UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - pos.uea.edu.br · aguda da infecção, em que os sintomas são muito semelhantes. Estudos têm demonstrado a circulação de arbovírus em várias

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

“IDENTIFICAÇÃO DE ARBOVÍRUS CIRCULANTES DURANTE SURTO DE

DENGUE NA CIDADE DE MANAUS, AMAZONAS”.

VALQUIRIA DO CARMO ALVES MARTINS

MANAUS 2012

VALQUIRIA DO CARMO ALVES MARTINS

“IDENTIFICAÇÃO DE ARBOVÍRUS CIRCULANTES DURANTE SURTO DE DENGUE NA CIDADE DE MANAUS, AMAZONAS”.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador (a): Profª. Dr.ª MARIA PAULA GOMES MOURÃO

MANAUS

2012

Ficha Catalográfica

M386i Martins, Valquiria do Carmo Alves. Identificação de arbovírus circulantes durante surto de

dengue na cidade de Manaus, Amazonas. / Valquiria do Carmo Alves Martins. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2012.

62 f. : il.

Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMT, 2012. Orientadora: Profa. Dra. Maria Paula Gomes Mourão

1. Doença febril aguda. 2. Arbovírus 3. Diagnóstico molecular I. Título.

CDU: 614.4

Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana N Silva, lotada na Escola Superior de Ciências da Saúde - UEA

VALQUIRIA DO CARMO RODRIGUES ALVES

“IDENTIFICAÇÃO DE ARBOVÍRUS CIRCULANTES DURANTE SURTO DE DENGUE NA CIDADE DE MANAUS, AMAZONAS.”

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

BANCA EXAMINADORA (ordem alfabética)

CINTIA MARA COSTA DE OLIVEIRA LUIZ TADEU MORAES FIGUEIREDO MARIA PAULA GOMES MOURÃO

RAJENDRANATH RAMASAWMY

REGINA MARIA PINTO DE FIGUEIREDO

Manaus, 14 de Setembro de 2012. .

AGRADECIMENTOS

A Deus, que me permitiu avançar em mais uma fase da minha vida.

À minha família, que esteve sempre presente e me apoiando. Ao meu marido,

Renato Silva Martins por todo amor, paciência. Aos meus filhos, Laís Alves Martins e Leonardo Alves. À querida Maria de Nazaré, que me ajuda todos os dias

a cuidar da minha família e, muitas vezes, é mais mãe dos meus filhos do que eu

mesma.

À minha amada mãe, Maria da Penha Rodrigues Alves, que sempre esteve

ao meu lado, não apenas nos momentos fáceis, mas, principalmente, nos difíceis,

sempre em oração para que no final tudo desse certo.

À minha orientadora, Prof.ª Dra. Maria Paula Gomes Mourão, pela paciência

e confiança em investir na minha formação acadêmica.

Aos colegas da Gerência de Virologia: Dra. Márcia, Dra. Regina, Dr. Vorney, Dra. Cintia, Liane, Elizabeth, Evaulino, João Bosto, Valéria, Natália, Caroline.

Obrigada pelos conselhos, apoio, amizade e por compartilhar as minhas alegrias e

também as minhas dificuldades. Em especial à Dra. Michele de Souza Barrionuevo, amiga, colega de trabalho e de jornada, pelo incentivo, paciência,

ensinamentos e sábios conselhos e, principalmente, pela colaboração na elaboração

desta dissertação.

A todos os professores do Programa de Pós-Graduação Em Medicina Tropical / Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas, pelos ensinamentos,

auxílio e amizade.

Ao Prof. Dr. Rajendranath Ramasawmy pela paciência e confiança, pelos

ensinamentos preciosos e pelas experiências compartilhadas.

Ao Prof. Dr. Felipe Naveca, diretor do Instituto de Pesquisa Leônidas & Maria

Deane (ILDM), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Manaus-Amazonas, pelos

ensinamentos fundamentais em biologia molecular e apoio nas análises.

Ao Prof. Dr. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo (USP-Ribeirão Preto) por ter

gentilmente fornecido os vírus utilizados neste projeto.

Ao Prof. Dr. Sergio Nozawa, pelo apoio teórico e por disponibilizar o

laboratório de biologia aquática da Universidade Nilton Lins, Manaus-Amazonas,

para análises de sequenciamento.

Às minhas amigas Giselle Falabella e Raquel Falabella pela amizade, apoio

e ajuda nos desenhos gráficos.

À Fundação Centro de Controle em Oncologia do Estado do Amazonas,

instituição na qual sou vinculada profissionalmente, a toda a sua Diretoria e, em

particular à Gerência do Laboratório de Analises Clínicas, por me permitir traçar

mais esta jornada.

Agradeço, enfim, a todas as pessoas que contribuíram para a melhoria deste

trabalho.

RESUMO

Os arbovírus são muitas vezes ligados a surtos em humanos e representam

um grave problema de saúde pública. Em geral, podem causar sintomatologia,

caracterizada por febre aguda, dor de cabeça, mialgias, artralgia, exantema, até

doenças mais graves, tais como hepatite e encefalite. Na maioria dos casos, o

diagnóstico diferencial entre os arbovírus pode ser difícil, especialmente na fase

aguda da infecção, em que os sintomas são muito semelhantes. Estudos têm

demonstrado a circulação de arbovírus em várias regiões do Brasil, durante

epidemias, e mostrou a necessidade de um sistema de vigilância eficiente para

controlar a entrada e a circulação de arbovírus. Em Manaus, a Fundação de

Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) é uma instituição pioneira

na implementação da vigilância de síndrome febril aguda indiferenciada. Este

estudo, portanto, teve como objetivo estudar os casos de doença febril aguda

indiferenciada, atendidos em um hospital terciário na Bacia Amazônica, durante a

epidemia de dengue em Manaus. No período de 1° de janeiro a 31 de maio de 2011,

foram incluídas no inquérito 677 amostras biológicas (soro) de pacientes com

suspeita clínica de dengue, notificados à Gerência de Virologia da FMT-HVD, para

confirmar o diagnóstico. Durante o período do estudo, todas as amostras foram

testadas e confirmadas por PCR e Nested-PCR, usando primers específicos para

Flavivirus (DENV 1-4, SLEV, BSQV, ILHV), Alphavirus (MAYV) e Orthobunyavirus

(OROV). Após a purificação de ácido nucleico, de 38,4% (260/677) foram positivas

para Flavivirus. Destes, DENV foi identificado em 100% das amostras, com 26

(10,0%) DENV-1, 120 (46,2%) DENV-2, 24 (9,2%) DENV-3, 77 (29, 2%) DENV-4, e

co-infecções de: DENV-1/4 5 (1,9%); DENV-1/2 1 (0,4%) DENV-2/4 6 (2,3%) e

DENV- 3/4 (0,4%). Uma análise comparativa das sequências dos quatro sorotipos

circulantes mostra uma similaridade de 97-99% com as sequências referências

depositadas no GenBank. De acordo com árvore filogenética tipo neighbor-joining,

as sequências obtidas no estudo para Dengue-1 são pertencentes ao genótipo V;

para Dengue-2 ao genótipo Asiático/americano; para Dengue-3 ao genótipo III; e

para o Dengue-4 genótipo II. Todas as amostras foram negativas para os gêneros

Alphavirus (MAYV) e Orthobunyavirus (OROV). Aumento da incidência de casos de

dengue e a ocorrência dos quatro sorotipos podem propiciar o risco de novas

epidemias e o aumento dos casos de dengue grave. No entanto, apenas o

monitoramento de doenças endêmicas e emergentes, que causam doença febril

aguda indiferenciada, pode fornecer as informações necessárias para as medidas

políticas adequadas e a vigilância da saúde pública para a região.

Palavras-chaves: Doença febril aguda, arbovírus, diagnóstico molecular, Amazonas.

ABSTRACT

Arboviruses often cause outbreak in humans and are a serious threat to public

health. Clinical manifestations from arbovirus infection may range from mild

symptoms , such as acute fever, headache, myalgia, artralgia or rash to severe

disease as bleeding, hepatitis or encephalitis. In most cases, the clinical differential

diagnosis between arboviruses can be difficult, especially in the acute phase of

infection, where symptoms are very similar. Several studies have shown the

circulation of arboviruses in various regions of Brazil during outbreaks and highlight

the urgency of an efficient system of surveillance to monitor the entry and circulation

of arboviruses. In Manaus, the Fundação de Medicina Tropical, Dr. Heitor Vieira

Dourado (FMT-HVD) is the first hospital that implemented the surveillance of acute

undifferentiated febrile syndrome. Here, the aim is to study the cases of acute

undifferentiated febrile illness seen in the tertiary referral hospital FMT-HVD of the

Brazilian Amazon Basin during the dengue epidemic in Manaus. From the first

January to May 2011, 677 sera samples from patients with suspected dengue clinical

manifestations were sent to the virology laboratory of the FMT-HVD to confirm

diagnosis. All the samples underwent nucleic acids purification and submitted to PCR

and nested PCR using specific primers for Flavivirus (DENV 1-4, SLEV, BSQV,

ILHV), Alphavirus (MAYV) and Orthobunyavirus (OROV). Of the 677 samples tested

by PCR and nested PCR, 260 (38.4%) were positive for Flavivirus. DENV was

detected in all the 260 samples. Of these, 26 (10.0%) had DENV-1, 120 (46.2%)

DENV-2, 24 (9.2%) DENV-3, 77 (29.2%) DENV-4, and co-infections of DENV-1/4,

DENV-1/2, DENV-2/4, e DENV- ¾ were observed in 5 (1,9%), 1 (0,4%), 6 (2,3%) and

1 (0,4%) respectively. Nucleotides sequence comparative analysis of the four

serotypes individually showed similarity ranging from 97 to 99% to each serotype

sequence in the database of GenBank. Phylogenetics construction using the

neighbor-joining methods revealed that the sequences obtained for DENV-1 belong

to genotype-V while DENV—2 to the Asian/American genotype, DENV-3 to

genotype III and DENV-4 to genotype II. Neither Alphavirus (MAYV) nor

Orthobunyavirus (OROV) was detected in all the samples. The increasing incidence

of dengue cases and the occurrence of the four serotypes simultaneously indicate

the risk of new epidemics and increased cases of dengue hemorrhagic fever.

However, only the monitoring of endemic and emerging diseases causing acute

undifferentiated febrile illness can provide the information necessary for appropriate

policy action and public health surveillance for the region.

Keywords: Febrile disease, acute, arbovirus, molecular diagnosis, Amazonas.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Ciclo de transmissão dos arbovírus. 02

Figura 2:

Ilustração da morfologia do virion de um Flavivirus e suas

principais proteínas estruturais.

04

Figura 3:

Esquema do genoma dos Flavivirus a partir de uma ORF.

04

Figura 4:

Fluxograma das manifestações clínicas causadas pela

infecção do vírus Dengue.

09

Figura 5:

Ilustração da morfologia do virion de um Alphavirus e suas

principais proteínas estruturais.

15

Figura 6:

Ilustração da morfologia do virion da Família Bunyaviridae e

suas principais proteínas estruturais.

18

Figura 7:

Ilustração do genoma da Família Bunyaviridae.

19

Figura 8:

Diagnóstico laboratorial das arboviroses.

22

Figura 9:

Fluxograma da metodologia aplicada às amostras incluídas no

estudo.

30

LISTA DE TABELA

Tabela 1. Proteínas virais dos Flavivirus e sua função. 05

Tabela 2.

Sinais de alarme e choque na infecção pelo vírus Dengue.

09

Tabela 3.

Relação de arbovírus brasileiros em estudo.

29

Tabela 4.

Relação das estirpes de arbovírus brasileiros que serão utilizadas

no estudo como controle positivo.

31

Tabela 5.

Relação de primers utilizados no estudo.

34

Tabela 6.

Relação de sequências de vírus DENV utilizadas na análise

filogenética.

45

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

°C Graus Celsius

3’NC 3’Não codificante

5’NC 5’Não codificante

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

BSQV Vírus Bussuquara

C Proteína do capsídeo

cDNA DNA complementar

CEP Comitê de Ética em Pesquisa

CHIKV Vírus Chikungunya

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

CPCV Vírus Cacipacoré

DENV Vírus dengue

DENV-1 Vírus Dengue sorotipo 1




DF Febre do dengue

DG Dengue grave

DHF Febre hemorrágica do dengue

DNA Ácido desoxirribonucleico

DNG Dengue não grave

DNG(SA) Dengue não grave com sinais de alerta

dNTP Desoxirribonucleosídeos trifosfatados

ddNTP Didesoxirribonucleosídeos trifosfatados

DSS Síndrome do choque do dengue

E Proteína do Envelope

E1 Proteína 1 do envelope viral

E2 Proteína 2 do envelope viral

E3 Polipeptídeo E3

ELISA Ensaio imunoenzimático

FA Febre amarela

FAS Febre amarela silvestre

FAPEAM Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas

FC Fixação do complemento

FMT-HVD Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado

G1 Proteínas G1 do envelope viral

G2 Proteínas G2 do envelope viral

IF Imunofluorescência

IFI Imunofluorescência indireta

IgG Imunoglobulina G

IgM Imunoglobulina M

IGUV Vírus Iguape

IH Inibição de hemaglutinação

ILHV Vírus Ilhéus

JEV Vírus da encefalite japonesa

M Molar

M Proteína da membrana

MAYV Vírus Mayaro

MgCl2 Cloreto de Magnésio

MgSO4 Sulfato de Magnésio

min. Minutos

mL Mililitro

mM Milimolar

MS Mistério da Saúde

N Proteína do nucleocapsídeo

NASBA Nucleic acid sequence based amplification

NB3 Nível três de biossegurança

nm Nanômetros

NS1 Proteína não estrutural 1

NS2a Proteína não estrutural 2a

NS2b Proteína não estrutural 2b


NS4a Proteína não estrutural 4a

NS4b Proteína não estrutural 4b


NSm Proteína não estrutural M

nsP1 Proteína não-estrutural P1




NSs Proteína não estrutural S

ORF Open Reading Frame

OROV Vírus Oropouche

pb Pares de base

PCR Reação em Cadeia de Polimerase

pmol Picomol

PM Peso molecular

PPSUS Programa de Pesquisa para o SUS

PrM Proteína de Pré-membrana

RNA Ácido Ribonucléico ROCV Vírus Rocio

RT-PCR Reação da transcriptase reversa, seguida de Reação em cadeia de polimerase

SLEV

Vírus da encefalite de Saint Louis

th

Temperatura de hibridização

TBEV

Vírus da encefalite transmitida por carrapatos

TCLE

Termo de consentimento livre e esclarecido

td Temperatura de desnaturação

te Temperatura de extensão

TN Teste de neutralização

UEA Universidade do Estado do Amazonas

VEEV Vírus da encefalite equina venezuelana

WNV Vírus do Nilo Ocidental

YFV Vírus da Febre Amarela

μl Microlitro

μM Micromolar

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 01

1.1 Considerações gerais dos arbovírus ................................................... 01

1.2 Família Flaviviridae – Gênero Flavivirus.............................................. 03

1.2.1 Vírus da Febre amarela (YFV) ............................................................ 07

1.2.2 Vírus Dengue (DENV) ......................................................................... 07

1.2.3 Vírus Bussuquara (BSQV) .................................................................. 12

1.2.4 Vírus Cacipacoré (CPQV) ................................................................... 12

1.2.5 Vírus Ilhéus (ILHV) .............................................................................. 13

1.2.6 Vírus da encefalite de Saint Louis (SLEV) .......................................... 13

1.3 Família Togaviridae – Gênero Alphavirus............................................ 15

1.4 Família Bunyaviridae – Gênero Orthobunyavirus................................. 18

1.5 Diagnóstico laboratorial das arboviroses.............................................. 20

1.5.1 Reação em cadeia da polimerase e sequenciamento nucleotídico... 22

2 JUSTIFICATIVA .......................................................................................... 25

3 OBJETIVOS.................................................................................................. 26

3.1 Geral..................................................................................................... 26

3.2 Específico............................................................................................. 26

4 METODOLOGIA............................................................................................ 27

4.1 Modelo de estudo ................................................................................ 27

4.2 Universo de estudo............................................................................... 27

4.2.1 Local de estudo.................................................................................... 27

4.2.2 Definição de caso................................................................................. 27

4.2.3 População de estudo............................................................................ 27

4.2.4 Participantes......................................................................................... 28

4.3 Procedimentos...................................................................................... 28

4.3.1 Doenças em estudo e algoritmos de investigação e diagnóstico........ 28

4.3.2 Métodos de diagnóstico laboratorial..................................................... 31

4.3.2.1 Protocolo de extração de RNA............................................................. 32

4.3.2.2 Síntese de DNA complementar (cDNA)............................................... 32

4.3.2.3 Primers................................................................................................. 33

4.3.2.4 Protocolo de PCR para identificação de Alphavirus ............................ 35

4.3.2.5 Protocolo de PCR para identificação de Flavivirus ............................. 37

4.3.2.6 Protocolo de PCR para identificação de Orthobunyavirus .................. 42

4.3.2.7 Avaliação eletroforética dos produtos de amplificação........................ 43

4.3.2.8 Sequenciamento nucleotídico.............................................................. 44

4.3.2.9 Análise da sequências.......................................................................... 45

4.3.3 Aspectos éticos.................................................................................... 47

4.4 Análise estatística dos resultados........................................................ 47

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 48

6 CONCLUSÃO .............................................................................................. 49

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 50

8 ANEXOS........................................................................................................ 63

8.1 Equipe científica de apoio ao desenvolvimento do projeto.................. A

8.2 Ficha clínica padrão para o estudo...................................................... B

8.3 Certificado de aprovação – CEP/FMT-HVD......................................... C

8.4 Termo de consentimento livre e esclarecido....................................... D

8.5 Artigo científico ................................................................................... E

1

Identificação de arbovírus circulantes durante surto de dengue na cidade de Manaus, Amazonas.

1. INTRODUÇÃO 1.1 Considerações gerais dos arbovírus

Os arbovírus (arthropod-borne-virus) são vírus que podem ser transmitidos ao

homem por vetores artrópodes (mosquitos, carrapatos, percevejos, entre outros) e

estão frequentemente associados a surtos ou epidemias. Representando um sério

problema de saúde pública, com implicações econômicas e sociais nos países

tropicais (1).

O Brasil é um país tropical de grande porte e um terço do seu território ainda

é coberto por florestas tropicais e outros ecossistemas naturais, os quais fornecem

condições ideais para ocorrência de diversas arboviroses, mantidas, em sua maioria,

por complexos ciclos zoonóticos. Estes envolvem patógenos que normalmente

circulam entre os animais não humanos, mas podem ser transmitido aos seres

humanos (2). Em um ciclo de manutenção enzoótico, envolvendo aves, roedores e

primatas, o que ocorre em hábitat silvestre. O vírus da Febre Amarela (YFV) é um

exemplo. Entretanto, acidentalmente, de forma menos comum, podem ser

transmitidos aos seres humanos (Figura 1) (3).

Os arbovírus precisam de um hospedeiro — no qual são replicados — e de

um vetor para a transmissão para outros organismos. A fêmea do mosquito, durante

a hematofagia, adquire e transmite o vírus ao hospedeiro. A transmissão vertical

pode ocorrer também, por via transovariana, na qual o artrópode infecta

verticalmente parte de sua prole (4).

De uma forma geral, as arboviroses podem causar desde sintomas leves,

caracterizados por febre, cefaleia, mialgia, artralgia, exantema, até doenças mais

graves, como aquelas que culminam com hemorragia, hepatite e encefalite, variando

de acordo com o tipo de arbovírus responsável pela infecção (2). Na maioria das

vezes, o diagnóstico clínico diferencial entre arboviroses pode ser difícil, sobretudo

na fase aguda da infecção, quando os sintomas são muito parecidos (5).

2


Figura 1: Ciclo de transmissão dos arbovírus. Descritos em três grandes categorias

de ambientes: natural (florestas), modificado (rural ou agrícola) e humanos (urbanos). Este esquema é um modelo geral que pode ser adaptado de acordo com o patógeno, o(s) vetor (es), o(s) hospedeiro(s) e o meio ambiente em que eles ocorrem (3).

A maioria dos arbovírus conhecidos tem o genoma constituído por ácido

ribonucleico (RNA) e são classificados, por meio de um sistema universal baseado

nas características físico-químicas, nas famílias: Bunyaviridae, Flaviviridae,

Reoviridae, Rhabdoviridae e Togaviridae (2). Reconhece-se ainda a existência de

possíveis arbovírus, fazendo parte das famílias: Arenaviridae, Poxviridae,

Herpesviridae e Coronaviridae, entre outras (6).

Apesar de pertencerem a um grupo heterogêneo, aqueles de importância

médica são agrupados em gêneros específicos. Os exemplos mais proeminentes de

arboviroses emergentes incluem: vírus do Nilo Ocidental (WNV, Flavivirus), na

América do Norte; o vírus da encefalite japonesa (JEV, Flavivirus), na Ásia; o vírus

Chikungunya (CHIKV, Alphavirus), na região do Oceano Índico. Nas Américas o

vírus da febre amarela, o vírus Oropouche, o vírus Mayaro e diversos outros

arbovírus, causadores de encefalite, e principalmente, o vírus dengue (DENV,

Flavivirus) em grande parte do mundo (4, 7).

3


No Brasil, são conhecidas mais de 40 espécies de arbovírus causadores de

doença humana e algumas delas estão associadas a epidemias em áreas urbanas.

Destacam-se: o vírus Dengue (DENV), vírus Mayaro (MAYV), Oropouche (OROV) e

Rocio (ROCV) os quais têm sido responsáveis por 95% dos casos de arboviroses

humanas no Brasil (6). Portanto, a maioria das arboviroses se concentra nos

gêneros Flavivirus, Alphavirus e Orthobunyavirus.

1.2 Família Flaviviridae – Gênero Flavivirus

A família Flaviviridae compreende os gêneros Flavivirus, Pestivirus e

Hepacivirus. Os Flavivirus incluem um grupo de importantes arbovírus, responsáveis

por considerável morbidade e mortalidade, pois podem causar doença encefálica

grave, febre hemorrágica, hepatite e doença febril em humanos (8).

Os Flavivirus compartilham características comuns quanto à morfologia dos

virions, determinantes antigênicos e a organização genômica. Apresentam formato

esférico, o envoltório mede cerca de 40-60 nm de diâmetro e inclui o nucleocapsídeo

contendo aproximadamente 11.000 nucleotídeos. O genoma é constituído por RNA

de fita simples, linear, de polaridade positiva, composto por uma região terminal não

codificante 5’ (7-metilguanosina); por uma estrutura única de leitura aberta (ORF) —

que contém mais de 10.000 nucleotídeos — e por uma região terminal não

codificante 3’ que não é poliadenilado — elemento distintivo desta família. A

poliproteína codificada pela cadeia aberta de leitura, após clivagem, libera três

proteínas estruturais: o capsídeo viral (C), a pré-membrana (prM) e o envelope (E) e

sete proteínas não estruturais: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4A, NS4B, NS5; das

quais a NS5 apresenta a sequência mais conservada entre as várias espécies do

gênero, conforme demonstrado nas (Figuras 2 e 3) (9, 10).

4


Figura 2: Ilustração da morfologia do virion da família Flavivirus e suas principais proteínas estruturais. Viriões maduros contêm duas proteínas da membrana do vírus codificado (M e E), enquanto que partículas virais imaturas contêm uma proteína precursora de membrana.

GENOMA – ESTRUTURA ÚNICA DE LEITURA ABERTA (ORF)

Figura 3: Esquema do genoma dos Flavivirus a partir de uma ORF. http://expasy.org/viralzone/all_by_species/43.html

As funções das proteínas virais ainda não foram totalmente estabelecidas.

Sabe-se, entretanto, que as proteínas estruturais são incorporadas ao virion durante

a maturação e liberação viral e as proteínas não estruturais são responsáveis pela

5


replicação nas células infectadas. As suas principais atividades conhecidas estão

descritas na Tabela 1 (9, 11).

Tabela 1: Proteínas virais dos Flavivirus e sua função.

Proteína Função

E Proteína responsável pela ligação do vírus na célula, bem como pela fusão com a membrana endossomal, sendo o maior determinante antigênico viral.

C Juntamente com o RNA viral, forma o nucleocapsídeo viral e está envolvida no transporte da proteína prM (precursora da proteína M) ao retículo endoplasmático para ser glicosilada.

M Proteína formada a partir do processamento de sua precursora prM, sendo uma proteína de membrana de partículas virais maduras.

NS 1 Participa, de forma essencial, na replicação do RNA viral, pois estudos de mutagêneses em NS1 causaram diminuição drástica na replicação do RNA e produção viral.

NS 2 Participa na replicação viral e pode estar associada à inibição de interferon. NS2B forma um complexo estável com a proteína NS3, agindo como um co-fator para a atividade serino-protease.

NS 3

Proteína multifuncional, com atividade de serino-protease na sua porção aminoterminal, é uma RNA-helicase RNA-dependente. Além disso, codifica uma atividade de RNA trifosfatase com o propósito de desfosforilar a região 5’ terminal do genoma do RNA, antes da adição da CAP.

NS 4 A e B As proteínas NS4 A e B são hidrofóbicas, associadas à membrana e pouco conservadas entre os Flavivirus. Acredita-se que são componentes da replicase por formarem complexos com NS2B e NS3.

NS 5 A proteína NS5 é a maior das proteínas virais e altamente conservada entre os Flavivirus. Apresenta atividade de RNA polimerase RNA-dependente na região 9 carboxi-terminal e metiltransferase em sua porção aminoterminal.

*E (Proteína do Envelope), M (Proteína da membrana), C (Proteína do capsídeo), NS1 (Proteína não estrutural 1), NS2 (Proteína não estrutural 2), NS3 (Proteína não estrutural 3), NS 4 a/b (Proteína não estrutural 4a/b), NS5(Proteína não estrutural 5)(8).

A evolução dos Flavivirus e sua epidemiologia são largamente determinadas

pelas necessidades ecológicas de seus hospedeiros vertebrados e invertebrados

(Figura 1). Estes podem ser agrupados por sequências de nucleotídeos, distribuição

geográfica e associações ecológicas. Com base no relacionamento antigênico

cruzado estes vírus podem ser divididos em oito subgrupos, utilizando testes

6


específicos de neutralização. Estes grupos antigênicos são: Tick-borne encefalitis

(TBEV), Rio Bravo, o JEV, Tyulenity, Ntaya, Uganda S, DENV e Modoc. Os

Flavivirus brasileiros ILHV, ROCV, YFV, CPCV e IGUV não foram agrupados, de

acordo com esta metodologia, pois não apresentaram reação significativa com

outros Flavivirus (12).

Alguns estudos filogenéticos, a fim de estabelecer relações genéticas entre os

Flavivirus brasileiros, com base em alinhamento de nucleotídeos e sequências de

aminoácidos do gene NS5, mostraram que os Flavivirus brasileiros estão agrupados

em três ramos principais: 1) ramo do dengue — subdividido nos tipos 1, 2, 3 e 4; 2) o

complexo JEV, incluindo SLEV, Cacipacoré, Bussuquara, Rocio, Ilhéus, Iguape; 3) o

ramo do vírus da Febre Amarela. Os vírus relacionados com o vírus da encefalite

japonesa (JEV) estão normalmente associados com mosquitos Culex spp,

comumente ornitófilos, e tendem a causar infecções, como Iguape e Cacipacoré,

apesar de nunca ser descrito como causa de doença humana. Os vírus Bussuquara

e lhéus não foram descritos como causa de encefalite em humanos, mas, com base

na sua estreita relação filogenética com o vírus Rocio e SLEV, poderiam ser

causadores potenciais de infecções do sistema nervoso central em humanos (10,

13-15).

Os Flavivirus, mesmo tirando a participação dos vírus dengue, são

importantes causadores de doença em todo mundo, destacando-se um complexo

identificado filogeneticamente por vírus zoonóticos de aves, são transmitidos por

mosquitos culicídeos e, ao infectarem o homem, podem causar doença febril aguda

ou meningoencefalite (16). Sabe-se que dos 11 Flavivirus, encontrados no

Brasil, nove foram isolados na região Amazônica. Estes, além dos DENV-1, DENV-

2, DENV-3 e DENV-4, são: vírus da Febre Amarela (YFV), Bussuquara (BSQV),

Cacipacoré (CPCV), vírus Ilhéus e vírus da encefalite de Saint Louis (SLEV) (17,

18).

7


1.2.1 Vírus da Febre Amarela (YFV)

O vírus da Febre Amarela foi causador de uma das doenças mais temidas,

antes do desenvolvimento de uma vacina. Hoje, ele ainda infecta cerca de 200.000

pessoas por ano; nas regiões tropicais da África — onde ocorrem cerca de 90% dos

casos — e representa um perigo significativo para os viajantes não vacinados para

essas áreas. Esses números são amplamente reconhecidos e podem estar

subestimados, devido à dificuldade de vigilância epidemiológica nas áreas

endêmicas. O vírus da Febre Amarela, o protótipo do gênero Flavivirus, é transmitido

em um ciclo envolvendo macacos e mosquitos (Haemagogus spp nas Américas e

Aedes spp na África), mas os seres humanos também podem servir como

hospedeiros acidentais para a infecção do mosquito. Apesar de a febre amarela

urbana ter sido extinta no Brasil desde 1948, os recentes aumentos na densidade e

distribuição de um possível vetor urbano — o mosquito Aedes aegypti — bem como

o aumento das viagens aéreas aumentam o risco de introdução e propagação da

febre amarela (19, 20).

Um método eficaz para prevenir a febre amarela é a vacinação. Mas mesmo

com uma extensiva campanha de vacinação e o alerta do perigo de se visitar áreas

de risco sem cobertura vacinal, a partir dos anos 80 tem se verificado a re-

emergência da febre amarela silvestre no Brasil. De 1990 a 2010 ocorreram 587

casos, com 259 óbitos (44,1%). A maioria dos casos ocorreu na região Norte com

178 casos (30,3%). Os outros episódios ocorreram em 16 estados do Brasil. O

estado com maior número isolado de casos foi Minas Gerais, com 104 casos (17,7

%). No Amazonas foram notificados 43 casos (7,3%), com 31 óbitos (72,1%). O

agravo foi mais frequente em pessoas acima de 15 anos, do sexo masculino, em

geral agricultores, madeireiros, pescadores e ecoturistas (21).

1.2.2 Vírus Dengue (DENV)

O dengue é um dos principais problemas de saúde pública no mundo.

Segundo estimativa da Organização Mundial de Saúde (OMS), 50-100 milhões de

8


pessoas são infectadas anualmente, dentre as quais cerca de 550 mil necessitam de

hospitalização e 20 mil morrem em consequência da doença. O vírus Dengue

(DENV) é o agente causador da febre do dengue clássica (DF), febre hemorrágica

do dengue (DHF) e da síndrome do choque do dengue (DSS). O dengue clássico e

a febre hemorrágica do dengue são, portanto, as arboviroses mais difundidas no

mundo e constituem causa importante de morbidade e mortalidade, resultando em

epidemias de impacto em saúde pública (22). O mosquito do gênero Aedes é o vetor

transmissor ao homem. O aumento da expansão desse vetor está relacionado,

proporcionalmente, à expansão dos grandes centros urbanos do Novo Mundo.

Resultante desse fato, estão as grandes epidemias (3).

Os DENVs são um conjunto de quatro diferentes sorotipos do vírus (DENV 1-

4). Estes são distintos entre si, mas relacionados antigenicamente. A imunidade

protetora induzida pelo vírus é duradoura e específica para cada sorotipo. Desta

maneira, indivíduos que vivem em áreas endêmicas podem desenvolver, após a

infecção, até quatro episódios de doença causada por DENV durante a vida. Uma

imunidade cruzada entre os diferentes tipos sorotipos pode ocorrer em até seis

meses após uma infecção natural (20, 23).

A descrição clínica da infecção pelo vírus dengue é frequentemente realizada

de forma polarizada: o dengue não grave (DNG) e o dengue grave (DG), podendo

evoluir para um quadro de choque (Figura 4). O quadro clinico pode variar desde

uma infecção assintomática a um quadro inespecífico com sintomas gerais como

febre, cefaleia, náuseas, vômitos, dor retrorbital, mialgias, artralgia e erupção

cutânea. Alguns sintomas (sinais de alerta) podem prenunciar gravidade, mesmo

que não haja alterações laboratoriais características, tais como vômitos muito

frequentes, dor abdominal, tonturas com hipotensão postural e hemorragias.

Condições preexistentes (hipertensão arterial, diabetes, asma e gravidez) podem

favorecer a evolução com gravidade (24).

A presença de sinais de alarme deve ser ativamente pesquisada em todos os

pacientes com suspeita de dengue, pois indica precocemente a possibilidade de

9


evolução para a gravidade. Os principais sinais estão listados na Tabela 2. Deve

também ser dada atenção a sinais de choque durante a realização do exame físico

(25).

Figura 4: Fluxograma das manifestações clínicas causadas pelo infecção pelo vírus

Dengue.

Tabela 2: Sinais de alarme e choque na infecção pelo vírus Dengue.

Sinais de alarme

Dor abdominal intensa e contínua;

Vômitos persistentes;

Hipotensão postural e/ou lipotímia;

Hepatomegalia dolorosa;

Hemorragias importantes (hematêmese e/ou melena);

Sonolência e/ou irritabilidade; diminuição da diurese;

Diminuição repentina da temperatura corpórea ou hipotermia;

Aumento repentino do hematócrito;

Queda abrupta de plaquetas;

Desconforto respiratório.

10


Sinais de choque

Hipotensão arterial; pressão arterial convergente

(PA diferencial < 20 mmhg);

Extremidades frias, cianose;

Pulso rápido e fino;

Enchimento capilar lento (> 2 segundos).

Segundo a World Health Organization (2009), a incidência de dengue tem

aumentado dramaticamente em todo o mundo nas últimas décadas. Mais de 2,5

bilhões de pessoas - mais de 40% da população mundial - estão agora em risco de

dengue. A OMS estima que pode ser de 50-100 milhões de infecções de dengue em

todo o mundo a cada ano. A doença tornou-se endêmica em mais de cem países da

na África, nas Américas, no Mediterrâneo Oriental, Sudeste da Ásia e do Pacífico

Ocidental. Sudeste da Ásia e as regiões ocidentais do Pacífico são as mais

seriamente afetadas (26).

Casos nas Américas, Sudeste Asiático e Pacífico Ocidental ultrapassaram 1,2

milhões de casos em 2008 e mais de 2,2 milhões em 2010. Recentemente, o

número de casos notificados permanecem aumentando. Em 2010, 1,6 milhão de

casos de dengue foram notificados apenas nas Américas, dos quais 49.000 eram

graves. A maior parte da região se tornou hiperendêmica com relato de co-

circulação de vários sorotipos (27).

No Brasil, o aumento na incidência de dengue é especialmente ligado à

dispersão e a níveis de infecção pelo Aedes aegypti. O dengue foi diagnosticado no

Brasil, pela primeira vez, em Boa Vista, estado de Roraima. A partir de sinais,

sintomas e laboratorial, em 1982, numa epidemia causada pelos sorotipos 1 e 4

(28). Na epidemia de 1986, a circulação do sorotipo DENV-1 foi detectada

inicialmente no estado do Rio de Janeiro e se espalhou para seis estados em 1990.

Naquele ano, a circulação de um novo sorotipo, DENV-2, foi detectado também no

estado do Rio de Janeiro. Dez anos depois, o DENV-3 foi detectado, pela primeira

vez, no estado do Rio de Janeiro e, posteriormente, no estado de Roraima, em

novembro de 2001 (29).

11


O número de casos confirmados acumulados no Brasil de 1998 a 2009

ultrapassou 4,3 milhões. No estado do Amazonas, os casos de dengue só

começaram a ser notificados a partir de 1998 e até 2009 foram confirmados 66,3 mil

casos. Em Manaus, no primeiro semestre de 2011, foram notificados 51.831 mil

casos e 13 óbitos (30-32). Em relação ao dengue hemorrágico, a situação é de

extrema preocupação devido ao aumento impressionante no número de casos nos

últimos anos. O estabelecimento dos quatro sorotipos, nas Américas, aumenta a

chance de formas graves da doença, bem como o aumento da incidência em

crianças e adultos jovens (33, 34).

De 1998 a 2000, foram notificados cerca de 26.000 casos de dengue no

estado do Amazonas. No ano de 2001, durante uma grande epidemia, mais de

19.000 casos foram notificados. Naquele ano, a Gerência de Virologia da FMT-HVD

isolou os DENV-1 e DENV-2, dentre estes, houve casos de febre hemorrágica (35).

Em 2003 foi isolado, pela primeira vez no Amazonas, o DENV-3 de um paciente

procedente da Bahia. Entretanto, na ocasião, muitos pacientes com sintomatologia

sugestiva de dengue, mostraram-se negativos para este vírus nos exames

específicos, sugerindo a ocorrência de infecções por outros arbovírus, dentre os

quais se ressaltam os Flavivirus (36).

O DENV-4 foi identificado, pela primeira vez em Manaus, durante um

estudo realizado na FMT-HVD, no ano de 2008 (33). Mais recentemente, teve-se o

conhecimento de epidemias silenciosas de febre por Oropouche (37, 38) e febre por

Mayaro (39), demonstrando a importância do diagnóstico laboratorial sistemático

dessas infecções entre os pacientes com síndrome febril aguda.

Embora reconhecendo que o dengue é hoje uma das mais importantes

flaviviroses, existem outros Flavivirus (vírus Bussuquara, Cacipacoré, Ilhéus e

vírus da encefalite de Saint Louis) negligenciados. Apresentam quadro clínico

bastante inespecífico, o qual pode ser compartilhado com inúmeras doenças

infecciosas e não infecciosas, e tem sido pouco discutido na literatura médica (2).

Alguns inquéritos soro epidemiológicos realizados demonstraram que mais de 30%

12


dos pacientes com suspeita clínica de síndrome febril aguda permaneceram sem

diagnóstico (36, 40-44). Somente o monitoramento dos agravos emergentes

causadores de doença febril aguda indiferenciada pode proporcionar as informações

necessárias para a adequada ação de política pública e de vigilância em saúde para

a região.

1.2.3 Vírus Bussuquara (BSQV)

O BSQV foi isolado de mosquitos e de animais silvestres da região

Amazônica, principalmente em roedores, como Proechimys spp. e mosquitos do

gênero Culex. Isolado originalmente no estado do Pará, Brasil, em 1956, e pela

primeira vez em humanos em 1971 (45). Um estudo realizado, em 1998, com jovens

militares que viviam em áreas de risco, teve o objetivo de investigar a soro

prevalência para Flavivirus. Foram analisadas 189 amostras de soros humanos

provenientes de três localidades da Província de Formosa, fronteira com o Brasil e

Paraguai, e em uma amostra foi confirmada ser positiva para Bussuquara pelo teste

de neutralização (46). O vírus não tem sido relacionado a surtos, mas foi causa de

doença febril aguda, produzindo: anorexia, dores articulares, calafrios, sudorese

profusa e cefaleia relatados pelo paciente. O quadro perdurou por cerca de quatro

dias (17)

1.2.4 Vírus Cacipacoré (CPQV)

O vírus Cacipacoré foi isolado pela primeira vez em 1977, em pássaros na

região Amazônica, mas ainda é desconhecida a associação de doença febril aguda

relacionada ao vírus CPCV (17). Existem evidências de este vírus ter sido isolado

em um paciente, morador do município de Theobroma, estado de Rondônia, com

quadro clínico suspeito de leptospirose, que foi confirmado por sorologia (47, 48), No

estado do Amazonas esse vírus já foi isolado de mosquito Aedes aegyptis (49).

13


1.2.5 Vírus Ilhéus (ILHV)

O vírus Ihéus foi isolado de Aedes sp. e Psorophora sp, capturados em 1944,

na cidade de Ilhéus, no litoral leste do Brasil (50). ILHV ocorre em todo o Brasil,

tendo diferentes artrópodes como vetores, porém o mosquito Psorophora ferox é

provavelmente o mais importante. Aves silvestres têm sido implicadas como

prováveis hospedeiros vertebrados do vírus, contudo foram também encontrados

anticorpos em outros vertebrados, como roedores, marsupiais, morcegos e

macacos, ou se isolou deles o vírus (17).

A doença em humanos é encontrada em casos esporádicos, associados a

exposições à floresta e o quadro clínico varia desde infecções assintomáticas até

encefalite. A doença febril, responsável pela maioria dos casos reconhecidos, inicia

subitamente com febre moderada ou elevada, cefaleia, calafrios, fotofobia, artralgia,

mialgia e astenia, evoluindo em média por três a cinco dias, com recuperação

completa e sem sequelas (51). Após o primeiro isolamento viral, inúmeros outros

isolamentos de pacientes febris, de mosquitos e de uma grande variedade de

animais, particularmente aves silvestres e morcegos. Esses dados foram obtidos no

Equador, no Peru, na Guiana Francesa, na Colômbia, no Panamá, em Trinidad e no

Brasil (44, 52-60).

1.2.6 Vírus da encefalite de Saint Louis (SLEV)

O vírus da encefalite de Saint Louis (SLEV) foi inicialmente descrito nos

Estados Unidos em St. Louis, Missouri, onde foi responsável por uma epidemia entre

julho e outubro de 1933. Identificaram-se 1.095 casos com 201 óbitos. É

amplamente distribuído nos Estados Unidos e nas Américas Central e do Sul,

mantidos em ciclos de transmissão envolvendo mosquitos do gênero Culex spp e

vários pássaros (61). Análises filogenéticas sugerem que o SLE foi introduzido na

Argentina e transportados da África, a bordo de navios e se dispersou gradualmente

para o norte da América (62).

14


A doença é transmitida acidentalmente ao homem por mosquitos infectados,

que normalmente se alimentam de sangue de pássaros. O início é caracterizado por

sintomas semelhantes à gripe, podendo evoluir para meningites agudas ou

subagudas com sinais neurológicos focais. Sintomas urinários podem ocorrer em até

25% dos pacientes. Comorbidades pré existentes como hipertensão, arteriosclerose,

diabetes e alcoolismo crônico podem predispor a infecções graves ou fatais. O

período de convalescença pode ser prolongado e é caracterizado por astenia,

irritabilidade, tremores, insônia, depressão, perda de memória, dor de cabeça,

sintomas esses com duração de até três anos (15).

No Brasil foi isolado pela primeira vez no norte do país, em 1964, a partir de

um pool de mosquitos Sabethes belisarioi coletados ao longo da rodovia Belém-

Brasília (63). Apesar da ampla distribuição de SLEV na região amazônica, verificada

por evidência sorológica em aves e humanos, até o final de 2000, não existiam

relatos de epidemia de encefalite devido ao vírus SLEV na região (17). Em 2005, foi

documentado um grande surto de encefalite de St. Louis em Córdoba, Argentina

(64). No mesmo ano, foi isolado o SLEV de um paciente febril suspeito de dengue,

em São Pedro, Estado de São Paulo (65). No entanto, um surto de SLEV ocorreu

concomitantemente com um grande surto de DENV-3 em São José do Rio Preto,

Estado de São Paulo. Durante esta manifestação, alguns pacientes apresentaram

manifestações hemorrágicas, identificadas por prova do laço positiva, petéquias e

gengivorragia. Um paciente apresentou co-infecção de DENV-3 e SLEV (66, 67).

Esta descoberta é também um alerta aos profissionais de saúde, devido à

necessidade de maior investigação clínica e epidemiológica de doenças febris como

no caso relatado. Infecções por SLEV podem ser reconhecidas ou confundidas com

outras causadas por outros arbovírus, como o dengue.

15


1.3 Família Togaviridae – Gênero Alphavirus

A família Togaviridae compreende os gêneros Alphavirus e Rubivirus. O vírus

da encefalite equina venezuelana (VEEV) é um Alphavirus e um importante

patógeno humano. É também um sistema modelo para o estudo da estrutura,

replicação e patogênese dos vírus deste gênero (4).

Estruturalmente, são esféricos, de 60 a 70 nm de diâmetro, com um

nucleocapsídeo icosaédrico envolvido em um envelope lipoproteico. O RNA é linear,

de fita simples, com aproximadamente 4x106 daltons e poliadenilado. O genoma tem

aproximadamente 11,7 Kb e comporta-se como RNA mensageiro. O envoltório

lipoprotéico contém bicamada lipídica de origem celular, que é derivada da

membrana plasmática da célula hospedeira. A proteína do capsídeo é organizada

em hexons e pentons, que complementa a organização das glicoproteínas (68). Nos

virions são encontrados três antígenos distintos: E1 e E2 (Glicoproteínas) e o C

(Nucleoproteína), conforme demonstrado na (Figura 5).

Figura 5: Ilustração da morfologia do virion da família Alphavirus e suas principais

proteínas estruturais. (a) A poliproteína codificada pela cadeia aberta de leitura, após clivagem, libera três proteínas estruturas (C, pE2 e E1) e quatro não estruturais (nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4). (b-c) Envoltório, esférico, de cerca de 60-70 nm de diâmetro, onde estão representadas as glicoproteínas E1 e E2, o Nucleocapsídeo representado pela proteína N e a bicamada lipídica (4).

16


O gênero Alphavirus constitui um grupo com 28 espécies de vírus,

classificados antigenicamente em 4 complexos. No geral, são responsáveis por

causar dois padrões distintos de doença: encefalite, com ou sem desmielinização, e

doença febril, com artralgia persistente (69). Cada Alphavirus é responsável por

apenas um destes tipos de doença, mas as síndromes clínicas não foram separadas

geograficamente. Por exemplo, os alphavirus presentes na América do Sul são os

vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), vírus da encefalite equina do leste

(EEEV), vírus da encefalite equina ocidental (WEEV), Mayaro (MAYV), Una (UNAV),

Pixuna (PIXV), Aura (AURAV), e Trocará (TROCV). Os três primeiros, como

indicado por seus nomes, causam encefalite; MAYV e UNAV causam doença febril,

que cursa com quadro de artrite prolongada e severa; ao passo que PIXV, AURAV e

TROCV não são conhecidos por causar doença humana (70).

O vírus Mayaro (MAYV) é um membro da família Togaviridae e gênero

Alphavirus. Estudos moleculares recentes têm reconhecido duas linhagens de

MAYV: genótipos D e L (71). Tem sido associado a uma doença semelhante ao

dengue, com exantema, febre moderada a grave, com duração de 3-5 dias e

artralgia. A artralgia permanece por várias semanas e afeta principalmente os

tornozelos, pulsos e dedos, mas também pode afetar as articulações maiores. O

MAYV é enzoótico para América do Sul e endêmico em áreas rurais. É mantido em

ciclo silvestre envolvendo vertebrados, incluindo primatas não humanos e mosquitos

Haemagogus janthinomys. Aves podem atuar como hospedeiros secundários, sendo

importantes para a disseminação do vírus (68).

A maioria das infecções por MAYV é esporádica e ocorre em pessoas com

história de recentes atividades dentro ou próximo a florestas. Vários pequenos

surtos têm sido relatados na região amazônica, normalmente limitados a áreas rurais

próximas ou no interior de florestas, onde o vetor é encontrado. Na cidade de São

Paulo, foi relatada a ocorrência de três casos de infecção por MAYV, em pacientes

infectados enquanto pescavam em Camapuã, MS (72).

17


Em fevereiro de 2008, um surto de febre por Mayaro ocorreu em um

assentamento no município de Santa Bárbara, norte do Brasil. Os pacientes

apresentavam erupção cutânea, febre e grave artralgia com duração de até sete

dias. Imunoglobulina M contra MAYV foi detectada por ELISA em 36 pessoas. O

vírus foi isolado, sequenciado e caracterizado como genótipo D em três pacientes

(73).

Em outro estudo realizado com pacientes atendidos na FMT-HVD, no período

de janeiro de 2007 a dezembro de 2008, foram testados anticorpos IgM para MAYV

e detectados em 33 amostras de 631 pacientes (5,2%). Os pacientes com IgM

positiva apresentaram doença febril aguda com mais de cinco dias (39). Embora as

taxas de anticorpos sejam encontradas em algumas comunidades rurais da bacia

amazônica do Brasil, é difícil isolar MAYV, devido ao período relativamente curto de

viremia.

O MAYV pode ser transmitido por mosquitos do gênero Aedes e, assim,

poderia se deslocar para cidades, em aves com viremia ou viajantes humanos, e se

adaptar a um novo ciclo que poderia envolver o homem como reservatório. Neste

contexto, os viajantes estão em risco de aquisição e importação desta doença, como

ocorrido com um cidadão francês que apresentou doença reumática grave depois de

visitar a Amazônia brasileira e um casal de holandeses que apresentou artralgia

persistente, febre e erupção cutânea temporária após estadia no Suriname. Todos

foram diagnosticados com infecção pelo vírus Mayaro (74, 75).

Em casos de surtos de doença febril aguda por MAYV, SLEV, CHIKV e

OROV, o diagnóstico laboratorial de casos suspeitos é fundamental, pois esses vírus

não são facilmente diferenciados de outras doenças virais, como o dengue, e pode

permanecer desconhecida a sua ocorrência (2).

18


1.4 Família Bunyaviridae – Gênero Orthobunyavirus

Os vírus deste gênero medem de 80 a 120 nm de diâmetro, apresentam

capsídeo de simetria helicoidal, circundado por um envoltório lipoproteico com

espículas superficiais. O genoma viral é constituído por três segmentos de RNA de

fita simples (Small-S, Medium-M e Large-L), lineares e de simetria helicoidal, os

quais codificam, respectivamente, proteínas estruturais do nucleocapsídeo (N),

glicoproteínas do envelope (G1 e G2) e a proteína (L), além das proteínas não

estruturais NSs e NSm (Figuras 6 e 7) (76).

Figura 6: Ilustração da morfologia do virion da Família Bunyaviridae e suas principais proteínas estruturais. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/de/e/e7/Bunyaviridae-Schema.jpg

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/de/e/e7/Bunyaviridae-Schema.jpg

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/de/e/e7/Bunyaviridae-Schema.jpg

19


Figura 7: Ilustração do genoma de virion da família Bunyaviridae. O Segmento L

codifica a proteína L, uma RNA polimerase dependente de RNA; o segmento M codifica duas glicoproteínas de superfície G1, G2 e NSm que formam as espículas do envelope; e o segmento S codifica N e Ns do nucleocapsídeo.(77)

O Orthobunyavirus de maior importância no Brasil é o vírus Oropouche

(OROV), responsável pela febre por oropouche (78). Sorologicamente está incluído

no grupo Simbu da classificação de CasaIs (79) e foi isolado pela primeira vez, em

1955, de amostra de um trabalhador florestal febril em Trinidad (80). Este vírus é

mantido na natureza pelos ciclos silvestres e urbanos. No ciclo silvestre, preguiças,

macacos e aves são os hospedeiros vertebrados e o Aedes serratus, o Culex

quinquefasciatus e o Culicoides paraensis (maruim) vetores. No ciclo urbano, o vírus

é transmitido de pessoa a pessoa, por meio da picada do Culicoides paraensis,

amplamente disseminado em áreas tropicais e subtropicais das Américas (81).

A febre por Oropouche é uma doença febril aguda, semelhante ao dengue,

apresentando sintomatologia com: cefaleia, mialgia, artralgia, podendo até mesmo

ser acompanhada de meningite asséptica. Alguns dias após o término do episódio

febril inicial é comum se observar a recorrência dos sintomas, porém, em geral, com

menor intensidade. Alguns pacientes podem exibir um quadro grave caracterizado

por meningite linfoplasmocitária. A recuperação dos enfermos é completa, sem

sequelas aparentes, mesmo nos casos mais graves (78).

20


Dentre os arbovírus encontrados na Amazônia, após o vírus Dengue, o vírus

Oropouche é o que tem sido isolado com mais frequência a partir de casos

humanos. Acredita-se que cerca de 500.000 casos de infecção por OROV tenham

ocorrido no Brasil nos últimos 48 anos. Em 2003 e 2004, vários casos de febre por

Oropouche foram detectados em Parauapebas e Porto de Moz, no Estado do Pará

(82). Ainda no Pará, após 26 anos da última epidemia de febre por Oropouche, foi

realizada uma pesquisa sorológica e um estudo prospectivo de casos agudos febris

em Magalhães Barata e Maracanã. Estes estudos mostraram uma prevalência de

anticorpos para OROV de 76,9% e 73,3%, respectivamente; os menores de 15 anos

foram os mais afetados; foi identificado o genótipo II, nos dois municípios (83). No

Amazonas, em 2008, houve relato de um surto na região de Manaus, onde 20,3%

dos pacientes com síndrome febril aguda, negativos para dengue, apresentavam

anticorpos IgM anti-OROV (37), e em pacientes com quadro clínico de

meningoencefalite (38). Nos últimos anos, a área de circulação e o potencial de

epidemia por OROV têm aumentado. Em 2003, foi isolado em um pequeno primata

— um sagui (Callithrix) — no estado de Minas Gerais, no sudeste do Brasil, longe da

Amazônia (84).

Considerando que vetores de OROV (Culicoides paraensis) ocorrem em

áreas de baixa altitude nas Américas, a destruição ambiental, bem como as

mudanças climáticas podem resultar em surtos nas grandes cidades do Brasil (2),

além do fato de a circulação do OROV, provavelmente, ser esporádica e

clinicamente silenciosa e, quando não associadas a surtos, é mais provável que

sejam negligenciadas pelos serviços de vigilância epidemiológica (85).

1.5 Diagnóstico laboratorial das arboviroses

O diagnóstico etiológico das arboviroses, tanto em amostras humanas como

em animais, é realizado a partir de técnicas diretas e indiretas, que são aplicadas de

acordo com o tempo de evolução do quadro clínico. Diagnóstico convencional é

baseado em testes sorológicos de triagem para detectar a presença de anticorpos

contra o vírus específico no soro do paciente. Muitas vezes, exige a comprovação de

21


um aumento na concentração de anticorpos a partir de uma amostra de sangue de

fase aguda e uma amostra da fase de convalescência (chamada de amostras

pareadas) (86).

Em amostras do início da sintomatologia, em que é provável que o vírus ainda

esteja em circulação, são utilizadas as técnicas de isolamento em cultura de células

ou animais de laboratório, segue-se a detecção de antígeno através de métodos

indiretos (imunofluorescência, ELISA, etc.) ou a detecção do genoma viral por

técnicas moleculares (RT-PCR, NASBA, PCR em tempo real) (87, 88), (Figura 8). A

partir de sete dias do início dos sintomas, é possível detectar a presença de

anticorpos IgM (por ELISA, imunofluorescência ou inibição da hemaglutinação) que,

dependendo do agente, apresentam diferentes períodos de persistência. Anticorpos

da classe IgG podem ser detectados, geralmente, alguns dias depois que o IgM foi

detectado (ELISA, neutralização em cultura de células, inibição da hemaglutinação,

imunofluorescência), e estes anticorpos podem permanecer por longos períodos de

tempo. Para as infecções recentes são necessários estudos sorológicos através da

detecção de IgM e ausência de IgG na amostra (89).

Entre as diferentes famílias virais reações cruzadas sorológicos devem ser

ponderadas na interpretação dos resultados laboratoriais. Essas relações são

reforçadas nas infecções secundárias ou sequencial, por arbovírus da mesma

família, que geram uma resposta de memória imunológica com altos títulos de

anticorpos. Já a imuno-histoquímica e os estudos histopatológicos são

frequentemente úteis para o estudo de casos fatais, principalmente naqueles casos

nos quais os resultados obtidos em outros testes foram pouco conclusivos (90).

22


Figura 8: Diagnóstico laboratorial das arboviroses.

1.5.1 Reação em cadeia da polimerase e sequenciamento nucleotídico

Dada a incidência de doenças causadas por estes vírus e seu

comportamento emergente, testes de laboratório se tornaram cada vez mais

importantes. No entanto, o diagnóstico laboratorial da infecção pelos arbovirus

continua a ser laborioso, pois o isolamento desses vírus é demorado e, para muitos

deles, requer um laboratório com nível três de biossegurança. Os diferentes testes

sorológicos de neutralização, com frequência, podem mostrar uma reatividade

cruzada entre espécies. Por todas estas razões, o desenvolvimento de testes

moleculares para esses agentes, incluindo a reação em cadeia da polimerase

(PCR), tem atraído uma série de esforços e atenção (91).

A técnica de PCR surgiu nos anos 80 como um método sensível, simples,

rápido e específico, possibilitando a identificação de vírus, a partir de fluídos de

23


isolamento ou de materiais biológicos de pacientes. Consiste em uma reação de

síntese de regiões específicas de DNA em ciclos repetidos. A cada ciclo, o número

de fragmentos são duplicados e, após trinta ciclos, uma molécula é amplificada em

mais de um bilhão de vezes. O método diagnóstico de infecções por arbovírus (nos

vírus RNA) por meio da PCR deve ser precedido de transcrição reversa. Nesse

caso, é necessário realizar uma etapa prévia à PCR: a síntese de uma fita de DNA

complementar (cDNA), tendo a molécula de RNA como molde — técnica de grande

utilidade na detecção genômica diagnóstica de vários vírus RNA (5, 88, 90).

A sensibilidade da metodologia do RT-PCR permite a detecção e identificação

dos arbovírus tanto em artrópodes vetores, quanto em amostras clínicas, nos quais

existem dificuldades de isolamento. Também é importante quando há necessidade

de um diagnóstico rápido para o tratamento clínico e implicações no controle de

epidemias ou de vetores, bem como a classificação taxonômica dos vírus que

apresentem reações cruzadas nos testes sorológicos (5, 10, 92).

A técnica de sequenciamento de DNA consiste na síntese in vitro de uma fita

de DNA na presença de quatro diferentes nucleotídeos trisfosfatados terminadores

de cadeia, os didesoxirribonucleosídeos trifosfatados: ddATP, ddCTP, ddGTP e

ddTTP, tendo como DNA-molde aquele cuja sequência deseja-se identificar. O

sequenciamento nucleotídico é uma das ferramentas mais importantes no que se

refere à caracterização de genes. A partir de produtos amplificados pela RT-PCR,

permite analisar comparativamente as sequências obtidas com as de vários

arbovírus — previamente conhecidos — ou até mesmo caracterizar um gene até

então não conhecido (13, 14, 93, 94).

Um novo método de sequenciamento de DNA, usualmente chamado de

Pyrosequencing, foi desenvolvido pela Roche Applied Sciences. Por meio deste

método, pode-se sequenciar genomas de organismos diversos de uma maneira

muito mais rápida e barata. No Pyrosequencing, a síntese de DNA ocorre através de

um complexo de reações o qual inclui enzimas (ATP sulfurilase e luciferase) e

substratos (adenosina 5’ fosfossulfato e luciferina). O grupo pirofosfato, liberado

24


durante a adição de um nucleotídeo, resulta na produção de luz detectável. Portanto,

quando um novo nucleotídeo é incorporado em uma cadeia crescente de DNA,

através da DNA polimerase, pirofosfato é gerado de maneira estequiométrica,

resultando na produção de ATP. Este leva à conversão enzimática da luciferina com

emissão de fótons. À medida que os componentes da reação diminuem, um novo

ciclo de reagentes é introduzido e então a incorporação de nucleotídeos específicos

é avaliada de maneira sequencial (95).

25


2. JUSTIFICATIVA

Uma limitação da realização de vigilância das arboviroses é o caráter

genérico de apresentação da doença. Enquanto a doença grave pode resultar em

manifestações hemorrágicas ou doença neurológica, as arboviroses geralmente

resultam em doença febril leve a moderada, muitas vezes assintomática.

Particularmente no início de progressão da doença, os pacientes apresentam

doença febril indiferenciada tornando o diagnóstico clínico pouco confiável. Em

função da falta de apresentação clínica distinta e da diversidade dos agentes

etiológicos, o suporte de laboratório tornou-se um componente crítico de programas

eficazes de vigilância.

Nesse aspecto, o emprego de métodos de biologia molecular, como a reação

em cadeia de polimerase precedida de transcrição reversa do RNA viral (RT-PCR),

permite o estabelecimento de um trabalho de rotina prático, rápido e seguro para o

diagnóstico de arboviroses. Entretanto, são poucos os estudos utilizando tais

métodos no diagnóstico de arboviroses brasileiras.

Apesar da relevância para a saúde pública, pouco se sabe sobre a

distribuição geográfica, o impacto relativo e os fatores de risco associados à

infecção por arbovírus em muitas regiões do mundo.

Diante das dificuldades e da necessidade de se diagnosticar precisamente e

com rapidez as doenças causadas por vírus emergentes, na Amazônia Ocidental

Brasileira, o presente trabalho pretende contribuir para a detecção de algumas

espécies de arbovírus brasileiros, pertencente às famílias Flaviviridae, Bunyaviridae

e Togaviridae utilizando-se métodos de biologia molecular.

Somente o monitoramento dos agravos endêmicos e emergentes causadores

de doença febril aguda indiferenciada podem proporcionar as informações

necessárias para adequada ação de política pública e de vigilância em saúde para a

região.

26


3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Vigilância laboratorial da circulação de arbovírus em humanos, durante

epidemia de dengue, em uma unidade terciária de saúde da Amazônia Ocidental

Brasileira, durante epidemia de dengue, em 2011, na cidade de Manaus/AM.

3.2 Específicos

• Detectar vírus da família Flaviviridae (DENV 1-4, BSQV, CPCV, ILHV e

SLEV), Togaviridae (MAYV) e Bunyaviridae (OROV) pela reação em cadeia

da polimerase precedida de transcrição reversa do RNA (RT-PCR);

• Genotipar os arbovírus isolados;

• Analisar as características clínicas, hematológicas e epidemiológicas (sexo,

idade, ocupação e localidade) de cada agravo em estudo;

• Detectar a ocorrência de co-infecções entre os arbovírus pesquisados;

27


4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Modelo de Estudo

Trata-se de um estudo descritivo retrospectivo, dos casos de doença febril

aguda, atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado

(FMT-HVD), durante surto de dengue ocorrido no período de 01 de Janeiro a 31 de

Maio de 2011, na cidade de Manaus.

4.2 Universo de Estudo 4.2.1 Local de Estudo

O estudo foi realizado na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira

Dourado, localizada em Manaus, capital do estado do Amazonas. A FMT-HVD é

uma instituição pioneira na implantação da vigilância de síndromes febris agudas e,

através da consolidação de um Ambulatório de Doença Febril Aguda, oferece um

serviço de atendimento a todo paciente com quadro de doença febril aguda

indiferenciada.

4.2.2 Definição de Caso

Paciente com idade acima de um ano apresentando doença febril aguda com

duração de até sete dias, acompanhada de dois ou mais dos seguintes sintomas

inespecíficos: cefaleia, mialgia, artralgia, dor retro-orbitária, fotofobia, exantema,

astenia, anorexia e mal-estar geral.

4.2.3 População de Estudo

Para fins deste estudo foram consideradas exclusivamente as amostra de

pacientes que apresentaram quadro clínico característico de doença febril aguda,

independente de idade e sexo, atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr.

28


Heitor Vieira Dourado, durante o surto de dengue na cidade de Manaus, cujo

material biológico (soro) foi encaminhado à Gerência de Virologia para a elucidação

diagnóstica da doença febril.

4.2.4 Participantes

No período de 01 de janeiro a 31 de maio de 2011 foram incluídos na

pesquisa 677 pacientes com suspeita clínica de dengue. Aqueles que atenderam a

definição de caso foram convidados a participar da pesquisa e a assinar o termo de

consentimento livre e esclarecido (TCLE), Anexo 8.4.

4.3 Procedimentos

As amostras utilizadas na pesquisa foram selecionadas a partir da demanda

espontânea da Gerência de Virologia da FMT-HVD. Essas amostras foram

sistematicamente aliquotadas em três tubos estéreis de 1,0 mL, sendo devidamente

identificados e em seguida conservados a -80ºC para análise sorológica e/ou

molecular.

Quando pertinente, foi feita uma revisão do prontuário informatizado dos

pacientes. Os dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais dos pacientes incluídos

na pesquisa foram registrados em uma ficha clínica padrão para o estudo (Anexo

8.2).

4.3.1 Doenças em estudo e algoritmos de investigação e diagnóstico

Os agravos avaliados nessa pesquisa foram as doenças causadas pelos

arbovírus emergentes na região, listados na Tabela 3, seguindo o algoritmo de

investigação e diagnóstico (Figura 9).

29


Tabela 3: Relação de arbovírus brasileiros em estudo.

FAMÍLIA GÊNERO VÍRUS (Abreviação) Togaviridae Alphavirus Mayaro (MAYV)

Flaviviridae Flavivirus

Dengue (DENV)

Bussuquara (BSQV) Cacipacoré (CPCV) Ilhéus (ILHV) St. Luis Encephalitis (SLEV)

Bunyaviridae Orthobunyavirus Oropouche (OROV)

30


Figura 9: Fluxograma da metodologia aplicada às amostras incluídas no estudo.

31


4.3.2 Métodos de diagnóstico laboratorial

As atividades de investigação laboratorial em todas as fases do estudo

aconteceram na Gerência de Virologia da FMT-HVD, com o apoio do Centro de

Pesquisa Leônidas & Maria Deane (FIOCRUZ Amazônia) e Universidade Nilton Lins.

Os arbovírus utilizados neste estudo, como controles positivos, estão listados

na Tabela 4 e foram, gentilmente, cedidos pelo Prof. Dr. Luiz Tadeu Morais

Figueiredo, do Centro de Pesquisa em Virologia da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto-USP.

Tabela 4: Relação das estirpes de arbovírus brasileiros que serão utilizadas

no estudo como controle positivo.

FAMÍLIA GÊNERO VÍRUS (Abreviação)

ESTIRPES (Abreviação)

Togaviridae Alphavirus Mayaro (MAYV) BeAr 20290

Flaviviridae Flavivirus

Dengue (DENV)

DENV 1 Mochizuki

DENV 2 SpH 125367

DENV 3 RP41

DENV 4 Boa Vista

Bussuquara (BSQV) BeAn 4073

Ilhéus (ILHV) BeH 7445

St. Luis Encephalitis (SLEV) BeH 355964 Bunyaviridae Orthobunyavirus Oropouche (OROV) Be An 19991

32


4.3.2.1 Protocolo de extração do RNA

O RNA viral foi extraído a partir de 140 µl de amostra clínica (soro), utilizando

o Qiamp Viral RNA kit (QIAGEN Inc., USA), de acordo com as recomendações do

fabricante. O volume final obtido será de 40 µl.

4.3.2.2 Síntese de DNA complementar (cDNA)

O método diagnóstico de infecções por arbovírus (nos vírus RNA), através da

PCR, deve ser precedido de transcrição reversa (RT-PCR). Nesse caso, é

necessário realizar uma etapa prévia à PCR, que é a síntese de uma fita de DNA

complementar (cDNA), tendo a molécula de RNA como molde. Assim como para

qualquer síntese de DNA, nessa reação também é indispensável a utilização de um

primer que anele com o RNA. Para a síntese de cDNA podem ser utilizados primers

genéricos ou específicos. Em nosso estudo, utilizamos os primers genéricos tipo

aleatórios (random primers).

Após a extração do RNA pelo método de Qiamp Viral RNA kit, foi utilizado o

RNA viral para síntese do cDNA, pela reação da transcrição reversa, composta de:

• 5µl de RNA, ao qual foram adicionados 1,0µl de randon primers

2,1µg/ml (Promega, Madison WI, USA);

• Segui-se incubação a 70ºC, por 5 minutos;

• Resfriou-se a solução em gelo por aproximadamente 2 minutos;

• Adiciona-se a solução (RNA/randon primers) os seguintes reagentes;

33


Componentes Vol. (µl) 1 Reação

H2O 5,75

Solução tampão 2x 12,5

Enzima Transcriptase Reversa 5U/µl 0,5

Rnasin 40U/ µl (promega,USA) 0,25

Volume total 25

Após a adição dos reagentes ao RNA/randon primers, o material foi incubado

no termociclador a 45ºC por 60 minutos. O cDNA obtido foi armazenado a -20 ºC.

4.3.2.3 Primers

Os primers usados para detecção dos Alphavirus se ligam a regiões do gene

da proteína nsP1, enquanto que os usados para detecção dos Flavivirus se ligam a

regiões do gene da proteína NS5 e CprM, de acordo com o primer específico

utilizado. Para detecção do OROV foram usados primers que se ligam no segmento

S/Nucleoproteína do genoma viral. Estes primers estão descritos na Tabela 5.

34


Tabela 5: Relação de primers utilizados no estudo.

Primers Sequência (5'-3') Amplicon (pb) Referência Primers - Semi-nested-PCR para diagnóstico de Vírus Mayaro

M2W (+) YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW 434

(5) cM3W(-) ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC nMay (+) GGAAGTTGGCCAAGGC 270 a

Primers –Real-time PCR para diagnóstico de Flavivirus mFU1(+) TACAACATGATGGGAAAGCGAGAGAAAAA

245 (93) CFD2 (-) GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC

Primers –Multiplex PCR para diagnóstico de Flavivirus FG 1(+) TCAAGGAACTCCACACATGAGATGTACT

958

(96)

FG 2(-) GTGTCCCATCCTGCTGTGTCATCAGCATACA

nDENV1(-) CGTTTTGCTCTTGTGTGCGC 472b

nDENV2(-) GAACCAGTTTGTTTDRTTTCATAGCTGCC 316b

nDENV3(-) TTCCTCGTCCTCAACAGCAGCTCTCGCACT 659b

nDENV4(-) GCAATCGCTGAAGCCTTCTCCC 222b

nBSQ (-) AAG TGA CAC CTG TTC AGG GTA 388b

nILH (-) TCC ACC GCT GAT CTG AGC CCG TGA 474b

nSLE (-) ATT CTT CTC TCA ATC TCC GT 232b

Primers Semi-nested-PCR para diagnóstico de Vírus Dengue D1 TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG

511

(97)

D2 TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC TS1 CGTCTCAGTGATCCGGGGG 482c

TS2 CGCCACAAGGGCCATGAACAG 119c

TS3 TAACATCATCATGAGACAGAGC 290c

TS4 CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA 392c

Primers – Nested-PCR para diagnóstico de Vírus Oropouche BUN-S (+) AGTAGTGTGCTCCAC

700/ 1.100 (90) BUN-C (-) AGTAGTATACTCCAC BS-S(+) GTGGGGTCCAATTTGC

300 BS-C(-) TGAACCCTATGCATCT a Com primer cM3W(-); b Com primer FG1(+); c Com primer D1(+); pb: pares de bases; (+) sensu; (-) anti-sensu

35


4.3.2.4 Protocolo de PCR para identificação de Alphavirus

Para a detecção de agentes virais do gênero Alphavirus e o vírus Mayaro,

será utilizada a estratégia desenvolvida por Bronzoni et al. (2005), com uma reação

de PCR gênero-específico, seguida de uma Semi-nested-PCR espécie-específica,

produzindo amplicons de 434 e 270 pb (96), de acordo com o protocolo.

PCR Gênero-específico Alphavirus


Concentração Final

H2O 12,1

Solução tampão 10x 2,5 1 X

MgCl2 50 mM 2 4 mM

dNTP 10 mM 1 0,4 mM

M2W 10 pmol 1 0,4 pmol

cM3W 10 pmol 1 0,4 pmol

Taq Platinum 5U/ µl 0,4 2 U

cDna 5

Total 25

O protocolo da reação de PCR no termociclador teve início a partir de

desnaturação inicial a 94°C durante 4min., seguido por 35 ciclos de desnaturação a

94°C durante 45 seg., hibridização a 45°C durante 45 seg., extensão a 72°C durante

45 seg. e extensão final a 72° C durante 7 minutos.

36


Semi -nested-PCR -Vírus Mayaro



H2O 17,1

Solução tampão 10 x 2,5 1,0 X

MgCl2 50 mM 1 2,0 mM

dNTP 10 mM 1 0,4 mM

cM3W 10 pmol 1 0,4 pmol

nMay 10 pmol 1 4 pmol


Amplicon 1

Total 25

O protocolo da reação de Nested-PCR no termociclador teve início a partir de


94°C durante 45 seg., hibridização a 45°C durante 45 seg., extensão a 72°C durante

45 seg. e extensão final a 72°C durante 7 minutos.

37


4.3.2.5 Protocolo de PCR para identificação de Flavivirus

Etapa 1. As 677 amostras foram testadas para vírus DENV no protocolo

desenvolvido por Lanciotti et al (1992). A primeira reação de PCR produziu cDNA de

uma parte do genoma viral (CprM) de aproximadamente 511 pb (97). Seguida de

Nested-PCR com primers específicos para determinação de cada sorotipo de

dengue, de acordo com o protocolo seguinte:

1º PCR - Vírus Dengue

Componentes Vol.(µl) 1 Reação


H2O 15

Buffer 10x 2,5 1 X

MgCl2 50 mM 0,75 1,5 mM

dNTP 10 mM 0,5 0,2 mM

D1 10 nM (+) 0,5 0,3 mM

D2 10 nM (-) 0,5 0,3 mM

Taq Platinum 5U/ µl 0,25 1,25 U

cDna 5

total 25



94°C durante 1 min., hibridização a 55°C durante 1 min., extensão a 72°C durante 2

min. e extensão final a 72°C durante 5 minutos.

38


Nested-PCR



H2O 27,0

Solução tampão 10x 5,0 1 X

MgCl2 50 mM 1,5 1,5 mM

dNTP 10 mM 1,0 0,2 mM

D1 10 nM 1,0 0,2 mM

TS1 10 nM 1,0 0,2 mM

TS2 10 nM 1,0 0,2 mM

TS3 10 nM 1,0 0,2 mM

D-4 10 nM 1,0 0,2 mM

Taq Platinum 500 U 0,5 2,5 U

amplicon Dil. 1:100 10,0

Total 50,0


desnaturação inicial a 94°C durante 4min, seguido por 28 ciclos de desnaturação a



39


Etapa 2. Para a detecção de agentes virais do gênero Flavivirus, não Dengue,

foi utilizada inicialmente a estratégia de triagem das amostras desenvolvida por

Chao et al (2007): uma reação real-time transcriptase reverse PCR (RT-PCR) para

rápida detecção de Flavivirus de interesse médico (93). Para a reação de real-time

PCR utilizamos os kit de reagentes Maxima SYBR® GREEN/ROX Fermentas, de

acordo com protocolo seguinte:

Real-time-PCR - Gênero-específico Flavivirus


H2O 7,5

Solução ponta para uso 2X 12,5

mFU1 10 pmol 1

CFD2 10 pmol 1

cDNA 3

Total 25

O perfil térmico da reação de PCR teve início a partir de desnaturação inicial a

95°C durante 15min., seguido por 45 ciclos a 95°C durante 15 segundo, e 48°C

durante 3 minutos,

40


Etapa 3. As amostras negativas na reação de real-time PCR, foram testadas

por outro protocolo para a detecção de agentes virais do gênero Flavivirus,

estratégia desenvolvida por Bronzoni et al. (2005). Uma reação de PCR gênero-

específico, produzindo amplicons de aproximadamente 958 pb (96), seguida de duas

Multiplex-Nested-PCR espécie-específica com primers selecionados com base na

sequência de nucleotídeos dos vírus de estudo. Na primeira M-N-PCR usamos Pool

1 primers de NDEN-1, NDEN-2, NDEN3 e NYF, juntamente com o primer FG1

(15μM cada). Na segunda M-N-PCR usamos Pool 2 de primers nSLE, nBSQ, nILH,

nROC juntamente com o primer FG1 (15μM cada), de acordo com o protocolo

seguinte:

PCR Gênero-específica Flavivirus



H2O 12,3 Buffer 10x 2,5 1 X

MgCl2 50 mM 1 2 mM

dNTP 10 Mm 1 0,4 mM

FG1 15 nM (+) 1,5 0,9 mM

FG2 15 nM (-) 1,5 0,9 mM


cDna 5 Total 25


desnaturação inicial a 94°C durante 4min, seguido por 30 ciclos de desnaturação a



41


M-N-PCR



H2O 12,3 Solução tampão 10x 2,5 1,0 X

MgCl2 50 mM 2 4,0 mM

dNTP 10 mM 1 0,4 mM

Pool (1/2) Primer 15mM 4 2,4 mM


Amplicon 3 Total 25





42


4.3.2.6 Protocolo de PCR para identificação de Orthobunyavirus

Para a detecção de agentes virais do gênero Orthobunyavirus, foi utilizada a

estratégia desenvolvida por Moreli et al. (2002): uma reação de PCR gênero-

específico, seguida de uma Nested-PCR espécie-específica com primers

selecionados com base na sequência de nucleotídeos de vírus Oropouche segmento

S, produzindo amplicons de aproximadamente 300 pb (90), de acordo com o

protocolo seguinte:

PCR – Gênero específico -Bunyavirus



H2O 15,1 Solução tampão 10x 2,5 1 X MgCl2 50 mM 1 2 mM dNTP 10 mM 1 0,4 mM BUN-S 10 pmol 1 0,4 pmol BUN-C 10 pmol 1 0,4 pmol Taq Platinum 5U/ µl 0,4 2 U cDna 3 Total 25



94°C durante 1min., hibridização a 55°C durante 1 min., extensão a 72°C durante 1


43


Nested-PCR para vírus Oropouche



H2O 17,1 Solução tampão 10x 2,5 1 X MgCl2 50 mM 1 2 mM dNTP 10 mM 1 0,4 mM BS-S 10 pmol 1 0,4 pmol BS-C10 pmol 1 0,4 pmol Taq Platinum 5U/ µl 0,4 2 U Amplicon 1 Total 25



94°C durante 1min., hibridização a 55°C durante 1 min., extensão a 72°C durante 1


4.3.2.7 Avaliação eletroforética dos produtos de amplificação

Todos os amplicons foram analisados por eletroforese, em gel de agarose a

1-2%. Para tanto, uma alíquota de 5,0µl do produto amplificado na reação de PCR

foi adicionada a 2,0µl de solução tampão de amostra (0,5% azul de bromo fenol e

20% de glicerol), corado com brometo de etídeo (10mg/ml), aplicado no gel

submerso em cuba horizontal de eletroforese, com solução tampão TBE 1X (89mM

Tris; 89mM Ácido Bórico; 2mM EDTA), pH 8,4 (Fermentas life scienses, Luthuania),

sob tensão elétrica de 100 Volts, aproximadamente por 70 minutos. Como controle

negativo, foi utilizado o ”branco”. As bandas foram visualizadas sob a luz ultravioleta

(UV) em uma câmara escura, equipada com transiluminador e a imagem foi

registrada através de câmara fotográfica digital. O tamanho dos amplicons foi

determinado em comparação com o marcador de peso molecular 100 pb (Fermentas

life scienses, Luthuania).

44


4.3.2.8 Sequenciamento nucleotídico

Os amplicons obtidos na PCR foram sequenciados pelo método de

interrupção da síntese da cadeia de nucleotídeo por dideoxinucleotídios, (98).

A purificação dos produtos da PCR, a fim de se eliminar bases não

incorporadas e reagentes excedentes, foi realizada utilizando as enzimas

Exonuclease I e Shrimp Alkaline Phosphatase-SAP. Em linhas gerais, ao

produto da PCR foram adicionados 10µL de solução Exo/Sap (0,025 µL

Exonuclease I, 0,250 µL SAP e água Milli Q), depois incubado a 37ºC por 30

minutos e então a 95ºC por 5 minutos. A quantificação das concentrações do

produto de PCR foi realizada no equipamento NanoDrop 2000/2000c, de acordo

com o manual do equipamento.

Definidas as concentrações para cada amostra, partimos para a reação de

sequenciamento, utilizando os reagentes e protocolo “Big Dye® Terminator 3.1

Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), segundo

recomendações do fabricante. Na reação de sequenciamento foram utilizados 2,3 μL

de solução ready reaction, 2 μL (80 ng) do produto de PCR purificado e 3,3 pmoles

de oligonucleotídeos, ajustados com água livre de RNase e DNase para um volume

final de 10 μL. A amplificação foi realizada em termociclador com o protocolo que

consiste de 39 ciclos, cada um composto por etapas de desnaturação a 96ºC por 15

segundos, anelamento dos iniciadores a 50ºC por 1 minuto e extensão a 60ºC por 4

minutos.

O produto final foi precipitado com a adição de 80µL de isopropanol 65%

(álcool isopropílico, Merck). A mistura foi agitada, incubada por 15 minutos à

temperatura ambiente e centrifugada a 4.000 rpm por 45 minutos. Ao final, o

sobrenadante foi retirado e desprezado e, em seguida, o precipitado foi lavado com

80μL de etanol a 60% e centrifugado a 4.000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante

foi descartado e o precipitado foi incubado a 60ºC por 10 minutos para a completa

evaporação do etanol. O precipitado foi então reconstituído em 10 μL de solução de

45


formamida Hidi, então aquecida a 95ºC por 4 minutos e submetido à eletroforese no

sequenciador automático.

A leitura automática das sequências foi realizada no analisador modelo DNA

analizer 3130XL (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), em placas ópticas de

96 amostras.

4.3.2.9 Análise das sequências

A análise das sequências obtidas neste estudo foi realizada por meio dos

algoritmos do programa BioEdit Sequence Alignment Edit, versão 7.0.9.0 (99). As

sequências foram confrontadas com outras existentes no GenBank, Tabela 6,

através do programa Mega 5 (100). As árvores filogenéticas tipo neighbor-joining,

para os quatro sorotipos, foram construídas baseadas no fragmento da CprM com

450 pb. Com um boot-strap de 75%.

Tabela 6: Relação de sequências de vírus DENV utilizadas na análise

filogenética.

Sorotipo País de origem Isolado (ano) Genótipo Genebank

acession DENV - 1 Tailândia 1994 I AY732480 Cambodia 2001 I AF309641 Estados Unidos 2000 II AF180817 Malásia 2007 III EF457905 Seychelles 2003 IV AB195673 Brasil 1990 V AF226685 Brasil 1997 V AF311956 Brasil 2000 V FJ850070 Brasil 2001 V AB519681 Brasil 2001 V AF513110 Brasil 2002 V FJ850075 Brasil 2005 V FJ850084 Brasil 2007 V FJ850090 Argentina 2000 V AF514885 Venezuela 1998 V FJ639741 Venezuela 2008 V FJ850103

46


Estados Unidos 2006 V EU482591 México 2008 V GU131983 Colômbia 2008 V GQ868570 DENV - 2 Tailândia 1988 Ásia I DQ181802 Tailândia 2002 Ásia I AJ487271 Nova guiné 1988 Ásia II AF038403 China 1999 Ásia II AF204178 Jamaica 2007 Asiático/Americano GQ199892 Brasil 2008 Asiático/Americano HM181971 Estados Unidos 2005 Asiático/Americano EU687216 Ilhas Virgens (EU) 2005 Asiático/Americano FJ898453

República Dominicana 2004 Asiático/Americano AB122022

Venezuela 2006 Asiático/Americano FJ639822 Colômbia 2004 Asiático/Americano FJ024477 Estados Unidos 1999 Americano AF100465 Venezuela 1992 Americano AF100469 Indonésia 2004 Cosmopolita AY858035 China 2000 Cosmopolita AF276619 DENV - 3 Polinésia Francesa 1989 I AY744677 Tailândia 1998 II AY676348 Brasil 2011 II JN697379 Brasil 2004 III EF629367 Seri-Lanca 2000 III AY099336 Brasil 2003 III EF643017 Brasil 2007 III GU131877 DENV - 4 Tailândia 1997 III AY618988 Tailândia 1991 I AY618990 Tailândia 2000 II AY618993 Estados Unidos 1995 II GQ199880 Venezuela 2006 II JN819406 Brasil 2011 II JN559740 Brasil 2012 II JN559741 Brasil 2010 II JN983813

47


4.3.3 Aspectos éticos

Este estudo faz parte do projeto “Doenças febris agudas em uma unidade terciária de saúde da Amazônia Ocidental Brasileira: estudos de epidemiologia, caracterização clínica e diagnóstica” PPSUS∕2009 EDITAL

FAPEAM ∕SUSAM ∕MS ∕CNPq∕nº 007∕2009; da pesquisadora responsável Prof.ª Dr.ª

Maria Paula Gomes Mourão. Foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa em

Seres Humanos (CEP) da FMT-HVD e está de acordo com as normas previstas na

resolução Nº 466/12, do Conselho Nacional de Saúde, aprovação nº 2015 (Anexo

8.3).

4.4 Análise estatística dos resultados

Para análise estatística dos dados coletados, a partir das fichas

epidemiológicas, foi criado um banco de dados no software Epi Info 3.5.1. As

análises estatísticas dos dados são baseadas em descrição de frequências,

prevalências e associações dos sorotipos com variáveis avaliadas como: distribuição

dos sorotipos por zonas da cidade, sexo, idade, procedência, gravidade e dias de

doença.

48


5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos e a discussão da pesquisa serão apresentados na

forma de artigo científico.

"Clinical and virological descriptive study in the 2011 outbreak of dengue in the Amazonas, Brazil"

Este manuscrito foi enviado e aceito para a publicação na revista Public

Library of Science one- PLOS ONE (fator de impacto 3.73, QUALIS A2 da CAPES

na área da CIÊNCIAS BIOLÓGICAS III) (Anexo 8.5).

49


6. CONCLUSÃO

Os resultados obtidos nos permitiu concluir que:

• Os quatro sorotipos de Dengue circularam em Manaus, durante a epidemia

ocorrida no ano de 2011. O sorotipo mais frequente foi o DENV-2 (46,2%),

seguido pelo DENV-4 (29,2%).

• A análise nucleotídica das sequências possibilitou a caracterização genotípica

dos sorotipos, DENV 1-V, DENV 2- Asiático/Americano, DENV 3-III e DENV

4-II.

• As co-infecções foram relacionadas com os sorotipos de vírus dengue, DENV-

1/4 5 (1,9%); DENV-1/2 1 (0,4%) DENV-2/4 6 (2,3%) e DENV- 3/4 (0,4%).

• Na análise das amostras clínicas de pacientes, negativas para DENV, com

síndrome febril indiferenciada, não houve detecção dos outros arbovírus

(SLEV, BSQV, ILHV, MAYV e OROV).

• O perfil clinico e laboratorial dos casos confirmados de dengue foi compatível

com os descritos na literatura.

• Neste estudo não foi possível estabelecer uma associação entre a severidade

da doença e determinantes genéticos do vírus dengue.

50


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ANEXOS

.

8 ANEXOS 8.1 Equipe Científica de Apoio ao Desenvolvimento do Projeto de Dissertação

Nome Título Área de Atuação Função

Maria Paula Gomes Mourão Doutora

Médica Infectologista, Pesquisadora da FMT-HVD Coordenador da proposta

Orientadora, desenho do estudo, análise dos dados.

Valquíria do Carmo R. Alves Especialista Farmacêutica/

Bioquímica Aluna responsável pela execução projeto

Cintia Mara Costa de Oliveira Doutora Bióloga, Pesquisadora

da FMT-HVD

Colaboradora nos experimentos de PCR.

Felipe Gomes Naveca Doutor Microbiologista, Pesquisador em Saúde Pública, Fiocruz-AM

Colaborador nos experimentos de PCR.

Guilherme Augusto Pivoto João Especialista

Médico Residente Infectologista / FMT-HVD

Revisão dos prontuários

João Bosco Lima Gimaque Mestre

Farmacêutico-Bioquímico, Pesquisador da FMT-HVD

Colaborador nos experimentos de PCR e Sorologia.

Luiz Tadeu Moraes Figueiredo Doutor

Médico, Pesquisador do Centro de Pesquisa em Virologia, FMRP/ USP.

Colaborador técnico-científico.

Michelle Souza Bastos Mestre

Farmacêutico-Bioquímica, Pesquisadora da FMT-HVD

Colaboradora nos experimentos de PCR e Sorologia.

Rajendranath Ramasawmy Doutor Genética molecular, Pesquisador Sênior da FMT-HVD


Regina Maria Pinto de Figueiredo Doutora Bióloga, Pesquisadora

da FMT-HVD


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8.2 Ficha clínica padrão para o estudo

FICHA CLÍNICA PADRÃO PARA O ESTUDO

Paciente nº Prontuário:

Idade anos Sexo: M ( ) F ( )

Procedência: Naturalidade:

Telefone Bairro:

Profissão:

Febre? não ( ) sim ( ) Há quanto tempo? dias

Outros sintomas:

Cefaleia não ( ) sim ( ) Astenia não ( ) sim ( )

Mialgia não ( ) sim ( ) Anorexia não ( ) sim ( )

Artralgia não ( ) sim ( ) Mal-estar geral não ( ) sim ( )

Exantema não ( ) sim ( )

Dor retro-orbitária não ( ) sim ( )

Fotofobia não ( ) sim ( )

Exames específicos Exames de Biologia Molecular:

Ht Dengue

Hg Oropouche

Plaquetas Mayaro

Albumina St. Louis

NS1 Bussuquara

Cacipacoré

Ilhéus

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8.3Certificado de aprovação - Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos

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8.4 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

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8.5 Artigo científico Clinical and virological descriptive study in the 2011 outbreak of dengue in the Amazonas, Brazil Valquiria do Carmo Rodrigues Alves*2, Michele de Souza Bastos1, 2, Rajendranath Ramasawmy1, 2,3, Regina Pinto de Figueiredo1, João Bosco Lima Gimaque1, Wornei Silva Miranda Braga1,2, Mauricio Lacerda Nogueira1,4, Sergio Nozawa3, Felipe Gomes Naveca5, Luiz Tadeu Moraes Figueiredo1,6, Maria Paula Gomes Mourão*1, 2,3. Affiliations:

1. Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Viera Dourado (FMT-HVD), Manaus, Amazonas, Brazil.

2. Universidade do Estado do Amazonas (UEA), Manaus, Amazonas, Brazil. 3. Universidade Nilton Lins, Manaus, Amazonas, Brazil 4. Faculdade de Medicina de São Jose do Rio Preto (FAMERP), São Jose do

Rio Preto, São Paulo, Brazil 5. Instituto Leônidas & Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz

(FIOCRUZ), Manaus, Amazonas, Brazil 6. Centro de Pesquisas em Virologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

(FMRP-USP), Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil E-mail addresses:

1. Valquiria do Carmo Alves Martins – [email protected] 2. Michele de Souza Bastos – [email protected] 3. Rajendranath Ramasawmy – [email protected] 4. Regina Pinto de Figueiredo – [email protected] 5. João Bosco Lima Gimaque – [email protected] 6. Wornei Braga - [email protected] 7. Mauricio Lacerda Nogueira - [email protected] 8. Sergio Nozawa - [email protected] 9. Felipe Gomes Naveca – [email protected] 10. Luiz Tadeu Moraes Figueiredo – [email protected] 11. Maria Paula Gomes Mourão – [email protected]

* Corresponding author:

Valquiria do Carmo Alves Martins, MD. Phone: +55 92 2127 3447 or +55 92 8128 6213 E-mail: [email protected] Address: Av. Pedro Teixeira, 25 - Gerência de Virologia

Manaus – Amazonas – Brazil ZIP Code: 69040-000

mailto:[email protected]












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Abstract Background: Dengue is a vector-borne disease in the tropical and subtropical region

of the world and is transmitted by the mosquito Aedes aegypti. In the state of

Amazonas, Brazil during the 2011 outbreak of dengue all the four Dengue virus

(DENV) serotypes circulating simultaneously were observed. The aim of the study

was to describe the clinical epidemiology of dengue in Manaus, the capital city of the

state of the Amazonas, where all the four DENV serotypes were co-circulating

simultaneously.

Methodology: Patients with acute febrile illness during the 2011 outbreak of dengue,

enrolled at the Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Viera Dourado (FMT-HVD),

a referral centre for tropical and infectious diseases in Manaus, were invited to

participate in a clinical and virological descriptive study. Sera from 677 patients were

analyzed by RT-nested-PCRs for flaviviruses (DENV 1-4, Saint Louis encephalitis

virus-SLEV, Bussuquara virus-BSQV and Ilheus virus-ILHV), alphavirus (Mayaro

virus-MAYV) and orthobunyavirus (Oropouche virus-OROV).

Principal Findings: Only dengue viruses were detected in 260 patients (38.4%).

Thirteen patients were co-infected with more than one DENV serotype and six

(46.1%) of them had a more severe clinical presentation of the disease. Nucleotide

sequencing showed that DENV-1 belonged to genotype V, DENV-2 to the

Asian/American genotype, DENV-3 to genotype III and DENV-4 to genotype II.

Conclusions: Co-infection with more than one DENV serotype was observed. This

finding should be warning signs to health authorities in situations of the large

dispersal of serotypes that are occurring in the world.

Key-words: Acute febrile illness, dengue, diagnosis by RT-PCR, dengue virus

phylogeny, Brazil.

.

Introduction

Dengue virus (DENV) infection may display either benign acute febrile illness or

severe disease such as dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome

(DHF/DSS) [1]. Over the last 31 years, Brazil has suffered successive outbreaks of

dengue. The incidence of dengue continues to increase, and in the last decade

700,000 cases are reported per year. The mean age of severe dengue patients is

decreasing. A high proportion of children are increasingly affected with severe

disease [2]. In recent years, dengue outbreaks have displayed many atypical cases

such as myocarditis, hepatitis, meningoencephalitis and acute kidney failure [3].

Fatality rates have also increased.

In Manaus, the capital city of the Amazonas state, circulation of the four DENV

serotypes was observed during the 2011 outbreak and is the only city to date to

report co-circulation of all four DENV serotypes simultaneously in Brazil, providing a

clear evidence of dengue hyperendemicity [4]. The occurrence of severe forms of

dengue is commonly related to secondary infections leading to antibody dependent

enhancement (ADE) of DENV infection in macrophages [5]. Alternatively, severe

forms of dengue could be related to virus mutants that emerge as part of a natural

selection process [6]. Molecular epidemiology studies have shown that DENV

genome suffers mutations and may lead each virus serotype to differentiate into

multiple genotypes [7].

This study describes the clinical epidemiology of dengue in a city where all the

four DENV serotypes are co-circulated simultaneously and also provides the

opportunity to compare clinical severity to DENV serotypes. The results of the

arboviruses surveillance performed by FMT-HVD during a dengue outbreak in 2011

are shown. Simultaneous circulations of the four DENV serotypes and different

clades were observed. Dengue co-infection seems to lead to more severe

manifestations.

Materials and Methods

Study design

.

This is a clinical and virological descriptive study to correlate clinical data with

DENV serotypes during the 2011 outbreak of dengue in the Amazonas, Brazil.

Patients with dengue were recruited from January 2011 through May 2011. A total of

677 patients from Manaus seeking medical assistance at the FMT-HVD agreed to

participate in the study.

Setting

All of the patients participating in this study are inhabitants of Manaus and

were recruited at the FTM-HVD. The FMT-HVD, located in the Manaus city with

almost a population of 2 million inhabitants, is the referral centre for acute febrile

illness and tropical infectious diseases.

Study sample

Patients with acute febrile illness but negative for malaria by thick blood smear

test and presenting any two of the following symptoms in the first visit: headache,

myalgia, arthralgia or malaise, were invited to participate in the present study. All of

the patients participating in the study signed a written informed consent form. Parents

or responsible party of children less than 18 years were required to sign a written

inform consent form. This study was approved by the internal review board of the

Ethics Committee of the FMT-HVD under the register number 2015.

Inclusion criteria

Patients with acute febrile illness presenting fever less than 7 days were

selected and classified according to the 2012 World Health Organization guidelines

for dengue cases (http://www.who.int/denguecontrol/9789241504713/en/).

Group I

Dengue without warning signs - patients live in/travel to dengue endemic area,

with fever and two of the following symptoms: nausea, vomiting, rash, aches and

pains; tourniquet test positive; leukopenia.

Group II

.

Dengue with warning signs - patients with abdominal pain or tenderness;

persistent vomiting; clinical fluid accumulation; mucosal bleed; lethargy, restlessness;

liver enlargement >2cm; increase in haematocrit concurrent with rapid decrease in

platelet count.

Group III

Severe dengue – patients presenting severe plasma leakage leading to shock

(DSS); fluid accumulation with respiratory distress; severe bleeding, and severe

organ involvement including the liver (AST or ALT >1000U/dL); the central nervous

system (impaired consciousness); and the heart [8].

The clinical classification of the patients with dengue was performed by the

clinicians according to the 2012 WHO guidelines for dengue on the day of

enrollment. All of the severe dengue patients were hospitalized and followed-up until

discharge. Furthermore, patients were seen in outpatient clinics 48 hours and 6-7

days after hospital discharge for hospitalized patients. Non-hospitalized patients were

seen twice, between 48 hours and 6 days after first clinical assessment.

Biochemical and hematology analysis

Blood sample was collected from all the patients on the day of presentation at

the FMT-HVD. The biochemical tests were done with automatic analyzer CT 600i

Wiener lab group apparatus while the hematological tests with the ABX pentra DX

120 HORIBA ABX Magnos bc.

PCR screening

Five mL of blood was collected from all the participants on the day of

presentation at the FMT-HVD. Serum was separated and RNA was purified from

200µL using the QIAamp Viral RNA mini kit (Qiagen, Germany) according to the

protocol of the kit. The extracted RNAs were stored at -70°C or immediately used for

laboratory tests. cDNA was synthesized by reverse transcription (RT) with

AccessQuick RT-PCR System kit (Promega, USA). The RT mixture consisted of 5 µl

of RNA, 1 unit of the enzyme reverse transcriptase, 12.5μl of AccessQuick Master

Mix (2x), 1μl of Random primer and 20U of RNase inhibitor (RNaseOUT -Invitrogen,

.

USA) in a final volume of 20μl completed with RNase free water. The mixture was

incubated at 72°C for 5 minutes (min) and at 45oC for 60 min and stored at - 20°C

until use.

For determining the DENV serotype, the cDNA were tested by a semi-nested

multiplex reverse transcription-PCR as described elsewhere [9]. Briefly, each cDNA

was subjected to polymerase chain reaction (PCR) amplification with D1 and D2

primers for 35 cycles: 1 min at 94°C, 1 min at 55°C, and 1 min at 72°C, with a final

extension for 10 min at 72°C. A second round of amplification was conducted with 10

µl (diluted 1:100) of the first reaction mixture, including DENV serotype-specific

reverse primers (TS1–TS4), and the conserved forward primer D1. The same cycling

parameters were used as in the first reaction.

All negative samples underwent another screening for DENV and other

flaviviruses using the real time RT-PCR with Maxima SYBR GREEN/ROX reagents

(Fermentas) [10]. Negative samples by real time RT-PCR were also tested by a

conventional RT-PCR with Flavivirus genera specific primers followed by multiplex-

nested-PCRs with species-specific primers [11]. After the first round of PCR with

Flavivirus genera specific primers, nested-PCR primers specific for Dengue DENV 1-

4, Saint Louis encephalitis virus-SLEV, Bussuquara virus-BSQV and Ilheus virus-

ILHV, were used in the Multiplex-PCR. Precautions to avoid contamination were

followed. Positive and negative controls were used in all reactions.

Samples previously negative to dengue were also tested for alphaviruses

using genera-specific primers followed by a Multiplex-Nested-PCR with species-

specific primers, including those for MAYV as previously described elsewhere [12].

For orthobunyaviruses, the samples were tested using genera-specific primers

followed by a Nested-PCR with OROV specific primers [13].

All the samples that showed co-infections were reprocessed for RNA

purifications from another aliquot of sera and undergone the RT-nested PCR for

DENV to confirm co-infections and to avoid any doubt of contaminations.

Nucleotide sequencing and phylogenetics

.

Nucleotide sequencing of amplicons was performed after treatment with

Exonuclease I (20U/µL) (BioLabs, New England) and Shrimp Alkaline

Phosphatase-SAP (1U/µL) (Fermentas). Briefly, the purification mixture included

amplicons, 10µL of Exo/SAP (0.025µL SAP, 0.250µL of Exonuclease I and 9.725 µL

of Milli Q water). The mixture was incubated at 37°C for 30 min and 95°C for 5 min.

Quantification of amplicons was performed in a NanoDrop 2000/2000c (Termo

Scientific). Purified amplicons were directly sequenced using the Big dye Terminator

Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, EUA), following instructions of the

manufacturer in the automatic sequencer ABI 3130L (Applied Biosystems, EUA).

Nucleotide sequences were analyzed by algorithms of the BioEdit Sequence

Alignment software [14]. Nucleotide and putative amino acid sequences were

compared to other sequences from GenBank for phylogenetic analysis by neighbor-

joining method using the Mega 5.05 software with 1000 bootstrap replications [15].

Gene Accession numbers:

All the nucleotide sequences were submitted to GenBank and can be

accessed with the following numbers: KF417476, KF417479, KF417480, KF417481,

KF417478, KF417482, KF417477, KF417485, KF417484, KF417483, KF417488,

KF417486, KF417489, KF417487, KF417490, KF417491, KF417496, KF417492,

KF417493, KF417495, KF417494.

Correlation of clinical data to DENV serotypes

Laboratory findings and DENV serotypes were crossed blindly to the clinical

status of all of the patients.

Statistical analysis

The Epi Info version 7.3.2 software was used for data handling. Descriptive

analyses were performed to calculate means and standard deviation for continuous

variable and relative frequency for categorical variable. Statistical analysis was

performed using SPSS version 17.0. Chi-Square tests with Yates correction were

performed for statistical comparison. Odds Ratio (OR) and 95% confidence interval

.

(CI) were calculated by logistic regression to estimate the effect of co-infection or

other clinical variables. Differences were considered significant at p ≤ 0.05.

Results

General characteristics of the study population

A total of 677 patients with acute febrile illness and negative for malaria were

included in the study. The mean age of the infected patients was 35.7± SD 15.7

(range 4 to 83 years) and 53.5% (139/260) were females.

Molecular typing

Molecular typing for DENV showed positivity for 260 (38.4%) patients. The

DENV serotypes were as follows: 46.2% (120/260) had DENV-2, 29.% (77/260)

DENV-4, 10.0% (26/260) DENV-1 and 9.2% (24/260) DENV-3. Thirteen had co-

infections: 2.3% (6/260) had DENV-2/4, 1.9% (5/260) DENV-1/4, 0.4% (1/260)

DENV-1/2 and 0.4% DENV-3/4. All samples were negative to other flaviviruses, and

also negative to MAYV and OROV. The patients were from different regions of the

city and comparison among the regions to DENV serotypes did not show any

difference. The co-infected patients were also from different regions.

Based on clinical presentation, dengue patients were classified as 192 dengue

without warning signs cases, 45 severe dengue cases (DHF in 37 cases and 8 cases

with neurological manifestations as somnolence, irritability and disorientation), and 23

dengue with warning signs cases. Clinical presentations of the dengue patients

associated with DENV serotypes are shown in Table 1. Seven of the co-infected

patients were classified as dengue with/without warning signs and the other six were

hospitalized after initial evaluation. Co-infected patients with more than one DENV

serotypes had more severe dengue (p=0.004) compared to mono-infected patients.

The serology and the viral load were not performed and it is possible that many of the

co-infected patients may be of secondary infections and developed severe disease.

Comparison of the different DENV serotypes with severity of the disease showed no

statistical difference.

.

Clinical manifestations associated with dengue serotypes and co-infections

are shown in Table 2. Cutaneous rash was more frequent (p=0.003) among patients

infected by DENV-1 or patients co-infected compared to patients infected with the

other serotypes. Ocular pain (p=0.03) and hemorrhagic phenomena (p=0.01) were

more frequent among patients co-infected with different serotype mixtures.

Laboratory findings associated to clinical severity of dengue are shown in

Table 3. Levels of albumin in plasma (p=0.03) and platelet counts <100.000/mm3

(p<0.01) were significantly related to severe dengue and dengue with warning signs

respectively.

Severe Dengue or minor hemorrhagic phenomena were prevalent among co-

infected patients with an OR of 4.57 (p=0.004) and 9.09 (p<0.001) respectively as

shown in Table 4. Other variables such as arthralgia, rash, ocular pain, alarm signs,

platelets counts and serum albumin level were also statistically significant compared

to mono-infected patients. In table 5 is described the individual data for each patient

co-infected with emphasis in their clinical and epidemiological findings.

Phylogenetics analysis

Nucleotides sequencing of a fragment of 453 base pairs for the region of prM-

C of 21 samples (16 cases with dengue without warning signs, 3 with severe dengue

and 2 with dengue with warning signs) were performed. Of the 21 samples, 7 were of

DENV-1, 7 of DENV-2, 2 of DENV-3 and 5 of DENV-4. Nucleotide sequences were

aligned and neighbor joining phylogenetic trees were generated for each DENV

serotype, as shown at Figures 1, 2, 3 and 4. DENV-1 (Fig.1), DENV-2 (Fig.2), DENV-

3 (Fig.3) and DENV-4 (Fig. 4) belong to the genotype V, Asian/American genotype,

genotype III and genotype II respectively. All the nucleotide sequences were

submitted to NCBI and the corresponding GenBank accession numbers were

generated (Supplementary Table S1, ALVES VCR 301013 STROBE).

Discussion

In the present study, 677 patients with suspected dengue fever were

evaluated and through three different molecular techniques only DENV were

detected in 260 patients. All the four DENV serotypes were detected with the

.

predominance of DENV-2 and DENV-4. Thirteen patients were co-infected with more

than one DENV serotypes. The co-infected patients manifested severe dengue and

dengue with warning signs compare to mono-infected patients. The clinical

presentation of dengue without warning signs among co-infected patients was

exuberant with cutaneous rash, arthralgia and ocular pain.

No difference was observed between the DENV serotypes and severity of the

disease. This is an important finding as DENV-2 in Brazil is related to severe disease

[16,17]. Co-infection with more than one DENV serotypes has been gradually

reported in the last decade. Rocco and colleagues (1998) were the first to report a

case of co-infection by serotypes of DENV-1 and 2 in a 30-year-old resident of

Miranda, MS, Brazil in 1996 and Lorono-Pino et al (1999) suggested that infections

with more than one serotype should be excepted in hyperendemic areas [18,19].

Since then several other authors have been reporting DENV co-infections [20-22].

In this study, co-infections were observed in 13 patients. Different from three

previous studies in Brazil where all the six co-infected reported patients were of

dengue without warning signs [18,23,24], 61% (8/13) of the co-infected patients in

this study had either severe dengue or dengue with warning signs. Some studies

have shown that co-infection can cause severe disease. In a study conducted in

India, six out of nine co-infected patients had DHF [25].

Altogether it can be suggested that concurrent infections by more than one

serotype could influence the clinical expression of dengue. The presence of two

DENV serotypes in an individual may possibly increase the DENV viremia levels

compare to a mono-infected patient. The number of infected leucocytes in co-infected

patients may be higher and can induce a large cytotoxicity phenomena leading to a

cytokine storm and progress to severe disease. High viral load and secondary

infections may also trigger the development of severe disease. The drawback in our

study is that the serology and the viral load were not performed. It cannot be rule out

that many of the patients were of secondary infections and developed severe

disease.

DENV can cause manifestations of central nervous system and an increasing

number of cases have been reported in the last few years [26-29]. In the present

.

study, among 45 patients with severe dengue, eight had neurologic alteration

(alteration in consciousness) and were not associated to any DENV serotype or co-

infections. All of the patients with neurologic alteration recovered from the disease.

These findings underscore the need to investigate dengue in patients with viral

meningoencephalitis in Manaus and other endemic areas.

Haematocrit, a parameter associated with capillary leak syndrome, was not

significantly increased among patients with severe dengue and dengue with warning

signs. It is possible that the oral rehydration therapy offered to all these patients has

been started before installation of a marked capillary leak. This intervention certainly

has reduced severe cases (only 1% among our patients) and fatalities. However,

platelet counts under 100.000/mm3 were related to severe dengue patients and to

dengue with warning signs.

Manaus is relatively isolated from the rest of the country. To identify whether

the DENV genotypes that are circulating in the country are similar in Manaus,

nucleotide sequencing of the selected samples were performed. All the DENV-1

serotypes were of genotype V, the only genotype detected so far in Brazil [30]. The

phylogenetic tree of DENV-1 (Fig. 1) displayed two distinct clades of genotype V from

patients in this study, which is supported by a high bootstrap value. In our samples

DENV genotypes and clades were not associated with severity of the disease and

neither to any region of the city. However, the dataset is small and need to be further

characterized to confirm this observation. In fact the co-circulation of different clades

and/or clade replacement is related to high genetic diversity of that isolates and can

lead to new distinct biological proprieties that may induce more severe disease.

Recently, two complete distinct strains (both belonging to genotype V) of DENV-1

were observed in Brazil [30].

DENV-2 serotypes from Manaus were grouped with the Asian/American

genotype that is more virulent than the indigenous American genotype and is also the

predominant genotype in Brazil [16,31]. DENV-3 belonged to genotype III introduced

from the Caribbean Islands and present in Brazil since the last 15 years [32,33]. All

DENV-4 analyzed in this study belonged to genotype II. DENV-4 was first described

in Manaus in 2008 [34]. It was found that this DENV-4 belonged to the genotype I,

which is of Asian origin and was never described in the American Continent [34,35].

.

Presently, probably, 2 genotypes (I and II) of DENV-4 are circulating in Manaus

[36,37].

Conclusions

The co-circulation of multiple serotypes or strains of dengue genotypes are

becoming common in endemic region and may increase the risk of major epidemics

as observed in Manaus during the 2011 outbreak where more than 50,000 cases of

dengue virus infections were reported. Future studies with quantification of viruses

and serology test will be needed to understand the mechanism of how co-infection

with more than one DENV serotypes may lead to severe dengue disease in the city

of Manaus.

Autor Contributins

Conceived and designed the experiments: VdCAM MdSB RR FGN LTMF

MPGM. Performed the experiments: VdCAM MdSB RPdF JBLG SN FGN. Analyzed

the data: VdCAM MdSB RR WSMB LTMF MPGM. Contributed

reagents/materials/analysis tools: VdCAM MdSB RR RPdF SN FGN LTMF MPGM.

Wrote the manuscript: VdCAM MdSB RR MLN LTMF MPGM.

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A

Table section Table 1. Clinical presentation of dengue patients associated to infecting virus serotypes and co-infections.

Clinical presentation DENV-1 DENV-2 DENV-3 DENV-4

Co-infections (DENV-1/2, DENV-1/4, DENV-2/4 and

DENV-3/4) Total

N % N % N % N % N % Dengue without warning signs 23 89 88 73 18 75 58 75 5 39 192

Dengue with warning signs 2 8 9 8 4 17 6 8 2 15 23

Severe dengue 1 4 23 19 2 8 13 17 6 46* 45 Total 26 120 24 77 13 260

*p= 0.004 Comparison of co-infected patients to mono-infected patients.

B

Table 2. Clinical aspects of dengue patients associated to the infecting virus serotype and co-infection.

Clinical presentation DENV-1 DENV-2 DENV-3 DENV-4

Co-infection (DENV-1/2, DENV-1/4, DENV-2/4 and DENV-

3/4) P

value N % N % N % N % N %

Headache 6 23 49 41 10 42 30 39 9 69 0.09 Myalgia 5 19 43 36 9 36 30 39 9 69 0.05 Arthralgia 2 8 28 23 5 21 18 23 7 54 0.03* Rash 6 23 9 8 1 5 4 5 4 31 <0.01* Ocular pain 4 15 28 23 9 38 15 20 7 54 0.03* Alarm signs 3 12 32 27 7 29 19 25 8 62 0.02* Hemorrhagic phenomena 1 4 21 18 5 21 10 13 8 62 <0.01* *p<0.05 is considered statistically significant. Comparison of co-infected patients to mono-infected patients.

C

Table 3. Laboratory findings of dengue patients associated with classification of dengue severity

Variable

Dengue without

warning signs Dengue with

warning signs

Severe P

dengue Value N % N % N %

Hemoconcentration

46 36 7 35 23 51 0.74 (45% for males, 42% for females)

17 13 16 80 42 93 <0.01* Platelet < 100 x103/µL

36 29 2 29 2 17 0.66 Leucocytes < 3.0 x103/µL

4 4 1 5 6 14 0.03* Albumin < 3.5 g/dL *p<0.05 is considered statistically significant. Comparisons between severe dengue patients to Dengue with/without warning signs patients.

D

Table 4. Dengue co-infection prevalence and associated variables.

Variable N N+ (%) (95%IC) OR (95% CI) P value

Total sample 260 13 (5.0) (2.4-7.6) - - Severe dengue N 247 39 (15.8) 1 Y 13 6 (46.20) 4.57 (1.43 -14.33 ) 0.004

Arthralgia N 247 53 (21.5) 1 Y 13 7 (53.8) 4.27 (1.38-13.25) 0.013 Rash N 247 20 (8.1) 1 Y 13 4 (30.8) 5.04 (1.43-17.84) 0.023

Ocular pain N 247 56 (27.7) 1 Y 13 7 (53.8) 3.98 (1.28-12.32) 0.018 Hemorrhagic phenomena N 247 37 (15.0) 1

Y 13 8 (61.5) 9.08 (2.82-29.28) < 0.001

Alarm signs N 247 61 (24.7) 1 Y 13 8 (61.5) 4.88 (1.54-15.47) 0.007 Platelet <100x103/µL N 182 66 (36.3) 1 Y 11 9(81.1) 7.91 (1.66-37.71) 0.004 Albumin < 3.5 g/dL N 144 8 (5.6) 1 Y 11 3 (27.3) 6.37 (1.41-28.75) 0.032

Odds Ratio (OR) were calculated by Chi-squared test.

E

Table 5. Clinical presentation of dengue in co-infected patients

Patient Age/ Gender

Days of fever

Clinical diagnosis Hospitalization Dengue

serotype (PCR) Hemorrhagic

events Cavitary effusion

Abdominal pain

Gallbladder wall thickening

1 25/M 3 I No DENV-1/DENV-4 N N ND ND 2 31/M ND I No DENV-1/DENV-2 N N ND ND 3 17/F 5 II Yes DENV-2/DENV-4 Y N N Y 4 64/F 7 III Yes DENV-3/DENV-4 Y N Y N 5 38/M 3 I Yes DENV-1/DENV-4 Y N N N 6 27/M 4 III Yes DENV-2/DENV-4 Y Y Y Y 7 18/F 6 III Yes DENV-1/DENV-4 Y N Y N 8 61/F 4 III Yes DENV-2/DENV-4 N N N N 9 45/F ND I No DENV-1/DENV-4 N N ND ND 10 36/F ND I No DENV-2/DENV-4 N N ND ND 11 28/F 7 III Yes DENV-1/DENV-4 Y N N Y 12 17/F 4 II Yes DENV-2/DENV-4 Y N N N 13 40/M 6 III Yes DENV-2/DENV-4 Y Y Y N

I: dengue without warning signs; II: dengue with warning signs; III: severe dengue; M: male; F: female; Y: yes; N: No; ND: no data

F

Figure Legends

Figure 1. Phylogenetic tree of DENV-1. The neighbor-joining tree was constructed based on the prM-C genome region and sequences were compared to sequences retrieved from Gene-Bank (NCBI, USA). Sequences from this study are marked with dots. Only boot-strap values above 75% are shown in the figure.

Figure 2. Phylogenetic tree of DENV-2. The neighbor-joining tree was constructed based on the prM-C genome region and sequences were compared to sequences retrieved from Gene-Bank (NCBI, USA). Sequences from this study are marked with dots. Only boot-strap values above 75% are shown in the figure.

Figure 3. Phylogenetic tree of DENV-3. The neighbor-joining tree was constructed based on the prM-C genome region and sequences were compared to sequences retrieved from Gene-Bank (NCBI, USA). Sequences from this study are marked with dots. Only boot-strap values above 75% are shown in the figure. Figure 4. Phylogenetic tree of DENV-4. The neighbor-joining tree was constructed based on the prM-C genome region and sequences were compared to sequences retrieved from Gene-Bank (NCBI, USA). Sequences from this study are marked with dots. Only boot-strap values above 75% are shown in the figure.

G

Supporting Information Legends Table S1. Nucleotide sequences used for generating phylogenetic trees are registered in GenBank (NCBI, USA). ALVES VCR 301013 STROBE

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - pos.uea.edu.br · aguda da infecção, em que os sintomas são muito semelhantes. Estudos têm demonstrado a circulação de arbovírus em várias