UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

FRANCISCO RENAN ARAGÃO LINHARES

OTIMIZAÇÃO DA CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL E FERTILIZAÇÃO

ASSISTIDA EM Cyprinus carpio (ACTINOPTERYGII) NO SEMIÁRIDO

BRASILEIRO

FORTALEZA - CEARÁ

2016

FRANCISCO RENAN ARAGÃO LINHARES

OTIMIZAÇÃO DA CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL E FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA

EM Cyprinus carpio (ACTINOPTERYGII) NO SEMIÁRIDO BRASILEIRO

Tese apresentada ao Curso de Doutorado em

Reprodução e Sanidade Animal do Programa

de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da

Faculdade de Veterinária da Universidade

Estadual do Ceará, como requisito parcial à

obtenção do título de doutor em Ciências

Veterinárias. Área de Concentração:

Reprodução e Sanidade Animal.

Orientador: Prof.a Dr.a Carminda Sandra Brito

Salmito Vanderley

FORTALEZA - CEARÁ

2016

Dedico à minha avó materna, Francisca

Aragão, por ter contribuído diretamente nesta

conquista.

AGRADECIMENTOS

A Deus por toda a oportunidade que me foi concedida durante minha vida.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias - PPGCV, da Faculdade de

Veterinária, da Universidade Estadual do Ceará, pela oportunidade de fazer parte do corpo

discente.

Ao Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB) e Laboratório de Biotecnologia da Reprodução

de Peixes (LBRP) da Universidade Estadual do Ceará (UECE) que através do uso de suas

instalações e equipamentos, tornou possível a conclusão do experimento.

Ao Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS), pelo apoio de laboratórios e

estruturas de pesquisa para realização do experimento.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de

estudo durante o período de doutorado.

À minha avó materna Francisca Aragão que apesar das condições difíceis naquela época,

sempre priorizou a educação de todos os filhos e netos e por fazer parte de minha educação

em todos os sentidos lá na minha infância.

À família Aragão Linhares pelos exemplos de determinação para cumprir com eficiência

minhas tarefas diárias.

À minha esposa Liliane Chagas Pascoal pela força de vontade para atingir os objetivos

traçados e aguentar meus estresses de cada dia.

À família Chagas Pascoal por todo o acolhimento e apoio desde o momento em que adentrei

na família.

Ao Professor Dr. José Ferreira Nunes, por toda a orientação que me foi passada e confiança

de fazer parte de sua equipe do Núcleo Integrado de Biotecnologia desde o início de minha

vida acadêmica.

À Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro, pelo meu acompanhamento durante o início de

minha iniciação científica e pela sua disponibilidade em sempre estar me ajudando nas horas

que mais preciso.

À Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley por ter acreditado no meu trabalho desde o

início da graduação e por sua orientação.

À Dra. Maria Audália Marques de Carvalho pelo apoio como coorientadora durante o período

de desenvolvimento da pesquisa, contribuição intelectual e membro avaliador da tese.

À Dra. Caroline Vieira Feitosa pela contribuição intelectual como membro avaliador da

referida Tese.

À Dra. Mônica Aline pela contribuição intelectual como membro avaliador da tese.

À Dra. Liliane Veras pelo apoio intelectual durante o período de desenvolvimento da pesquisa

e apoio de suas experiências em campo.

Ao Dr. Francisco José Lopes Cajado pela contribuição intelectual como membro avaliador da

referida tese.

Ao Dr. Cláudio Cabral e ao Me. Assis Montenegro pela realização da estatística.

À José Agenor Galvão pelos ensinamentos práticos durante a realização dos experimentos e

pelo total apoio a minha pesquisa científica no DNOCS.

Aos pós-graduandos Júlia Trugílio Lopes, Larissa Teixeira Nunes, Mayara Setúbal Oliveira,

Jordana Leite Sampaio, Priscila Silva de Almeida Monteiro, João Paulo Silva Pinheiro,

Renata Vieira do Nascimento e Vanessa Alves Pereira por todo o apoio fornecido aos meus

experimentos em Fortaleza e Pentecoste.

Aos alunos de iniciação científica, Rômulo Roberto Ribeiro Pinheiro, Thais Maia Torres,

Yasmim Maia Ferreira, Edna Raquel Paiva Teodozia, Cibele Castro Monteiro, Eric Silva

Antério, Filipe Oliveira Ferreira, Karen Emanuelly Pinheiro Gomes, Jéssica Uchôa Pinheiro,

Francisco Yan Tavares Reis, José Pedro Vieira Arruda Júnior, Maria Mayara Aguiar Lima,

Sayansk Queiroz da Silva, Vanessa Sayonara de Farias Monteiro e José de Souza Junior pela

disponibilidade e disposição para cumprir com eficiência suas tarefas.

Aos integrantes do Núcleo Integrado de Biotecnologia, em especial a Iraci Clemente de Melo

e Henna Roberta Quito.

RESUMO

A carpa comum, introduzida no nordeste do Brasil pelo Departamento Nacional de Obras

Contras às Secas (DNOCS) no ano de 1977, é uma das espécies mais cultivadas em todo o

mundo. Por representar uma espécie com grande valor comercial, os objetivos desse trabalho

foram: (1) avaliar o efeito da suplementação das vitaminas C (ácido ascórbico) ou E (α-

tocoferol) ao meio ACP-104 sobre a qualidade do sêmen pós-descongelado da carpa comum;

(2) definir a melhor proporção do número de espermatozoides por ovócito (dose inseminante)

utilizando sêmen in natura da espécie. Para o experimento 1, foram formados oito pools a

partir da coleta de sêmen de 15 machos. As amostras seminais coletadas foram avaliadas

quanto à motilidade total, à velocidade, ao percentual de espermatozoides normais, à

vitalidade espermática e a duração da motilidade antes e depois da criopreservação seminal.

Esta foi realizada em meio ACP-104 acrescido de dimetilsulfóxido (DMSO) ou etilenoglicol

(EG), suplementados ou não com vitamina C ou E. As amostras foram então congeladas em

vapor de nitrogênio líquido em dry shipper e estocadas em nitrogênio líquido (-196 °C) até a

descongelação e análises. O experimento 2, utilizou-se de um pool de sêmen de 5 machos e

um pool de ova de 2 fêmeas. Os gametas coletados foram então fertilizados nas seguintes

proporções de espermatozoides/ovócito: D1-15.152, D2-60.491, D3-179.584, D4-238.072 e

D5-298.563. Além disso, foi registrado em imagens o desenvolvimento embrionário da carpa

comum. No que diz respeito aos resultados do experimento 1, foi observado que o EG

suplementado com vitamina E produziu resultado significativamente superior de motilidade

total, normalidade espermática e duração da motilidade em relação ao DMSO, concluindo-se

que o EG deve ser, portanto, o crioprotetor de escolha a ser utilizado com o ACP-104

suplementado ou não com vitamina E. Para o experimento 2, verificou-se que a porcentagem

de fertilização aumentou de forma linear, atingindo um platô em 45,5% na proporção de

208.295 espermatozoides/ovócito. Assim, recomenda-se o uso da dose inseminante de

aproximadamente 200.000 espermatozoides/ovócito na rotina de fertilização assistida dessa

espécie no nordeste brasileiro. Além disso, o desenvolvimento embrionário da carpa em

latitude equatorial segue a cronologia semelhante ao relatado para a espécie em clima

temperado.

Palavras-chave: Criopreservação. Antioxidantes. Espermatozoides/ovócito. Embriologia.

ABSTRACT

The common carp, introduced in northeastern Brazil by the National Department of Works

Cons Drought (DNOCS) in 1977, is one of the most cultivated species in the world. To

represent a species with high commercial value, the objectives of this study were: (1) evaluate

the effect of supplementation of vitamins C (ascorbic acid) or vitamin E (α-tocoferol) with

ACP-104 medium on the quality of post-thawed of common carp; (2) determine the best ratio

of the number of sperm per oocyte using semen in natura. For the experiment 1, semen pools

from 15 selected males were formed. Seminal samples were evaluated for total motility,

velocity, percentage of normal sperm, sperm vitality and duration of total motility before and

after the seminal cryopreservation. This was performed in extenders ACP-104 plus DMSO or

EG supplemented or not with vitamin C or E. The samples were frozen in vapors of nitrogen

into dry shipper and stored in liquid nitrogen (-196 °C) until thawing and analysis. The

experiment 2, semen pool from 5 selected males and eggs pool from 2 selected female were

formed. Gametes collected were then fertilized in the following proportions of sperm/oocyte

D1-15.152, D2-60.491, D3-179.584, D4-238.072 and D5-298.563. Moreover, monitoring of

embryonic development was done. For the results of experiment 1, EG supplemented with

vitamin E, produced significantly better results overall motility, sperm normality and duration

of motility relative to DMSO, it concluded that the EG should be the cryoprotectant of choice

for use with the ACP-104 supplemented or not with vitamin E. For the experiment 2, it was

found that the fertilization rate increased linearly up to the proportion of 208.295

spermatozoa/oocyte, and, from this point, the fertilization rate was maintained at 45,5%.

Therefore, we recommend the use of the insemination dose of approximately 200.000

sperm/oocyte in the artificial fertilization routine of common carp in brazilian northeast.

Furthermore, embryonic development of carp in equatorial latitude follows the chronology

similar to that reported for the species in temperate zones.

Key-words: Cryopreservation. Antioxidants. Epermatozoa/oocyte. Embryology.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

CAPÍTULO 1

Figura 1- Estágios do desenvolvimento embrionário de carpa comum (Cyprinus carpio).

(A) formação de mórula, (B) formação de blástula e (C) gástrula....................32

CAPÍTULO 4

Figura 1- Taxas de fertilização assistida de ovócitos de carpa comum (Cyprinus carpio)

fertilizados artificialmente com diferentes relações espermatozoides/ovócito.

Para x<208.295, y=1,6*10-4+11,7559. Para x>208.295, y=45,49

(R2=93,30).........................................................................................................73

Figura 2- Estágios do desenvolvimento embrionário de carpa comum (Cyprinus carpio).

Primeiras segmentações (A e B), formação de mórula (C), formação de blástula

(D), gástrula inicial (E), 50% de gastrulação (F), 80% de gastrulação (G), 90%

de gastrulação (H), fechamento do blastóporo (I), diferenciação do embrião, da

vesícula ótica (vo) e formação dos somitos (so) (J), região caudal destacada do

vitelo (K), embrião com movimentação dentro da membrana coriônica (L),

eclosão (M). Aumento de 40x...........................................................................75

LISTA DE TABELAS

REVISÃO DE LITERATURA

Tabela 1 - Taxas de fertilização e eclosão (%) após a realização de fertilização artificial

utilizando diferentes doses inseminantes com sêmen descongelado de algumas

espécies de ciprinídeos................................................................................. .....21

CAPÍTULO 1

Tabela 1 - Médias dos valores físicos, químicos e microbiológicos da água do açude

Pereira de Miranda nas unidades experimentais durante o experimento.

Pentecoste, Ceará...............................................................................................32

CAPÍTULO 2

Tabela 1 - Taxas de fertilização e eclosão (%) após a realização de fertilização artificial

utilizando diferentes doses inseminantes com sêmen descongelado de algumas

espécies de ciprinídeos......................................................................................46

CAPÍTULO 3

Tabela 1 - Efeito de diferentes tipos de crioprotetores sobre os parâmetros cinéticos de

espermatozoides frescos (grupo controle) e descongelados de Cyprinus carpio

criopreservados em ACP-104 sem vitaminas....................................................58

Tabela 2 - Efeito de diferentes tipos de crioprotetores sobre o percentual de

espermatozoides normais e vitalidade de espermatozoides frescos (grupo

controle) e descongelados de Cyprinus carpio criopreservados em ACP-104

sem vitaminas....................................................................................................59

Tabela 3- Efeito de diferentes tipos de crioprotetores acrescidos de vitaminas sobre os

parâmetros de motilidade total (%), espermatozoides morfologicamente

normais (%) e vitalidade espermática (%) de espermatozoides frescos (grupo

controle) e descongelados de Cyprinus carpio criopreservados em ACP-

104.....................................................................................................................60

Tabela 4 - Efeito de diferentes tipos de crioprotetores acrescidos de vitaminas sobre a

duração da motilidade (segundos) de espermatozoides frescos (grupo controle)

e descongelados de Cyprinus carpio criopreservados em ACP-

104.....................................................................................................................60

CAPÍTULO 4

Tabela 1 - Taxa de fertilização e eclosão (%) de ovos de carpa comum (Cyprinus carpio)

fertilizados com diferentes proporções de espermatozoides (sptzs) por

ovócito...............................................................................................................72

LISTA DE ABREVIATURAS

ALH Deslocamento lateral da cabeça

ACP Água de coco em pó

BCF Frequência de batimento cruzado

CASA Análise espermática auxiliada por computador

CEUA Comitê de Ética para o Uso de Animais

CPAq Centro de Pesquisas em Aquicultura

DMSO Dimetilsulfóxido

DNOCS Departamento Nacional de Obras Contra às Secas

EG Etilenoglicol

EHC Extrato hipofisário de carpa

LBRP Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes

mOsm Miliosmole

NIB Núcleo Integrado de Biotecnologia

SCA Sperm Class Analyser

sptz Espermatozoide

STR Retilinearidade

LIN Linearidade

UECE Universidade Estadual do Ceará VAP – Velocidade média do percurso

VCL Velocidade do percurso curvilinear

VSL Velocidade em linha reta

WOB Oscilação

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...........................................................................................................13

2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................13

2.1 ESPÉCIE.......................................................................................................................13

2.2 TAXONOMIA..............................................................................................................14

2.3 REPRODUÇÃO............................................................................................................14

2.4 CRIOPRESERVAÇÃO................................................................................................15

2.4.1 Diluição seminal e armazenamento do sêmen..........................................................15

2.4.2 Adição de vitaminas C ou E aos meios de congelação.............................................17

2.5 AVALIAÇÃO DO SÊMEN IN NATURA E PÓS-DESCONGELADO.......................19

2.6 FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA ARTIFICIAL..............................................................20

3 JUSTIFICATIVA........................................................................................................23

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA.........................................................................................24

5 OBJETIVOS................................................................................................................25

5.1 OBJETIVO GERAL.....................................................................................................25

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................................25

6 CAPÍTULO 1...............................................................................................................26

7 CAPÍTULO 2...............................................................................................................36

8 CAPÍTULO 3...............................................................................................................51

9 CAPÍTULO 4...............................................................................................................67

10 CONCLUSÕES...........................................................................................................79

11 PERSPECTIVAS........................................................................................................80

12 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA...........................................................................81

13

1 INTRODUÇÃO

O brasileiro Rodolfo von Ihering (1883-1939), diretor da Comissão Técnica de

Piscicultura do Nordeste e pioneiro em fecundação artificial de peixes por meio da descoberta

da inseminação artificial de peixes, colocou o Brasil em nível mundial em piscicultura.

Porém, constatando a pobreza qualitativa e quantitativa da ictiofauna do semiárido nordestino,

representada por apenas dez espécies de valor comercial, o brasileiro e a sua equipe passaram

a estudar inúmeras espécies de outras bacias hidrográficas, a partir de 1935, com o objetivo de

serem introduzidas e aclimatadas na região (DNOCS, 2009). Dentre as espécies, destaca-se a

carpa comum (Cyprinus carpio vr hungaricus), trazida da Hungria em 1986. Este peixe é

considerado de alto valor comercial, forte apelo culinário e esportivo, sendo uma das espécies

mais cultivadas em todo o mundo, representando 6,14% do total da produção mundial

aquícola (FAO, 2008) e 76,7% da produção de pescado do Brasil (ECHEVENGUÁ, 2006).

Nesse contexto, o desenvolvimento de biotécnicas como a criopreservação gamética

vem contribuindo para o crescimento da piscicultura mundialmente. A criopreservação

espermática destaca-se como uma ferramenta essencial para a reprodução artificial,

possibilitando a preservação de espécies de peixes ameaçadas de extinção (VIVEIROS et al.,

2012a), além da renovação e do aumento da variabilidade genética de peixes comerciais.

Estudos recentes realizados pela equipe do Laboratório de Biotecnologia da

Reprodução de Peixes pertencente à Universidade Estadual do Ceará obtiveram resultados

próximos e satisfatórios aos parâmetros seminais encontrados na literatura para carpa comum

(LINHARES et al., 2015). No entanto, o protocolo de criopreservação seminal desenvolvido

para a espécie citada acima utilizando o diluente ACP-104 acrescido de diferentes

crioprotetores e suplementado com vitaminas C ou E ainda não foi empregado. Além disso, a

literatura também não relata a caracterização do desenvolvimento embrionário e a

determinação da dose inseminante da espécie no nordeste brasileiro.

Dessa forma, a realização destes procedimentos contribuirá para a introdução de novas

linhagens de carpa comum nos açudes públicos e privados utilizando um protocolo

padronizado de criopreservação seminal e fertilização artificial, fortalecendo a piscicultura

comercial no estado do Ceará.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 ESPÉCIE

14

A carpa comum, nativa do litoral do mar Cáspio e Aral, é considerada uma das

espécies de peixes de água doce domesticadas mais antigas, cultivadas há mais de 2000 anos

na China (BALON, 1995). Devido a sua tolerância e resistência a uma ampla variedade de

habitats aquáticos, estes animais se espalharam por todo o mundo (BRITTON et al., 2007).

São animais que vivem em grupo, apresentando hábito alimentar onívoro, com tendência à

iliofagia (FROESE; PAULY, 2007). É uma espécie típica de ambientes lênticos, capaz de

suportar baixos níveis de oxigênio dissolvido (3,2 mg/L) (MACÊDO et al., 2007). A

temperatura ideal para seu bom desenvolvimento varia de 24 a 28 °C, porém, apresenta uma

faixa tolerável de 8 a 30 °C, sendo assim, um peixe rústico e de fácil adaptação (GRAEFF;

PRUNER, 1999). As carpas geralmente apresentam um comprimento variando entre 30 e 60

cm e pesam entre 0,5 e 4 kg (TOMELLERI; EBERLE, 1990).

2.2 TAXONOMIA

Reino: Animalia

Filo: Chordata

Classe: Actinopterygii

Ordem: Cypriniformes

Família: Cyprinidae

Gênero: Cyprinus

Espécie: Cyprinus carpio

2.3 REPRODUÇÃO

O ciclo reprodutivo dos peixes teleósteos depende de vários fatores dentre eles o

fotoperíodo, temperatura, salinidade, pH, tubidez e precipitação pluviométrica (BROMAGE

et al., 2001; GLASSER et al., 2004). Em regiões tropicais e subtropicais as carpas geralmente

atingem a maturação sexual durante o primeiro ano de vida e pode desovar várias vezes

dentro de um determinado ano (SIVAKUMARAN et al., 2003). Kucharczyk et al. (2008)

reforçam que é possível produzir alevinos de carpa comum durante todo o ano, sem a

diminuição da qualidade dos gametas e alevinos. Segundo Moreira et al. (2001), a

temperatura ótima da água para se realizar a reprodução induzida das carpas comuns, situa-se

entre 22 a 28ºC.

15

No ambiente natural, as fêmeas desovam em águas paradas com a presença de

macrófitas, liberando cerca de 100 a 230 g de ovócitos por quilograma de peso corporal, uma

média de 100.000 a 300.000 ovócitos.Kg-1 (LINHART et al., 1995). Sem o cuidado parental,

os ovócitos são colocados sobre plantas aquáticas que, ao entrarem em contato com a água,

adquirem adesividade e aumentam de três a quatro vezes seu volume. A fertilização ocorre

externamente e ao final do desenvolvimento embrionário, os ovos eclodem. Os alevinos

recém-eclodidos tornam-se capazes de se alimentar de minúsculos animais aquáticos após o

desaparecimento do saco vitelínico (WOYNAROVICH, 1993).

2.4 CRIOPRESERVAÇÃO

Desde que Blaxter (1953) realizou os primeiros estudos de criopreservação de gametas

de peixes, muitas pesquisas têm sido voltadas para a criopreservação do sêmen de várias

espécies de pescado, incluindo a carpa comum (Cyprinus carpio). A introdução desta

biotécnica na reprodução animal tem sido de grande importância para a aquicultura,

contribuindo para aumentar a propagação de material genético de alto valor em menor espaço

de tempo.

A execução de um protocolo de criopreservação de sêmen incluem ajustes de taxas de

diluição, escolhas de diluentes e diluidores, tempo de equilíbrio entre o crioprotetor e os

espermatozoides, método de envase adequado, taxas de resfriamento e descongelamento das

amostras e relação entre espermatozoides:ovócitos durante a realização de testes de

fertilização. A presença de várias etapas dificulta a padronização de protocolos de congelação

seminal devido às diferentes interações espécie-específicas do volume, composição seminal e

suas características bioquímicas em cada etapa do processo (YANG; TIERSCH, 2009). Neste

contexto, abordaremos as variações das etapas que abrange o processo de crioprervação

seminal de carpa comum.

2.4.1 Diluição seminal e armazenamento do sêmen

Os espermatozoides, quando submetidos às alterações rigorosas de temperaturas,

estão sujeitos aos danos ocasionados pelo frio, denominados crionjúrias (SILVA; GUERRA,

2011). Estes danos podem levar a um decréscimo nas características espermáticas, como a

velocidade, motilidade, capacidade de fertilização e subsequente redução das taxas de eclosão

(LI et al., 2010). Dessa forma, após a coleta, o sêmen é submetido à etapa de diluição

16

resultante da adição de soluções protetoras capazes de minimizar os danos causados pelas

crioinjúrias. Estas soluções são chamadas de crioprotetores, atuando na diminuição do ponto

de congelação da água, reduzindo o estresse osmótico e os efeitos da cristalização sobre a

estrutura celular (SALMITO-VANDERLEY et al., 2012).

Devido à especificidade própria de cada grupo animal, torna-se fundamental a

adequação da composição do diluidor as características seminais de cada espécie. Na

literatura são relatadas soluções contendo apenas sais, apenas açucares ou uma combinação

dos mesmos para a criopreservação seminal de peixes. A solução de Alsever, cuja composição

é formada por NaCl e citrato de sódio, é considerado um dos diluidores mais conhecidos

utilizado em ciprinídeos (NAHIDUZZAMAN et al., 2012). Além disso, muitos autores

também utilizam um diluidor descrito por Kurokura et al. (1984) resultantes da combinação

dos sais NaCl, KCl, CaCl2 e NaHCO3 (AKÇAY et al., 2004; RANI; MUNUSWAMY, 2014;

YAVAS et al. 2014). Outro tipo de diluidor utilizado em ciprinídeos é a glicose (HORVÁTH

et al., 2007). Esta age como substrato de energia, componente osmótico e agente crioprotetor

em função do seu alto peso molecular, contribuindo para o equilíbrio osmótico e atuando

como substituto de eletrólitos (HOLT, 2000). Em geral, os diluidores acrescidos de açucares

são capazes de melhorar a motilidade espermática durante a criopreservação seminal de

algumas espécies de ciprinídeos (URBÁNYI et al., 2006). A combinação de sais (NaCl, KCl)

e açucares (frutose, glicose e sacarose) podem ser utilizados da mesma forma como diluidores

de sêmen de carpa comum (IRAWAN et al., 2010).

Outra alternativa, é a utilização do diluidor água de coco em pó (ACP), considerada

uma das inovações mais recentes da biotecnologia do sêmen de peixes desenvolvido por

pesquisadores da Universidade Estadual do Ceará-Brasil. O ACP é composto por sais,

proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras, além de indutores da divisão celular e

diversos eletrólitos, proporcionando meio nutritivo completo para os espermatozoides.

Estudos com a água de coco já foram realizados em várias espécies como caprinos (NUNES,

1995), ovinos (ARAÚJO, 1990) e suínos (TONIOLLI; MESQUITA, 1990). Estudos iniciais

em peixes mostraram resultados satisfatórios na combinação do ACP com os crioprotetores

DMSO (VELASQUEZ-MEDINA, 2008; VIEIRA, 2011) e metilglicol (VIVEIROS et al.,

2008), podendo ser utilizado também como diluidor para a criopreservação seminal de carpa

comum (LINHARES et al., 2015).

Os diluentes seminais também atuam como carreadores de crioprotetores, agindo em

conjunto para proteger os espermatozoides contra os efeitos deletérios do congelamento. Os

crioprotetores podem ser classificados como internos ou externos. Os crioprotetores internos

17

atuam na redução do ponto crioscópio da água intracelular evitando a formação de cristais de

gelo e o comprometimento da integridade da membrana espermática interna durante as

mudanças de temperatura.

Os crioprotetores internos mais comumente utilizados em ciprinídeos são

dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, propilenoglicol, dimetilacetamida (DMA), glicerol e

etanol (SULTANA et al., 2010; IRAWAN et al., 2010; AKÇAY et al., 2004). Na maioria dos

estudos, o DMSO fornece os melhores resultados, provavelmente devido a sua rápida

penetração em espermatozoides e sua interação com os fosfolipídios da membrana

espermática (SUQUET et al., 2000). Os crioprotetores externos atuam na estabilização da

membrana plasmática e restauração dos fosfolipídeos perdidos pelos espermatozoides durante

o congelamento. No entanto, estes não são utilizados frequentemente em ciprinídeos, sendo

relatadas na literatura à adição de gema de ovo-citrato ou somente gema de ovo as soluções

diluidoras de sêmen de carpa comum (SULTANA et al., 2010; ÖĞRETMEN et al., 2014;

YAVAS et al. 2014).

Outro ponto a ser levado em consideração é o ajuste das concentrações dos

crioprotetores antes de serem misturados aos diluentes, pois os mesmos são tóxicos as células

em temperatura ambiente. Comumente as concentrações dos crioprotetores são ajustados a 5

ou 10%, pois as pesquisas apontam que em altas concentrações alguns crioprotetores pode ser

prejudicial à motilidade espermática (RANI; MUNUSWAMY, 2014).

Após a diluição o sêmen estará pronto para o armazenamento. Os equipamentos mais

utilizados para congelar as amostras são as caixas térmicas de poliestireno, refrigeradores

programáveis, dry shippers e botijões criogênicos (TAITSON et al., 2007; IRAWAN, et al.,

2010; NAHIDUZZAMAN et al., 2012). Após o equilíbrio térmico, o sêmen congelado é

transferido para um botijão de nitrogênio líquido, onde pode ser conservado por longos

períodos à -196 °C sem efeitos deletérios (ASHWOOD-SMITH, 1980).

2.4.2 Adição de vitaminas C ou E aos meios de congelação

O processo de congelamento e descongelamento pode ocasionar danos a membrana

plasmática e outras organelas celulares devido ao estresse oxidativo, choque térmico e

formação de cristais de gelo intracelulares (GUTHRIE; WELCH, 2005). O estresse oxidativo

é ocasionado pela geração excessiva de espécies reativas do metabolismo do oxigênio (ROS)

(MAIA; BICUDO, 2009). As ROS (O2-, OH•, HO2

• e H2O2) são intermediários químicos

18

reativos continuamente produzidas pelo metabolismo aeróbio celular que podem comprometer

a viabilidade e a função espermática (SŁOWIŃSKA et al., 2013).

Para combater a produção excessiva de ROS e o estresse oxidativo, o sêmen apresenta

um sistema de defesa antioxidante intra e extracelular formado por componentes enzimáticos

e não enzimáticos (SANOCKA; KURPISZ, 2004). Os antioxidantes enzimáticos são

representados pelo superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e sistema glutatião

peroxidase/glutatião redutase (GSH-Px/GSH-Red), enquanto os não-enzimáticos são α-

tocoferol, ascorbato, urato, piruvato, glutatião, taurina e hipotaurina (SILVA; GUERRA,

2012).

No entanto, o sistema intracelular de defesa antioxidante do espermatozoide é mais

susceptível a ação das ROS, devido à escassez de citoplasma que é perdido durante a

maturação celular (CARVALHO et al., 2002). Além disso, Stradaioli et al. (2007) observaram

que a crioproservação reduz os níveis dos antioxidantes presentes tanto na célula quanto no

plasma seminal, fortalecendo a evidência de que, entre as causas da deterioração da qualidade

do sêmen após um ciclo de congelação e descongelação, estão aquelas ligadas ao estresse

oxidativo.

Dessa forma, pesquisas relacionadas à adição de antioxidantes aos diluidores seminais

de peixes têm sido realizadas a fim de melhorar a qualidade do sêmen criopreservado por

meio da prevenção ou redução do processo peroxidativo. Neste contexto, podem ser

destacados entre os antioxidantes já estudados com esta finalidade a vitamina E e a vitamina

C (NAVARRO et al., 2014; MARTINEZ-PÁRAMO et al., 2012).

A vitamina E (α-tocoferol e derivados) é um antioxidante não enzimático

(MANEESH; JAYALEKSHMI, 2006), encontrada em quantidades baixas em membranas

celulares de mamíferos e no plasma seminal que pode proteger os espermatozoides contra

danos oxidativos do DNA e da membrana (SIKKA, 2004). Este antioxidante é capaz prevenir

a peroxidação lipídica e suprimir, por conseguinte, a produção de malonaldeido (AITKEN;

CLARKSON, 1988), o que é possível pelo fato de atuar como quelante das ROS produzidas

durante a lipoperoxidação (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).

O ácido ascórbico ou vitamina C atua neutralizando as ROS e RNS por meio de

reações de redução (BARREIROS et al., 2006). Dessa forma, a inibição da peroxidação

lipídica promovida por este antioxidante ocorre sobre as membranas celulares, atuando

eficientemente sobre os radicais O2˙˙, H2O2, ClO˙, OH˙, OOH˙ (VASCONCELOS et al.,

2007). A vitamina C também atua sinergicamente com a vitamina E, através da geração de

19

tocoferol, reduzindo a produção de ROS e protegendo o espermatozoide contra danos no

DNA (GUERRA et al., 2004).

2.5 AVALIAÇÃO DO SÊMEN IN NATURA E PÓS-DESCONGELADO

O método ideal para predizer a fertilidade dos machos reprodutores é pelo exame das

características seminais à campo. Portanto, a qualidade espermática torna-se um pré-requisito

para a seleção dos animais em programas de reprodução artificial. A avaliação do ejaculado

deve ser rápida e eficiente, preservando a qualidade inicial e a capacidade fertilizante.

Amostras seminais são avaliadas tendo em vista várias características físicas como o aspecto,

a cor, o volume, o pH, a osmolaridade, a concentração, a morfologia e a motilidade

espermática. A partir desses resultados qualquer desvio para os padrões de uma determinada

espécie pode ser correlacionado com a fertilidade (HAFEZ, 1995).

O aspecto seminal pode ser facilmente classificado de forma subjetiva, podendo ser

classificado em viscoso, líquido e indeterminado (SUQUET et al., 1992), enquanto o pH do

sêmen de peixes de água doce varia de 6,5 a 8,5 e a osmolaridade em torno de 300 mOsm/Kg

(TABARES et al., 2005; MORISAWA; SUSUKI, 1980).

A concentração espermática é uma das medidas quantitativas mais importantes

utilizadas na pesquisa e rotina de avaliação do sêmen de peixes (SILVEIRA et al., 1987). A

determinação da concentração espermática contribui para a padronização da taxa de diluição

sêmen:diluidor apropriada para a criopreservação seminal e posterior utilização em programas

de fertilização assistida.

A qualidade espermática está diretamente relacionada com a motilidade dos gametas

masculinos, uma vez que esta característica constitui um pré-requisito para a fertilização dos

ovócitos (RURANGWA et al., 2004). A técnica convencional, baseada na observação através

de microscópio óptico, é utilizada pela maioria dos laboratórios para realizar análise seminal.

Embora sujeita a distintos graus de imprecisão, devido à subjetividade da avaliação a partir de

escalas arbitrárias (CHAMBEYRON; ZOHAR, 1990), este método é tão confiável quanto à

análise objetiva desde que realizada por um técnico treinado.

O sistema de análise seminal auxiliado por computador consiste basicamente de um

microscópio de contraste de fase acoplado a uma câmera de vídeo. As imagens geradas são

reproduzidas e analisadas de forma eficiente e objetiva por meio do software Sperm Class

Analyser – SCA instalado no sistema operacional de um computador adaptado a estes

equipamentos. A automatização desta análise permite maior objetividade e rapidez, uma vez

20

que é realizada numa menor fração do tempo requerido pela avaliação subjetiva. A utilização

deste equipamento contribuiu para a produção de trabalhos mais detalhados sobre a atividade

dos espermatozoides, avaliando os parâmetros de rápidos, médios, lentos, estáticos,

velocidade do percurso curvilinear (VCL), velocidade do percurso médio (VAP), velocidade

em linha reta (VSL), retilinearidade (STR), linearidade (LIN), oscilação (WOB), frequência

de batimento cruzado (BCF), e deslocamento lateral da cabeça (ALH). Os parâmetros de

velocidade, VCL, VAP e VSL, descrevem o movimento do espermatozoide, enquanto, os

parâmetros LIN, STR e WOB representam as relações entre estas velocidades VSL e VCL;

VSL e VAP; VAP e VCL, respectivamente.

2.6 FERTILIZAÇÃO ASSISTIDA ARTIFICIAL

O sucesso do protocolo de criopreservação é verificado através da descongelação do

sêmen em banho de imersão térmica e avaliação da qualidade espermática. A fertilização

artificial é a etapa final para a análise da qualidade dos gametas, sendo considerado um dos

indicadores mais seguros e eficientes para se comprovar a condição do material

criopreservado. A biotécnica pode ser realizada por dois métodos diferentes: o método úmido

que se baseia na mistura de gametas masculinos e femininos coletados simultaneamente com

água (SULTANA et al., 2010) e o método a seco que mistura primeiramente os gametas

acrescentando-se água em seguida (AKÇAY et al., 2004).

A reprodução artificial em carpa é mais complexa porque o procedimento de

inseminação requer uma solução específica para evitar a aderência entre os ovócitos que

ocorre normalmente ao entrarem ao contato com a água. A aderência é oriunda do envelope

vitelino que reveste os ovócitos e é formado por carboidratos desidratados (LINHART et al.,

1995). Essas camadas acelulares envoltórias servem para proteção, nutrição e barreira pela

qual os espermatozoides devem atravessar (MONTANARI, 2013). Entretanto, essa mesma

aderência é responsável pela formação de uma massa de ova que dificulta o encontro da

micrópila pelos espermatozoides, prejudicando o processo de fertilização.

A solução comumente utilizada pode ser formulada de duas formas conforme a

quantidade de ureia adicionada. Uma delas é composta por 3 g de ureia e a outra por 20 g de

ureia juntamente com 4 g de NaCl para cada litro de água. Essas soluções atuam na ativação

dos espermatozoides e remoção da adesividade dos ovócitos durante agitação contínua por 1

hora a 1 hora e 30 minutos. Após esse período adiciona-se uma solução de ácido tânico

(0,5g/L) por 20 segundos, removendo-a em seguida (BILLARD et al., 1995). Vale ressaltar

21

que muitos autores relatam a utilização da solução contendo 3% de ureia (IRAWAN et al.,

2010; HORVÁTH et al., 2007). No entanto, Billard et al. (1995) afirmam que a solução

contendo 20% de ureia é uma solução melhorada, necessitando de menos tempo de agitação

para a remoção da adesividade dos ovócitos. Além disso, pode-se utilizar também o leite em

pó composto por 27,2% de gordura, 26,6g de albumina, 37,2g de açúcar do leite, 5,8g de íons,

0,2g de lecitina e 3g de água em 100g do mesmo para a preparação de uma solução de 40g de

leite em pó por litro de água declorada ou limpa. A solução de leite em pó deve ser adicionada

lentamente misturando-se um volume de 1L da solução por Kg de ovócitos. Após 60 minutos,

adiciona-se lentamente mais água durante 10 minutos para substituição da solução de leite e

em seguida ovócitos podem ser transferidos para as incubadoras (LINHART et al., 2003).

Durante os testes de fertilização necessita-se definir a dose inseminante ideal, ou seja,

a proporção mínima de espermatozoides por ovócito capaz de produzir a máxima

sobrevivência em termos de larvas eclodidas. Esta técnica conserva e economiza gametas,

melhora a utilização do macho e contribui para um aumento da variabilidade genética. O

sucesso de uma fertilização artificial utilizando uma dose inseminante é determinado por meio

da taxa de fertilização, ou seja, a partir de uma coleta aproximada de 150 embriões contam-se

aqueles em estágio de gástrula e divide-se pelo número de ovócitos fertilizados (HORVÁTH

et al., 2003). Da mesma forma, também é calculada a taxa de eclosão por meio da contagem

do número de larvas eclodidas dividida pelo número total de ovócitos fertilizados. A definição

da dose inseminante utilizando sêmen criopreservado de ciprinídeos já foi estabelecida por

alguns autores obtendo diferentes resultados de taxa de fertilização e eclosão (Quadro 1).

Tabela 1. Taxas de fertilização e eclosão (%) após a realização de fertilização artificial utilizando

diferentes doses inseminantes com sêmen descongelado de algumas espécies de ciprinídeos. Espécies Meios de congelação Dose

inseminante

(sptzs:ovócito)

Taxa de

fertilização

(%)

Taxa de

eclosão

(%)

Referências

Diluidor Diluente

Carpa

comum

(Cyprinus

carpio)

Glicose Metanol 10% 2,6-3,4x104:1 74 ± 15 67 ± 17 Horváth et al.

(2003)

Carpa

comum

(Cyprinus

carpio)

Kurokura +

própolis

Dimetilsulfóxido

10% + gema de

ovo 10%

1,0 x105:1 95,0 ± 0,6 60,3 ± 2,0 Öğretmen et

al. (2014)

Carpa

comum

(Cyprinus

carpio)

Kurokura +

trealose

Dimetilacetamida

20%

1,0 x105:1 98 80±2 Warnecke &

Pluta (2003)

Carpa

comum

(Cyprinus

NaCl +

Sacarose

DMSO 10% 2,0x105:1 73,6±6,5 62,8±5,9 Irawan et al.

(2010)

22

carpio)

Carpa

espelho

(Cyprinus

carpio)

NaCl + KCl

+ Tris

Dimetilacetamida

15%

2,5x105:1 25,9 - Akçay et al.

(2004)

Carpa

comum

(Cyprinus

carpio)

Kurokura DMSO 10% 1,8-2,4x105:1 56±10 52±9 Linhart et al.

(2000)

Carpa

indiana

(Labeo

calbasu)

Alsever DMSO 10% ou

Metanol 10%

4,1x105:1 65±3 ou

63±4

45±2 ou

45±3

Nahiduzzama

n et al. (2012)

Posteriormente, os ovócitos fertilizados são transferidos para um sistema de

incubação, desenvolvido de acordo com as especificidades do animal. As incubadoras podem

apresentar dimensões de 0,6m de altura e 0,7m de diâmetro com capacidade para 90L

(NAHIDUZZAMAN et al., 2012). É importante ressaltar que o suprimento de oxigênio,

temperatura adequada e fluxo contínuo de água são fundamentais para o desenvolvimento

embrionário regular. Este é comumente descrito pelos autores em fases divididas em zigoto,

primeiras clivagens, mórula, blástula, gástrula, fechamento do blastóporo, diferenciação do

embrião e embrião eclodido, sendo o tipo de clivagem meroblástica discoidal. Durante o

surgimento de cada fase é registrado o tempo (horas ou minutos) após o início da fertilização.

Sividanes et al. (2012) observou as primeiras segmentações com 22 minutos, estágio

de mórula com 1 hora e 43 minutos, blástula com 2 horas e 27 minutos, gástrula com 5 horas

e 50 minutos, fechamento do blastóporo com 9 horas e 49 minutos, diferenciação do embrião

com 12 horas e 56 minutos e a eclosão das larvas com 20 horas e 3 minutos após a fertilização

a uma temperatura de 24 °C. Enquanto Nica et al. (2012) verificou as primeiras segmentações

com 50 minutos, estágio de mórula e blástula com 50 minutos a 1 hora e 35 minutos, gástrula

com 6 horas e 15 minutos, diferenciação do embrião com 15 horas e eclosão das larvas com

50 horas após a fertilização a uma temperatura de 22 °C. Portanto percebe-se que os tempos

dos registros embrionários e eclosão dependem principalmente da temperatura da água de

incubação dos embriões (SORENSEN et al., 1966). Do exposto, torna-se fundamental o

conhecimento da embriologia detalhada da carpa comum para uma melhor compreensão da

biologia da espécie.

23

3 JUSTIFICATIVA

O desenvolvimento de biotécnicas como a indução hormonal, a reprodução artificial

em cativeiro e a criopreservação de gametas vem contribuído para aumentar a produção de

pescado, permitindo o crescimento deste setor mundialmente. No entanto, são inúmeros os

protocolos que visam à produção de carpa comum devido às diferenças espécie-específicas

das características gaméticas (YANG; TIERSCH, 2009). Em todo o mundo, já foram

desenolvidos protocolos de criopreservação de sêmen para mais de 200 espécies de pescado

(TIERSCH et al., 2007). No entanto, ainda não existe na literatura um protocolo definido de

criopreservação seminal de carpa comum utilizando o diluente ACP-104 suplementado com

vitaminas C ou E. A execução deste protocolo investigará a capacidade de aumentar a

qualidade seminal e proteger os espermatozoides de carpa comum do efeito tóxico dos

radicais livres durante o processo de criopreservação seminal. Além disso, o estabelecimento

da dose inseminante usando sêmen in natura e a caracterização do desenvolvimento

embrionário desta espécie no nordeste do Brasil auxiliará a definição do melhor protocolo a

ser utilizado com sêmen criopreservado em água de coco em pó, possibilitando um aumento

na variabilidade genética dos plantéis nordestinos e diminuição do grau de endocruzamentos

dos estoques reprodutores.

24

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA

O diluidor ACP-104 suplementado com vitamina C e combinado com 10% do

crioprotetor DMSO apresentou melhor desempenho na qualidade seminal após a

criopreservação de carpa comum quando comparado ao mesmo meio sem

suplementação.

A dose inseminante de 200.000 espermatozoides/ovócito utilizando sêmen in natura

produziu uma taxa aceitável de alevinos de carpa comum pós-fertilização no Nordeste

do Brasil.

A cronologia do desenvolvimento embrionário da carpa comum no Nordeste do Brasil

não é semelhante ao relatado para a espécie em clima temperado, porém as imagens

registradas estão de acordo com o clima temperado.

25

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o efeito de diferentes antioxidantes e crioprotetores sobre a qualidade

do sêmen criopreservado de carpa comum (Cyprinus carpio) e definir a melhor

proporção do número de espermatozoides por ovócito (dose inseminante)

utilizando sêmen in natura;

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Otimizar o protocolo existente definindo inicialmente o crioprotetor que deve

ser usado em associação com o meio ACP-104 para a criopreservação seminal

de carpa comum;

Registrar e caracterizar em imagens o desenvolvimento embrionário de carpa

comum no nordeste do Brasil (3°45'00" de latitude sul e 39°10'24" de

longitude oeste);

26

6 CAPÍTULO 1

Influência da qualidade da água sobre o desenvolvimento embrionário de carpa comum

(Cyprinus carpio)

Water quality influence on the embryonic development of common carp

Periódico: Ciência Animal (ISSN: 0104-3773)

Qualis: B4

27

RESUMO

O estado do Ceará se destaca pela presença de açudes que auxiliam a piscicultura. Dentre

estes reservatórios de água, destaca-se o açude Pereira de Miranda, que se encontra

atualmente em estado de eutrofização. Dessa forma, a presente pesquisa objetivou avaliar a

influência da qualidade da água do açude Pereira de Miranda sobre o desenvolvimento

embrionário de carpa comum. Para tanto, os gametas obtidos foram fertilizados e o

acompanhamento do desenvolvimento embrionário foi realizado até a eclosão dos ovos para

se estimar as taxas de fertilização e eclosão. O tipo de clivagem foi meroblástica discoidal,

típica de ovos telolécitos. A taxa de fertilização média encontrada foi de 17,25 ± 1,19%.

Porém, a taxa de eclosão foi nula, observando-se embriões degenerados na sua totalidade. A

baixa taxa de fertilização e não eclosão pode estar relacionada as alterações da maioria dos

parâmetros de qualidade de água analisados tais como: temperatura (28,63 ± 0,67 ºC),

oxigênio dissolvido (4,38 ± 0,41 mg/L O2), dureza (216,6 mg/L de CaCO3), alcalinidade (156

mg/L de CaCO3), pH (7,5 a 10,9), amônia (1,09 mg/L) e nitrito (0,104 mg/L) que

permaneceram fora da faixa ideal para o desenvolvimento inicial desta espécie. Assim,

conclui-se que a eutrofização do açude Pereira de Miranda pode prejudicar a reprodução de

carpa comum nas estações de piscicultura abastecidas pelo açude, o que torna urgente a

definição de uma série de ações para melhoria de suas águas.

Palavras-chave: fertilização assistida, piscicultura, reprodução

28

Influência da qualidade da água sobre o desenvolvimento embrionário de carpa comum

(cyprinus carpio)

Francisco Renan Aragão LINHARES1*, Larissa Teixeira NUNES1, Júlia Trugilio LOPES1,

José Agenor Soares GALVÃO2, José Ferreira NUNES1, Carminda Sandra Brito SALMITO-

VANDERLEY1

1Universidade Estadual do Ceará. 4Departamento Nacional de Obras Contra as Secas -

DNOCS

Abstract

The state of Ceará is highlighted by the presence of dams that help fish farming. Among these

water reservoirs, there is the dam Pereira de Miranda, which is currently suffer from

eutrophication. Thus, the present study aimed to evaluate the influence of the reservoir water

quality Pereira de Miranda on the embryonic development of common carp. Therefore, the

obtained gametes were fertilized and monitoring of embryonic development was carried out

until the eggs hatch to estimate the fertilization and hatching rates. The type of cleavage was

meroblastic discoidal typical of telolecithal eggs. The average fertilization rate was found to

be 17.25 ± 1.19%. However, the hatching rate was zero, observing degenerate embryos in its

entirety. The low rate of fertilization and not hatch may be related changes in most water

quality parameters analyzed such as temperature (28.63 ± 0.67 ºC), dissolved oxygen (4.38 ±

0.41 mg/L O2), hardness (216.6 mg/L CaCO3), alkalinity (156 mg/L CaCO3), pH (7.5 to

10.9), ammonia (1.09 mg/L) and nitrite (0.104 mg/L) which have remained outside the

optimal range for the initial development of this species. Thus, it is concluded that the

eutrophication of the dam Pereira de Miranda can impair reproduction of common carp in fish

culture stations supplied by the dam, which makes it urgent to design a series of actions to

improve their waters.

Keywords: assisted fertilization, fish farming, reproduction

Introdução

Atualmente, a carpa comum (Cyprinus carpio) representa o quarto pescado da

aquicultura continental mais produzido no Brasil (Boletim estatístico da pesca e aquicultura,

2011). De acordo com o mesmo boletim, o Nordeste representa a segunda maior produção

aquícola continental de pescado, estando o estado do Ceará na liderança entre as regiões

29

nacionais. A espécie foi introduzida no final do século XIX com a chegada dos primeiros

imigrantes (Silva, 2005) e no Nordeste, através do Departamento Nacional de Obras Contras

às Secas (DNOCS) no ano de 1977 (DNOCS, 2009).

Neste contexto, os açudes construídos no Ceará apresentam grande importância para a

piscicultura do estado. Dentre estes reservatórios de água, destaca-se o açude Pereira de

Miranda, com barragem localizada no município de Pentecoste, Ceará e distante 85 km de

Fortaleza. O mesmo, foi construído pelo DNOCS entre os anos de 1950 e 1957, visando o

abastecimento de água, a irrigação, a geração de energia elétrica e a piscicultura. No entanto,

o açude citado encontra-se em estado de eutrofização, podendo prejudicar entre outras

utilidades a piscicultura da região (COGERH, 2015). Diante deste quadro, a avaliação dos

parâmetros físicos, químicos e microbiológicos da água do açude em questão, será

fundamental para se monitorar a sobrevivência e reprodução dos peixes no ambiente em que

vivem.

Dessa forma, a presente pesquisa objetivou avaliar a influência da qualidade da água,

por meio de análises de parâmetros fiscos, químicos e microbiológicos do açude em estado de

eutrofização Pereira de Miranda sobre o desenvolvimento embrionário de carpa comum.

Material e métodos

A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade

Estadual do Ceará (11516665-3/63). O trabalho foi realizado no Centro de Pesquisas em

Aquicultura (CPAq) do Departamento Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS) em

Pentecoste - Ceará, situando-se a 3° 45' 00" de latitude sul e 39° 10' 24" de longitude oeste,

local onde o abastecimento de água é realizada pelo açude Pereira de Miranda.

Para a realização da fertilização assistida, um pool de sêmen foi formado a partir da

coleta de sêmen de três machos sexualmente maduros de comprimento médio de 43,2 ± 2,8

cm e peso médio de 1,51 ± 0,2 kg, que receberam dose única de extrato hipofisário de carpa

(EHC) de 1 mg/kg de peso vivo. Doze horas após a indução hormonal da reprodução, os

animais foram mergulhados individualmente num tanque contendo solução anestésica de

Eugenol (Cequímica Ltda., Brasil) diluído em álcool absoluto e água (1:10:1000) por

aproximadamente dois minutos. Durante a coleta do sêmen, os animais foram contidos em

decúbito lateral sobre uma esponja (D33) e envolvidos com um pano úmido sobre os olhos

para minimizar o estresse. O orifício urogenital foi enxuto com papel toalha e o sêmen foi

coletado em tubos graduados de polietileno realizando-se uma pressão abdominal no sentido

ântero-posterior.

30

As amostras foram conservadas sobre gelo em escamas em caixas térmicas a uma

temperatura de aproximadamente 5 °C até a realização da fertilização artificial assistida. Para

a seleção das amostras, foi estimada a análise subjetiva da motilidade utilizando um

microscópio óptico (Nikon Eclipse E200 – ampliação de x400) após a mistura de uma

alíquota de 2 µL de sêmen e 100 µL de água do tanque, considerando-se como 0% (zero)

nenhum espermatozoide móvel e 100% (cem) todos os espermatozoides móveis. Somente as

amostras com o valor superior a 80% de motilidade foram utilizadas, enquanto aquelas

contaminadas com água, fezes, urina ou sangue foram descartadas.

Para a coleta de ovócitos, foram utilizadas duas fêmeas, de comprimento médio de 46

± 5,7 cm e peso médio de 2,38 ± 0,6 kg, submetidas à indução da desova pela aplicação de

duas doses de 0,5 e 5,0 mg/kg de peso vivo de EHC, num intervalo de doze horas entre elas.

A partir do material coletado, formou-se um pool de ova do qual foram retiradas cinco

amostras de 25 g (aproximadamente 21.800 ovócitos) de ovócitos para fertilização a seco de

cada amostra com 157,5 µL de sêmen fresco. Essa dose de sêmen correspondia à proporção

aproximada de 200.000 espermatozoides por ovócito (Irawan et al., 2010). Os gametas foram

então misturados suavemente durante dois minutos a fim de evitar injúrias nos ovócitos.

Para a remoção da adesividade dos ovócitos, cada amostra foi imersa durante uma

hora em 100 mL de solução de ureia, sob homogeneização constante. Completado os 60

minutos, as amostras foram lavadas com 100 mL de solução de ácido tânico puríssimo (0,5

g/L) (Vetec Ltda., Brasil) durante 20 segundos (Billard et al., 1995). Para a remoção desta

última solução, todas as amostras (n=5) foram então lavadas três vezes com 100 mL de água

do tanque. Posteriormente, cada uma das amostras foram transferidas para incubadoras

confeccionadas a partir de canos de PVC (policloreto) teladas no fundo de volume

aproximado de 1 L.

Inicialmente, o acompanhamento do desenvolvimento embrionário foi realizado a cada

meia hora e posteriormente a cada hora até a eclosão dos ovos. Estes foram removidos das

incubadoras com auxílio de uma peneira e depositados em placas de Petri para observações

em microscópio óptico (Nikon Eclipse E200 – ampliação de x400), equipado com uma

câmera fotográfica digital, a fim de documentar e melhor visualizar os ovos. As taxas de

fertilização foram calculadas por meio da contagem do número de embriões em estágio de

gástrula pelo total de ovócitos. A taxa de eclosão foi estimada contando-se o número de larvas

e dividindo pelo número total de ovócitos fertilizados. Foram observados aleatoriamente 200

embriões de cada incubadora para ambos os parâmetros avaliados, sendo realizada uma média

das cinco replicatas.

31

Paralelamente ao experimento, foram analisados parâmetros físicos, químicos e

microbiológicos da água utilizada na incubação dos embriões. A temperatura, o oxigênio

dissolvido (OD) e o pH foram medidos in loco de três em três horas desde o início da

fertilização assistida até as fases finais do desenvolvimento embrionário, no qual utilizou-se

um medidor de oxigênio dissolvido e temperatura (Phtek, modelo DO-100) e pHmetro

(KASVI, modelo K39-0014P). Para os parâmetros alcalinidade, dureza, amônia e nitrito

foram coletadas amostras de água das incubadoras de embriões do CPAq – DNOCS e

refrigeradas a 4°C conforme recomendações do Guia da CETESB (Companhia de Tecnologia

de Saneamento Ambiental) até serem processadas em Fortaleza pela Superintendência

Estadual do Meio Ambiente do Ceará (SEMACE).

Para os parâmetros microbiológicos, foi analisada o número mais provável de

coliformes termotolerantes e o número mais provável de Pseudomonas. Para tanto, as

amostras também foram processadas no mesmo dia pelo LABOMAR: Instituto de Ciências do

Mar – UFC. No local, as amostras foram serialmente diluídas em solução salina estéril até 10-

5. O Número Mais Provável (NMP) de coliformes termotolerantes foi determinado segundo a

técnica dos tubos múltiplos usando meio de cultura Caldo Lauryl MUG (Difco). Para se obter

o NMP de coliformes termotolerantes, consultou-se a tabela de Mc Crady (APHA, 2005). O

NMP de Pseudomonas spp. foi obtido através da técnica de tubos múltiplos usando caldo

asparagina, como citado por Cabrini & Gallo (2001). Dos tubos positivos (com turvação)

foram repicadas alçadas para placas de ágar cetrimide e incubadas a 35 °C por 48 h. O

surgimento de coloração esverdeada em toda a placa ou de colônias com luminescência verde

indicou resultado positivo para a presença de Pseudomonas spp. Para a contagem de bactérias

heterotróficas cultiváveis foi utilizada a técnica de plaqueamento pour plate onde uma

alíquota de 1 mL de cada diluição sucessiva foi colocado em placa de Petri e coberto com o

meio de cultivo Plate Count Agar (PCA), misturado e incubadas em estufa a 35–37 ºC por 48

h de acordo com o Standard Methods (APHA, 2005).

Resultados e discussão

As imagens registradas para o desenvolvimento embrionário se enquadram no padrão

relatado pela literatura para a espécie carpa comum (Cyprinus carpio). O tipo de clivagem foi

meroblástica discoidal típica de ovos telolétcitos e o desenvolvimento embrionário,

apresentou três períodos bem definidos, divididos em mórula, blástula e gástrula (Leite et al.,

2013) (Fig. 1).

32

Figura 1. Estágios do desenvolvimento embrionário de carpa comum (Cyprinus carpio). (A)

formação de mórula, (B) formação de blástula e (C) gástrula.

A taxa de fertilização média encontrada foi de 17,25 ± 1,19%, sendo considerada

baixa quando comparada a 75,6 ± 7,5% observada por Irawan et al. (2010) para sêmen fresco.

A taxa de eclosão foi nula, observando-se embriões degenerados na sua totalidade.

A temperatura é considerada um fator importante para se monitorar a má formação nas

larvas, pois segundo Moreira et al. (2001), a temperatura ótima da água para se realizar a

reprodução induzida das carpas comuns, situa-se entre 22 a 28 ºC. Assim, a temperatura

média de 28,63 ± 0,67 ºC (Tab. 1) encontrada no presente trabalho está no limite para os

padrões de outros estudos na área de desenvolvimento inicial de carpas, podendo ter

ocasionado má formação dos embriões e não eclosão.

Tabela 1. Médias dos valores físicos, químicos e microbiológicos da água do açude Pereira de Miranda nas

unidades experimentais durante o experimento. Pentecoste, Ceará.

Parâmetros Média ± D. P.

Temperatura (°C) 28,63 ± 0,67

Oxigênio dissolvido (mg/L O2) 4,38 ± 0,41

Dureza (mg/L CaCO3) 216,6

Alcalinidade (mg/L CaCO3) 156

pH (0-14) 7,5 a 10,9

Amônia (mg/L) 1,09

Nitrito (mg/L) 0,104

Coliformes termotolerantes (100 mL-1) 17 x 102

Pseudomonas sp. (100 mL-1) 4,5 x 102

A concentração de oxigênio dissolvido para um desenvolvimento embrionário ideal

em carpa comum encontra-se entre 6 a 9 mg L-1 O2, sendo considerada uma das espécies mais

exigentes (Boryshpolets et al., 2009). No entanto, o valor médio encontrado para o oxigênio

dissolvido nas incubadoras dos embriões foi de 4,38 ± 0,41 mg/L O2 (Tab. 1), sendo inferior

ao relatado na literatura para a espécie.

A dureza e a alcalinidade apresentaram níveis de 216,6 e 156 mg/L de CaCO3 (Tab. 1)

podendo ser classificadas como águas brandamente duras e, portanto, sem aplicação biológica

33

(GRAEFF; MONDARDO, 2006). Além disso, esses dois parâmetros podem ter ocasionando

uma grande oscilação do pH de 7,5 a 10,9 (Tab. 1).

A concentração de amônia encontrada de 1,09 mg/L (Tab. 1) foi considerada alta,

apesar de permanecer dentro da tolerância de 0,6 e 2 mg/L usualmente reportados. O nível de

nitrito foi de 0,104 mg/L, estando fora das concentrações letais para a espécie estudada

(Golombieski et al., 2005).

No que diz respeito às análises bacteriológicas, verificou-se a ocorrência de coliformes

termotolerantes (17 x 102 100 mL-1) (Tab.1) indicando presença de efluentes de esgotos

domésticos, assim como também a ocorrência de Pseudomonas sp. (4,5 x 102 100 mL-1)

(Tab.1), consideradas patógenos oportunistas na infecção de ovos de peixes. De fato,

Sorensen et al. (2014) verificou que a interferência microbriana em ovos fertilizados de

enguia (Anguilla anguilla) afetou significativamente a taxa de eclosão e a longevidade larval.

Além disso, observou-se na água a presença de uma grande quantidade de zooplâncton,

podendo ser responsável também pela degeneração de embriões em desenvolvimento.

Podemos concluir que a eutrofização do açude Pereira de Miranda pode prejudicar a

reprodução de carpa comum nas estações de piscicultura abastecidas pelo açude, o que torna

urgente a definição de uma série de ações para melhoria de suas águas.

Agradecimentos

Agradecemos ao Departamento Nacional de Obras Contra Secas (DNOCS) e

Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes (LBRP), por fornecer as instalações e

as amostras utilizadas nos experimentos. A Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) pelo

apoio financeiro e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) pela concessão de bolsa de estudos.

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36

7 CAPÍTULO 2

Biotécnicas aplicadas a reprodução de ciprinídeos

Biotechs applied the reproduction of cyprinids

Periódico: Acta Veterinaria Brasilica (ISSN: 1981-5484)

Qualis: Qualis: B3

37

RESUMO

Esta revisão relata as variações de cada etapa que abrange o processo de crioprervação

seminal e fertilização assistida artificial em ciprinídeos. Os diluidores mais utilizados para a

criopreservação do sêmen de carpa são uma combinação de sais e açucares associados aos

crioprotetores DMSO ou metanol. Para o armazenamento em nitrogênio líquido as amostras

podem ser envasadas em palhetas de diferentes volumes e congeladas em caixas térmicas de

poliestireno, refrigeradores programáveis, dry shippers ou botijões criogênicos. Após o

descongelamento, uma alíquota do sêmen criopreservado é retirada para o cálculo da dose

inseminante e realização da fertilização assistida artificial. Em seguida, os ovos fertilizados

são tratados com uréia, NaCl e ácido tânico e transferidos para um sistema de incubação.

Diante de uma variedade de protocolos relatados pela literatura, ainda é fundamental o

aperfeiçoamento continuado destas biotécnicas para permitir o aprimoramento dos programas

de reprodução de ciprinídeos.

Palavras-chave: Cyprinus sp; criopreservação seminal; fertilização assistida.

38

Biotécnicas aplicadas a reprodução de ciprinídeos

Carminda Sandra Brito Salmito-Vanderley1*, Francisco Renan Aragão Linhares 2, Maria

Audália Marques de Carvalho 3, Mayara Setúbal Oliveira 4, José Ferreira Nunes5

1 Profa. Doutora Adjunta da Universidade Estadual do Ceará (UECE) e Pesquisadora do

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV). * Autor para

correspondência: E-mail: sandra.salmito@uece.br.

2 Doutorando em Reprodução e Sanidade Animal pelo PPGCV – UECE.

3 Doutora em Biotecnologia pela Rede Nordeste de Biotecnologia – UECE.

4 Mestranda em Reprodução e Sanidade Animal pelo PPGCV – UECE.

5 Prof. Doutor Titular da Universidade Estadual do Ceará e Pesquisador do PPGCV.

Abstract

This review reports the variations of each stage which covers the process of sperm

cryopreservation and artificial fertilization in cyprinids. The most commonly used extenders

for sperm cryopreservation of carp are a combination of salts and sugars associated with

DMSO or methanol. The samples can be packaged in straws of different volumes for storage

in liquid nitrogen and frozen in styrofoam boxes, computer-controlled freezer, dry shippers or

cryogenic vessel. After thawing an aliquot of cryopreserved semen is taken for the calculation

of insemination dose and realization of artificial assisted fertilization. Then fertilized eggs are

treated with urea, NaCl and tannic acid and transferred to incubation system. Faced with a

variety of protocols reported in the literature, it is still essential to continued improvement of

these biotechnologies to enable the improvement of breeding programs for cyprinids.

Keywords: Cyprinus sp; sperm cryopreservation; artificial fertilization.

Introdução

Constatando a pobreza da ictiofauna do semiárido nordestino, o brasileiro Rodolfo von

Ihering, diretor da Comissão Técnica de Piscicultura do Nordeste, passou a estudar inúmeras

espécies de outras bacias hidrográficas, a partir de 1935, com o objetivo de serem

39

introduzidas na região. Dentre as espécies de alto valor comercial, destaca-se a carpa comum

(Cyprinus carpio vr hungaricus), trazida da Hungria em 1986 (DNOCS, 2009).

Nesse contexto, o desenvolvimento de biotécnicas reprodutivas de base como a

indução hormonal e a reprodução artificial em cativeiro vem contribuindo para aumentar a

produção de pescado, permitindo o crescimento deste setor mundialmente. Outra biotécnica

reprodutiva bastante difundida em peixes é a criopreservação seminal. Em todo o mundo, já

foram desenvolvidos protocolos de criopreservação de sêmen para mais de 200 espécies de

pescado (Tiersch et al., 2007). Na carpa comum, são inúmeros os protocolos de

criopreservação e fertilização assistida que visam a sua produção.

Assim, diante da importância da aplicação destas biotécnicas, este artigo apresentará

uma revisão sobre o conhecimento atual das técnicas de criopreservação seminal e fertilização

assistida utilizadas na produção de ciprinídeos.

Criopreservação

Desde que Blaxter (1953) realizou os primeiros estudos de criopreservação de gametas

de peixes, muitas pesquisas têm sido voltadas para a criopreservação do sêmen de várias

espécies de pescado, incluindo a carpa comum (Cyprinus carpio). A introdução desta

biotécnica na reprodução animal contribui para aumentar a propagação de material genético

de alto valor em menor espaço de tempo.

A execução de um protocolo de criopreservação de sêmen inclue ajustes de taxas de

diluição, escolhas de diluentes e crioprotetores, tempo de equilíbrio entre o crioprotetor e os

espermatozoides, método de envase adequado, taxas de resfriamento e taxas de descongelação

das amostras. Diante da presença de várias etapas e suas interações surgem dificuldades para a

padronização de protocolos de congelação seminal (Yang & Tiersch, 2009). Nesse contexto,

abordaremos as variações de cada etapa que abrange o processo de crioprervação seminal de

carpa comum encontradas na literatura nos últimos anos.

Diluição seminal

40

Os espermatozoides, quando submetidos às alterações rigorosas de temperaturas, estão

sujeitos à danos ocasionados pelo frio, denominados crionjúrias (Silva & Guerra, 2011). Estes

danos podem levar a um decréscimo nas características espermáticas, como a velocidade,

motilidade, capacidade de fertilização e subsequente redução das taxas de eclosão (Li et al.,

2010). Dessa forma, após a coleta, o sêmen é submetido à etapa de diluição resultante da

adição de soluções protetoras capazes de minimizar os danos causados pelas crioinjúrias.

Estas soluções são chamadas de crioprotetores, atuando na diminuição do ponto de

congelação da água, reduzindo o estresse osmótico e os efeitos da cristalização sobre a

estrutura celular (Salmito-Vanderley et al., 2012).

Devido à especificidade própria de cada grupo animal, torna-se fundamental a

adequação da composição do diluidor as características seminais de cada espécie. Na

literatura são relatadas soluções contendo apenas sais, apenas açucares ou uma combinação

dos mesmos para a criopreservação seminal de peixes. A solução de Alsever, cuja composição

é formada por NaCl e citrato de sódio, é considerado um dos diluidores mais conhecidos

utilizados em ciprinídeos (Nahiduzzaman et al., 2012). Além disso, muitos autores também

utilizam um diluidor descrito por Kurokura et al. (1984) resultantes da combinação dos sais

NaCl, KCl, CaCl2 e NaHCO3 (Akçay et al., 2004; Rani & Munuswamy, 2014). Outro tipo de

diluidor utilizado em ciprinídeos é a glicose (Horváth et al., 2007). Esta age como substrato

de energia, componente osmótico e agente crioprotetor em função do seu alto peso molecular,

contribuindo para o equilíbrio osmótico e atuando como substituto de eletrólitos (Holt, 2000).

Em geral, os diluidores acrescidos de açucares são capazes de melhorar a motilidade

espermática durante a criopreservação seminal de algumas espécies de ciprinídeos (Urbányi et

al., 2006). A combinação de sais (NaCl, KCl) e açucares (frutose, glicose e sacarose) podem

ser utilizados da mesma forma como diluidores de sêmen de carpa comum (Irawan et al.,

2010).

Outra alternativa, é a utilização do diluidor água de coco em pó (ACP®), composto

por sais, proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras, além de indutores da divisão celular

e diversos eletrólitos. O ACP® é considerado uma das inovações mais recentes da

biotecnologia do sêmen de peixe e já foi utilizado com sucesso por Linhares (2012) para a

criopreservação seminal de carpa comum. Recentemente, Öğretmen et al. (2014) obtiveram

resultados satisfatórios de motilidade espermática, taxas de fertilização e eclosão utilizando

extrato bruto de própolis como diluidor para a criopreservação de sêmen de carpa comum,

41

sendo identificado compostos fenólicos, terpenóides, flavonoides, ácidos graxos, açucares e

outros componentes.

Os diluentes seminais também atuam como carreadores de crioprotetores, agindo em

conjunto para proteger os espermatozoides contra os efeitos deletérios da congelação. Os

crioprotetores podem ser classificados como internos ou externos. Os crioprotetores internos

atuam na redução do ponto crioscópio da água intracelular evitando a formação de cristais de

gelo e o comprometimento da integridade da membrana espermática interna durante as

mudanças de temperatura. Os crioprotetores internos comumente utilizados em ciprinídeos

são dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, propilenoglicol, dimetilacetamida (DMA), glicerol e

etanol (Akçay et al., 2004; Irawan et al., 2010; Sultana et al., 2010). Na maioria dos estudos, o

DMSO fornece os melhores resultados, provavelmente devido a sua rápida penetração em

espermatozoides e sua interação com os fosfolipídios da membrana espermática (Suquet et al.,

2000). Os crioprotetores externos atuam na estabilização da membrana plasmática e

restauração dos fosfolipídeos perdidos pelos espermatozoides durante a congelação. No

entanto, estes não são utilizados frequentemente em ciprinídeos, sendo relatadas na literatura

à adição de gema de ovo-citrato ou somente gema de ovo as soluções diluidoras de sêmen de

carpa comum (Sultana et al., 2010; Öğretmen et al., 2014).

Após a diluição, os crioprotetores requerem um tempo de equilíbrio para penetrar nas

células. Este é um processo dinâmico e depende da permeabilidade dos espermatozoides,

crioprotetores e as suas concentrações (Yang & Tiersch, 2009). Irawan et al. (2010) obtiveram

uma taxa de motilidade espermática de 94,5±3,3% utilizando como diluidor NaCl e sacarose,

diluente DMSO 10% e tempo de equilíbrio de 10 min a 25 °C para a criopreservação seminal

de carpa comum. Porém, utilizando as mesmas condições de criopreservação seminal da

espécie, Linhares (2012) iniciou o processo de congelamento das amostras sem a utilização de

tempo de equilíbrio obtendo 61,8±10,7% de motilidade espermática. Por outro lado,

Nahiduzzaman et al. (2012) observaram que quando as amostras de sêmen de carpa indiana

(Labeo calbasu) foram criopreservadas com Alsever e DMSO 5%, maiores taxas de

motilidade foram obtidos, aproximadamente 90±0%, em todos os tempos de equilíbrio (5, 10,

15, 20 e 25 min) testados a 4 °C. No entanto, Akçay et al. (2004) obteve uma taxa de

motilidade espermática de 55% utilizando um tempo de equilíbrio de 45 min a 4 °C para

criopreservar sêmen de carpa comum diluído em NaCl, KCl, CaCl2, NaHCO3 e DMSO 15%.

42

Portanto, a variedade dos tempos de equilíbrio relatadas na literatura é esperada

devido a grande quantidade de diluidores utilizados para a família dos ciprinídeos. Além

disso, a taxa de diluição é um fator a ser considerado.

Taxas de diluição e armazenamento do sêmen

As concentrações dos diluentes precisam ser ajustadas antes de serem misturados aos

diluidores, pois os mesmos são tóxicos as células em temperatura ambiente. Comumente as

concentrações dos crioprotetores são ajustados a 5 ou 10%, pois as pesquisas apontam que em

altas concentrações alguns crioprotetores pode ser prejudicial à motilidade espermática. Rani

& Munuswamy (2014) observaram menores taxas de viabilidade espermática (35%)

utilizando 20% de DMSO, viabilidade mediana (61,5%, 62,3%, 60,8%) utilizando glicerol

(10% e 20%) e DMSO 15% e viabilidade máxima (75,8%) utilizando 10% de DMSO em

amostras de sêmen de carpa comum conservadas a 4 °C. Após a verificação da melhor

concentração do crioprotetor e formação do diluente, o sêmen é submetido a diferentes taxas

de diluição para se verificar a melhor proporção entre as quantidades de diluente e sêmen. A

literatura relata a utilização de diferentes taxas de diluição para a criopreservação do sêmen de

carpa comum tais como 1:1, 1:3, 1:5, 1:6, 1:7 e 1:9 (Linhart et al., 2000; Warnecke & Pluta,

2003; Sultana et al., 2010; Linhares, 2012).

Para o armazenamento em nitrogênio líquido a mistura (sêmen:diluente) deve ser

envasada em recipientes padronizados para uniformizar o processo de resfrigeração e evitar

variações de transferência de calor. Para tal finalidade, podem ser utilizados palhetas de 0,25

mL, 0,5 mL, 1,2 mL, 2 mL e 5 mL (Linhart et al., 2000; Akçay et al., 2004; Horváth et al.,

2007; Irawan et al., 2010). Em seguida, o sêmen é submetido a uma queda gradual de

temperatura que influenciará o equilíbrio osmótico e o pH de soluções intra e extracelulares

durante a congelação. O ideal é que a taxa de resfrigeração seja rápida o suficiente para

minimizar o tempo de exposição às soluções concentradas e lenta o suficiente para minimizar

a quantidade de formação de gelo intracelular (Yang & Tiersch, 2009). Essa taxa de

resfriamento varia de acordo com o equipamento utilizado para fazê-lo.

Equipamentos de congelação

43

Os equipamentos utilizados para congelar as amostras de sêmen são as caixas térmicas

de poliestireno, refrigeradores programáveis, dry shippers e botijões criogênicos. A caixa

térmica de isopor é formada por poliestireno, dentro da qual é adaptada uma bandeja metálica

distante do fundo alguns centímetros acima da superfície do nitrogênio líquido. As dimensões

(comprimento x largura x altura) das caixas utilizadas podem variar de 27-40 cm x 18-24 cm

x 28-33 cm (Lahnsteiner et al., 2000; Linhares, 2012). A altura ideal para a congelação de

sêmen acima da superfície do nitrogênio líquido varia entre as espécies de ciprinídeos, sendo

utilizadas 2, 3, 4 e 6 cm (Irawan et al., 2010; Linhares, 2012). A temperatura na caixa pode

variar de -100 a -130 °C dependendo da quantidade de nitrogênio líquido despejado. As

amostras são suspensas sob a bandeja e congeladas por um período específico em vapor de

nitrogênio líquido podendo ser deixadas no interior da caixa por 3, 10, 20 ou 25 min (Alvarez

et al., 2003; Urbányi et al., 2006; Boryshpolets et al., 2009; Irawan et al., 2010). Dependendo

da espécie de peixe e da velocidade de resfriamento, o método de congelação de sêmen em

caixa térmica de poliestireno pode ser tão eficaz quanto à utilização de um refrigerador

programável.

Este último equipamento citado anteriormente é programado para controlar o

resfriamento gradual de amostras biológicas antes de serem imersas em nitrogênio líquido. A

redução da temperatura é realizada durante um período determinado pelo programador

estabelecendo-se um intervalo de temperatura inicial e final para o término do resfriamento.

Este processo é chamado de curva de resfriamento e pode variar entre as taxas de resfriamento

e intervalos de temperatura inicial e final. Nahiduzzaman et al. (2012), em apenas uma etapa,

resfriou as amostras de 5°C a -80°C numa taxa de resfriamento de 10°C/min enquanto Irawan

et al. (2010) utilizou a mesma taxa de resfriamento porém um intervalo de temperatura

diferente de 25°C a -40°C. Sultana et al. (2010), utilizando duas etapas, primeiramente

resfriou as amostras de 5°C a -4°C numa taxa de resfriamento de 4°C/min e em seguida

prosseguiu o resfriamento de -4°C a -80°C sob uma taxa de 10°C/min. No entanto, Linhart et

al. (2000) utilizou um protocolo diferente resfriando primeiramente as amostras de 4°C a -9°C

numa taxa de resfriamento de 4°C/min e em seguida continuou de -11°C a -80°C sob uma

taxa de 11°C/min.

O dry shipper é um contêiner para transportar com segurança amostras em

temperaturas criogênicas. Trata-se de um botijão em alumínio, cujo interior está recoberto por

um material de absorção de nitrogênio líquido responsável pela congelação a vapor de

amostras de sêmen a uma taxa de resfriamento de aproximadamente 25–40 °C min-1 com

44

estabilização gradual de -181 °C em 3 min (Taitson et al., 2007). O equipamento foi utilizado

com sucesso para carpa comum, obtendo boas taxas de motilidade espermática quando

comparado à caixa de poliestireno comumente utilizada para a espécie (Linhares, 2012). No

entanto, são escassas as pesquisas que relatam a utilização do dry shipper para criopreservar

sêmen de carpa comum. O dry shipper é utilizado com frequência para as espécies nativas

brasileiras tais como Brycon insignis e Brycon opalinus obtendo resultados positivos de

motilidade, fertilização e eclosão (Viveiros et al., 2012a,b).

Após o equilíbrio térmico, o sêmen congelado é transferido para um botijão de

nitrogênio líquido, onde pode ser conservado por longos períodos (Li et al., 2010) até ser

utilizado para fertilização.

Fertilização

O sucesso do protocolo de criopreservação é verificado através da descongelação do

sêmen em banho de imersão térmica e avaliação da qualidade espermática, sendo a

fertilização artificial a etapa final para a análise da qualidade dos gametas. A biotécnica pode

ser realizada por dois métodos diferentes: o método úmido que se baseia na mistura de

gametas masculinos e femininos coletados simultaneamente com água (Sultana et al., 2010) e

o método a seco que mistura primeiramente os gametas acrescentando-se água em seguida

(Akçay et al., 2004).

A reprodução artificial em carpa é mais complexa porque o procedimento de

inseminação requer uma solução específica para evitar a aderência entre os ovócitos que

ocorre normalmente na água doce. A aderência é oriunda do envelope vitelino que reveste os

ovócitos e é formado por carboidratos desidratados (Linhart et al., 1995). Essas camadas

acelulares envoltórias servem para proteção, nutrição e barreira pela qual os espermatozoides

devem atravessar (Montanari, 2013). Entretanto, essa mesma aderência é responsável pela

formação de uma massa de ova que dificulta o encontro da micrópila pelos espermatozoides,

prejudicando o processo de fertilização.

A solução comumente utilizada pode ser formulada de duas formas conforme a

quantidade de ureia adicionada. Uma delas é composta por 3 g de ureia e a outra por 20 g de

ureia juntamente com 4 g de NaCl para cada litro de água. Essas soluções atuam na ativação

dos espermatozoides e remoção da adesividade dos ovócitos durante agitação contínua por 1

45

hora a 1 hora e 30 minutos. Após esse período adiciona-se uma solução de ácido tânico

(0,5g/L) por 20 segundos, removendo-a em seguida (Billard et al., 1995). Vale ressaltar que

muitos autores relatam a utilização da solução contendo 3% de ureia (Horváth et al., 2007;

Irawan et al., 2010). No entanto, Billard et al. (1995) afirmam que a solução contendo 20% de

ureia é uma solução melhorada, necessitando de menos tempo de agitação para a remoção da

adesividade dos ovócitos. Além disso, pode-se utilizar também o leite em pó composto por

27,2% de gordura, 26,6g de albumina, 37,2g de açúcar do leite, 5,8g de íons, 0,2g de lecitina e

3g de água em 100g do mesmo para a preparação de uma solução de 40g de leite em pó por

litro de água declorada ou limpa. A solução de leite em pó deve ser adicionada lentamente

misturando-se um volume de 1 L da solução por Kg de ovócitos. Após 60 minutos, adiciona-

se lentamente mais água durante 10 minutos para substituição da solução de leite e em

seguida ovócitos podem ser transferidos para as incubadoras (Linhart et al., 2003).

Durante os testes de fertilização necessita-se definir a dose inseminante ideal, ou seja,

a proporção mínima de espermatozoides por ovócito capaz de produzir a máxima

sobrevivência em termos de larvas eclodidas. Esta técnica conserva e economiza gametas,

melhora a utilização do macho e contribui para um aumento da variabilidade genética. O

sucesso de uma fertilização artificial utilizando uma dose inseminante é determinado por meio

da taxa de fertilização, ou seja, a partir de uma coleta aproximada de 150 embriões contam-se

aqueles em estágio de gástrula e divide-se pelo número de ovócitos fertilizados (Horváth et

al., 2003). Da mesma forma, também é calculada a taxa de eclosão por meio da contagem do

número de larvas eclodidas dividida pelo número total de ovócitos fertilizados. A definição da

dose inseminante utilizando sêmen criopreservado de ciprinídeos já foi estabelecida por

alguns autores obtendo diferentes resultados de taxa de fertilização e eclosão (Quadro 1).

Posteriormente, os ovócitos fertilizados são transferidos para um sistema de

incubação, desenvolvido de acordo com as especificidades do animal. As incubadoras podem

apresentar dimensões de 0,6m de altura e 0,7m de diâmetro com capacidade para 90L

(Nahiduzzaman et al., 2012). É importante ressaltar que o suprimento de oxigênio,

temperatura adequada e fluxo contínuo de água são fundamentais para o desenvolvimento

embrionário regular. Este é comumente descrito pelos autores em fases divididas em zigoto,

primeiras clivagens, mórula, blástula, gástrula, fechamento do blastóporo, diferenciação do

embrião e embrião eclodido, sendo o tipo de clivagem meroblástica discoidal. Durante o

surgimento de cada fase é registrado o tempo (horas ou minutos) após o início da fertilização.

46

Sividanes et al. (2012) observou as primeiras segmentações com 22 minutos, estágio

de mórula com 1 hora e 43 minutos, blástula com 2 horas e 27 minutos, gástrula com 5 horas

e 50 minutos, fechamento do blastóporo com 9 horas e 49 minutos, diferenciação do embrião

com 12 horas e 56 minutos e a eclosão das larvas com 20 horas e 3 minutos após a fertilização

a uma temperatura de 24 °C. Enquanto Nica et al. (2012) verificou as primeiras segmentações

com 50 minutos, estágio de mórula e blástula com 50 minutos a 1 hora e 35 minutos, gástrula

com 6 horas e 15 minutos, diferenciação do embrião com 15 horas e eclosão das larvas com

50 horas após a fertilização a uma temperatura de 22 °C. Portanto percebe-se que os tempos

dos registros embrionários dependem principalmente da temperatura da água de incubação

dos embriões. Do exposto, torna-se fundamental o conhecimento da embriologia detalhada da

carpa comum para uma melhor compreensão da biologia da espécie.

Tabela 1. Taxas de fertilização e eclosão (%) após a realização de fertilização artificial utilizando diferentes

doses inseminantes com sêmen descongelado de algumas espécies de ciprinídeos.

Espécies Meios de congelação Dose

inseminante

(sptzs:ovócito)

Taxa de

fertilização

(%)

Taxa de

eclosão

(%)

Referências

Diluidor Diluente

Carpa

comum

(Cyprinus

carpio)

Glicose Metanol 10% 2,6-3,4x104:1 74 ± 15 67 ± 17 Horváth et al.

(2003)

Carpa

comum

(Cyprinus

carpio)

Kurokura +

própolis

Dimetilsulfóxido

10% + gema de

ovo 10%

1,0 x105:1 95,0 ± 0,6 60,3 ± 2,0 Öğretmen et

al. (2014)

Carpa

comum

(Cyprinus

carpio)

Kurokura +

trealose

Dimetilacetamida

20%

1,0 x105:1 98 80±2 Warnecke &

Pluta (2003)

Carpa

comum

(Cyprinus

carpio)

NaCl +

Sacarose

DMSO 10% 2,0x105:1 73,6±6,5 62,8±5,9 Irawan et al.

(2010)

Carpa

espelho

(Cyprinus

carpio)

NaCl + KCl

+ Tris

Dimetilacetamida

15%

2,5x105:1 25,9 - Akçay et al.

(2004)

Carpa

comum

(Cyprinus

carpio)

Kurokura DMSO 10% 1,8-2,4x105:1 56±10 52±9 Linhart et al.

(2000)

Carpa

indiana

(Labeo

calbasu)

Alsever DMSO 10% ou

Metanol 10%

4,1x105:1 65±3 ou

63±4

45±2 ou

45±3

Nahiduzzama

n et al. (2012)

Considerações finais

47

As biotécnicas utilizadas na produção de carpa comum vêm avançando e contribuindo

para aprimorar programas de reprodução de ciprinídeos. No entanto, diante de uma variedade

de ferramentas empregadas na produção de alevinos não há uma padronização nos protocolos

de criopreservação e reprodução assistida. A literatura relata diferenças entre diluidores, taxas

de diluição, armazenamento do sêmen, equipamentos de congelação e técnicas de fertilização

assistida em um mesmo grupo de animais, tornando esse conjunto de biotécnicas

inconsistentes e de difícil difusão. Portanto, percebe-se que os protocolos são desenvolvidos

para alcançar determinados objetivos conforme as necessidades e condições de pesquisa de

cada grupo.

Neste contexto, é fundamental o aperfeiçoamento continuado destas biotécnicas,

permitindo futuramente a preservação de espécies em via de extinção bem como aquelas de

potencial produtivo capazes de favorecer a geração de proteínas de origem animal adequadas

para aniquilar a fome proteica que assola parte da população mundial.

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51

8 CAPÍTULO 3

Efeito de vitaminas adicionadas ao diluente ACP-104 sobre a qualidade do sêmen

criopreservado de carpa comum (Cyprinus carpio)

Effect of vitamins added to the ACP-104 extender on the quality of cryopreserved semen

of common carp (Cyprinus carpio)

Periódico: Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia (ISSN: 1678-4162)

Fator de impacto: 0,269 (Qualis A2)

52

RESUMO

O objetivo foi alcançado a partir da divisão da pesquisa em dois experimentos: (1) aperfeiçoar

o protocolo de congelação utilizando água de coco em pó (ACP-104) como diluente para a

criopreservação seminal de carpa comum; (2) avaliar o efeito da suplementação das vitaminas

C (ácido ascórbico) ou E (α-tocoferol) sobre os melhores diluidores testados no experimento 1

na qualidade do sêmen pós-descongelado da espécie. Para o experimento 1, foram formados

oito pools de sêmen provenientes de 14 machos selecionados. As amostras seminais coletadas

foram avaliadas quanto à motilidade total, à velocidade, ao percentual de espermatozoides

normais e à vitalidade espermática antes e depois da criopreservação seminal. Esta foi

realizada em meio ACP-104 acrescido de dimetilsulfóxido (DMSO), ou etilenoglicol (EG), ou

glicerol, ou metanol, todos à concentração de 10% diluídos em 1:3 (sêmen:diluidor). As

amostras foram então congeladas em vapor de nitrogênio líquido em dry shipper e estocadas

em nitrogênio líquido (-196 °C). Para o experimento 2, foram formados oito pools a partir da

coleta de sêmen de 15 machos. As amostras seminais foram avaliadas seguindo as mesmas

análises do experimento 1, acrescentando-se a duração da motilidade total. A criopreservação

seminal utilizou-se dos meios ACP-104 acrescido de DMSO ou EG, suplementados ou não

com vitamina C ou E. Os melhores resultados encontrados no experimento 1 foram obtidos

com o DMSO e o EG. Estes não diferiram significativamente entre si para a motilidade total

(24% e 28%; p>0,05) e normalidade espermática (32% e 26%; p>0,05) respectivamente. Para

o experimento 2, o EG suplementado com vitamina E produziu significativamente resultados

superiores de motilidade total, normalidade espermática e duração da motilidade em relação

ao DMSO, concluindo-se que o EG deve ser, portanto, o crioprotetor de escolha a ser

utilizado com o ACP-104 suplementado ou não com vitamina E.

Palavras-chave: Cyprinus carpio, sêmen, criopreservação, antioxidantes, ACP-104

53

Efeito de vitaminas adicionadas ao diluente ACP-104 sobre a qualidade do sêmen

criopreservado de carpa comum (Cyprinus carpio)

F. R. A. Linhares1*, M. S. Oliveira1, J. F. Nunes1, M. A. M. Carvalho1, C. C. Campello1, C. S.

B. Salmito-Vanderley1

1Universidade Estadual do Ceará – UECE – Fortaleza, CE

Abstract

The objective was achieved from the research division in two experiments: (1) improving the

freezing protocol using powdered coconut water (ACP-104) as a diluent for the

cryopreservation seminal of common carp; (2) evaluate the effect of supplementation of

vitamins C (ascorbic acid) or vitamin E (α-tocoferol) with the best extenders tested in

experiment 1 on the quality of post-thawed. For the experiment 1, semen pools from 14

selected males were formed. Seminal samples were evaluated for total motility, velocity,

percentage of normal sperm and sperm vitality before and after the seminal cryopreservation.

This was done in ACP-104 extender plus dimethyl sulfoxide (DMSO), or ethylene glycol

(EG), or glycerol or methanol all at concentration 10% diluted in 1:3 (semen:extender). The

samples were frozen in vapors of nitrogen into dry shipper and stored in liquid nitrogen (-196

°C). For the experiment 2, eight pools were formed from the 15 male. The semen samples

were evaluated following the same analysis of the experiment 1 adding duration of total

motility. The sperm cryopreservation was performed in extenders ACP-104 plus DMSO or

EG supplemented or not with vitamin C or E. The best results found in Experiment 1 were

obtained with DMSO and EG. They do not differ significantly for total motility (24% and

28%; p>0.05) and normal sperm (32% and 26%; p>0.05) respectively. For experiment 2, EG

supplemented with vitamin E, produced significantly better results overall motility, sperm

normality and duration of motility relative to DMSO. In conclusion the EG should be the

cryoprotectant of choice for use with the ACP-104 supplemented or not with vitamin E.

Keywords: Cyprinus carpio, sperm, cryopreservation, antioxidants, ACP-104

54

Introdução

O diluente ACP-104 preparado à base de água de coco vem sendo utilizado com

relativo sucesso na criopreservação do sêmen de peixes (Carvalho et al., 2014). No entanto

sua eficiência ainda é baixa, como diluente para a criopreservação, em termos de conservação

da motilidade e de velocidades espermáticas quando os resultados são comparados ao sêmen

in natura (Linhares et al., 2015). Esse baixo desempenho tem sido observado em outros

diluidores de criopreservação e foram correlacionados com o estresse térmico, osmótico e

oxidativo (Li et al., 2010). Desse modo são necessários novos estudos que possibilitem

aumentar a eficiência do meio ACP-104.

O estresse oxidativo é ocasionado pela geração excessiva de espécies reativas do

metabolismo do oxigênio conhecidas como ROS (O2-, OH•, HO2

• e H2O2) (Martinez-Páramo

et al., 2012). As ROS podem prejudicar a função espermática; reduzir viabilidade, motilidade

e integridade de membrana; aumentar a peroxidação lipídica e comprometer a atividade de

algumas enzimas após criopreservação (Słowińska et al., 2013). Para combater a produção

excessiva de ROS e o estresse oxidativo, o sêmen apresenta um sistema de defesa

antioxidante intra e extracelular formado por componentes enzimáticos e não enzimáticos

(LAHNSTEINER; MANSOUR, 2010). No entanto o sistema intracelular de defesa

antioxidante do espermatozoide é mais susceptível à ação das ROS, devido à escassez de

citoplasma, o qual é perdido durante a maturação celular (Carvalho et al., 2002). Alguns

estudos têm demonstrado que a adição de antioxidantes aos meios de congelação de sêmen de

peixes ajuda a proteger os espermatozoides, reduzindo os danos provocados pelo estresse

oxidativo (Kutluyer et al., 2014; Navarro et al., 2014).

As vitaminas C (ácido ascórbico) e E (α-tocoferol e derivados) são antioxidantes não

enzimáticos que protegem os espermatozoides de danos oxidativos do DNA e previnem a

deterioração oxidativa de lipídios poli-insaturados presentes na membrana que rodeia as

células e organelas celulares (Martinez-Páramo et al., 2012). Contudo não existem

publicações sobre a suplementação das vitaminas C ou E ao diluente ACP-104 quanto a sua

capacidade de aumentar a qualidade seminal e proteger os espermatozoides de carpa comum

do efeito tóxico dos radicais livres. Portanto o objetivo da presente pesquisa foi otimizar o

protocolo existente definindo inicialmente qual crioprotetor deve ser usado em associação

com o meio ACP-104 para a criopreservação seminal de carpa comum e posteriormente, após

55

seleção do crioprotetor, avaliar o efeito da suplementação da vitamina C ou E ao diluidor

escolhido sobre a qualidade do sêmen após a descongelação.

Material e métodos

A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade

Estadual do Ceará (CEUA/UECE; 11516665-3/63). Os animais utilizados pertenciam ao

Centro de Pesquisas em Aquicultura (CPAq) do Departamento Nacional de Obras Contra as

Secas (DNOCS) (Pentecoste - Ceará).

A pesquisa foi dividida em dois experimentos: (1) aperfeiçoar o protocolo de

congelação utilizando água de coco em pó (ACP-104) como diluente para a criopreservação

seminal de carpa comum; (2) avaliar o efeito da suplementação das vitaminas C e E sobre os

melhores crioprotetores selecionados no experimento 1 com base na qualidade do sêmen pós-

descongelação. A coleta de sêmen foi realizada em janeiro de 2015. No primeiro experimento,

o sêmen foi obtido a partir de 14 machos sexualmente maduros (46,36 ± 3,63 cm e 1,68 ±

0,41 Kg), que foram estimulados à espermiação após dose única de extrato hipofisário de

carpa (EHC; Danúbio Aquicultura Ltda., Brasil) de 1 mg/Kg de peso vivo. Os animais foram

previamente sedados em solução de eugenol (Cequímica Ltda., Brasil), diluída em álcool

absoluto e água (1:10:10000). Após 12 horas da indução hormonal, o sêmen foi colhido por

meio de massagem abdominal, evitando-se contaminação com água, fezes, urina ou sangue. O

sêmen foi coletado em tubos graduados e as amostras conservadas em caixas térmicas (~ 5

°C). O volume seminal (mL) foi aferido diretamente nos tubos; o pH, por meio de fitas de pH

(Merck-Alemanha) e a concentração espermática, por contagem em câmara de Neubauer. A

análise subjetiva da motilidade foi estimada com o auxílio de um microscópio ótico (Nikon

Eclipse E200 - ampliação de 100x) após a mistura de 2 µL de sêmen e 100 µL de água do

tanque. Considerando-se como 0% nenhum espermatozoide móvel e 100% todos os

espermatozoides móveis, somente as amostras com motilidade superior a 80% foram

utilizadas.

A partir das amostras selecionadas, foram formados oito pools, cada um constituído

pela combinação das amostras de três machos de forma aleatória com algumas outras carpas

contribuindo mais de uma vez para a formação dos pools. Cada pool foi dividido em quatro

alíquotas, diluído na proporção de 1:3 (sêmen:diluidor) em diluente ACP-104 (ACP

Biotecnologia, Fortaleza, Ceará, Brasil) e acrescido de dimetilsulfóxido (DMSO),

56

etilenoglicol (EG), glicerol ou metanol, todos na concentração de 10% (Cequímica Ltda.,

Brasil). Dessa forma, os quatro criodiluidores para cada pool foram: ACP-104 + DMSO;

ACP-104 + EG; ACP-104 + glicerol e ACP-104 + metanol. O grupo controle correspondeu ao

sêmen in natura. A solução crioprotetora foi preparada de acordo com Linhares et al. (2015).

No segundo experimento, verificou-se o efeito da suplementação com vitamina C ou E

nos melhores criodiluentes do experimento 1 sobre a qualidade seminal. Para o sêmen obtido

de 15 machos sexualmente maduros (52,27 ± 5,56 cm; 2,37 ± 0,80 Kg), seguiu-se o mesmo

procedimento: indução hormonal, coleta e preparação das amostras, congelação e avaliação

para ambos os experimentos. Cada pool (n=8) foi dividido em seis alíquotas e diluído na

proporção de 1:3 (sêmen:diluidor) em diluente ACP-104 acrescido de 10% de DMSO ou EG

suplementados ou não com vitamina C (0,0001 mg; ácido ascórbico) ou E (0,0001 mg; α-

tocoferol) conforme Navarro et al. (2014). Assim foram formados seis tratamentos: ACP-104

+ DMSO; ACP-104 + DMSO + vitamina C; ACP-104 + DMSO + vitamina E; ACP-104 +

EG; ACP-104 + EG + vitamina C e ACP-104 + EG + vitamina E. O grupo controle

correspondeu ao sêmen in natura.

A criopreservação seminal realizada nos dois experimentos seguiu a seguinte

metodologia: os criodiluidores foram envasados em palhetas de 0,25 mL, distribuídas em

hastes de alumínio e congelados em dry shipper (Cryofarm) por dez minutos numa taxa de

resfriamento de aproximadamente 25-40 °C/min com estabilização gradual de -181 °C em 3

min. Em seguida as hastes de alumínio foram transferidas para um botijão com nitrogênio

líquido (-196 °C) e transportadas até o Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes

do Núcleo Integrado de Biotecnologia (LBRP-NIB) da UECE (Fortaleza - Ceará). Após uma

semana de estocagem, as amostras seminais foram descongeladas em banho-maria a 25 °C

por 30 segundos e analisadas quanto aos parâmetros cinéticos (motilidade total e velocidades

espermáticas), à vitalidade e à morfologia espermática. No experimento 2, a análise da

duração da motilidade espermática foi acrescentada.

Por meio da análise objetiva computadorizada (CASA), o sêmen foi avaliado quanto

aos parâmetros de porcentagem de motilidade total (velocidade espermática >10 μm/s), de

velocidade curvilinear (VCL), de velocidade em linha reta (VSL) e de velocidade média do

percurso (VAP). Cada imagem (n=25) foi analisada utilizando-se a configuração padrão para

peixes estabelecida pelo Sperm Class Analyser software (SCATM 2005, Microptics, S.L.

versão 3.2.0, Barcelona, Espanha). Para ativação, 2 μL de sêmen foram misturados com 100

57

μL de NaCl (0,29%) em câmara de Makler® e as amostras foram analisadas em microscópio

ótico com contraste de fase (Nikon® H550S, ECLIPSE 50i, Japan, 400x) conectado a uma

vídeo câmera. As imagens foram gravadas de três a quatro segundos após a ativação.

A vitalidade espermática foi avaliada a partir de esfregaços corados (10 µL eosina:10

µL nigrosina:5 µL sêmen), contando-se 200 espermatozoides por lâmina em microscópio

ótico (400x). Considerou-se espermatozoides vivos com membrana intacta (cabeça não

corada) e espermatozoides mortos com ruptura na membrana plasmática (forte coloração

avermelhada).

Para a análise morfológica espermática, esfregaços realizados com sêmen fixado em

citrato formol 4% foram corados com rosa bengala conforme Miliorini et al. (2011),

registrando-se os espermatozoides normais (%) em microscópio ótico (400x). Foram

observados 200 espermatozoides (100 por lâmina).

A duração da motilidade (segundos) consistiu na observação dos espermatozoides em

microscópio ótico (400x; CASA), acionando-se o cronômetro desde o momento da ativação

do sêmen até que restassem somente 10% de células móveis.

No experimento 1, um total de 256 palhetas foram criopreservadas, resultantes da

combinação de 8 palhetas x 4 tratamentos x 8 pools. Para o experimento 2, foram

criopreservadas 384 palhetas, resultantes da combinação de 8 palhetas x 6 tratamentos x 8

pools.

Os dados foram inicialmente submetidos aos testes de Shapiro-Wilk e Bartlett para

confirmação dos requerimentos com o objetivo de realização da análise de variância

(distribuição normal dos resíduos e homocedasticidade, respectivamente). Nos casos em que

não houve homogeneidade de variâncias entre os tratamentos, considerando os dados brutos,

foram feitas tentativas de transformação (logarítmica, radicial e angular). Para algumas

variáveis, a transformação logarítmica resultou em enquadramento nos requerimentos da

ANOVA. A análise de variância foi então executada considerando um delineamento

inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2 x 3, sendo dois tratamentos e três

possibilidades de inclusão de vitaminas (vitaminas C, E ou nenhuma vitamina). Nos casos em

que houve significância dos efeitos principais ou da interação, foi aplicado o teste de Student-

Newman-Keuls (SNK) para comparação das médias. Comparações com o grupo controle

foram feitas usando-se o teste de Dunnett. Em alguns casos, persistiu a homocedasticidade,

58

mesmo após as tentativas de transformação, e foi aplicado o teste não paramétrico de Kruskal-

Wallis. Em todas as situações, diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05, e

os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão.

Resultados

Para o experimento 1, as amostras do sêmen in natura apresentaram valor médio de

motilidade subjetiva igual a 96,50 ± 6,27%, concentração espermática média igual a 19,59 ±

5,85x109 espermatozoides/mL, volume médio de 7,54 ± 6,20 mL e pH médio de 8,25 ± 0,26.

Em todos os tratamentos, independente do crioprotetor utilizado e do acréscimo ou

não de vitaminas, o sêmen descongelado mostrou uma redução significativa (p<0,05) em

todos os parâmetros seminais avaliados (motilidade total, velocidades, percentual de

espermatozoides normais, vitalidade e duração da motilidade) em comparação ao sêmen in

natura (Tab. 1, 2, 3 e 4).

Quando o sêmen criopreservado com DMSO foi comparado ao EG, os resultados não

diferiram entre si (p>0,05). Contudo, ao serem comparados com o glicerol e metanol,

mostraram motilidade total significativamente superior (p<0,05; Tab. 1). Efeitos deletérios

sobre a qualidade seminal foram observados com o glicerol e metanol com apenas 2% e 11%

de motilidade total respectivamente. As velocidades espermáticas do sêmen criopreservado

em glicerol e metanol foram abaixo (p<0,05) dos demais crioprotetores (Tab. 1), quando

observou-se aglutinação dos espermatozoides logo após a descongelação das amostras com

estes dois crioprotetores.

O percentual de espermatozoides normais diminuiu em média 21% após a

criopreservação seminal ao comparar-se o sêmen in natura (Tab. 2). Apesar do alto percentual

de espermatozoides vivos (~ 92%) no grupo controle, apenas cerca de 47% de

espermatozoides foram normais, influenciando negativamente os resultados do sêmen

descongelado. Considerando-se como critério principal a motilidade total, seguido da

velocidade e da normalidade espermática, os melhores tratamentos em ordem decrescente

foram EG, DMSO, metanol e glicerol (Tab. 1 e 2).

Tabela 1. Efeito de diferentes tipos de crioprotetores sobre os parâmetros cinéticos de espermatozoides frescos

59

(grupo controle) e descongelados de Cyprinus carpio criopreservados em ACP-104 sem vitaminas.

Crioprotetor

Parâmetros cinéticos

Motilidade total (%) VCL (μm/s) VSL (μm/s) VAP (μm/s)

Controle 95,06±4,34 86,77±21,27 37,51±15,09 68,54±19,70

DMSO 24,38±15,37*a 37,68±3,95*a 22,08±3,76*a 31,30±4,81*a

EG 28,30±15,21*a 41,70±5,46*a 25,95±5,19*a 36,10±5,11*a

Glicerol 2,65±3,72*c 15,39±16,65*c 6,55±7,22*c 11,14±12,11*c

Metanol 11,05±9,48*b 34,50±4,56*b 17,05±4,30*b 26,99±4,73*b

*Representa diferença significativa em relação ao controle. Letras minúsculas distintas representam diferenças

significativas entre linhas. O controle corresponde ao sêmen in natura. ACP- 104: água de coco em pó para

sêmen de teleósteos de água doce de fertilização externa; DMSO: dimetilsulfóxido; EG: etilenoglicol; VCL:

velocidade curvilinear; VSL: velocidade retilinear; VAP: velocidade média do percurso.

Tabela 2. Efeito de diferentes tipos de crioprotetores sobre o percentual de espermatozoides normais e

vitalidade de espermatozoides frescos (grupo controle) e descongelados de Cyprinus carpio

criopreservados em ACP-104 sem vitaminas.

Crioprotetor Espermatozoides normais (%) Vitalidade (%)

Controle 46,62 ± 13,44 91,75 ± 3,23

DMSO 31,94 ± 6,97*a 37,16 ± 10,76*a

EG 26,44 ± 6,92*ab 25,71 ± 7,39*b

Glicerol 20,50 ± 8,36*b 28,05 ± 14,78*ab

Metanol 25,06 ± 6,79*ab 28,09 ± 8,99*ab

*Representa diferença significativa em relação ao controle. Letras minúsculas distintas representam

diferenças significativas entre linhas. O controle corresponde ao sêmen in natura. ACP-104: água de

coco em pó para sêmen de teleósteos de água doce de fertilização externa; DMSO: dimetilsulfóxido; EG:

etilenoglicol.

Para o segundo experimento, as amostras seminais coletadas apresentaram taxa média

de motilidade subjetiva de 90,13 ± 22,92%, concentração espermática média de 27,36 ±

9,83x109 espermatozoides/mL, volume médio de 6,65 ± 6,97 mL e pH médio de 7,23 ± 1,61.

Os crioprotetores DMSO e EG foram, então, selecionados para o segundo experimento

para se avaliar o efeito da suplementação de vitamina C ou E no meio ACP-104 contendo

DMSO ou EG sobre a qualidade espermática.

O acréscimo de vitamina C ou E ao EG não teve nenhum efeito quando comparado ao

tratamento sem vitamina (p>0,05; Tab. 3). Contudo a adição de vitamina C ao DMSO

aumentou a taxa de motilidade total em 11% quando comparado ao tratamento sem vitamina e

em 17% quando comparado ao tratamento com vitamina E (Tab. 3). Independente do

acréscimo ou não de vitaminas, o EG foi o crioprotetor que obteve maiores índices de

normalidades espermáticas. Dentro dos tratamentos envolvendo o DMSO, o acréscimo de

vitamina C proporcionou maiores índices de normalidade espermática, enquanto o acréscimo

de vitamina E não produziu um efeito benéfico na concentração testada (Tab. 3).

60

Tabela 3. Efeito de diferentes tipos de crioprotetores acrescidos de vitaminas sobre os parâmetros de motilidade

total (%), espermatozoides morfologicamente normais (%) e vitalidade espermática (%) de espermatozoides

frescos (grupo controle) e descongelados de Cyprinus carpio criopreservados em ACP-104.

Parâmetros

avaliados

Controle Crioprotetor Vitaminas

Sem vitamina C E

Motilidade total 96,14 ± 5,89 DMSO 34,63 ± 6,29*Bb 46,04 ± 9,94*Aa 28,87 ± 7,44*Bb

EG 48,22 ± 9,46*Aa 53,93 ± 12,83*Aa 52,50 ± 15,27*Aa

Espermatozoides

normais

83,71 ± 13,29 DMSO 32,00 ± 6,90*Ab 40,17 ± 5,67*Aa 21,83 ± 5,08*Bc

EG 57,17 ± 14,85*Aa 49,50 ± 7,48*Aa 53,67 ± 18,29*Aa

Vitalidade 97,44 ± 2,24 DMSO 47,12 ± 7,12*Ba 67,33 ± 12,69*Aa 74,50 ± 11,29*Aa

EG 36,75 ± 7,74*Bb 48,58 ±

8,12*ABb

61,08 ±

22,50*Aab

*Representa diferença significativa em relação ao controle. Letras maiúsculas distintas representam diferenças

significativas entre colunas dentro de cada parâmetro analisado (motilidade total, espermatozoides normais e

vitalidade). Letras minúsculas distintas representam diferenças significativas entre linhas dentro de cada

parâmetro analisado (motilidade total, espermatozoides normais e vitalidade). O controle corresponde ao sêmen

in natura. ACP-104: água de coco em pó para sêmen de teleósteos de água doce de fertilização externa; DMSO:

dimetilsulfóxido; EG: etilenoglicol.

Quanto à vitalidade espermática, o número de células viáveis, após o acréscimo de

vitamina C ou E, foi superior ao tratamento sem vitamina usando-se o DMSO como o

crioprotetor (Tab. 3; p<0,05). O uso do EG acrescido de vitamina E foi superior quando

comparado ao tratamento sem vitamina ou acrescido de vitamina C (p<0,05).

O crioprotetor EG foi capaz de manter a duração da motilidade espermática constante,

independente do acréscimo ou não de vitamina C ou E (Tab. 4), não havendo diferença

significativa (p>0,05).

Tabela 4. Efeito de diferentes tipos de crioprotetores acrescidos de vitaminas sobre a duração da

motilidade (segundos) de espermatozoides frescos (grupo controle) e descongelados de Cyprinus

carpio criopreservados em ACP-104.

Controle 168,14 ± 55,34

Crioprotetor Vitaminas

Sem vitamina C E

DMSO 65,57 ± 10,77*ABa 82,37 ± 25,66*Aa 50,67 ± 20,22*Ba

EG 81,67 ± 30,60*Aa 90,83 ± 9,64*Aa 70,54 ± 11,50*Aa

*Representa diferença significativa em relação ao controle. Letras maiúsculas distintas representam

diferenças significativas entre colunas. Letras minúsculas distintas representam diferenças

significativas entre linhas. O controle corresponde ao sêmen in natura. ACP- 104: água de coco em pó

para sêmen de teleósteos de água doce de fertilização externa; DMSO: dimetilsulfóxido; EG:

etilenoglicol.

Foi observado que a duração da motilidade reduziu em 32 segundos após o acréscimo

de vitamina E ao DMSO (50,67 ± 20,22%) quando comparada ao tratamento acrescido de

vitamina C (82,37 ± 25,66), havendo diferença significativa (p<0,05) entre os dois

61

tratamentos (Tab. 4). No presente estudo, a dose de 0,0001 mg utilizada para a vitamina E

combinada com DMSO 10% não foi benéfica.

Discussão

Este é o primeiro trabalho que avalia a interação do diluente ACP-104 com quatro

diferentes crioprotetores na criopreservação do sêmen de carpa comum. Além disso avalia de

forma original o efeito da suplementação de vitamina C ou E ao meio ACP-104 contendo

DMSO ou EG.

A redução da qualidade seminal após criopreservação, já observada no sêmen

descongelado de várias espécies, vem sendo atribuída principalmente a fatores como estresses

osmótico, térmico e oxidativo (Martinez-Páramo et al., 2012). Durante o processo de

criopreservação, os espermatozoides são submetidos à diluição do plasma seminal e a

temperaturas negativas em curto espaço de tempo. A diluição tem, assim, uma ação

multifatorial sobre a resistência dos espermatozoides contra lesões do congelamento (Akçay

et al., 2004), que dependem da taxa de diluição e da interação entre a composição química do

diluente com o tipo e a concentração de crioprotetor utilizada (Viveiros et al., 2012),

produzindo resultados diferenciados em relação à espécie. Além disso a diluição seminal

reduz a concentração de antioxidantes presente no plasma seminal, dificultando o combate aos

radicais livres referencias. Isso favorece a perda da qualidade seminal devido a danos

celulares, tais como alterações na estrutura da bicamada lipídica da membrana espermática,

baixa regulação de proteínas de membrana e enzimas citoplasmáticas, perda da integridade de

membrana e fragmentação de DNA (Li et al., 2010).

Os crioprotetores DMSO e metanol foram utilizados na presente pesquisa por serem

comumente utilizados para o sêmen de carpa (Salmito-Vanderley et al., 2014). O EG, ainda

pouco utilizado na criopreservação de sêmen da espécie estudada, foi escolhido com base nos

estudos de Li et al. (2013) por produzir menos danos osmóticos e oxidativos quando

comparado ao DMSO. Embora ambos alterem o estado de fosforilação das proteínas sobre os

resíduos de tirosina e treonina (Li et al., 2013), o EG tem sido menos prejudicial a este efeito

(Li et al., 2010; Li et al., 2013). O glicerol é pouco empregado na criopreservação do sêmen

de peixes, principalmente na concentração de 10%, pois tem elevada pressão osmótica e

viscosidade, o que promove uma aglutinação espermática e injúrias celulares irreversíveis

62

(Irawan et al., 2010). Entretanto foi escolhido para que fosse investigada a interação entre ele

e o diluente ACP-104.

A adição de antioxidantes aos diluidores de criopreservação com o intuito de melhorar

a qualidade espermática após a criopreservação vem sendo objeto de estudos por diferentes

grupos de pesquisas no mundo (Kutluyer et al., 2014; Navarro et al., 2014). Alguns destes

trabalhos têm revelado o efeito positivo de certos antioxidantes sobre a redução dos níveis de

ROS e sobre a motilidade total, a qual melhora; na duração da motilidade e na redução das

anormalidades espermáticas. Contudo este efeito positivo depende do tipo e da concentração

do antioxidante (Cao e Cutler, 1997).

As vitaminas C e E são conhecidas como potentes antioxidantes capazes de eliminar

os radicais livres e seus efeitos negativos. A vitamina C interage com a vitamina E e com o

selênio na manutenção da atividade de algumas enzimas como a superóxido dismutase (SOD)

e a glutationa peroxidase que são importantes para a eliminação de radicais oxidantes

produzidos pelo metabolismo espermático (Navarro et al., 2009). Entretanto a interação da

vitamina C com E juntamente com o ACP-104 não foi investigada no presente estudo.

A água de coco verde, que é base para o diluente ACP-104, é rica em aminoácidos,

vitaminas, sais minerais, carboidratos, além de possuir baixo teor de lipídios saturados e

insaturados (Carvalho et al., 2006). A vitamina C, presente no coco verde, é capaz de

proporcionar uma ação anti-inflamatória e antioxidante ao eliminar diretamente os radicais

livres e inibir a produção in vitro de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

(Carvalho et al., 2006; Santos et al., 2013), destacando assim a importância da água de coco

como uma alternativa no combate as ROS.

O processo de liofilização da água de coco reduz drasticamente os níveis de seus

compostos, muito embora a concentração de ácido ascórbico se mantenha constante segundo

Santos et al. (2013). No produto ACP, após a liofilização, detectou-se para cada 100 g do pó,

16,51 mg de vitamina C (Carvalho, 2013). Todavia o volume de diluente ACP, utilizado nesse

estudo, continha apenas 0,034 mg de vitamina C para cada mL de sêmen criopreservado,

sugerindo-se que a concentração de ácido ascórbico tanto do diluente quanto da

suplementação pode ter sido insuficiente para atuar na eliminação dos ROS. Deste modo é

necessário investigar concentrações mais elevadas de vitaminas C e E e suas interações com

outros antioxidantes na suplementação do meio ACP-104 capazes de favorecer um aumento

significativo na qualidade do sêmen pós-descongelado que seja comparável ao sêmen fresco.

63

Outro ponto a ser levado em consideração é o estresse que os peixes podem ter sofrido

durante o período de estiagem que assola a região onde foram realizados os experimentos

(CPAq, DNOCS – Pentecoste - CE). A crise hídrica vem diminuindo a níveis críticos a água

dos reservatórios (FUNCEME, 2015), o que pode ser um dos fatores que provocam alterações

na qualidade de água (Linhares et al., 2013) e na maturação dos gametas, justificando as

baixas taxas de velocidades dos espermatozoides e o alto percentual de anormalidades

espermáticas encontrados na pesquisa. Apesar disso a morfologia dos espermatozoides está

dentro dos padrões de normalidade exigidos para outros animais pelo Colégio Brasileiro de

Reprodução Animal (2013).

A duração da motilidade espermática é considerada um parâmetro importante a ser

avaliado, pois os espermatozoides necessitam de um tempo para encontrar a micrópila do

ovócito e fertilizá-la. Na presente pesquisa, o EG livre ou não de vitaminas e o DMSO

adicionado à vitamina C foram os tratamentos que apresentaram duração de motilidade

suficiente para os espermatozoides encontrarem a micrópila.

Conclusão

Conclui-se que o EG suplementado ou não com vitamina E seja o crioprotetor de

escolha a ser utilizado com o meio ACP-104 para criopreservar espermatozoides de carpa, por

apresentar melhor desempenho em termos de motilidade, de normalidade, de vitalidade e de

duração da motilidade espermática.

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67

9 CAPÍTULO 4

Determinação da dose inseminante e embriogênese na fertilização assistida

de carpa comum no nordeste brasileiro

Determination of insemination dose and embryonic development in the artificial

fertilization of common carp in brazilian northeast

Periódico: Ciência Rural (ISSN: 1678-4596)

Fator de impacto: 0,383 (Qualis B1)

68

RESUMO

A presente pesquisa dividiu-se em duas etapas: a primeira visou determinar a dose

inseminante para fertilização assistida da carpa comum (Cyprinus carpio), e a segunda

objetivou o registro em imagens e tempo de desenvolvimento de cada fase embrionária desta

espécie em latitude equatorial. Para execução da primeira etapa, os gametas foram coletados

de reprodutores induzidos hormonalmente e fertilizados nas seguintes proporções de

espermatozoides/ovócito: D1-15.152, D2-60.491, D3-179.584, D4-238.072 e D5-298.563.

Para a segunda etapa, o acompanhamento do desenvolvimento embrionário foi realizado por

meio de observações periódicas em estereoscópio até a eclosão das larvas. A porcentagem de

fertilização aumentou de forma linear, atingindo um platô em 45,5% na proporção de 208.295

espermatozoides/ovócito. Observou-se que os parâmetros de qualidade de água

permaneceram constantes e dentro dos padrões para o desenvolvimento inicial desta espécie.

O desenvolvimento embrionário apresentou três períodos bem definidos, divididos em mórula

(2 horas), blástula (3 horas) e gástrula (5 horas). O início da eclosão ocorreu entre 42 horas e

30 minutos e 45 horas após a fertilização, o que equivale a um intervalo de 1165,14 e 1235,7

horas-grau. Assim, recomenda-se o uso da dose inseminante de aproximadamente 200.000

espermatozoides/ovócito na rotina de fertilização assistida dessa espécie no nordeste

brasileiro. Além disso, o desenvolvimento embrionário da carpa em latitude equatorial segue

a cronologia semelhante ao relatado para a espécie em clima temperado.

Palavras-chave: Cyprinus carpio, embriologia, espermatozoides/ovócito, reprodução.

69

Determinação da dose inseminante e embriogênese na fertilização assistida

de carpa comum no nordeste brasileiro

Francisco Renan Aragão LinharesI Jordana Sampaio LeiteI Liliane Veras LeiteI Priscila Silva

de AlmeidaI Rômulo Roberto Ribeiro PinheiroI Assis Rubens MontenegroII Carminda Sandra

Brito Salmito-VanderleyI*

I*Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes, Programa de Pós-Graduação em

Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará (UECE),

Fortaleza, CE, Brasil. E-mail: sandra.salmito@uece.br. Autor para correspondência.

IIPrograma de Doutorado Integrado, Departamento de Zootecnia, Universidade Federal do

Ceará (UFC), Fortaleza, CE, Brasil.

Abstract

This research divided into two stages: the first aimed to determine the insemination

dose for artificial fertilization of common carp (Cyprinus carpio), and the second aimed to

record images and time in the development of each embryonic stage of the species in

equatorial latitude. For the implementation of the first stage, the gametes were collected from

induced breeding hormonally and fertilized in the following proportions of sperm/oocyte D1-

15152, D2-60491, D3-179584, D4-238072 and D5-298.563. For the second step, monitoring

of embryonic development was done through periodic observations in stereoscope until

hatching. The fertilization rate increased linearly up to the proportion of 208.295

spermatozoa/oocyte, and, from this point, the fertilization rate was maintained at 45,5%. It

was observed that the water quality parameters and remained constant within the standards for

the initial development of this species. The embryonic development showed three well

defined periods, divided into morula (2 hours), blastocyst (3 hours) and gastrula (5 hours).

The start of the hatching occurred between 42 hours and 30 minutes and 45 hours after

fertilization, which is equivalent to range of 1165.14 and 1235.7 hours-degree. Therefore, we

recommend the use of the insemination dose of approximately 200.000 sperm/oocyte in the

artificial fertilization routine of common carp in brazilian northeast. Moreover, embryonic

development of carp in equatorial latitude follows the chronology similar to that reported for

the species in temperate zones.

Key-words: Cyprinus carpio, embryology, spermatozoa/oocyte, reproduction.

70

Introdução

A carpa comum foi introduzida no Nordeste do Brasil por meio do Departamento

Nacional de Obras Contra as Secas (DNOCS) no ano de 1977 (DNOCS, 2009), e nos últimos

anos representa o quarto pescado da aquicultura continental mais produzido no país

(BOLETIM ESTATÍSTICO DA PESCA E AQUICULTURA, 2011). De acordo com o

mesmo boletim, o Nordeste representa a segunda maior produção aquícola continental de

pescado entre as regiões nacionais.

Nesse contexto, biotecnias aplicadas à fertilização assistida em peixes surgem como

ferramentas essenciais para auxiliar a crescente demanda de pescado no Brasil. A biotecnia de

fertilização assistida consiste em fertilizar o maior número de ovócitos com a menor

quantidade de espermatozoides, garantindo a máxima fertilidade com maior economia de

sêmen (LEITE et al., 2013). Porém, apesar da fertilização assistida de carpa comum ser

dominada (SALMITO-VANDERLEY et al., 2014), ainda são utilizados diferentes volumes

de sêmen por ovócito (dose inseminante), surgindo uma dúvida sobre a escolha da dose mais

eficiente para a realização da técnica.

Para avaliar o sucesso da fertilização assistida, torna-se necessário o acompanhamento

do desenvolvimento embrionário, visando a obtenção de embriões viáveis. Apesar de existir

relatos sobre o desenvolvimento embrionário da espécie em regiões de clima temperado

(NICA et al., 2012), o registro de imagens e a cronologia deste desenvolvimento para carpa

comum em latitude equatorial no Nordeste do Brasil não são relatados na literatura. A

compreensão destes eventos embrionários auxiliará na produção de novas linhagens de carpa

comum no Nordeste do Brasil.

Desta forma, os objetivos da presente pesquisa foram a determinação da dose

inseminante, ou a proporção de espermatozoide/ovócito, adequada para uso na fertilização

assistida de carpa comum (Cyprinus carpio) e o registro de imagens e do tempo de

desenvolvimento de cada fase embrionária para esta espécie em condições naturais de latitude

equatorial do nordeste do Brasil.

Material e métodos

A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade

Estadual do Ceará (CEUA/UECE; 11516665-3/63). O experimento foi realizado nos meses de

dezembro de 2014 e janeiro de 2015 no Centro de Pesquisas em Aquicultura (CPAq) do

DNOCS em Pentecoste - Ceará, situado a 3° 45' 00" de latitude sul e 39° 10' 24" de longitude

oeste.

71

O experimento foi dividido em duas etapas: (1) determinar a dose inseminante, ou

seja, a melhor proporção do número de espermatozoides por ovócitos; (2) registrar imagens e

acompanhar a cronologia do desenvolvimento embrionário. Para a etapa 1, o sêmen foi obtido

de 5 machos sexualmente maduros (43,5±2,13cm; 1,9±0,6kg) que receberam dose única de

extrato hipofisário de carpa (EHC; Danúbio Aquicultura Ltda., Brasil) de 1mg/kg de peso

vivo. Doze horas após a indução hormonal da reprodução, foi formado um pool do sêmen

coletado por meio de massagem abdominal.

O volume seminal foi aferido por meio de tubos graduados, o pH por fitas de pH

(MERCK-Alemanha) e a concentração espermática por contagem em câmara de Neubauer.

A análise subjetiva da motilidade (0 - 100%) foi estimada com o auxílio de um

microscópio ótico (Nikon Eclipse E200 - ampliação de 100x) após a adição de 100µL de água

do tanque a 2µL de sêmen. Os ovócitos foram obtidos de duas fêmeas sexualmente maduras

(53±8,49cm; 4,15±0,92kg) submetidas à indução da desova pela aplicação de duas doses de

EHC (0,5 e 5,0mg/kg, com intervalo de doze horas entre elas). Após a aplicação da segunda

dose hormonal, a temperatura da água do tanque foi verificada a cada hora para determinar o

momento da desova (tempo de latência) em horas-grau.

Foi formado um pool de ova do qual foram retiradas três amostras de 1g para estimar

a concentração de ovócitos. Do mesmo pool de ova, também foram retiradas 5 amostras de

25g, que foram fertilizadas com 20μL, 80μL, 237,5μL, 315μL ou 395μL do pool de sêmen em

quintuplicata. Essas quantidades de sêmen corresponderam às seguintes doses inseminanes:

15.152 (D1), 60.491 (D2), 179.584 (D3), 238.072 (D4) e 298.563 (D5) espermatozoides/

ovócito. Em seguida, utilizou-se o protocolo preconizado por BILLARD et al. (1995) para a

desagregação dos ovos. Estes logo foram transferidos para incubadoras cônicas de fluxo

constante com capacidade para 20L.

Para a segunda etapa experimental, exemplares de embriões foram observados em

microscópio ótico (ampliação de 40x) equipado com uma câmera fotográfica digital. A taxa

de fertilização foi calculada por meio da contagem de embriões em estágio de gástrula

dividido pelo total de ovócitos. A taxa de eclosão foi estimada quando pelo menos 50% das

larvas eclodiram, contando-se o número de larvas e dividindo pelo número total de ovos

fertilizados. Foram observados aleatoriamente 200 embriões de cada incubadora para ambos

os parâmetros avaliados.

Simultaneamente ao experimento, foram analisados temperatura, oxigênio dissolvido

(Phtek, modelo DO-100) e pH (KASVI, modelo K39-0014P) da água das incubadoras de três

em três horas, desde o início da fertilização assistida até as fases finais do desenvolvimento

72

embrionário. Também foram analisados os parâmetros de alcalinidade, de dureza, de amônia e

de nitrito conforme recomendações do Guia da Companhia de Tecnologia de Saneamento

Ambiental e analisadas pela Superintendência Estadual do Meio Ambiente do Ceará. A etapa

2 da pesquisa também foi realizada em quintuplicata, obedecendo as mesmas condições

experimentais.

Para as análises estatísticas, os dados foram incialmente submetidos aos testes de

Shapiro-Wilk e Bartlett para confirmação dos requerimentos para realização da análise de

variância (distribuição normal dos resíduos e homocedasticidade, respectivamente). A análise

de variância foi então executada, considerando um delineamento inteiramente casualizado, no

qual o efeito da quantidade de espermatozoides por ovócito foi avaliado. Nos casos em que

houve significância do efeito, foi aplicado o teste de Student-Newman-Keuls (SNK) para

comparação das médias. Aplicou-se o modelo de regressão segmentada ou descontínua

(Modelo “Broken Line” ou “Linear Response Plateau”) por meio do procedimento NLIN do

programa SAS (2002).

Resultados e discussão

Os valores médios de pH e volume seminais e de concentração e motilidade

espermáticas registrados foram 7,33±0,29, 9,19±2,84mL, 26,6±2,55x109 espermatozoides mL-

1 e 95%, respectivamente. A quantidade mínima e máxima de ova liberada foi de 111 e 638g,

respectivamente, com uma concentração média de 1408±146,5 ovócitos por grama de ova. As

fêmeas desovaram após 196,75±8,13 horas-grau do final do tratamento hormonal,

correspondendo a um tempo de latência de 7 horas. Todos estes valores foram semelhantes

aos parâmetros observados na literatura para carpa comum (IRAWAN et al., 2010).

No que diz respeito à etapa 1, foi verificado que as taxas de fertilização aumentaram

gradativamente até a proporção de 208.295 espermatozoides/ovócito (Tabela 1). Quando a

proporção foi aumentada para 238.072 e 298.563 espermatozoides/ovócito, a porcentagem de

ovócitos fertilizados permaneceu constante.

Tabela 1 - Taxa de fertilização e eclosão (%) de ovos de carpa comum (Cyprinus carpio) fertilizados com

diferentes proporções de espermatozoides (sptzs) por ovócito.

Dose inseminante Proporção sptzs/

ovócito

Taxa de

fertilização±DP (%)

Taxa de eclosão±DP

(%)

D1 15.152 13,50±2,09a 83,80±13,34

D2 60.491 22,50±4,91b 65,00±15,05

D3 179.584 40,50±2,12c 83,25±10,68

D4 238.072 45,80±7,12c 70,80±12,75

D5 298.563 46,60±3,49c 71,40±9,13

Letras minúsculas sobrescritas distintas representam diferenças significativas entre linhas.

73

Obteve-se a equação de regressão descontínua: Ŷ=11,7559+0,000162X (p<0,0001),

em que Ŷ=taxa de fertilização e X=espermatozoides por ovócito, alcançando-se um alto grau

de correlação entre as variáveis (R2=93,30). A taxa de fertilização aumentou de forma linear

até atingir a taxa máxima de 45,5%, e permaneceu constante, iniciando o platô na proporção

de 208.295 espermatozoides/ovócitos (Figura 1). Esse ponto de início do platô representa a

proporção mínima necessária para que a máxima fertilidade seja atingida.

Figura 1 - Taxas de fertilização assistida de ovócitos de carpa comum (Cyprinus carpio) fertilizados

artificialmente com diferentes relações espermatozoides/ovócito. Para x<208.295, y=1,6*10-4+11,7559. Para

x>208.295, y=45,49 (R2=93,30).

Apesar das taxas de fertilização terem apresentado diferença significativa (p<0,0001)

entre si, os resultados referentes às taxas de eclosão não diferiram significativamente

(p<0,136) para as doses inseminantes utilizadas no presente estudo (Tabela 1).

A literatura relata a utilização de diferentes doses inseminantes utilizando sêmen

fresco de ciprinídeos, obtendo resultados variados de taxa de fertilização e eclosão

(SALMITO-VANDERLEY et al., 2014). Essa variação entre os resultados se deve à

utilização de diferentes protocolos de fertilização assistida, influenciando as taxas de

fertilização e eclosão. O volume de solução acrescentada durante a mistura dos gametas é um

exemplo disso. Segundo BILLARD et al. (1995), se um baixo volume de água for usado para

um grande número de espermatozoides por ovócito, a baixa qualidade do sêmen pode ser

mascarada pela grande quantidade de espermatozoides, afetando a confiabilidade dos

resultados.

74

Outro ponto ligado a variação do protocolo de fertilização assistida é a quantidade

excessiva de espermatozoides durante o ajuste da proporção espermatozoides/ovócito. O

aumento desta proporção pode ocasionar acúmulo de espermatozoides na micrópila, gerando

poliespermia e/ou competição entre os espermatozoides (KWANTONG & BART, 2009). A

razão ótima de espermatozoides/ovócito verificadas no presente estudo foi de 208.295. No

entanto, o aumento da proporção de espermatozoides/ovócito para 298.563 manteve-se no

platô de fertilização (45,5%), não sendo observado efeito do excesso de espermatozoides de

carpa comum sobre as taxas de fertilização.

Além dos fatores nutricionais, sociais, idade, fisiologia, manejo, estresse e etc., a

qualidade da água também pode influenciar na qualidade dos gametas, interferindo nos

resultados de dose inseminante (VALDEBENITO et al., 2013). Apesar disso, a variação da

temperatura da água (26 a 29,4°C) durante o experimento não prejudicou as taxas de eclosão

encontradas no presente estudo, não atingindo temperaturas iguais ou acima de 30°C. De fato,

segundo SAPKALE et al. (2011), só há diminuição da taxa de eclosão quando há um aumento

da temperatura de 26 para 30°C. Além disso, os teores de oxigênio dissolvido na água (6,10 a

8,61mg L-1 O2), alcalinidade (160 a 166mg L-1 de CaCO3), concentração de amônia (0,19 a

0,82mg L-1) e nitrito (0,018 e 0,107mg L-1) se mantiveram dentro da faixa recomendada por

BORYSHPOLETS et al. (2009), TAVARES (1995), LUKOWICZ (1982) e ARANA (1997)

respectivamente. Apesar dos valores encontrados para a dureza (273,6 a 284mg L-1 de

CaCO3) se apresentarem acima dos parâmetros admissíveis (30 a 100mg L-1 de CaCO3), o pH

médio (7,5) não oscilou, mantendo-se dentro do aceitável (SAPKALE et al., 2011).

No que diz respeito à segunda etapa experimental, observou-se que as imagens

geradas durante o acompanhamento do desenvolvimento embrionário se enquadraram no

padrão de clivagem meroblástica discoidal, típica de ovos telolécitos (LEITE et al., 2013).

Pôde-se observar que a formação da blástula foi evidenciada com uma média de 3

horas após a fertilização (~82,61 horas-grau) (Figura 2D). Nessa fase observou-se um

abaulamento do polo animal. A fase de gástrula foi verificada entre 5 horas e 5 horas e 30

minutos após a fertilização (137,3 e 151,86 horas-grau) (Figura 2E). Essa fase foi

caracterizada pela movimentação de células do polo animal para o polo vegetal, recobrindo

gradativamente a região vitelínica. Conforme as células se movimentavam, a fase de gástrula

avançou para as fases de 50%, 80% e 90% de recobrimento do vitelo, culminando com o

fechamento do blastóporo. Esta última fase ocorreu em até 8 horas após a fertilização

(~220,28 horas-grau) (Figura 2F, G, H e I).

75

Figura 2 - Estágios do desenvolvimento embrionário de carpa comum (Cyprinus carpio). Primeiras

segmentações (A e B), formação de mórula (C), formação de blástula (D), gástrula inicial (E), 50% de

gastrulação (F), 80% de gastrulação (G), 90% de gastrulação (H), fechamento do blastóporo (I), diferenciação do

embrião, da vesícula ótica (vo) e formação dos somitos (so) (J), região caudal destacada do vitelo (K), embrião

com movimentação dentro da membrana coriônica (L), eclosão (M). Aumento de 40x.

A diferenciação do embrião para um formato larval se deu entre 14 e 16 horas após a

fertilização (384,44 e 441,76 horas-grau), tornando-se notório o aparecimento dos somitos e o

início da encefalização, com o surgimento da vesícula ótica (Figura 2J). O início do

desprendimento da cauda do vitelo ocorreu entre 22 e 25 horas após a fertilização (604,12 e

690,25 horas-grau) (Figura 2K). Nessa fase, foram observados os movimentos de contração

muscular, tornando-se mais intensos com o avanço do desenvolvimento embrionário. O

embrião apresentou movimento de natação dentro da membrana de fertilização entre 40 e 43

76

horas após a fertilização (1104,4 e 1180,78 horas-grau) (Figura 2L), até o momento em que a

larva eclodiu e tornou-se livre. Mesmo antes da eclosão, já era possível visualizar o

aparecimento de pigmentação ao longo do embrião e o início da circulação sanguínea,

evidenciada pelos batimentos do coração. A eclosão das larvas ocorreu entre 42 horas e 30

minutos e 45 horas após a fertilização (1165,14 e 1235,7 horas-grau) (Figura 2M).

Os tempos dos registros embrionários e eclosão dependem principalmente da

temperatura da água de incubação dos embriões (SAPKALE et al., 2011). Porém, observou-se

que o tempo para se atingir o estágio de fechamento do blastóporo (220,28 horas-grau após a

fertilização) e de eclosão (1165,14 e 1235,7 horas-grau após a fertilização) a uma temperatura

média de 27,5°C no presente estudo foi próximo ao relatado por NICA et al. (2012) para

ciprinídeos em regiões temperadas (231 horas-grau; 1100 horas-grau, respectivamente, a

22ºC).

Conclusões

Diante do exposto, recomenda-se o uso da dose inseminante de aproximadamente

208.295 espermatozoides/ovócito para a fertilização assistida dessa espécie no nordeste

brasileiro, garantindo boa fertilidade e economia de gametas. Além disso, o desenvolvimento

embrionário da carpa, em latitude equatorial no Nordeste do Brasil, segue o padrão para ovos

telolécitos, tendo cronologia semelhante ao relatado para a espécie em clima temperado.

Salienta-se que as informações obtidas contribuirão para a realização de programas de

fertilização assistida da espécie no Nordeste do Brasil.

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79

10 CONCLUSÕES

Recomenda-se o uso da dose inseminante de aproximadamente 208.295

espermatozoides/ovócito para a fertilização assistida dessa espécie no nordeste brasileiro,

garantindo boa fertilidade e economia de gametas. Além disso, o desenvolvimento

embrionário da carpa, em latitude equatorial no Nordeste do Brasil, segue o padrão para ovos

telolécitos, tendo cronologia semelhante ao relatado para a espécie em clima temperado.

80

11 PERSPECTIVAS

Na presente pesquisa, observou-se que o efeito da suplementação das vitaminas C ou

E ao meio ACP-104 sobre a qualidade do sêmen pós-descongelado de carpa comum não foi

comparável ao sêmen fresco. Deste modo, é necessário investigar concentrações mais

elevadas desses antioxidantes e suas interações entre si e com outros antioxidantes na

suplementação do meio ACP-104 capazes de favorecer um aumento significativo na

qualidade do sêmen pós-descongelado que seja comparável ao sêmen fresco.

Durante os experimentos para determinação da dose inseminante de carpa comum no

Centro de Pesquisas em Aquicultura (CPAq, DNOCS – Pentecoste - CE) foi constatada

problemas sérios na qualidade da água onde se encontravam os embriões em

desenvolvimento. Esse fator influenciou de algum modo alguns resultados referentes a

determinação da dose inseminante na presente pesquisa, como baixas taxas de velocidades

dos espermatozoides e o alto percentual de anormalidades espermáticas. Diante do exposto,

torna-se necessário a realização de futuras pesquisas com condições mais adequadas, visto

que a eutrofização do açude Pereira de Miranda pode prejudicar a reprodução de carpa

comum nas estações de piscicultura abastecidas pelo açude. Apesar disso, a pesquisa poderá

auxiliar na produção e introdução de novas linhagens de carpa comum via fertilização

assistida, contribuindo efetivamente para a consolidação da piscicultura comercial no

Nordeste do Brasil.

81

12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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