UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

CÂMPUS UNIVERSITARIO DE SINOP

INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS

EFEITO DA APLICAÇÃO DO BIOCARVÃO NOS ATRIBUTOS

MICROBIOLOGICOS DO SOLO, CULTIVADO COM TECA, NO BIOMA

AMAZÔNIA

Mirelly Mioranza

Engenheira Agrônoma

2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

CÂMPUS UNIVERSITARIO DE SINOP

INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS

EFEITO DA APLICAÇÃO DO BIOCARVÃO NOS ATRIBUTOS

MICROBIOLOGICOS DO SOLO, CULTIVADO COM TECA, NO BIOMA

AMAZÔNIA

Mirelly Mioranza

Orientador: Dr. Anderson Ferreira

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Agronomia, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Agronomia. Área de concentração: Ciências do Solo.

Fevereiro de 2016

DADOS CURRICULARES DO AUTOR

Mirelly Mioranza - filha de Gilmar Mioranza e Aparecida de Fátima

Montagneri Mioranza nasceu em 23 de Agosto de 1990, na cidade de

Amambai, estado de Mato Grosso do Sul. Em 2008 ingressou no curso de

Agronomia pela Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), campus

universitário de Sinop-MT, obtendo o titulo de Engenheira Agrônoma em 2013.

Ingressou no Curso de Pós Graduação em Agronomia - Ciência do Solo da

UFMT em março de 2014. Em março de 2014 ingressou no curso de Mestrado

em Agronomia pelo Programa de Pós-Graduação em Agronomia pela mesma

instituição, obtendo o título de Mestre em Agronomia em 2016.

Odiei as palavras e as

amei, e espero tê-las usado

direito.

Markus Zusak- The Book Thief

OFEREÇO

Aquele ao qual devemos toda honra e toda glória.

”Omnia possum in eo qui me confortat”

(Fp, 4,13)

DEDICO

Aos meus pais, Fátima e Gilmar Mioranza, pelo apoio, incentivo e pela confiança depositada em

mim ao longo desses anos. Amo vocês!

Uma pequena Teoria

As pessoas só observam as cores do dia no começo e no fim, mas, para mim, está muito claro

que o dia se funde através de uma multidão de matizes e entonações, a cada momento que

passa. Uma só hora pode consistir em milhares de cores diferentes.

Amarelos céreos, azuis borrifados de nuvens. Escuridões enevoadas.

No meu ramo de atividade, faço questão de notá-los.

Markus Zusak- The Book Thief

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, por me dar saúde, sabedoria e fé para a

concretização dos meus objetivos.

Aos meus pais, Gilmar Mioranza e Fátima, pelo incentivo, pela educação

que me proporcionaram e pelos princípios que me ensinaram. Por entenderem

minha ausência constante e acreditar no meu caminho, sabendo que essa é

mais uma etapa vencida na busca de um sonho.

Aos meus irmãos, Francielly e Marcos Vinicius por fazerem parte da

minha vida, cada um do seu jeito, mas cada qual com sua importância e

contribuição.

A Universidade Federal de Mato Grosso- Campus de Sinop e ao

Programa de Pós Graduação em Agronomia pela oportunidade de estudo

desde a graduação ate a realização deste Mestrado.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior –

CAPES e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso –

FAPEMAT, pela concessão da bolsa de estudo.

Aos professores do curso de Pós-Graduação em Agronomia, por todo o

conhecimento transmitido. Muito obrigada!

Ao meu orientador, Dr. Anderson Ferreira, pela orientação, pelo

incentivo, confiança e pela contribuição marcante na minha formação

profissional. Obrigada pela amizade também.

Obrigada a todos da Embrapa que de alguma forma tenham contribuído

com este projeto, em especial aos meninos do campo Enio e Tiago que sempre

nos ajudaram nos momentos ‘temidos’ de coleta. Sou muito grata a vocês.

Aos pesquisadores da Embrapa: Fabiana Rezende pela gerencia dos

recursos do projeto e Flavio Tardin pela paciência e as aulas de estatísticas.

Essas informações são valiosas.

Aos técnicos do laboratório de Biologia Molecular, Joyce e Bruno - sem

vocês essa pesquisa não seria possível.

Agradeço imensamente as minhas amigas agrônomas Kaynara

Kavasaki, Lana Bäumgartner e Tairiny Oliveira (não é agrônoma, mas te

considero pacas). Espero que nossa amizade seja eterna. Amo vocês!

Agradeço minha parceira de laboratório Jacqueline Jesus, pelo

companheirismo, pela amizade e confiança. Sem você esta jornada não teria a

mesma graça. E agora vai me aguentar por mais quatro anos, rumo ao

doutorado. Obrigada!

As minhas queridas Embrapianas, Andressa, Carol, Camila, Luana,

Maíra, Mari e Carolina (mamãe do João), pelos momentos de descontração,

pelos ‘coffees’, pelos ‘Happy Hour’ muito necessários. Enfim, obrigada por

fazerem desta jornada bem mais divertida! Arrasaram gatas!!

Aos estagiários da equipe “Pró- enzima”: Okada, Bruce, Vinicius, Junior

e Elisa. Sou muito grata a vocês, por me ajudarem sempre, mesmo tendo que

pesar solo toda vez que não dava certo. Vocês são demais. Obrigada,

obrigada!

Agradeço aos meus companheiros de viagem: Tati, Kaynara, Jacque,

Vini, Heitor, Lana e Andréia. Minhas “férias” foram muito mais divertidas com

vocês. Agradeço também aos novos amigos que fiz durante esses momentos.

Obrigada a todos do Grupo “Tudo Junto e Misturado”. Quem tem

amigos, nunca esta só. Vocês são demais!!

A todos que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização

deste trabalho.

E por fim, agradeço a banda Engenheiros do Hawaii pelas musicas

inspiradoras. Vocês permitiram que eu concluísse as analises de DGGE. Valeu!

Meus Sinceros Agradecimentos!!!

SUMÁRIO

RESUMO ......................................................................................................... 12

ABSTRACT ...................................................................................................... 13

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ................................................... 14

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 14

2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................ 16

2.1. Teca (Tectona grandis Linn f) ............................................................... 16

2.2. Origem do biocarvão ............................................................................. 17

2.2.1. Biocarvão e a sua interação com o solo ........................................ 19

2.3. Qualidade do solo ................................................................................. 23

2.4. Microbiota do Solo ................................................................................ 24

2.5. Indicadores Microbiológicos do solo ..................................................... 24

2.5.1. Atividade Enzimática ...................................................................... 25

2.5.2. Diversidade Microbiana através da técnica de DGGE ................... 26

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 27

CAPÍTULO 2 – Efeito da aplicação do biocarvão nos atributos

microbiologicos do solo, cultivado com teca, no bioma amazônia ........... 37

RESUMO ......................................................................................................... 37

1.INTRODUÇÃO .............................................................................................. 38

2. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 40

2.1. Descrição da Área de Estudo ................................................................ 40

2.2. Plantio da Teca ..................................................................................... 41

2.3. Produção do Biocarvão ......................................................................... 41

2.4. Tratamentos .......................................................................................... 42

2.5. Área de Referência ............................................................................... 42

2.6. Amostragem de solo ............................................................................. 43

2.7. Umidade e pH do solo ........................................................................... 43

2.8. Atividade Enzimática ............................................................................. 43

2.9.Caracterização da comunidade de bactérias (gene 16S rDNA) ............. 44

2.9.1. Extração de DNA e Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) ...... 44

2.9.2. Gel em Eletroforese com Gradiente Desnaturante (DGGE) .......... 45

2.10. Análise Estatística ............................................................................... 46

4. RESULTADOS ............................................................................................. 47

4.1. Atividade Enzimática, pH e umidade do solo ........................................ 47

4.2. Diversidade bacteriana (Índice de Shannon) ........................................ 49

4.3. Estrutura da comunidade de bactérias totais (gene 16S rDNA) ............ 50

4.4. Relação das alterações nas comunidades microbianas com atributos do

solo. .................................................................................................................. 52

5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 55

6. CONCLUSÃO ............................................................................................... 61

7. AGRADECIMENTOS ................................................................................... 62

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 62

9. ANEXOS ...................................................................................................... 68

EFEITO DA APLICAÇÃO DO BIOCARVÃO NOS ATRIBUTOS

MICROBIOLOGICOS DO SOLO, CULTIVADO COM TECA, NO BIOMA

AMAZÔNIA

RESUMO - O biocarvão é o produto formado a partir da decomposição térmica da biomassa, em ambiente fechado, através de suprimento limitado de oxigênio e de temperaturas relativamente baixas e utilizado como condicionador de solo. O objetivo desta pesquisa foi avaliar o uso do biocarvão como condicionador do solo e seu efeito na atividade da β-glicosidase, fosfatase ácida e diversidade bacteriana do solo em experimento de Teca com três e quinze meses de duração, em um latossolo vermelho-amarelo, localizados em Sinop - Mato Grosso, Brasil. Os tratamentos consistiram de: T1- Muda sem biocarvão; T2- Muda com biocarvão; T3- Muda sem biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T4- Muda com biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T5- Muda sem biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo; T6- Muda com biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo. Foi determinada a atividade de duas enzimas relacionadas ao ciclo do C e P e a biodiversidade bacteriana foi avaliada por meio da técnica de DGGE com iniciadores universais para a região 16S rDNA de bactérias. Não houve incremento na atividade da β-glicosidase quinze meses após aplicação do biocarvão, mas sua forma ativada proporcionou a maior atividade desta enzima, ao contrário a fosfatase ácida apresentou uma baixa atividade nos primeiros 3 meses e após quinze meses com aplicação do biocarvão no solo a atividade desta enzima foi maior. Em relação à umidade e pH do solo, não foi alterado pela presença do biocarvão. A estrutura e diversidade da comunidade bacteriana no solo sofreram influencia mais acentuada do biocarvão com quinze meses de aplicação no solo. Palavras-chave: DGGE, condicionador de solo, β-glicosidase, fosfatase ácida, ecologia microbiana

EFFECT OF APPLICATION OF BIOCHAR ON MICROBIOLOGICAL SOIL

PROPERTIES, CULTIVATED WITH TECA, IN THE AMAZON BIOME

ABSTRACT – The biochar product is formed from the thermal decomposition of

biomass in a closed environment by limited supply of oxygen and at relatively

low temperatures and used as a soil conditioner. The aim of this study was to

evaluate the use of biochar as a soil conditioner and its effect on the β-

glucosidase activity, acid phosphatase and bacterial diversity in soil Teak

experiment with fifteen and three months duration in a oxisol, located in Sinop -

Mato Grosso, Brazil.The treatments were: T1 seedling without biocarvão ; T2

seedling with biocarvão; T3 seedling without biocarvão + activated biocarvão

applied to the soil; T4 seedling with biocarvão + activated biocarvão applied to

the soil; T5- seedling without biocarvão + biocarvão not activated applied to the

soil; T6- seedling with biocarvão + biocarvão not activated applied to the soil. It

determined the activity of two enzymes related to the cycle C and P and

bacterial biodiversity was evaluated by DGGE technique using universal

primers for the bacterial 16S rDNA region. There was no increase in the activity

of β-glucosidase fifteen months after application of biochar, but its activated

form accompanied by increased activity of this enzyme, unlike the acid

phosphatase had a low activity in the first 3 months and after fifteen months on

application of biochar in the soil the activity of this enzyme was higher. With

regard to moisture and soil pH was not altered by the presence of biochar. The

structure and diversity of the bacterial community in the soil suffered more

pronounced influence of biochar fifteen months of soil application.

KEYWORDS: DGGE, soil conditioner, β-gluicosidase, acid phosphatase, microbial ecology

14

CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS

1. INTRODUÇÃO

Em ambientes tropicais, o processo de degradação dos solos encontra-

se intimamente relacionado à dinâmica da matéria orgânica (CAMARGO,

1999). Diversos autores têm ressaltado que a converção da vegetação nativa

em área de produção agrícola pode reduzir drasticamente os teores de matéria

orgânica e consequentemente alterando a qualidade dos solos, principalmente

no Cerrado/Amazônia, devido ao menor suprimento de resíduos orgânicos e ao

aumento na taxa de decomposição (FREIXO et al., 2002; BAYER et al., 2004;

CHEN et al., 2004; MACEDO et al., 2008).

Os microrganismos são a parte viva e mais ativa da matéria orgânica do

solo, e são muito importantes nos processo de decomposição de resíduos,

ciclagem de nutrientes, fixação biológica do nitrogênio, decomposição de

material mineral, solubilização de nutrientes, formação da matéria orgânica e

estrutura do solo (ZILLI et al., 2003; KARLEN et al., 2003). Em condições

naturais os solos tropicais, possuem baixa fertilidade natural, porém

características físicas e biológicas favoráveis. Uma vez incorporados ao

processo produtivo, para que proporcionem condições adequadas ao

crescimento das plantas cultivadas, é necessário o aumento da sua fertilidade

química, por meio de calagens, gessagens e adubações (CORAZZA et al.,

2004).

O cultivo agrícola, entretanto, promove alterações em atributos físicos,

químicos e biológicos, com o passar dos anos (BAYER et al., 1999). Assim,

mesmo que uma área cultivada apresente fertilidade química mais elevada do

que uma área sob vegetação nativa, e essa fertilidade seja adequada para

obtenção de produtividades elevadas, outros atributos do solo serão alterados,

o que pode comprometer a eficiência dos sistemas e a sustentabilidade dos

sistemas de produção implantados (SILVA et al., 2009).

Atualmente, a fronteira agrícola brasileira está inserida dentro da

Amazônia Legal, particularmente, as maiores áreas estão no estado de Mato

15 Grosso (DOMINGUES E BERMANN, 2012). Nesse sentido, novas alternativas

para manter o manejo adequado e conservação da qualidade de solos devem

ser exploradas como, por exemplo, uso de biocarvão como condicionadores de

solos. Para regiões como o Cerrado e áreas de transição com Amazônia, onde

as praticas de queimadas são comuns, a quantidade e a qualidade de MOS ao

passar do tempo podem ser influenciadas pela produção de carvão vegetal,

que representa uma fração de carbono orgânico total (COT), estável no solo

(FONTANA, 2006).

Biocarvão é o produto da combustão incompleta de restos de material

orgânico ou de culturas voltadas à sua produção. Possui alto teor de C e

grande área superficial devido a sua porosidade em consequência do processo

de queima na ausência do oxigênio (MADARI at al., 2009). Apresenta baixo

teor de nitrogênio, o que resulta em uma elevada relação de C:N. Segundo Bird

et al. (1999), o biocarvão pode ser significativamente degrado em uma escala

de décadas ou milhares de anos em solos tropicais. A biodegradação do

biocarvão no solo é um processo relativamente lento que resulta na

mobilização do carbono e na alteração das propriedades da superfície do

carvão, aumentando a concentração de sítios quimicamente reativos que

podem fazer ligações com os nutrientes presentes e contribuírem para

aumentar a CTC do solo. (GLASER et al., 2003).

Dentre os possíveis benefícios ambientais que podem ser alcançados

com uso de biocarvão podemos citar: (1) mitigação nas mudanças do clima; (2)

melhoria na fertilidade dos solos; e (3) redução da poluição ambiental

(LEHMANN et al., 2011). Devido a sua enorme importância na manutenção da

produtividade dos ecossistemas agrícolas e florestais, torna-se cada vez mais

frequentes as pesquisas que colaboram para um melhor entendimento sobre

as propriedades microbiológicas dos solos. Nesse ponto, conhecer a

quantidade, diversidade e atividade do componente microbiológico do solo,

pode auxiliar no entendimento das mudanças no balanço de carbono e fluxo de

energia, na ciclagem de nutrientes e na sua fertilidade, pois a atividade e

biomassa microbiana são consideradas indicadores importantes de degradação

do solo (RIBEIRO, 2012).

Dessa maneira, objetiva-se manter o carbono orgânico no solo,

utilizando o biocarvão, através da avaliação de alguns atributos microbiológicos

16 em cultivo com Teca no interior do Mato Grosso, como condicionador dos solos

tropicais.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Teca (Tectona grandis Linn f)

A espécie Tectona grandis Linn f., popularmente conhecida como Teca

(Brasil) ou Teak (Índia), é uma espécie arbórea natural das florestas do

sudoeste asiático (SÁNCHEZ, 2002). Esta arvore pertence à família

Lamiaceae, é uma espécie arbórea decídua da floresta tropical, caducifólia que

perde suas folhas na estação seca, apresenta um fuste cilíndrico que pode

alcançar alturas maiores que 25 m quando cresce em condições

edafoclimáticas favoráveis (SHIMIZU et al., 2007).

O bom crescimento e alta qualidade da madeira estão associados a

alguns fatores ambientais, tais como, a profundidade do solo, a capacidade de

retenção de água, solos com boa drenagem, ricos em cálcio, relevo suave e

fertilidade mediana. A teca se desenvolve melhor com precipitações anuais

variando de 1250 a 3750 mm e temperaturas que oscilam entre os 13°C e

37°C, desenvolvendo-se melhor aos 25ºC (SETH & KAUL, 1978).

O plantio de teca, tem se mostrado nos últimos anos como uma das

grandes essências florestais de cultivo intensivo no Brasil, sobretudo no Estado

de Mato Grosso, com mais de 48.000 hectares de área cultivada, conforme

constatado por Shimizu et al. (2007). Neste Estado, o cultivo de Teca está em

franca expansão, tendo em vista o alto valor comercial de sua madeira,

associado às condições edafoclimáticas favoráveis encontradas em diversas

regiões (ÂNGELO et al.,2009).

A área de florestas plantadas com teca no Brasil atingiu, em 2009,

estimados 65.240 ha, enquanto em 2008 o total foi de 58.810 ha. Tais áreas

representam crescimento de 10,9% na área plantada deste grupo de espécies

no país indicando o interesse crescente por tal gênero florestal, principalmente

em função das expectativas de retorno financeiro em projetos com a mesma

17 (ABRAF, 2010). Atualmente, os plantios totalizam 67.329 ha e representam

apenas 0,4% da produção de madeira plantada no Brasil (ABRAF, 2013).

A produtividade média obtida para teca está na ordem de 15 m³/ha.ano,

representando uma produção estimada de 0,7 milhões de m³ por ano dividida

entre a Região Norte (32,6%) e Centro-oeste (67,4%) (ABRAF, 2013). Segundo

Finger et al., (2001), a produção mundial de madeira de teca é estimada em 3

milhões de m³/ano, o que é extremamente baixa pela demanda atual dessa

espécie no mercado exterior. No momento, o reflorestamento com teca no

Brasil surge como uma ótima opção de investimento.

2.2. Origem do biocarvão

O biocarvão (biochar) é o produto da degradação térmica de materiais

orgânicos na ausência de ar (pirólise) e difere do carvão vegetal devido sua

aplicação como condicionador de solo (LEHMANN et al., 2011).

O biocarvão é o produto formado a partir da decomposição térmica da

biomassa, em ambiente fechado, através de suprimento limitado de oxigênio e

de temperaturas relativamente baixas (<700ºC) (LEHMANN E JOSEPH, 2009).

E de acordo com Sohi et al. (2010), o biocarvão apenas deve ser utilizado

quando existir potencial para: melhorar a qualidade do solo, a produtividade

agrícola e contribuir para a mitigação da emissão de gases do efeito estufa a

longo prazo.

Solos antropogênicos são formados através de milhares de anos, devido

à decomposição térmica do material vegetal e a continua reposição da matéria

orgânica no solo. O biocarvão esta normalmente relacionada com estes solos,

por sua semelhança no processo de formação, sugere-se também uma

conexão com a “Terra Preta de Índio” (TPI), um solo altamente fértil encontrado

na Amazônia, devido principalmente à alta capacidade de troca de cátions

(CTC), aos altos teores de matéria orgânica e nutrientes como fósforo,

potássio, nitrogênio e cálcio (NOVOTNY et al., 2009).

No Brasil, exemplo do efeito benéfico do biocarvão (ou carbono

pirogênico) para a fertilidade dos solos tropicais são os solos chamados de

terra preta de índio (ou terra preta arqueológica), que são solos antrópicos dos

18 povos pré-colombianos da Bacia Amazônica (KAMPF E KERN, 2005). Esses

solos contêm elevado teor de carbono pirogênico que chega a ser 2,5 vezes

maior que o teor desse material em solos adjacentes não antrópicos. Esse

carbono, que provavelmente se originou de queimas periódicas de lavouras e

resíduos da atividade diária previamente carbonizada, foi incorporado ao solo

pelo homem e pela atividade biológica no solo durante centenas ou milhares de

anos.

Evidencias indicam de que as TPI são depósitos culturais criados a partir

de adição de artefatos como peças de cerâmicas, ferramentas de pedras e

carvão ao redor das áreas habitadas e da manipulação de material orgânico

em áreas associadas ao cultivo. O fogo é um componente crucial na formação

desses solos por contribuir na forma de carvão e cinza, o que aumenta o pH do

solo (devido aos carbonatos presentes nas cinzas vegetais) e suprime a

toxidade do alumínio nas raízes vegetais e microbiota do solo (TEIXEIRA et al.,

2010; GLASER et al., 2001; GLASER et al., 2002).

O solo amazônico é geralmente arenoso ou argiloso, tem pouco

nutriente e apresenta uma fina camada superficial de húmus, proveniente das

florestas. Contudo em algumas regiões amazônicas são encontradas manchas

profundas de solos, escura e muito fértil, ao contrário do que é normalmente

encontrado em quase toda região. O aumento da atividade biótica e da

capacidade de retenção de nutrientes através da deposição de material

orgânico e carvão vegetal pode ser a principal razão pela persistência desses

solos, por um longo período de tempo mesmo após o término do seu manejo

cultural (TEIXEIRA et al., 2010).

Para regiões como o Cerrado e áreas de transição com Amazônia, onde

as praticas de queimadas são comuns, a quantidade e a qualidade de MOS ao

passar do tempo podem ser influenciadas pela produção de carvão vegetal,

que representa uma fração de carbono orgânico total (COT), estável no solo

(FONTANA, 2006). Biocarvão (BC) é o produto da combustão incompleta de

restos de material orgânico ou de culturas voltadas à sua produção, apresenta

baixo teor de nitrogênio, o que resulta em uma elevada relação C:N e possui

alto teor de C e grande área superficial devido a sua porosidade em

consequência do processo de queima na ausência do oxigênio (MADARI et al.,

2009).

19

Segundo Bird et al. (1999), o BC pode ser significativamente degradado

em uma escala de décadas ou milhares de anos em solos tropicais. A

biodegradação do BC no solo é um processo relativamente lento que resulta na

mobilização do carbono e na alteração das propriedades da superfície do

carvão, aumentando a concentração de sítios quimicamente reativos que

podem fazer ligações com os nutrientes presentes e contribuírem para

aumentar a CTC do solo (GLASER et al., 2003). Dentre os possíveis benefícios

ambientais que podem ser alcançados com uso de biocarvão podemos citar:

(1) mitigação nas mudanças do clima; (2) melhoria na fertilidade dos solos; e

(3) redução de poluição ambiental (LEHMANN et al., 2011).

Estudos tem demonstrado também a utilização do biocarvão como

alternativa para melhorar a fertilidade dos solos, devido a um rearranjo dos

átomos de carbono, aumentando a porosidade do material, isto proporciona

melhoria nas propriedades químicas, principalmente pela alta superfície

específica resultando em aumento da capacidade de troca de cátions e

adsorção de nutrientes (ATKINSON et al., 2010). Em solos onde o sistema de

manejo possibilita acúmulo de material orgânico, como a adição de biocarvão,

as condições são favoráveis à fertilidade do solo, ao desenvolvimento

microbiano, além da reciclagem de resíduos e de nutrientes (MADARI et al.,

2009).

2.2.1. Biocarvão e a sua interação com o solo

A melhoria na fertilidade do solo tem sido atribuída ao aumento da

capacidade de troca catiônica, as alterações no pH do solo e as contribuições

diretas de nutrientes fornecidos pelo biochar (MAJOR et al., 2010;XU et al.,

2013; WANG et al., 2015). Além disso, devido a sua estrutura de carbono

aromático, o biochar é mais resistente á decomposição microbiana e pode

persistir no solo de 1000 a 10.000 anos, mantendo assim, estoque de carbono

no solo (WARNOCK et al., 2007; STEINER et al., 2007; RUTIGLIANO et al.,

2013).

As interações entre matéria orgânica e a superfície coloidal das argilas

são dependentes da distribuição dos grupos funcionais, da matéria orgânica,

20 da polaridade dos componentes, da composição e concentração dos cátions e

ânions na solução do solo. A área de superfície específica do biochar é de 200-

400 m2 g-1, é comparável a da argila e superior a da areia (PETTER et al.,

2012). Tais parâmetros levam a hipótese de que a presença do biochar em

solos arenosos pode suprir de certa forma a limitada disponibilidade de água,

baixa capacidade de troca catiônica, disponibilidade de nutrientes e atividade

de microrganismos. Reações complexas similares estão propensas a ter lugar

nas superfícies dos biocarvãos, principalmente se estes biocarvões

apresentam alto conteúdo mineral (JOSEPH et al., 2010).

O biochar apresenta cinzas, que são fontes de P, K e outros elementos,

que podem ser mais solúveis e acessíveis nos biocarvões que na matéria

orgânica não pirolisada. O efeito do biocarvão na disponibilidade destes

elementos pode explicar alguns impactos na produção de algumas culturas a

curto prazo, especialmente pelo fato de que, alguns elementos não podem ser

disponibilizados simplesmente pelo aumento da quantidade de matéria

orgânica no solo (SOHI et al., 2010).

Em solos adubados com uma mistura de cinzas e carvão, proveniente

de um usina termoelétrica, Omil et al. (2013) observaram que não foi

necessária a aplicação suplementar de P com aplicações anuais da mistura,

durante três anos, em doses de 4,5 t ha-1, no crescimento de um povoamento

de Pinus radiata, com anos de idade. Os autores ainda ressaltaram que os

tratamentos com a mistura, proporcionaram menores perdas de nutrientes por

lixiviação e aumento no teor de matéria orgânica do solo, mesmo em solo

arenoso. Petter et al. (2012) concluíram que a aplicação de biocarvão de

eucalipto em aplicações de 8, 16 e 32 t ha-1 em campo, afetou positivamente a

fertilidade do solo, aumentando principalmente a disponibilidade de Ca, P, e

aumentando o pH e o carbono orgânico total dos solos.

Estudando a influência do biocarvão em duas doses, 8 ou 20 t ha-1,

aplicadas uma única vez, na qualidade do solo adubado, Major et al. (2010)

observaram, após quatro anos da aplicação em savana colombiana, que o

biocarvão, produzido a partir de resíduos de madeira, aumentou principalmente

a disponibilidade de Ca e Mg e o pH, e diminuiu a acidez trocável.

A capacidade de troca catiônica está relacionada á área de superfície

específica, mas é altamente dependente de sítios quimicamente reativos.

21 Esses sítios vão se formando ao longo dos anos ao passo que partículas são

atacadas por microrganismos no solo, alterando as características químicas e

físicas do biochar (COHEN-OFRI et al., 2006). Essas alterações segundo estes

autores, se dão pelo aumento de cargas elétricas oriundas da oxidação dos

compostos bioquímicos, levando a um aumento no número de compostos

fenólicos, hidroxílicos, carbonilicos e quinonas e, consequentemente, a um

aumento no número de cargas negativas resultante da substituição pelas

cargas positivas no processo de oxidação. Talvez esta seja à explicação do

aumento da CTC do biochar com o passar dos anos em solos que contem esse

material.

Um aumento no pH do solo após a aplicação do biocarvão é

frequentemente relatado em diversos tipo de solo (GLASER et al., 2002;

AMELOOT et al, 2013.; XU et al., 2014). Isto é devido ao pH alcalino do

biocarvão, que é positivamente relacionado com a sua temperatura de

produção e do tipo de matéria-prima (à base de madeira tende a ter um pH

mais elevado do que o biocarvão a partir de resíduos de culturas e

compostagem). Outra razão para o aumento do pH no solo é a presença de

grupos fenólicos, carboxilo e hidroxilo carregados negativamente sobre

superfícies de biocarvão que se ligam aos H + da solução do solo, reduzindo

desse modo a sua concentração aumentando assim, o pH. A influência positiva

do biocarvão no aumento pH do solo é mais acentuada em solos ácidos e com

baixo teor de matéria orgânica, provavelmente porque está ligada à capacidade

de tamponamento do pH do solo (GUL et al., 2015).

A presença de biochar pode contribuir para algumas alterações nas

propriedades físicas do solo, tais como a estrutura, porosidade, diâmetro dos

poros e densidade em função de sua maior área superficial especifica

(PETTER et al., 2012). Ainda segundo esses autores, a mudança nas

características físicas do solo devido à incorporação do biochar pode resultar

em maior produtividade das plantas, devido a maior disponibilidade de água na

zona próxima ao sistema radicular e também devido à porosidade do biochar

que pode aumentar a capacidade de retenção de água, especialmente em

solos de textura arenosa, reflexo das estruturas celulares da matéria prima que

é normalmente produzido. Contudo, a estrutura aromática, que tem

características hidrofóbicas, pode reduzir a penetração de água nos espaços

22 porosos dos agregados do solo, aumentando assim a estabilidade dos

agregados (GLASER et al., 2002).

Todas essas alterações nas propriedades físicas podem levar a

mudanças em outras propriedades do solo, principalmente químicas e

biológicas, em função do surgimento de sítios quimicamente reativos e habitats

de proteção para microrganismos do solo (BRADY E WEIL, 2008).

A estrutura porosa do biochar, sua elevada área superficial interna e sua

capacidade de absorver matéria orgânica, gases e nutriente inorgânicos

fornecem um habitat ideal para os microrganismos do solo colonizar, crescer e

reproduzir, principalmente bactérias, actinomicetos e fungos micorrizicos

arbusculares (THIES et al., 2009). Dependendo do tamanho do poro, diferentes

microrganismos terão acesso aos espaços internos, tais como bactérias (entre

0,3 a 3 mm), fungos (2-80 mm) e protozoários (7-30 mm). Os macroporos do

biochar (> 200 nm) representam, provavelmente, o habitat mais protegido uma

vez que são do tamanho certo para acomodar as bactérias (QUILLIAM et al.,

2013), embora o biochar também apresente microporos (<2 nm) e mesoporos

(2-50 nm) que podem armazenar água e substancias dissolvidas que são

necessárias para o metabolismo microbiano (BREWER E BROWN, 2012).

Muitos autores tem sugerido que os poros do biochar agem como

microhabitats para a colonização microbiana, onde eles são protegidos dos

seus predadores naturais ou por serem menos competitivos no solo, poderem

se estabelecer (WARNOCK et al., 2007; RUTIGLIANO et al., 2014; GUL et al.,

2015). O tamanho e abundancia dos poros é influenciado pela matéria-prima e

da temperatura de produção do biocarvão, onde maior a temperança, resulta

em mais água e volatilização de matéria orgânica, criando assim, poros

maiores (BREWER E BROWN, 2012).

O aumento da biomassa e diversidade microbiana no solo é vista como

um resultado proporcionado pela adição do biochar. SUN et al., (2013)

verificaram um aumento 3 vezes mais no Índice de Shannon-Weiner para o

perfil bacteriano de DGGE 16S rDNA no solo com biochar comparado com o

controle durante uma incubação de 96 dias. Hu et al. (2014) verificaram uma

diversidade bacteriana maior de 12%, 30% e 37% e uma diversidade de fungos

menor de 17%, 40% e 23% nos índices de Shannon-Weiner, Simpsons e Chao

respectivamente, em solo argiloso de floresta. Esta detecção de gêneros

23 /espécies devido a um aumento no tamanho e densidade das populações

microbianas, em função do biochar, baseada no DNA fornece aos

pesquisadores a capacidade de usar ferramentas moleculares para sondar

ainda mais os processos microbianos que são afetados em solos com a

aplicação deste material.

2.3. Qualidade do solo

A qualidade do solo, em um ecossistema, compreende o equilíbrio entre

os processos geológicos, hidrológicos, químicos, físicos e biológicos do solo

(BRUGGEN E SEMENOV, 2000; SPOSITO E ZABEL, 2003; ZILLI et al., 2003).

O conceito de qualidade do solo surgiu no final da década de 70 e

durante os 10 anos seguintes estiveram muito associados ao conceito de

fertilidade (KARLEN et al., 2003). Acreditava-se, por exemplo, que um solo

quimicamente rico era um solo com alta qualidade, isto porque tinha a

capacidade de prover a produção agrícola. Entretanto, a percepção de

qualidade do solo evoluiu e, num entendimento mais amplo, percebe-se que

não basta apenas o solo apresentar alta fertilidade, mas, também, possuir boa

estruturação e uma alta diversidade de organismos.

Essa evolução do conceito de qualidade do solo, fez com que sua

complexidade de avaliação fosse ampliada, uma vez que todos estes

parâmetros estão intimamente associados, podendo ser avaliados por vários

indicadores. Nos estudos de ZILLI et al. (2003) avaliou-se a diversidade

microbiana como indicador de qualidade do solo (IQS), estabeleceu as

seguintes características ideais de um indicador de qualidade do solo: ser

capaz de responder, de forma rápida e acurada, a um distúrbio no solo; refletir

os aspectos do funcionamento do ecossistema; possuir processo de avaliação;

ser economicamente viável. Ainda neste contexto, Visser e Parkinson (1992)

mencionam que precisa ter uma distribuição universal e independente de

sazonalidade.

O tipo de manejo do solo interfere diretamente nos atributos físicos,

químicos e biológicos do solo (CARTER, 1986). Essas interferências são

promovidas principalmente pelas modificações na temperatura e umidade do

24 solo, qualidade do resíduo vegetal depositado e atividade dos microrganismos

(CATTELAN E VIDOR, 1990).

2.4. Microbiota do Solo

Os microrganismos ocupam em torno de 0,5% do espaço poroso do

solo. O solo não rizosférico, é considerado um deserto nutricional, devido à

ausência de substratos necessários ao metabolismo microbiano e as condições

físico-químicas nem sempre favoráveis. Dessa forma, é muito importante a

natureza dos compostos que fornecem carbono, nutrientes e energia ao

metabolismo celular, pois a microbiota do solo utiliza os resíduos vegetais,

animais e de outros microrganismos para a sua reprodução (MOREIRA E

SIQUEIRA, 2006).

As bactérias, que tem geralmente diâmetro aproximado de 0,5 μm,

localizam-se na matéria orgânica, nos poros e no interior dos agregados. A

ocupação dos poros é devido ao seu tamanho e fornecimento de gases e água

(MOREIRA E SIQUEIRA, 2006).

O solo e, consequentemente, a microbiota são continuamente

influenciados por condições do ambiente, como a umidade, temperatura,

manejo do cultivo e precipitação (CARDOSO E FREITAS, 1992). Por essa

razão, e condições de estresses abióticos e bióticos, apenas parte desses

microrganismos encontram-se em estado ativo, cerca de 15 a 30 % das

bactérias e 10% dos fungos. Essa parte ativa dos microrganismos é

denominada de biomassa microbiana, respondendo por 90% da atividade

microbiana no solo (SIQUEIRA E FRANCO, 1988).

2.5. Indicadores Microbiológicos do solo

Os indicadores de qualidade do solo podem ser classificados como

físicos, químicos e biológicos (ZILLI et al., 2003). Dentre estes, o biológico

possui uma capacidade de responder rapidamente às alterações no solo,

fornecendo informações rápidas sobre mudanças nas propriedades do solo. Os

indicadores biológicos podem ser mensurados pela composição da microbiota

e sua biomassa, diversidade genética de microrganismo e da atividade

25 enzimática, para mitigação de possíveis estratégias de manejo

conservacionistas do solo (KARLEN et al., 2003).

2.5.1. Atividade Enzimática

O estudo da atividade enzimática tem sido reportado como indicador

efetivo da qualidade do solo, da decomposiçã da matéria orgânica e da

disponibilidade de nutrientes. As enzimas presentes no solo, em geral, são

produzidas por microrganismos, via intra e extracelulares. A atividade

enzimática do solo resulta principalmente da ação de enzimas extracelulares

que podem estar livres na solução do solo, adsorvidas nos coloides ou

imobilizadas em complexos húmicos, estas enzimas são mais importantes na

biodegradação de macromoléculas orgânicas no solo, devido às interações das

enzimas com os coloides do solo (MOREIRA E SIQUEIRA, 2006).

Lisboa et al. (2012) explicam que devido a baixa concentração de

enzimas no solo, as determinações são mensuradas indiretamente, através da

medida da sua atividade e não de quantidade. Geralmente, a atividade é

avaliada por meio da adição de um substrato específico para cada enzima, em

uma concentração conhecida, onde ocorrerá a ligação e, posteriormente, a

quebra desse substrato, e com a incubação sob condições ótimas de pH e

temperatura quantifica-se o produto (TABATABAI, 1994).

A escolha das enzimas a serem analisadas para avaliar a qualidade do

solo baseia-se na sua sensibilidade ao manejo do solo, na decomposição da

matéria orgânica e operacionalidade da analise. As enzimas mais comumente

avaliadas são as hidrolases ligadas aos ciclos do C, N, P e S.

As glicosidases podem ser encontradas em plantas, animais e

microrganismos, catalisam reações de hidrólise de celulose em glicose, cujos

produtos são importantes fontes de carbono para os microrganismos do solo.

As fosfatases são fundamentais na mineralização do fósforo e,

consequentemente, na ciclagem deste nutriente no ambiente. Elas estão

amplamente distribuídas no solo e tem sido estudadas porque catalisam a

hidrolise de fósforo orgânico e inorgânico, disponibilizando-o assim para as

26 plantas. De acordo com seu pH ótimo de ação, podem ser classificadas como

ácidas (pH 6,5) ou alcalinas (pH 11) (TABATABAI, 1994).

No Brasil, maioria dos estudos realizados envolvendo a atividade

enzimática do solo foi em regiões de clima tropical, principalmente no Cerrado

brasileiro. Nessas regiões, geralmente observa-se que a atividade da β-

glicosidase varia de 24 a 35 μg p-nitrofenol g-1 solo h-1 na profundidade de 0-5

cm, sendo que nem sempre as áreas de mata nativa apresentam os maiores

valores quando comparados aos solos cultivados (MENDES, 2006). Em

relação à fosfatase ácida, ela geralmente é superior em áreas de vegetação

nativa, e os valores normalmente encontrados variam de 260 a 1500 μg p-

nitrofenol g-1 solo h-1 (MATSUOKA et al., 2006)

Apesar de serem indicadores sensíveis para avaliar a qualidade do solo,

faz-se necessário o estabelecimento de cuidadosas relações destas com o

clima e solo, uma vez que, esta análise é muito influenciada por variações

ambientais, como o manejo do solo, pH, temperatura, umidade, precipitação,

composição da microbiota e outros.

2.5.2. Diversidade Microbiana através da técnica de DGGE

Aproximadamente 9.500 espécies de procariotos já foram descritas ao

longo dos anos. No entanto, por meio de técnicas moleculares, sabe-se que

isso representa apenas cerca de 1 a 10% da biodiversidade existente no

planeta (THOMPSON et al., 2005). Atualmente, existem diversos métodos

moleculares disponíveis para o estudo de comunidades microbianas

independentes de cultivo. Eles se baseiam principalmente em técnicas que

utilizam a manipulação dos ácidos nucleicos, ou seja, o DNA ou o RNA

extraído diretamente do solo, entre os quais se podem citar o DGGE,

Sequenciamento, PCR em tempo real entre outros (MUYZER, 1993;

CARDENAS E TIEDJE, 2008).

A técnica de eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) se

baseia na mobilidade eletroforética de fragmentos de DNA parcialmente

desnaturados de mesmos tamanhos, mas de diferentes sequências de pares

de base amplificados por PCR de uma mesma amostra ambiental em um gel

27 de poliacrilamida que contém gradiente linear desnaturante crescente

composto por ureia e formamida (MUYZER, 1993). Quando sequencias de

mesmos pares de bases atingem a temperatura de desnaturação a uma

determinada posição no gel, a migração praticamente cessa. Diferentes teores

de G+C na dupla fita, irão parar de migrar em diferentes posições devido à

variação de gradiente de desnaturação e, assim, podem ser separados pelo

DGGE (RACHID, 2010). O DNA amplificado é separado de acordo com a

quantidade de grampos G+C dos diferentes fragmentos, construindo assim um

perfil de bandas que representam a impressão digital da estrutura da

comunidade microbiana em diferentes ambientes.

Uma sequencia de DNA rica em guanina e citosina (grampo de GC),

variando entre 30 e 40 bases é anexada no final 5’ do oligonucleotideo iniciador

forward, modificando dessa forma o padrão de desnaturação em que

praticamente 100 % das sequencias podem ser identificadas (MUYZER E

SMALLA, 1998). Segundo Øvreås et al. (1997) a região V3 do rDNA 16S é a

região mais estudada para avaliar a comunidade microbiana através da técnica

de DGGE, por apresentar a maior quantidade de bandas no gel e produzir um

perfil mais significativo.

O DGGE é uma técnica de fingerprinting relativamente rápida, pouco

onerosa e possibilita a análise simultânea de varias amostras. No entanto, o

DGGE apresenta algumas limitações, onde somente fragmentos de até 500 pb

podem ser separados no gel de acrilamida e apenas espécies predominantes

presentes na comunidade podem ser detectadas, em que, a população

detectada no gel pode corresponder a menos de 1% dos organismos existentes

na amostra (FROMIN et al., 2002).

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37 CAPÍTULO 2 – EFEITO DA APLICAÇÃO DO BIOCARVÃO NOS ATRIBUTOS

MICROBIOLOGICOS DO SOLO, CULTIVADO COM TECA, NO BIOMA

AMAZÔNIA

RESUMO - Biocarvão é um material orgânico que contém um elevado teor de

carbono, produzido por pirólise, na ausência de oxigênio. Possui uma estrutura

aromática, tornando-o estável e altamente resistente a degradação química e

biológica no solo. O objetivo desta pesquisa foi avaliar o uso do biocarvão

como condicionador do solo e seu efeito na atividade da β-glicosidase,

fosfatase ácida e diversidade bacteriana do solo em experimento de Teca com

três e quinze meses de duração, em um latossolo vermelho-amarelo,

localizados em Sinop - Mato Grosso, Brasil. Os tratamentos consistiram de: T1-

Muda sem biocarvão; T2- Muda com biocarvão; T3- Muda sem biocarvão +

biocarvão ativado aplicado no solo; T4- Muda com biocarvão + biocarvão

ativado aplicado no solo; T5- Muda sem biocarvão + biocarvão não ativado

aplicado no solo; T6- Muda com biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no

solo. Foi determinada a atividade de duas enzimas relacionadas ao ciclo do C e

P e a biodiversidade bacteriana foi avaliada por meio da técnica de DGGE com

iniciadores universais para a região 16S rDNA de bactérias. Não houve

incremento na atividade da β-glicosidase quinze meses após aplicação do

biocarvão, mas sua forma ativada proporcionou a maior atividade desta

enzima, ao contrário a fosfatase ácida apresentou uma baixa atividade nos

primeiros 3 meses e após quinze meses com aplicação do biocarvão no solo a

atividade desta enzima foi maior. Em relação à umidade e pH do solo, não foi

alterado pela presença do biocarvão. A estrutura e diversidade da comunidade

bacteriana no solo sofreram influencia mais acentuada do biocarvão com

quinze meses de aplicação no solo.

Palavras-chave: DGGE, condicionador de solo, β-glicosidase, fosfatase ácida, microbial ecology

38

1. INTRODUÇÃO

A Amazônia brasileira, uma das principais regiões produtoras de

madeira tropical do mundo, tem sofrido com a falta de oferta de madeira natural

legalizada. A Tectona grandis Linn f., ou simplesmente Teca, é uma espécie

que vem ganhando grande destaque dentro do cenário florestal brasileiro nos

últimos anos, sobremaneira no Estado de Mato Grosso, devido às condições

edafoclimáticas favoráveis (ZIECH, 2011).

A madeira da espécie é utilizada principalmente na indústria naval,

construção civil e indústria moveleira na fabricação de assoalhos e de decks.

Em Mato grosso a área plantada é de 48.526,2 há, e se encontra distribuída

em 42 municípios, indicando o interesse crescente por tal gênero florestal,

principalmente em função das expectativas de retorno financeiro em projetos

com a mesma (SHIMIZU et al., 2007). Atualmente, os plantios totalizam 67.329

ha e representam apenas 0,4% da produção de madeira plantada no Brasil

(ABRAF, 2013).

Embora a Teca seja encontrada em diversas regiões dentro da faixa

tropical e subtropical, a produtividade observada difere para cada uma destas

regiões (ZIECH, 2011). No estado de Mato Grosso os povoamentos de Teca

apresentam produtividades extremamente variáveis em função da diversidade

de condições física e química do solo (SHIMIZU et al., 2007).

O processo de transformação física e química do solo agrícola é

condicionado, em parte pela calagem, que apresenta ação dispersante de

agregados e, em parte, pela atividade biológica, que promove a mineralização

da matéria orgânica estável do solo (SPERA et al., 2009). Uma alternativa para

manter a matéria orgânica e melhorar a fertilidade do solo é o uso de resíduos

orgânicos carbonizados ou biocarvão (THIES et al., 2015). Esse biocarvão é

produzido por meio de um processo chamado pirólise o qual permite a

decomposição térmica do material orgânico em condições limitadas de

suprimento de oxigênio e em temperaturas em torno de 500ºC (LEHMANN E

JOSEPH, 2009).

Usado como condicionador de solo, o biocarvão pode aumentar a

disponibilidade de nutrientes para as plantas e melhorar as propriedades físicas

39 e biológicas do solo, promovendo um rearranjo dos átomos de carbono

aromáticos, aumentando a porosidade do material (AMELOOT et al.,2014). Isto

pode proporcionar melhoria nas propriedades químicas, principalmente pela

alta superfície específica resultando em aumento da capacidade de troca de

cátions e adsorção de nutrientes e tornando-o muito mais resistente à

decomposição microbiana (LEHMANN, 2007; ATKINSON et al., 2010).

A estrutura porosa do biocarvão serve como habitat para os

microrganismos do solo, devido à área superficial e a sua capacidade de

adsorver material orgânico solúvel, gases e nutrientes inorgânicos, podendo

providenciar um habitat para os microrganismos colonizar (LEHMANN E

JOSEPH, 2015). Além disso, a adição do biocarvão ao solo pode alterar as

propriedades físico-químicas do solo (estrutura e pH), os quais influenciam

diretamente na atividade e biomassa microbiana, bem como, na composição da

comunidade de microrganismos (LEHMANN et al., 2011).

Para a avaliação da qualidade de um solo, tem sido difundida também a

necessidade de identificação de parâmetros indicativos do seu estado de

conservação e/ou degradação.

Os estudos sobre bioindicadores mostram que os microrganismos do

solo, devido às características como abundância e atividades bioquímicas,

apresentam alto potencial de uso na avaliação da degradação do solo

(MOREIRA E SIQUEIRA, 2006). Segundo Araujo e Monteiro (2007), a atividade

enzimática do solo esta inter-relacionada com a matéria orgânica, com as

propriedades físicas e com a atividade e biomasssa microbiana podendo

funcionar como um bom indicador de mudanças na qualidade do solo.

Como resultado da sua sensibilidade as mudanças ambientais, a

atividade enzimática e a estrutura e abundancia da microbiota do solo tem sido

amplamente utilizados como indicadores das mudanças na qualidade do solo

(WANG et al., 2015). Atualmente, existem diversos métodos moleculares

disponíveis para o estudo de comunidades microbianas independentes de

cultivo. Eles se baseiam principalmente em técnicas que utilizam a

manipulação dos ácidos nucleicos, ou seja, o DNA ou o RNA extraído

diretamente do solo (RACHID, 2010).

Nesse sentido, diante do potencial do uso de biocarvão como alternativa

na melhoria e conservação dos solos e a possibilidade de usar a biologia

40 molecular para estudar o a comunidade microbiana no solo os objetivos deste

trabalho foram: i) avaliar as possíveis influencia dessa pratica na atividade

enzimática relacionada ao ciclo do carbono e fósforo; ii) verificar a influencia da

aplicação do biocarvão na diversidade bacteriana e na interação com o solo em

Sinop, Mato Grosso.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Descrição da Área de Estudo

O experimento foi implantado na área experimental da Embrapa

Agrossilvipastoril (Anexo A), no bioma Amazônia, município de Sinop, MT (11°

52′ 23″ Sul, 55° 29′ 54″ Oeste, a 384 m de altitude).

O clima da região segundo a classificação de Köppen é do tipo Am,

apresenta característica de clima de monção, com moderada estação seca e

ocorrência de precipitação média mensal inferior a 60 mm (ALVAREZ et al.,

2013).

O solo é classificado como Latossolo Vermelho Amarelo distrófico típico,

textura argilosa, horizonte A moderado e com relevo plano (DIEL et al., 2014).

Antes da implantação do experimento foram determinados os atributos

químicos e granulométricos na camada de 0–20 cm: pH em CaCL2 de 5,1; 13

mg dm-3 de P (Mehlich-1); 62 mg dm-3 de K (Mehlich-1); 2,6 cmolc dm-3 de Ca;

0,7 cmolc dm-3 de Mg; 0,0 cmolc dm-3 de Al; CTC de 7,4 cmolc dm-3 e 30,4 g

dm-3 de matéria orgânica (MO). A textura do solo é argilosa com 283 g kg-1 de

areia, 150 g kg-1 de silte e 567 g kg-1 de argila. Para correção da acidez,

aplicou-se 1,5 ton.ha-1 de calcário em área total de acordo com as indicações

agronômicas.

Foram analisados os dados climáticos como: precipitação, umidade e

temperatura médias mensais, de outubro de 2013 a abril de 2015, para

observações das alterações climáticas cumulativas de 6 meses anteriormente

as coletas. A precipitação total acumulada durante o período da chuva

(outubro-abril) em 2014 foi de 2200,55 mm com a temperatura média de 25º C

e umidade relativa do ar de 82,06%. No período da chuva em 2015 a

precipitação total acumulada era de 1632,47 mm com a temperatura média de

26,4ºC e umidade relativa média de 83,8% (Fig

Fig. 1. Climograma de Sinop, MT, gerado a partir da precipitação acumulada de cada mês e temperatura média no período de outubro/ 2013 a maio/ 2015. Fonte: Embrapa.

2.2. Plantio da Teca

O material para o plantio consistiu em um clone de

comercialmente denominado de Proteca A1. Delimitou

tratamentos, totalizando 24 parcelas de 600,25m² com a plantio de 49 mudas

de teca em cada uma. Sendo que as 25 mudas centrais fizeram parte da

parcela útil, composta com uma bordadura simples. Utilizou

de 3,5 m entre linhas e de 3,5 m entre planta com a

no sulco a uma distância de 75 cm para cada lado do local pré

para o plantio da muda. As doses de biocarvão aplicados no solo foram: 2.500g

por cova de biocarvão não ativado e de 600g por cova do biocarvão ativado.

2.3. Produção do Biocarvão

A produção do biocarvão deu

nativas da região processadas pela SSPT Pesquisas Tecnológicas LTDA

localizada no município de Mogi Mirim (SP).

precipitação total acumulada era de 1632,47 mm com a temperatura média de

26,4ºC e umidade relativa média de 83,8% (Figura 1).

. Climograma de Sinop, MT, gerado a partir da precipitação acumulada de cada mês e mperatura média no período de outubro/ 2013 a maio/ 2015. Fonte: Embrapa.

O material para o plantio consistiu em um clone de Tectona grandis

comercialmente denominado de Proteca A1. Delimitou-se 4 blocos com 6

talizando 24 parcelas de 600,25m² com a plantio de 49 mudas

de teca em cada uma. Sendo que as 25 mudas centrais fizeram parte da

parcela útil, composta com uma bordadura simples. Utilizou-se o espaçamento

de 3,5 m entre linhas e de 3,5 m entre planta com a incorporação do biocarvão

no sulco a uma distância de 75 cm para cada lado do local pré

para o plantio da muda. As doses de biocarvão aplicados no solo foram: 2.500g

por cova de biocarvão não ativado e de 600g por cova do biocarvão ativado.

2.3. Produção do Biocarvão

A produção do biocarvão deu-se a partir de pó de serra de espécies

nativas da região processadas pela SSPT Pesquisas Tecnológicas LTDA

localizada no município de Mogi Mirim (SP).

41

precipitação total acumulada era de 1632,47 mm com a temperatura média de

. Climograma de Sinop, MT, gerado a partir da precipitação acumulada de cada mês e mperatura média no período de outubro/ 2013 a maio/ 2015. Fonte: Embrapa.

Tectona grandis L. f.,

se 4 blocos com 6

talizando 24 parcelas de 600,25m² com a plantio de 49 mudas

de teca em cada uma. Sendo que as 25 mudas centrais fizeram parte da

se o espaçamento

incorporação do biocarvão

no sulco a uma distância de 75 cm para cada lado do local pré- determinado

para o plantio da muda. As doses de biocarvão aplicados no solo foram: 2.500g

por cova de biocarvão não ativado e de 600g por cova do biocarvão ativado.

se a partir de pó de serra de espécies

nativas da região processadas pela SSPT Pesquisas Tecnológicas LTDA

42

Foram utilizados dois tipos de biocarvão: não ativado e ativado. Para

obtenção do biocarvão não ativado processou-se o pó de serra em reator de

pirólise lenta (Forno Vertical), com 25 minutos de residência no forno, a 450°C.

Para obtenção do biocarvão ativado foi necessário aumentar a temperatura do

reator de pirólise (Forno Tubular Horizontal) para 650°C e injetar vapor de água

durante o processo. O tratamento de ativação realizou-se com intuito de

eliminar resíduos do processo de pirólise, desobstruir os poros do biocarvão e

disponibilizar radicais orgânicos na superfície do carvão.

2.4. Tratamentos

Os tratamentos consistiram de: T1- Muda sem biocarvão; T2- Muda com

biocarvão; T3- Muda sem biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T4-

Muda com biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T5- Muda sem

biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo; T6- Muda com biocarvão +

biocarvão não ativado aplicado no solo. Aplicou-se em todos os tratamentos a

mesma quantidade de adubo: 60 g por cova de NPK (20-00-20), 120g por cova

de P2O5 e 12 g por cova de FTE BR (3,9% enxofre, 1,8% de boro, 2,0% de

manganês e 9,0% de zinco).

Foram utilizados dois tipos de muda: muda com substrato composto de

100% substrato comercial (Mac Plant) e muda com substrato composto de 25%

de biocarvão ativado + 75% de substrato comercial.

2.5. Área de Referência

A 1ª área denominada de Pousio está localizada próximo aos blocos do

experimento da fazenda experimental da Embrapa Agrossilvipastoril e desde

2010 deixou de ser área agrícola sendo naturalmente revegetada por

gramíneas invasoras.

A 2ª área está coberta por Mata Nativa composta por Floresta Estacional

Perenifolia (HAIDAR et al., 2013). O fragmento avaliado está localizado

próximo à área experimental da fazenda da Embrapa Agrossilvipastoril,

formando corredor ecológico a partir da mata ciliar do rio Teles Pires com

extensão total de 7,3 km e largura média de 200 m.

43 2.6. Amostragem de solo

A coleta das amostras de solo foi em abril dos anos de 2014

(experimento com três meses no campo) e 2015 (experimento com quinze

meses no campo), caracterizado pelo final do período chuvoso. Com auxilio de

um trado tipo holandês, as amostras de solo deformadas foram coletadas na

profundidade de 0-10 cm. Em cada tratamento foram coletadas 20 amostras

simples para formar uma amostra composta por parcela. As coletas foram

realizadas a 40 cm de distancia entre as plantas e sempre na área útil da

mesma.

O solo coletado foi homogeneizado, acondicionado em caixas térmicas

contendo gelo e transportados para ao Laboratório de Microbiologia do Solo e

Biologia Molecular da Embrapa Agrossilvipastoril. As amostras foram

armazenadas em câmara fria a ± 4 °C até a execução das análises de

atividade enzimática. Para as analises moleculares, o solo foi armazenado a -

80ºC.

2.7. Umidade e pH do solo

O teor de umidade do solo foi realizado por meio do método da umidade

atual, onde as amostras de campo foram secas em estufa a 105 °C, por 24

horas, ao final o peso da água foi obtido pela diferença entre o peso da

amostra úmida e seca (EMBRAPA, 1997). O pH em água foi determinado para

cada tratamento nos dois períodos avaliados (EMBRAPA, 1997).

2.8. Atividade Enzimática

Foi determinada a atividade de duas enzimas: β-glicosidase e fosfatase

ácida conforme o método proposto por (TABATABAI, 1994). O principio do

método é baseado na determinação colorimétrica do p-nitrofenol liberado pela

ação da enzima, quando o solo é incubado com substrato especifico. Para as

análises de β-glicosidase o substrato utilizado na reação foi o p-nitrofenil- β-D-

glucopiranosídeo 0,05M (PNG 0,05M) e para a Fosfatase Ácida o substrato

utilizado na reação foi o p-nitrophenyl phosphate 0,05M (PNF 0,05M).

44

Para cada amostra de solo coletada no campo, necessitou duas

repetições analíticas no laboratório, mais o controle. A concentração de p-

nitrofenol produzido foi estimada a partir de uma curva padrão preparada com

concentrações conhecidas de p- nitrofenol (0; 10; 20; 30; 40 e 50 μg p-

nitrofenol mL-1) com R2 > 0,99, na regressão linear, após, os resultados foram

expressos em μg p-nitrofenol g-1 solo seco h-1 (TABATABAI E BREMNER,

1969).

2.9. Caracterização da comunidade de bactérias (gene 16S rDNA)

2.9.1. Extração de DNA e Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

O DNA genômico do solo foi extraído com PowerSoil™ DNA isolation kit

(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA., USA), conforme protocolo descrito pelo

fabricante. A qualidade do material extraído foi verificada em gel de agarose a

0,8% e a quantificação do mesmo foi realizada em NanoDrop (Thermo

Scientific).

Na amplificação do gene 16S rDNA, utilizou-se o seguinte conjunto de

primers: iniciador 799F (5’- AACMGGATTAGATACCKG-3’) e finalizador 1492R

(5’- TACGGYTACCTTGTTACG-ACT-3’). Foram realizadas duas reações de

PCR, para evitar a amplificação de possíveis DNAs de cloroplastos presentes

no material extraído do solo (CHELIUS E TRIPLETT, 2001). A solução da

primeira reação continha: 1 μL do DNA total extraído (5-20 ng), 2,5 μL de

tampão 10x com MgCl2 (Sigma), 0,2 mM de cada desoxirribonucleotídeos

trifosfato, 0,4 μM de cada primer, 2,5 U de Taq DNA polimerase (Sigma), 0,2

mg de BSA (albumina de soro bovino) e água ultra pura estéril (Milli-Q) para

volume final de 25 μL.

A primeira PCR foi conduzida em termociclador (Bio-Rad T100TM

Thermal Cycler) programado para realizar desnaturação inicial a 95ºC por 3

min, seguido de 35 ciclos a 94°C por 20 seg, 53ºC por 40 seg, 72ºC por 40 seg

e com extensão final de 72ºC por 7 min. O produto da PCR foi corado com

GelRedTM 20x aplicado em gel de agarose 1,5 % (p/v), submetido a

eletroforese de 70 V por 55 min e observado sobre luz ultravioleta. Para cada

amostra, dois fragmentos de DNA foram observados, correspondendo a 1090

45 pb e 735 pb referentes ao DNA mitocondrial e bacteriano respectivamente,

posteriormente o gel foi fotodocumentado (Loccus Biotecnologia).

Os amplicons resultantes dessa amplificação foram utilizados como

moldes para uma nova PCR-2 especifica que abrangem a região V3 do DNA

ribossômico 16S (OVREAS et al., 1997), realizados com o conjunto de primers:

U968GC (5’-grampo CG+ AACGCGAAGAACCTTAC-3’) e 378R (5’-

CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’). A amplificação foi feita em solução

contendo: 0,5 μL do produto da PCR1, 0,4 μM de ambos os primers, 2,5 μL de

tampão 10x com MgCl2 (Sigma), 0,2 mM de cada desoxirribonucleotídeos

trifosfato, 2,5 U de Taq DNA polimerase (Sigma), 1 % de formamida e água

ultrapura estéril (Milli-Q) para volume final de 25 μL.

A reação foi programada para realizar desnaturação inicial a 94ºC por 4

min, seguido de 35 ciclos a 94ºC por 1 min, 56ºC por 1 min, 72ºC por 1 min e

extensão final de 72ºC por 10 min. O resultado das amplificações foi verificado

em gel de agarose 1,5 % (p/v), coradas com GelRedTM 20x, submetidas a

corrente de 70 Volts por 55 min e observadas sobre luz ultravioleta. A presença

e o tamanho do gene bacteriano amplificado, 410pb foi certificado e

fotodocumentado (Loccus Biotecnologia). A quantificação do mesmo foi

realizada em NanoDrop (Thermo Scientific).

2.9.2. Gel em Eletroforese com Gradiente Desnaturante (DGGE)

Os produtos amplificados na PCR-2 foram analisados através da técnica

de DGGE utilizando-se um equipamento DcodeTM Universal Mutation

Detection System (Bio-Rad Inc., Hercules, USA). Os géis de acrilamida:bis-

acrilamida (37:1 m:m) 6% (p/v), preparados com gradiente desnaturante linear

de 35% - 65%, os gradientes formados a partir de soluções estoque de

poliacrilamida, contendo 0 a 100% de desnaturante (100 % corresponde a 7 M

de ureia e 30% de formamida). Aproximadamente 200 ng foram aplicados em

cada slot do gel. O tempo de eletroforese foi de 17 horas a 60ºC e 60v em TAE

1,0 X (10 Mm de Tris-Acetato e 0,5 Mm de EDTA, pH 8,0). Após a eletroforese,

os géis foram corados por 30 minutos com GelRedTM, fotografados em luz UV,

utilizando-se um sistema de captura de imagem (Loccus Biotecnologia) e

46 analisados através do programa BioNumerics versão 7.1 (Applied Maths, Sint

Martens Latem, Bélgica).

A determinação da diversidade de bactérias totais no solo foi por meio

do Índice de Shannon (H’) baseada na intensidade das bandas presentes no

gel do DGGE em que foi considerado o número total de bandas da canaleta e a

intensidade individual de cada banda.

2.10. Análise Estatística

Todos os dados de atividade enzimática, índice de shannon, pH e

umidade do solo foram analisados em relação à normalidade (Kolmogorov-

Sminov & Liliefors e Shapiro-Wilk’s) e homocedasticidade (Cochran C, Hartley,

Bartlett). Quando essas condições foram respeitadas, foi executada a análise

de variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey para diferenciação de média

(ao nível de 5% de probabilidade) nos casos de diferenças significativas.

O Índice de Shannon (H’), que indica a diversidade de espécies, foi

determinado pelo número de bandas presentes em cada amostra do gel e o

total do número de indivíduos pela intensidade das bandas utilizando o

programa Bionumerics versão 7.1 (Applied Maths, Sint Martens Latem,

Bélgica). O resultado desse índice foi submetido á análise de variância e as

comparações de médias foram feitas através do teste de Tukey (p,<0,05). Para

a análise da estrutura das comunidades microbianas, foram geradas matrizes

de presença e ausência das bandas detectadas nos perfis do gel do DGGE.

Essa matriz foi utilizada na analise de componentes principais (PCA) para cada

ano de experimento.

Com os dados de presença e ausência de bandas, foi primeiramente

realisada a analise de correlação (DCA) entre as amostras e variáveis

(bandas), que forneceu informação sobre a distribuição dos dados de espécies

em cada grupo microbiano avaliado. Em casos onde a distribuição foi linear

(valor do primeiro eixo <4,00), a análise multivariada foi realizada por análise

de redundância (RDA), enquanto que valores >4,00 (distribuição normal)

indicam a melhor análise por correspondência canônica (CCA) (ANDREOTE et

al., 2009).

47

A correlação dos dados ambientais com a ocorrência das bandas foi

determinada pela Análise de Redundância (RDA), realizada no software

Canoco (Canoco 4.5, Biometris, Wageningen, Holanda). As bandas observadas

nos géis de DGGE foram consideradas como espécies e o teste estatístico de

permutação de Monte Carlo foi aplicado considerando 999 permutações

aleatórias, permitindo avaliar a significância (valor de p) dos fatores ambientais

na distribuição de espécies das amostras. Nestas análises foram também

obtidos os valores de λA (Lambda-1), que mostram as porcentagens das

variâncias explicadas pelos fatores ambientais independentemente. Como

variáveis ambientais foram usadas a atividade das enzimas β-glicosidase e

fosfatase ácida, Índice de Shannon (H’), pH e Umidade Gravimétrica do solo.

4. RESULTADOS

4.1. Atividade Enzimática, pH e umidade do solo

A atividade da enzima β-glicosidase apresentou um comportamento

distinto quanto a aplicação do biocarvão no solo nos primeiros 3 meses de

implantação em 2014 (Figura 2A). Na enzima β-glicosidase, os maiores valores

de atividade foram obtidos nos tratamentos com a aplicação do biocarvão em

sua forma ativada no solo, T3 e T4 (51,91 e 58,77 μg p-nitrofenol h-1 g solo

seco-1, respectivamente) e a menor atividade obtida foi no tratamento T5 com

aplicação do biocarvão não ativado (39,58 μg p-nitrofenol h-1 g solo seco-1).

A atividade enzimática após 15 meses de experimento com biocarvão

também apresentou a maior atividade da β-glicosidase no tratamento T3 com o

uso do biocarvão ativado (65,59 μg p-nitrofenol h-1 g solo seco-1) e a menor

atividade nos tratamentos T5 e T6 (37,07 e 35,22 μg p-nitrofenol h-1 g solo

seco-1, respectivamente) utilizando o biocarvão não ativado (Figura 2B). As

áreas de referência nos dois anos avaliados apresentaram valores de β-

glicosidase menores quando comparados com os tratamentos com o uso do

biocarvão.

Após três meses de aplicação do biocarvão no solo, a maior atividade da

fosfatase ácida foi encontrada foi no tratamento T1 (controle). Os tratamentos

48 com a presença do biocarvão não diferiram entre si em que, todos os

tratamentos com aplicação do biocarvão no solo apresentaram valores de

atividade menores em relação ao controle. A mata nativa apresentou a maior

atividade (1229,89 μg p-nitrofenol h-1 g solo seco-1) para a fosfatase ácida

(Figura 2C).

Após quinze meses da aplicação do biocarvão no solo, verificou-se um

incremento na atividade da fosfatase ácida (Figura 2D). A menor atividade

observada foi nos tratamentos T1 e T2 (246,66 e 128,35 μg p-nitrofenol h-1 g

solo seco-1, respectivamente). Não houve diferença em aplicar o biocarvão na

forma ativada e não ativada para a atividade desta enzima. A Mata Nativa e o

Pousio apresentaram a maior atividade da fosfatase ácida.

Tratamentos

T1 T2 T3 T4 T5 T6 Pousio Mata

0

200

400

600

800

1000

1200

1400 Fosfatase Ácida 2014

Tratamentos

T1 T2 T3 T4 T5 T6 Pousio Mata

0

200

400

600

800

1000 Fosfatase Ácida 2015

a

Tratamentos

T1 T2 T3 T4 T5 T6 Pousio Mata

ug p

-nitr

ofen

ol h

-1 g

sol

o se

co-1

0

20

40

60

80 B-glicosidase 2015

Tratamentos

T1 T2 T3 T4 T5 T6 Pousio Mata

0

10

20

30

40

50

60

70 B-glicosidase 2014

ug p

-nitr

ofen

ol h

-1 g

sol

o se

co-1

ug p

-nitr

ofen

ol h

-1 g

sol

o se

co-1

ug p

-nitr

ofen

ol h

-1 g

sol

o se

co-1

ab ab

ab a

b

ab ab

abc

a

abc

bc

c

a

ab b b b b

ab

b

a a a a

A B

C D

Fig.2. Média da atividade enzimática em experimento com aplicação de biocarvão em latossolo vermelho-amarelo, cultivado com Teca no Bioma Amazônia. Tratamentos: T1- Muda sem biocarvão; T2- Muda com biocarvão; T3- Muda sem biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T4- Muda com biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T5- Muda sem biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo; T6- Muda com biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo e duas áreas de referência. Médias seguidas da mesma letra indicam que não houve diferença estatística pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

49

Não houve diferença estatística para o pH do solo com 3 e 15 meses de

experimento (Anexo B). A média dos tratamentos para o pH do solo no primeiro

ano foi de 4,71 e no segundo de 4,64. O pH das áreas de referencia (Pousio e

Mata Nativa) observados foram 3,82 e 3,18, respectivamente. Quanto à

Umidade Gravimétrica (UG%) do solo, esta também não apresentou diferença

significativa, sendo a média dos tratamentos de 2014 de 16,65% e de 2015 de

24,92%, refletindo a maior precipitação acumulada no mês de abril neste ano,

período em que foram coletadas as amostras de solo.

4.2. Diversidade bacteriana (Índice de Shannon)

O uso do biocarvão ativado aplicado no solo proporcionou a maior

diversidade bacteriana (2,72) em experimento com 3 meses de aplicação do

biocarvão, no ano de 2014, sendo o valor mais próximo da Mata Nativa (2,79) e

foram superiores aos tratamentos com biocarvão não ativado (T5 e T6), que

apresentaram os menores valores de diversidade bacteriana (2,31 e 2,21,

respectivamente) (Tabela 1). Os tratamentos T5 e T6, caracterizados pela

aplicação do biocarvão não ativado aplicado no solo apresentaram os menores

valores de diversidade bacteriana (2,31 e 2,21 respectivamente), valores estes,

próximos ao observado na área de Pousio.

Tabela 1 Índice de Shannon (H’) dos perfis de DGGE de comunidades bacterianas totais do solo, cultivado com Teca no Bioma Amazônia.

Tratamento Índice de Shannon (H’) 2014

Índice de Shannon (H’) 2015

T1 2,5734ab 2,0990b

T2 2,4536bc 2,3852a

T3 2,7121a 2,4554a

T4 2,3985bc 2,4839a

T5 2,3103c 2,5080a

T6 2,2171c 2,5859a

Pousio 2,0422 2,2117

Mata Nativa 2,7957 2,5902

CV (%) 4,68 4,60

T1- Muda sem biocarvão; T2- Muda com biocarvão; T3- Muda sem biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T4- Muda com biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T5- Muda sem biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo; T6- Muda com biocarvão +

/////

///

50 biocarvão não ativado aplicado no solo e duas áreas de referência. Médias seguidas da mesma letra indicam que não houve diferença estatística pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

No ano de 2015 em experimento com 15 meses de aplicação do

biocarvão, a maior diversidade também foi encontrada na área de Mata Nativa

(2,59). Entre os tratamentos, somente o T1 (sem aplicação do biocarvão)

diferiu estatisticamente dos demais. Os valores de diversidade entre os

tratamentos T2 ao T6 foram bastante semelhantes e muito próximos da área de

referencia de Mata Nativa, sendo novamente superiores ao Pousio, que junto

com o tratamento controle, apresentaram a menor diversidade bacteriana do

solo no ano de 2015.

4.3. Estrutura da comunidade de bactérias totais (gene 16S rDNA)

Os géis obtidos a partir de amostras de solo coletadas em experimento com

três e quinze meses de aplicação do biocarvão permitiram a visualização de

diferentes perfis das comunidades bacterianas (ANEXO C). A estrutura da

comunidade bacteriana total do solo foi caracterizada através da análise do

perfil de bandas pela amplificação dos genes 16S rDNA com a reação da

polimerase em cadeia combinada com DGGE.

A técnica de PCR-DGGE possibilitou identificar diferenças na

composição das comunidades bacterianas do solo no ano de 2014 em função

dos tratamentos, em que, o uso do solo (implantação de uma área manejada

com Teca) distinguiu-se da área de Pousio e de Mata Nativa (Figura 3). A

ordenação gerada por meio da PCA (Analise de Componentes Principais)

separou os tratamentos em três grupos distintos e praticamente equidistantes,

sugerindo que a comunidade bacteriana total do solo se estruturou de três

maneiras diferentes e não há maior ou menor relação de similaridade entre

duas comunidades em relação á outra. A relativa proximidade entre as

repetições mostra um padrão de estrutura dentro de cada tratamento.

O eixo 2 explicou 12.4 % da variância e conseguiu discriminar os três

grupos, com maior força a área manejada com Teca (com e sem biocarvão),

enquanto o eixo 1 explicou 20.8% da variância e agrupou a área manejada com

a Mata Nativa e as colocou distante da área de Pousio.

51

Fig.3. Analise de Componentes Principais (PCA) do perfil estrutural das comunidades bacterianas do solo por PCR-DGGE em experimento com três meses de aplicação do biocarvão (2014). T1- Muda sem biocarvão; T2- Muda com biocarvão; T3- Muda sem biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T4- Muda com biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T5- Muda sem biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo; T6- Muda com biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo.

A análise da estrutura da comunidade bacteriana total do solo no ano de

2015 (experimento com quinze meses de implantação) revelou padrão de

resposta semelhante á análise do ano anterior (Figura 4). Contudo, a

comunidade de bactérias dentre os tratamentos cultivados com Teca,

apresentaram uma variação maior na estrutura da comunidade quanto à

aplicação ou não do biocarvão e em relação a sua forma ativada no solo.

O eixo 1 explicou 18.1 % da variância e discrimina de forma mais tênue

os tratamentos T1 (controle) e T3 (aplicação de biocarvão ativado no solo)

sem, contudo, distingui-las dos demais tratamentos da área cultivada com

Teca. Já, o eixo 2 explicou 11.2% da variância e discrimina de forma marcante

a área de Mata Nativa das demais áreas estudadas.

52

Fig.4. Analise de Componentes Principais (PCA) do perfil estrutural das comunidades bacterianas do solo por PCR-DGGE em experimento com quinze meses de aplicação do biocarvão (2015). T1- Muda sem biocarvão; T2- Muda com biocarvão; T3- Muda sem biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T4- Muda com biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T5- Muda sem biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo; T6- Muda com biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo.

4. 4. Relação das alterações nas comunidades microbianas com atributos

do solo.

A correlação entre os atributos do solo e a estrutura da comunidade

microbiana foi realizada por meio da analise multivariada. Os valores de λA

(Lambda-1) e de p obtidos para cada variável, nos dois anos de experimento,

estão apresentados na Tabela 2. O resultado da analise (RDA) permitiu

acessar os fatores que apresentam maior ou menor interferência na

determinação dos perfis de DGGE e consequentemente na composição da

comunidade bacteriana.

53 Tabela 2. Quantificação da influência das variáveis analisadas sobre a estrutura da comunidade bacteriana do solo. Os valores de (λA%) representam o percentual de explicação de cada variável e (p) seu respectivo índice de significância (p<0,05), de acordo com o teste de permutação de Monte Carlo.

Variáveis λA (%)

2014

Valor de p

2014

λA (%)

2015

Valor de p

2015

Fosfatase Ácida 15% 0.001 14% 0.001

Índice de Shannon(H’) 10% 0.001 12% 0.001

β-glicosidase 5% 0.003 9% 0.053

Umidade (UG) 5% 0.014 8% 0.036

pH 2% 0.758 3% 0.057

TOTAL* 32% - 46% -

*Soma das percentagens de explicação de cada variável avaliada.

No ano de 2014, os resultados indicam que 36,9% do total de variância

na composição da comunidade bacteriana do solo, podem ser explicados pelas

variáveis ambientais, enquanto 17,7% e 10,1% da variância foi explicada pelo

eixo 1 e eixo 2, respectivamente. Os dois eixos mostraram uma boa correlação

com as variáveis ambientais (r=0.93 e r=0,92) (ANEXO D). Os atributos que

mais contribuíram para a separação dos perfis da comunidade bacteriana do

solo foram à atividade da fosfatase ácida (λA=15%), Índice de Shannon

(λA=10%), β-glicosidase (λA=5%) e umidade do solo (λA=5%) que contribuíram

significativamente na disposição da estrutura da comunidade bacteriana.

As variáveis pH e β-glicosidase foram diretamente relacionadas com o

perfil da comunidade bacteriana presente nos tratamentos T1, T3 e T4 (Figura

5). Ao contrario, a área de Pousio e Mata Nativa estão negativamente

correlacionadas com o pH e a atividade da β-glicosidase, entretanto a área de

Mata Nativa correlacionou-se positivamente com a atividade da fosfatase ácida

e Índice de Shannon (H’).

54

Fig. 5. Agrupamento da analise de redundância (RDA) dos perfis de DGGE de bactérias totais (rDNA16S) e relação com os atributos do solo em 2014. Tratamentos: T1- Muda sem biocarvão; T2- Muda com biocarvão; T3- Muda sem biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T4- Muda com biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T5- Muda sem biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo; T6- Muda com biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo; Pousio e Mata Nativa.

Analisando os perfis de DGGE obtidos no ano de 2015 com

oligonucleotideos universais para o domínio bactéria, foi possível apenas

verificar como fatores significantes (p<0,05) determinantes da comunidade

bacteriana a atividade da fosfatase ácida, Índice de Shannon (H’) e umidade do

solo (Tabela 2).

Os resultados indicam que 33,4% do total de variância na composição

da comunidade bacteriana do solo, podem ser explicados pelas variáveis

ambientais, enquanto 15,7% e 9,7% da variância foi explicada pelo eixo 1 e

eixo 2, respectivamente. Os dois eixos também mostraram uma boa correlação

com as variáveis ambientais (r=0.93 e r=0,93) (ANEXO E).

A análise de redundância (RDA) permitiu acessar os fatores que

apresentaram maior ou menor interferência na determinação dos perfis de

DGGE e consequentemente na composição da comunidade bacteriana (Figura

6). O pH e a β-glicosidase correlacionaram negativamente com a área de Mata

55 Nativa, mas obtiveram uma correlação positiva com os tratamentos T3 e T4

(aplicação do biocarvão ativado no solo). Em contrapartida, a fosfatase ácida

apresentou uma alta correlação positiva com a área de Mata Nativa, enquanto

a maior diversidade bacteriana (Índice de Shannon) esta mais relacionada à

composição da comunidade bacteriana do solo observados no tratamento T6

(aplicação do biocarvão não ativado no solo).

Fig.6. Agrupamento da analise de redundância (RDA) dos perfis de DGGE de bactérias totais (rDNA16S) e relação com os atributos do solo em 2015. Tratamentos: T1- Muda sem biocarvão; T2- Muda com biocarvão; T3- Muda sem biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T4- Muda com biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T5- Muda sem biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo; T6- Muda com biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo; Pousio e Mata Nativa.

5. DISCUSSÃO

A atividade biológica dos solos abrange todas as reações metabólicas

celulares, suas interações e seus processos bioquímicos mediados ou

conduzidos pelos microrganismos (SILVA et al., 2009). A aplicação do

biocarvão no solo tem sido relatada como um dos componentes que pode

56 modular os atributos químicos e físicos do solo (LEHMANN et al., 2011), em

que, a atividade enzimática e a diversidade microbiana do solo são importantes

e sensíveis indicadores microbiológicos de qualidade de solos (BASTIDA et al.,

2008; LU et al., 2015). Nesse sentido, foram avaliados no presente estudo o

efeito do biocarvão na atividade enzimática e na biodiversidade bacteriana do

solo cultivado com Teca.

Devido à capacidade de adsorver compostos orgânicos e inorgânicos,

alguns autores tem demonstrado que o biocarvão pode inibir a atividade de

algumas enzimas no solo ou os seus substratos que ficam adsorvidos nos

sítios de reação (JIN, 2010; BAILEY et al., 2011; LEHMANN et al., 2011). Para

os estudos de curto prazo, no entanto, é ainda necessário determinar se as

propriedades físicas do biocarvão (por exemplo, porosidade e grande área de

superfície) vão beneficiar a atividade dos microrganismos do solo (Warnock et

al, 2007) ou não (QUILLIAM et al., 2013), podendo contribuir também com a

capacidade de adsorção melhorada de compostos polares e apolares (ZHAO et

al., 2015a).

Entretanto, no presente estudo, foi verificado que a atividade enzimática

da β-glicosidade e fosfatase ácida é afetada positivamente por meio da

aplicação de biocarvão ativado, um importante condicionador de solo. O

biocarvão ativado apresenta maior área de superfície, volume e diâmetro dos

poros criados durante a pirolise (HONGJIE, 2014).

O tamanho dos poros favorece o movimento de raízes através do solo, o

que pode ser um dos fatores responsáveis pela maior produção de enzimas na

presença do biocarvão ativado (JAAFAR et al., 2015). Esses mesmos autores,

verificaram a presença de pequenas partículas de solo no interior desses poros

e concluíram que o aumento da porosidade do biocarvão fornece um habitat

seguro, água e nutrientes para a reprodução dos microrganismos, favorecendo

a atividade microbiana no solo (JOSEPH et al., 2010).

Além das características físicas do biocarvão, algumas propriedades

químicas do solo correlacionam-se com a atividade da β-glicosidade. O grande

volume de material orgânico em decomposição no solo (30,4 g dm-3 teor de

matéria orgânica no solo) podem ter contribuído também para atividade desta

enzima, uma vez que, a matéria orgânica fornece substrato para sua ação e

também protege as enzimas do solo em suas formas ativas (SOUZA E

57 LOBATO, 2004). Essa proteção ocorre devido à formação de complexos

enzimas-compostos húmicos (DENG E TABATABAI, 1997), deixando a β-

glicosidade indisponível para a degradação e desnaturação pelas enzimas

proteolíticas naturalmente presentes no solo das áreas cultivadas.

β-glicosidade e celobio-hidrolase são as principais controladoras da

dinâmica do carbono no solo. Estas enzimas refletem fortemente a

mineralização do C e são frequentemente utilizadas para indicar a taxa de

incorporação de carbono lábil no solo (SINSABAUGH et al., 2008). Liao et al.

(2016) observaram a maior atividade destas enzimas a medida que aumentava

a dose de biocarvão aplicado no solo, em comparação com o tratamento

controle (0 t ha-1). Os autores concluíram que a adição do biocarvão no solo

promove a mineralização do carbono, proporcionando substratos para estas

enzimas, além de que, os compostos voláteis liberados durante a produção do

biocarvão em baixas temperaturas de pirólise (350ºC a 500ºC) podem estimular

a atividade da β-glicosidade.

Wu et al. (2013) observaram que a aplicação do biocarvão não

proporcionou efeito sobre a atividade da β-glicosidade. Os autores sugeriram

que as formas de C do biocarvão produzidos a partir da palha de trigo eram

muito recalcitrantes e não estimularam a atividade enzimática do solo.

Os maiores valores de atividade enzimática observados em solos sob

Mata Nativa ocorrem devido ao maior aporte de resíduos nestes locais e

também pela diversidade deste material vegetal (LISBOA et al., 2012).

Resultados esses não observados na nossa pesquisa, em que a área de Mata

Nativa apresentou a menor atividade enzimática da β-glicosidade nos dois anos

de experimento. Nestes casos, outros fatores também deve estar influenciando,

como se verificou em nossa pesquisa em que a β-glicosidade correlacionou-se

positivamente com o pH nos dois anos de experimento.

Os solos da Mata Nativa apresentam um menor valor de pH quando

comparados com os valores da área cultivada, além disso, a composição dos

resíduos adicionado ao solo podem influenciar na atividade enzimática. Os

resíduos mais lignificados tendem a ser mais difíceis de decompor, reduzindo

assim a quantidade de resíduos carbonados, que são substrato da β-

glicosidade (BAILEY et al., 2011; PAZ FERREIRO et al., 2014).

58

Matsuoka et al. (2003), relataram que a atividade da β-glicosidase foi

maior no sistema de cultivo perene de uva do que na mata e na área de soja

convencional. Os autores atribuem esse fato aos restos vegetais de folhas,

frutos, galhos e flores na entrelinha da videira, pois a β-glicosidase atua na

etapa final da decomposição da celulose, sendo responsável pela hidrólise dos

resíduos de celobiose e formando o açúcar simples β-D-glucose.

Assim como a matéria orgânica, as argilas do solo também podem

estabilizar as enzimas e manter sua atividade por longos períodos de tempo

(ALLISON, 2006). Segundo Turner et al. (2002), esse mecanismo pode ser

direto, ou indireto, seja adsorvendo em sua superfície as próprias enzimas, ou

realizando uma proteção física a matéria orgânica, nutrientes e microrganismos

do solo.

Trazi (2014) relata que o biocarvão melhora as propriedades químicas

do solo em campo, após 30 meses de sua aplicação, principalmente pela

redução da acidez do solo e pelo aumento dos valores de saturação por bases,

K e P.

Em relação à atividade da fosfatase ácida, nos primeiros três meses, a

adubação com fósforo pode ter influenciado a baixa atividade desta enzima,

provavelmente devido a resíduos de fósforo disponíveis no solo, resultantes da

aplicação de fertilizante fosfatado (120 g de P2O5 por cova). Quanto maior a

disponibilidade de P solúvel no solo, menor é a atividade da enzima fosfatase

ácida (GATIBONE et al., 2008), uma vez que ela é liberada pelas plantas e

microrganismos quando há baixa disponibilidade de P solúvel no solo.

A fosfatase ácida pode estar presente nos exsudados liberados pelas

raízes das plantas, ao passo que, a fosfatase alcalina origina-se dos fungos e

bactérias do solo. Nos estudos de Jin et al. (2016), eles verificaram maior

atividade da fosfatase ácida nas amostras controles (sem aplicação do

biocarvão) em relação a fosfatase alcalina, em que a atividade da fosfatase

ácida diminuiu com adição do biocarvão. Os autores concluíram que esta

variação na atividade da fosfatase ácida e alcalina podem estar atribuídas a

aplicação do biocarvão, ao pH do solo e a disponibilidade de P.

De modo geral, as áreas sob vegetação nativa apresentam uma maior

atividade da fosfatase ácida, e as áreas cultivadas, os menores valores,

corroborando com os resultados obtidos por Evangelista et al. (2012) que

59 observaram a maior atividade da fosfatase ácida em área nativa de Cerrado no

período chuvoso e de estiagem. Outra razão para a maior atividade da

fosfatase ácida em áreas de vegetação nativa é a presença de grande

quantidade de carbono e fósforo orgânico contido na biomassa microbiana do

solo e baixa disponibilidade de fósforo inorgânico (GATIBONI et al., 2008).

Elzobair et al. (2015) observaram um efeito neutro do biocarvão no

potencial enzimático mas, observaram que a atividade da fosfatase ácida foi

maior após três anos de aplicação do biocarvão no solo. Entretanto, Carneiro et

al. (2008) verificaram que a fosfatase ácida não foi capaz de diferenciar os

manejos e usos do solo estudado, não encontrando diferenças significativas

entre si e também não encontraram correlação dela com a fertilidade de um

latossolo vermelho.

Segundo Dick et al. (1988), a matéria orgânica é outro fator que pode

influenciar na atividade desta enzima, uma vez que apresenta efeitos benéficos

sobre a comunidade microbiana, além de proteger fisicamente e manter as

enzimas na sua forma ativa no solo. Bailey et al. (2011) relataram que a

aplicação do biocarvão no solo geralmente aumenta a atividade enzimática

relacionados ao ciclo do N e P e reduz a atividade enzimática envolvidos no

ciclo do C.

A análise redundância revelou uma alta correlação da β-glicosidade com

o pH do solo, enquanto para a fosfatase ácida a correlação foi negativa, sendo

mais influenciada pelo uso do solo. Deng e Tabatabai (1997) afirmaram que a

maior atividade dessa enzima se expressa com pH do solo em torno de 5,0 e

que a atividade da fosfatase ácida tende a diminuir com o aumento do pH. As

alterações na atividade enzimática dos solos pode ser uma resposta das

alterações químicas após aplicação do biocarvão (ABUJABHA et al., 2015).

Enquanto outros estudos tem relatado um aumento no pH do solo após

a aplicação do biocarvão (KIMETU et., 2008; RUTIGLIANO et al., 2014;

AMELOOT et al., 2014; XU et al., 2014), nossos resultados mostraram que não

houve diferença no pH com aplicação do biocarvão em relação ao controle,

mas verificamos uma diminuição do pH após quinze meses da aplicação no

solo. O efeito do biocarvão no pH do solo depende do valor do pH do próprio

biocarvão, das condições de pirólise e do material usado para a sua produção

(LEHMANN et al., 2011). Um aumento da matéria orgânica após a adição do

60 biocarvão também pode diminuir o pH do solo, devido á atividade microbiana e

ácidos orgânicos liberados durante a decomposição (ABUJABHA et al., 2015).

Em nosso estudo, após 3 meses de aplicação do biocarvão no solo,

verificamos que o uso do solo foi o responsável pela mudança na estrutura da

comunidade bacteriana, onde houve a separação bem distinta de 3 grupos

(solo cultivado com biocarvão, solo de Mata Nativa e uma área não manejada

de solo com plantas espontâneas), em que a microbiota do solo foi influenciada

pelo uso do solo. As comunidades vegetais podem modificar as condições dos

micro-ambientes ocupados pelos microrganismos, devido ao aporte de material

vegetal e exsudados liberados, alterando assim as diversas populações na

comunidade microbiana do solo (NDAW et al., 2009), refletindo na maior

diversidade bacteriana observada nesse trabalho.

Evidenciou-se uma alteração na estrutura da comunidade bacteriana no

solo cultivado com teca influenciado pela adição do biocarvão no solo após

quinze meses. As alterações nas propriedades físico-químicas do solo após a

aplicação do biocarvão, tais como pH, teor de água, atividade enzimática,

diversidade microbiana e principalmente teor de carbono orgânico podem ser a

principal razão para alterações nas populações bacterianas do solo (LEHMANN

et al., 2011; KELLY et al., 2014; ABUJABHA et al., 2015).

A diversidade bacteriana, em nossos estudos, representada pelo Índice

de Shannon (H’) foi maior na Mata Nativa e no tratamento com aplicação do

biocarvão ativado. Nos estudos realizados por Liao et al. (2016), trabalhando

com aplicação de três doses de biocarvão (0 t ha-1; 2,5 t ha-1 e 4,5 t ha-1)

observaram aumento na diversidade bacteriana do solo representada pelo

Índice de Shannon (H’) a medida que incrementava as doses de biocarvão no

solo. Em nossa pesquisa, após quinze meses, a diversidade da Mata Nativa

ainda foi maior, e os tratamentos com o biocarvão apresentaram um valor de

Índice de Shannon (H’) semelhantes, em que as superfícies e poros do

biocarvão fornecem um habitat para os microrganismos, além de melhorar a

densidade, pH e a circulação de ar, água e nutrientes no interior da matriz do

solo (GUL et al., 2015).

Há uma ampla evidencia na literatura que a adição do biocarvão melhora

as propriedades físico-químicas do solo, refletindo na atividade dos

microrganismos do solo. A influência que o biocarvão tem nas comunidades

61 microbianas é fortemente afetada pelo tempo em que ele é adicionado e pelas

características do solo (THIES et al., 2015). As reações que ocorrem quando o

biocarvão recém-preparado é adicionado ao solo, é bastante diferente

daquelas que ocorrem depois que as superfícies do biocarvão foram afetadas

por processos bióticos e abióticos (ZHAO et al., 2015a ; ZHAO et al., 2015b).

Joseph et al. (2010) atribuem alguns fatores que podem influenciar as

características do biocarvão e suas reações no solo, como, a composição e

disponibilidade de nutrientes, matéria orgânica, textura do solo, condições de

pH, biota do solo, tipo de material vegetal, a proximidade do biocarvão da

rizosfera e as variações temporais da umidade do solo. Todos os fatores, em

conjunto, irão modular as alterações na atividade, abundancia e diversidade de

comunidades microbianas no solo.

6. CONCLUSÃO

A atividade da β-glicosidade é favorecida pela aplicação do biocarvão

ativado no solo. Contudo, a fosfatase ácida é mais influenciada pelo pH e uso

do solo, em relação a aplicação do biocarvão.

A área de Mata Nativa, apresentou a maior atividade da fosfatase ácida

e diversidade bacteriana e a menor atividade da β-glicosidade, que pode estar

relacionada ao pH mais ácido e a composição da matéria orgânica nestas

áreas.

As mudanças na estrutura das comunidades podem estar associadas

com o aumento da macroporosidade do biocarvão ativado, proporcionando um

nicho seguro para os microrganismos do solo, embora seja desconhecido em

que medida os efeitos benéficos do biocarvão mantém-se constante ao longo

do tempo.

A aplicação do biocarvão e o seu uso como condicionador do solo,

apresentam resultados variáveis nas características do solo, influenciando na

diversidade da comunidade bacteriana pelo tempo em que ele é adicionado.

62 7. AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de

Mato Grosso (FAPEMAT), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior (CAPES), a pesquisadora Dr. Fabiana de Abreu Rezende pelo

apoio e incentivo à pesquisa, a Universidade Federal de Mato Grosso e ao

programa de pós-graduação em Agronomia da UFMT pelo apoio no

desenvolvimento deste trabalho e a Embrapa Agrossilvipastoril pelo incentivo e

amparo na execução desta pesquisa.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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68 9. ANEXOS

EFEITO DA APLICAÇÃO DO BIOCARVÃO NOS ATRIBUTOS

MICROBIOLOGICOS DO SOLO, CULTIVADO COM TECA, NO BIOMA

AMAZÔNIA

Mirelly Mioranzaa, Jacqueline Jesus Nogueira da Silvab, Fabiana Abreu de Rezendec, Onã da

Silva Freddid, Anderson Ferreirac

a Programa de Pós-Graduação em Agronomia (UFMT, Sinop-MT) bPrograma de Pós-Graduação em Ciências Ambientais (UFMT, Sinop-MT) c Embrapa Agrossilvipastoril (Sinop-MT)

d Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT, Sinop-MT)

ANEXO A

Fig. 1. Fotografia aérea da unidade experimental do cultivo de Teca (Tectona grandi f. L) - Embrapa Agrossilvipastoril, 2015.

69 ANEXO B Média do pH e Umidade Gravimétrica do solo avaliado em experimento com 3 meses (2014) e 15 meses (2015) de aplicação do biocarvão em latossolo vermelho-amarelo, cultivado com Teca no Bioma Amazônia.

Tratamento pH em água

2014

pH em água

2015

UG (%)

2014

UG (%)

2015

T1 4,53a 4,40a 16,09a 25,05a

T2 4,73a 4,83a 16,96a 24,95a

T3 4,87a 4,72a 17,41a 25,43a

T4 4,80a 4,67a 16,27a 26,64a

T5 4,91a 4,69a 16,94ª 24,56a

T6 4,39a 4,64a 16,28a 24,92a

Pousio 3,82 4,31 22,11 23,12

Mata Nativa 3,18 3,33 21,04 24,10

CV (%) 5,49 6,24 6,12 4,66

T1- Muda sem biocarvão; T2- Muda com biocarvão; T3- Muda sem biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T4- Muda com biocarvão + biocarvão ativado aplicado no solo; T5- Muda sem biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo; T6- Muda com biocarvão + biocarvão não ativado aplicado no solo e duas áreas de referência. Médias seguidas da mesma letra indicam que não houve diferença estatística pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. ANEXO C

Gel de DGGE, para os tratamentos T1, T2 e T3 em 2014 (A) e tratamentos T4, T5 e T6 em 2015 (B) de bactérias (rDNA 16S) obtidos com gradiente de desnaturante de 35-65% com quatro repetições para cada tratamento.

A B

70 ANEXO D Resumo da analise de redundância (RDA). Seleção automática realizada com o teste de permutação de Monte Carlo em 2014.

Axes 1 2 3 4

Eigenvalues 0.177 0.101 0.058 0.019

Species-environment correlations 0.936 0.929 0.81 0.652

Cumulative percentage variance

of species data 17.7 27.8 33.6 35.5

of species-environment relation 48.1 75.6 91.2 96.4

Sum of all canonical eigenvalues 0.369

ANEXO E Resumo da analise de redundância (RDA). Seleção automática realizada com o teste de permutação de Monte Carlo em 2015.

Axes 1 2 3 4

Eigenvalues 0.157 0.097 0.051 0.022

Species-environment correlations 0.936 0.938 0.778 0.678

Cumulative percentage variance

of species data 15.7 25.4 30.5 32.6

of species-environment relation 46.9 78.8 91.1 97.6

Sum of all canonical eigenvalues 0.334