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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
SIMONE VIEIRA CASTRO
CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO: EFICIÊNCIA DE DIFERENTES AGENTES CRIOPROTETORES
FORTALEZA 2011
SIMONE VIERA CASTRO
CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO: EFICIÊNCIA DE DIFERENTES AGENTES CRIOPROTETORES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Co-orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo
FORTALEZA 2011
Xxxxx Castro, Simone Vieira
Criopreservação De Tecido Ovariano Caprino: Eficiência De Diferentes Agentes Crioprotetores /Simone Vieira Castro – Fortaleza, 2011.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Dissertação de Mestrado (Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
1. Folículo pré-antral. 2. Solução de congelação. 3. Agente
crioprotetor.
SIMONE VIEIRA CASTRO
CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO: EFICIÊNCIA DE DIFERENTES AGENTES CRIOPROTETORES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.
Aprovada em:____/____/____
BANCA EXAMINADORA
___________________________________ Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues
Universidade Estadual do Ceará (Orientadora)
__________________________ Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo
Universidade Estadual do Ceará (Co-orientador Examinador)
__________________________ Profa. Dra. Carolina Madeira Lucci
Universidade de Brasília (Examinadora)
Aos meus pais, Diomar Felicíssimo de Castro
e Maria Divina Vieira da Mota Castro.
Dedico
17
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Ceará, em especial ao Programa de Pós-gaduação
em Ciências Veterinárias (PPGCV), que me proporcionou a realização de um curso de
pós-graduação de reconhecida qualidade.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pelo suporte financeiro por meio da concessão da bolsa.
À banca examinadora, por ter aceitado prontamente o convite, sobretudo pela
colaboração na correção deste trabalho.
À Dr. Ana Paula Ribeiro Rodrigues e Dr. José Ricardo de Figueiredo, pela
orientação na realização deste trabalho, pela oportunidade e pela confiança em mim
depositada. Obrigada por todos os ensinamentos.
Ao professor Dr. Cláudio Cabral Campello, tanto pelo precioso auxilio na
análise estatística, quanto pela dedicação e atenção sempre que solicitado.
Ao professor Dr. Kalil Skeff e seu filho Murad Skeff, por me acolherem
carinhosamente e pelo privilégio de fazer parte da família Skeff durante minha estadia
em Brasília.
Aos companheiros do instituto de ciências biológicas da UnB, Dra. Carolina
Madeira Lucci, Dra. Sônia Nair Báo, Natalia Lemos Chaves, Felipe Coutinho, Misléia
Rodrigues e Ingrid Gracielli, que demonstraram como é importante a parceria entre
instituições no mundo acadêmico.
Aos professores Dra. Tânia Vasconcelos, Dra. Helciléia Dias Santos e Dr.
Marcello Otake Sato, que acreditaram em mim e guiaram meus primeiros passos na vida
acadêmica.
A todos os membros da equipe LAMOFOPA que me deram apoio e
contribuíram de forma direta ou indireta para a execução deste trabalho. Em especial a
18
Luciana Rocha Faustino, pelo apoio e grande amizade desde minha chegada à Fortaleza.
À Adeline de Andrade Carvalho, inseparável companheira de bancada nesta árdua
caminhada, muito obrigada.
À minha “família cearense” Cleidson Manoel Gomes da Silva, Liliane Moreira
Silva e Oscar Oliveira Brasil, pelo apoio indispensável, por todas as horas
compartilhadas em nosso “lar” e pela grande amizade.
Agradeço imensamente a toda minha família que sempre me deu força e
carinho para suportar a saudade e superar a enorme distância que nos separa. Aos meus
amados pais Diomar e Divina, meus primeiros e eternos mestres, pelo amor infinito,
apoio incondicional, por me ensinarem as lições mais valiosas e importantes da vida que
me permitiram chegar até aqui. Agradecimento mais que especial aos meus queridos
irmãos Diogo e Eudes Vieira Castro, que sempre me protegeram e dos quais sinto
imenso orgulho e admiração.
Enfim, agradeço a todas as pessoas que contribuíram de alguma forma para
esta conquista. Muito obrigada!
19
“Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo
para a vitória é o desejo de vencer.”
Mahatma Gandhi
20
RESUMO A criopreservação de tecido ovariano tem sido alvo de intensos estudos com finalidade
de auxiliar na tecnologia de reprodução assistida em animais e humanos. Para o sucesso
da criopreservação, a composição da solução de congelação, especialmente o agente
crioprotetor intracelular utilizado, é de fundamental importância. Desta forma, o
presente trabalho teve por objetivo definir uma solução de congelação lenta para o
tecido ovariano caprino. Para isso, foram realizados dois experimentos. No experimento
I, fragmentos de córtex ovariano de cabras foram submetidos à congelação lenta na
presença de 12 diferentes soluções contendo 1,0 M de etilenoglicol (EG), propanodiol
(PROH) ou dimetilsulfóxido (DMSO) como agentes crioprotetores intracelulares,
associados ou não à sacarose e/ou soro fetal bovino (SFB). No experimento II,
fragmentos previamente congelados em soluções contendo DMSO suplementado ou não
com sacarose e/ou SFB foram submetidos ao cultivo in vitro por 48 horas. Para
avaliação folicular pós-descongelação foi utilizada a histologia clássica e teste de
viabilidade por marcadores fluorescentes (etidio homodimero-1 e calceína-AM), nos
experimentos I e II, além da análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de
transmissão no experimento II. No tocante à análise estatística do efeito dos diferentes
agentes crioproterores e a interação com os suplementos foi utilizada ANOVA seguida
de teste SNK, enquanto os dados referentes à viabilidade foram comparados pelo teste
Qui-quadrado. Os valores foram considerados significativos quando p<0,05. O
experimento I demonstrou que apenas as soluções contendo DMSO foram capazes de
manter a morfologia folicular semelhante à observada no tecido fresco. Não foram
observadas diferenças entre o percentual de folículos morfologicamente normais no
tecido somente criopreservado e criopreservado seguido do cultivo in vitro. A análise da
viabilidade realizada após o cultivo in vitro de tecido ovariano revelou que apenas a
solução de congelação composta por DMSO adicionado de SFB (75,6%) foi capaz de
manter o percentual de folículos viáveis semelhante ao verificado no tecido cultivado
sem prévia congelação (89,3%). Folículos pré-antrais caprinos considerados
morfologicamente normais após a análise ultraestrutural foram encontrados somente em
tecido ovariano fresco, cultivado sem prévia congelação e congelados com
DMSO+SFB. Em conclusão, a solução de congelação composta por DMSO associado
ao SFB garantiu a manutenção da viabilidade, bem como da ultraestrutura folicular após
48 horas de cultivo in vitro.
Palavras-chave: Folículo pré-antral. Solução de congelação. Agente criprotetor.
21
ABSTRACT
The cryopreservation of ovarian tissue has been the target of intense study with the
purpose of assisting in the technology of assisted reproduction in animals and humans.
For the success of cryopreservation, the composition of the freezing solution, especially
the intracellular cryoprotectant agent used is of fundamental importance. Thus, this
study aimed to define a solution for slow freezing of ovarian tissue goat. For this, two
experiments were conducted. In experiment I, fragments of goat ovarian cortex were
subjected to slow freezing in the presence of 12 different solutions containing 1.0 M
ethylene glycol (EG), propanediol (PROH) or dimethyl sulfoxide (DMSO) as
intracellular cryoprotectants, associated or not sucrose and / or fetal calf serum (FCS).
In experiment II fragments previously frozen in solutions containing DMSO
supplemented or not with sucrose and / or FCS were cultured in vitro for 48 hours. To
assess follicle after thawing was used histology and viability test by fluorescent markers
(ethidium homodimer-1 and calcein-AM) in experiments I and II, in addition, to
ultrastructural analysis by transmission electron microscopy in experiment II regarding
the statistical analysis, the effect of different cryoprotectant agents and interaction with
supplements was used ANOVA followed by SNK test, while data concerning the
viability were compared by chi-square. Values were considered significant when p
<0.05. The first experiment showed that only solutions containing DMSO were able to
maintain follicular morphology similar to that observed in fresh tissue. No significant
differences were observed among the percentage of morphologically normal follicles in
ovarian tissue cryopreserved before and after in vitro culture. After in vitro culture of
ovarian tissue, the viability analysis showed that only the freezing solution composed by
DMSO and FCS (75.6%) maintained the percentage of viables follicles similar to that
observed after culture without cryopreservation (89.3%). Preantral follicles considered
morphologically normal after ultrastructural analysis were found out in the fresh
control, fragments cultured before and after cryopreservation with DMSO and FCS. In
conclusion, the freezing solution containing DMSO and FCS guarantee the maintenance
of viability as well as the follicular ultrastructure after short-term in vitro culture.
Key-words: Preantral follicle. Freezing solution. Cryoprotectant agente.
22
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1. Metabolização do etilenoglicol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: aldeído
desidrogenase; AO: aldeído oxidase; LDH: lactato desidrogenase; AGAT: alanina
glioxilato aminotransferase; GO: glicolato oxidase; GD: glicolato desidrogenase) –
Adaptado de Corley et al. [25]........................................................................................ 70
Figura 2. Metabolização do propanodiol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: aldeído
desidrogenase; GLUr: glutationa reduzida; LDH: lactato desidrogenase)..................... 71
Figura3. Principais setores industriais de utilização da glicerina. Fonte: Mota et al.
[75].................................................................................................................................. 72
Figura 4. Metabolização do glicerol e possíveis destinos metabólicos.......................... 73
Figura 5 Análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão de folículo
criopreservado com 1,5 M (A) e 3M (B) de glicerol (Imagem cedida por Rodrigues et
al.,[91])........................................................................................................................... 74
CAPÍTULO 2
Figure 1 Isolated viable preantral follicle labeled by calcein-AM (green flourescence)
(A) and non-viable preantral follicle labeled by ethidium homodimer-1 (red
fluorescence) (B)…………………………………………………………………..… 101
Figure 2 Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles before
(fresh control) and after slow-freezing. *Differs significantly from the fresh control (P <
0.05)………………………………………………………………………………….. 101
Figure 3 Goat preantral follicles from the fresh control (A, B) and cultured control (C,
D). In A, a well-preserved preantral follicle can be observed with intact granulosa cells
and cytoplasmic content without any sign of organelles loss. (B) In a high
magnification, note that ooplasm is finely granular and the mitochondria are well-
23
preserved without any sign of vacuolization. In C, several vacuoles were observed in
ooplasm of cultured follicles, however note the intact nuclear membrane in D. GC:
granulosa cells; O: oocyte; nu: nucleus; m: mitochondria; er: endoplasmic reticulum; *
vacuole. Scale bar: 2 µm (A, C) 1µm (B, D)………………………………………… 102
Figure 4 Goat preantral follicles after cryopreservation with freezing solution containing
DMSO alone (A, B) and DMSO added by sucrose (C, D), fetal calf serum alone (E, F)
or fetal calf serum in combination with sucrose (G, H), followed by in vitro culture for
48 h. In A, normal granulosa cells are showed; however a vacuolated ooplasm can be
observed. In B and C, note alterations as detachment between granulosa cells and
oocyte, in D irregular mitochondria and swollen endoplasmic reticulum are showed in
the oocyte, besides the nuclear membrane thickening. (E) Note normal ooplasm finely
granulated and abundant organelles. (F) Intact nuclear membrane and normal
mitochondria and endoplasmic reticulum. (G) Normal granulosa cell and oocyte with an
irregular nucleus. (H) Oocyte with swollen mitochondria and vacuolated ooplasm. GC:
granulosa cells; O: oocyte; nu: nucleus; m: mitochondria; er: endoplasmic reticulum; *
vacuole. Scale bar: 2 µm (A, C, E, G) 1µm (B, D, F, H)............................................. 103
24
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1: Principais resultados com a utilização de diferentes agentes crioprotetores na
criopreservação de tecido ovariano e oócitos................................................................. 75
CAPÍTULO 2
Table 1 Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles in goat
ovarian tissue from the fresh control and after cryopreservation, followed or not by
short-term in vitro culture (48 h). *Differs significantly from the fresh control (P <
0.05)………………………………………………………………………………..… 105
Table 2 Percentage (mean ± SD) of viable preantral follicles after in vitro culture for 48
h before (cultured control) and after cryopreservation in DMSO added or not by sucrose
and/or fetal calf serum. a,b,c Differs significantly (P < .05)………………………...... 105
25
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C – Graus Celsius
a.c. – Antes de cristo
Ac. – Acido
ACP – Agente(s) crioprotetor(es)
ADH – Álcool desidrogenase
AGAT – Alanina glioxilato aminotrasferase
ALDH – Aldeído desidrogenase
AM – Grupamento acetoximetil
AMPc – Adenosina monofosfato cíclico
AO – Aldeído oxidase
ATP – Adenosina trifosfato
BSA – Albumina sérica bovina
Ca2+ - Cálcio
cm - Centímetros
CO2 – Gás carbônico
CPA – Cryoprotectant agent
DMS - Dimetilsulfuro
DMSO - Dimetilsulfóxido
DMSO2 - Dimetilsulfona
DNA – Ácido desoxirribonucléico
EG - Etilenoglicol
FSC – Fetal calf serum
g - Grama
GD- Glicolato desidrogenase
GLI - Glicerol
GLM – General linear models
GLUr – Glutationa reduzida
GO – Glicolato oxidase
h – Hora(s)
HE – Hematoxylin - eosin
HEPES – Ácido (N-[2-Hidroximetil] Piperazina-N`-[2-Etanosulfônico]4-(2-
hydroxythyl)
26
HMEM- Meio essencial mínimo tamponado com HEPES
ITS- Insulina transferrina selênio
K+ - Potássio
kg- Quilograma
kV – Quilo volts
LDH – Lactato desidrogenase
M - Molar
MAPK – Proteína quinase ativadora de mitose
MEM - Meio essencial mínimo
MET – Microscopia eletrônica de transmissão
mg – Miligrama
min – Minuto(s)
ml - Mililitro
mM - Milimolar
mm3- Milímetro cúbico
MOIFOPA – Manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais
MPF – Fator promotor de mitose
MSM - Metilsulfonilmetano
Na+ - Sódio
pH – Potencial hidrogeniônico
PROH - Propanodiol
SAC - Sacarose
SAS – Statistical analysis system
SD – Standard deviation
SFB – Soro fetal bovino
SH – Soro humano
SSS – Substituto sintético do soro
TEM – Trasmission electron microscopy
v:v – Volume/volume
µl – Microlitro
µm – Micrômetro
µmol - Micromolar
27
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................................... 16
2. REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................... 17
2.1 Ovário dos mamíferos: organização morfológica e
folicular.............................................................................................. 17
2.2 Criopreservação de gametas femininos presentes no tecido
ovariano............................................................................................. 19
2.3 Agentes crioprotetores...................................................................... 20
2.3.1 Agentes crioprotetores intracelulares...................................... 20
2.3.2 Agentes crioprotetores extracelulares ..................................... 21
2.4 Avaliação de folículos pré-antrais após criopreservação.................. 22
2.5 CAPITULO 1. (Agentes crioprotetores intracelulares: características
e utilização na criopreservação de tecido ovariano e oócitos) ................ 25
3. JUSTIFICATIVA............................................................................................... 75
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA................................................................................. 77
5. OBJETIVOS ....................................................................................................... 78
5.1 Geral....................................................................................................... 78
5.2 Específicos.............................................................................................. 78
6. CAPÍTULO 2. (Freezing solution containing dimethylsulfoxide and fetal calf
serum maintains survival and ultrastructure of goat preantral follicles after
cryopreservation and in vitro culture of ovarian tissue)………………………... 79
7. CONCLUSÕES……………………………………………………………… 104
8. PERSPECTIVAS……………………………………………………………… 105
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………… 106
APÊNDICE A…………………………………………………………………… 128
1 INTRODUÇÃO
A biotécnica de manipulação de oócitos inclusos em folículos ovariano pré-antrais
(MOIFOPA) compreende três diferentes processos: o isolamento, a preservação e o
cultivo in vitro de folículos pré-antrais (FIGUEIREDO et al., 2008). O isolamento
folicular já está bem estabelecido, enquanto que a preservação e o cultivo ainda
necessitam de ajustes para a determinação de um protocolo ideal a fim de que se possa
obter oócitos viáveis e competentes, aptos a serem fertilizados e produzirem embriões in
vitro. Especificamente, com relação à preservação, que é o tema principal desta
dissertação, essa técnica pode ser realizada por um período curto (resfriamento) ou
prolongado (criopreservação). A criopreservação é uma ferramenta de grande interesse
para a reprodução assistida, uma vez que a preservação de gametas femininos pode
assegurar a conservação de espécies animais, além de ser uma estratégia para
possibilitar a restauração da fertilidade, por meio de transplante, tanto na espécie
humana (BEDAIWY & FALCONE, 2004) como em linhagens especiais de animais de
laboratório (camundongo:LIU et al, 2008) ou de produção (ovino: BORDES et al
2005).
De um único ovário podem ser recuperados milhares de folículos pré-antrais, e
consequentemente os oócitos neles contidos. Esta prática seria uma fonte
potencialmente rica de material genético para a reprodução animal se os oócitos
pudessem ser preservados e, posteriormente, crescidos e maturados após cultivo
folicular in vitro visando a produção in vitro de embriões. Contudo, não é possível, em
um único momento, a manipulação da totalidade de folículos pré-antrais que se pode
recuperar de um único ovário (35.000/ovário caprino – LUCCI et al., 1999) sem
comprometer a viabilidade folicular. Portanto, o desenvolvimento de protocolos para a
preservação desses folículos é de fundamental importância com o intuito de permitir a
implantação de bancos de reservas genéticas, até que sejam desenvolvidos protocolos
ideais capaz de promover o completo desenvolvimento de folículos pré-antrais in vitro.
Neste contexto, vários protocolos de criopreservação de tecido ovariano, utilizando
a congelação lenta, têm sido empregados no intuito de assegurar a viabilidade de
folículos pré-antrais após criopreservação do tecido ovariano de animais domésticos
(ovino: PINTO et al., 2008; caprino: LUZ et al., 2009; bovino: CELESTINO et al.,
2008). Entretanto, um protocolo eficiente para tecido ovariano caprino ainda não foi
17
desenvolvido e muitas questões referentes à criopreservação de folículos pré-antrais
ainda precisam ser elucidadas, como por exemplo, o efeito da associação de
crioprotetores intracelulares aos extracelulares e a adição de macromoléculas à solução
de criopreservação.
O presente trabalho inicialmente apresenta uma descrição geral sobre o ovário
mamífero e a estrutura folicular; criopreservação de tecido ovariano; agentes
crioprotetores, bem como a avaliação de folículos ovarianos pré-antrais criopreservados.
Esse estudo também traz uma vasta revisão a cerca dos “Agentes crioprotetores
intracelulares: características e utilização na criopreservação de tecido ovariano e
oócitos”. Além disso, a contribuição científica para o campo da criopreservação de
material genético de fêmeas, utilizando o ovário caprino como modelo experimental.
2 - REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Ovário dos mamíferos: Organização morfológica e folicular
O ovário mamífero não é apenas a gônada feminina que contém o suprimento
de células germinativas para produzir as próximas gerações (função exócrina ou
gametogênica-produção e liberação dos gametas), mas é também a glândula reprodutiva
feminina que controla alguns aspectos do desenvolvimento e fisiologia da fêmea, como
a produção de esteróides sexuais - esteroidogênese (EDSON et al., 2009). A
organização básica dessa gônada é estabelecida nas fases iniciais da organogênese,
durante a vida fetal, com exceção dos roedores, em que, especificamente a formação de
folículos ovarianos é verificada até um curto período de tempo após o nascimento
(FORTUNE, 1994).
Na maioria das espécies, histologicamente são observadas duas regiões, uma
interna (medular) e uma região externa, denominada cortical. A região medular é
constituída por tecido fribroelástico distribuído de forma irregular, algumas células
musculares lisas, feixes nervosos, vasos linfáticos e sanguíneos que adentram o córtex
ovariano e são responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário (HAFEZ & HAFEZ,
2004). A região cortical contém inúmeros folículos ovarianos em diferentes estádios de
desenvolvimento, corpos hemorrágicos, lúteos, albicans e uma população de células
mesenquimais pouco diferenciadas, muito semelhantes às células mesenquimatosas
embrionárias, que podem sofrer grandes e complexas modificações durante a vida
18
reprodutiva. Estas últimas se diferenciam em células da teca interna e externa e são de
fundamental importância na esteroidogênese.
O folículo ovariano corresponde à unidade morfológica e funcional do ovário e
é constituído essencialmente por um oócito circundado por células foliculares
(granulosa) e demarcado por uma membrana basal (FORTUNE, 1994), que os separa do
estroma ovariano, e tem como principal função proporcionar um ambiente ideal para o
crescimento e maturação do oócito (GORDON, 1994). De acordo com características
morfológicas, os folículos ovarianos podem ser divididos em folículos pré-antrais ou
folículos antrais (GONÇALVES et al., 2002). Os folículos pré-antrais são
caracterizados pela ausência de cavidade antral e podem ser classificados em
primordiais, transição, primários e secundários de acordo com o estádio de
desenvolvimento. Os folículos primordiais, que se encontram em um estágio de
quiescência (CORTVRINDT & SMITZ, 2001), são considerados reservatórios de
gametas femininos (QU et al. 2000) e são caracterizados pela presença de uma camada
de células da granulosa em formato pavimentoso. Já os primários e secundários são
considerados folículos em estágios iniciais de crescimento e, são caracterizados pela
presença do oócitos circundado por uma ou mais camadas de células de granulosa de
formato cúbico, respectivamente (FIGUEIREDO et al.., 2008).
Por outro lado, os folículos que apresentam uma cavidade repleta de líquido
folicular, denominada antro, pertencem à categoria de folículos antrais, sendo
subdivididos em folículos terciários e pré-ovulatórios. Em ambas as classes, os folículos
possuem um oócito circundado pela zona pelúcida, células foliculares, uma cavidade
contendo líquido folicular, membrana basal e as camadas de células da teca interna e
externa. Especificamente, os folículos pré-ovulatórios apresentam uma ampla cavidade
antral e um oócito apto a retomar a meiose e completar a maturação, ou seja, passar do
estádio de prófase I para metáfase II (BARNETT et al., 2006).
Estudos têm demonstrado que cerca de 90% dos folículos ovarianos
encontram-se na fase de folículos pré-antrais, sendo a grande maioria (95%)
representada por folículos primordiais (SAUMANDE, 1991). Os folículos antrais, por
sua vez, representam apenas aproximadamente 10% de toda a população folicular do
ovário e são extremamente susceptíveis à morte folicular (FIGUEIREDO et al., 1995).
De maneira geral, em primatas e ruminantes a quantidade de folículos presentes em
19
cada ovário é estabelecida ainda durante a vida fetal sendo possível encontrar, já ao
nascimento, a presença de folículos em estádios iniciais de desenvolvimento (primário e
secundário) e pequenos folículos antrais, porém, devido à afuncionalidade do eixo
hipotálamo-hipose-gonadal não progridem para estádios mais avançados antes da
puberdade (BETTERIDGE et al., 1989). No entanto, Bukovsky et al. (2004)
demonstraram possíveis mecanismos que indicam a formação de folículos ovarianos em
mulheres adultas.
O número total de folículos por ovário varia entre espécies, sendo de
aproximadamente 1.500 na camundonga (SHAW et al., 2000); 33.000 na ovelha
(AMORIM et al., 2000); aproximadamente 2.000.000 na mulher (ERICKSON et al.,
1986) e 35.000 folículos pré-antrais na cabra (LUCCI et al., 1999). Porém a população
de folículos pode variar também em função de fatores como raça, genética (SMITH et
al., 1993), idade (ROY & TREACY,1993) e estado reprodutivo do animal (ERICKSON
et al., 1986). Desta forma, considerando a abundância de folículos pré-antrais presentes
no tecido ovariano, aliada às características intrínsecas que favorecem à criotolerância,
como baixa taxa metabólica, tamanho reduzido e ausência de zona pelúcida, a
criopreservação de oócitos nesta fase representa uma alternativa promissora para a
preservação de gametas femininos (AMORIM et. al., 2003).
2.2 Criopreservação de gametas femininos presentes no tecido ovariano
A conservação do tecido ovariano, e consequentemente dos folículos pré-
antrais nele presente, tem atraído o interesse de clínicos e pesquisadores, visto que a
eficiente criopreservação do tecido ovariano possibilitaria um grande avanço para a
reprodução assistida animal e humana. O tecido ovariano previamente criopreservado
pode ser utilizado em auto e xenotransplante, possibilitando a retomada das funções
endócrina e gametogênica (LIU et. al., 2008). Além disso, pode ainda ser destinado ao
cultivo in vitro dos folículos pré-antrais isolados (GOSDEN et. al., 2002), sendo uma
alternativa de grande interesse para mulheres acometidas de câncer, evitando, portanto,
a reintrodução de células malígnas, o que é possível ocorrer após transplante (AMORIM
et al., 2009).
A criopreservação consiste na conservação de material biológico a
temperaturas ultra-baixas, com o objetivo de garantir a permanência das células em uma
20
baixa taxa metabólica durante um período de estocagem indeterminado, do qual possam
ser resgatadas e continuar o seu desenvolvimento (PEGG, 2007) e função normais após
o processo de descongelação. Para tanto, o material é armazenado geralmente em
nitrogênio líquido a –196°C. Porém, para garantir as propriedades estruturais e
funcionais normais de um material biológico que foi submetido a um protocolo de
criopreservação, é necessário considerar cuidadosamente alguns fatores como a
composição da solução de criopreservação, especialmente no que compete à escolha do
tipo e concentração do agente crioprotetor intracelular utilizado, bem como, a
associação com crioprotetores extracelulares.
Outro fator que deve ser levado em consideração no estabelecimento do
protocolo de congelação é o tipo e organização estrutural do material a ser
criopreservado. Assim, o desenvolvimento de protocolos para congelação de tipos
celulares isolados em suspensão, como espermatozóides, oócitos ou embriões, torna-se
relativamente menos complexo, quando comparado com a congelação de tecidos ou
folículos, visto que estes são formados por diferentes tipos celulares (NEWTON et al.,
1998). No entanto, a congelação de folículos isolados apresenta entraves tanto em
decorrência dos possíveis danos causados pelo próprio método de isolamento, como
pela perda de viabilidade, pelo elevado tempo de manipulação. Embora alguns estudos
visem desenvolver protocolos de criopreservação de folículos pré-antrais isolados (DE
LA PEÑA et al., 2002; AMORIM et. al., 2003), a maneira mais prática e rotineiramente
adotada, que possibilita a conservação de uma grande quantidade de folículos pré-
antrais, é a criopreservação do tecido ovariano.
2.3 Agentes crioprotetores
Os agentes crioprotetores (ACP) são solventes orgânicos, utilizados sozinhos
ou em associação, que agem protegendo a célula durante o período de estocagem em
baixas temperaturas, prevenindo-a dos danos causados pela formação de gelo
intra/extracelular ou choque osmótico (HAN et al., 2009). Esses agentes podem ser
classificados em intracelulares (penetrantes) ou extracelulares (não penetrantes).
2.3.1 Agentes crioprotetores intracelulares
Os ACP intracelulares possuem baixo peso molecular e têm a capacidade de
21
substituir a água presente no espaço intracelular. De modo geral, os ACP que têm
demonstrado melhor eficiência na manutenção da viabilidade e características
estruturais e ultraestruturais de folículos pré-antrais após criopreservação são o
etilenoglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) e propanodiol (PROH). Apesar dos
benefícios obtidos com a utilização dos ACP, a eficiência dessas substâncias pode variar
com as características inerentes ao próprio ACP (tipo, concentração e tempo de
exposição) ou inerentes ao material biológico (tipo celular ou tecidual, estádio de
desenvolvimento da estrutura e espécie animal). Além disso, a toxicidade do ACP não
pode ser negligenciada e é um dos fatores limitantes para o sucesso de um protocolo de
conservação. A estrutura, metabolização e mecanismos tóxicos, bem como a utilização
dos principais agentes crioprotetores utilizados estão descritos no capitulo I desta
dissertação.
2.3.2 Agentes crioprotetores extracelulares
Visando otimizar a eficácia das soluções de congelação, frequentemente são
utilizadas substâncias que, apesar de não penetrarem na célula, auxiliam no processo de
criopreservação. Muitas macromoléculas possuem ação crioprotetora comprovada,
conferindo maior estabilidade à célula quando esta é exposta a baixas temperaturas
(EROGLU et al., 2009). Estas substâncias possuem a capacidade de preservar a
integridade estrutural e funcional da membrana celular (HUANG et al., 2008) devido à
interação com proteínas e glicoproteínas de membrana (DUNAN e FORD-LLOYD,
2004).
Dentre os crioprotetores extracelulares, a sacarose, carboidrato composto por
uma frutose e uma glicose, é utilizada com bastante freqüência nas soluções de
criopreservação, pois além de sua capacidade crioprotetora, essa substância age como
um tampão osmótico contra o estresse celular causado durante a adição e remoção do
crioprotetor intracelular (MANDELBAUM et al., 1988). A sacarose já foi utilizada com
sucesso na crioproteção de oócitos caprinos (SHARMA et al., 2006) e humanos
(COTICCHIO et. al., 2006); tecido ovariano de diferentes espécies (caprino: SANTOS
et al., 2006a; ovino:CECCONI et al., 2004; ONIONS et al 2008; bovinos: LUCCI et al.,
2004; humanos: KEROS et al., 2009). A adição de sacarose à solução de congelação
aplicada a oócitos humanos tem demonstrado ser eficiente, resultando em altas taxas de
22
sobrevivência, melhor preservação da configuração do fuso e dos cromossomos, bem
como obtenção de embriões de qualidade superior (BARRITT et al., 2007;
PARMEGIANI, et al., 2008). Do mesmo modo, Santos et al. (2006b) observaram que a
adição de sacarose ao meio de congelação contendo EG é benéfica para manutenção da
viabilidade de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano caprino.
Outro componente amplamente utilizado nas soluções de congelação é o soro
fetal bovino (SFB). Sua composição não é bem definida e varia em função do sexo,
idade e raça do feto, mas é conhecido por possuir diversas substâncias como proteínas,
carboidratos, aminoácidos, vitaminas, fatores de crescimento e hormônios (PICTON et
al., 2008), que podem atuar positivamente na crioproteção celular durante o
resfriamento a baixas temperaturas. Comumente empregado na proporção de 10 a 20%,
o SFB tem sido utilizado em soluções de congelação de tecido ovariano (caprino: LUZ
et al., 2009; camundongas: CHOI et. al., 2008), oócito (bovino: KIM et. al., 2001),
tecido testicular (camundongo: MILAZZO et. al., 2008; macaco: JAHNUKAINEN et.
al., 2007), células precursoras neurais (camundongo: MILOSEVIC et. al., 2005), córnea
(suíno: HALBERSTADT et. al.; 2001; bovino: FAN et. al., 2009) e espermatogônias
(bovino: IZADYAR, et. al., 2002).
2.4 Avaliação de folículos pré-antrais após criopreservação
A eficiência do protocolo empregado na criopreservação de tecido ovariano
pode ser verificada pela: 1) manutenção da estrutura morfológica e ultra-estruturtal dos
folículos (KEROS et al., 2009) e do próprio estroma (MARSELLA et al., 2008); 2) pela
viabilidade folicular (SOLEIMANI et al., 2006); 3) pela capacidade de desenvolvimento
e produção de hormônios durante o cultivo in vitro (WALLIN et al., 2009) ou 4) in vivo
(WANG et al., 2002). Estes parâmetros podem ser avaliados, respectivamente, por
estudos morfológicos, comumente empregando histologia clássica e microscopia
eletrônica de transmissão, testes de viabilidade, por meio de corantes vitais e/ou
marcadores fluorescentes, bem como através da observação do desenvolvimento
folicular após cultivo in vitro ou in vivo (transplante).
A histologia clássica permite a observação de alterações estruturais
relacionadas à disfunção e morte celular, como picnose, retração citoplasmática do
oócito, destacamento da membrana basal, desorganização das células da granulosa. Já a
23
microscopia eletrônica de transmissão, permite uma avaliação mais detalhada da
estrutura folicular, com visualização das organelas citoplasmáticas, vacuolização,
alterações de membrana e integridade de junções celulares.
Contudo, os estudos morfológicos realizados imediatamente após a
descongelação podem não ser indicadores suficientes da eficácia do procedimento de
criopreservação, uma vez que a morfologia nem sempre está relacionada com a
competência de desenvolvimento folicular (SANTOS et al., 2007). Dentre os métodos
de análise de viabilidade, o uso de marcadores fluorescentes que indiquem a presença de
atividade enzimática no interior da célula associado a outros marcadores que revelem
danos na membrana mostra-se confiável, merecendo destaque os marcadores calceína-
AM e Etídio Homodimero-1, respectivamente. A Calceína é um marcador cuja ligação
com um grupamento acetoximetil (AM) impede a emissão de fluorescência pelo
bloqueio dos sítios de ligação com o Cálcio. Ao penetrar nas células, as enzimas
esterases, ativas apenas em células vivas, clivam esta ligação com grupamento AM.
Uma vez livre, a calceína conjuga-se com o cálcio intracelular e passa a emitir uma
fluorescência verde quando excitada pela radiação ultravioleta (NERI et al., 2001). Por
outro lado, o Etídio Homodímero 1 é um composto de alto peso molecular capaz de
penetrar apenas em células que apresentem algum dano de membrana. Dentro da célula
este composto conjuga-se com ácidos nucléicos, especialmente com DNA, e passa a
emitir fluorescência vermelha quando excitado por radiação (GATTI et al., 1998).
Logo após a criopreservação podem ocorrer alterações moleculares que se
manifestam com a retomada do metabolismo e desenvolvimento folicular (Siebzehnrübl
et al. 2000). Para evidenciar estas possíveis alterações, diversos estudos tem destacado o
cultivo in vitro como uma ferramenta valiosa para verificar a capacidade de
desenvolvimento de folículos pré-antrais previamente criopreservados (Cecconi et al
2004; Tsuribe et al, 2009; Borges et al 2009; Faustino et al, 2010). Após congelação do
tecido ovariano de camundongas seguida de cultivo foi relatado o crescimento in vitro
de folículos isolados, porém com uma taxa de desenvolvimento e sobrevivência
folicular inferior àquela obtida com o tecido fresco (NEWTON & ILLINGWORTH,
2001). Um estudo realizado com folículos pré-antrais de camundongas, isolados a partir
de tecido ovariano fresco e criopreservado, demonstrou que folículos previamente
congelados desenvolvem-se mais lentamente quando comparado aos folículos não
submetidos a este procedimento (Segino et al., 2005). Choi et al (2008) demonstraram
24
que a criopreservação suprime temporariamente a proliferação das células da granulosa
de folículos pré-antrais de camundongas, o que pode estar relacionado ao atraso no
desenvolvimento folicular. No entanto, recentemente foi mostrado que folículos
isolados derivados de tecido vitrificado apresentaram crescimento folicular e maturação
oocitária similar aos folículos não vitrificados (HAIDARI et al, 2008).
25
CAPÍTULO 1
Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na criopreservação de tecido ovariano e oócitos
Intracellular Cryoprotectant Agents: Characteristics and Use of Ovarian Tissue and
Oocyte Cryopreservation
Periódico: Acta Scientiae Veterinarie (Publicado –2011, 39(2): 95)
26
Agentes crioprotetores intracelulares: características e utilização na
criopreservação de tecido ovariano e oócitos
Intracellular cryoprotective agents: characteristics and use in cryopreservation of
ovarian tissue and oocytes
Simone Vieira Castro1, Adeline de Andrade Carvalho, Cleidson Manoel Gomes da
Silva, Luciana Rocha Faustino, José Ricardo de Figueiredo, Ana Paula Ribeiro
Rodrigues
Laboratório de manipulação de oócitos e folículos ovarianos pré-antrais –
LAMOFOPA, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza,
CE, Brasil.
Abstract
Background: The application of cryopreservation in human and animal reproductive
medicine has stimulated several studies about the effects of low temperatures and
freezing processes on cells and tissues, in order to develop efficient protocols for
gamete and embryo preservation. Moreover, cryopreservation is a fundamental tool for
the establishment of animal germplasm banks, allowing the preservation of genetic
material from several species and breeds or for further study and/or recovery of
desirable characteristics. For the success of cryopreservation, the addition of an
intracellular cryoprotectant agent in the freezing solution is indispensable. However,
issues related to intracellular cryoprotectant agents used, e.g., their metabolism and
27
potential toxicity, must be examined carefully so we can choose the cryoprotectant most
suitable for a specific structure.
Review: In this regard, this review introduces several aspects of cryopreservation, such
as basic principles and methods used (slow freezing and vitrification), describing the
fundamental steps of cryoprotectant agent’s exposure, cooling, storage, thawing or
warming and removal of the cryoprotectant agent. The addition of an intracellular
cryoprotectant to the freezing solution is essential, but does not guarantee the success of
the cryopreservation protocol, due to its toxic effect, which requires a perfect balance
between cryoprotectant concentration, temperature and exposure time to the structure
which will be cryopreserved. Some studies attribute the toxicity of these agents mainly
to the secondary metabolites formed when the cell resumes its activity and gradually
begins to metabolize the cryoprotectant agent. These secondary metabolites, such as
lactate resulting from the degradation of propanediol and the production of oxalic acid
after the catalysis of ethylene glycol, can interfere in a number ways on cellular
homeostasis, resulting from an acid-base imbalance with cellular acidosis until the
uncoupling of oxidative phosphorylation in the mitochondrial membrane, preventing the
production of adenosine triphosphate. In addition, there are characteristics of tissue’s
formation and metabolic peculiarities inherent to each species, resulting in differences
in optimal conditions required to maintain the biological properties of cells after
thawing. Therefore, in addition to the knowledge about the chemical and biological
characteristics of the most suitable cryoprotectant agent for a given species, it is also
necessary to adjust the concentration and exposure time to it, allowing a more efficient
preservation of various cell types.
Conclusion: Cryopreservation is a valuable tool for female gametes preservation,
providing support for several reproductive biotechnologies allowing safeguard the
28
genetic material and facilitating its propagation. However, the success of this procedure
depends on the proper use of a cryoprotectant agent, which application, although
essential, can cause irreversible cell damage that can result in cellular death. Although
there is no ideal cryoprotectant agent, able to protect completely the cell at low
temperatures and also to be free of toxicity, it has been demonstrated that the
cryoprotectants currently employed enabled the preservation of oocytes and ovarian
tissue allowing the in vitro production of embryos and the restoration of fertility after
transplantation.
Keywords: cryopreservation, female gamete, ethylene glycol, propanediol,
dimethylsulphoxide, glycerol.
Descritores: criopreservação, gameta feminino, etilenoglicol, propanodiol,
dimetilsulfóxido, glicerol.
I. INTRODUÇÃO
II. FUNDAMENTOS DA CRIOPRESERVAÇÃO
1. Métodos de criopreservação
III. HISTÓRICO DOS AGENTES CRIOPROTETORES
IV. AGENTES CRIOPROTETORES INTRACELULARES
1. Etilenoglicol
a. Obtenção e aplicações
b. Metabolização e mecanismo tóxico
c. Utilização do EG na criopreservação de tecido ovariano e
gametas femininos
2. Dimetilsulfóxido
a. Obtenção e aplicações
29
b. Metabolização e mecanismo tóxico
c. Utilização do DMSO na criopreservação de tecido ovariano e
gametas femininos
3. Propanodiol
a. Obtenção e aplicações
b. Metabolização e mecanismo tóxico
c. Utilização do PROH na criopreservação de tecido ovariano e
gametas femininos
4. Glicerol
a. Obtenção e aplicações
b. Metabolização e mecanismo tóxico
c. Utilização do GLI na criopreservação de tecido ovariano e
gametas femininos
V. CONCLUSÃO
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
I. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, a criotecnologia tem conquistado grande destaque tanto na
medicina reprodutiva humana quanto na reprodução animal, seja através da
criopreservação de embriões [58]; células germinativas masculinas [12] ou femininas
[65] ou mesmo através da criopreservação de tecido gonadal como ovário [92].
A criopreservação tem como princípio básico a redução da temperatura como
forma de reduzir o metabolismo celular, permitindo que as células ou os tecidos sejam
conservados por períodos indeterminados, permitindo a retomada do desenvolvimento
celular normal após o armazenamento [86] em nitrogênio líquido (-196°C). No entanto,
30
o sucesso dessa técnica depende de uma delicada e complexa interação entre
importantes variáveis, que envolve tanto questões físicas, como o volume da solução de
criopreservação e as taxas de resfriamento; quanto questões químicas referentes à
composição da solução de criopreservação. Além disso, para reduzir ou evitar as
injúrias induzidas pelas baixas temperaturas é essencial a adição de substâncias que
proporcionem uma crioproteção celular e tecidual durante a redução da temperatura
[108]. Essas substâncias, conhecidas como agentes crioprotetores (ACPs) são
fundamentais para o sucesso da criopreservação.
Embora, os ACPs sejam absolutamente necessários e amplamente utilizados nos
protocolos de criopreservação, os mecanismos que conferem proteção ao material
biológico, bem como a toxicidade e a metabolização celular destes agentes não são
completamente esclarecidos e abordados na literatura. Neste contexto, a presente
revisão tem como objetivo descrever os aspectos ligados ao processo de
criopreservação, ressaltando os ACPs intracelulares, isto é, aqueles que atravessam a
membrana celular e, portanto, evitam, sobretudo, a formação de gelo no interior da
célula.
II. Fundamentos da criopreservação
A criopreservação consiste na conservação do material biológico, por tempo
indefinido, a temperaturas negativas [94], para que quando descongelado, o material
biológico possa prosseguir seu desenvolvimento normal [86]. A temperatura em que é
realizada a criopreservação é conhecida como “temperatura criogênica”, isto é,
temperatura extremamente baixa na qual os gases encontram-se liquefeitos à pressão
atmosférica [94]. Essa temperatura é obtida com o nitrogênio líquido, cuja temperatura é
de -196°C, ou em sua fase de vapor [54], na qual a temperatura varia em função da
31
distância entre a amostra e o nível de nitrogênio líquido. À temperatura criogênica,
todas as reações químicas, processos biológicos, bem como as atividades intra e
extracelulares estão suspensas, portanto, teoricamente, uma célula ou tecido podem ser
mantidos criopreservados indefinidamente [102]. Porém, para isso, é necessária a
utilização de um ACP na composição da solução de criopreservação, cuja concentração
depende do método de criopreservação empregado.
1. Métodos de criopreservação
O processo de criopreservação pode ser realizado por dois métodos, isto é, a
congelação lenta e a vitrificação. Independente do método utilizado, a criopreservação
baseia-se em cinco etapas fundamentais: 1) exposição ao ACP, com a finalidade de
permitir a difusão desses agentes nos compartimentos celulares; 2) resfriamento com
redução da temperatura de forma gradual (congelação lenta) ou súbita (vitrificação),
na qual a amostra passa da temperatura ambiente para a temperatura criogênica; 3)
armazenamento ou estocagem, permitindo a preservação do material em temperatura
ultrabaixa por períodos indefinidos; 4) descongelação ou aquecimento, etapa na qual
ocorre o resgate do material criopreservado e retomada do metabolismo celular; e 5)
diluição ou remoção do ACP, a fim de evitar, na presença de temperatura fisiológica ou
ambiente, a produção de metabólitos secundários, o que intensificaria a ação tóxica
destes aditivos.
Os métodos de criopreservação divergem entre em si, principalmente, quanto à
taxa de redução de temperatura empregada. A congelação lenta é caracterizada por uma
redução gradual da temperatura, com o objetivo de reduzir o estresse térmico na fase de
32
transição das soluções do estado líquido para o estado sólido [96]. Além disso, é
caracterizada também por uma desidratação celular gradual que evita ou reduz a
formação de cristais de gelo. Nesta situação, baixas concentrações de ACP são
suficientes a fim de que esses objetivos sejam alcançados [101].
Para o resfriamento lento, o material biológico geralmente é congelado sob o
controle de um freezer programável e, uma vez atingido uma adequada desidratação
celular, a qual ocorre quando a temperatura se encontra entre -30 a -80ºC, o material é
estocado em nitrogênio líquido [85] à temperatura de -196° C.
Por outro lado, a vitrificação consiste no método de criopreservação na qual a
redução de temperatura ocorre de forma brusca, cujo objetivo é a obtenção de um sólido
amorfo ou em estado vítreo, que difere do sólido cristalino por não haver formação de
cristais de gelo no interior dos compartimentos celulares [114]. Contudo, para a
obtenção desse estado vítreo é necessário, além de uma alta taxa de resfriamento (por
exemplo, 2500 °C/min), a utilização de uma solução de vitrificação com alta
viscosidade, a qual é obtida com o emprego de elevadas concentrações de ACPs [27,
115].
Independente do método empregado, a adição de um ACP representa um fator
chave para o sucesso da criobiologia, sendo indispensável sua presença para que as
células possam resistir às injúrias resultantes do procedimento de criopreservação [87,
77, 71]. Contudo, os metabólitos resultantes da degradação dos ACPs pela célula podem
ser tóxicos para as células, sendo este um fator limitante para o sucesso da utilização
dos mesmos [32].
III. Histórico dos agentes crioprotetores
33
A descoberta acidental da ação crioprotetora do glicerol por Polge et al. [88]
durante as suas tentativas para preservar espermatozóides de aves revolucionou os
métodos de criopreservação de diversas células e tecidos. No ano seguinte, Smith
(Smith, 1950) estendeu as observações da função desse agente para a criopreservação de
eritrócitos do sangue humano. Esses dois relatos foram fundamentais para identificar
elementos chaves que desempenhariam um papel crucial na evolução do campo da
biopreservação, como por exemplo, a) a necessidade de utilização de um ACP; b) o
processo pelo qual as células poderiam ser expostas com sucesso a um ACP penetrante
ou intracelular, bem como a c) a maneira de congelar e descongelar. Na década
seguinte, exatos dez anos mais tarde, Lovelock e Bishop [63], descreveram a utilização
do dimetilsulfóxido como ACP, cujas características conferem maior permeabilidade a
vários tipos de células em relação ao Glicerol.
Somente, a partir da década de 80, estudos já consideravam o efeito tóxico dos
crioprotetores como um obstáculo para o sucesso da criobiologia [31]. Desde então,
tem-se buscado novas substâncias capazes de proteger as células dos efeitos deletérios
das baixas temperaturas e que não seja prejudicial às mesmas. Os ACPs são substâncias
de classe orgânica variada, que agem protegendo a célula durante o período de
estocagem em baixas temperaturas, prevenindo a formação de gelo intracelular e
possíveis danos causados pela desidratação [46]. Dependendo do local de ação, os
ACPs podem ser classificados como intracelulares ou extracelulares. Por razões
didáticas, na presente revisão, serão abordados somente os ACPs intracelulares.
IV. Agentes crioprotetores intracelulares
Os crioprotetores intracelulares são solventes orgânicos de baixo peso
molecular que possuem a capacidade de penetrar na célula [89]. Dentre os
34
crioprotetores intracelulares destacam-se, o etilenoglicol, o dimetilsulfóxido e o
propanodiol por apresentarem uma capacidade de penetração superior a do glicerol e
baixa toxicidade. Contudo, a eficiência destes ACPs pode variar em função da estrutura
(célula ou tecido) a ser criopreservada [90], do tipo e concentração e tempo de
exposição utilizado antes do processo de criopreservação propriamente dito. Além
disso, as diferenças estruturais entre as espécies animais é também um fator que pode
influenciar na eficácia de um ACP [37, 33].
De forma geral os ACPs intracelulares atuam substituindo parcialmente a água
no interior da célula e ligam-se ao hidrogênio das moléculas de água intracelular [52],
aumentando a viscosidade da solução de congelação, consequentemente, reduzindo o
ponto de congelação da mesma. Além disso, os ACPs também agem prevenindo a
exposição do material a altas concentrações de eletrólitos, através da ligação aos
próprios eletrólitos ou pela substituição parcial pela água. Os tópicos subseqüentes
apresentam uma descrição detalhada sobre as características dos agentes crioprotetores
intracelulares mais amplamente utilizados nos processos de criopreservação de
materiais biológicos. A tabela 1 mostra uma síntese dos principais resultados da
utilização de diferentes agentes crioprotetores para a criopreservação de estruturas como
o tecido ovariano e oócitos de diversas espécies
1. Etilenoglicol
1.a. Obtenção e aplicações
35
O etilenoglicol (EG) ou monoetilenoglicol é um álcool de fórmula molecular
C2H4(OH)2, obtido a partir da hidrólise do óxido de eteno, empregado como
anticongelante em sistemas de refrigeração de motores, fluído de freio e como matéria
prima para produção de fibra poliéster [70]. Devido às suas características de baixo peso
molecular (62,07 g/mol) e baixo ponto de fusão (-15,6°C), o EG tem sido amplamente
empregado como agente crioprotetor intracelular [78]. Todavia, a metabolização desse
crioprotetor gera subprodutos potencialmente tóxicos, como o acido glicólico e oxalato
[25].
1.b. Metabolização e mecanismo tóxico
No sistema celular, a metabolização do EG ocorre inicialmente no retículo
endoplasmático, onde é convertido em glicoaldeído pela enzima álcool desidrogenase
(ADH) e em menor quantidade pela citocromo P450 2E1 [106]. O glicoaldeído pode
originar como subproduto o ácido glicólico, que representa a via prioritária de
metabolização, e o glioxal, de menor importância in vivo devido à sua meia-vida curta
[66, 35]. O ácido glicólico é rapidamente degradado pela enzima aldeído desidrogenase
(ALDH), resultando na formação de ácido glioxílico. A partir deste metabólito, o ácido
oxálico é formado pela ação da glicolato oxidase (GD) e lactato desidrogenase (LDH).
O ácido oxálico, por sua vez pode conjugar-se com íons cálcio originando o oxalato de
cálcio, um componente tóxico que compromete principalmente a função renal [25]. As
reações de metabolização do EG são mostradas na Figura 1
Dependendo da quantidade de EG metabolizado, o ácido glicólico formado
excede a capacidade tamponante natural da célula, levando a uma redução do pH com
36
consequente acidose celular, resultando na formação de glicina e ácido oxálico [15]. Em
um estudo sobre células renais, McMartin e Wallace [72] observaram o efeito do
oxalato de cálcio monohidratado, resultante da conjugação do ácido oxálico advindo do
metabolismo do EG com íon cálcio e, sugeriram que o acúmulo intracelular deste
metabólito pode levar a uma alteração da permeabilidade mitocondrial, inibindo a
cadeia respiratória, culminando com a morte celular devido à inibição da síntese de
adenosina trifosfato (ATP). Contudo, estudos realizados in vivo, avaliando a quantidade
de subprodutos do EG secretados na urina, revelaram uma variação entre indivíduos em
decorrência do polimorfismo dos sistemas ADH e ALDH. Nesta abordagem, Gross et
al. [43] avaliando a ação de diferentes isoformas de ALDH humana, demonstraram que
a oxidação dos aldeídos (glicoaldeídos), em seus respectivos ácidos, representam a
etapa limitante para a toxicidade do EG. Um estudo realizado em ratos corrobora com
este fato, pois foi demonstrado que a diferença de sensibilidade à toxicidade do EG está
relacionada a fatores genéticos [27]. Porém, vale ressaltar que a toxicidade biológica
dos agentes crioprotetores está diretamente relacionada às suas respectivas
concentrações. Assim, nas concentrações normalmente empregadas para o processo de
congelação lenta, a toxicidade não parece ser um fator limitante para a utilização do EG
como agente crioprotetor, uma vez que, diversos estudos mostram altas taxas de
sobrevivência celular após criopreservação de folículos caprinos [3] e bovinos [18],
oócitos humanos [28] e embriões ovinos [103] com o uso de EG.
1.c. Utilização do EG na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos
37
O EG tem sido corriqueiramente empregado para a conservação de folículos
ovarianos pré-antrais isolados [94, 97] ou inclusos em tecido ovariano [9, 33], oócitos
[7] e embriões [30], obtendo-se resultados satisfatórios e promissores. Apesar disso,
alguns estudos têm demonstrado resultados contraditórios quanto à utilização deste
agente.
Um estudo realizado na espécie bovina, utilizando diferentes crioprotetores
(EG, PROH, DMSO e glicerol) para a congelação lenta de tecido ovariano mostrou que
o EG nas concentrações de 1,5 e 3,0 M, reduziu significativamente o percentual de
folículos morfologicamente normais (52,5% e 32,8%, respectivamente). Segundo os
autores [64], esse resultado foi provavelmente devido à ação tóxica desse crioprotetor.
Por outro lado, Celestino et al. [18] obtiveram um alto percentual de folículos viáveis,
semelhante ao controle fresco, tanto após a exposição quanto após a congelação-
descongelação do tecido ovariano bovino, utilizando 1,5 M de EG.
Em suínos, a utilização de 1,5 M EG mostrou ser mais eficiente no que
concerne à manutenção da morfologia e ultraestrutura de folículos pré-antrais inclusos
em tecido ovariano, proporcionando taxas superiores ao PROH e glicerol com duas
horas de incubação após a descongelação [9]. Amorim et al, [2] avaliaram diferentes
concentrações de EG para a congelação de folículos pré-antrais ovino isolados e
observaram que as concentrações de 1,0; 1,5 e 2,0 M foram capazes de manter a
viabilidade semelhante à verificada para folículos frescos ou não congelados (controle).
A eficiência de diferentes concentrações pode ser devido à diferença espécie-específica
e, principalmente, à forma de congelação, pois apesar do EG apresentar uma boa
permeabilidade, por razões físico-químicas, a penetração do ACP em um tecido é mais
lenta quando comparada à estruturas ou células em suspensão.
38
A alta permeabilidade do EG tem justificado sua grande utilização na
criopreservação de oócitos maturos (camundongo [22]; coelho [11]) e imaturos (ovino
[7]; bovino [19]). A exposição de oócitos humanos a 1,5 M de EG por 10 minutos
conservou a conformação da rede de filamentos corticais de actina, após a congelação
53,8% dos oócitos apresentavam fuso organizado e com os cromossomos alinhados,
7,7% apresentaram desorganização do fuso sem alterar o alinhamento dos cromossomos
e 38,5% possuíam fuso desorganizado ou ausente aliado à desorganização dos
cromossomos [28]. Porém, a exposição de oócitos de camundongas a 6,0 M de EG por
mais de 10 minutos resultou em distúrbios na organização dos filamentos do
citoesqueleto, sendo possível observar irregularidades na distribuição cortical da actina
e ausência da rica rede de filamentos que circundam os cromossomos logo após a
quebra da vesícula germinativa [49, 34].
2. Dimetilsulfóxido
2.a. Obtenção e aplicações
O dimetilsulfóxido (DMSO) é um composto polar, cuja fórmula química é
C2H6SO [93]. É caracterizado por possuir peso molecular de 78 g/mol [16] e
temperatura de congelação de 18,5°C [10]. O DMSO é amplamente utilizado para
solubilizar pequenas moléculas orgânicas [13] e foi sintetizado pela primeira vez pelo
químico russo Alexander Saytzeff, sendo inicialmente empregado apenas como solvente
[76]. Por ser um subproduto da indústria de extração de celulose e, portanto, facilmente
39
disponível, o DMSO passou a ser utilizado industrialmente a partir da década de
quarenta do século XX [80].
A partir da década de sessenta, o DMSO foi introduzido na medicina com fins
farmacológicos e terapêuticos, sendo descritas mais de trinta propriedades, incluindo
atuação intiinflamatória, imunomoduladora, antimicrobiana, vasodilatadora,
antioxidante e crioprotetora [10]. Como crioprotetor, o DMSO foi utilizado pela
primeira vez na criopreservação de sêmen de touro e hemácias humanas e bovinas, por
Lovelock e Bishop [63]. Desde então, a ação crioprotetora desse agente vem se
destacando e tem sido largamente utilizado na criopreservação de folículos ovarianos
[55, 29], oócitos [107, 65] e embriões [58].
2.b. Metabolização e mecanismo tóxico
Por ser um álcool dipolar, o DMSO é capaz de interagir ou combinar-se com
ácidos nucléicos, carboidratos, lipídeos, proteínas e muitas drogas sem alterar de forma
irreversível a configuração das moléculas [105]. Essa substância é considerada
relativamente atóxica [112] e é encontrada em diversas espécies vegetais e animais,
incluindo o homem [59]. O DMSO interage com as membranas, atravessando-as
rapidamente por meio de difusão. Recentemente, estudos com injeção intraoocitária de
RNA através do canal protéico aquaporina-3, em oócitos de rã (Xenopus SP), foi
demonstrado pela primeira vez o transporte de DMSO por este canal, mesmo em
condições de baixo gradiente de concentração [113].
40
As vias metabólicas seguidas pelo DMSO, bem como seu efeito sobre diversos
sistemas biológicos ainda não são completamente elucidados. De um modo geral, o
DMSO é oxidado em dimetilsulfona (DMSO2), também conhecida com
metilsulfonilmetano (MSM), um importante metabólito utilizado como fonte de enxofre
na síntese de metionina [81]. O MSM é eliminado por via urinária [50] ou pode ser
reduzido pela DMSO-redutase em dimetilsulfuro (DMS), um produto volátil que é
eliminado pelos pulmões [74]. Estudos realizados em camundongos com a
administração de até 2 g/kg de MSM demonstraram tolerância a esse composto, sem
efeitos agudos ou crônicos, não causando nenhuma lesão patológica ou alterações de
órgãos [48].
Tanto o DMSO quanto seus metabólitos têm baixo potencial tóxico [38, 5].
Avaliando-se a genotoxicidade dos agentes crioprotetores mais utilizados na
criopreservação, foi confirmado que, dentre os agentes estudados (DMSO, EG e
PROH), o DMSO foi o único que não induziu alterações cromossômicas, mesmo em
concentrações elevadas de 150 a 200 mg/mL. Contraditoriamente, Zampolla et al. [116],
trabalhando com oócitos de Zebrafish, demonstraram que após exposição a 2,0 M de
DMSO por 30 minutos, ocorreu um aumento no DNA mitocondrial, na tentativa de
corrigir as injúrias causadas pela adição deste agente. Porém, em concentrações
superiores a 3,0 M, os oócitos foram incapazes de realizar a replicação do DNA
mitocondrial, além de ocorrer uma queda imediata dos níveis celulares de ATP.
2.c. Utilização do DMSO na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos
41
O DMSO tem sido utilizado com sucesso para criopreservação de gametas e
embriões. Quando utilizado na concentração de 1,5 M para criopreservação de
fragmentos de tecido ovariano humano (25 mm3), seguida por xenotransplante em
camundongos imunodeficientes, foi observado uma baixa recuperação de oócitos e taxa
de maturação oocitária, com oócitos apresentando grande desorganização da cromatina
[56]. Em ovinos, a análise histológica revelou que a criopreservação de tecido ovariano
com 1,5 M de DMSO, seguida por isolamento folicular e cultivo in vitro de folículos
isolados, resultou em 50% de degeneração folicular no primeiro dia de cultivo. Ao fim
de 10 dias de cultivo, uma análise da interação célula-célula revelou uma redução
significativa neste parâmetro quando comparado com tecido criopreservado com EG ou
tecido não criopreservado [17]. Contudo nestes trabalhos os folículos sofreram grande
influência do tipo de cultivo e do organismo para o qual foi xenotransplantado. Isto
supõe que os resultados não podem ser atribuídos exclusivamente à criopreservação ou
ao agente crioprotetor empregado, haja vista, que utilizando a mesma concentração de
DMSO, Demeestere et al. [29] obtiveram sucesso após tranplantes ortotópico e
heterotópico (subcutâneo) de tecido ovariano criopreservado, constatando a retomada da
ciclicidade hormonal e da fertilidade com obtenção de gestação natural.
No que diz respeito à criopreservação de oócitos, muitos trabalhos associam o
DMSO a outros agentes intracelulares, principalmente ao EG [107, 109, 23]. Mahmoud
et al. [65], comparando diferentes combinações de agentes crioprotetores na vitrificação
de oócitos imaturos de búfalas, demonstraram que a combinação de EG e DMSO é mais
efetiva, resultando em maiores taxas de maturação pós vitrificação, quando comparado
a apenas ao EG ou às combinações EG ou DMSO com glicerol. No entanto, na espécie
bovina, Campos-Chillòn et al. [14] encontraram um percentual de clivagem (87,5%) e
formação de blastocisto (23,6%) significativamente superior em zigotos criopreservados
42
com 7,0 M de EG quando comparado aqueles criopreservados com 2,5 M de DMSO
(79,4%).
3. Propanodiol
3.a. Obtenção e aplicações
O 1,2-propanodiol (PROH) foi inicialmente descrito por Wurtz em 1859, mas
sua produção em escala industrial iniciou-se em 1930. Este composto é produzido pela
hidrólise direta do óxido de propileno, sendo formado o 1,2- propilenoglicol e o 1,3-
propilenoglicol simultaneamente, pela adição sequencial do óxido de propileno ao
propilenoglicol [75]. O PROH (C3H8O2) também pode ser obtido a partir do glicerol
(1,2,3,-propanotriol) através de uma reação de hidrogenólise, conduzida em
temperaturas que variam de 150 a 200°C, na presença de catalisadores ácidos [75].
Outra forma de obtenção deste composto é através da glicerina, que é constituída por
95% de glicerol. A glicerina pode, inclusive, ser obtida como um co-produto do
biodiesel, apresentando-se como uma alternativa viável e sustentável para a produção de
PROH [100].
A maior aplicação do PROH é na manufatura de resinas de poliéster insaturadas
sendo também aplicado na indústria farmacêutica e de alimentos [39]. Contudo, por
possuir características como baixo peso molecular, alta permeabilidade à membrana
celular [36] e biodegradabilidade, o PROH tem sido utilizado como agente
descongelante e anti-congelante em naves espaciais, automóveis e máquinas
43
refrigeradas [75], além de mostrar-se como um eficiente crioprotetor na preservação de
diversos tipos celulares e tecidos (Tecido ovariano:[92]; folículos: [4]; oócitos: [53];
sêmen: [41]; embriões: [24]).
3.b. Metabolização e mecanismo tóxico
O efeito tóxico do PROH na criopreservação ainda é pouco explorado, contudo,
por sua utilização em outras áreas, como na indústria alimentícia e cosmética, existem
trabalhos que relatam seus efeitos tóxicos em ensaios experimentais, quando
administrado em altas doses em casos acidentais [82, 6], havendo relato de casos de
sinais de intoxicação pelo PROH utilizado como veículo de medicamentos [111]. De
toda forma, os efeitos observados incluem a produção de lactato intracelular com
consequente acidificação e alterações hematológicas, podendo ocasionar desequilíbrio
ácido-básico e morte celular [111].
No organismo, o PROH é oxidado a monohidroxiacetona e convertido a ácido
pirúvico (piruvato), que é destinado ao ciclo do ácido cítrico para produção energética
através da gliconeogênese. Esse composto também pode sofrer oxidação resultando em
produção de lactoaldeído, posteriormente convertido em ácido láctico (lactato). Os
produtos formados, lactoaldeído e monohidroxiacetona, são interconversíveis, ou seja,
um produto pode ser convertido no outro [95], assim como o lactato e o piruvato
(Figura 2).
Estudos conduzidos em células de tecido vascular suíno, indicaram que a
alteração do pH ou o do estresse oxidativo não possuem papel decisivo nas lesões
44
tóxicas provocadas pela exposição ao PROH. O efeito tóxico deste composto parece ser
exercido através de um influxo de sódio para o meio intracelular. Este mecanismo ainda
é incerto, contudo acredita-se que ocorram lesões por alterações secundárias como
alteração da homeostase do cálcio intracelular, via disfunção da bomba Na+/Ca2+ e
distúrbios na permeabilidade das mitocôndrias com o decréscimo de função da Na+/K+-
ATPase [112].
3.c. Utilização do PROH na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos e
embriões
Devido às suas características estruturais, o PROH despertou grande interesse
de pesquisadores que passaram a investigar a aplicabilidade desta substância para a
preservação de gametas femininos [24, 53, 20].
Na criopreservação de tecido ovariano suíno, o PROH mostrou-se menos
eficiente quando comparado ao EG e DMSO, proporcionando uma menor taxa de
folículos morfologicamente normais, tanto imediatamente quanto após curto período (2
horas) de incubação [9]. Quando utilizado na concentração de 1,5 M com 10 minutos de
exposição, o PROH proporcionou taxas aceitáveis de manutenção da morfologia e
ultraestrutura de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano de cutia, Dasyprocta
aguti (dados não publicados). Amorim et al. [4] avaliando diferentes concentrações de
PROH (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 M) na criopreservação de folículos primordiais isolados
ovinos, obtiveram melhores resultados com 1,5 M, encontrando 10,6% de folículos
viáveis comparado com o controle. Já para tecido ovariano caprino o PROH nas
concentrações de 1,5 ou 3 M resultaram em taxas de folículos morfologicamente
normais significativamente inferiores a criopreservação com 1,5 M de DMSO [92]
45
Em oócitos de macacas rhesus (Macaca mulatta), o PROH mostrou-se mais
permeável que o DMSO e o EG [53]. Além disso, o PROH (1,5 M) foi capaz de manter
a organização do fuso meiótico de oócitos de camundongos em temperaturas
subfisiológicas, no entanto, essa organização foi perdida após o aquecimento dos
mesmos [20]. Em felinos, a mesma concentração de PROH foi eficiente na preservação
de oócitos imaturos, proporcionando taxas de maturação e desenvolvimento
embrionário (clivagem e formação de blastocisto) semelhantes às observadas para
oócitos frescos ou não congelados (controle). Porém, nas concentrações de 0,75 e 3,0 M
foi observado um grande percentual de anormalidade do fuso meiótico, 62% e 42,7%,
respectivamente [24]. Em oócitos humanos maturos e imaturos, o PROH na
concentração de 1,5 M induziu a liberação de cerca de 70% dos grânulos corticais [40],
evidenciando que seu uso pode acarretar em dificuldades para a fertilização devido ao
enrijecimento precoce da zona pelúcida. Parmegiani et al. [83] relataram o nascimento
de uma criança saudável após a fertilização in vitro de oócitos humanos maturos que
permaneceram criopreservados com 1,5 M de PROH por cinco anos. Utilizando a
mesma concentração (1,5 M) associada a 0,3 M de sacarose, Konc et al. [57] relataram
o nascimento dos primeiros bebês húngaros oriundo de oócitos congelados, que
resultaram em 127 embriões transferidos com taxa de gestação de 20%.
4. Glicerol
4.a. Obtenção e aplicações
46
O glicerol, ou 1,2,3-propanotriol (C3H8O3) ocorre naturalmente em formas
combinadas, como com ácidos graxos nos triglicerídeos, em todos os óleos graxos
animais e vegetais, sendo isolado quando estes óleos são saponificados com hidróxido
de sódio ou potássio no processo de manufatura de sabões [75]. O primeiro relato de
isolamento do glicerol foi descrito por Scheele em 1779, pelo aquecimento de uma
mistura de óxido de chumbo com azeite de oliva, na época, chamado de “o doce
princípio das gorduras”. Apesar disso as primeiras evidências de um material parecido
com sabão é datado de 2800 a.c. encontradas em escavações na antiga Babilônia. A
denominação de “sabão” foi dada pelos romanos, tendo origem no Monte Sapo, onde
eram realizados sacrifícios de animais, cuja gordura derretida era levada pelas águas da
chuva e, misturado com cinzas e barro, acumulava ao longo das margens do rio Tibre e
era utilizado pelas mulheres romanas para limpar suas vestes [1].
Desde 1949, o glicerol também tem sido produzido comercialmente pela
síntese do propeno. A etapa inicial é a cloração a alta temperatura, envolvendo radicais
livres como intermediários, para formar o cloreto de alila. Este é então reagido com
ácido hipocloroso dando um produto de adição à dupla (haloidrina). Por fim, o
tratamento da haloidrina com excesso de base leva ao glicerol [75]. Atualmente, a
produção de biodiesel [42] tem se tornado uma forma alternativa para a obtenção de
glicerol. O óleo utilizado no processamento do biodísel, ou seja, os são triglicerídeos,
sob a ação de um catalisador básico e na presença de metanol ou etanol sofre uma
transesterificação originando três moléculas de ésteres metílicos ou etílicos (que
constituem o biodiesel em sua essência) e liberando uma molécula de glicerol [69].
O termo glicerol é utilizado apenas para o produto químico puro,
comercialmente é encontrado como glicerina, um produto purificado com pelo menos
95% de glicerol. A glicerina tem aplicação em diferentes setores de cosmético, higiene
47
pessoal, alimentos e medicamentos dentre outros [75]. A figura 3 mostra uma
distribuição percentual de aplicações usuais da glicerina.
4.b. Metabolização e mecanismo tóxico
O glicerol é encontrado normalmente em todos os tecidos animais, sendo o nível
plasmático normal de 0,1 mM em ratos, 0,05-0,1 mM em humanos [61] e 0,65 mM em
frangos [104], porém estes níveis variam em função da atividade do indivíduo podendo
elevar de 65 µmol l-1 para 150 µmol l-1 em apenas duas horas de exercícios [44]. No
organismo animal, o glicerol é metabolizado em glicerol 3-fosfato pela enzima glicerol
quinase e transformado em diidroxiacetona fosfato e gliceraldeído-3-fosfato que é
intermediário do metabolismo dos carboidratos [84]. O destino metabólico do glicerol
pode ser dirigido, dependendo do tecido e do estado nutricional do animal, para o
fornecimento de esqueleto carbônico para a gliconeogênese, entrar na via glicolítica
para a geração de energia ou ser utilizado como precursor na síntese de novos
triglicerídeos (figura 4).
Por ser um constituinte normal presente nas membranas celulares e em todos os
óleos e gorduras animal e vegetal, todas as células são capazes de metabolizar o
glicerol, não havendo informações toxicológicas referentes ao mesmo, ou sua forma
comercial, glicerina, em bancos de dados reconhecidos internacionalmente. Contudo, já
foi relatado que o glicerol pode afetar eventos físicos no citoplasma, como a
organização citoplasmática através da alteração na polimerização da tubulina e aumento
da viscosidade; altera a permeabilidade e estabilidade da bicamada lipídica e atua
diretamente de modo prejudicial no glicocálix e nas proteínas de membrana, formando
48
ligações não covalentes com as mesmas [45]. Apesar de ser utilizado na dosagem de 6
ml/kg para induzir modelos de lesão renal aguda em camundongos, semelhante a
ocorrida na rabdomiólise [67], é uma excelente fonte de carbono e favorece o
metabolismo secundário, como demonstrado por Oliveira [79] que obteve uma maior
produção de violaceína (pigmento com atividade antibiótica, antivirótica e anti
Trypanossoma cruzi) pela bactéria Chromobacterium violaceum substituindo a glicose
pelo glicerol.
4.c. Utilização do GLI na criopreservação de tecido ovariano e gametas femininos
Apesar de considerado o crioprotetor padrão na criopreservação de gametas
masculinos, o glicerol não apresenta uma alternativa eficiente para preservação de
gametas femininos. Amorim et al. [4] avaliando a eficiência do glicerol na preservação
de folículos primordiais isolados ovinos, obtiveram taxas de sobrevivência de 0,44;
1,33; 3,72. 3,12 e 2,52% utilizando 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; e 2,5 M, respectivamente. Além
disso, um estudo realizado para avaliar a eficácia do glicerol, EG, PROH e DMSO, nas
concentrações de 1,5 e 3 M, na a criopreservação de folículos pré-antrais ovinos
isolados demonstraram que o glicerol é o agente menos efetivo na preservação dessas
etruturas [98].
Utilizando as mesmas concentrações (1,5 e 3 M) de glicerol acima mencionadas
para a espécie ovina, na congelação de tecido ovariano caprino, Rodrigues et al [91]
demonstraram que é possível preservar folículos pré-antrais inclusos no tecido, obtendo
41% (1,5 M) e 36% (3 M) de folículos morfologicamente normais, mantendo também a
normalidade das características ultraestruturais (Figura 5). Apesar disso já foi
49
demonstrado com a criopreservação de tecido ovariano felino, que a utilização de
glicerol não é eficiente na preservação dos folículos pré-antrais, proporcionando um
percentual de folículos morfologicamente normais semelhante ao observado no tecido
congelado sem a adição de agentes crioprotetores, sendo 39,3% e 26%, respectivamente
[60]. O mesmo foi constatado por Borges et al. [9], que avaliando os quatro agentes
crioprotetores na preservação de tecido ovariano suíno, não obtiveram nenhum folículo
morfologicamente normal com a utilização do glicerol.
Em oócitos, a presença da zona pelúcida dificulta ainda mais a penetração do
glicerol quando comparado a outros tipos celulares. A criopreservação de oócitos
bovinos maturados in vitro utilizando 10% de glicerol, resultou em apenas 3% de
clivagem após fertilização e cultivo in vitro, porém nenhuma estrutura desenvolveu-se
ao estádio de blastocisto [99]. Hunter et al. [51] avaliando a empregabilidade do glicerol
e DMSO na criopreservação de oócitos humanos, verificaram que apesar de serem
fertilizados, as estruturas não foram capazes de continuar seu desenvolvimento normal
após 48 h de cultivo. Um estudo conduzido para avaliar o coeficiente de permeabilidade
da membrana do oócito a diferentes crioprotetores, utilizando o coelho como modelo,
demonstrou que o glicerol não alterou significativamente a condutividade hidráulica
quando comparado com o EG e o DMSO, porém a permeabilidade a solutos (expresso
em cm mim-1) foi inferior (DMSO: 2,9 x 10-3; EG: 2,7 x 10-3; GLI: 0,27 x 10-3). Nesse
mesmo estudo, avaliando a capacidade de desenvolvimento de oócitos após ativação
partenogenética, apenas 19% dos oócitos expostos ao glicerol chegaram ao estádio de 2-
8 células, não sendo obtida nenhuma mórula ou blastocisto [62].
50
V. Conclusão
A criopreservação representa uma valiosa ferramenta para a preservação de
gametas femininos tanto de animais quanto de humanos, oferecendo suporte para
diversas biotecnias reprodutivas permitindo salvaguardar o material genético e,
facilitando a sua difusão. No entanto o sucesso do procedimento depende da utilização
adequada de um agente crioprotetor considerando uma delicada e complexa relação
entre fatores como tempo, temperatura de exposição, bem como a concentração e o tipo
desse agente. Apesar de indispensável para o sucesso da criopreservação, nenhum dos
agentes crioprotetores, atualmente empregados são isentos de oferecer riscos às células.
Neste sentido, inúmeros trabalhos têm sido realizados com o intuito de estabelecer as
condições ideais para a utilização de um determinado crioprotetor para a
crioconservação de um dado tipo celular ou tecido. A relevância da criopreservação
para a reprodução assistida estimula novos estudos a fim de compreender, determinar e
otimizar os protocolos para cada espécie e estrutura, incluindo também a busca por
novos agentes crioprotetores, que sejam eficientes e não prejudiciais às estruturas a
serem criopreservadas.
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FIGURAS
Figura 1. Metabolização do etilenoglicol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: a
desidrogenase; AO: aldeído oxidase; LDH: lactato desidrogenase; AGAT: alanina glioxilato
aminotransferase; GO: glicolato oxidase; GD: glicolato desidrogenase)
al. [25].
Figura 1. Metabolização do etilenoglicol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: a
desidrogenase; AO: aldeído oxidase; LDH: lactato desidrogenase; AGAT: alanina glioxilato
aminotransferase; GO: glicolato oxidase; GD: glicolato desidrogenase) – Adaptado de Corley et
68
Figura 1. Metabolização do etilenoglicol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: aldeído
desidrogenase; AO: aldeído oxidase; LDH: lactato desidrogenase; AGAT: alanina glioxilato
Adaptado de Corley et
Figura 2. Metabolização do propanodiol (ADH: álcool de
desidrogenase; GLUr: glutationa reduzida; LDH: lactato desidrogenase
Figura 2. Metabolização do propanodiol (ADH: álcool desidrogenase; ALDH: aldeído
desidrogenase; GLUr: glutationa reduzida; LDH: lactato desidrogenase
69
sidrogenase; ALDH: aldeído
Figura3. Principais setores industriais de utilização da glicerina. Fonte: Mota et al. [75].Figura3. Principais setores industriais de utilização da glicerina. Fonte: Mota et al. [75].
70
Figura3. Principais setores industriais de utilização da glicerina. Fonte: Mota et al. [75].
Figura 4. Metabolização do glicerol e possíveis destinos metabóFigura 4. Metabolização do glicerol e possíveis destinos metabólicos
71
Figura 5 Análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão de folículo
criopreservado com 1,5 M (A) e 3M (B) de glicerol (Imagem cedida por Rodrigues et al.,[91]).
.
Figura 5 Análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão de folículo
criopreservado com 1,5 M (A) e 3M (B) de glicerol (Imagem cedida por Rodrigues et al.,[91]).
72
Figura 5 Análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão de folículo
criopreservado com 1,5 M (A) e 3M (B) de glicerol (Imagem cedida por Rodrigues et al.,[91]).
73
Tabela 1: . Principais resultados com a utilização de diferentes agentes crioprotetores na criopreservação de tecido ovariano e oócitos.
Estrutura Espécie Agentes crioprotetores Método Principais resultados Referencia
Ovário inteiro Humano 10% DMSO + 0,4% BSA Congelação lenta
(rápida 1°C/min)
Preservação da ultra-estrutura de folículos pré-antrais e células endoteliais
Martinez-Madrid et al. [68]
Ovário inteiro Camundongo 15% DMSO +15% EG+ 20% SS + 0,5M SAC
Vitrifiicação Nascimento de dois filhotes saudáveis, após procedimentos de cultivo, maturação e fertilização in
vitro dos oócitos recuperadose transplante de embriões
Hasegawa et al., 2006[47]
Ovário inteiro Ovino 1,5M PROH + 0,1M SAC + 2% HSA
Congelação lenta Características morfológicas de folículos preservadas, com aumento dos níveis de AMPc após perfusão in
vitro
Wallin et al. [110]
Ovário inteiro e
hemi-ovário
Camundongo 1,5 M DMSO Congelação lenta Restauração da função ovariana com nascimentos após transplante ortotópico de ovários criopreservados,
porém baixa fertilidade.
Liu et al. [62]
Fragmento cortical
(10 mm3)
Bovino 1,5 ou 3M DMSO, PROH, EG e GLI (10 ou 20%)
Congelação lenta DMSO e PROH demonstram ser mais efetivos na preservação da integridade estrutural de células
somáticas e reprodutivas
Lucci et al. [64]
Fragmento cortical
(20 mm3)
Ovino 2,6 M DMSO + 2,6 Acetamida + 1,31 M PROH +
0,0075M polietileno glicol
Vitrificação Nascimento de dois cordeiros saudáveis e um com má formação de membro, que veio a óbito dois meses após
o nascimento
Bordes et al. [8]
Fragmento Humano 1,5 M DMSO + 0,1M SAC + Congelação lenta Restauração da função ovariana com gestação natural Demeestere et al. [29]
74
cortical
(50 mm3)
10% SH
Fragmento cortical
(5 mm espessura)
Caprino 1,5 ou 3M DMSO, PROH Congelação lenta Percentual de folículos morfologicamente normais após a criopreservação foi superior com 1,5M de DMSO
quando comparado a 3M DMSO e 1,5 ou 3 M de PROH
Rodrigues et al. [92]
Fragmento cortical
(3 mm espessura)
Felino 1,5 M GLI ou EG Congelação lenta GLI não preservou a morfologia dos folículos pré-antrais colocar o resultado do EG
Lima et al. [60]
Oócito Camundongo 1,5 M PROH + 0,3 M SAC Congelação lenta Manutenção da organização do fuso meiótico em temperaturas subfisiológicas seguida por perda da
organização após aquiecimento
Chang et al [20]
Oócito Humano 1,5 M PROH + 0,3M SAC Congelação lenta Restauração do fuso meiótico após 3 horas de incubação pós descongelação com boas taxas de sobrevivência,
fertilização e gestação
Chen et al. [21]
Oócito Camundogo 5,5 M EG + 1,0M SAC + 20% SFB
Vitrificação Recuperação da organização do fuso meiótico após uma hora de incubação pós-descongelação
Chen et al. [22]
Oócito Ovino 20% EG + 20% DMSO + 0,5M SAC + 20% SFB
Vitrificação Desorganização do fuso e cromatina após maturação in vitro, redução dos níveis de MPF e MAPK de oócitos
vitrificados sem células do cumulus
Bogliolo et al. [7]
DMSO: dimetilsulfóxido; PROH: propanodiol: EG: etilenoglicol; GLI: glicerol; S: sacarose; BSA: albumina sérica bovina; SH: soro humano; SSS: substituto sintético de soro
75
3. JUSTIFICATIVA
Apesar de alguns protocolos para a criopreservação de tecido ovariano caprino já
terem sido testados, trabalhos que mostrem resultados mais relevantes, como a produção
embrionária ou gestação/nascimento nesta espécie, ainda não foram relatados. Este fato
restringe, de certa forma, a aplicação prática e rotineira da criopreservação na
reprodução animal assistida, haja vista que os protocolos atualmente utilizados ainda
não estão perfeitamente estabelecidos, necessitando, portanto de vários ajustes. Dentre
os ajustes necessários destaca-se a associação de crioprotetores intracelulares com
importantes substâncias como, por exemplo, o SFB e a sacarose, os quais poderiam
incrementar as soluções de criopreservação, aumentando consequentemente as taxas de
sucesso. No entanto, apesar de diversos estudos já relatarem o emprego da sacarose em
procedimentos de criopreservação, ainda não foi demonstrado o seu efeito sobre a
congelação de tecido ovariano caprino. Com relação ao SFB, embora amplamente
utilizado em protocolos de criopreservação, os efeitos da adição deste componente não
são cientificamente comprovados, bem como, os efeitos benéficos ao processo ainda
não foram atribuídas ao mesmo.
No tocante à avaliação de folículos pré-antrais congelados no tecido ovariano,
normalmente tem sido realizada através da histologia clássica e microscopia eletrônica
de transmissão (MET). A histologia clássica permite verificar apenas as alterações
morfológicas superficiais das células da granulosa e do oócito. Já a MET tem a
capacidade de revelar as mudanças ultra-estruturais foliculares, porém nem sempre as
características morfológicas avaliadas imediatamente após a descongelação estão
correlacionadas com a capacidade funcional do folículo. Assim um período de cultivo
após a descongelação permite uma avaliação mais fidedigna da viabilidade e função
folicular. Além disso, as técnicas para verificar a viabilidade de folículos isolados do
tecido ovariano, como os marcadores fluorescentes, são amplamente utilizados e
conferem uma maior segurança à análise.
Nesse sentido, a realização desse estudo foi de grande relevância para a
criobiologia por se tratar de um trabalho pioneiro, o qual mostra a importância da adição
de SFB e sacarose ao meio de congelação de tecido ovariano caprino. Os resultados
deste trabalho permitirão auxiliar na implementação de um protocolo exequível de
76
congelação lenta, além de viabilizar a implantação de bancos de germoplasma animal.
Sem dúvidas, esse estudo beneficiará produtores de animais de genética superior, e até
mesmo permitirá a conservação de espécies e raças em via ou ameaçadas de extinção.
Além disso, a criopreservação de tecido ovariano caprino poderá também ser de grande
interesse para a elucidação de questões ainda pouco esclarecidas na criopreservação do
tecido ovariano em animais de produção.
77
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
1) A adição de soro fetal bovino associado a sacarose à solução de congelação, pode
maximizar a viabilidade e o percentual de folículos pré-antrais morfologicamente
normais após congelação/descongelação.
78
5. OBJETIVOS
5.1 Geral
Definir uma solução de congelação lenta para folículos pré-antrais inclusos no
tecido ovariano caprino.
5.2 Específicos
Verificar a necessidade de adição do SFB e sacarose na solução de congelação lenta
para tecido ovariano caprino;
Avaliar a morfologia e viabilidade de folículos pré-antrais caprinos após congelação
lenta, comparando a eficiência de diferentes agentes crioprotetores intracelulares
(EG, PROH e DMSO);
Avaliar a morfologia, ultra-estrutura e viabilidade de folículos pré-antrais após
congelação lenta e cultivo in vitro
79
6. CPÍTULO II
Solução de congelação contendo dimetilsulfóxido e soro fetal bovino
mantem a sobrevivencia e ultraesturura de folículos pré-antrais caprinos
após criopreservação e cultivo in vitro de tecido ovariano
Freezing solution containing dimethylsulfoxide and fetal calf serum maintains survival
and ultrastructure of goat preantral follicles after cryopreservation and in vitro culture of
ovarian tissue
Periódico: Cell and Tissue Research (submetido em: Junho de 2011)
80
Abstract
Goat ovarian cortex fragments were subjected to slow freezing in the presence of
different solutions containing intracellular cryoprotectants, including 1.0 M of ethylene
glycol (EG), propanediol (PROH) or dimethyl sulfoxide (DMSO), with or without
sucrose and/or fetal calf serum (FSC). Histological examination revealed that only the
DMSO-containing solutions were able to maintain a follicular ultrastructure similar to
the morphology observed in the fresh control. Therefore, fragments previously
cryopreserved in DMSO solutions (with and without sucrose and/or FCS) were cultured
in vitro for 48 h and then subjected to viability, histological and ultrastructural analysis.
No significant differences were observed among the percentages of morphologically
normal follicles in cryopreserved ovarian tissue before in vitro culture (DMSO: 62.5%;
DMSO+sucrose: 68.3%; DMSO+FCS: 60.0%; DMSO+sucrose+FCS: 60.0%) and after
culture (DMSO: 60.8%; DMSO+sucrose: 64.2%; DMSO+FCS: 70.8%;
DMSO+sucrose+FCS: 55.0%) . After in vitro culture, the viability analysis showed that
only the freezing solution containing DMSO and FCS (75.6%) maintained a percentage
of viable follicles similar to that observed after culture without cryopreservation
(89.3%). As determined by ultrastructural analysis, morphologically normal preantral
follicles were detected in the fresh control and in fragments cultured before and after
cryopreservation with DMSO and FCS. In conclusion, the freezing solution containing
DMSO and FSC, under the experimental conditions tested, guaranteed the maintenance
of viability and follicular ultrastructure after short-term in vitro culture.
Keywords: Cryopreservation. Freezing solution. Preantral follicle. Caprine.
81
1. Introduction
Ovarian tissue cryopreservation has aroused much interest especially for
application in human reproductive medicine. This technique may be an indispensable
complement to other assisted reproductive techniques that aim to preserve the endocrine
and reproductive functions of women after chemotherapy and/or radiotherapy (Broecke
et al., 2001). In animal reproduction, preservation of ovarian tissue in cryobanks
provides the means to preserve the genetic heritage of females that possesses superior
genetics but have lost their reproductive function due to death or diseases. Likewise,
this technique may be used to preserve the genetic material from endangered breed or
species (Comizzoli et al., 2000).
In caprine species, for example, it has been documented that gonadal function
recovers following auto-transplantation of cryopreserved ovarian tissue (Santos et al.,
2009). However, many adjustments are necessary to define an optimal cryopreservation
protocol for ovarian tissue in this species. In an attempt to enhance these protocols,
different compositions of freezing solutions have been investigated (Rodrigues et al.
2004ab; Luz et al. 2009; Faustino et al. 2010). For use in these solutions, intracellular
cryoprotectant agents (CPAs) have been investigated. These agents include ethylene
glycol (EG; feline: Lima et al. 2009; caprine: Faustino et al. 2010), propanediol (PROH;
bovine: Lucci et al., 2004; caprine: Luz 2010) and dimethyl sulfoxide (DMSO; ovine:
Pinto et al., 2008; caprine: Luz et al., 2009). However, no studies have compared, under
optimal conditions, the efficiency of these agents for the preservation of goat ovarian
tissue.
In addition to the intracellular CPAs, substances such as sucrose (Marsella et al.,
2008; Fabbri et al., 2010) and fetal calf serum (FCS; Jahnukainen et al., 2007; Milazzo
et al., 2008; Izadyar et al., 2002) have been routinely used to maximize the efficiency of
82
freezing solutions. These substances have the ability to interact and preserve the
structural and functional integrity of the cell membrane (Anchordoguy et al., 1988;
Crowe et al., 2003; He & Woods, 2004). In addition, they can act in the extracellular
space and indirectly prevent the formation of intracellular ice crystals (Santos et al.,
2000), which are one of the major causes of cell injury during the slow freezing process
of cryopreservation.
When added to a freezing solution, sucrose alters the osmotic gradient, promotes
cell dehydration and inhibits intracellular ice formation during cryopreservation (Santos
et al 2006b). Furthermore, studies have shown that the addition of sucrose to the
freezing solution stabilizes the phospholipids that form the lipid bilayer (Danso and
Ford-Lloyd, 2004) and increases post-thaw cell survival (Borini et al., 2006; Zhang et
al., 2009). Santos et al. (2006b) showed that a solution containing 0.5 M sucrose and 1.0
M EG was effective for goat ovarian tissue cryopreservation. Although the FCS was
considered an unnecessary component in the freezing solution for goat ovaries
(Campbell & Brockbank, 2007), this substance has been widely used for ovarian tissue
cryopreservation in other species (murine: Choi et al., 2008; caprine: Luz et al., 2009;
ovine: Onions et al., 2008: human: Isachenko et al., 2003). However, it is not known
which intracellular CPA (EG, PROH or DMSO) is most effective for preantral follicle
preservation. Furthermore, it is unknown whether the addition of sucrose at a low
concentration (0.1 M) or 10% FSC is beneficial or essential for goat ovarian tissue
cryopreservation.
The objectives of the present study included the following: i) to determine the
efficiency of EG, PROH or DMSO as intracellular CPAs, ii) to determine the best
composition (intracellular CPAs, sucrose and/or FCS) of slow freezing solution for
83
preantral follicles enclosed in goat ovarian tissue, and iii) to evaluate the ultrastructure
of caprine preantral follicles after slow freezing and short-term in vitro culture (48 h).
2. Materials and methods
2.1. Source and transport of ovaries
Ovaries from adult mixed-breed goats (Capra hircus) were obtained at a local
slaughterhouse. Ovaries were washed once in 70% alcohol and twice in HEPES-
buffered MEM (HMEM; Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), supplemented
with 0.1% (v:v) penicillin/streptomycin (Sigma). Within 1 h of slaughter, the ovaries
were transported to the laboratory in thermos flasks at 20 °C.
2.2. Experiment 1: Determination of the slow freezing solution for ovarian tissue
2.2.1. Experimental design
At the laboratory, the cortex from each pair of ovaries (n = 5) was removed and
13 fragments (3x3x1 mm) were obtained. One fragment (fresh control) was immediately
fixed in Carnoy’s solution for 4 h for histological examination. The remaining
fragments (n = 12) were cryopreserved. In total, 13 treatments were included in this
work. The freezing solutions were composed of HMEM supplemented with EG, PROH
or DMSO with or without 0.1 M sucrose and/or 10% FCS. The concentration (1.0 M)
and exposure times for EG (5 min), PROH (5 min) and DMSO (10 min) were
84
previously defined by Faustino (2009), Luz et al. (2008) and Luz et al. (unpublished
data), respectively.
The slow freezing was performed according to the protocol described by
Faustino (2009), with some modifications. Briefly, ovarian fragments were exposed to
1.8 ml of freezing solution for 5 (EG or PROH) or 10 (DMSO) min in macrotubes.
After the exposure period, the macrotubes were transferred to a programmable freezer
(Freeze Control, CryoLogic Pty Ltd., Waverley, Australia), previously equilibrated at
20 ºC. The vials were cooled at 2 °C/min from 20 °C to -7 °C, and ice crystal formation
(seeding) was manually induced by touching the vials with forceps that were pre-cooled
in liquid nitrogen (-196 ºC). After 10 min, the vials were cooled at 0.3 º C/min to -40 °C
and finally at 10 °C/min to -70 °C. The samples were immersed into liquid nitrogen and
stored for up to one week.
To thaw, the vials were removed from liquid nitrogen, kept at room
temperature (~20 °C) for 1 min and then immersed in a 37 °C water bath until the
freezing solution was completely melted. In all treatments, the CPA was removed by a
three-step equilibration, which employed a 5 min treatment in each of the following: (i)
HMEM + 10% FCS + 0.5 M sucrose, (ii) HMEM + 10% FCS + 0.25 M sucrose, and
(iii) HMEM + 10% FCS. Thereafter, the ovarian tissue fragments were fixed for
histological examination.
2.2.2 Histological examination of preantral follicles
For histological examination, after fixation in Carnoy’s solution, the ovarian
fragments were dehydrated in ethanol, cleared in xylene, embedded in paraffin wax, and
serially sectioned at 5 µm. Every fifth section was mounted on a glass slide and stained
85
with hematoxylin – eosin (HE). All sections were examined using a light microscope
(Nikon, Tokyo, Japan) at a magnification of x 400. For each treatment, 30 preantral
follicles were analyzed per repetition. Only preantral follicles with visible nuclei were
counted. Preantral follicles (one or more layers of granulosa cells and no antral cavity)
were classified as morphologically normal if they presented intact oocyte and granulosa
cells. The follicles were considered degenerated if they contained a pyknotic oocyte
nucleus or shrunken ooplasm, with or without disorganized granulosa cells and/or
detachment of the basement membrane (Rodrigues et al. 2004).
2.2.3 Viability analysis of preantral follicles
The effect of cryopreservation on the viability of preantral follicles was studied.
Based on histological analysis, goat ovarian tissue were obtained from adult goats (n =
5) and cryopreserved using the CPA that better preserved the follicular morphology.
The preantral follicles were isolated from the fresh control or the frozen/thawed ovarian
fragments using the mechanical method described by Lucci et al. (1999), with some
modifications. Briefly, with a tissue chopper (the Mickle Laboratory Engineering Co.,
Gomshal, Surrey, UK) adjusted to a sectioning interval of 75 µm, samples were cut into
small pieces and placed in 2 ml MEM supplemented with 3 mg/ml bovine serum
albumin (BSA). Samples were then pipetted 100 times using a large Pasteur pipette
(1600 µm) and 100 times with a smaller Pasteur pipette (600 µm) to dissociate preantral
follicles from stroma. The resulting suspension was filtered through 200 µm nylon mesh
filters.
Preantral follicles found in the suspension were then transferred to 100 µl
droplets of MEM. Thereafter, the viability of the preantral follicles (< 200 µm) was
86
assessed using a two-color fluorescent cell viability assay, which allowed for
simultaneous detection of live and dead cells by calcein-AM and ethidium homodimer-1
probes, respectively. Calcein-AM revealed intracellular esterase activity of viable cells;
ethidium homodimer-1 labeled nucleic acids of non-viable cells, which indicated
disruption of the plasma membrane. The test was performed by adding 4 µM calcein-
AM and 2 µM ethidium homodimer-1 (Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe,
Germany) to each drop of MEM that contained the isolated follicles. Samples were then
incubated at 37 °C for 15 min. After labeling, preantral follicles were classified as
viable if the cytoplasm of the oocytes and granulosa cells was stained with calcein-AM
(green) and chromatin was not stained with ethidium homodimer (red), and otherwise
they were considered non-viable (stained in red with ethidium homodimer-1) (Figure 1),
Images were obtained using an inverted microscope (Nikon, Tokyo, Japan) at a
magnification of 400 x. The wavelengths used for excitation/emission were 458/515 nm
for calcein AM and 525/ 590 for ethidium homodimer-1.
2.3 Experiment 2: In vitro culture of preantral follicles enclosed in ovarian cortex
frozen/thawed
2.3.1. Experimental design
Using the results of experiment 1, we defined an experimental protocol for
experiment 2 to assess the survival, ultrastructure and viability of cryopreserved
preantral follicles after short-term in vitro culture (48 h). After dissection of the goat
ovaries (n = 10), 14 fragments (9 mm3) were obtained from each ovarian pair. One
fragment was immediately fixed for histological examination and transmission electron
87
microscopy (TEM); this fragment represents the fresh control (control 1). Another
fragment was also randomly taken for the in vitro culture (cultured control non-
cryopreserved: control 2). The remaining fragments (n = 12) were cryopreserved in
triplicate, using one of four treatments. We utilized the four CPA-containing freezing
solutions that gave the best results in experiment 1, as defined by morphological and
viability by fluorescence. After thawing, one fragment from each treatment (DMSO
with or without sucrose and/or FCS) was histologically examined, and the other two
fragments were cultured in vitro. At the end of the culture period, the fragments were
subjected to histological analysis, ultrastructural analysis and viability assessment using
fluorescent markers. From each fragment reserved for histological analysis, a small
sample was removed and fixed for TEM.
For the 48 h in vitro culture, ovarian fragments were separately transferred to a
24-well culture dish (Corning, NY, USA), which contained 1 ml of culture medium per
well. The culture medium consisted of αMEM supplemented with ITS (1.0 µg/ml
insulin, 0.55 µg/ml transferrin and 5 ng/ml selenium), 50 ng/ml follicle-stimulating
hormone (FSH), 50 µg/ml ascorbic acid, 2 mM glutamine, 2 mM hypoxanthine, 1.25
mg/ml BSA, 100 µg/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Ovarian tissues were
cultured at 39 °C in an atmosphere of 5% CO2 in air.
2.3.3 Ultrastructural analysis
For a more in-depth evaluation of follicular morphology after histological
analysis, ultrastructural studies were performed on fragments from fresh, cultured
control and cryopreserved/cultured groups. A portion of tissue, with a maximum
dimension of 1 mm3, was cut from each fragment of ovarian tissue. The tissue was then
88
fixed in Karnovsky solution (4% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M
sodium cacodylate buffer at pH 7.2) for 4 h at room temperature. After two washes in
the sodium cacodylate buffer, specimens were post-fixed in 1% osmium tetroxide and
0.8% potassium ferricyanide in 0.1 M sodium cacodylate buffer for 1 h at room
temperature. The samples were dehydrated through a gradient of acetone solutions and
then embedded in Spurr resin. Afterward, semi-thin sections (4 µm) were cut, stained
with toluidine blue and analyzed by light microscopy at 400 x magnification. Ultra-thin
sections (70–75 nm) were obtained from preantral follicles, which were classified as
morphologically normal in semi-thin sections, according to standard histological
criteria. Subsequently, ultra-thin sections were examined under a transmission electron
microscope (Jeol JEM 1011) operating at 80 kV. The density and integrity of the
ooplasmic and granulosa cells and organelles were evaluated. We also assessed
vacuolization and membrane integrity of the samples.
2.4 Statistical analysis
Percentages of morphologically normal follicles observed in both assays were
initially subjected to Shapiro-Wilk and Bartlett’s tests to confirm normal distribution
and homogeneity of variance, respectively. Results obtained from the first assay were
then submitted to analysis of variance using the PROC GLM procedure of SAS (SAS
Inst. Inc., Cary, NC, USA); a 3×3 factorial arrangement of treatments was used, and
cryoprotectant (EG, PROH or DMSO) and supplementation (with sucrose, FCS or both)
were employed as the main effects. Ovarian fragments were considered as the
experimental units. The model was used: Yij=µ+Ci +Sj+(Ci×Sj)+eij, where Yijk =
dependent variable (percentage of morphologically normal preantral follicles), µ=
89
general mean; Ci = Cryoprotectant, Sj = Supplementation, Ci×Sj = interaction between
cryoprotectant and supplementation and eij = residual error. The second assay was
performed according to a 2×2×3 factorial arrangement of treatments, with medium (with
or without DMSO), procedure (only cryopreservation and cryopreservation followed by
culture) and supplementation (with sucrose, FCS or both supplements) used as the main
effects. The following model was used: Yijk=µ+Mi+Pj+Sk+(Mi×Pj)+(Pj×Sk)+eijk, where
Yijk = dependent variable, µ= general mean; Mi = Medium with or without DMSO, Pj =
Procedure, Sk = Supplementation, Mi×Pj = interaction between medium and procedure,
Pj×Sk = interaction between procedure and supplementation and eijk = residual error.
When any main effect or interactions was significant, the means were separated by
Student-Newman-Keuls test. For evaluation of viability using fluorescent markers,
follicles were taken as a pool and analyzed for dispersion of frequency with Chi-square
test. In all cases, differences were considered to be significant when P<0.05, and the
results were expressed as mean + standard deviation (SD).
3. Results
3.1 Experiment 1: Determination of the slow freezing solution for ovarian tissue
Using histological analysis, a total of 1950 preantral follicles, taken from 13
treatment groups, were morphologically evaluated. Figure 2 shows the percentage of
morphologically normal preantral follicles enclosed in fresh ovarian fragments and
those in fragments subjected to freezing with EG, PROH or DMSO supplemented or not
witch sucrose and/or FCS. The percentage of morphologically normal follicles in the
fresh control (non-cryopreserved tissue) was 85.5%. After cryopreservation, there was a
90
significant decrease (P < 0.05) in the percentage of morphologically normal follicles, as
compared to the control. However, this decline in the number of normal follicles was
not seen when the ovarian tissue was cryopreserved in a freezing solution containing
DMSO alone (69.3%) or associated with FCS (70.0%). However, when the
cryopreservation treatments were compared to each other, no significant difference was
observed.
The follicular viability, detected by fluorescent markers, was determined in
follicles from the fresh tissue and after cryopreservation with DMSO with or without
supplementation in the absence or presence of sucrose and/or FCS. The percentage of
viable follicles found in the fresh control (97.7%), DMSO (96.0%), DMSO plus sucrose
(100.0%), FCS (100.0%) or both (100.0%) did not significantly differ (P > 0.05).
3.2 Experiment 2: In vitro culture of preantral follicles enclosed in ovarian cortex
frozen/thawed
The percentages of morphologically normal preantral follicles observed in the
fresh control, cultured control, and after cryopreservation with DMSO (with sucrose
and/or FCS), with or without 48 h of in vitro culture (Figure 3), are shown in Table 1.
In the cultured control, we observed a reduction in the percentage of
morphologically normal follicles (64.2%), as compared to the fresh control (90.8%). The
interaction between the procedure of cryopreservation and in vitro culture no showed
significant effect, ie, the percentage of morphologically normal follicles remained similar
to the cultured control (P > 0.05). Moreover, no significant difference between the
percentage of morphologically normal follicles was observed when ovarian tissue was
only cryopreserved and after in vitro culture prior cryopreservation.
91
3.3 Ultrastructure analysis of goat preantral follicles
Only goat preantral follicles from the fresh control, cultured control, and those
cryopreserved in freezing solution containing DMSO and FBS followed by in vitro
culture were found to be morphologically normal by ultrastructural analysis. These
follicles showed intact granulosa cells, finely granulated ooplasm, intact and abundant
organelles, rare vacuoles and an absence of nuclear changes (Figures 4; 5E and F). In
contrast, follicles cultured after cryopreservation with only DMSO exhibited few
vacuoles and irregular or turgid mitochondria (Figure 5 A and B).
Regardless of the presence of FCS, the addition of sucrose to the freezing
medium resulted in ultrastructural changes such as detachment of granulosa cells,
swelling of the mitochondria and endoplasmic reticulum, and alteration in the nuclear
membrane with segregation of the lipid bilayer. These changes can be observed in
Figures 4 C, D, G and H.
The fluorescent viability analysis of the in vitro cultured preantral follicles
revealed that only the freezing solution containing DMSO supplemented with FCS
(75.6%) was able to maintain a percentage of viable follicles similar to the cultured
control (89.3%). Otherwise, follicular viability was significantly reduced when ovarian
tissue was cryopreserved in freezing solutions containing only DMSO, DMSO +
sucrose or DMSO + sucrose + FCS, as compared with ovarian tissue cultured without
cryopreservation. Furthermore, the follicular viability of tissue cryopreserved with a
freezing solution containing only DMSO was significantly inferior to the solution
containing DMSO supplemented with FCS (P < 0.05, Table 2).
92
4. Discussion
In this study, 12 freezing solutions composed of different CPAs (EG, PROH
and DMSO) and with or without sucrose and/or FBS were used to cryopreserve goat
ovarian tissue. For the first time, it was demonstrated the need for the addition of FCS,
freezing solution containing 1,0 M of DMSO, to maintain the viability and
ultrastructure of preantral follicles enclosed in goat ovarian tissue, which has been
cryopreserved and cultured in vitro for a short period (48 h).
In the first experiment, in which the efficiency of three different intracellular
CPAs was investigated, we found that only the solutions containing DMSO, with or
without FCS, retained a follicular morphology similar to that observed in non-
cryopreserved tissue. Previous studies have reported success using EG (Faustino, 2009) or
PROH (Luz et al., 2010). However, in the present study, DMSO was more effective; it was
the only CPA that maintained a follicular morphology similar to that found in the fresh
control.
The effects of ovarian tissue freezing on the preantral follicles are typically
evaluated immediately after thawing. However, following cryopreservation, molecular
changes may occur and manifest themselves with the resumption of metabolism and
follicular development (Siebzehnrübl et al., 2000). Studies have shown that short-term
culture can be used as a valuable tool to verify the developmental ability of
cryopreserved preantral follicles (Choi et al 2008, Amorim et al., 2009). Based on these
studies, we used short-term in vitro culture as an additional tool to precisely evaluate the
follicular cryopreservation procedure. After in vitro culture for 48 hours, no difference
in the percentage of morphologically normal follicles was observed between fragments
that were cultured or cryopreserved/cultured. The cryopreservation procedure may
93
promote several follicular changes, including loss of cell and membrane integrity,
decrease in mitochondrial activity (Santos et al., 2006b) and damage to the cytoskeleton
(Smith et al., 2004). These changes usually lead to degeneration, with loss of typical
configuration, which prevents the identification of these follicles after culture (Sheikh et
al., 2011). Thus, only normal or minimally damaged follicles are displayed.
In this study, the analysis of viability showed no difference between the control
and other treatments immediately after thawing. However, after 48 h of in vitro culture,
only the ovarian tissue cryopreserved with DMSO and FCS maintained a percentage of
viable follicles similar to the cultured control. These findings are consistent with other
studies that demonstrate the importance of FCS for both cryopreservation and in vitro
culture (Abedelahi et al., 2008). This may be due to the role of FCS as a survival factor
and a promoter of follicular development (Mao et al., 2002; Basso et al., 2007).
Specifically for cryopreservation, FCS has the ability to alter the physiological
membrane permeability (Marco-Jiménez et al., 2006), and provides protection to the plasma
membrane, since the amino acids of proteins contained in serum interact electrostatically with
the phosphate groups in the membrane phospholipids, (Anchordoguy et al., 1988; Picton et
al., 2008).
The ultrastructural evaluation revealed normal preantral follicles after culture
of ovarian tissue previously frozen in DMSO and FCS. On the other hand, the addition
of 0.1 M sucrose, with or without FCS, resulted in ultrastructural changes such as
swollen organelles (mitochondria and endoplasmic reticulum), cytoplasmic
vacuolization and loss of nuclear membrane integrity. These modifications may result
from an osmotic imbalance, as previously described in human ovarian tissue
cryopreserved in the presence of sucrose (Fabri et al., 2010). Santos et al. (2006b)
suggested that when ovarian tissue is cryopreserved in a solution containing sucrose, the
94
sugar facilitates proper cell rehydration during thawing and cryoprotectant removal.
However, if cryoprotectant removal occurs too slowly, the CPA can remain in the
tissues for an extended period, which results in deleterious effects on the follicle cells.
The results of our study are consistent with other studies that evaluated the effect of
sucrose in cryopreservation solutions. Using 0.2 or 0.3 M sucrose, Marsella et al. (2008)
observed poor follicular preservation associated with wide and irreversible stromal cells
degeneration, which was likely due to the osmotic shock. Structural damages were also
observed in human follicles after ovarian tissue cryopreservation in the presence of
higher (0.3 M) sucrose concentrations (Fabbri et al., 2010). We believe that the
concentration of 0.1 M used in the present study promoted excessive follicular
dehydration. These results demonstrate that, under these experimental conditions,
sucrose is unnecessary in the freezing solution. However, do not discard the possibility
of lower concentrations than 0.1 M and the adding of multi-step, can be beneficial when
added to the cryopreservation solution.
The results of this study allowed us to conclude that a freezing solution
containing DMSO and FCS was efficient for ovarian tissue preservation, under
experimental conditions tested, and ensured the maintenance of follicular viability and
ultrastructure after 48 h of in vitro culture.
95
References
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Figure captions
Figure 1 Isolated viable preantral follicle labeled by calcein
(A) and non-viable preantral follicle labeled by ethidium homodimer
fluorescence) (B).
Figure 2 Percentage (mean
(fresh control) and after slow
0.05).
Figure 1 Isolated viable preantral follicle labeled by calcein-AM (green flourescence)
viable preantral follicle labeled by ethidium homodimer
Figure 2 Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles before
(fresh control) and after slow-freezing. *Differs significantly from the fresh control (
99
AM (green flourescence)
viable preantral follicle labeled by ethidium homodimer-1 (red
SD) of morphologically normal preantral follicles before
freezing. *Differs significantly from the fresh control (P <
Figure 3 Histological sections of preantral follicles in which morphologically normal in
(A) fresh tissue, (B) cultured tissue no
DMSO added fetal calf serum are shown. (D) Degenerating preantral follicles after in
vitro culture of tissue predicting cryopreservation in freezing solution contain DMSO
without supplementation, (E) supplemented w
serum. Arrows indicate oocyte retraction and pyknotic nucleus.
Figure 3 Histological sections of preantral follicles in which morphologically normal in
(A) fresh tissue, (B) cultured tissue no cryopreserved and (C) cryopreserved with
DMSO added fetal calf serum are shown. (D) Degenerating preantral follicles after in
vitro culture of tissue predicting cryopreservation in freezing solution contain DMSO
without supplementation, (E) supplemented with sucrose and (F) sucrose/fetal calf
serum. Arrows indicate oocyte retraction and pyknotic nucleus.
100
Figure 3 Histological sections of preantral follicles in which morphologically normal in
cryopreserved and (C) cryopreserved with
DMSO added fetal calf serum are shown. (D) Degenerating preantral follicles after in
vitro culture of tissue predicting cryopreservation in freezing solution contain DMSO
ith sucrose and (F) sucrose/fetal calf
Figure 4 Goat preantral follicles from the fresh cont
D). In A, a well-preserved preantral follicle can be observed with intact granulosa cells
and cytoplasmic content without any sign of organelles loss. (B) In a high
magnification, note that ooplasm is finely granular an
preserved without any sign of vacuolization. In C, several vacuoles were observed in
ooplasm of cultured follicles, however note the intact nuclear membrane in D. GC:
Goat preantral follicles from the fresh control (A, B) and cultured control (C,
preserved preantral follicle can be observed with intact granulosa cells
and cytoplasmic content without any sign of organelles loss. (B) In a high
magnification, note that ooplasm is finely granular and the mitochondria are well
preserved without any sign of vacuolization. In C, several vacuoles were observed in
ooplasm of cultured follicles, however note the intact nuclear membrane in D. GC:
101
rol (A, B) and cultured control (C,
preserved preantral follicle can be observed with intact granulosa cells
and cytoplasmic content without any sign of organelles loss. (B) In a high
d the mitochondria are well-
preserved without any sign of vacuolization. In C, several vacuoles were observed in
ooplasm of cultured follicles, however note the intact nuclear membrane in D. GC:
102
granulosa cells; O: oocyte; nu: nucleus; m: mitochondria; er: endoplasmic reticulum; *
vacuole. Scale bar: 2 µm (A, C) 1µm (B, D).
103
104
Figure 5 Goat preantral follicles after cryopreservation with freezing solution containing
DMSO alone (A, B) and DMSO added by sucrose (C, D), fetal calf serum alone (E, F)
or fetal calf serum in combination with sucrose (G, H), followed by in vitro culture for
48 h. In A, normal granulosa cells are showed; however a vacuolated ooplasm can be
observed. In B and C, note alterations as detachment between granulosa cells and
oocyte, in D irregular mitochondria and swollen endoplasmic reticulum are showed in
the oocyte, besides the nuclear membrane thickening. (E) Note normal ooplasm finely
granulated and abundant organelles. (F) Intact nuclear membrane and normal
mitochondria and endoplasmic reticulum. (G) Normal granulosa cell and oocyte with an
irregular nucleus. (H) Oocyte with swollen mitochondria and vacuolated ooplasm. GC:
granulosa cells; O: oocyte; nu: nucleus; m: mitochondria; er: endoplasmic reticulum; *
vacuole. Scale bar: 2 µm (A, C, E, G) 1µm (B, D, F, H).
Table 1 Percentage (mean
ovarian tissue from the fresh control and after cryopreservation, followed or not by
short-term in vitro culture (48 h). *Differs signific
0.05).
Table 2 Percentage (mean ±
h before (cultured control) and after cryopreservation in DMSO added or not by sucrose
and/or fetal calf serum. a,b,c
Table 1 Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles in goat
ovarian tissue from the fresh control and after cryopreservation, followed or not by
term in vitro culture (48 h). *Differs significantly from the fresh control (
± SD) of viable preantral follicles after in vitro culture for 48
h before (cultured control) and after cryopreservation in DMSO added or not by sucrose
Differs significantly (P < .05).
105
SD) of morphologically normal preantral follicles in goat
ovarian tissue from the fresh control and after cryopreservation, followed or not by
antly from the fresh control (P <
SD) of viable preantral follicles after in vitro culture for 48
h before (cultured control) and after cryopreservation in DMSO added or not by sucrose
106
7. CONCLUSÕES
A utilização de DMSO como agente crioprotetor intracelular demostrou ser
eficiente para a preservação do tecido ovariano caprino, mantendo a morfologia de
folículos pré-antrais semelhante à observada no tecido não criopreservado.
A adição de soro fetal bovino à solução de congelação lenta contendo 1,0 M de
DMSO proporcionou um efeito aditivo benéfico, garantindo a manutenção da
viabilidade e da ultraestrutura após 48 horas de cultivo in vitro.
107
8. PERSPECTIVAS
No presente estudo foi demonstrado que a solução de congelação contendo 1,0 M
de DMSO adicionado 10% SFB, como fonte protéica foi mais eficiente em manter a
morfologia, viabilidade e ultraestrutura de folículos pré-antrais inclusos em tecido
ovariano caprino, após 48 horas de cultivo in vitro. . O protocolo apresentado poderá ser
utilizado de forma rotineira para a preservação de folículos pré-antrais caprinos, visando
a implantação de bancos de germoplasma. Contudo, considerando a variabilidade no
tocante à composição do SFB, o qual varia entre partidas, recomenda-se a realização de
experimentos na tentativa de buscar uma fonte protéica, cuja composição seja
completamente conhecida. Alem disso, faz-se necessário a realização de cultivo de
longa duração, a fim de comprovar a capacidade do folículo previamente criopreservado
de crescer e se desenvolver in vitro até sua maturação.
108
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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