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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
IDENTIFICACIÓN DE INDICADORES ENTÉRICOS EN
CILANTRO (Coriandrum sativum) Y PEREJIL (Petroselinum
sativum) QUE SE EXPENDEN EN MERCADOS POPULARES
DEL NORTE DE LA CIUDAD DE QUITO
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO
DE INGENIERA DE ALIMENTOS
DAYANA KAROLINA CERÓN SALGADO
DIRECTORA: ING. NUBIA GRIJALVA V.
Quito, Septiembre, 2014
© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2014
Reservados todos los derechos de reproducción
DECLARACIÓN
Yo Dayana Karolina Cerón Salgado, declaro que el trabajo aquí descrito es
de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o
calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas
que se incluyen en este documento.
La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos
correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de
Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional
vigente.
_________________________
Dayana Karolina Cerón Salgado
C.I. 171686309-5
CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo que lleva por título “IDENTIFICACIÓN DE
INDICADORES ENTÉRICOS EN CILANTRO (Coriandrum sativum L.) Y
PEREJIL (Petroselinum sativum) QUE SE EXPENDEN EN MERCADOS
POPULARES DEL NORTE DE LA CIUDAD DE QUITO”, que, para aspirar
al título de Ingeniera de Alimentos, fue desarrollado por Dayana Karolina
Cerón Salgado, bajo mi dirección y supervisión, en la Facultad de Ciencias
de la Ingeniería; y cumple con las condiciones requeridas por el reglamento
de Trabajos de Titulación artículos 18 y 25.
______________________________
Ing. Nubia Grijalva V.
DIRECTORA DELTRABAJO
C.I. 171766568-9
DEDICATORIA
Todo el esfuerzo aquí plasmado está dedicado a mi padre, un hombre
espectacular que ha sido un ejemplo permanente para mi vida por ser una
persona trabajadora, luchadora, llena de valores y sobre todo de amor
incondicional. Este trabajo es en agradecimiento por sus continuas
enseñanzas, por todos esos días de extenuante trabajo, por su paciencia y
sobre todo porque jamás se ha dado por vencido para sacarme adelante y
hacer de mí, la persona que ahora soy.
Este trabajo también es dedicado para esas dos personas sin las cuales no
hubiera sido posible la perseverancia gracias a su apoyo incondicional, mis
amados hermanos, Belén y Luis, tal vez su aporte no fue con conocimientos
pero si con consejos y amor para que no me diera por vencida en ningún
paso que daba, siempre mis logros serán para ustedes porque mi vida no
estaría completa si faltara alguno de los dos.
Y finalmente a mi madre, que es el ángel que guía mi vida, gracias a ti por
darme la vida porque de otra forma hoy no hubiera podido lograr esto; sé
que desde allá arriba estarás orgullosa de mí. Te Amo.
AGRADECIMIENTO
En primer lugar y ante todo doy gracias a Dios por cada día regalarme una
nueva oportunidad para levantarme y luchar por cumplir mis sueños como
ahora lo estoy haciendo.
A mi padre Enrique por darme los estudios y siempre estar conmigo, a mis
hermanos Belén y Luis que hacen que cada día de mi vida sea una dicha a
su lado y porque sé que mis logros les hacen felices también a ellos.
Agradezco inmensamente y de corazón a la Ing. Nubia Grijalva, que más
que una directora de tesis ha sido una gran amiga, confidente y de quien
siempre he recibido los mejores consejos profesionales y personales,
gracias por brindarme su amistad, cariño y confianza, sin su apoyo este
trabajo no hubiera podido llegar a feliz término.
Y finalmente pero no menos importantes agradezco a esas personas
quienes me han regalado los momentos más lindos de esta etapa
universitaria, MIS AMIGOS! Siempre incondicionales para mí: Estefy, Tañis,
Dayta Mo, gracias por quererme y estar a mi lado; a Jess por haber
demostrado que no fueron necesarios largos años de conocer a alguien
para brindarme su ayuda, apoyo, paciencia, en fin una verdadera y sincera
amistad; pero especialmente agradezco a Naty Q., mi consejera, soporte,
ayuda, cómplice, casi hermana en fin, su presencia ha sido muy importante
estos años universitarios, simplemente eres mi mejor amiga.
¡Les quiero de corazón amigos y futuros colegas!
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
PÁGINA
RESUMEN vii
ABSTRACT viii
1. INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO 5
2.1. INOCUIDAD ALIMENTARIA 5
2.2. ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS 7
2.2.1. TIPOS DE ENFERMEDADES MICROBIANAS DE
ORIGEN ALIMENTARIO 8
2.2.1.1. Intoxicaciones alimentarias 9
2.2.1.2 Infecciones transmitidas por alimentos 10
2.2.1.3. Toxicoinfecciones alimentarias 11
2.2.2. CAUSAS DE LAS ENFERMEDADES TRANSMITIDAS
POR ALIMENTOS11
2.3. INDICADORES ENTÉRICOS 13
2.3.1. ENTEROBACTERIAS 14
2.3.2. COLIFORMES 16
2.3.2.1. Coliformes fecales 17
2.3.2.2. Escherichia coli 18
2.3.2.2.1. Generalidades 18
2.3.2.2.2. Enfermedades 20
2.3.2.2.3. Alimentos implicados 22
2.3.2.2.4. Prevención 23
2.3.2.3. Análisis y detección de coliformes 23
2.4. VEGETALES TIPO HOJA 25
2.4.1. CILANTRO 26
2.4.1.1. Generalidades de la planta 26
ii
PÁGINA
2.4.1.2. Clasificación taxonómica 28
2.4.1.3. Composición y valor nutricional 28
2.4.1.4. Variedades 29
2.4.1.5. Cultivo en Ecuador 30
2.4.2. PEREJIL 31
2.4.2.1. Generalidades de la planta 31
2.4.2.2. Clasificación taxonómica 32
2.4.2.3. Composición y valor nutricional 33
2.4.2.4. Variedades 34
2.4.2.5. Cultivo en Ecuador 35
2.5. INTOXICACIONES CAUSADAS POR LA INGESTA DE
VEGETALES TIPO HOJA 36
2.6. USO DE INDICADORES ENTÉRICOS PARA DETERMINAR
LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE VEGETALES TIPO
HOJA 38
3. METODOLOGÍA 41
3.1 DESCRIPCIÓN Y TOMA DE MUESTRA 41
3.2 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS 42
3.2.1 DILUCIONES SUCESIVAS 42
3.2.2 RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
COLIFORMES FECALES Y Escherichia coli. 43
3.2.2.1 Colimetría presuntiva 43
3.2.2.2 Colimetría confirmatoria 44
3.2.2.3 Colimetría complementaria 46
3.2.2.3.1 Prueba para indol (I): 46
3.2.2.3.2 Prueba de rojo de metilo (RM): 47
3.2.2.3.3 Prueba de Voges-Proskauer (VP) 47
3.2.2.3.4 Prueba para la utilización de citrato 48
iii
PÁGINA
3.2.3 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES
PORLA TÉCNICA DE RECUENTO EN PLACA 49
3.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS 50
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS 51
4.1 RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES Y
Escherichia coli 51
4.1.1 COLIFORMES TOTALES 52
4.1.2 COLIFORMES FECALES 56
4.1.3 Escherichia coli 58
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 62
5.1 CONCLUSIONES 62
5.2 RECOMENDACIONES 64
BIBLIOGRAFÍA 65
ANEXOS 72
iv
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 2.1. Alimentos involucrados en los brotes de ETAs 8
Tabla 2.2. Enterobacterias más importantes:punto de vista clínico 16
Tabla 2.3. Condiciones de crecimiento de E.coli 19
Tabla 2.4. Alimentos contaminados con E.coli 22
Tabla 2.5. Clasificación taxonómica del cilantro 28
Tabla 2.6. Composición nutricional del cilantro 29
Tabla 2.7. Variedades de cilantro 30
Tabla 2.8. Clasificación taxonómica del perejil 33
Tabla 2.9. Composición nutricional del perejil 34
Tabla 2.10. Calidad microbiológica en vegetales frescos 39
Tabla 3.1 Identificación de coliformes por IMViC 49
Tabla 4.1. Resultados de coliformes totales por mercado 53
Tabla 4.2 Resultados de coliformes totales de cilantro por puesto de expendio 54 Tabla 4.3 Resultados de coliformes totales de perejil por puesto de expendio 55 Tabla 4.4 NMP de coliformes fecales 57
v
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 2.1. Factores que ocasionan ETAs 13
Figura 2.2. Estructura del género Enterobacteriaceae 15
Figura 2.3. Estructura de Escherichia coli 19
Figura 2.4. Características de cepas de E.coli causantes de diarrea 21
Figura 2.5. Análisis microbiológico de E.coli 25
Figura 2.6. Estructuras morfológicas del cilantro 27
Figura 2.7 Variedades de perejil 35
Figura 3.1. Mercados del norte de la ciudad de Quito 41
Figura 3.2. Tubos BGBL 43
Figura 3.3. Tubos BGBL y TSB 44
Figura 3.4. Siembra en estría 45
Figura 3.5. Cultivos purificados 46
Figura 3.6. Coliformes en agar VRB 50
Figura 4.1. Recuento de coliformes totales 52
Figura 4.2. Pruebas de identificación bioquímicas para E.coli. 58
Figura 4.3. Presencia de E.coli en vegetales tipo hoja analizado 59
Figura 4.4. Distribución de muestras de cilantro y perejil según la presencia de E.coli por mercado y puesto de expendio 60
vi
ÍNDICE DE ANEXOS
PÁGINA
ANEXO I
TABLA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) POR g/mL DE
ALIMENTO 72
ANEXO II
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS MERCADO LA OFELIA 73
ANEXO III
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS MERCADO IÑAQUITO 74
ANEXO IV
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS MERCADO SANTA CLARA 75
ANEXO V
PROCEDIMIENTO DE RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICA-
CIÓN DE E. coli 76
ANEXO VI
TÉCNICA RECUENTO EN PLACA AGAR VRB 79
vii
RESUMEN
El cilantro y el perejil son vegetales tipo hoja de consumo habitual que
generalmente se ingieren crudos. Por su naturaleza, tipo de cultivo y
manipulación previa a la comercialización pueden ser portadores de agentes
infecciosos capaces de causar enfermedades transmitidas por alimentos
(ETAs). En esta investigación se analizaron 108 muestras (54 de cilantro y
54 de perejil) obtenidas de manera aleatoria en tres puestos de expendio de
tres mercados del norte de la ciudad de Quito seleccionados para este
estudio. Se realizó la determinación de Coliformes Totales (CT), Coliformes
Fecales (CF) y Escherichia coli (EC) según la metodología establecida por la
NTE INEN 1529-8 en medios selectivos para este tipo de microorganismos;
la identificación de E.coli se realizó empleando pruebas bioquímicas. La
población de CT para cilantro fue de 5.09 log UFC/g y 6.39 log UFC/g para
perejil. Se obtuvieron valores de CF de 607.0 NMP/g en el mercado uno,
596.7 log NMP/g en el mercado dos y 474.2 NMP/g para el mercado tres.
El 23.1% de las muestras de perejil presentaron recuentos positivos para
Escherichia coli mientras que para cilantro el 14.8% de las muestras fueron
positivas. La presencia de indicadores entéricos (CT, CF y EC) en cilantro y
perejil fue independiente del mercado y puesto de expendio lo cual indica un
alto nivel de contaminación y demuestra la necesidad de un control
microbiológico en el sistema de riego, cosecha, transporte y condiciones
higiénicas de los manipuladores para asegurar la calidad de vegetales tipo
hoja evitando posibles brotes de enfermedades transmitidas por este tipo de
alimento. Cabe recalcar que en el Ecuador hasta el momento no se han
registrado datos de análisis microbiológicos realizados en cilantro y perejil, y
además no se cuenta con normativa que controle este tipo de productos.
viii
ABSTRACT
Coriander and Parsley are leaf vegetables of regular consumption. They are
generally ingested uncooked. Due to their nature, cultivation methods and
handling process prior to commercialization, these products can carry
infectious agents that are capable of causing foodborne diseases. In this
research 108 samples were analyzed (54 of coriander and 54 of parsley).
These samples were obtained under a random method in three distribution
spots on each of the markets around the north of the city of Quito. Total
coliforms (TC), fecal coliforms (FC) and Escherichia coli (EC) were detected
applying the NTE INEN 1529-8 methodology on selective media for this type
of microorganism. The identification of E.coli was performed using
biochemical tests. The average TC value for the coriander was 5.09 log
UFC/g and 6.39 log UFC/g for the parsley. Values of 607.0 NMP/g for CF for
the market #1, 597.7NMP/g for the market # 2, and 474.2 NMP/g for the
market # 3 were found. The 23.1% of the parsley samples presented positive
recounts for Escherichia coli while for the coriander the 14.8% of the samples
were positive for this bacterium. The presence of enteric indicators (TC, FC,
and EC) in coriander and parsley was independent from the market and the
distribution point which indicates a high contamination level and
demonstrates the necessity of a microbiologic control on the irrigation
system, farming, transport and hygienic conditions of the handlers in order to
assure the quality of the leafy vegetables avoiding possible breakouts of
diseases caused by these products. In Ecuador there are not data about
microbiological analyzes in these vegetables, neither legislation to control
this type of product.
1. INTRODUCCIÓN
1
1. INTRODUCCIÓN
Las hortalizas son un grupo de alimentos que se cultivan en huertos o
sembríos, su consumo principalmente está enfocado a la alimentación por
poseer innumerables propiedades nutricionales (Rivera, Rodríguez, & López,
2009).
El valor nutricional de las hortalizas se basa especialmente en
micronutrientes como potasio, calcio, hierro; las cantidades de
macronutrientes no son significativas ni presentan un alto valor calórico. Las
hortalizas o vegetales tipo hoja como cilantro, perejil, apio, lechuga, acelga y
espinaca son empleadas en platos tradicionales o comúnmente preparados
en los hogares, tal es el caso de sopas, ensaladas, comidas rápidas (Verdú
& Carazo, 2005).
El cilantro es una planta herbácea, sus hojas presentan un aspecto muy fino
con sabor y aroma característicos, es una fuente importante de vitamina K
que interviene en factores de coagulación sanguínea. Se lo considera
originario del norte de África y sur de Europa. Fue una de las primeras
especies que se introdujo en América para la conservación de carnes y
como hierba medicinal: sus frutos maduros se usan para condimentar. En
países de Latinoamérica como México, Venezuela, Colombia y Ecuador se
usan las hojas frescas enteras o picadas. Además del uso culinario, en
muchas culturas (India, Grecia, China y Japón) se usa el cilantro como
remedio casero. En estudios realizados en la década de los noventa se le
atribuyó propiedades quelantes para atrapar metales en sangre que
producen envenenamiento (Ramos, 2008).
El perejil, planta herbácea, se consume de forma cruda. Es originario del
Mediterráneo oriental. Los griegos y romanos lo veneraban como una planta
sagrada que acompañaba las grandes festividades (Japon, 2011).
2
Posee vitaminas como la A, B1, B2 y C aunque no son una fuente
significativa, además de minerales como hierro y fósforo; su olor
característico está dado por un aceite volátil llamado apiol (Galeazzi, 2004).
El cilantro y el perejil son vegetales de consumo habitual que se ingieren
crudos. Por su naturaleza pueden ser portadores de agentes infecciosos
causantes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs). Por el tipo
de cultivo y la manipulación previa a la comercialización pueden presentar
un alto número de enterobacterias que son la causa más importante de
enfermedades gastrointestinales. La detección e identificación de este tipo
de microorganismos, permite tener una idea de la calidad microbiológica que
presenta el producto (Galeazzi, 2004).
Las ETA´s representan un gran peligro para la salud de los seres humanos.
Son producidas por la ingesta de alimentos y bebidas contaminados con
microorganismos y sus toxinas, muchas personas enferman y mueren
alrededor del mundo por consumir alimentos insalubres (Ramírez Merida,
Alfieri, Gamboa, & Morón de Salim, 2009).
Pese a que no se notifica un elevado porcentaje de ETA’s, estas son solo
una pequeña fracción de lo que ocurre en la realidad, razón por la cual no
se tienen datos de la incidencia anual de las mismas, por ejemplo, se estima
que en los países industrializados se informa <10% de la cifra real, mientras
que en los países en vías de desarrollo se informa solo el 1% de las cifras
reales (Fuentes & Cepedillo, 2012).
Se han descrito más de 250 ETA’s, ocasionadas por distintas bacterias, virus
y parásitos. Entre las bacterias comúnmente reconocidas como causantes
de ETA se encuentran especies de los géneros Campylobacter y
Salmonella, así como la cepa O157:H7 de la enterobacteria Escherichia coli
(Flores & Rojas, 2005).
3
El Sistema de Información Regional para la Vigilancia Epidemiológica de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) de la OPS/OMS
manifestó que los brotes relacionados con legumbres y hortalizas
representan el 2,39% de las enfermedades de América Latina y el Caribe
(Hualpa & Castillo, 2009).
La inocuidad de los alimentos engloba acciones encaminadas a garantizar la
máxima seguridad posible de los mismos; es necesaria la vigilancia continua
de los alimentos a lo largo de toda su cadena de suministro: en el transporte,
manipulación, limpieza y comercialización. Las políticas y actividades que
persiguen dicho fin deben trabajar en dimensiones sociales, económicas,
culturales y políticas. (Camelo A. , 2003).
Se debe trabajar en el control sanitario de todos los alimentos,
especialmente de aquellos que presentan una alta frecuencia de consumo y
no se someten a procesos de cocción, es decir se consumen casi o
totalmente crudos como cilantro y perejil.
En estudios similares realizados en vegetales frescos en Venezuela, Perú y
Costa Rica se detectó la presencia de microorganismos como Salmonella,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, mohos y levaduras que fueron
hallados principalmente en lechuga, tomates, cilantro, perejil y cebollas
(Rivera, Rodríguez, & López, 2009) (Ramírez Merida, Alfieri, Gamboa, &
Morón de Salim, 2009) (Ginestre, Rincón, Romero, Castellano, & Ávila,
2010).
La población ecuatoriana mantiene la costumbre de adquirir alimentos como
verduras, hortalizas y frutas en los mercados por su costo y presentación.
Las condiciones de manipulación de los alimentos en los mercados no son
óptimas, pues no siempre cumplen con normas que aseguren inocuidad. Por
ello este estudio aportará a determinar la calidad microbiológica de los
vegetales frescos consumidos con alta frecuencia, como son cilantro y perejil
en los principales mercados del norte de Quito.
4
OBJETIVO GENERAL
Identificar los principales indicadores entéricos en cilantro
(Coriandrum sativum) y perejil (Petroselinum sativum) que se
expenden en tres mercados populares del Norte de la ciudad de
Quito.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Realizar recuentos de coliformes totales en muestras de cilantro y
perejil de tres mercados populares del norte de Quito: Mercado Santa
Clara, Mercado Iñaquito y Mercado La Ofelia.
2. Realizar recuentos de coliformes fecales y E.coli en muestras de
cilantro y perejil de tres mercados populares del norte de Quito:
Mercado de Santa Clara, Mercado Iñaquito y Mercado La Ofelia.
2. MARCO TEÓRICO
5
2. MARCO TEÓRICO
2.1. INOCUIDAD ALIMENTARIA
Inocuidad es la garantía de que los alimentos no van a causar daño cuando
se preparen y/o consuman de acuerdo con el uso al que se le destine. Un
alimento inocuo es aquel que está libre de peligros físicos (huesos, piedras,
fragmentos de metal o cualquier materia extraña), peligros químicos
(medicamentos veterinarios, pesticidas, toxinas de microorganismos,
agentes de limpieza y desinfección) y peligros biológicos (microorganismos
patógenos) (Codex Alimentarius, 2003).
La inocuidad de los alimentos se asegura controlándola desde el inicio de la
cadena de suministros, con la ayuda de la aplicación de buenas prácticas
de agricultura y manufactura, en la producción, procesamiento (incluyendo el
etiquetado), manipulación, distribución, almacenamiento, venta, preparación
y uso final de los alimentos, junto con la aplicación del Sistema de HACCP
(Análisis de Riesgos y Puntos de Control) (FAO, 1996).
El término inocuidad no se debe confundir con las palabras Calidad y
Seguridad. La calidad de los alimentos es una característica compleja que
determina su valor o aceptabilidad para el consumidor. Abarca atributos
negativos como el estado de descomposición, contaminación con suciedad,
decoloración y olores desagradables, y atributos positivos, como origen,
color, aroma, textura y métodos de elaboración de los alimentos (OMS,
2007).
La seguridad alimentaria “existe cuando todas las personas tienen en todo
momento acceso físico y económico a suficientes alimentos inocuos y
nutritivos para satisfacer sus necesidades alimenticias y sus preferencias en
6
cuanto a los alimentos con el fin de llevar una vida activa y sana” (FAO,
1996).
La seguridad alimentaria está dada en función de cuatro componentes o
pilares fundamentales que son: disponibilidad de los alimentos, estabilidad,
acceso a los alimentos, consumo y utilización biológica (Jácome, 2012)
La actual Constitución del Ecuador, en el Capítulo Segundo, Art.- 13,
expresa que las personas y colectividades tienen derecho al acceso seguro
y permanente a alimentos sanos, suficientes y nutritivos (Constitución del
Ecuador, 2008).
La ley Orgánica del Régimen de la Soberanía Alimentaria del Ecuador,
establece en el capítulo IV “Sanidad e inocuidad alimentaria”; que la
finalidad de la inocuidad alimentaria es promover una adecuada nutrición y
proteger la salud de las personas previniendo, eliminando o reduciendo la
ocurrencia de enfermedades causadas y que puedan agravarse por el
consumo de alimentos que estén contaminados (LORSA, 2010).
La producción de alimentos libres de contaminantes depende de los
procesos de elaboración, así como de las personas que tienen contacto con
los mismos. La contaminación bacteriana de los alimentos causa problemas
de salud; entre los más importantes se encuentra la salmonelosis y
enfermedades causadas por estafilococos y clostridios (Rivera J. F., 2012).
El mantenimiento de la higiene en la infraestructura donde se procesan o
elaboran alimentos es una condición esencial para asegurar la inocuidad de
los productos. En cada etapa de la cadena alimentaria, desde la producción
primaria hasta el consumo, son necesarias prácticas higiénicas eficaces. La
implementación de procedimientos operativos de saneamiento (POES) que
describen tareas de saneamiento antes, durante y después de las
operaciones de elaboración, ayudarán a asegurar la calidad de los alimentos
(Mercado, 2007).
7
2.2. ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS
Las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs) son consideradas
como la causa principal de trastornos que se producen en el tracto intestinal,
manifestándose con varios síntomas entre los que se destacan: dolores
abdominales, diarreas y vómito. Son causadas por ingerir alimentos que
contienen cantidades de microorganismos patógenos (bacterias, virus,
hongos, parásitos) mayores a la DMI (Dosis Mínima Infectiva), o productos
tóxicos, que resultan nocivos para el organismo (Bravo, 2004).
La DMI es la cantidad más pequeña de material infeccioso que suele
producir enfermedad; varía entre las personas dependiendo de su estado
general de salud y de la forma como se ingieren las bacterias (en ciertas
condiciones las DMI pueden ser muy baja por lo que es muy necesaria la
higiene) (Fuentes & Cepedillo, 2012).
Se han descrito más de 250 ETAs. La mayoría de enfermedades
transmitidas por alimentos son infecciones ocasionadas principalmente por
bacterias, entre las más comunes como causantes de ETAs se encuentran
especies de los géneros Campylobacter y Salmonella, así como la cepa
O157:H7 de la enterobacteria Escherichia coli (González & Rojas, 2005).
Según las cifras de la Organización de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la Salud
(OMS), la región latinoamericana experimentó al menos 6.000 brotes de
diversos tipos de enfermedades de origen alimentario, entre 1993 y 2002
( Instituto Nacional de Salud de Colombia, 2011).
El Sistema de Información Regional para la Vigilancia Epidemiológica de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos de la OPS/OMS manifiesta que
los brotes relacionados con legumbres y hortalizas representan el 2,39% de
8
las enfermedades de América Latina y el Caribe como lo muestran los datos
presentados en la Tabla 2.1 (SIRVETA, 2002).
En Ecuador el mayor índice de mortalidad infantil está dado por
enfermedades gastrointestinales, siendo la segunda causa de morbilidad
según las estadísticas del INEC. Los microorganismos patógenos (bacterias,
virus o parásitos) en el agua y alimentos pueden provocar: cólera, fiebre
tifoidea, poliomielitis, meningitis y hepatitis A y E y una gran variedad de
intoxicaciones alimentarias (Clavijo, 2011).
Los microorganismos están presentes en el medio ambiente natural (aire,
agua o suelo); es decir, pueden ser propios de los alimentos antes de su
obtención, o presentarse cuando colonizan el alimento durante la cadena de
suministro ya sea en su obtención, transporte, industrialización y/o
conservación, pues contienen asociaciones microbianas que cuando llegan a
los alimentos son capaces de sobrevivir, proliferar e interaccionar con sus
componentes (Larrañaga et al., 2000;Mossel & Moreno, 1991).
Tabla 2.1. Alimentos Involucrados en los brotes de ETAs
(Panalimentos OPS/OMS, 2002)
Alimento involucrado % Brotes
Pescado 21.52
Agua 19.51
Carnes rojas 14.20
Lácteos 7.88
Huevo-Mayonesa 5.85
Carnes de aves 5.08
Hortalizas-Legumbres 2.39
9
2.2.1. TIPOS DE ENFERMEDADES MICROBIANAS DE ORIGEN
ALIMENTARIO
Con base a las características de la enfermedad, se pueden dividir en tres
tipos de enfermedades microbianas de origen alimentario:
2.2.1.1. Intoxicaciones alimentarias
Se originan como consecuencia de la ingesta de alimentos en los que
existen sustancias tóxicas que pueden ser originarias de restos de
pesticidas, moluscos contaminados por metales, metabolitos propios del
alimento, o toxinas producidas por microorganismos presentes en alimentos
(Larrañaga, Carballo, Rodríguez, & Fernandez, 2000).
Son de carácter gastroentérico agudo, pues su sintomatología aparece de
forma violenta poco tiempo después de haber ingerido el alimento
contaminado. Los microorganismos que producen con mayor frecuencia
intoxicaciones son Staphyloccocus aureus y Clostridium botulinum
(Caballero, 2008).
Según Ray & Bhunia (2010), las principales caraterísticas de una
intoxicación alimentaria son:
1. La toxina se produce a medida que el patógeno crece en el alimento.
2. Una toxina es estable o inestable al calor.
3. Para que se dé la intoxicación, se requiere ingerir un alimento con una
toxina activa, y células microbianas no viables. La dosis mínima
infectiva depende del tipo de microorganismo.
4. Los síntomas son instantáneos, generalmente aparecen 30 min
después de la ingestión.
10
5. Los síntomas dependen del tipo de toxina: enterotoxinas (síntomas
gástricos) por patógenos como Staphylococcus aureus y neurotoxinas
(síntomas neurológicos) por patógenos como Clostridium botulinum.
6. No se presenta fiebre.
2.2.1.2 Infecciones transmitidas por alimentos
Se originan por la presencia de microorganismos que colonizan, se
multiplican e invaden el alimento, sin que se evidencie la producción de
ningún tipo de toxina por parte del microorganismo; la dosis mínima infectiva
depende del tipo de microorganismo. (Larrañaga et al., 2000).
Se produce por la ingestión de alimentos y/o agua contaminados con
agentes infecciosos específicos como bacterias, virus, hongos y parásitos,
que en el tracto intestinal puedan multiplicarse, e invadir otros aparatos o
sistemas. Su período de incubación es mucho más prolongado, por ejemplo,
una de las infecciones más comunes es la salmonelosis, donde el periodo de
incubación de la Salmonella es de 24 a 36 horas, en relación una
intoxicación alimentaria, donde generalmente los síntomas se presentan en
un lapso de 2 a 4 horas después de ingerir el alimento (Caballero., 2008).
Según Ray & Bhunia (2010), las principales características de infección por
alimentos son:
1. Las células vivas de patógenos (bacterias y virus) se consumen por
medio de los alimentos.
2. Las células patógenas se albergan en las células epiteliales del
estómago donde se multiplican y producen la toxina.
3. Los niveles de carga que se requieren para que se produzca la
infección varían según el tipo de microorganismo patógeno.
4. Los síntomas se presentan después de 24h.
11
5. Los síntomas entéricos que se presentan incluyen dolor abdominal,
diarrea, náuseas, vómito y fiebre. Ejemplo de estos patógenos son:
Salmonella, Shigella, E.coli enteropatogénica, Vibrio
parahaemolyticus, Campylobacter jejuni.
6. Los síntomas no entéricos se presentan cuando los patógenos o
toxinas invaden otros órganos; los síntomas dependen del tipo de
órgano afectado, pero van acompañados por fiebre. Ejemplo de
estos patógenos son: Listeria monocytogenes, E.coli
enterohemorrágica, Vibrio vulnificus, virus de hepatitis A.
2.2.1.3. Toxicoinfecciones alimentarias
Se originan por la ingesta de alimentos que contienen microorganismos
patógenos, que además de multiplicarse e invadir el organismo, producen
toxinas (Larrañaga et al., 2000).
Según Ray & Bhunia (2010), las principales características de una
toxicoinfección por alimentos son:
1. Generalmente son microorganismos formadores de esporas o bacilos
Gram negativos.
2. Las células formadoras de esporas no se multiplican en el tracto
digestivo.
3. Las células Gram negativas se multiplican con rapidez en el tracto
digestivo.
4. Muchas células mueren pero al hacerlo sus toxinas son liberadas.
5. Las toxinas de ambos grupos de microorganismos producen síntomas
de gastroenteritis.
12
2.2.2. CAUSAS DE LAS ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR
ALIMENTOS
Las ETAs son producidas por la ingesta de alimentos y bebidas
contaminadas, la Organización Mundial de la Salud (OMS), ha calculado que
cada año mueren 1,8 millones de personas como consecuencia de
enfermedades diarreicas siendo la población más vulnerable niños, ancianos
y mujeres embarazadas, a causa de esto, en el año 2001, la OMS difundió
las “5 claves para la inocuidad de los alimentos” cuyo fin fue garantizar la
preparación higiénica de los alimentos y prevenir la mayoría de las ETA’s,
estando orientadas a productores, comerciantes y consumidor final(Ramírez,
Alfieri, Gamboa, & Morón de Salim, 2009; OMS, 2007).
Existen varias causas que producen ETAs entre las que Caballero et al.
(2008) destaca como primordiales a las siguientes:
Sustancias tóxicas presentes en el tejido de animales y plantas
(ejemplo: ciguatera).
Adición de aditivos (ejemplo: nitrito).
Metales tóxicos (ejemplo: mercurio, arsénico, hierro, plomo).
Agentes químicos (ejemplo: plaguicidas, residuos de materiales de
empaque).
Origen Biológico, siendo esta, una de las causas prioritarias debido a
la gran cantidad de agentes biológicos existentes.
En la Figura 2.1se presentan otro tipo de factores que pueden ocasionar el
desarrollo de ETAs, dividiéndose en tres categorías: abuso del tiempo de
exposición - temperaturas inadecuadas de cocción o manejo, mala
manipulación de alimentos - equipo mal lavado y contaminación cruzada
que es la transmisión de microorganismos de un alimento contaminado, en
la mayoría de los casos crudo, a otro que ya está cocinado (Bravo, 2004).
13
Figura 2.1. Factores que ocasionan ETAs
(Bravo, 2004)
Los cambios en los hábitos alimentarios de la sociedad, como el consumo de
alimentos envasados, comidas fuera del hogar, expendio de comidas
preparadas y comidas rápidas, son factores que contribuyen al incremento
de las ETAs. Estos cambios en los estilos de vida presentan riesgos, con
mayor probabilidad de ocurrencia en países del primer mundo (Olea, Díaz,
Fuentes, Vaquero, & García, 2012).
2.3. INDICADORES ENTÉRICOS
La determinación de microorganismos patógenos en alimentos es una
práctica analítica básica por dos razones: la primera, son parte de un
procedimiento para detectar microorganismos indicadores de calidad, y la
segunda, porque se convierten en agentes importantes para determinar
ETAs (Larrañaga et al., 2000).
14
Los indicadores entéricos ponen en evidencia deficiencias en la calidad
microbiológica de un determinado alimento, al exceder un valor de referencia
experimentalmente establecido por organismos oficiales (Benavides, 2006).
Para determinar, en base a un indicador, si se acepta o rechaza el consumo
de un alimento, se debe primero comprobar si la cantidad elevada de
microorganismos son resultado de un nivel de contaminación inicial o de su
posible crecimiento de contaminación a lo largo de la cadena de suministro
(Ray & Bhunia, 2010).
2.3.1. ENTEROBACTERIAS
La familia Enterobacteriaceae no incluye solo coliformes sino muchos
géneros y especies que son patógenos entéricos, por lo que el recuento del
grupo completo puede ser un mejor indicador de higiene y posible
contaminación fecal (Ray & Bhunia, 2010).
Las enterobacterias están constituidas por un grupo heterogéneo de
bacterias Gram negativas. Reciben este nombre debido a su ubicación
habitual como saprofitos en el tubo digestivo; de igual manera se encuentran
en el suelo, agua y la vegetación. Son microorganismos con forma de bastón
de 1-3 µm de largo y 0,5 µm de diámetro, su envoltura se caracteriza por
tener una estructura multilaminar, la membrana interna contiene una doble
capa de fosfolípidos y la externa está formada por un peptidoglicano delgado
que contiene una elevada concentración de proteínas (Puerta- García &
Mateos-Rodríguez, 2010). En la Figura 2.2 se puede observar la estructura
de las enterobacterias.
15
Figura 2.2. Estructura del género Enterobacteriaceae
(Merino & Lôsch, 2012)
Según las características microbiológicas, las enterobacterias son bacterias
no esporuladas con crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis, es decir, son
anaerobios facultativos; fermentan la glucosa con o sin formación de gas,
muestran negatividad a la prueba de la oxidasa; no aumenta su crecimiento
en un medio hipertónico y pueden ser móviles, dependiendo de la presencia
o no de flagelos (Galí, 2010).
Dentro de la familia Enterobacteriaceae se reconocen más de 30 géneros
diferentes. En la Tabla 2.2 se detallan los géneros y especies que se aíslan
con mayor frecuencia y son de importancia clínica.
16
Tabla 2.2. Enterobacterias más importantes desde el punto de vista clínico
Géneros Especies
Escherichia E. coli
Shigella S. flexneri, S. sonnei, S.dysenteriae
Salmonella S. enteric, S. bongori
Klebsiella K. pneumonia, K. oxytoca
Enterobacter E. cloacae, E. aerogenes, E. agglomerans
Serratia S. cloacae, S. odorífera, S. fonticola
Citrobacter C. freundii, C. kooseri
Proteus P. vulgaris, P. mirabilis
Providencia P. rettgeri, P. stuartii
Yersinia Y. enterocolítica, Y. pestis
(Merino & Lôsch, 2012)
Uno de los factores de virulencia en las enterobacterias es su capacidad de
producir toxinas, existiendo una amplia variedad de citotoxinas y
enterotoxinas causantes de los diferentes síndromes diarreicos. Las
enterobacterias tienen la capacidad de adquirir rápidamente resistencia a los
antibióticos debido a que poseen plásmidos, que son unidades de ADN
extracromosómico (Galí, 2010).
2.3.2. COLIFORMES
El grupo coliforme es considerado como el principal indicador de patógenos
entéricos y comprende: coliformes, coliformes fecales y E.coli. El término
coliforme representa un grupo de especies de diversos géneros como:
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter. Se los agrupa juntos por
compartir características comunes: son bacilos Gram negativos, no
17
formadores de esporas, facultativos anaeróbicos; son sensibles al
tratamiento con calor bajo, por ello mueren con la pasteurización (Ray &
Bhunia, 2010).
Debido a que los coliformes se encuentran comúnmente en el tracto
intestinal, su presencia puede indicar una contaminación fecal, por ello se los
considera como microorganismos indicadores; sin embargo se debe
considerar que los coliformes presentes en los alimentos pueden tener o no
un origen fecal (Yousef & Carlstrom, 2006).
A pesar de la presencia de coliformes, los alimentos se pueden consumir sin
peligro, siempre y cuando se cumpla con los niveles de tolerancia (un
coliforme por cada 100ml agua); si hay cantidades superiores, el alimento no
debe consumirse (Gómez, 2002).
2.3.2.1. Coliformes fecales
Los coliformes fecales constituyen un grupo de bacterias cuya especificidad
como contaminante fecal es mucho más alta; los grupos que se encuentran
con mayor frecuencia en las heces fecales son E.coli, Klebsiella y
Enterobacter (Ray & Bhunia, 2010).
Una de las características que diferencia a los coliformes fecales es que son
termotolerantes, pues su temperatura de incubación oscila entre 44 y 45°C
es decir que soportan temperaturas elevadas lo que permite diferenciarlos
de los coliformes totales, fermentan la lactosa produciendo ácido y gas; en el
recuento de coliformes fecales se determina el número de los mismos por
gramo o cm3 de alimento (INEN, 1990 ;CYTED, 2011).
Los coliformes fecales, incluyendo E.coli, son fáciles de destruir, aplicando
una temperatura de 55ºC se logra su destrucción, sin embargo es
recomendable asegurarse temperaturas por encima de 63ºC así como
18
también pueden morir durante el almacenamiento en congelación. Los
coliformes pueden estar presentes en equipos y utensilios que al emplearlos
contaminarán los alimentos procesados (Montville et al., 2012).
2.3.2.2. Escherichia coli
Escherichia coli fue descubierta por primera vez en 1885 por el bacteriólogo
alemán Theodore von Escherich, quién la llamó Bacterium coli;
posteriormente esta bacteria recibirá el nombre con la que actualmente se la
conoce, en honor a su descubridor (Pesantez, 2010).
Schardinger, en 1982, fue el primero que utilizó E.coli como indicador de
organismos patógenos transmitidos por el consumo de agua; Teobaldo
Smith, un año más tarde manifiesta que al ser E. coli un organismo que se
encuentra de forma constante en el tracto intestinal, su presencia en agua o
alimentos se debe a que ha existido contaminación con materia fecal del
hombre o animales de sangre caliente (Jay, 2000).
2.3.2.2.1. Generalidades
E. coli pertenece al grupo de coliformes, es una bacteria Gram negativa,
anaerobia facultativa, no esporulada, con forma de bastón como se observa
en la Figura 2.3; su nicho natural es el tracto intestinal de los seres
humanos, animales de sangre caliente y aves (Ray & Bhunia, 2010).
19
Figura 2.3. Estructura de Escherichia coli
(Puerta- García & Mateos-Rodríguez, 2010)
Se multiplica a temperaturas entre 6 y 50º C, con una temperatura óptima
alrededor de 37º C. También, pueden crecer en presencia de un 6% de
NaCl, ya que es más resistente a estos compuestos en comparación a otras
bacterias, como por ejemplo, Salmonella (Guadalupe, 2002).
En la Tabla 2.3 se indican los principales parámetros que inciden en el
crecimiento de E.coli.
Tabla 2.3. Condiciones de crecimiento de E.coli
Condiciones Mínimo Óptimo Máximo
Temperatura 7-8 35-40 46
pH 4.4 6-7 10
aw 0.95 0.99 ----
(Do Santos, 2007)
Investigaciones realizadas indican que existe más de un tipo de cepas
patógenas de E.coli; se han dividido en seis grupos en base a la capacidad
para producir toxinas, adherirse e invadir las células epiteliales del intestino.
Los grupos son: E.coli enterotoxigénica (ETEC), E.coli enteropatogénica
(EPEC), E.coli enteroinvasiva (EIEC), E.coli difusamente adherida (DAEC),
E.coli enteroagregativa (EAEC) y E.coli enterohemorrágica (EHEC)
(Montville et al., 2012).
20
2.3.2.2.2. Enfermedades
E. coli coloniza el intestino del hombre pocas horas después de que ha
ingresado al organismo; se le considera un microorganismo de flora normal,
pero hay cepas que pueden ser patógenas y causar daño produciendo
diferentes cuadros clínicos, entre ellos diarrea (Guadalupe, 2002).
Es considerado un microorganismo marcador que actúa como indicador e
índice ya que la presencia genérica de este microorganismo en una muestra
revela una posible contaminación fecal y la posible presencia simultánea en
el alimento de otros microorganismos patógenos ecológicamente
relacionados (Montville et al., 2012).
La forma de infección de E. coli en la mucosa intestinal es: adhesión,
colonización de la mucosa para absorber nutrientes de la flora del intestino,
evasión de las defensas del huésped, multiplicación y daño al huésped
(García, 2004).
Según el tipo de cepa, se genera sintomatología diferente causada por el
tipo de toxina o mecanismo presente. En la Figura 2.4se presenta la
patología desarrollada por diferentes cepas de E.coli.
21
Figura 2.4. Características de cepas de E.coli causantes de diarrea
(García, 2004)
La cepa enterohemorrágica de E.coli (EHEC), fue reconocida en 1982 como
un patógeno que afecta al hombre pudiendo causar diarrea o colitis
hemorrágica en seres humanos. El principal reservorio de EHEC O157: H7
en particular es el ganado vacuno y ovino, quienes no presentan síntomas
de la infección, eliminando de su organismo heces contaminadas. Los seres
humanos adquieren EHEC O157: H7 por contacto directo con los animales,
sus excrementos, tierra/ agua contaminada, o por medio de la ingestión de
carne de vacuno y otros productos animales como la leche, así también por
la ingesta de verduras y frutas contaminadas. La dosis infecciosa de este
serotipo de E. coli es baja, se requieren de 100 a 200 bacterias para producir
la enfermedad y el período de excreción del organismo varía de 2 días a 5
meses, lo que aumenta el riesgo de enfermedad (OIE, 2009).
22
2.3.2.2.3. Alimentos implicados
La presencia de E.coli en las materias primas alimenticias indica
contaminación fecal, directa o indirecta. La contaminación directa ocurre en
el procesamiento de materias primas de origen animal por la falta de higiene
de las personas que manipulan el producto, la contaminación indirecta se da
por aguas servidas o sucias (Ray & Bhunia, 2010). Algunos ejemplos de
alimentos contaminados se lista en la Tabla 2.4.
Tabla 2.4. Alimentos Contaminados con E.coli
Alimento Tipo de Contaminación
Carne picada cruda o poco cocida Directa
Semillas germinadas crudas Indirecta
Leche cruda Indirecta
Hamburguesas poco cocidas Directa
Salami curado Directa
Yogur Directa
Queso elaborado con leche cruda Directa
Frutas Indirecta
Verduras:
Col
Espinacas
Lechuga
Ensaladas
Indirecta
(OMS, 2011)
Otras cepas de E.coli, especialmente la EHEC, son capaces de sobrevivir
durante meses en el estiércol contaminando, afectando directamente las
aguas superficiales que se utilizan para bebida y riego, contaminando así las
verduras, frutas y productos que se encuentran en la superficie de las tierras
de cultivo (Guadalupe, 2002).
23
En 1982, se detectó por primera vez una infección masiva de E.coli O157:H7
relacionada con el consumo de productos cárnicos; recientes casos de
enfermedades con este serotipo han sido relacionadas con frutas y
vegetales contaminados cuya causa principal se debe al agua de riego
(Montville et al., 2012).
2.3.2.2.4. Prevención
Las fuentes de transmisión de E.coli se pueden prevenir aplicando medidas
de control en todas las etapas de la cadena alimentaria, desde la producción
agropecuaria en la granja hasta la elaboración, fabricación y preparación de
los alimentos, tanto en establecimientos comerciales como en los hogares.
Las medidas de prevención frente a E.coli se centran en cocción adecuada
de los alimentos, uso de agua potable, lavado de frutas y vegetales antes de
consumirlos, y sobre todo una correcta higiene tanto del manipulador como
del consumidor de alimentos (OMS, 2011; DoSantos, 2007).
2.3.2.3. Análisis y detección de coliformes
Según Rivera (2012), para detectar E.coli se deben realizar tres pruebas
consecutivas: presuntiva, confirmativa y complementaria.
Prueba presuntiva: Se emplea la determinación del Número Más Probable
(NMP) que es la estimación del número de bacterias existentes en una
muestra de alimento. Se realizan diluciones sucesivas con el medio líquido
Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa y campanas de Durham; el fin de realizar
esta prueba es buscar tubos con presencia de gas lo que es indicativo de
una prueba positiva procedente del CO2 que causa la fermentación de la
lactosa. Se calcula el número más probable de E.coli por mililitro o gramo de
alimento utilizando las tablas del número más probable (INEN, 1990).
24
Prueba confirmatoria: Con cada uno de los tubos positivos de la prueba
presuntiva, se realiza la técnica de recuento en placa mediante siembra por
estría en placas Petri con medio selectivo líquido, como es el Agar Eosina
Azul de Metileno (EMB); de las colonias sospechosas se realizará tinción
Gram, con ello se comprobará la presencia de bacilos Gram negativos no
esporulados (INEN, 1990).
Prueba complementaria: Para identificar las diferentes bacterias
pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, se emplea un conjunto de
pruebas bioquímicas conocidas como IMViC, con las que se verifica la
producción de indol a partir del triptófano (I), se comprueba el descenso de
pH del caldo glucosa a través de la reacción de rojo de metilo (M), la
comprobación de la producción de acetona a partir de glucosa través de la
reacción de Voges- Proskauer (V), y la utilización del citrato como fuente de
carbono (C) (Rivera J. F., 2012).
En la Figura 2.5 se muestra un esquema de los análisis microbiológicos que
se realizan para la detección de E.coli.
25
Figura 2.5 Análisis Microbiológico de E.coli
(Cano, 2006)
2.4. VEGETALES TIPO HOJA
“Los productos frescos son probablemente los alimentos más difíciles para
establecer criterios y controles microbiológicos” (Montville et al., 2012).
Los alimentos son de gran importancia en la salud y la vida de las personas,
la frecuencia de consumo de vegetales ha aumentado por su calidad
nutricional, por lo que se debe salvaguardar la calidad higiénica y sanitaria
de los mismos, desde el campo hasta la mesa del consumidor (Gombas,
2012).
Por lo general los alimentos que se consumen frescos como vegetales y
frutas tienen una microbiota natural compleja que viene dada desde el
campo. Evidencias epidemiológicas indican que la contaminación en
productos frescos no presenta peligro para la salud, sin embargo los criterios
microbiológicos para vegetales frescos se han aplicado desde que se han
26
presentado brotes epidemiológicos resultantes de vegetales frescos
contaminados con patógenos entéricos (Montville et al., 2012).
Los productos frescos no eran considerados como vehículo de
enfermedades alimentarias hasta antes de los años 90’s cuando se produjo
una epidemia de cólera en Latinoamérica que redujo notablemente el
consumo de hortalizas en muchos países de la región por casi un año
(Camelo, 2003).
Los vegetales tipo hoja son consumidos en fresco, por lo tanto todo
organismo patógeno para el ser humano que pueda transportarse sobre su
superficie constituye un peligro potencial. Bacterias como Shigella spp.,
Salmonella spp., Aeromonas spp., Escherichia coli, Listeria monocytogenes
así como las toxinas producidas por Clostridium botulinum y otros
microorganismos han sido identificadas como responsables de
enfermedades alimentarias transmitidas por la ingestión de frutas y
hortalizas (Camelo, 2003).
Se requiere un manejo cuidadoso de los vegetales tipo hoja durante la
cosecha y empaque ya que por su naturaleza y fácil contacto con aire, agua
y suelo, pueden facilitar la entrada de los microorganismos y provocar
alteraciones o daños físicos en el alimento (Do Santos, 2007).
2.4.1. CILANTRO
2.4.1.1. Generalidades de la planta
El cilantro (Coriandrum sativum), perteneciente a la familia Apiaceae
(Umbelliferae), es un cultivo que se originó en el sur de Europa, continente
asiático, centro y norte de la India, centro y sur de Rusia y regiones
orientales de Afganistán y Pakistán (Vallejo & Estrada, 2004).
27
Su uso por primera vez como planta medicinal y de condimento aparece en
registros históricos egipcios de 1550 A.C; los españoles y portugueses en
sus viajes de conquista y colonización trajeron el cilantro y otras especias al
Caribe, Centro y Sur América (Morales J. P., 1995).
Alcanza 40 a 80 cm de alto, sus hojas presentan un color verde claro u
oscuro, con bordes dentados; sus hojas son alternadas, finamente divididas
con un pecíolo en la base; las flores son actinomorfas y hermafroditas y
están dispuestas en umbelas formadas generalmente por un pequeño cáliz
de 5 sépalos, una corola de 5 pétalos, 5 estambres alternados con pétalos.
Las semillas tienen de 3 a 5mm de diámetro, son redondas de color verde y
cambiando a marrón al madurar, tienden a desprenderse de la planta
cuando están maduras (Vallejo & Estrada, 2004; Morales, 1995).
En las Figuras a y b se muestran las diferentes estructuras morfológicas que
puede tener el cilantro, formadas generalmente por un tallo que se ramifica
presentando hojas finas y delgadas (Vallejo et al., 2004).
Figura 2.6. Estructuras Morfológicas del Cilantro: a) Planta de cilantro
florecida, b) Posición de hojas en tallo.
(Morales J. P., 1995)
28
2.4.1.2. Clasificación taxonómica
La clasificación taxonómica del cilantro que propone (Oleas & Taco, 2011)
se presenta en la Tabla 2.5.
Tabla 2.5. Clasificación Taxonómica del Cilantro
Nombre
Científico
Coriandrum sativum
Nombre común Cilantro
Reino Plantae
Clase Angiospermas
Subclase Dicotiledónea
Familia Umbelliferae Juss
Subfamilia Apidaceae Drude
Tribu Coriandreae W. Koch
Géneros Coriandrum
Bifora, Hofman
Sclerotiaria Korovin
(Oleas & Taco, 2011)
2.4.1.3. Composición y valor nutricional
La composición del cilantro en 100 gramos de porción comestible se detalla
en la Tabla 2.6.
29
Tabla 2.6. Composición nutricional del cilantro
(INIAP, 2000)
La parte comestible del cilantro es principalmente su follaje, las hojas frescas
del cilantro son ricas en caroteno, calcio y vitaminas A, B2 y C (Morales J.
P., 1995).
Las hojas poseen propiedades diuréticas, estimulantes, antisépticas,
antiespasmódicas y purificadoras de la sangre, se usa para cicatrizar
heridas, úlceras y ayuda a la maduración de inflamaciones (Corporación
Colombiana Internacional, 2006).
Sus propiedades medicinales y aromáticas están relacionadas con su
contenido de aceites esenciales que forman parte de la composición
química del cilantro como son: decanal, dodecanal, decano, huleno,
cerofileno, linanol, taninos, ácido málico (Ramos, 2008).
2.4.1.4. Variedades
En general las variedades del cilantro se clasifican como de floración lenta o
rápida, y según el color de sus flores blanco, rosa o morado.
Como se indica en la Tabla 2.7, actualmente en el mercado también existen
cultivares híbridos que han sido aprobados por los agricultores a pesar de su
alto costo (Vallejo & Estrada, 2004).
Composición Química de la parte comestible (100g)
Agua 83.00
Proteína 4.20
Grasas 0.46
Carbohidratos 8.00
Fibra 2.20
Cenizas 2.20
30
Tabla 2.7. Variedades de Cilantro
Nombre del
Cultivar
Característica Tipo
Cilantro Criollo
Florece a los 40-50 días, del mismo
se han desarrollado diferentes
variedades
Variedad
MS Susceptible a la cenicilla causada por
el hongo Erysiphe Variedad
Long Stanlin Alcanza 75cm de alto al madurar las
semillas Híbrido
Shepherd’s
Floración rápida, semillas inmaduras
de olor y sabor muy fuertes, cuando
maduran la fragancia cambia a olor
parecido al cítrico.
Híbrido
Slow Bolt
Floración lenta, de hoja ancha de
excelente productividad para
consumo en fresco.
Híbrido
Mágnum Color verde intenso, buen
comportamiento poscosecha Variedad
(Vallejo & Estrada, 2004)
2.4.1.5. Cultivo en el Ecuador
El cilantro en el Ecuador tiene una producción amplia y con alta frecuencia,
debido a las características geográficas y climáticas del país, que favorecen
su desarrollo y crecimiento. Se lo cultiva especialmente en la Sierra, en las
provincias de Imbabura, Pichincha, Chimborazo, Carchi, Tungurahua y
Bolívar; tiene un ciclo vegetativo corto, que entre la siembra y la cosecha,
oscila alrededor de 40 a 45 días ( Revista El Agro, 2013).
31
Los requerimientos climáticos de este cultivo son de preferencia entre los
1000 y 1300 metros sobre el nivel del mar, en suelos francos y franco
arcilloso, bien drenado, rico en materia orgánica, pH entre 5 y 7,5. (Morales,
Brunner, Flores, & Martínez, 2011).
Las enfermedades más comunes en el cilantro están causadas por
patógenos que afectan las hojas, por ejemplo hongos como: Erysipe,
Cercospora y Alternaria, y la bacteria Pseudomonas syringae o los que
afectan las raíces como Rhizoctonia y Fusarium. Las plagas más reportadas
incluyen orugas como: Spodoptera exigua, Spodoptera frugiderpay
Trichoplusia nii, ácaros y trípidos(Morales et al., 2011).
Un estudio realizado por expertos de la Universidad de California (USA) y de
la Universidad Autónoma de Guadalajara (México) confirma que el cilantro
es eficaz para combatir bacterias presentes en los alimentos como la
Salmonella, resultando ser más efectivo que la gentamicina, antibiótico
utilizado normalmente para combatir esta bacteria (Wong & Kitts, 2006).
2.4.2. PEREJIL
2.4.2.1. Generalidades de la planta
El perejil (Petroselinum sativum) pertenece a la familia Apiaceae. Es una
planta herbácea bianual aromática, muy ramificada, de tallo cilíndrico, de
alrededor de 60cm de altura y con raíz carnosa. Las hojas son compuestas,
con limbo triangular y con foliolos dentados, rizados, siendo el principal
órgano de consumo; tienen una longitud de 10 a 20cm, con segmentos
ovalados o cuneiformes, algunos son lisos y otros crespos de color verde
oscuro. Las flores se presentan en forma de sombrilla aplanadas por arriba,
de color verde-amarillento y producen un fruto redondeado, que una vez
32
maduro se divide en dos medios frutos arqueados (Japon, 2011;Marsh &
Gardener, 2008).
Es originario de la región del Mediterráneo, de la isla de Cerdeña en Italia.
Se cultivó en España e Inglaterra antes del siglo XVI, extendiéndose desde
ahí a América, África y Asia. Petroselinum proviene del nombre común
griego petroselino dado a una especie de perejil que crecía sobre las rocas
(Morales J. P., 1995).
El perejil es utilizado ampliamente como condimento; sus hojas rizadas son
utilizadas como aderezo y como saborizante de carnes, salchichas,
alimentos enlatados, sopas, salsas y como sazonador; también es apreciado
como aromatizante de quesos (Marsh & Gardener, 2008).
El perejil ha demostrado tener gran cantidad de componentes químicos
como la apiína y los flavonoides, que le confieren propiedades diuréticas,
antioxidantes, emenagogas (estimula la menstruación), carminativas y
diuréticas. Debido a los apioles que contiene se lo debe usar con cuidado
pues en dosis inadecuadas puede producir convulsiones, espasmos y
parálisis; en ciertos casos presenta también propiedades abortivas o
contraceptivas (INIAP, 2000; Vallejo et al., 2004).
2.4.2.2. Clasificación taxonómica
La clasificación taxonómica del perejil que propone (Oleas & Taco, 2011) se
presenta en la Tabla 2.8.
33
Tabla 2.8. Clasificación Taxonómica del Perejil
Nombre
Científico
Petroselinum sativum
Nombre común Perejil
Reino Plantae
Clase Angiospermas
Subclase Dicotiledónea
Familia Umbelliferae
Subfamilia Apidaceae Drude
Géneros Petroselinum
(INIAP, 2000)
2.4.2.3. Composición y valor nutricional
El perejil es una hortaliza muy importante debido a su valor nutricional,
caracterizándose por tener un alto contenido de vitamina C, β-caroteno,
tiamina, riboflavina, y vitamina E (García, Cortes, & Rodríguez, 2010).
La composición nutricional del perejil es similar a la de otros vegetales tipo
hoja, que contienen un alto contenido de agua pero bajo valor energético.
En la Tabla 2.9se destacan los principales componentes nutricionales que
tiene el perejil, siendo lo más representativo su alto contenido de provitamina
A y vitamina C (Verdú & Carazo, 2005).
34
Tabla 2.9. Composición Nutricional del Perejil
Composición Química de la parte comestible (100g)
Agua 85.00
Proteína 3.40
Grasas 0.60
Carbohidratos 7.10
Fibra 2.10
Cenizas 1.80
Otros componentes (mg)
Calcio 237.00
Fósforo 58.00
Hierro 3.90
Vitamina A 3.200 UI
Tiamina 0.11
Riboflavina 0.20
Niacina 0.80
Ácido ascórbico 38.00
Calorías 44
(INIAP, 2000)
Estudios realizados con aceite esencial del perejil para evaluar su capacidad
antioxidante, mostraron que dos de sus constituyentes, el apiol y la
miristicina, contribuyen a dicha propiedad, y sugieren que el perejil podría
ser una alternativa de consumo de antioxidantes naturales (Reyes, Zabala, &
Alonso, 2012).
2.4.2.4. Variedades
Existen tres tipos principales de perejil que son: de hoja lisa, rizada y
paramount como se observa en las Figuras a-c. El de tipo hoja lisa es menos
vistoso pero tiene sabor más fuerte, el rizado tiene hojas finamente divididas
35
y arrugadas y el paramount tiene hojas rizadas más compactas siendo las
mismas encorvadas y encrespadas (García H. D., 2013).
Una de las variedades más sembradas es el “Dark Green Italian” del tipo de
hoja lisa, cosechándose entre 75-80 días, tiene hojas muy dentadas con
mejor sabor que los rizados. El perejil rizado contiene los subtipos: Doble
rizado o Moss Curled, Evergreen y Triple rizado (Morales J. P., 1995).
Figura 2.7 Variedades de Perejil: a) Perejil Liso, b) Perejil Liso y
c) Paramount
(Marsh & Gardener, 2008)
2.4.2.5. Cultivo en el Ecuador
El cultivo de perejil es muy exigente cuanto a la calidad del suelo, pues debe
ser muy rico en humus y muy fértil; es recomendable que antes de la
siembra el suelo sea arado para que las raíces puedan penetrar
profundamente. Para el cultivo comercial se debe repetir la siembra al
menos anualmente para garantizar la obtención continua de la semilla. Bajo
condiciones adecuadas resiste bien todos los climas, de preferencia el frío
(INIAP, 2000).
36
Aunque no existen datos reales de la producción de perejil en el Ecuador, se
considera que las principales zonas de cultivo están en las provincias de
Loja, Chimborazo, Bolívar, Imbabura, Cotopaxi y Tungurahua; también
existen algunos cultivos en la costa (García H. D., 2013).
2.5. INTOXICACIONES CAUSADAS POR LA INGESTA DE
VEGETALES TIPO HOJA
Las hortalizas que están expuestas a contaminación generan un riesgo
inminente para la salud humana. Uno de los factores más comunes de
contaminación microbiana para los cultivos es la utilización de aguas
servidas que contienen patógenos, empleadas para el riego, particularmente
para las hortalizas que son ingeridas sin cocerlas como es el caso de:
lechugas, col, zanahoria, rábano, perejil, apio, cebollín y el cilantro (Clavijo,
2011).
Un informe realizado por el Centro para el Control de Enfermedades de
Estados Unidos (CDC, por sus siglas en inglés) a través de información
recopilada desde 1998 al 2008, indicó que las verduras de hojas verdes son
responsables de más enfermedades transmitidas por alimentos que
cualquier otro producto alimentario. La fuente del 22% de las enfermedades
se encontró en verduras de hojas verdes como la col rizada o la espinaca
(Diario El Comercio, 2013;Grajales, 2013).
Se han reportado varios casos de contaminación presente en vegetales tipo
hoja en diferentes lugares del mundo:
En Mayo del 2011, se declaró en Alemania una toxiinfección alimentaria por
verduras (pepinos, tomates y lechuga) contaminadas con Escherichia coli
37
O157:H7 teniendo como resultando 1000 afectados y 10 fallecidos (Diario El
Universal, 2011).
Real Mex Foods, en agosto del 2012, emprendió un retiro voluntario del
mercado de 77.688 libras de su marca El Torito, específicamente de la
ensalada lista: “Grilled Chicken Caesar Salad” debido a una posible
contaminación por Salmonella ya que contenía un aderezo hecho con
cilantro que la Administración de Alimentos y Medicina (FDA) había
ordenado retirar del mercado debido a la contaminación con este patógeno.
El retiro fue clasificado como de Clase I, que indica una situación de peligro
que provoca efectos adversos graves o incluso la muerte como
consecuencia del consumo de los productos (Arteaga, 2012).
En el mes de abril del 2013, la Subsecretaría de Defensa del Consumidor de
Argentina inhibió el consumo de verduras de hoja, como espinaca, acelga y
lechuga durante quince días debido a que podían estar contaminadas como
consecuencia de inundaciones que afectaron a la zona del cinturón verde de
La Plata, lugar que abastece de verduras y todo tipo de hortalizas al resto
del país (Diario InfoRegión, 2013).
En agosto del 2013, Buurma Farms Inc., empresa dedicada a la producción
y venta de vegetales frescos, retiró voluntariamente 465 cajas de cilantro lote
No. 02D312A4, debido a una posible contaminación con Listeria
monocytogenes. La empresa se dio cuenta de este problema después de
que el Departamento de Agricultura de Michigan realizara una prueba de
rutina; rápidamente se alertó al resto de minoristas y mayoristas pidiendo
que se retirara el producto de sus estantes (Robledo, 2013).
Según un estudio del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos
(FAO), la radiación ionizante es el único método que consigue eliminar por
completo los patógenos causantes de enfermedades que pueden ser
transmitidos en los alimentos frescos. Los investigadores desarrollaron un
método en el cual sumergieron dos vegetales de hoja verde (espinaca y
38
lechuga) en una mezcla con E. coli. Las hojas fueron tratadas mediante tres
sistemas: lavado con agua, enjuague con un tratamiento químico (solución
de hipoclorito de sodio) y con irradiación (con una dosis de 1-10 kilo Grays
(kGy). Los resultados finales mostraron que el lavado con agua no fue eficaz
para reducir los niveles del patógenos; el tratamiento químico no redujo de
forma significativa el número de E. coli en las hojas de espinacas y redujo en
menos de un 90% las bacterias en las muestras de lechuga. Finalmente, la
radiación ionizante redujo de forma significativa la población del patógeno
tanto en las hojas de espinaca como de lechuga. El nivel de eliminación fue
independiente de la dosis aplicada, con reducciones del 99.99% en la
lechuga y del 99.90% en espinacas en las dosis más altas (10kGy) (Zamora,
2008).
2.6. USO DE INDICADORES ENTÉRICOS PARA DETERMINAR
LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE VEGETALES TIPO
HOJA
La microbiota original de los alimentos crudos proviene del entorno donde se
producen, es decir de las granjas o tierras de cultivo. La manipulación de los
alimentos crudos durante su obtención y transporte aumentan una gran
cantidad de contaminantes. La calidad de los alimentos depende de sus
propiedades físicas, químicas, microbiológicas y sensoriales; la calidad
microbiológica puede estimarse en términos generales mediante el análisis
microbiológico de recuento total en placa (RTP) (Yousef & Carlstrom, 2006).
Para determinar la calidad de los vegetales, en diferentes países de América
Latina se han realizado estudios afines con el tema de investigación
empleando distintas muestras de vegetales frescos y obteniendo niveles
significativos de contaminación microbiana; la información recopilada de
estos estudios se puede observar en la Tabla 2.10
39
Tabla 2.10. Calidad Microbiológica en Vegetales Frescos
Título Vegetal Microorganismos
encontrados País/Año
Calidad
microbiológica y
bacterias
enteropatógenas
en vegetales
tipo hoja
Lechugas
Cilantros
Perejiles
Coliformes totales
y fecales
Salmonella
Aeromonas
Vibrio
Venezuela
2010
Frecuencia de
Listeria en
muestras de
tomates y
cilantro frescos
en tres
supermercados
Tomates
Cilantro
-Listeria
monocytogenes
-Listeria ivanovii
-Listeria seeligeri
Venezuela
2009
Contaminación
fecal en
hortalizas que
se expenden
en mercados
-Cebolla
-Rabanito
-Culantro
-Lechuga
-Perejil
-Coliformes
fecales
-Escherichia
coli
Perú
2009
Indicadores
entéricos en
vegetales
frescos que se
comercializan
en mercados
populares
Lechugas
Cilantros
Perejiles
-Coliformes
totales y fecales
- Escherichia coli
Venezuela
2009
Calidad
sanitaria de
ensaladas de
verduras
crudas, listas
para su
consumo
-Espinaca
-Lechuga
-Pepino
-Cebolla
-Coliformes
totales, fecales
-Escherichia coli
México
2006
Calidad
microbiológica
y aislamiento
de Shigella en
vegetales
frescos
Lechugas
Tomates
-Shigella sp.
-Salmonella sp.
-Coliformes
totales y fecales
Costa Rica
2001-2002
40
En el Ecuador se ha realizado un estudio sobre la determinación de
coliformes totales y E. coli en muestras de lechuga expendidas en cuatro
mercados de la ciudad de Cuenca, reportando un grado de contaminación
tolerable de coliformes totales y un nivel aceptable de la presencia de E. coli
en las lechugas (Vélez & Ortega, 2013).
Sin embargo aún no se cuenta con normativa ecuatoriana, razón por la cual
se han empleado valores referenciales de normas internacionales para
determinar el grado de contaminación presente en los vegetales en estudio.
3. METODOLOGÍA
41
3. METODOLOGÍA
3.1 DESCRIPCIÓN Y TOMA DE MUESTRA
La población objeto de estudio estuvo conformada por dos vegetales tipo
hoja: cilantro y perejil. Se seleccionaron al azar tres puestos de expendio de
estos vegetales en cada uno de los mercados populares seleccionados del
Norte de la ciudad de Quito: Mercado La Ofelia, Santa Clara y La Carolina
como se muestran respectivamente en la Figura 3.1.
Figura 3.1. Mercados del Norte de la ciudad de Quito
42
Las muestras fueron recolectadas los días sábados en el mercado La Ofelia,
y los días domingos en los mercados Santa Clara y La Carolina, en las
condiciones normales de manipulación y venta al público; tanto el culantro
como perejil fueron colocados en un funda plástica por las mismas
vendedoras (con las manos que manipulan el dinero de la venta), en cada
puesto de venta el peso aproximado que se adquirió fue 80g de cada
vegetal. Las muestras se tomaron de 3 lotes diferentes, durante los meses
de febrero y marzo del 2014; cada muestra en 2 tomas distintas (2 réplicas),
fueron transferidas a una funda sellada estéril etiquetada, conservada en
cadena de frío para su posterior traslado al Laboratorio de Microbiología de
la Universidad Tecnológica Equinoccial para los respectivos análisis.
3.2ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS
3.2.1 DILUCIONES SUCESIVAS
Para realizar los análisis microbiológicos se realizaron diluciones sucesivas
según la norma técnica ecuatoriana INEN1 529-2
Los ensayos se realizaron en una cámara de flujo laminar marca Telstar, con
el fin de mantener condiciones estériles. Se pesó 25g de muestra y se
transfirieron a un frasco con 225 mL de agua peptonada estabilizada el pH;
se homogenizó la muestra (dilución 10-1) y a partir de esta dilución se
preparó diluciones sucesivas (10-2…10-7) en tubos de ensayo que contenían
9 mL de agua peptonada.
43
3.2.2 RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE COLIFORMES
FECALES Y Escherichia coli
El recuento de coliformes fecales y Escherichia coli se realizó según la
norma técnica ecuatoriana INEN 1529-8
3.2.2.1 Colimetría presuntiva
Se inoculó 1ml de las diluciones 10-110-2 y 10-3, a una serie de tres tubos
para cada dilución que contenían 9 mL de caldo BGBL (verde brillante bilis
lactosa) con tubos Durham invertidos. Se incubaron a 30°C por 48 horas.
Transcurrido este tiempo se consideró como presuntos positivos en cada
dilución todos aquellos tubos que presentaron crecimiento con producción de
gas que llene el fondo cóncavo de la campana Durham como se observa en
la Figura 3.2. Para la lectura de los resultados se obtuvo una combinación
numérica que fue comparada con la tabla de NMP incluida en el Anexo I.
Figura 3.2. Tubos BGBL
44
3.2.2.2 Colimetría confirmatoria
Posteriormente, de cada uno de los tubos presuntamente positivos se
inoculó de dos a tres asadas en 2 tubos: uno con 10 mL de caldo BGBL con
campanas Durham y otro con 3 mL de TSB (caldo triptona de soya) los
cuales fueron incubados por 24 horas a 45.5°C.Transcurrido este tiempo, se
consideró como coliformes fecales positivos los tubos de BGBL que
presentaron producción de gas y aquellos de TSB positivos a la prueba de
producción de indol (al añadir tres gotas del reactivo de Kovac se forma un
anillo rojo en la superficie); la reacción fue negativa cuando se conservaba el
color original del medio (Figura 3.3).
Figura 3.3. Tubos BGBL y TSB
A continuación, de cada tubo de BGBL que resultó positivo para las dos
pruebas mencionadas anteriormente, se inoculó aplicando la técnica de
siembra en estría, con la ayuda de un asa estéril se transfirió una porción de
cultivo a una placa de EMB (agar eosina azul de metileno). En la figura 3.4
se observa el procedimiento de siembra en estría; se incubó las placas
invertidas a 37°C por 24 horas.
45
Figura 3.4. Siembra en estría
(Cano, 2006)
Se seleccionaron 2-3 colonias bien aisladas y típicas de E. coli, negras
nucleadas con brillo verde metálico, y se sembró para purificar el cultivo por
la técnica de cola de pez en tubos inclinados con PCA (agar de recuento en
placa) incubándolos a 37°C por 24 horas. Con las bacterias que crecieron
se efectuó la tinción por el método Gram con el fin de saber si el cultivo
presentaba un solo tipo de microorganismos, bacilos Gram negativos.
La tinción Gram se realizó según el procedimiento de Rivera(2012) y Yousef
& Carlstrom (2006). Se transfirió una porción de colonia desde el tubo
sembrado por cola de pez de la Figura 3.5 (a), a una gota de agua destilada
mezclándola y difundiéndola con la ayuda de un asa, se secó la extensión y
se fijó con calor pasando el portaobjetos sobre la llama de un mechero. Para
ejecutar la tinción Gram se cubrió la extensión con cristal violeta durante 1
minuto, se lavó con agua destilada con la ayuda de una piseta, se colocó
lugol por 1minuto y se lavó. Posteriormente se añadió una mezcla alcohol
acetona, se lavó y finalmente se añadió safranina por 30 segundos se lavó
nuevamente con agua destilada, se secó y se observó la placa con un
46
microscopio marca Olimpus CX31, con el lente 100X colocando una gota de
aceite de inmersión sobre la muestra, comprobando la pureza de los cultivos
como se observa en la Figura 3.5 (b) con los que se realizó las pruebas
bioquímicas IMViC.
Figura 3.5. Cultivos Purificados
3.2.2.3 Colimetría complementaria
3.2.2.3.1 Prueba para indol (I)
A partir del cultivo puro, se sembró por picadura con una aguja de
inoculación en un tubo con medio SIM, que se incubó por 24 horas a 37°C.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se añadió 2 gotas de reactivo
de Kovac. La aparición de color rojo en la superficie del reactivo determina
que la prueba es positiva, mientras que la prueba es negativa cuando el
reactivo conserva el color original.
Para la prueba de indol en la colimetría presuntiva, NMP positivos, se
sembró por depósito de dos a tres asadas en un tubo con 3mL de caldo
TSB, se incubó por 24 horas a 45,5°C, transcurrido este tiempo se añadió 3
gotas del reactivo de Kovac. La prueba es positiva cuando aparece un anillo
rojo en la superficie del medio después de añadir el reactivo.
47
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido
triptófano; las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de
hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y
aminoácido. Se produce un anillo rojo-morado cuando se ha producido indol
a partir del triptófano en el medio (Jimenez, 2009).
3.2.2.3.2 Prueba de rojo de metilo (RM)
Se sembró por depósito una asada de cultivo puro en un tubo con caldo RM-
VP (rojo de metilo-Voges Proskauer) a 37°C por 24 horas. Después del
tiempo transcurrido de incubación se añadió 3 gotas de solución de rojo de
metilo. Si el medio se torna rojo la prueba es positiva y negativa cuando no
cambia el color del medio. Es una prueba que indica por qué vía metabólica
se ha fermentado la glucosa; una coloración roja indica que la glucosa es
metabolizada vía ácidos mixtos; donde estos ácidos (acético, fórmico) son
relativamente fuertes y producen un descenso brusco del pH del medio (este
cambio de pH se detecta añadiendo el indicador rojo de metilo) (Macddafin,
2008).
3.2.2.3.3 Prueba de Voges-Proskauer (VP)
Se sembró por depósito una asada de cultivo puro en un tubo con caldo RM-
VP (rojo de metilo- Voges Proskauer) por 24 horas a 37°C, después de este
tiempo se añadieron 3 gotas de solución alcohólica de α-naftol al 6%, y
finalmente 2 gotas de solución de hidróxido de potasio al 40%, se agitó el
tubo después de añadir cada solución. Al paso de aproximadamente 5
minutos se observó la reacción. La aparición de un color rojo brillante indicó
que el resultado es positivo, mientras que si no hay cambio de color la
48
reacción es negativa. Es una prueba que detecta la fermentación
butanodiólica, en la cual se producen menor cantidad de ácidos que en la
fermentación ácido-mixta (prueba rojo de metilo), y una gran cantidad de
butanodiol. Mediante α-naftol y KOH al 40%, se detecta la presencia de
acetoína que en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo, este origina una
coloración roja al reaccionar con los restos guanidínicos de algunos
aminoácidos de la peptona del medio (Winn, Janada, & Woods, 2006).
3.2.2.3.4 Prueba para la utilización de citrato
Para realizar esta prueba, se sembró por estría sobre la superficie del pico
de flauta del medio Simmons Citrato, se incubó por 24 horas a 37°C. Pasado
este tiempo se observó la reacción; un cambio de color del medio de verde a
azul determinó que la prueba fue positiva. Esta prueba se fundamenta en
que un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de
carbono, también utiliza las sales de amonio como fuente de nitrógeno; la
extracción del nitrógeno de las sales amonio producen amoníaco el cual
alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino (azul) (Betancourt, 2007).
La presencia de E. coli, se confirma cuando los microorganismos detectados
cumplan con las características que se detallan en la Tabla 3.1.
49
Tabla 3.1 Clasificación de coliformes por IMViC
(INEN, 1990)
3.2.3 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES POR LA TÉCNICA
DE RECUENTO EN PLACA
La siembra en placa para el recuento total de coliformes se realizó según la
metodología de Yousef & Carlstrom (2006).
Se depositó 1 mL de las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7en placas Petri vacías y
se transfirió 15 mL de agar VRB (agar bilis rojo violeta) fundido (~48°C) a las
placas, se homogenizó la mezcla con la ayuda de un agitador de placas
para asegurar la distribución uniforme del inóculo. Se incubó a 37°C por 24
horas. Se consideran como coliformes a las colonias que presentan un color
rojo-púrpura rodeadas de un halo de ácidos biliares precipitados como se
observa en la Figura 3.6.
50
Figura 3.6. Coliformes en Agar VRB
3.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Se utilizó un diseño factorial AxB, siendo la variable A los mercados y B los
lotes; los resultados fueron procesados mediante un análisis de varianza
(ANOVA), las medias fueron comparadas con la prueba de Tukey con una
significancia de 0.05 usando el software estadístico INFOSTAT versión
estudiantil.
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
En el presente capítulo se describen los resultados y discusión del recuento,
aislamiento e identificación de coliformes totales, fecales y E.coli en
muestras de cilantro y perejil expendidos en mercados del norte de la ciudad
de Quito. Los mercados se designaron numéricamente como: 1. Ofelia, 2.
Iñaquito y 3. Santa Clara. Las evidencias fotográficas de la recolección de
muestras en cada mercado se presentan en los Anexos II-IV.
4.1 RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES Y
Escherichia coli
Según la norma INEN 1529-8 (1990), el análisis de E. coli comprende tres
fases: colimetría presuntiva (coliformes totales), colimetría confirmativa
(coliformes fecales) y colimetría complementaria (E.coli).
Actualmente en el Ecuador no existen normas que indiquen los valores
máximos permisibles de coliformes totales, fecales y E.coli en vegetales tipo
hoja (cilantro y perejil), tampoco se registran estudios publicados en relación
a la identificación de indicadores entéricos en este tipo de alimentos, por lo
tanto resulta difícil verificar el cumplimiento de criterios microbiológicos que
permiten aceptar o rechazar el producto.
52
4.1.1 COLIFORMES TOTALES
Para el recuento de coliformes totales se empleó el método de la
determinación del número más probable (48h a 30°C) por la técnica de
dilución en tubos. Según la combinación numérica obtenida con los tubos de
BGBL se detectó en todas las muestras un NMP de coliformes >1100
UFC/g, razón por la cual se procedió a la determinación de coliformes totales
por la técnica de recuento en placa, en un medio selectivo para este tipo de
microorganismos como se observa en la Figura 4.1. Algunas investigaciones
realizadas en hortalizas revelan una importante contaminación fecal; López,
Romero, & Duarte (2003) en Chile reportaron en el 100% de muestras de
apio que los valores de coliformes fueron >1100/g poniendo en manifiesto
una elevada contaminación de este alimento.
Figura 4.1 Recuento de Coliformes Totales a) Técnica NMP
b) Técnica de Recuento en Placa
Los valores reportados en los recuentos en placa para coliformes totales se
muestran en la Tabla 4.1
53
Tabla 4.1. Resultados de Coliformes Totales por Mercado
Cilantro Perejil
Mercado Log UFC/g1
1 5.36 ± 0.41a 7.45 ± 0.22a
2 4.33 ± 0.43b 5.52 ± 0.54c
3 5.57 ± 0.24a 6.20 ± 0.54b
1media ± desviación estándar (n=6)
Letras diferentes indican diferencia significativa entre mercado (p<0.05)
En relación a los resultados de los recuentos obtenidos en cilantro, el
promedio de las medias obtenidas fue de 5.09 log UFC/g presentando
diferencias de 1 log entre cada uno de los mercados, el mercado 3 fue el que
presentó mayor población de coliformes totales. Ginestre et al. (2010)
reportaron que el 96% de las muestras presentaron coliformes totales en
muestras de cilantro comercializados en mercados populares de Maracaibo,
los recuentos obtenidos estuvieron en un rango de 4 - 9 log UFC/g,
resultados que fueron similares a los obtenidos en el presente estudio, la
fuente de variación de los recuentos de coliformes totales puede ser por el
sitio de muestreo y el tipo de vegetal analizado.
El valor promedio de los recuentos de coliformes totales en perejil fue 6.39
log UFC/g, siendo la diferencia entre medias superior a 0.6 log UFC/g entre
los mercados. Los mayores recuentos se obtuvieron a partir del mercado
1fueron de estos valores son más altos que los reportados por Emin & Vural
(2008), quienes determinaron la calidad microbiológica de vegetales de hoja
verde en dos sitios de expendio en la ciudad de Diyarbakir-Turquía: en
perejil reportaron recuentos de coliformes totales de 2.20 log UFC/g en
muestras adquiridas en verdulerías y 3.96 log UFC/g en bazares o
mercados.
54
Rincón et al. (2010) analizaron la calidad microbiológica de vegetales tipo
hoja en dos supermercados de Maracaibo-Venezuela; reportaron la
presencia de coliformes totales con valores para el cilantro de 4.19 log
UFC/g y para el perejil de 4.03 log UFC/g, según los autores esta elevada
carga microbiana indica que estos vegetales pueden representar una fuente
potencial de microorganismos patógenos.
Los resultados obtenidos en relación al recuento de coliformes totales por
puesto de expendio en cada mercado, para cilantro y perejil, se muestran en
las tablas 4.2 y 4.3 respectivamente; se obtuvieron resultados diferentes en
cada uno de ellos.
Tabla 4.2 Resultados de Coliformes Totales de Cilantro por Puesto de
Expendio
Log UFC/g1
Puesto Mercado 1 Mercado 2 Mercado 3
1 4.88 ± 0.01b 4.84 ± 0.06a 5.83 ± 0.1ª
2 5.72 ± 0.19a 3.89 ± 0.10c 5.42 ± 0.26ª
3 5.48 ± 0.23ab 4.25 ± 0.07b 5.46 ± 0.08ª 1 media ± desviación estándar (n=2)
Letras diferentes indican diferencia significativa entre mercado (p<0.05)
55
Tabla 4.3 Resultados de Coliformes Totales de Perejil por Puesto de
Expendio
Log UFC/g1
Puesto Mercado 1 Mercado 2 Mercado 3
1 7.36 ± 0.11a 4.87 ± 0.12a 6.65 ± 0.07ª
2 7.42 ± 0.16a 5.67 ± 0.08a 6.43 ± 0.13ª
3 7.59 ± 0.37a 6.02 ± 0.17b 5.53 ± 0.10b 1 media ± desviación estándar (n=2)
Letras diferentes indican diferencia significativa entre mercado (p<0.05)
Tanto para cilantro como para perejil en el mercado 2 se encontraron los
valores de coliformes totales más bajos en las muestras analizadas. Al
comparar los resultados de los recuentos obtenidos en cada vegetal se pudo
observar de manera evidente que la contaminación microbiana fue más
elevada en las muestras de perejil, esta diferencia podría atribuirse a que el
área superficial que presentan las hojas de este vegetal es mucho mayor a
la del cilantro; tanto el mercado 1 como el 3 presentaron elevada
contaminación de coliformes totales con una diferencia de medias superior a
0.9 log UFC/g. Lo ideal en un puesto de expendio es que además de
presentar recuentos microbiológicos bajos en el alimento analizado, se
asegure el cumplimiento de los requisitos básicos sanitarios como el uso de
agua potable para la limpieza tanto de los alimentos como utensilios
empleados, el uso de recipientes sanitarios para evitar despilfarros de
basura y desperdicios, y sobre todo que el aseo personal de los
expendedores (cabello, uñas, ropa) sea impecable. Se mantiene un alto
riesgo de contaminación en los alimentos que se expenden en este tipo de
lugares debido a malas prácticas de manufactura e higiene; por lo tanto el
manipulador de alimentos es responsable de controlar y evitar que el
producto comercializado esté contaminado.
56
El análisis de coliformes totales en vegetales tipo hoja cobra importancia ya
que según manifiesta Rivera (2012), los coliformes son útiles como
componentes de criterios microbiológicos para indicar contaminación,
especialmente si la muestra analizada no sufre ningún tratamiento térmico.
En el Ecuador no existen normativas que determinen valores de criterios
microbiológicos para vegetales frescos que se consumen crudos, realidad
que se repite en la mayoría de países de América Latina; sin embargo para
el presente estudio se han tomado como valores de referencia los expuestos
en normativas internacionales (México y Perú) donde se establece que los
niveles de aceptabilidad para coliformes totales en verduras y hortalizas son
de 102- 104. Los valores reportados en la presente investigación sobrepasan
estos límites establecidos.
4.1.2 COLIFORMES FECALES
Los coliformes fecales están más estrechamente relacionados con la
contaminación fecal que los coliformes totales, la presencia de ellos puede
reflejar la ineficiente calidad de los procesos asépticos a los que son
sometidos los vegetales (Emin & Vural, 2008).
En la Tabla 4.4 se muestran los resultados de la cuantificación de coliformes
fecales obtenidos por el método de NMP (45.5°C por 48 horas) referentes a
los tres mercados y al tipo de vegetal analizado. Los valores más altos de
coliformes fecales se encontraron en los mercados 1 y 2, es importante
aclarar que en ambos centros de expendio los puestos de venta se
localizaron en un espacio al aire libre en donde los vendedores arman su
puesto de venta con materiales propios, y son desmontados cuando el
horario de ventas termina razón por la cual los recuentos pudieron verse
afectados al estar directamente expuestos a factores ambientales como aire
y polvo; los puestos de venta del mercado 3 se encontraron dentro de una
infraestructura cerrada diseñada para el expendio y comercialización de
57
alimentos, es precisamente este mercado el que presentó menores
recuentos microbiológicos para este indicador.
Tabla 4.4NMP de coliformes fecales
NMP de Coliformes Fecales / g
Mercado 1 Mercado 2 Mercado 3
Cilantro 246.9 350.2 231.2
Perejil 360.1 246.5 243.0
Total 607.0 596.7 474.2
En cilantro el 29.6% de las muestras fue positivo para coliformes fecales;
este porcentaje es menor frente al obtenido por Ginestre et al. (2010),
quienes reportaron porcentajes de coliformes superiores al 80% en muestras
de cilantro. En el estudio realizado por Barrantes et al. (2002) en vegetales
frescos (lechuga y tomate), se encontró que el 27.8% (15/107) de los
vegetales presentó coliformes fecales; este valor es similar al reportado en el
presente estudio lo que podría deberse a las condiciones en las que se
realizaron ambos muestreos.
Para las muestras de perejil y cilantro el recuento de coliformes fecales fue
similar, presentándose en ambos vegetales un 29.6% de estos
microorganismos; estos valores son inferiores a los reportados para perejil
por Ginestre et al. (2010), quienes obtuvieron el 71% de muestras positivas;
mientras que en los resultados reportados por Rivera, Rodríguez, & López
(2009) el porcentaje de coliformes fecales en perejil fue de 36.8%; se
atribuyó esta contaminación al agua de riego procedente de ríos en los que
se vierte agua residual no tratada que es propagada sobre cultivos que son
vendidos en mercados locales y consumidos por la población urbana y rural
de las ciudades.
58
Los resultados obtenidos para coliformes fecales en este estudio se
interpretan como no aceptables ya que según la Norma Oficial Mexicana
NOM-093-SSA1 (COFEPRIS, 1994) en su apéndice sobre especificaciones
microbiológicas para verduras o frutas que se consumen crudas, establece
que los límites máximos permisibles para este tipo de alimentos es de 100
NMP/g de coliformes fecales poniendo en manifiesto que estos
microorganismos indicadores revelan deficientes condiciones sanitarias y de
higiene durante el procesamiento, almacenamiento y transporte de
alimentos.
4.1.3 Escherichia coli
La presencia de la bacteria E.coli fue comprobada con los resultados de las
pruebas complementarias (IMViC) cuya interpretación como se observa en la
Figura 4.2 permitió determinar el número muestras positivas para esta
bacteria.
Figura 4.2 Pruebas de Identificación Bioquímicas para E.coli: a) Indol (+),
b) Rojo Metilo (+), c) Voges Proskauer (-), d) Simmons Citrato (-)
De las 108 muestras de vegetales tipo hoja analizadas, 41 (37,9%)
resultaron positivas para determinar E.coli; 25 de estas fueron de perejil y 16
59
de cilantro. Como se observa en la Figura 4.3, el perejil fue el que presentó
mayor porcentaje de casos positivos de E. coli en relación al otro vegetal
analizado.
Figura 4.3. Presencia de Escherichia coli en vegetales tipo hoja analizados
Monge, Chinchilla, & Reyes (2000) reportaron en su estudio sobre la
estacionalidad de bacterias intestinales en hortalizas que se consumen
crudas, que en el 42% de las muestras de hojas de cilantro, los niveles de
E.coli oscilaron entre 4 log UFC/g y 7 log UFC/g y señalan que es necesario
analizar las prácticas de manejo poscosecha ya que los índices de
contaminación fecal de los productos hortícolas son mayores en las áreas de
mercado que en las de cultivo. Por otro lado, en el estudio de contaminación
fecal en hortalizas que se expenden en mercados de Cajamarca-Perú se
detectó la presencia de E.coli en más del 24% del total de las muestras
analizadas, la mayor frecuencia de esta bacteria se detectó en perejil,
lechuga y rabanito (Rivera, Rodríguez, & López,2009).
En la Figura 4.4 se presenta la distribución de las muestras de cilantro y
perejil según la presencia de E. coli por mercado y puesto de expendio. Se
Muestras Negativas
72%
Cilantro 11%
Perejil 17%
60
puede observar que en el cilantro, el mercado que tuvo mayor presencia de
esta bacteria fue el mercado 3, con 33.3% de muestras positivas,
presentándose mayores recuentos microbiológicos en el puesto 3; en el
mercado 1 se detectó esta bacteria en 27.8% de las muestras y una cantidad
igual para el mercado 2. Respecto a las muestras de perejil la mayor
incidencia de E.coli se reportó de igual forma en el mercado 3 con 72.2%
teniendo mayor incidencia de recuentos en el puesto 3, seguido del mercado
1, con 50.0% de muestras positivas y mayores recuentos en el puesto 3,
finalmente en el mercado 2 se puede observar que la incidencia de esta
bacteria se presentó únicamente en el puesto 2 con 16.7%, en los puestos 1
y 3 no se reportaron resultados de muestras positivas para la presencia de
E.coli.
Figura 4.4 Distribución de muestras de cilantro y perejil según la presencia
de E.coli por mercado y puesto de expendio
La Norma sanitaria peruana (DIGESA, 2008) establece que para frutas y
hortalizas frescas (sin previo tratamiento), el rango microbiológico aceptable
para E. coli es de 102 a 103 NMP/g; en la presente investigación se
determinó que trabajando con diluciones hasta 103 se encontró que el 37.9%
0
1
2
3
4
5
6
Mercado1
Mercado2
Mercado3
Mercado1
Mercado2
Mercado3
Culantro Perejil
#Mu
estr
as
con
pre
sen
cia
de
E.co
li
MERCADOS
P1
P2
P3
61
de las muestras analizadas fueron positivas, criterio que determina una
calidad microbiológica poco satisfactoria de los vegetales en estudio.
La presencia de la bacteria Escherichia coli en el 37.9% de las muestras
analizadas indica una defectuosa práctica higiénica de las personas que
están involucradas con la poscosecha, distribución, manipulación y
comercialización de estos vegetales. E.coli al ser el mejor indicador de
contaminación fecal y al estar presente en alimentos puede poner en riesgo
la inocuidad alimentaria ya que esto muestra claramente las deficiencias en
la limpieza y desinfección del lugar de expendio y del manejo del producto
por parte de las personas que expenden estos vegetales en los mercados
(Rivera,2012).
La pesencia de E. coli en las muestras analizadas, es un indicador de una
posible presencia de otros patógenos entéricos, por lo que este tipo de
alimentos no debería consumirse crudo sin antes realizar un proceso
adecuado de desinfección.
En el país, la deficiencia en la higiene de los centros de expendio populares
así como la falta de normativas que regulen la inocuidad en el transporte,
almacenamiento y venta de productos que se consumen crudos, como los
vegetales, aumenta el riesgo microbiológico cuyas consecuencias son las
enfermedades de tipo gastrointestinal que tienen una alta frecuencia de
ocurrencia en la población, y especialmente en los niños.
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
62
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 CONCLUSIONES
Si bien los análisis se realizaron únicamente en tres mercados
del norte de la ciudad de Quito, los resultados pueden dar una
idea general del nivel higiénico de los vegetales y otros
productos alimenticios que se expenden en estos lugares y se
consumen con alta frecuencia. Existe la posibilidad que los
resultados encontrados en el presente trabajo, se repita en
otros mercados de la misma ciudad así como en otros de
diferentes ciudades del país.
Los mayores recuentos de coliformes totales fueron de 5.57 log
UFC/g en el mercado Santa Clara para cilantro y 7.45 log
UFC/g en el Mercado La Ofelia para perejil; para ambos
vegetales los menores recuentos microbiológicos se reportaron
en el mercado Iñaquito. Estos resultados indicarían falencias
en la aplicación de buenas prácticas de higiene durante la
manipulación previa y la venta; sin embargo la presencia de
este tipo de microorganismos en los alimentos no se considera
como peligrosa para el consumidor.
El estudio revela que los niveles más altos de contaminación
por coliformes fecales se reportan en las muestras de perejil
adquiridas en el mercado La Ofelia (360.1 NMP/g) y en cilantro
del mercado Iñaquito (350.2 NMP/g) por lo que se asume que
estos resultados pueden depender de las condiciones de
expendio en cada mercado. La presencia de coliformes fecales
63
indica una deficiencia higiénica de las personas que manipulan
los alimentos así como las condiciones insalubres de los
mercados donde se comercializan vegetales frescos mostrando
así una deficiente calidad e inocuidad de este tipo de alimento.
En esta investigación el 37.9% (41/108) de las muestras fueron
positivas para E. coli, presenciándose esta bacteria en el
14.8% de las muestras de cilantro y en 23.1% de perejil, esta
bacteria indica contaminación de origen fecal poniendo en
manifiesto la deficiencia de higiene en el transporte,
almacenamiento y comercialización de vegetales frescos. La
presencia de E. coli fue independiente del mercado y puesto de
expendio por lo que se evidencia la importancia de un control
microbiológico de los vegetales tipo hoja desde la cosecha
para evitar brotes de enfermedades transmitidas por este tipo
de alimento.
De los resultados microbiológicos obtenidos se determinó que
ninguno de los parámetros analizados cumplieron con las
especificaciones establecidas en las normativas peruana y
mexicana. Las normas ecuatorianas (INEN) no contemplan
criterios microbiológicos para este tipo de alimentos; es preciso
que se desarrolle una normativa ya que actualmente existe una
tendencia hacia el mayor consumo de frutas y hortalizas,
motivada por una creciente preocupación de adoptar un estilo
de vida más saludable.
64
5.2 RECOMENDACIONES
Debido a que la presencia de coliformes y E.coli pueden ser un factor
para contraer ETAs, los organismos de control deben establecer criterios
microbiológicos que indiquen valores máximos permisibles de estos
microorganismos en vegetales tipo hoja con la finalidad de garantizar la
inocuidad para los consumidores.
Es necesaria la capacitación de los agricultores y comerciantes en lo que
se refiere a Buenas Prácticas Agrícolas (BPA) y Buenas Prácticas de
Manufactura (BPM) durante la recolección, almacenamiento, transporte
y comercialización con la finalidad de asegurar la inocuidad del producto
reduciendo los excesivos niveles de contaminación.
Es recomendable realizar estudios en otro tipo de vegetales donde se
analice la calidad microbiológica ya que estos alimentos son de consumo
masivo e ingeridos crudos o cocinados, por lo que es necesario contar
con rangos establecidos.
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ANEXOS
72
ANEXO I
TABLA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) POR
g/mL DE ALIMENTO
(INEN, 1990)
73
ANEXO II
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
MERCADO LA OFELIA
Figura A.2. Recolección de la Muestra- La Ofelia: a) Instalaciones, b)
Puesto1,c) Puesto 2 y d) Puesto3
74
ANEXO III
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
MERCADO IÑAQUITO
Figura A.3. Recolección de la Muestra- Iñaquito: a) Instalaciones, b)
Puesto1,c) Puesto 2 y d) Puesto3
75
ANEXO IV
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
MERCADO SANTA CLARA
Figura A.4. Recolección de la Muestra-Sta. Clara: a) Instalaciones, b)
Puesto1,c) Puesto 2 y d) Puesto3
76
ANEXO V
PROCEDIMIENTO
RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE E.
COLI
77
78
Figura A.5.Recuento, aislamiento e identificación de E.coli: a) Pesado de la
muestra, b) Homogenizado, c) Diluciones Sucesivas, d) Recuento de
coliformes, e) Estriados en placa, f) Purificación en PCA, g) Tinción Gram, h)
Confirmación bacilos Gram (-) y i) Pruebas IMViC
79
ANEXO VI
TÉCNICA RECUENTO EN PLACA
AGAR VRB
Figura A.6. Recuento en Placa (VRB): a) Preparación agar estéril, b)
Inoculación, c) Dispersión en tubos, d) Siembra por vertido y e) Recuento