dos tendencias claramente definidas, una etapa inicial donde se
aprecia una mayor rapidez de formación de los peróxidos hasta un tiempo de 100 horas;
posteriormente se aprecia una tendencia lineal, donde al parecer se mantiene constante la
concentración de los peróxidos.
En la Figura 14 se muestra el comportamiento de los coeficientes de extinción analizados
para el aceite de mora a 60 ºC.
Figura 13. Comportamiento de la oxidación del aceite de mora (R. adenotrichos)
expresado como dienos (K232) y trienos (K270) conjugados durante almacenamiento y
sus respectivas desviaciones estándar a 60 ºC (n=3).
Tiempo (h)
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300
Con
cen
tra
ció
n (
mL
/gcm
)
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
K232
K270
71
La formación de los compuestos primarios de oxidación ocurre inicialmente a una tasa muy
baja en aceites resistentes a este proceso, como en el caso del aceite de dátil donde después
de 40 días a 60 ºC, el coeficiente K232 pasó de 0,6 a 3,8 mL/g cm; adicionalmente, los
productos primarios de la oxidación no son estables a altas temperaturas y su degradación
puede promover la formación de productos secundarios que absorben a 270 nm (Besbes et
al., 2004).
Según lo descrito en el párrafo anterior, el aceite de mora se muestra como un aceite con
una baja resistencia a la oxidación, si sólo se consideran los altos valores del coeficiente
K232 obtenidos en un corto tiempo de almacenamiento (7,66 mL/g cm en 10 días).
Abou-Gharbia et al. (1996) indican que los valores de los índices de p-anisidina y de
peróxidos para un aceite de sésamo a 65 ºC por dos días fueron similares a los valores
obtenidos para el aceite almacenado a 22 ºC por dos meses. De forma similar, el aceite de
soya y de algodón presentan una evaluación de sabor y olor similar después de 4 días de
almacenamiento a 60 ºC y 4 meses a 26 ºC. Autores como Khan y Shahidi (2001), han
planteado que la oxidación o envejecimiento de un aceite un día a 65 ºC, es equivalente al
envejecimiento del mismo aceite durante un mes a 25 ºC. Por lo tanto, esta relación
encontrada en estos casos sugiere que los resultados obtenidos en la oxidación del aceite a
60 ºC durante un corto tiempo de experimentación puede emplearse para estimar el tiempo
real de oxidación del aceite a temperatura ambiente (Douny et al., 2016).
En la figura 15, se muestra el comportamiento del índice de peróxidos en el aceite de mora
durante su almacenamiento a 20 ºC.
En la figura 15 se observa que el valor del índice de peróxidos se mantiene muy bajo y
cercano a cero, durante los primeros 30 días de almacenamiento, lo cual es conocido como
período de inducción. Luego, entre el día 30 y 40 ocurre un aumento exponencial en la
rapidez de generación de los peróxidos hasta alcanzar el valor máximo permitido en el día
110 (10 mEq peróxidos/kg TAG). Entre los días 50 y 110 de la evaluación se aprecia que el
índice de peróxidos aumenta de 4,64 a 9,95 mEq peróxidos/kg TAG, o sea que se duplica
en ese período.
72
Figura 14. Comportamiento de la oxidación del aceite de semilla de mora (R.
adenotrichos) expresado como índice de peróxidos y su desviación estándar durante
almacenamiento a 20 ºC (n=3).
Si se compara el comportamiento de los peróxidos en el aceite a 20 ºC y a 60 ºC (Figura 13)
presentan tendencias muy diferentes, ya que en el aceite almacenado a 60 ºC los peróxidos
exhiben un comportamiento de aumento exponencial del tiempo 0 a las 100 h, que
posteriormente tienden a mantenerse en una concentración estable.
Además, se observa que después de un día de almacenamiento a 60 ºC ya el aceite supera el
límite máximo permitido de peróxidos (10 mEq peróxidos/kg TAG), en comparación con el
aceite almacenado a 20 ºC que alcanza el límite máximo permitido aproximadamente
después de cien días en almacenamiento. Por lo tanto, en el presente caso, no se puede
asociar la oxidación de un día a 60 ºC con la oxidación de un mes a 20 ºC en el aceite de
mora.
A continuación, en la figura 16, se muestra el comportamiento de los dienos y los trienos
conjugados del aceite de semilla de mora almacenados a 20 ºC durante 110 días. Se puede
observar que los dienos presentan un aumento de 2,57 mL/g cm al inicio, hasta un valor de
4,08 mL/g cm a los 110 días. Por otro lado, la concentración de trienos no muestra una
variación considerable a lo largo del tiempo y se mantuvo constante en valores alrededor de
1,0 mL/g cm.
Tiempo (días)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Índ
ice d
e p
eróxid
os
(mE
q P
eróxid
os/
kg
TA
G)
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
73
Figura 15. Comportamiento de la oxidación del aceite de mora (R. adenotrichos)
expresado como dienos (K232) y trienos (K270) conjugados y sus desviaciones estándar
durante almacenamiento a 20 ºC (n=3).
En el caso de los dienos conjugados se observa que tanto a 60 ºC y 20 ºC, muestran un
aumento (ver figura 15 y 16) donde a mayor temperatura la pendiente de los dienos
(m60 ºC = 0,022 > m20 ºC = 0,012), es decir, a una mayor temperatura aumenta la tasa de
generación de los dienos. Es importante recalcar que la concentración de trienos se
mantuvo constante en ambas temperaturas, lo que indica que los productos primarios de la
oxidación del aceite no se están transformando a productos secundarios en ninguna de las
dos temperaturas evaluadas.
De igual forma que el comportamiento del aceite de mora, Douny et al. (2016), encontraron
diferencias en los patrones de crecimiento de los parámetros de oxidación del aceite de
linaza dependiendo de la temperatura de almacenamiento. Observaron un crecimiento en
los parámetros de oxidación evaluados (índice de peróxidos y dienos conjugados), donde a
60 ºC el comportamiento incrementó de manera lineal mientras que a 20 ºC la tendencia fue
de forma exponencial. Además, los valores obtenidos para ambos parámetros fueron tres
veces más altos después de seis meses a 60 ºC que después de seis días a 20 ºC. Lo anterior,
lo explican debido a la baja estabilidad de los dienos y los peróxidos a temperaturas
elevadas, que se transforman rápidamente a los productos secundarios del proceso de
oxidación.
Tiempo (días)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Con
cen
tra
ción
(m
L/g
cm)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
K232
K270
74
Choe et al. (2005) mencionan que la oxidación de los aceites y la descomposición de los
hidroperóxidos, aumenta conforme la temperatura de almacenamiento aumenta. Sin
embargo, si se observan los valores obtenidos para el coeficiente K270 (Figuras 14 y 16), se
presenta un comportamiento constante, lo que puede significar que existe un efecto
antioxidante que no permite que los compuestos primarios de la oxidación se degraden a
compuestos secundarios. Es importante recalcar que un cambio no considerable en el K270
confirma la resistencia del aceite al proceso de oxidación, que puede estar asociado a la
presencia de antioxidantes como compuestos fenólicos, esteroles y tocoferoles (Besbes et
al., 2004).
Los antioxidantes son compuestos que extienden el período de inducción de la oxidación,
en el caso de los aceites. Estos compuestos inactivan los radicales libres, controlan la
transición de metales, aplacan el 1O2, e inactiva los sensibilizadores, por medio de la
donación de hidrógenos a los radicales libres para convertirlos en productos no radicalarios.
Los mejores compuestos donantes de hidrógenos son los compuestos monohidroxi o
polihidroxifenoles, compuestos por varios anillos sustituidos (Choe et al., 2005).
En el Cuadro XIV, se muestran el contenido de los distintos tocoferoles en el aceite de
semilla de mora antes y después del período de almacenamiento a 20 ºC.
Cuadro XIV. Variación del contenido tocoferoles en el aceite de mora (R.
adenotrichos) debido al tiempo de almacenamiento a 20 ºC.
Isómeros Concentración (mg/g) Porcentaje de
reducción (%) 0 días 110 días
δ-tocoferol 4,98 0,72 85,5
γ-tocoferol 21,53 1,64 92,4
α-tocoferol 20,35 13,46 33,9
Tocoferoles totales 46,86 15,82 66,2
En el cuadro XIV se puede apreciar la disminución en la concentración de los distintos
tocoferoles presentes en el aceite de mora, debida al período de almacenamiento de 110
días a 20 ºC, probablemente por su actividad antioxidante. Como ya se ha mencionado, los
tocoferoles son los antioxidantes más importantes presentes en los aceites, y su contenido
en el aceite varía según el cultivo, procesamiento y tipo de almacenamiento del aceite. Yi et
75
al. (2011), reportan que la concentración del α-tocoferol disminuye con el tiempo de uso en
la oleína de palma durante la operación de fritura, al mismo tiempo que disminuye la
generación de compuestos polares en el aceite.
Asimismo, se puede apreciar que inicialmente, el aceite de mora presenta una mayor
concentración del γ-tocoferol, seguido por el α-tocoferol y en una menor proporción del δ-
tocoferol. Una vez concluido el tiempo de almacenamiento a 20 ºC, las proporciones
variaron, conservándose mayor cantidad del isómero α. Cabe mencionar que el isómero γ
disminuyó en un 92,4 %, seguido por el δ en 85,0 % y por último el α con una disminución
del 34 % aproximadamente.
La degradación en mayor grado del γ-tocoferol coincide con lo descrito por Aladedunye y
Przybylski (2013), que evaluaron la estabilidad oxidativa del aceite de girasol con alto
contenido de ácido oleico (9,5 %) utilizado en fritura, donde el isómero γ, presente en
mayor cantidad (γ > α > δ) se degradó más rápidamente que los encontrados en menor
concentración. En el caso específico del α-tocoferol, este se conserva debido a su alta
estabilidad de resonancia donde el anillo aromático presenta la conformación más óptima
que los demás isómeros (Woollard y Indyk, 2003), como se puede apreciar en la Figura 17.
Figura 16. Estructuras de los tocoferoles presentes en el aceite de semilla de mora (R.
adenotrichos). Fuente: Papas (2006).
76
A continuación, se presenta el cuadro XV con valores de la actividad biológica para los
isómeros de los tocoferoles. A pesar de que los datos están relacionados con la actividad de
las vitaminas, se muestra que el isómero α es el que presenta un mayor valor que los demás
isómeros. Según Belitz et al. (2009), la máxima actividad del α-tocoferol se debe
principalmente a sus propiedades antioxidantes, que dificultan o impiden la peroxidación
lipídica.
Cuadro XV. Actividad biológica de los tocoferoles.
Tocoferol Actividad
(UI/mg)
Vitamina E comercial 1,00
α-tocoferol 1,50
γ-tocoferol 0,15
δ-tocoferol 0,01 Fuente: (Belitz et al., 2009). 1 mg = 1 UI, Vitamina E = acetato de α-tocoferol racémico.
Por otro lado, lo que conocemos como vitamina E comercial (sintética) consiste en una
mezcla de acetato de tocoferol racémico. El acetato de tocoferol consiste en el éster acético
del α-tocoferol, que le confiere más estabilidad para asegurar que cumpla su función
metabólica dentro del cuerpo humano.
Choe et al. (2005) mencionan que los tocoferoles compiten con los aceites polinsaturados
por los radicales peroxilo, ya que estos reaccionan más rápido (104-109 L mol-1 s-1) que el
lípido (10-60 L mol-1 s-1). Una molécula de tocoferol puede proteger aproximadamente 103-
108 de moléculas de ácidos grasos poliinsaturados. Los tocoferoles pueden transferir un
átomo de hidrógeno de los 6 grupos hidroxilo del anillo cromático eliminando los radicales
peroxilo, generando radicales tocoferoxilo, los cuales son más estables por sus estructuras
de resonancia que los radicales peroxilo. Además, se afirma la existencia de un efecto
sinérgico de los antioxidantes que puedan estar presentes en un aceite. Es por esto que se
puede suponer una posible disminución en el contenido de carotenoides y polifenoles en el
aceite durante el tiempo en el que fue almacenado.
Por último, el proceso de extracción del aceite de mora con IPA resulta con más
operaciones unitarias que un proceso de extracción de aceite con hexano, además sería
77
interesante llevar a cabo una comparación de costos en ambos procesos. A nivel funcional,
el aceite presenta sus ventajas debido a la presencia de compuestos antioxidantes
(tocoferoles E) que pueden resultar interesantes para los consumidores; sin embargo, a que
la relación de ácidos grasos polinsaturados que presenta no se considera beneficiosa para la
salud, y puede considerarse como una desventaja.
78
6 CONCLUSIONES
El subproducto industrial de mora evaluado se considera una materia prima
apropiada para la extracción de aceite debido a que contiene un (12,7 ± 0,6) g/100 g
BS.
El IPA es un disolvente que se puede considerar como una alternativa para la
extracción de aceites, pero su ligera polaridad implica un reto tecnológico en la
separación del mismo debido a los demás componentes de la mora (como proteínas,
polifenoles y clorofilas) que se solubilizan en el disolvente.
Se obtuvo que con una relación de disolvente/sustrato de 4,00 g IPA/g sustrato a
una temperatura de extracción 50 ºC, se alcanza la capacidad máxima de extracción
de aceite a los 75 minutos.
Se evidenció que las variables evaluadas: temperatura y Rds presentan un efecto
significativo sobre el porcentaje de extracción del aceite de mora. En el modelo
generado para la extracción del aceite ambas variables muestran un efecto positivo,
es decir, se obtiene mejor rendimiento de extracción conforme se aumenta Rds y la
temperatura de trabajo.
La optimización del proceso de extracción del aceite permitió seleccionar las
siguientes condiciones de operación: 5,8 g IPA/g sustrato y 37,9 ºC, para obtener
contenido de aceite de (9,101 ± 0,244) g/100 g BS.
El IPA extrae otros componentes de la semilla de mora, entre ellos proteínas que
forman una emulsión con el aceite cuando se agrega agua para su separación. Estas
proteínas precipitaron a un pH 5 facilitando su separación, lo anterior indica que el
pI de estas proteínas se encuentra cercano a ese valor de pH.
Se estima que el aceite obtenido del subproducto de mora tiene un nivel alto de
insaturaciones reflejado por un índice de yodo de 159,5 cg I2/g TAG, valor que
coincide con la densidad del aceite (0,9223 ± 0,0003) g/mL, el índice de refracción
(1,4742 ± 0,0003) y el contenido de los ácidos grasos: oleico (12,36 %), linoleico
(67,90 %) y linolénico (10,75 %).
79
El índice de saponificación del aceite de mora (189,0 ± 1,5) mg KOH/g TAG,
indica que presenta una composición alta en ácidos grasos de altos pesos
moleculares.
El contenido de clorofilas totales (120,05 mg/g) se relaciona estrechamente con el
resultado obtenido para de L* (3,1 ± 0,1) en la determinación de color.
El aceite de mora extraído presenta contenidos de polifenoles totales de 2,28 mg
AG/100 g, valor que se considera bajo en comparación con los aceites de género
Rubus encontrados en la literatura.
Se obtuvo un aceite con indicadores de calidad muy buenos: índice de acidez (2,00
± 0,01) mg KOH/g TAG e índice de peróxidos (0,3 ± 0,6) mEq peróxidos/kg TAG.
Los valores iniciales del contenido de dienos y trienos conjugados (2,5714 ±
0,0008) mL/g cm y (0,885 ± 0,001) mL/g cm respectivamente, no se puede asociar
al grado de oxidación, sino más bien un alto contenido de ácido linolénico y
carotenoides.
De acuerdo con los resultados de la prueba de estabilidad oxidativa efectuada al
aceite de mora, no se puede relacionar el grado de oxidación de un día a 60 ºC con
el de un mes a 20 ºC.
El aceite de mora almacenado a temperatura ambiente (20 ºC) presenta una
estabilidad oxidativa mayor a cien días (índice de peróxidos ≤ 10 mEq peróxidos/kg
TAG), que se puede relacionar directamente con el contenido constante de los
trienos conjugados y al efecto antioxidante de tocoferoles totales que presentan una
disminución en su contenido de 46,86 mg/g inicialmente a 15,82 mg/g en el día 110.
Falta incluir conclusión general sobre la calidad de aceite solicitada por Alicia
80
7 RECOMENDACIONES
Realizar un análisis de costos entre la extracción convencional con hexano y la
extracción con IPA para evaluar la factibilidad económica y rentabilidad del
proceso desarrollado.
Comparar las características fisicoquímicas y de calidad del aceite de mora extraído
con IPA y con hexano.
Evaluar la extracción del aceite del subproducto de mora con un disolvente que no
sea tan difícil de adquirir debido a su condición de precursor.
Evaluar la extracción mecánica por prensado en frío del aceite de las semillas de
mora como opción más amigable a la extracción con disolventes.
Aplicar una operación de refinamiento al aceite de mora extraído con IPA y evaluar
su estabilidad oxidativa a temperatura ambiente.
81
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91
9 ANEXOS
A.1. Determinación de la cinética de extracción del aceite de semilla de mora
utilizando IPA como disolvente.
Cuadro A.I. Datos empleados para la elaboración de la cinética de extracción del aceite de
mora con una Rds de 4,00 g IPA/g sustrato a 50 ºC, con agitación a 300 rpm.
Tiempo
(min)
Masa (g) Contenido aceite
(% m/m) Muestra Sólido Aceite
0 0 0 0 0
10 123,20 23,35 1,6336 6,9958
30 119,40 22,63 1,8679 8,2538
50 95,20 18,04 1,7166 9,5134
60 96,80 18,35 1,6953 9,2400
75 86,20 16,34 1,5838 9,6938
90 114,10 21,63 2,0486 9,4727
105 97,40 18,46 1,7582 9,5238
120 99,30 18,82 1,8044 9,5871
135 99,60 18,88 1,8063 9,5683
150 100,90 19,12 1,7840 9,3284
165 103,60 19,64 1,8582 9,4631
180 117,70 22,31 1,9090 8,5572
92
A.2. Síntesis de los análisis de regresión múltiple para el modelo generado en la
superficie de respuesta.
Cuadro A.II. Influencia de la relación sustrato/disolvente y la temperatura en el
rendimiento de extracción del aceite de semilla de mora y sus coeficientes de extinción.
Tratamiento
Rds
(g IPA/g
sustrato)
Temperatura
(°C)
Re
(g aceite/g
sustrato BS)
K232
(mL/g cm)
K270
(mL/g cm)
1 3,44 34,4 7,503 5,053 1,981
2 3,44 55,6 8,041 4,964 2,207
3 5,56 34,4 8,678 5,536 1,929
4 5,56 55,6 8,672 5,333 2,323
5 3,00 45,0 7,367 4,968 1,841
6 6,00 45,0 9,732 5,101 2,147
7 4,50 30,0 8,752 5,260 1,983
8 4,50 60,0 8,586 4,844 2,069
9 4,50 45,0 7,961 5,108 1,982
10 4,50 45,0 7,949 4,138 1,484
11 4,50 45,0 8,074 4,912 1,896
12 4,50 45,0 7,937 5,555 2,491
Cuadro A.III. Probabilidades y parámetros estadísticos de los modelos generados en la
superficie de respuesta para el rendimiento de extracción del aceite y sus coeficientes de
extinción.
Variables
respuestas pmodelo R2 R2-adj pfa MS fa
MS
Error puro
Gráfica
residuos
Re 0,005 0,850 0,760 0,000 0,170 0,004 Aleatorio
K232 0,864 0,227 0,000 0,940 0,043 0,350 -
K270 0,912 0,186 0,000 0,935 0,023 0,171 -
pmodelo > 0,05 no significativo.
Cuadro A.IV. Probabilidades de las variables utilizadas en el modelo para la superficie de
respuesta para el rendimiento de extracción del aceite.
Factor Coeficiente de regresión Probabilidad
Intercepto 7,980 0,000
Rds (Lineal) 0,644 0,000
Rds (Cuadrática) 0,188 0,005
Temperatura (Lineal) 0,037 0,193*
Temperatura (Cuadrática) 0,248 0,002
Rds*Temperatura (Lineal) - 0,136 0,023
* p > 0,05 no significativa.
93
Cuadro A.V. Análisis de varianza para el modelo generado en la superficie de respuesta
para el rendimiento de extracción del aceite.
Fuentes de
variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Suma de cuadrados
promedio
Valor F
(calculado) p
Regresión 3,91 4 0,98 9,92 0,01
Residual 0,69 7 0,10
Falta de ajuste 0,68 4 0,17 42,78 0,01
Error puro 0,01 3 0,00
Suma de cuadrados 4,60 11
R2 0,85
Figura A.1. Relación entre los residuos predichos y los observados para el rendimiento de
extracción del aceite de semilla de mora.
94
A.3. Síntesis del análisis fisicoquímico del aceite de semilla de mora para determinar
su composición de ácidos grasos.
Cuadro A.VI. Perfil de ácidos grasos que componen el aceite de semilla de mora extraído
con IPA como disolvente.
Análisis realizados g ácido graso/100 g
Láurico C 12:0 0,02 Mirístico C 14:0 0,04 Palmítico C 16:0 4,12 Palmitoleico C 16:0 0,10 Margárico C 17:0 0,07 Margaroleico C 17:0 0,05 Esteárico C 18:0 2,64 Oleico C 18:1 12,36
Trans-trans-linoelaidico C 18:2t 0,03
Linoleico C 18:2 67,90
Araquidico C 20:0 1,19
α-Linolenico C 18:3 10,75
Heneicosanoico C 21:0 0,04
Cis-11,14-Eicosadienoico C 20:2 0,10
Cis-11,14,17-Eicosatrienoico C 20:3 0,06
Otros no identificados 0,47
A.4. Síntesis de los datos obtenidos en la determinación de la estabilidad oxidativa del
aceite de semilla de mora a diferentes temperaturas
Cuadro A.VII. Datos necesarios para la elaboración de las cinéticas de oxidación del
aceite de semilla de mora almacenado a 20 ºC.
Día Índice de Peróxidos K232 K270
(mEq Perox /kg
TAG)
Desviación
estándar
(mL/g
cm)
Desviación
estándar
(mL/g
cm)
Desviación
estándar
0 0,32 0,55 2,57 0,00 0,89 0,00
10 0,12 0,12 2,98 0,00 0,79 0,00
20 0,08 0,13 3,31 0,00 0,91 0,00
30 0,16 0,14 3,24 0,00 0,91 0,00
40 6,06 1,21 3,48 0,00 0,95 0,01
50 4,64 1,22 3,62 0,00 0,97 0,00
60 7,64 0,07 3,35 0,00 0,88 0,01
70 8,67 0,46 3,80 0,01 1,02 0,00
80 7,14 1,09 3,77 0,00 0,98 0,00
90 7,61 0,90 4,16 0,00 1,11 0,00
100 9,77 0,40 3,98 0,00 0,94 0,00
110 9,95 1,00 4,09 0,02 0,92 0,01
95
Cuadro A.VIII. Datos necesarios para la elaboración de las cinéticas de oxidación del
aceite de semilla de mora almacenado a 60 ºC.
Hora (h) Índice de Peróxidos K232 K270
(mEq Perox /kg TAG) Desviación
estándar (mL/g cm)
Desviación
estándar (mL/g cm)
Desviación
estándar
0 0,32 0,55 2,57 0,00 0,89 0,00
2 1,66 0,30 2,70 0,00 0,72 0,00
4 2,57 0,38 3,22 0,00 0,96 0,00
6 5,42 0,36 3,39 0,00 0,97 0,01
26 16,69 0,38 3,55 0,00 0,82 0,00
49 25,08 0,75 4,44 0,00 0,83 0,00
76 37,28 0,29 5,61 0,00 0,93 0,00
98 44,73 0,99 6,50 0,00 0,97 0,00
121 39,27 0,27 6,18 0,00 0,93 0,00
146 45,56 0,37 7,28 0,00 1,13 0,00
173 48,87 3,82 7,46 0,01 1,13 0,00
195 52,41 3,70 7,65 0,01 1,16 0,00
221 44,48 2,93 7,37 0,00 1,12 0,00
246 48,94 4,62 7,66 0,01 1,18 0,00
265 52,80 5,39 6,94 0,00 1,08 0,00
