Upload
vuque
View
212
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MANOELA TORRES DO RÊGO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO
AQUOSO, FRAÇÕES E COMPOSTOS IDENTIFICADOS NOS FRUTOS DE
Hancornia speciosa Gomes (APOCYNACEAE)
NATAL/RN
2015
MANOELA TORRES DO RÊGO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DO EXTRATO
AQUOSO, FRAÇÕES E COMPOSTOS IDENTIFICADOS NOS FRUTOS DE
Hancornia speciosa Gomes (APOCYNACEAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas (Área de concentração: Bioanálises e Medicamentos).
Orientador:
Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa
Co-orientadora:
Profa. Dra. Mariana Angélica Oliveira Bitencourt
NATAL/RN
2015
AGRADECIMENTOS
À Deus, ser de infinita sabedoria, por dar-me força e saúde para
superar e enfrentar tantos obstáculos ao longo desses dois anos, fazendo-me
acreditar que tudo é possível, basta ter persistência, fé e vontade de vencer.
Ao meu orientador Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa,
meu pai científico, pela confiança, pelas oportunidades, por todos os desafios
lançados e por acreditar que eu seria capaz. Pode ter certeza cada palavra foi
um tijolinho para consolidar minha esperança e acreditar que no final daria tudo
certo. Saiba que lhe admiro, respeito e acima de tudo me orgulho de ser sua
aluna, um orientador humano e com o coração enorme.
À minha co-orientadora, a Profª. Dra. Mariana Angélica Oliveira
Bitencourt, minha mãe científica, pela oportunidade, atenção, paciência,
ensinamentos, confiança e amizade, o que seria de mim sem você? Pois é,
sem você tudo seria mais difícil. Agora serei Mestra, mas nunca deixarei de ser
‘sua menina’, obrigada por sempre segurar a minha mão, que Deus te abençoe
infinitamente!
À minha amiga e companheira Allanny Furtado pela parceria na vida
pessoal e acadêmica, você foi essencial para o desenvolvimento deste
trabalho. Acredite, não sei como minha caminhada seria sem você! Duas
pessoas com personalidades tão diferentes, mas que se complementam como
enzima e substrato. Minha amiga torço muito pelo seu sucesso, assim como
você torce pelo meu, e se Deus permitir, trilharemos juntas por muito tempo.
Aos alunos de Iniciação Científica que acompanharam o
desenvolvimento deste trabalho: Rafael Castro e Nayara Souza. Muito
obrigada pela disposição e dedicação às longas horas de experimento, aprendi
muito com vocês.
Ao meu pai (Vamberto Torres) meu espelho, minha maior referência e
meu maior incentivador, tudo o que eu sou e tudo que tenho devo a você, pode
ter certeza ESSA CONQUISTA É SUA, obrigada por ser o melhor pai do
mundo. À minha mãe (Gina Lopes), minha melhor amiga, quem sempre me
amparou e confortou com seu amor, orações e paciência, todas as palavras de
incentivos foram essenciais para chegar aonde eu cheguei, e se Deus me der
essa graça, ainda realizarei seu sonho. A meu irmão (João Pedro) pelo
companheirismo, pelo consolo em momentos de estresse, por me incentivar e
acreditar que sempre eu seria capaz. Tenho com vocês o mais belo exemplo
de união, amor e o verdadeiro significado da família. Vocês foram essenciais
para que eu perseverasse diante das dificuldades. Obrigado por sonharem
juntos comigo. Amo vocês!
Ao meu namorado (João Luiz) pela paciência, compreensão e
incentivo, sem você tudo seria mais difícil, muito obrigada meu amor.
Todos os colegas e professores do Laboratório de Tecnologia e
Biotecnologia Farmacêutica (Tecbiofar) pelas contribuições científicas e
amizade. Em especial gostaria de agradecer a Maíra Lima, Alaine Maria,
Philippe Castro, Gabriel Azevedo, Karla Samara, Alessandra Daniele,
Ilanna Tainá, Menilla Alves, Richele Machado, Juliana Félix, Yamara
Menezes, Fiamma Gláucia, Andréia Estrela, Jacyra Antunes e Jairo Sotero
(amigo e professor).
À Dona Ana e Washington, pela paciência e auxílio nos cuidados com
os animais no Biotério do Centro de Ciências da Saúde da UFRN.
Agradeço aos animais, vítimas solicitadas pela ciência para o benefício
da humanidade, o meu respeito e eterna gratidão.
Agradeço a todos os familiares e amigos que sempre me apoiaram e
incentivaram, seja por orações ou mensagens motivacionais e me desculpo
pelos momentos de ausência.
Àqueles que por ventura deixei de mencionar e que contribuíram
direta ou indiretamente para a realização desse trabalho.
Matar o sonho é matarmo-nos. É mutilar a nossa alma. O sonho
é o que temos de realmente nosso, de impenetravelmente e
inexpugnavelmente nosso.
(Fernando Pessoa)
RESUMO
Hancornia speciosa Gomes (Apocynaceae), conhecida popularmente
por ‘mangabeira’, é usada na medicina popular para o tratamento de desordens
inflamatórias, hipertensão, dermatites, diabetes, doenças hepáticas e
desordens estomacais. No que diz respeito aos frutos de H. speciosa, a
etnobotânica indica o uso principalmente para o tratamento de inflamação e
tuberculose, entretanto não há relatos de estudos que comprovem sua possível
atividade biológica. O estudo tem como objetivo avaliar a atividade anti-
inflamatória do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa Gomes. O extrato
aquoso foi preparado por decocção, posteriormente submetido a um
fracionamento por meio de partição líquido-líquido e os metabolitos
secundários identificados por Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada
ao detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) e Cromatografia líquida
acoplada ao detector de arranjo de diodo e ao espectrômetro de massa (CL-
DAD-EM). As propriedades anti-inflamatórias do extrato aquoso, frações
diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt) e n-butanol (n-BuOH), bem
como a rutina e o ácido clorogênico foram investigadas usando modelos in vivo
e in vitro. Testes in vivo compreenderam edema de orelha induzido por xilol,
onde foi mensurado a formação do edema; peritonite induzida por carragenina
onde foi avaliado os leucócitos totais em 4h e bolsa de ar induzida por zimosam
que foi mensurado a contagem total de leucócitos e contagem diferencial em 6,
24 e 48 horas. Os testes in vitro avaliaram os níveis de citocinas IL-1β, IL-6, IL-
12 e TNF-α usando ELISA a partir do modelo de peritonite induzido por
carragenina. Os resultados demonstraram a presença de rutina e ácido
clorogênico no extrato aquoso dos frutos de H. speciosa por CLAE-DAD e CL-
DAD-EM. O extrato aquoso e frações, bem como a rutina e ácido clorogênico
inibiram significativamente o edema de orelha induzido por xilol e reduziram a
migração celular em modelos animais, tanto na peritonite induzida por
carragenina como na bolsa de ar induzida por zimosam. Além disso, foi
observada a redução dos níveis de expressão de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12 e
TNF-α. Este é o primeiro estudo que demonstra o efeito anti-inflamatório do
extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa contra diferentes agentes
inflamatórios em modelos animais, sugerindo que suas moléculas bioativas,
especialmente rutina e ácido clorogênico contribuem, em parte, para o efeito
anti-inflamatório do extrato aquoso. Estes resultados suportam a utilização de
H. speciosa na medicina popular e revelam que o extrato aquoso apresenta um
potencial terapêutico para o desenvolvimento de uma droga herbal com
propriedades anti-inflamatórias.
Palavras-chave: Hancornia speciosa, rutina, ácido clorogênico, anti-inflamatório, Apocynaceae.
ABSTRACT
Hancornia speciosa Gomes (Apocynaceae), popularly known as
‘mangabeira’, has been used in folk medicine to treat inflammatory disorders,
hypertension, dermatitis, diabetes, liver diseases and stomach disorders.
Regarding the Hancornia speciosa fruits, the ethnobotany indicates its use
especially for treating inflammation and tuberculosis. However, no study has
been done so far to prove such biological activities. The objective was
evaluation anti-inflammatory activity from the fruits of Hancornia speciosa
Gomes (mangabeira). Aqueous extract was prepared by decoction,
subsequently submitted the liquid-liquid fractionation. The secondary
metabolites were identified by high performance liquid chromatography coupled
with detector diode array (HPLC-DAD) and liquid chromatography diode array
detector coupled with mass spectrometry (LC-DAD-MS). The anti-inflammatory
properties of the aqueous extract, dichloromethane (CH2Cl2), ethyl acetate
(EtOAc) and n-butanol (n-BuOH) fractions of the fruits from H. speciosa, as well
as rutin and chlorogenic acid were investigated using in vitro and in vivo
models. In vivo tests comprised the xylene-induced ear edema that was
measured the formation of edema, carrageenan-induced peritonitis was
evaluated the total leukocytes at 4h and zymosan-induced air pouch was
measured the total leukocytes and differential cell count at 6, 24 and 48 hours,
whereas in vitro tests were evaluated levels of cytokines IL-1β, IL-6, IL-12 and
TNF-α using ELISA obtained of carrageenan-induced peritonitis model. The
results showed the presence of rutin and chlorogenic acid were detected in the
aqueous extract from H. speciosa fruits by HPLC-DAD and LC-DAD-ME.
Furthermore, the aqueous extracts and fractions, as well as rutin and
chlorogenic acid significantly inhibited the xilol-induced ear edema and reduced
cell migration in the animal models such as carrageenan-induced peritonitis and
zymosan-induced air pouch. In addition, reduced levels of cytokines IL-1β, IL-6,
IL-12 and TNF-α were observed. This is the first study that demonstrated the
anti-inflammatory effect of aqueous extract from Hancornia speciosa fruits
against different inflammatory agents in animal models, suggesting that their
bioactive molecules, especially rutin and chlorogenic acid contributing, at least
in part, to the anti-inflammatory effect of aqueous extract. These findings
support the widespread use of Hancornia speciosa in popular medicine and
demonstrate that this aqueous extract has therapeutic potential for the
development of a herbal drugs with anti-inflammatory properties.
Keywords: Hancornia speciosa, rutin, chlorogenic acid, Anti-inflammatory, Apocynaceae.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Cascata do ácido araquidônico ................................................... 23
Figura 2 - Mecanismo de ação dos anti-inflamatórios não esteroidais (A) e
anti-inflamatórios esteroidais (B) ................................................. 25
Figura 3 - Frutos de Hancornia speciosa Gomes ........................................ 29
Figura 4 - Esquema representativo do processo de fracionamento por
meio de partição líquido-líquido do extrato aquoso dos frutos de
Hancornia speciosa. ...................................................................... 38
Figura 5 - Cromatogramas obtidos por Cromatografia em Camada Delgada
do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia speciosa
........................................................................................................ 51
Figura 6 - Cromatogramas obtidos por co-Cromatografia em Camada
Delgada do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia
speciosa com padrões .................................................................. 52
Figura 7 - Cromatograma obtido por CLAE do extrato aquoso dos frutos
de Hancornia speciosa e seus respectivos espectros de UV
gerados pelo detector DAD. ......................................................... 54
Figura 8 - Estrutura química da rutina (A) e do ácido clorogênico (B) ...... 55
Figura 9 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa na
migração leucocitária a partir do modelo de peritonite induzido
por carragenina ............................................................................. 57
Figura 10 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa
sobre a produção de citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e
TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de camundongos
submetidos à peritonite induzido por carragenina .................... 58
Figura 11 - Efeito das frações diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila
(AcOEt) e n-butanol (n-BuOH) de Hancornia speciosa na
migração leucocitária a partir do modelo de peritonite induzido
por carragenina ............................................................................. 59
Figura 12 - Efeito das frações diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila
(AcOEt) e n-butanol (n-BuOH) de Hancornia speciosa sobre a
produção de citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α (D) a
partir do exsudato peritoneal de camundongos submetidos à
peritonite induzido por carragenina ............................................ 60
Figura 13 - Efeito da rutina na migração leucocitária a partir do modelo de
peritonite induzido por carragenina ............................................ 61
Figura 14 - Efeito da rutina sobre a produção de citocinas IL-1β (A), IL-6
(B), IL-12 (C) e TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de
camundongos submetidos à peritonite induzido por carragenina
........................................................................................................ 62
Figura 15 - Efeito do ácido clorogênico na migração leucocitária a partir
do modelo de peritonite induzido por carragenina .................... 63
Figura 16 - Efeito do ácido clorogênico sobre a produção de citocinas IL-
1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α (D) a partir do exsudato
peritoneal de camundongos submetidos à peritonite induzido
por carragenina ............................................................................. 64
Figura 17 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa na
migração leucocitária a partir do modelo de bolsa de ar induzido
por zimosam .................................................................................. 71
Figura 18 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa
sobre cinética de migração leucocitária em modelo de bolsa de
ar induzida por zimosam .............................................................. 73
Figura 19 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa
sobre cinética de migração de polimorfonucleares (A) e
mononucleares (B) em modelo de bolsa de ar induzida por
zimosam ......................................................................................... 74
Figura 20 - Efeito rutina na migração leucocitária a partir do modelo de
bolsa de ar induzido por zimosam ............................................... 75
Figura 21 - Efeito da rutina sobre cinética de migração leucocitária em
modelo de bolsa de ar induzida por zimosam ............................ 76
Figura 22 - Efeito da rutina sobre cinética de migração de
polimorfonucleares (A) e mononucleares (B) em modelo de
bolsa de ar induzida por zimosam ............................................... 77
Figura 23 - Efeito do ácido clorogênico na migração leucocitária a partir
do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam ....................... 78
Figura 24 - Efeito do ácido clorogênico sobre cinética de migração
leucocitária em modelo de bolsa de ar induzida por zimosam . 79
Figura 25 - Efeito do ácido clorogênico sobre cinética de migração de
polimorfonucleares (A) e mononucleares (B) em modelo de
bolsa de ar induzida por zimosam ............................................... 80
LISTA DE TABELA
Tabela 1 - Partes da planta e uso popular da espécie Hancornia speciosa
........................................................................................................ 30
Tabela 2 - Partes da planta, preparação e atividade biológica comprovada
experimentalmente da espécie Hancornia speciosa .................. 31
Tabela 3 - Principais metabólitos encontrados no extrato aquoso dos
frutos de Hancornia speciosa e seus respectivos métodos
químicos de identificação. ............................................................ 49
Tabela 4 – Percentagem de inibição do extrato aquoso e frações dos
frutos de Hancornia speciosa, bem como rutina e ácido
clorogênico em modelo de peritonite induzida por carragenina
........................................................................................................ 67
Tabela 5 - Atividade anti-edematogênica do extrato aquoso dos frutos de
Hancornia speciosa, rutina e ácido clorogênico em modelo de
edema de orelha induzido por xilol .............................................. 69
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AC Ácido clorogênico
AcOEt Acetato de etila
AIEs Anti-inflamatórios esteroidais
AINEs Anti-inflamatórios não-esteroidais
Anova Analysis of variance (análise de variância)
BuOH n-butanol
CCD Cromatografia em camada delgada
CCS Centro de Ciências da Saúde
CD4 Cluster of differentiation of type 4 (Cluster de diferenciação
do tipo 4)
CH2Cl2 Diclorometano
CLAE-DAD Cromatografia a líquido de alta eficiência acoplada a
arranjos diodo
CL-DAD-EM Cromatrografia líquida acoplada ao detector de arranjo de
diodo e ao espectrômetro de massa
Co-CCD Co-cromatografia em camada delgada
CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
COX-1 Cicloxigenase 1
COX-2 Cicloxigenase 2
DAD Detector de arranjo de diodos
EA Extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa
ECA Enzima conversora de angiotensina
ELISA Enzyme-linked immunoabsorbent assay (ensaio de
imunoabsorbância ligada à enzima)
EM Espectrofotômetro de massas
ESI-MS Electrospray ionization mass spectrometry (espectrometria
de massas com ionização electrospray)
FR1 Fração diclorometano
FR2 Fração acetato de etila
FR3 Fração n-butanol
i.p. Intraperitoneal
i.v. Intravenoso
HCl Ácido clorídrico
H2SO4 Ácido Sulfúrico
IL-1β Interleucina 1β
IL-6 Interleucina 6
IL-12 Interleucina 12
iNOS Inducible nitric oxide synthase (óxido nítrico sintetase
induzida)
MN Mononucleares
MyD88 Myeloid differentiation primary response gene 88 (gene de
resposta primária de diferenciação mielóide 88)
m/z relação massa carga
NF-κB Nuclear factor kappa B (fator nuclear kappa B)
NK Natural Killer cell (células exterminadoras naturais)
ON Óxido nítrico
p p-valor
PBS Phosphate buffered saline (tampão salina-fosfato)
PG Prostaglandinas
PGE2 Prontaglandinas E2
PI3-K Phosphoinositide 3-kinase (Fosfatidilinositol 3-quinase)
PMN Polimorfornucleares
PGI2 Prostaciclina
Rf Retention factor (fator de retenção)
RT Tempo de retenção
Sal Solução salina estéril (0,9 mg/mL)
s.c. Subcutâneo
Sisbio Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade
TMB Tetrametilbenzidina
TNF-α Tumor necrosis factor α (fator de necrose tumoral α)
TXA2 Tromboxanos A2
UV Ultravioleta
Zim Zimosam
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 16
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................... 19
2.1 Inflamação ................................................................................................. 19
2.1.1 Aspectos gerais da inflamação ..................................................... 19
2.1.2 Eventos vasculares e celulares .................................................... 20
2.1.3 Principais mediadores inflamatórios ............................................ 21
2.1.4 Terapia anti-inflamatória ................................................................ 24
2.2 Plantas Medicinais como alternativa terapêutica .................................. 26
2.2.1 Hancornia speciosa Gomes .......................................................... 28
3 OBJETIVOS .................................................................................................. 34
3.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 34
3.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 34
4 JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 35
5 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 37
5.1 Material vegetal ........................................................................................ 37
5.2 Preparação do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa ..... 37
5.3 Fracionamento do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa 37
5.4 Análises fitoquímicas do extrato aquoso de Hancornia speciosa ....... 38
5.4.1 Triagem fitoquímica ....................................................................... 38
5.4.1.1 Pesquisa de Taninos – Reação de precipitação em gelatina
.............................................................................................................. 39
5.4.1.2 Pesquisa de Alcalóides – Reação de precipitação em
reagente de Dragendorff, Mayer, Wagner e Bertrand ....................... 39
5.4.1.3 Pesquisa de Saponinas – Reação de formação de espuma 39
5.4.1.4 Pesquisa de Compostos fenólicos – Reação com cloreto
férrico ................................................................................................... 40
5.4.1.5 Pesquisa de Flavonóides – Reação de Cianidina ou Shinoda
.............................................................................................................. 40
5.4.2 Cromatografia em camada delgada (CCD) ................................... 40
5.4.3 Cromatografia líquida de alta eficiência acoplado ao detector de
arranjo de diodo (CLAE- DAD) ............................................................... 41
5.4.4 Cromatografia líquida acoplada com detector de arranjos de
diodo e ao espectrômetro de massas (CL-DAD-EM) ........................... 42
5.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória do extrato aquoso dos frutos
de Hancornia speciosa, rutina e ácido clorogênico. ................................... 43
5.5.1 Animais de experimentação .......................................................... 43
5.5.2 Modelo de peritonite induzido por carragenina........................... 43
5.5.2.1 Dosagem de citocinas inflamatórias IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α
do lavado peritoneal ............................................................................ 44
5.5.3 Modelo de edema de orelha induzido por xilol ............................ 45
5.5.4 Modelo de bolsa de ar induzido por zimosam ............................. 46
5.5.4.1 Cinética de migração leucocitária total e diferencial a partir
do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam ............................. 47
5.6 Análise estatística .................................................................................... 48
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 49
6.1 Análise Fitoquímica do extrato aquoso dos frutos de Hancornia
speciosa .......................................................................................................... 49
6.1.1 Triagem fitoquímica e Cromatografia em camada delgada (CCD)
.................................................................................................................. 49
6.1.2 CLAE-DAD e LC-DAD-EM confirmam a presença de rutina e
ácido clorogênico no extrato aquoso dos frutos Hancornia speciosa
.................................................................................................................. 53
6.2 Efeito do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia speciosa,
rutina e ácido clorogênico em modelo de peritonite induzido por
carragenina ..................................................................................................... 55
6.3 Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa, rutina e
ácido clorogênico em modelo de edema de orelha induzido por xilol ...... 68
6.4 Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa, rutina e
ácido clorogênico em modelo de bolsa de ar induzido por zimosam ....... 70
7 CONCLUSÂO ............................................................................................... 83
REFERENCIAS ................................................................................................ 85
PRODUÇÕES CIENTÍFICAS ........................................................................... 96
Artigo de Mestrado submetido como autora ............................................... 96
Artigo Publicado como co-autora ................................................................. 97
Artigo Submetido como co-autora ............................................................... 98
16
1 INTRODUÇÃO
O uso de plantas medicinais é uma prática comum na medicina popular
brasileira e baseia-se no acúmulo de conhecimentos empíricos por vários
grupos étnicos sobre a eficácia destes produtos naturais (LUIZ-FERREIRA et
al., 2008). No Brasil existem 120.000 espécies vegetais, onde cerca de 20%
são conhecidas por ter caráter medicinal. Elas são amplamente utilizadas em
pesquisas para o desenvolvimento de novos medicamentos, pois representam
uma fonte rica de compostos com atividades farmacológicas (YASEEN et al.,
2015). Estas plantas são encontradas em abundância e representam uma fonte
natural de fácil acesso a população com um custo relativamente baixo
(CALIXTO, 2005).
A Hancornia speciosa Gomes, pertence à família Apocynaceae,
conhecida popularmente como ‘mangabeira’ é uma árvore frutífera encontrada
em regiões do cerrado e caatinga do Brasil (RODRIGUES; CARVALHO, 2001).
Na medicina popular o suco leitoso dos frutos é usado no tratamento de
úlceras, processos inflamatórios e tuberculose (SAMPAIO, 2008), enquanto
que o infuso das cascas é utilizado no tratamento de hipertensão, úlceras
gástricas, distúrbios estomacais e processos inflamatórios (ALMEIDA et al.,
1998). Suas raízes e folhas são usadas como adstringente e no tratamento de
hipertensão e reumatismo (GRANDI et al., 1982; HIRSCHMANN; ARIAS,
1990). Alguns estudos reportados na literatura comprovam várias atividades
biológicas, como por exemplo, o extrato etanólico das folhas exibiu efeitos anti-
hipertensivos (FERREIRA et al., 2007a, 2007b), anti-carcinogênico
(ENDRINGER et al., 2009, 2010) e anti-diabético (PEREIRA et al., 2015).
Moraes et al. (2008) e Rodrigues et al. (2007) demonstraram que o extrato
hidroalcóolico e o infuso das cascas apresentaram efeito gastroprotetor, bem
como atividade antibacteriana contra Helicobacter pylori. Outros estudos
mostraram que o látex possui atividade angiogênica (ALMEIDA et al., 2014),
antimicrobiana, antifúngica (SILVA et al., 2011) e anti-inflamatória (MARINHO
et al., 2011). Porém no que diz respeito aos frutos não há estudos científicos
que evidenciem sua atividade biológica, apenas o uso popular, especialmente
no tratamento de desordens inflamatórias.
17
A inflamação é a resposta do sistema imune frente a diferentes
estímulos, podendo ser desencadeada por substâncias químicas, luz
ultravioleta, calor, substâncias inócuas externas, isquemia, interações
antígeno-anticorpo ou contra os próprios tecidos do corpo (CARVALHO;
LEMÔNICA, 1998). O reconhecimento de um estímulo ou agente lesivo
desencadeia ativação e amplificação da resposta imunológica, induzindo a
ativação de células e liberação de mediadores envolvidos com a resposta
inflamatória (NATHAN, 2002; SCHMID-SCHONBEIN, 2006). Dentre esses
mediadores as citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α) merecem
atenção, pois elas são responsáveis pela modulação da resposta inflamatória
induzindo a expressão de moléculas de adesão e por induzir recrutamento
leucocitário da corrente sanguínea para o local da inflamação (TAYAL; KALRA,
2008).
Para inibir ou controlar o processo inflamatório, medicamentos anti-
inflamatórios não esteroidais (AINEs) e anti-inflamatórios esteroidais (AIEs) são
comumente utilizados. Entretanto, o uso prolongado ou abusivo de AINEs pode
causar sérios efeitos adversos, tais como complicações cardiovasculares e
gastrointestinais (SOSTRES et al., 2010), enquanto que os AIEs causam
imunossupressão reduzindo a resistência à infecção, agravamento de úlceras
estomacais e osteoporose (WHITEHOUSE, 2011).
Alternativamente, a população vem utilizando as plantas como opção
para o tratamento de desordens inflamatórias. Estudos tem mostrado que
substâncias derivadas de plantas são capazes de alterar a função do sistema
imune através de vários efeitos imunomoduladores. Por exemplo, alguns
extratos vegetais são capazes de inibir a migração leucocitária, secreção de
citocinas, liberação de histamina, proliferação e diferenciação de linfócitos
(PLAEGER, 2003; SAKLANI; KUTTY, 2008). Dando importância a estas
propriedades biológicas, o conhecimento popular unido ao conhecimento
científico tem mostrado ser uma ótima ferramenta para a descoberta de novos
fitoterápicos a partir de plantas medicinais (ITOKAWA et al., 2008; SAKLANI;
KUTTY, 2008; KOLEWE; GAURAV; ROBERTS, 2008).
Com base nas propriedades biológicas de H. speciosa e na importância
das plantas medicinais como fonte para descoberta de novos medicamentos, o
estudo teve como objetivo avaliar o efeito anti-inflamatório do extrato aquosos
18
dos frutos de H. speciosa em modelos experimentais de inflamação em
camundongos. In vivo foram avaliados os modelos de (i) peritonite induzida por
carragenina, (ii) edema de orelha induzido por xilol e (iii) bolsa de ar induzida
por zimosam, enquanto que in vitro foram analisadas (iv) a produção de
citocinas inflamatórias (IL β1, IL-6, IL-12 e TNF-α) obtidas a partir do modelo de
peritonite induzida por carragenina. Além disso, foi possível realizar análises
fitoquímicas para identificação dos constituintes presentes no extrato aquoso.
Este é o primeiro estudo que investigou o efeito anti-inflamatório do extrato
aquoso dos frutos de H. speciosa em modelos experimentais de inflamação.
19
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Inflamação
2.1.1 Aspectos gerais da inflamação
A palavra inflamação, do grego phlogosis e do latim flamma, significa
fogo, área em chama. Trata-se de um dos mecanismos mais primitivos de
defesa natural do organismo a invasão por microrganismos patogênicos
(BITENCOURT et al., 2011). Os primeiros sinais clínicos da inflamação foram
datados a aproximadamente 3000 a.C., porém no século I d.C., Aulus C.
Celsus documentou os quatro sinais da inflamação: calor, rubor, edema e dor.
No século XIX, Rudolf Virchow adicionou o quinto sinal, a perda de função
(BENAROYO, 1994; SCOTT; KHAN; DURONIO, 2004).
A inflamação é uma resposta do sistema imune a diferentes estímulos
causados por agentes químicos, físicos ou biológicos e tem por função
erradicar os agentes microbianos ou irritantes e potencializar o reparo tecidual
(BAUTISTA, 2003). No momento da injúria ocorre aumento no fluxo sanguíneo
e dilatação dos pequenos vasos (rubor), seguido do aumento da
permeabilidade vascular (edema), induzindo o aumento da temperatura local
(calor) e a passagem de leucócitos do vaso para o local da inflamação (dor)
(BENAROYO, 1994). O processo inflamatório termina quando o estímulo é
eliminado e os mediadores secretados são destruídos ou dispersos. Além
disso, o nosso organismo é capaz de autorregular a resposta imune e assim
impedir uma resposta inflamatória exacerbada (GRUNDY, 2003), porém
quando o processo inflamatório é desregulado e a resposta inflamatória passa
a ser exacerbada pode ocorrer injúria tecidual, com consequente perda de
função no órgão injuriado ou até mesmo morte (SHERWOOD; TOLIVER-
KINSKY, 2004).
A resposta inflamatória pode ocorre de duas formas: aguda e crônica,
divisão essa baseada na duração e características patológicas. Normalmente a
forma aguda é de curta duração (de minutos, horas ou poucos dias), cuja
característica principal está relacionada com o extravasamento de plasma e
proteínas plasmáticas para o interstício, o que induz formação de edema e
20
migração leucocitária (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004), enquanto que
a forma crônica é caracterizada por inflamações mais prolongadas (semanas,
meses ou anos), podendo ser precedida pela forma aguda, estando associada
à presença de linfócitos, macrófagos, proliferação de vasos sanguíneos, fibrose
e necrose tecidual (DRAY, 1995).
2.1.2 Eventos vasculares e celulares
O processo inflamatório é um mecanismo complexo e consiste de dois
eventos principais que ocorrem simultaneamente, os eventos vasculares e
celulares, com a presença de uma diversidade de substâncias solúveis.
O evento vascular inicia com a lesão e envolve basicamente a
microcirculação. Em condições normais as células e proteínas plasmáticas
migram livremente no sentido do fluxo sanguíneo, porém ao sofrer algum
estímulo lesivo os vasos alteram sua permeabilidade para facilitar a passagem
de leucócitos para o local da inflamação (BAUTISTA, 2003). No primeiro
momento ocorre uma vasoconstricção, com duração de segundo, seguida de
uma vasodilatação produzida por histaminas, serotoninas, bradicininas e
prostaglandinas, que medeiam à contração das células endoteliais favorecendo
o aumento da permeabilidade vascular (SERHAN et al., 2009). O aumento da
permeabilidade vascular induz a formação de edema, caracterizado pelo
extravasamento de fluido rico em proteínas, do compartimento intravascular
para o interstício (ALLER et al., 2007).
A vasodilatação e a exsudação plasmática são acompanhadas por uma
sequência de eventos celulares que resulta na passagem dos leucócitos
intravascular para os tecidos (SUNDERKOTTER et al., 2003). Esses eventos
ocorrem nos vasos e são divididos em três etapas: a primeira etapa ocorre a
marginação, rolagem e adesão; segunda transmigração através do endotélio
(diapedese) e a terceira está relacionado com a migração nos tecidos em
direção a estímulos quimiotáticos (TRAVIS, 1993).
Para iniciar a marginalização é necessário haver mudanças nas
condições hemodinâmicas da circulação sanguínea, com isso os leucócitos
passam a assumir uma posição periférica ao longo da superfície endotelial
(TRAVIS, 1993). Depois ocorre rolamento das células nas paredes dos vasos
21
com interações fracas entre as moléculas de adesão, como as E, P e L-
selectinas, presentes no endotélio e seu respectivo ligante, o fragmento de
carboidrato sialil-Lewis, presente nos leucócitos (MIDDLETOM et al.,1997;
POBER; SESSA, 2007), posteriormente uma interação mais forte permite a
adesão das células às paredes dos vasos. Essa adesão firme ocorre pela
interação entre as moléculas de adesão celular do tipo 1 (ICAM-1) endotelial
com proteínas heterodiméricas da família das integrinas dos leucócitos. A
interação com ICAM-1funcionam como estimuladores da transmigração dos
leucócitos pelo endotélio para os tecidos (diapedese) (KELLY et al., 2007;
LEHMANN et al., 2003). A diapedese envolve desmontagem transitória de
junções endoteliais e penetração dos leucócitos através da membrana basal
subjacente, uma vez no espaço extravascular, a migração de células usa
diferentes integrinas para ganhar aderência em fibras de colágeno e chegarem
ao local da inflamação (ZARBOCK; LEY, 2009). Chegando ao local da
inflamação, os leucócitos fagocitam os patógenos e posteriormente são
ativados para liberação de mediadores inflamatórios, como citocinas, proteases
e espécies reativas de oxigênio que têm como função, combater os agentes
infecciosos (NATHAN, 2006; MALLECH; GALLIN, 1987). Os neutrófilos são os
principais leucócitos que participam na defesa do organismo durante o
processo inflamatório. Sua participação é multifuncional no processo de
inflamação e envolvem respostas apropriadas por meio de locomoção,
reconhecimento seletivo do agente agressor, fagocitose e sua posterior
destruição, além de induzir o recrutamento de outras células leucocitárias
(CASSATELLA, 1995). Os neutrófilos predominam nos tecidos inflamados
durante as primeiras horas, em seguida são substituídos por mononucleares,
em especial os monócitos, que surgem após 24 horas (SIQUEIRA, 2000).
2.1.3 Principais mediadores inflamatórios
Os eventos vasculares e celulares ocorrem graças à presença de
diversos mediadores químicos inflamatórios, os principais envolvidos na
inflamação incluem histamina, serotonina, bradicinina, metabolitos do ácido
araquidônico, citocinas, dentre outros (CASTELLHEIM et al., 2009).
22
A histamina e serotonina, aminas vasoativas, são mediadores pré-
formados (RINGVALL et al., 2008) responsáveis, juntamente com outros
mediadores, pela vasodilatação e subsequente aumento da permeabilidade
vascular (ALLER et al., 2007). A histamina exerce seu efeito biológico ao se
ligar a receptores histamínicos presentes em células endoteliais e na
musculatura lisa vascular e quando ativados provocam vasodilatação pela
produção de óxido nítrico (JANSEN-OLESEN et al., 1997). Semelhante à
histamina, a serotonina exerce o mesmo efeito biológico e está relacionada
com a sensação de dor na inflamação, através de sua ação sobre neurônios
sensoriais (DRAY, 1995). A bradicinina, um peptídeo vasoativo, afeta o calibre
dos vasos sanguíneos através de estimulação de neurônios pós-ganglionares
simpáticos liberando histamina, causando a vasodilatação (CARVALHO;
LEMÔNICA, 1998).
O ácido araquidônico é formado a partir de fosfolipídios de membrana
pela ação da fosfolipase A2, e a partir dele serão formados precursores de
vários eicosanoides (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005). As prostaglandinas,
prostaciclinas, lipoxinas, leucotrienos e os tromboxanos são exemplos de
eicosanoides formados (DRAY, 1995; TANIKAWA et al., 2002) (Figura 1). O
ácido araquidônico pode ser metabolizado pelas enzimas cicloxigenase e
lipoxigenases. As cicloxigenases são responsáveis em produzir
prostaglandinas (D2, E2 e F2), prostaciclinas (PGI2) e troboxanos, enquanto
que as lipoxigenases são responsáveis em produzir leucotrienos e lipoxinas. As
prostaciclinas e prostaglandinas atuam na quimiotaxia de neutrófilos e
macrófago e são potentes vasodilatadores, aumentando a permeabilidade
vascular e promovendo o extravasamento plasmático. Os troboxanos A2 são
potentes agregadores plaquetários e os leucotrienos, em especial o LTB4,
ativam as respostas dos neutrófilos, como agregação e adesão ao endotélio
venular, geração de espécies reativas de oxigênio e liberação de enzimas,
além da potente atividade quimiotática (LEE et al., 2003; NATHAN, 2002;
SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).
23
Figura 1 - Cascata do ácido araquidônico
Fonte: Autoria própria
Dentre todos os mediadores envolvidos na inflamação, as citocinas são
as que merecem mais atenção. Trata-se de polipeptídeos que exercem seus
efeitos em baixas concentrações modulando a função de outras células ou da
própria célula que as liberaram. Normalmente são liberadas durante as reações
imunes e inflamatórias, com a função de regular a ação das células destes
sistemas (OPAL; DEPOLO, 2000). As principais citocinas envolvidas em
processos inflamatórios são o fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), a
interleucina 1β (IL-1β) e a interleucina 6 (IL-6) (ALWANI, et al., 2006).
Macrófagos ativados estão entre as células que mais produzem essas citocinas
pró-inflamatórias, juntamente com a IL-12. (BITENCOURT, 2011).
A IL-1β é uma citocina produzida principalmente por monócitos e
macrófagos, que induz inflamação sistêmica através da ativação da
cicloxigenase-2 (COX-2) com a formação de prostaglandinas E2. O TNF-α
produzido principalmente por monócitos, macrófagos e linfócitos-T, é um dos
mediadores mais potentes e precoces da resposta inflamatória. Juntos, a IL-1β
e o TNF-α, ativam IL-6 que induz a síntese e liberação de proteínas de fase
aguda pelos hepatócitos durante estímulos dolorosos, como trauma, infecção,
24
operação e queimadura (OLIVEIRA, et al., 2011). Já a IL-12 desempenha um
papel importante porque ativa as células NK e favorece a diferenciação dos
linfócitos T CD4 em TH1 (ações pro-inflamatórias) durante a resposta
imunidade adaptativa (BITENCOURT, 2011).
2.1.4 Terapia anti-inflamatória
A homeostasia é restabelecida quando a inflamação é limitada por
respostas anti-inflamatórias desenvolvidas por nosso organismo (NATHAN;
LIDDLE, 2002). Porém quando nosso organismo não é capaz de restabelecer
essa homeostase é necessário o uso de substâncias que quando
administradas possuam ação anti-inflamatória e atuem na recuperação da
homeostasia corpórea.
Dentre as principais terapias anti-inflamatórias, os anti-inflamatórios
não esteroidais (AINEs) são os mais utilizados. Sua ação ocorre principalmente
pela inibição da enzima cicloxigenase (COX), que é responsável pela produção
de prostaglandinas, prostaciclinas e troboxanos (BURIAN; GEISSLINGER,
2005) (Figura 2A). A COX se apresenta com 3 isoformas: COX-1, COX-2 e
COX-3.
A COX-1 é de caráter constitutivo, atuando como protetor de mucosa,
além de mantém a reperfusão hepática e renal, enquanto que a COX-2 é
ativada principalmente em processos inflamatórios. A grande limitação dos
AINEs está em seu efeito farmacológico ocorrer à base de efeitos colaterais
graves, principalmente sobre o trato gastrointestinal, isso porque esses
medicamentos inibem tanto a COX-1 como a COX-2 (ALWANI, EL et al., 2006).
Os efeitos adversos gastrointestinais estão associados à supressão da
expressão da COX-1, resultando em lesões gástricas, hemorragias e
ulcerações, além de alterações cardiovasculares, falência renal e asma
(RANG, 2007; SOSTRES et al., 2010).
Além de inibir a produção de prostaglandinas, os anti-inflamatórios não
esteroidais são capazes de impedir que as células leucocitárias possam aderir
e migrar no endotélio vascular em determinados processos inflamatórios.
Assim, um dos melhores efeitos farmacológicos exercidos pelos AINEs e outros
25
anti-inflamatórios, como glicocorticoides, é limitar a ativação e recrutamento de
leucócitos (WAGNER; ROTH, 2000).
Os glicocorticoides, ou anti-inflamatórios esteroidais (AIEs), atuam no
início da cascata da produção de eicosanoides. São medicamentos que inibem
a fosfolipase A2, promovendo a redução da oferta de ácido araquidônico,
consequentemente impedindo a formação de leucotrienos, lipoxinas,
prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos (DOLAN-O’KEEFE; NICK, 1999)
(Figura 2B).
Figura 2 - Mecanismo de ação dos anti-inflamatórios não esteroidais (A) e anti-
inflamatórios esteroidais (B)
Fonte: Autoria própria
Um glicocorticoide que é bastante usado na terapêutica é a
dexametasona. Trata-se de um anti-inflamatório esteroidal de ação prolongada,
que possui atividade farmacológica 30 vezes maior que a hidrocortisona. Este
medicamento atua inibindo a produção de citocinas inflamatórias, suprimindo a
exsudação do plasma e inibindo a ativação, migração, adesão e
recrutamento celular, além de impedir o acúmulo de leucócitos no local da
inflamação (KAWAMURA et al., 2000; RANG, 2007). Como é esperado, os
AIEs também inibem a formação dos leucotrienos, eicosanoide responsável
pela quimiotaxia de neutrófilos e aumento da permeabilidade vascular. Sua
ação anti-inflamatória é superior ao AINEs por ter a capacidade de impedir a
ação tanto das lipoxigenases como das cicloxigenases (HIGGS et al. 1980).
Apesar de ter uma ação superior aos AINEs, os glicocorticoides
também podem causar inúmeros efeitos adversos, principalmente quando
A B
26
utilizado em altas doses, por longos períodos de tempo ou repetidamente.
Entre os principais efeitos estão à imunossupressão, osteoporose, retenção de
líquidos, predisposição ao desenvolvimento de úlceras gástricas, entre outras
complicações (WHITEHOUSE, 2011).
Os medicamentos anti-inflamatórios são usados para alívio dos
sintomas, particularmente dor e inflamação, porém causam sérios e inúmeros
efeitos adversos. Dependendo da patologia ou condição clínica do paciente,
estes medicamentos não apresentam vantagens quanto ao tratamento, uma
vez que os efeitos adversos podem sobrepor os efeitos terapêuticos. Desta
forma, a busca por novas alternativas terapêuticas, e/ou tratamentos anti-
inflamatórios com menos efeitos adversos são alvos de pesquisas. Neste
contexto as plantas medicinais vêm ganhando espaço e importância na
indústria farmacêutica, já que são amplamente utilizadas na pesquisa de novos
fármacos, pois representam uma fonte rica de compostos com atividade
farmacológica.
2.2 Plantas Medicinais como alternativa terapêutica
Os primeiros registros do uso de plantas medicinais datam 3.000 anos
a.C. As primeiras civilizações perceberam que algumas plantas tinham a
capacidade de combater doenças, baseado no conhecimento empírico
acumulado pelos povos primitivos e indígenas (VIEGAS; BOLZANI;
BARREIRO, 2006).
As plantas medicinais são usadas em todo mundo, porém nas regiões
rurais de países desenvolvidos a fitoterapia é bastante evidente, já que muitas
pessoas vivem em condições de pobreza e não tem acesso a medicina
moderna, dependendo somente de praticantes da medicina tradicional e do uso
de plantas medicinais como atenção primária a saúde (GOLENIOWSKI et al.,
2006). Através do uso popular que as pesquisas se iniciam, já que fornece
informações primárias para o aprofundamento técnico-cientifico sobre
determinada espécie.
A biodiversidade da flora brasileira aliada ao seu vasto potencial
terapêutico tem levado inúmeros pesquisadores a investigarem as
27
propriedades químicas e biológicas de uma grande variedade de plantas
utilizadas na medicina popular, bem como no sentindo de dar uma base
científica ao uso popular (BOLDI, 2004; SZELENYI; BRUME, 2002).
Nos últimos anos houve um grande avanço científico envolvendo
estudos químicos e farmacológicos de plantas medicinais. A descoberta de
substâncias, que em estado natural ou após sofrerem processos de
transformação química, possuem atividade farmacológica, muitas vezes já
confirmada pelo uso popular e comprovada cientificamente, gera interesses
institucionais e governamentais. No Brasil, estima-se que 25% dos 10 bilhões
do faturamento da indústria farmacêutica nacional sejam originados de
medicamentos derivados do reino vegetal. (AGRA et al., 2008; GUERRA;
NODARI, 2001).
Dentro deste contexto, o Brasil é um país privilegiado, pois ocupa o
primeiro lugar dentre os 17 países mais ricos do mundo em biodiversidade,
possuindo cerca de 20 % do total de espécies existentes no planeta
(BANDEIRA-MELO et al., 2000). O bioma da caatinga brasileiro, por exemplo,
apresenta uma grande diversidade na sua flora, com arsenal de plantas que
possui moléculas com potencial terapêutico que precisam ser estudadas suas
propriedades curativas, especialmente para o tratamento e/ou controle de
doenças anti-inflamatórias (CALIXTO et al., 2004). Existem estudos que
demonstram que fármacos derivados de plantas são capazes de alterar a
função do sistema imunológico com uma gama de efeitos imunomoduladores,
podendo afetar a secreção de citocinas, liberação de histamina e a proliferação
de linfócitos (PLAEGER, 2003; SAKLANI; KUTTY, 2008).
Considerando que a terapia anti-inflamatória apresenta uma série de
efeitos adversos e que muitas vezes os efeitos colaterais podem sobrepor os
efeitos terapêuticos, existe uma necessidade de pesquisar novos fármacos que
possuam atividade anti-inflamatória, porém com o mínimo de efeitos colaterais.
Neste contexto, as plantas medicinais vêm ganhando espaço, e os frutos de
Hancornia speciosa vêm sendo bastante utilizado na medicina popular para o
tratamento de desordens inflamatórias (SAMPAIO, 2008).
28
2.2.1 Hancornia speciosa Gomes
A Hancornia speciosa Gomes conhecida popularmente como
mangabiba, mangaíba, mangaíba-uva, mangabeira de minas, fruta de doente,
mangabeira e mangaba, palavra de origem indígena que significa “coisa boa de
comer”, pertence ao grupo das Eudicotiledoneas, classe Magnoliopdida, ordem
Gentianales, família Apocynaceae e espécie Hancornia speciosa Gomes
(SOARES et al., 2001). É uma árvore frutífera nativa do Brasil de clima tropical
e largamente encontrada em vários estados brasileiros, desde os tabuleiros
costeiros e baixadas litorâneas do Nordeste, onde são mais abundantes, até
cerrados das regiões Centro-Oeste, Norte e Sudeste (SILVA et al., 2006).
Trata-se de uma árvore de grande porte, podendo atingir até 15 metros
de altura. Possui um tronco tortuoso com ramos lisos e avermelhados, suas
cascas apresentam um látex branco com aspecto leitoso, cor branca e pH em
torno de 3-4 (LIMA, 2014). As folhas são opostas, simples e pecioladas
(ALMEIDA et al., 1998), as flores brancas e aromáticas (GANGA, CHAVES;
NAVES, 2009). O fruto (Figura 3) apresenta casca amarelada com manchas ou
estrias avermelhadas, normalmente de forma elipsóide ou esférica, medindo de
2,5 a 6 centímetros de comprimento, contendo geralmente, de 2 a 15, ou até 30
sementes discóides, de 7 a 8 milímetros de diâmetro. Apresenta uma polpa
branca, doce, ácida, macia e viscosa com grande valor nutritivo que é
consumida fresca ou como suco, além de poder ser consumida como gelados,
geleias, confeitos e bebidas (LORENZI, 1998; VIEIRA NETO et al., 2002;
SANTOS et al., 2007).
29
Figura 3 - Frutos de Hancornia speciosa Gomes
Fonte: seresvivosdorn.blogspot.com.br
Na medicina popular o suco leitoso dos frutos e o látex são utilizados
como medicamento caseiro no tratamento de tuberculose, úlceras, dermatoses,
verrugas, hematomas, inflamações diversas, diarreia e herpes (SAMPAIO,
2008). O látex também é usado para o tratamento de doenças relacionadas a
fungos (SANTOS et al., 2007), luxação, estimulante hepático, agente
emagrecedor e hipoglicemiante (POTT; POTT, 1994). O infuso das cascas no
tratamento de hipertensão, úlceras gástricas, distúrbios estomacais e
processos inflamatórios, as cascas também são usadas no tratamento de
afecções pulmonares, câimbras e luxações (ALMEIDA et al., 1998; SILVA
JÚNIOR, 2005). As folhas são utilizadas o tratamento de dismenorreia,
diabetes, obesidade e verrugas (ALMEIDA et al., 1998), outros relatos indicam
o infuso das folhas para amenizar cólicas menstruais (SILVA JUNIOR, 2004).
Suas folhas e raízes são usadas também como adstringente e no tratamento
de hipertensão e reumatismo (GRANDI et al., 1982; HIRSCHMANN; ARIAS,
1990). A tabela 1 resume o uso popular de Hancornia speciosa.
30
Tabela 1 - Partes da planta e uso popular da espécie Hancornia speciosa
Parte da planta Uso popular Referências
Frutos
tuberculose, úlceras,
dermatoses, verrugas,
hematomas, inflamações
diversas, diarreia e herpes
SAMPAIO, 2008
Látex
tuberculose, úlceras,
dermatoses, verrugas,
hematomas, inflamações
diversas, diarreia, herpes,
doenças fúngicas, luxação,
diabetes e obesidade
SAMPAIO, 2008;
SANTOS et al., 2007;
POTT; POTT, 1994
Cascas
hipertensão, úlceras gástricas,
distúrbios estomacais,
processos inflamatórios,
afecções pulmonares, câimbras
e luxações
ALMEIDA et al., 1998;
SILVA JÚNIOR, 2005
Folhas
dismenorréia, diabetes,
obesidade, verrugas e cólicas
menstruais, hipertensão,
reumatismo
ALMEIDA et al., 1998;
SILVA JÚNIOR, 2005;
GRANDI et al., 1982;
HIRSCHMANN; ARIAS,
1990
Raízes
Hipertensão e reumatismo
GRANDI et al., 1982;
HIRSCHMANN; ARIAS,
1990
Existem alguns estudos evidenciando o uso popular de Hancornia
speciosa, sintetizados na Tabela 2, como o realizado por Moraes et al. (2008)
que demonstraram que extrato hidroalcoólico das cascas pode ser utilizado no
combate, cura de úlceras gástricas e no tratamento de Helicobacter pylori.
Estas atividades foram atribuídas ao alto teor de proantrocianidinas poliméricas
contidas na fitopreparação. No extrato etanólico das cascas foram identificadas
a presença de saponinas, triterpenos, esteróides, taninos, compostos fenólicos,
catequinas e ácido clorogênico (ANDRADE et al., 2002; HONDA, 2000) e
comprovado o efeito antimicrobiano contra bactérias gram-positivas
(Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis), gram-negativa
(Pseudomonas aeruginosa) e antifúngico (Aspergillus flavus, Candida
guilliermondii, Rhodotorula rubra, Cephalosporium spp. e Trichosporon spp)
31
(COSTA et al., 2008) . Rodrigues et al. (2006,2007) fracionou o infuso das
cascas com acetato de etila e foi possível isolar ácido gálico, ácido clorogênico
e ácido siríngico.
Tabela 2 - Partes da planta, preparação e atividade biológica comprovada experimentalmente da espécie Hancornia speciosa
Parte da planta
Preparação Atividade Comprovada
Referências
Cascas
Extrato
hidroalcoólico
Antiulceroso
Anti Helicobacter-pylori
MORAES et al.,2008
Cascas
Extrato
etanólico
Antibacteriano
Antifúngico
COSTA et al., 2008;
HONDA, 2000
Folhas
Fração acetato
etila-metanol
Anti-hipertensivo
SILVA et al., 2011;
FERREIRA et al.,2007a, 2007b
Folhas
Extrato
etanólico e fração acetato
de etila:metanol
Quimiopreventiva
ENDRINGER et al., 2009, 2010
Folhas
Extrato
etanólico e fração
diclorometano
Antidiabético
PEREIRA et al., 2015
Látex
Látex
Anti-inflamatório
MARINHO et al.,
2011
Látex
Látex
Antifúngico
SILVA et al., 2011
Látex
Látex
Angiogênico
ALMEIDA et al.,
2014
32
No estudo de Silva et al. (2011) a fração acetato etila-metanol (1:1) do
extrato etanólico das folhas da mangabeira foi capaz de inibir a enzima
angiotensina I (ECA), levando a reduzir os níveis plasmáticos de angiotensina II
e aumentando os níveis de óxido nítrico (ON), consequentemente gerando um
efeito hipotensor. Ferreira et al. (2007a, 2007b) verificaram por Análise de
Cromatografia líquida de alta performance (CLAE) que o extrato etanólico das
folhas tinha como substância majoritária a rutina e que este flavonóide era o
responsável por promover o efeito vasodilatador em artérias mesentéricas de
ratos, não só pela produção de óxido nitríco, mas também pela ativação da via
fosfatidil-inositol 3-quinase (PI3K). Ainda sobre as folhas como farmacógenos
Endringer e colaboradores (2009, 2010) mostraram que o extrato etanólico e
fração acetato de etila:metanol (45:55) apresentavam uma atividade
quimiopreventiva por ter a capacidade de inibir o fator nuclear kappa B (NF-κB)
que está envolvido nos processos de proliferação, antiapoptose e
quimiorresistência de células neoplásicas. A função de quimioprevenção foi
atribuída ao sinergismo do L-(+)-bornesitol, ácido quínico e rutina. Outro estudo
realizado por Honda (1990) detectou a presença de esteróides, triterpenos e
taninos. Santos et al. (2007) detectou a presença de óleos voláteis
apresentando um teor variado de monoterpenos oxigenados e como
compostos majoritários o geraniol, α- terpenol e linalol. O estudo mais recente
da espécie demonstrou que o extrato etanólico e a fração diclorometano das
folhas são um potente anti-diabético, por ter a capacidade de inibir a enzima α-
glicosidase e aumentar a captação de glicose. No mesmo estudo foi
identificado no extrato etanólico a presença de bornesitol, ácido quínico, ácido
clorogênico e flavonoides glicosilados, enquanto que na fração diclorometano
foi detectado a presença de ésteres de lupeol e α e β-amirina (PEREIRA et al.,
2015).
No que diz respeito ao látex, Marinho e colaboradores (2011)
demonstraram a redução dos sinais inflamatórios através do bloqueio da via
das prostaglandinas E2 (PGE2), por reduzir a produção de citocinas pro-
inflamatórias no modelo de inflamação de bolsa de ar induzida por carragenina.
Esses dados corroboraram com o modelo de inflamação induzido por formalina
(segunda fase da inflamação), edema de pata induzido por carragenina, (todos
os intevalos de tempo) e contorções induzidas por ácido acético, demonstrando
33
que o látex de Hancornia speciosa pode ser uma terapia promissora ou
complementar no tratamento de desordens inflamatórias. No estudo realizado
por Santos et al. (2007) nas condições de análises e diante das linhagens
testadas (Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Neisseria
meningitidis, Streptococcus spp., Cryptococcus neoformans e Candida spp) o
látex da mangabeira não apresentou atividade antimicrobiana, entretanto no
estudo de Silva et al. (2011) mostraram um efeito do látex bastante significativo
contra o fungo Candida albicans. O látex também mostrou eficiência na
indução da angiogênese, favorecendo o processo de cicatrização, além de não
possuir atividade genotóxica e citotóxica (ALMEIDA et al., 2014). A Tabela 2
resume atividade biológica comprovada experimentalmente de Hancornia
speciosa.
No que diz respeito aos frutos foi realizado um estudo envolvendo
composição química, em que foram identificadas e quantificadas substâncias
voláteis em diferentes estágios de maturação (frutos verdes, médios e
maduros). Nos frutos verdes foram identificados 33 substâncias, sendo as
principais: monoterpenos oxigenados (linalol, α-terpineol e geraniol), ésteres,
cetonas, aldeidos e alcoois. Os frutos no seu estagio de maturação médio e
maduros apresentaram a mesma constituição, porém com proporções
diferentes (SAMPAIO; L. NOGUEIRA, 2006). A Tabela 2 resume atividade
biológica comprovada experimentalmente de Hancornia speciosa.
34
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito anti-inflamatório do extrato aquoso, frações e
compostos identificados dos frutos de Hancornia speciosa em modelos
experimentais de inflamação in vivo e in vitro.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar o estudo fitoquímico do extrato aquoso dos frutos de
Hancornia speciosa;
Avaliar o efeito do extrato aquoso, frações e compostos identificados
no extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa em modelo de peritonite
induzido por carragenina em camundongos albinos BALB/c;
Avaliar o efeito do extrato aquoso, frações e compostos identificados
no extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa na produção de citocinas
inflamatórias através do método de ELISA;
Avaliar o efeito do extrato aquoso e compostos identificados no extrato
aquoso dos frutos de Hancornia speciosa em modelo de edema de orelha
induzido por xilol em camundongos albinos BALB/c;
Avaliar o efeito do extrato aquoso e compostos identificados no extrato
aquoso dos frutos de Hancornia speciosa em modelo de bolsa de ar induzido
por zimosam em camundongos albinos Swiss;
Avaliar o efeito do extrato aquoso e compostos identificados nos frutos
de Hancornia speciosa na cinética de migração celular total e diferencial em
diferentes intervalos de tempo (6, 24 e 48 horas) partindo do modelo de bolsa
de ar induzido por zimosam em camundongos albinos Swiss.
35
4 JUSTIFICATIVA
A inflamação é uma resposta do sistema imune a diferentes estímulos
causados por agentes químicos, físicos ou biológicos e tem por função
erradicar os agentes microbianos ou irritantes, além de potencializar o reparo
tecidual (BAUTISTA, 2003). É mediada por eventos vasculares e celulares que
ocorrem graças à presença de diversos mediadores químicos inflamatórios. O
processo inflamatório termina quando o estímulo é eliminado e os mediadores
secretados são destruídos ou dispersos, além disso, nosso organismo possui
mecanismos anti-inflamatórios ativos que modulam a resposta e evitam que ela
seja exacerbada (GRUNDY, 2003). Porém, quando a inflamação não é
controlada e passa a ser excessiva é necessário o uso de substâncias que
possuam ação anti-inflamatória e atuam na recuperação da homeostasia
corpórea.
Para inibir ou controlar o processo inflamatório, medicamentos anti-
inflamatórios não esteroidais (AINEs) e anti-inflamatórios esteroidais (AIEs) são
comumente utilizados. Entretanto, o uso prolongado ou abusivo de AINEs pode
causar sérios efeitos adversos, tais como complicações cardiovasculares e
gastrointestinais (SOSTRES et al., 2010), enquanto que os AIEs podem induzir
a redução da resistência à infecção, agravamento de úlceras estomacais e
osteoporose (WHITEHOUSE, 2011).
Tendo em vista que, em determinadas patologias ou condições clínicas
do paciente, os anti-inflamatórios não apresentam vantagens quanto ao
tratamento, uma vez que os efeitos adversos podem sobrepor o efeito
terapêutico se faz necessário à busca de novas alternativas terapêuticas para o
tratamento de desordens inflamatórias. As plantas medicinais são uma ótima
alternativa, uma vez que dispõem de um arsenal de moléculas bioativas que
podem ser usadas na terapia anti-inflamatória, além de que são encontradas
em abundância e representam uma fonte natural de fácil acesso a população
com um custo relativamente baixo (CALIXTO, 2005).
No nosso bioma, a Hancornia speciosa Gomes merece destaque,
conhecida popularmente como mangabeira, trata-se de uma planta frutífera
bastante utilizada na medicina popular para o controle de desordens
inflamatórias. Existem estudos que comprovem o efeito anti-inflamatório da
36
espécie, realizado por Marinho et al. (2011), utilizando o látex como
farmacógenos, porém nada existe descrito sobre o possível efeito biológico que
os frutos podem exercer. Assim, o estudo propõe, de modo inédito, comprovar
o uso popular dos frutos de Hancornia speciosa, identificando os principais
metabólitos secundários envolvidos no processo anti-inflamatório e dar suporte
a uma possível droga herbal que pode vir ser utilizado no tratamento de
desordens inflamatórias.
37
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Material vegetal
Os frutos maduros da Hanconia speciosa foram coletados na região de
Barra do Punaú (lat: -5,34527 long: -35,41666), cidade de Rio do Fogo, Rio
Grande do Norte, nordeste brasileiro em março de 2011. A coleta foi realizada
mediante autorização do Sistema de Autorização e Informação em
Biodiversidade (Sisbio) (número 35017) e Autorização de Acesso e de
Remessa de Componente do Patrimônio Genético (Processo 010844/2013-9).
A exsicata contendo folhas, flores e frutos de H. speciosa foi depositada no
Herbário Parque das Dunas do Centro de Biociências da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, Brasil, sob o número de registro UFRN 16880.
5.2 Preparação do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa
Os frutos da ‘mangabeira’ (500 g) foram cortados em pedaços
menores e submetidos à extração por decocção. O material vegetal foi deixado
em água fervente por 15 minutos, na proporção de 1: 10 (fruto : água m/v).
Após 15 minutos, o decocto foi filtrado utilizando um papel filtro Whatman N° 1.
Parte do decocto foi utilizado para as análises fitoquímicas e a outra parte foi
liofilizado para o fracionamento por meio de partição líquido-líquido e
experimentos in vivo e in vitro.
Para o processo de liofilização o decocto foi congelado a -80 °C e em
seguida submetido ao liofilizador da marca Liotop, modelo L 202.
5.3 Fracionamento do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa
O extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa (EA), 500 mL, foi
submetido a um fracionamento por meio de partição líquido-líquido utilizando
solventes de polaridades crescentes: diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila
38
(AcOEt) e n-butanol (n-BuOH). A partir do fracionamento foram obtidas as
frações diclorometano (FR1), acetato de etila (FR2) e n-butanol (FR3) (Figura
4). As frações foram secas em um evaporador rotatório e estocadas em
geladeira até o momento do uso. Para os experimentos in vivo as frações
foram ressuspendidas em PBS.
Figura 4 - Esquema representativo do processo de fracionamento por meio de partição
líquido-líquido do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa.
Fonte: Autoria própria
5.4 Análises fitoquímicas do extrato aquoso de Hancornia speciosa
5.4.1 Triagem fitoquímica
Para evidenciar as principais classes de substâncias químicas
presentes no extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, o decocto foi submetido
a testes qualitativos que se baseiam em reações químicas que resultam na
formação de precipitados ou formas, desenvolvimento ou mudança de
coloração (MATOS, 2009; ZUCOLOTTO; VARGAS, 2010). Foram pesquisados
39
a presença de taninos, alcaloides, saponinas, compostos fenólicos e
flavonóides.
5.4.1.1 Pesquisa de Taninos – Reação de precipitação em
gelatina
Para a detecção de taninos 2 mL do extrato aquoso dos frutos de H.
speciosa foram colocados em um tubo de ensaio e sobre a amostra gotejada
uma solução aquosa de gelatina a 2,5%. A formação de precipitado reversível
ou irreversível confirma a presença de taninos no extrato (ZUCOLOTTO;
GIORDANI, 2013).
5.4.1.2 Pesquisa de Alcalóides – Reação de precipitação em
reagente de Dragendorff, Mayer, Wagner e Bertrand
Para a detecção de alcalóides 2 ml do extrato aquoso dos frutos de H.
speciosa foram colocados em um béquer e adicionado 20 mL de ácido sulfúrico
(H2SO4) à 10%. A amostra foi aquecida e deixada sob fervura por 5 minutos,
em seguida filtrada. Em uma placa de vidro 2 gotas da amostra foi colocada em
contato com reagentes, entre eles: reagente de Dragendorff, Wagner, Mayer e
Bertrand. A formação de um precipitado amarelo-alaranjado (reagente de
Dragendorff) ou marrom escuro (reagente de Wagner) ou branco leitoso
(reagente de Mayer) ou branco amarelado (reagente de Bertrand) indica a
presença de alcalóides no extrato (ZUCOLOTTO; GIORDANI, 2013).
5.4.1.3 Pesquisa de Saponinas – Reação de formação de
espuma
Para a detecção de saponinas 2 mL do extrato aquoso dos frutos de H.
speciosa foram colocados em um tubo de ensaio grande e sobre a amostra
acrescentada 4 mL de água destilada. O tubo foi agitado verticalmente e
40
vigorosamente por 1 minuto. A formação de espuma persistente confirma a
presença de saponinas no extrato, porém o desaparecimento da espuma em
poucos instantes torna a amostra ausente (ZUCOLOTTO; GIORDANI, 2013).
5.4.1.4 Pesquisa de Compostos fenólicos – Reação com cloreto
férrico
Para detecção de compostos fenólicos 2 mL do extrato aquoso dos
frutos de H. speciosa foram colocados em um tubo de ensaio e sobre a
amostra adicionado 2 gotas de solução etanólica de cloreto férrico a 2,5%. A
formação de coloração verde-escuro, violeta e azul positiva a amostra quanto a
presença de compostos fenólicos (ZUCOLOTTO; GIORDANI, 2013).
5.4.1.5 Pesquisa de Flavonóides – Reação de Cianidina ou
Shinoda
Para detecção de flavonóides 2 mL do extrato aquoso dos frutos de H.
speciosa foram colocados em uma cápsula de porcelana e levada ao banho-
maria a 50 °C para retirar toda água. Posteriormente foram adicionados 0,2 mL
de clorofórmio no resíduo da cápsula, em seguida o clorofórmio foi desprezado
e o resíduo da capsula redissolvido com 1 mL de etanol a 70%. A amostra foi
transferida para um tubo de ensaio e sobre ela adicionada, pelas paredes do
tudo, 1 mL de ácido clorídrico (HCl) concentrado e 200 mg de magnésio em pó.
A formação de coloração amarela a vermelho, ou vermelho a vermelho-sangue,
ou vermelho a violeta ou vermelho a rosa confirma a presença de flavonóides
no extrato (ZUCOLOTTO; GIORDANI, 2013).
5.4.2 Cromatografia em camada delgada (CCD)
O extrato aquoso e frações foram analisados por Cromatografia em
camada delgada de fase normal usando as seguintes condições:
41
cromatoplacas de alumínio em gel de sílica com indicador de fluorescência (F-
254) (Macherey-Nagel ®) como adsorvente, e acetato de etila : ácido fórmico :
ácido acético : água (8,0 : 0,5 : 0,5 : 0,5 v:v:v:v) como fase móvel. As
cromatoplacas foram secas e as manchas foram observadas na luz ultravioleta
(UV) no comprimento de onda de 254 e 365 nm. Em seguida as placas foram
reveladas com agentes cromogênicos: vanilina sulfúrica (vanilina 2 % e ácido
sulfúrico 10 % em etanol) seguida de aquecimento; cloreto férrico (5 % em
metanol) e reagente Natural A (1 % em metanol) com visualização na luz UV
365 nm. Os valores do fator de retenção (Rf), cor e comportamento das
manchas foram analisados e registrados para serem comparados com dados
da literatura (WAGNER; BLADT, 2001). Subsequentemente, co-cromatografias
em camada delgada (co-CCDs) foram realizadas utilizando diferentes padrões,
tais como: ácido clorogênico (Sigma 95%), ácido caféico (Sigma 98%), rutina
(Sigma 94%), quercetina (Sigma 95%), canferol (Sigma 97%), ácido elágico
(Sigma 95%), isoquercetina (Sigma 90%), vitexina (Fluka 98%). Após a
identificação dos possíveis metabolitos secundários, eles foram confirmados
qualitativamente por Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada arranjo
diodo (CLAE-DAD) e Cromatrografia líquida com arranjos diodos acoplados
espectrofotômetro de massa (CL-DAD-EM).
5.4.3 Cromatografia líquida de alta eficiência acoplado ao detector
de arranjo de diodo (CLAE- DAD)
As amostras do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa e soluções
padrão de referência foram solubilizadas em metanol e água na proporção de
1:1, obtendo uma solução final na concentração de 5 mg/ml e 50 μg/mL,
respectivamente. Todas as amostras foram filtradas através de uma membrana
de 0,45 μm (MILEX®) e uma alíquota de 20 μL foi injetada para analise por
CLAE. A identificação dos principais compostos presentes no extrato aquoso
foi realizada por Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) utilizando um
cromatógrafo Varian® equipado com bomba quaternária (ProStar-240), injetor
automático (ProStar-410) e detector de arranjo de diodos (DAD) (ProStar-335).
42
Todos os dados foram processados utilizando o software GalaxieTM
Chromatography. O método cromatográfico foi realizado utilizando uma coluna
de fase reversa (Phenomenex®) C18 (250 x 4.6 mm x 5μm). A fase móvel
composta de acetonitrila (A) e ácido acético 1% (B) foi usada com o seguinte
gradiente: 0-5 minutos 13: 87% (A) em (B), 5-25 minutos 18: 82% (A) em (B),
25-30 minutos 20: 80% (A) em (B) e 30-35 minutos 21: 79% (A) em (B), com
uma taxa de fluxo de 1,0 mL/minuto e comprimento de onda UV de 270 e 340
nm. Todos os solventes utilizados para análise foram filtrados em membranas
de 0,45 μm e desgaseificados por meio de ultrassom. Os picos foram
identificados por comparação com tempo de retenção (TR) dos padrões de
referência, com espectros de UV e por co-injeção (padrões de referência +
extrato aquoso). Os padrões de rutina e ácido clorogênico foram obtidos da
Sigma-Aldrich®, USA.
5.4.4 Cromatografia líquida acoplada com detector de arranjos de
diodo e ao espectrômetro de massas (CL-DAD-EM)
Análises de alta resolução por Cromatografia líquida acoplada com
detector de arranjo de diodo e ao espectrômetro de massa (CL-DAD-EM) foi
realizada em um aparelho Shimadzu LC-20AD, equipado com injetor
automático (SIL-20A, Shimadzu), um detector de diodos (SPD-M20AV,
Shimadzu) e acoplado a um micrOTOFII (Bruker Daltonics) ESI -qTOF
espectrômetro de massa. Baixa resolução aplicada no mesmo aparelho HPLC
acoplado a amaZon (Bruker Daltonics) ESI-ion trap espectrômetro de massa.
Para análise cromatográfica utilizou uma coluna cromatográfica
analítica de fase reversa (Phenomenex®) C18 (250 x 4.6 mm x 5μm). A fase
móvel composta de acetonitrila (A) e ácido acético 1% (B) foi usada com o
seguinte gradiente de eluição: 0-5 minutos 13:87% (A) em (B), 5-25 minutos
18:82% (A) em (B), 25-30 minutos 20: 80% (A) em (B) e 30-35 minutos 21: 79%
(A) em (B), com uma taxa de fluxo de 1,0 mL/minuto. O eluente da coluna foi
dividido na proporção de 7:3, o fluxo maior foi para o detector DAD e a inferior
para o espectrômetro de massa.
43
5.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória do extrato aquoso dos frutos
de Hancornia speciosa, rutina e ácido clorogênico.
5.5.1 Animais de experimentação
Camundongos Swiss e BALB/c machos e fêmeas, com 6 a 8 semanas
de vida, pesando entre 25 a 35 gramas, provenientes do Biotério do Centro de
Ciências da Saúde (CSS) da UFRN, foram utilizados para os estudos. Os
animais foram mantidos, de 5-6 por gaiola, a uma temperatura de 22 + 2 °C,
em um ciclo claro/escuro (12:12 horas), com livre acesso a água e comida.
Cada grupo experimental era constituído de 5 animais (n= 5) e o grupo salina
(controle negativo) recebeu apenas solução salina estéril (0,9 mg/mL). O
protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética em
Experimentação Animal da Universidade Federal do Rio Grande do Norte sob o
protocolo Nº 008/2011 e está em conformidade com as diretrizes do Conselho
Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).
5.5.2 Modelo de peritonite induzido por carragenina
A atividade biológica do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa,
bem como da rutina e ácido clorogênico foi avaliada através do modelo de
peritonite induzido por carragenina em camundongos albinos BALB/c. Os
animais foram divididos em grupos e tratados por via intravenosa (i.v.) com 100
μL de solução salina estéril (0,9 mg/mL), extrato aquoso (20, 30 ou 40 mg/kg),
rutina (2, 2,5, 5 mg/kg) e ácido clorogênico (2, 2,5, 5 mg/kg), enquanto que a
dexametasona na dose de 0,5 mg/kg, medicamento anti-inflamatório de
referência, foi aplicado via intraperitoneal (i.p.). Após 30 minutos, os animais
foram desafiados por via intraperitoneal com um 1 mL de solução de
carragenina (1 mg/mL) ou 1 mL de solução salina estéril (grupo Sal). O grupo
carragenina (controle positivo) foi tratado com solução salina estéril (i.v.) e foi
desafiado com a carragenina. Passadas 4 horas, os animais foram
eutanasiados por via intraperitoneal com overdose de xilazina e cetamina (10
44
mg/kg - 100 mg/kg), realizado o deslocamento cervical e o exsudato peritoneal
foi coletado, com 2 mL de solução salina estéril (0,9 mg/mL). As amostras
foram centrifugadas numa rotação de 1500 rpm por 10 minutos a 4° C. O
sobrenadante foi coletado para determinar os níveis de citocinas inflamatórias
IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α, estes foram estocados no freezer – 80°C até o
momento do uso, enquanto que o pellet celular foi utilizado para contagem total
de leucócitos. A contagem celular foi determinada em câmara de Neubauer,
diluindo a amostra na solução de Turk, para isso foram utilizados 10 µL do
pellet celular em 90 μL de solução de Turk. Os resultados foram expressos
como número total de leucócitos (106/mL) (CUNHA et al., 1989; MAGALHÃES
et al., 2011).
5.5.2.1 Dosagem de citocinas inflamatórias IL-1β, IL-6, IL-12 e
TNF-α do lavado peritoneal
Os sobrenadantes dos exsudatos peritoneais coletados no modelo de
peritonite induzido por carragenina foram usados para mensurar os níveis de
IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α. As análises foram realizadas através do ensaio de
imunoabsorbância ligada à enzima (ELISA), utilizado o kit Ebioscience (San
Diego, CA, USA). As placas foram previamente sensibilizadas com 4 mg/mL do
anticorpo de captura específico para cada uma das citocinas. Para isto, 50
μL/poço de anticorpo monoclonal de captura (1: 250 anticorpo/diluente) foi
adicionados as placas, posteriormente as placas foram incubadas overnight a 4
°C. No dia seguinte as placas foram lavadas 5 vezes com PBS-0,05% de
Tween 20, retirado o excesso de solução de lavagem e adicionados 200
μL/poço da solução de bloqueio, as placas foram seladas e deixadas em
temperatura ambiente por 1 hora. A solução de bloqueio foi preparada diluindo
o diluente em água destilada (1:5). Após 1 hora as placas foram lavadas 5
vezes com PBS-0,05% de Tween 20, retirado o excesso de solução de
lavagem, adicionado 50 μL/poço da curva padrão e das amostras (ambos em
duplicata) e em seguida seladas e deixadas em temperatura ambiente por 2
horas. Para preparar a curva padrão, cada citocina recombinante foi preparada
45
na concentração de 500 pg/mL (2µL da citocina recombinante em 4 mL
diluente), essa concentração foi o segundo ponto da curva. Partindo da
primeira diluição foram realizadas diluições de base 2 para os demais pontos
(250; 125; 62,5; 31,25; 15,62; 7,81; 3,90; 1,95; 0,97 e 0,48 pg/mL). O primeiro
ponto da curva foi o branco e a ele foi adicionado 50 μL/poço de diluente. É
importante deixar as primeiras filas de cada placa (fila A e B) para a curva
padrão. Após 2 horas as placas foram lavadas 5 vezes com PBS-0,05% de
Tween 20, retirado o excesso de solução de lavagem e adicionado o 4 mg/mL
do anticorpo secundário ou de detecção (biotinalado) para cada citocina. Para
isto, 50 μL/poço de anticorpo monoclonal de captura (1: 250) foi adicionados às
placas, posteriormente as placas foram seladas e incubadas a temperatura
ambiente por 1 hora. Após 1 horas as placas foram lavadas 5 vezes com PBS-
0,05% de Tween 20, retirado o excesso de solução de lavagem e adicionado 4
mg/mL avidina conjugada a peroxidase. Para isto, 50 μL/poço avidina
conjugada a peroxidase (1: 250) foi adicionadas as placas, em seguida seladas
e incubadas a temperatura ambiente por 30 minutos. Após os 30 minutos as
placas foram lavadas 7 vezes com PBS-0,05% de Tween 20, retirado o
excesso de solução de lavagem e adicionado 4 mg/mL do substrato
tetrametilbenzidina (TMB). Para isto, 50 μL/poço do substrato
tetrametilbenzidina (1: 250) foi adicionados as placas, depois foram seladas e
incubadas a temperatura ambiente por 15 minutos e foi acompanhado o
aparecimento de cor. Por fim, foram adicionados 50 μL/poço de uma solução
H2SO4 a 1N e as placas lidas numa leitora de microplacas (Epoch Biotek) em
um comprimento de onda de 450 nm. Os valores das absorbâncias foram
convertidos em pg/mL utilizando uma equação polinomial gerada a partir da
curva padrão construída com diferentes concentrações de citocinas
recombinantes, através do software estatístico GraphPad versão 3.0.
5.5.3 Modelo de edema de orelha induzido por xilol
O efeito do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa e compostos
rutina e ácido clorogênico na inflamação aguda tópica em camundongos
albinos BALB/c foi avaliada de acordo com procedimentos previamente
46
descritos por Parveen et al. (2007). Os animais foram tratados por via
intraperitoneal com 100 µL de solução salina estéril (0,9 mg/mL),
dexametasona (0,5 mg/kg), extrato aquoso (40, 50 ou 60 mg/kg), rutina (2,5, 5
ou 10 mg/kg) ou ácido clorogênico (10, 12,5 ou 15 mg/kg). Após 30 minutos do
tratamento, o edema de orelha foi induzido com 20 µL de xilol na superfície
anterior e 20 µL de xilol na superfície posterior da orelha direita. A orelha
esquerda foi usada como controle e aplicada apenas solução salina estéril (0,9
mg/mL). Após 15 minutos da aplicação do xilol, os animais foram eutanasiados
com overdose de xilazina e cetamina (10mg/kg – 100 mg/kg), realizado o
descolamento cervical e ambas orelhas cortadas com secções de 7 mm
usando punch de biopsia, em seguida pesadas. A resposta edematogênica foi
mensurada através da diferença entre o peso da orelha direita e esquerda e o
nível de inibição (em percentagem) foi calculado de acordo com a seguinte
equação.
Inibição de edema (%) = 1 – [ Mdt – Met ] / [ nMdt – nMet] x 100, sendo
- Mdt: Média aritmética do peso das orelhas direitas dos animais tratados com
dexametasona ou extrato aquoso ou rutina ou ácido clorogênico.
- Met: Média aritmética do peso das orelhas esquerdas dos animais tratados
com dexametasona ou extrato aquoso ou rutina ou ácido clorogênico.
- nMdt: Média aritmética do peso das orelhas direitas dos animais não tratados.
- nMet: Média aritmética do peso das orelhas esquerdas dos animais não
tratados.
5.5.4 Modelo de bolsa de ar induzido por zimosam
O extrato aquoso dos frutos de H. speciosa e compostos rutina e ácido
clorogênico foram avaliados em modelo de bolsa de ar induzido por zimosam
47
em camundongos albinos Swiss. Todos os grupos receberam 5 mL de ar estéril
no dorso pela via subcutânea, para a formação da bolsa, após 3 dias 2,5 mL de
ar estéril foi injetado no mesmo local para reforço da bolsa de ar. O ar estéril foi
coleta no fluxo laminar em condições assépticas. Seis dias após a formação da
bolsa inicial, os animais foram tratados por via intraperitoneal com 100 µL de
solução salina estéril (0,9 mg/mL), dexametasona (2,0 mg/kg), extrato aquoso
(40, 50 ou 60 mg/kg), rutina (2,5, 5 ou 10 mg/kg) ou ácido clorogênico (10, 12,5
ou 15 mg/kg). Após 30 minutos uma solução de zimosam (1 mg/mL) foi injetada
dentro da bolsa de ar. O grupo zimosam foi tratado com solução salina estéril
(i.v.) e foi desafiado com a zimosam. Passadas 6 horas, os animais foram
eutanasiados por via intraperitoneal com overdose de xilazina e cetamina (10
mg/kg - 100 mg/kg), realizado o deslocamento cervical e o exsudato da bolsa
foi coletado, por aspiração, com 2 mL de solução salina estéril (0,9 mg/mL). As
amostras foram centrifugadas numa rotação de 1500 rpm por 10 minutos a 4°
C. O pellet celular foi utilizado para contagem total de leucócitos utilizando
câmara de Neubauer, diluindo a amostra na solução de Turk. Para isso foram
utilizados 10 µL do pellet celular em 90 μL de solução de Turk (Vigil et al.,
2008; Yoon et al., 2005). Os resultados foram expressos como número total de
leucócitos (106/mL).
5.5.4.1 Cinética de migração leucocitária total e diferencial a
partir do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam
Para realizar o experimento de cinética de migração leucocitária total e
diferencial, a dose de 50mg/kg do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, 2,5
mg/kg de rutina e 10mg/kg do ácido clorogênico foram escolhidas. Os animais
foram tratados conforme descrito (metodologia 5.5.4) e o exsudato da bolsa de
ar colhido em diferentes intervalos de tempo (6, 24 e 48 horas) após o desafio
com zimosam. O pellet celular foi utilizado tanto para contagem total de
leucócitos como para a contagem diferencial. Para contagem diferencial, a
amostra foi diluída em 500 μL de PBS, em seguida as lâminas foram
preparadas por citocentrifugação a partir de uma alíquota (20 μL) do pellet
48
celular e coradas com corante panótico rápido (LaborClin; Brasil). As análises
das lâminas foram realizadas em microscópio óptico através da objetiva de
imersão em óleo (aumento de 100x) e foram contadas 100 células
diferenciando-as em subpopulações celulares: mononucleares e
polimorfonucleares (SILVA, 2011).
5.6 Análise estatística
Os dados foram expressos com médias + devios padrão. As análises
estatiticas foram realizadas por Anova seguidas por teste de Tukey utilizando o
software estatístico GraphPad Prism® versão 5.00, onde os níveis de
significância foram estabelecidos como *** ou ###p<0,001,** ou ##p<0,01 e * ou
#p<0,05. Para análises de regressão linear foi utilizado o software estatístico
GraphPad versão 3.00.
49
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Análise Fitoquímica do extrato aquoso dos frutos de Hancornia
speciosa
6.1.1 Triagem fitoquímica e Cromatografia em camada delgada
(CCD)
Na triagem fitoquímica foi revelado à presença de taninos, alcalóides,
saponinas, flavonóides e ácidos fenólicos nos frutos de H. speciosa. A Tabela 3
apresenta as principais classes de metabólitos secundários encontrados com
seus respectivos métodos químicos.
Tabela 3 - Principais metabólitos encontrados no extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa e seus respectivos métodos químicos de identificação.
Metabólitos
secundários
Métodos Químicos Hancornia
speciosa
Taninos Reação de precipitação em gelatina Positivo
Alcalóides
Reação de precipitação em reagente
de Dragendorff, Mayer, Wagner e
Bertrand
Positivo
Saponinas Reação de formação de espuma Positivo
Compostos
fenólicos
Reação com cloreto férrico Positivo
Flavonóides Reação de Cianidina ou Shinoda Positivo
O extrato aquoso dos frutos de H. speciosa foi submetido a um
fracionamento por meio de partição líquido-líquido, utilizando solventes de
polaridade crescente: diclorometano (FR1), acetato de etila (FR2) e n-butanol
(FR3). As frações foram submetidas evaporador rotativo sob pressão reduzida
para retirar os solventes. Com as frações foram realizadas as análises
fitoquímicas e avaliação da atividade biológica.
Na tentativa de identificar os possíveis metabolitos sugeridos pelos
métodos químicos, o extrato aquoso e frações diclorometano, acetato de etila e
n-butanol foram submetidas à análise por Cromatografia em camada delgada.
50
A análise por Cromatografia em camada delgada foi realizada
utilizando diferentes reagentes reveladores, entres eles: vanilina sulfúrica
(vanilina 2% e ácido sulfúrico 10 % em etanol) seguida de aquecimento; cloreto
férrico (5 % em metanol) e reagente Natural A (1 % em metanol) com
visualização na luz UV 365 nm.
Quando a cromatoplaca foi revelada com vanilina sulfúrica após o
aquecimento, reagente universal de compostos orgânicos, foi possível
identificar no extrato aquoso três bandas de cor amarela cada uma com o fator
de renteção (Rf) de 0,08, 0,16 e 0,36, e uma banda de cor cinza com Rf de
0,68. As frações AcOEt e n-BuOH apresentaram o mesmo comportamento de
manchas, coloração e fator de retenção (Figura 5A). Outra cromatoplaca foi
revelada com cloreto férrico, reagente específico para compostos fenólicos, e
observou-se o desenvolvimento de 2 bandas de cor amarela no extrato aquoso
com Rf de 0,16 e 0,22, as mesmas bandas foram observadas nas frações
AcOEt e n-BuOH. A fração AcOEt também apresentou duas bandas de cor
cinza com Rf de 0,36 e 0,46 (Figura 5B). Estes resultados sugerem que as
bandas amarela correspondem principalmente a flavonoides e as manchas
cinza a ácidos fenólicos. Para confirmar a presença destes compostos, uma
cromatoplaca foi revelada com Reagente Natural A (Figura 5C), reagente
específico para identificação de flavonóides. Foi possível detectar no extrato
aquoso a presença de uma banda laranja (Rf= 0,16) e uma azul fluorescente
(Rf=0,36), quando observada a cromatoplacas no UV em 365 nm (figura 5D).
Estes resultados caracterizam a possível presença de flavonoides e ácidos
fenólicos (Wagner and Bladt, 1996).
Subsequentemente, uma co-cromatografia em camada delgada (co-
CCDs) foi realizada no intuito de identificar o possível flavonóide e o ácido
fenólico identificados no extrato aquoso através das CCDs. Para isso,
diferentes padrões disponíveis no laboratório foram testados juntamente com o
extrato e frações, tais como: ácido clorogênico, ácido caféico, rutina,
quercetina, canferol, ácido elágico isoquercetina, vitexina, luteolina, iso-
orientina e orientina. Através da comparação de amostras comerciais de rutina
e ácido clorogênico com o extrato aquoso e frações, é possível que a banda de
cor laranja seja rutina (Rf= 0,16) e a banda de cor azul fluorescente, quando
observada na luz UV 365 nm seja ácido clorogênico (Rf= 0,36). A similaridade
51
nos Rf, o mesmo comportamento de mancha e coloração sugere que no
extrato aquoso é possível existir a presença de rutina e ácido clorogênico
(Figura 6). Para confirmar a presença uma análise qualitativa utilizando
cromatografia liquida de alta eficiência acoplada tanto ao arranjo diodo, como
ao espectrofotômetro de massa foi realizada.
Figura 5 - Cromatogramas obtidos por Cromatografia em Camada Delgada do extrato
aquoso e frações dos frutos de Hancornia speciosa
Fase móvel: acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético: água (8:0,5:0,5:0,5, v/v/v/v).
Adsorvente: cromatoplacas em gel de sílica F254. Amostras: Extrato aquoso (EA), fração
diclorometano (CH2Cl2), fração acetato de etila (AcOEt) e fração n-butanol (BuOH) Detecção:
(A) Vanilina sulfúrica com aquecimento, (B) Cloreto férrico, (C) Reagente Natural A e (D)
Reagente Natural A sob luz UV 365 nm.
Fonte: Dados obtidos e analisados
A B
C D
EA EA
EA EA
CH2Cl2 CH2Cl2
CH2Cl2 CH2Cl2 AcOEt
AcOEt AcOEt
AcOEt Bu-OH Bu-OH
Bu-OH Bu-OH
52
Figura 6 - Cromatogramas obtidos por co-Cromatografia em Camada Delgada do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia speciosa com
padrões
Fase móvel: acetato de etila: ácido fórmico: ácido acético: água (8:0,5:0,5:0,5, v/v/v/v). Adsorvente: cromatoplacas em gel de sílica F254. Amostras: rutina (Rt),
ácido clorogênico (AC),extrato aquoso (EA), extrato aquoso e rutina (EA+Rt), extrato aquoso e ácido clorogênico (EA+AC), fração CH2Cl2 (FR1), fração
CH2Cl2 e rutina (FR1+Rt), fração CH2Cl2 e ácido clorogênico (FR1+AC), fração AcOEt (FR2), fração AcOEt e rutina (FR2+Rt), fração AcOEt e ácido
clorogênico (FR2+AC), fração BuOH (FR3), fração BuOH e rutina (FR3+Rt) e fração BuOH e ácido clorogênico (FR3+AC). Detecção: (A) Reagente Natural A
e (B) Reagente Natural A sob luz UV 365 nm.
Fonte: Dados obtidos e analisados
Rt AC EA EA+Rt EA+AC FR1 FR1+Rt FR1+AC FR2 FR2+Rt FR2+AC FR3 FR3+Rt FR3+AC
Rt AC EA EA+Rt EA+AC FR1 FR1+Rt FR1+AC FR2 FR2+Rt FR2+AC FR3 FR3+Rt FR3+AC
A
B
53
6.1.2 CLAE-DAD e LC-DAD-EM confirmam a presença de rutina e
ácido clorogênico no extrato aquoso dos frutos Hancornia speciosa
A análise qualitativa do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa por
CLAE mostrou a presença de três picos majoritários em 340 nm, nomeado pico
1 com tempo de retenção (RT) de 7,9 minutos, pico 2 com 25,5 minutos e pico
3 com 28,5 minutos (Figura 7). Para confirmar a presença de rutina e ácido
clorogênico observada por CCD, as soluções padrões dos compostos foram
analisados por CLAE-DAD e mostrou tempo de retenção de 7,9 e 25,5,
minutos. Os picos 1 e 2 apresentaram tempo de retenção similar ao ácido
clorogênico e rutina (RT= 7,91 e RT= 25,5, respectivamente). Além disso, foi
realizado a análise do espectro UV dos picos 1 e 2 que apresentaram absorção
máxima de 222 e 326 nm (pico 1) e 257 e 353 nm (pico 2) similar ao espectro
do ácido clorogênico e rutina (MABRY, 1970). Análise de co-injeção dos
padrões + extrato aquoso foi observado um aumento na área do pico,
provavelmente referente a presença destes compostos no extrato aquoso dos
frutos de H. speciosa. O pico 3 não foi identificado, mas pelo espectro UV é
possível sugerir a presença de um ácido fenólico (223 e 332 nm).
A análise LC-DAD-EM foi realizada no intuito de determinar a massa
molar dos flavonoides e ácidos fenólico que estavam sendo investigados, além
de confirmar as identificações sugeridas pelo CLAE-DAD. Para isto, modos de
íon positivo e negativo foram usados na análise por espectrometria de massas
com ionização “electrospray” (ESI-MS), onde os espectros dos compostos
obtidos ESI-MS foram comparados com a base de dados MassBank
(http://www.massbank.jp).
O pico 1 mostrou tempo de retenção de 7,9 minutos, absorção máxima
no UV de 222 e 326 nm e relação massa carga (m/z)(int.) [M+H]+ m/z de
355,1035. A molécula foi identificada como ácido clorogênico, comparando com
a molécula protonada (calculou 355.1029, error 1,6 ppm). Além disso, a
molécula protonada apresentou íons padrão de fragmentação [M+H-
192]+ de m/z 163, ao qual foi atribuído a uma perda da porção do ácido quínico.
O pico 2 mostrou tempo de retenção de 25,5 minutos, absorção
máxima no UV de 257 e 353 nm e relação massa carga (m/z)(int.)
[M+H]+ m/z de 611,160 (molécula protonada) e fragmentos de 465 e 303. A
54
molécula foi identificada como rutina e a massa exata foi calculada como
611,1607, (massa teórica exata: 611,1612, error 0,8 ppm). O fragmento
apresentou um íon [M+H-146]+ de m/z 465, a qual foi atribuído a perda da
porção da ramnose e aglicona protonada [M+H-146-162]+, com a perda de
308u correspondendo a ramnose (146 u) e uma porção da glicose (162 u).
Figura 7 - Cromatograma obtido por CLAE do extrato aquoso dos frutos de Hancornia
speciosa e seus respectivos espectros de UV gerados pelo detector DAD.
A análise por CLAE acoplado arranjo de diodo (CLAE-DAD) do extrato aquoso dos frutos de
Hancornia speciosa mostrou a presença de três picos principais, sendo o pico 1 representando
pelo ácido clorogênico com tempo de retenção de 7,9 minutos (absorção de 222 a 326 nm),
pico 2 a rutina com tempo de retenção de 25,5 minutos (absorção de 257 a 353 nm) e de pico 3
um compostos fenólico não identificado com tempo de retenção de 28,5 minutos (absorção de
223 a 332 nm). A taxa de fluxo foi mantida constante a 1,0 ml/min, e os cromatogramas foram
analisados a 340 nm.
Fonte: Dados obtidos e analisados
A rutina é um flavonóide pertencente à subclasse dos flavonóis que
apresenta em sua estrutura um dissacarídeo (raminose + glicose) ligados a
posição 3 do anel pirano (Figura 8A) (PEDRIALI, 2005). Já o ácido clorogênico,
um ácido fenólico, formado pela esterificação do ácido caféico com ácido
55
quínico (Figura 8B) (ZHANG et al., 2010). Além do extrato aquoso dos frutos
possuir rutina e ácido clorogênico, o extrato etanólico e fração acetato de etila
das cascas apresentaram ácido clorogênico em sua constituição química
(COSTA et al., 2008; ANDRADE et al., 2002; HONDA, 2000) e nas cascas a
função hipotensora foi atribuída principalmente a presença de rutina presente
no extrato etanólico (FERREIRA, et al., 2007a; 2007b). Dentre os flavonóides e
ácidos fenólicos estudados, a rutina e o ácido clorogênico têm se destacado
em função das suas diversas atividades farmacológicas. Ambos possuem
atividade antioxidante, anti-inflamatória, hepatoprotetora e anticarcinogênica
(LIMA et al., 2014; XU et al., 2010; ZHANG et al., 2010).
Figura 8 - Estrutura química da rutina (A) e do ácido clorogênico (B)
Fonte: ChemSketch 10.0
6.2 Efeito do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia speciosa,
rutina e ácido clorogênico em modelo de peritonite induzido por
carragenina
A atividade bilógica do extrato aquoso e frações dos frutos de H.
speciosa, bem como da rutina e ácido clorogênico, foram avaliados através do
A
B
56
modelo de peritonite induzido por carragenina, onde foram analisados a
migração total de leucócitos e produção de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α.
No trabalho foi possível observar que os animais que foram tratados
por via intravenosa (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), trinta minutos
depois desafiados com carragenina intraperitoneal (i.p) exibiu uma severa
migração leucócitária para cavidade peritoneal, bem como aumentou a níveis
de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α. Porém todos os grupos que foram
tratados (i.v) com diferentes doses (20, 30 ou 40 mg/kg) do extrato aquoso dos
frutos de H. speciosa (Figura 9) mostraram redução da migração leucocitária
para cavidade intraperitoneal, como também foram capazes de reduzir os
níveis das citocinas IL-1β (Figura 10A), IL-6 (Figura 10B), IL-12 (Figura 10C) e
TNF-α (Figura 10D), quando comparado com o grupo que recebeu solução
salina estéril (i.v.) e carragenina (i.p.).
O extrato aquoso (EA), na dose de 40 mg/kg, foi administrado como
controle por via intravenosa (sem os animais receberem inflamação por
carragenina). Observou-se que o extrato apresentou efeito antimigratório para
cavidade peritôneal, tendo um resultado diferente estatisticamente ao grupo
que foi desafiado com carragenina, demonstrando que o extrato não tem a
capacidade de induzir infamação. A dexametasona (0,5 mg/kg), medicamento
anti-inflamatório de referência, foi utilizada como grupo controle e foi capaz de
reduzir tanto a migração leucocitária para cavidade peritoneal como a produção
de citocinas inflamatórias induzida pela carragenina.
57
Figura 9 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa na migração
leucocitária a partir do modelo de peritonite induzido por carragenina
Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), extrato
aquoso (20, 30 e 40 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois
foi administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Um grupo
recebeu apenas o extrato aquoso (EA) na dose de 40 mg/kg. Após 4 horas o exsudato
peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem
total de células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada coluna representa a
média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro padrão da
média (EPM). ###
p<0,001 e ##
p<0,01 comparando com o grupo solução salina estéril (Sal);
***p<0,001 comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex,
dexametasona (0,5 mg/kg), EA, extrato aquoso (40 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
58
Figura 10 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa sobre a produção
de citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de
camundongos submetidos à peritonite induzido por carragenina
Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), extrato
aquoso (20, 30 e 40 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois
foi administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4 horas o
exsudato peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril e centrifugado. Com o
sobrenadante foi quantificado a produção das citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α
(D) utilizando o ensaio de imunoabsorbância ligada à enzima (ELISA). Cada coluna representa
a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro padrão da
média (EPM). ###
p<0,001 comparando com o grupo solução salina estéril (Sal); ***p<0,001
comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex, dexametasona (0,5
mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
59
Posteriormente cada fração foi administrada por via intravenosa (i.v.)
na dose de 20 mg/kg (Figura 11) trinta minutos antes da administração da
carragenina. Os resultados demonstram que as três frações apresentaram
efeitos semelhantes na inibição da migração leucocitária, bem como foram
capazes de inibir a produção de citocinas IL-1β (Figura 12A), IL-6 (Figura 12B),
IL-12 (Figura 12C) e TNF-α (Figura 12D).
Figura 11 - Efeito das frações diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt) e n-
butanol (n-BuOH) de Hancornia speciosa na migração leucocitária a partir do modelo de
peritonite induzido por carragenina
Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), frações
diclorometano (FR1), acetato de etila (FR2) e n-butanol (FR3) na dose de 20 mg/kg ou
dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois foi administrado (i.p.) 1 mL de
carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4 horas o exsudato peritoneal foi
coletado com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem total de
células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada coluna representa a média dos
valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro padrão da média (EPM). ###
p<0,001, ##
p<0,01 e #p<0,05 comparando com o grupo solução salina estéril (Sal);
***p<0,001 comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex,
dexametasona (0,5 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
60
Figura 12 - Efeito das frações diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt) e n-
butanol (n-BuOH) de Hancornia speciosa sobre a produção de citocinas IL-1β (A), IL-6
(B), IL-12 (C) e TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de camundongos submetidos à
peritonite induzido por carragenina
Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), frações
diclorometano (FR1), acetato de etila (FR2) e n-butanol (FR3) na dose de 20 mg/kg ou
dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois foi administrado (i.p.) 1 mL de
carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4 horas o exsudato peritoneal foi
coletado com 2 mL de solução salina estéril e centrifugado. Com o sobrenadante foi
quantificado a produção das citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α (D) utilizando o
ensaio de imunoabsorbância ligada à enzima (ELISA). Cada coluna representa a média dos
valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro padrão da média (EPM). ###
p<0,001 comparando com o grupo solução salina estéril (Sal); ***p<0,001 comparando com
o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex, dexametasona (0,5 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
61
O passo seguinte foi avaliar o efeito da rutina e do ácido clorogênico
identificados por Cromatografia líquida de alta eficiência (DAD e DAD-EM),
ambos obtidos da Sigma. Observou-se que os grupos tratados com rutina
(Figura 13) e ácido clorogênico (Figura 15) por via intravenosa, nas doses de 2,
2,5 e 5 mg/kg exibiram uma inibição tanto na migração de células leucocitárias
como na produção de citocinas IL-1β (Figura 14A), IL-6 (Figura 14B), IL-12
(Figura 14C) e TNF-α (Figura 14D) para a rutina e IL-1β (Figura 16A), IL-6
(Figura 16B), IL-12 (Figura 16C) e TNF-α (Figura 16D) para o ácido
clorogênico.
Figura 13 - Efeito da rutina na migração leucocitária a partir do modelo de peritonite
induzido por carragenina
Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), rutina (2,
2,5 e 5 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois foi
administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4 horas o
exsudato peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a
contagem total de células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada coluna
representa a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro
padrão da média (EPM). ###
p<0,001, ##
p<0,01 e #p<0,05 comparando com o grupo solução
salina estéril (Sal); ***p<0,001, comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina
estéril; Dex, dexametasona (0,5 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
62
Figura 14 - Efeito da rutina sobre a produção de citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e
TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de camundongos submetidos à peritonite
induzido por carragenina
Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), rutina (2,
2,5 e 5 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos depois foi
administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4 horas o
exsudato peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril e centrifugado. Com o
sobrenadante foi quantificado a produção das citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e TNF-α
(D) utilizando o ensaio de imunoabsorbância ligada à enzima (ELISA). Cada coluna representa
a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro padrão da
média (EPM). ###
p<0,001 e ##
p<0,01 comparando com o grupo solução salina estéril (Sal);
***p<0,001 comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex,
dexametasona (0,5 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
63
Figura 15 - Efeito do ácido clorogênico na migração leucocitária a partir do modelo de
peritonite induzido por carragenina
Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), ácido
clorogênico (2, 2,5 e 5 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos
depois foi administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4,
o exsudato peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada
a contagem total de células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada coluna
representa a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro
padrão da média (EPM). ###
p<0,001 e ##
p<0,01 comparando com o grupo solução salina estéril
(Sal); ***p<0,001 comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex,
dexametasona (0,5 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
64
Figura 16 - Efeito do ácido clorogênico sobre a produção de citocinas IL-1β (A), IL-6 (B),
IL-12 (C) e TNF-α (D) a partir do exsudato peritoneal de camundongos submetidos à
peritonite induzido por carragenina
Camundongos BALB/c foram tratados (i.v.) com solução salina estéril (0,9 mg/mL), ácido
clorogênico (2, 2,5 e 5 mg/kg) ou dexametasona na dose de 0,5 mg/kg (i.p.), trinta minutos
depois foi administrado (i.p.) 1 mL de carragenina (1 mg/mL) ou solução salina estéril. Após 4
horas o exsudato peritoneal foi coletado com 2 mL de solução salina estéril e centrifugado.
Com o sobrenadante foi quantificado a produção das citocinas IL-1β (A), IL-6 (B), IL-12 (C) e
TNF-α (D) utilizando o ensaio de imunoabsorbância ligada à enzima (ELISA). Cada coluna
representa a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam o erro
padrão da média (EPM). ###
p<0,001 comparando com o grupo solução salina estéril (Sal);
***p<0,001 comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex,
dexametasona (0,5 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
65
A carragenina é um polissacarídeo de origem marinha que induz um
processo inflamatório agudo caracterizado por uma intensa liberação de
mediadores inflamatórios. Trata-se de um agente inflamatório que atua de
maneira trifásica. Na primeira fase (0 a 1,5 hora) ocorre a liberação de
histamina e serotonina, enquanto que na segunda fase (1,5 a 2,5 horas) ocorre
a liberação de cininas, o sinergismo destes mediadores induz um rápido
aumento da permeabilidade vascular seguido da formação de edema. Na
terceira fase (2,5 a 6 horas) ocorre a produção de prostaglandinas que são
responsáveis em manter a permeabilidade vascular e o edema formado
(HARADA et al., 1998; VINEGAR et al., 1969).
O aumento da permeabilidade vascular e produção de mediadores
inflamatórios resultam em um aumento gradual do extravasamento de líquido e
do número células leucocitárias que migram para cavidade peritoneal,
principalmente neutrófilos, que são capazes de produzir citocinas, associadas
com a imunopatologia da inflamação (SYAM et al., 2014), sendo as principais
as interleucina-1β (IL-1β), interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral α
(TNF- α) (AKIRA et al., 1990). Estas citocinas são responsáveis em modular a
resposta inflamatória, e quando produzidas em excesso podem induzir uma
instabilidade hemodinâmica ou distúrbios metabólicos, contribuindo com lesões
em órgão-alvo, podendo levar à insuficiência de múltiplos órgãos ou até mesmo
morte (LARCHE et al., 2006; ZHANG; JIANXIONG, 2007). Outra citocina que
merece atenção é a IL-12 que atua como imunoestimuladora de células NK
(GAZZINELLI et al., 1993).
A IL-1β é uma citocina produzida principalmente por monócitos e
macrófagos, induz inflamação sistêmica através da ativação da cicloxigenase-2
(COX-2) com a formação de prostaglandinas E2. Tem como atividades
biológicas primordiais a estimulação de células CD4 a secretar IL-2 e produzir
receptores para a IL-2, proliferar e ativar linfócitos B, neutrófilos,
monócitos/macrófagos, aumentando as atividades quimiotáticas e fagocitárias,
facilitando o processo de diapedese (DINARELLO, 1989). O TNF-α produzido
principalmente por monócitos, macrófagos e linfócitos-T, é um dos mediadores
mais potentes e precoces da resposta inflamatória. Juntos, a IL-1β e o TNF-α,
ativam IL-6 a síntese e liberação de proteínas de fase aguda pelos hepatócitos
durante estímulos dolorosos, como trauma, infecção e queimadura. Já a IL-12
66
desempenha um papel importante porque ativa as células NK e favorece a
diferenciação dos linfócitos T CD4 em TH1 (ações inflamatórias) durante a
resposta imunidade adaptativa (OLIVEIRA et al., 2011).
Nosso estudo demonstrou que o extrato aquoso e frações dos frutos de
H. speciosa, bem como rutina e ácido clorogênico exerceram efeito anti-
inflamatório em todas as doses testadas, sendo capazes de inibir a migração
leucocitária para cavidade peritoneal (Tabela 4), como a produção de citocinas
(IL-1β, IL-6, IL-12 e TNF-α) em modelo de peritonite induzido por carragenina
em camundongos. Os resultados apresentados nessa dissertação corroboram
com o estudo realizado por Marinho et al. (2011), em que foi possível observar
que o látex de Hancornia speciosa exerceu efeito anti-inflamatório por ter a
capacidade de inibir a formação de edema de pata induzido por carragenina,
histamina, serotonina e bradicinina, como também inibir a migração leucocitária
para bolsa de ar quando induzida por carragenina, além de inibir as enzimas
iNOS e COX-2, bem como as citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α,
moléculas chaves para o desenvolvimento da resposta inflamatória. Estes
dados comprovam que os frutos e o látex podem ser uma alternativa natural
para o tratamento de desordens inflamatórias.
No que diz respeito ao mecanismo anti-inflamatório do extrato aquoso
dos frutos de H. speciosa ainda não foi elucidado. Entretanto existem algumas
hipóteses que podem ser sugeridas. Considerando que no momento da injúria
ocorre uma contração de células e extravasamento de exsudato. Estes eventos
vasculares induzem a ativação de mediadores inflamatórios, seguido por um
recrutamento e adesão de leucócitos, principalmente neutrófilos, para o local
da inflamação. Esse mecanismo é regulado por moléculas de adesão
endoteliais e citocinas inflamatórias (HOPKINS, 2003; SCHMID-SCHÖNBEIN,
2006). É provável que o extrato aquoso ou moléculas bioativas atuem inibindo
os mediadores envolvidos na inflamação induzida por carragenina, como por
exemplo, histamina, serotonina, cininas e prostaglandinas que estão
intimamente relacionados com a vasodilatação e formação de exsudato
peritoneal e/ou inibindo receptores (integrinas) presentes nos leucócitos que se
ligam as moléculas de adesão intercelulares (ICAMs) que são expressas pelas
células endoteliais ativadas, impedindo que os leucócitos rolem com firmeza ao
longo da superfície do endotélio, e ocorra o processo de transmigração
67
(passagem dos leucócitos do vaso para o interstício). A não expressão de
ICAMs demonstrou uma redução significativa do rolamento de leucócitos,
afetando consequentemente sua entrada no local da inflamação (LEHMANN et
al., 2003). Consequentemente, se esses mediadores e eventos inflamatórios
são bloqueados ou interrompidos, a produção de citocinas inflamatórias
também será comprometida.
Tabela 4 – Percentagem de inibição do extrato aquoso e frações dos frutos de Hancornia
speciosa, bem como rutina e ácido clorogênico em modelo de peritonite induzida por
carragenina
Grupos (tratamento i.v.)
Dose (mg/kg)
Migração celular (106/mL)
Inibição (%)
salina
dexametasona
----
0,5
23,70 + 0,751
7,500 + 0,570***
68,35
extrato aquoso 20 10,40 + 1,030*** 56,11
extrato aquoso 30 3,800 + 0,700*** 83,96
extrato aquoso 40 6,120 + 0,171*** 74,17
fração CH2Cl2 20 7,000 + 0,7583*** 70,46
fração AcOEt 20 5,400 + 1,259*** 77,21
fração n-BuOH 20 5,100 + 0,6782*** 78,48
rutina 2 7,000 + 2,133*** 70,46
rutina 2,5 11,10 + 1,470*** 53,16
rutina 5 9,000 + 0,689*** 62,02
ácido clorogênico 2 12,60 + 2,790*** 46,83
ácido clorogênico
ácido clorogênico
2,5
5
11,70 + 2,113***
8,100 + 1,251***
50,63
65,82
Valores são médias ± desvios padrão (D.P.), n = 5, ***p<0,001, grupos testados comparados com grupos salina. Fonte: Dados obtidos e analisados
68
6.3 Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa, rutina e
ácido clorogênico em modelo de edema de orelha induzido por xilol
O efeito do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, rutina e ácido
clorogênico na formação do edema foram avaliados usando o modelo de
edema de orelha induzido por xilol. Observou-se que os grupos tratados via
intraperitoneal com as doses 40, 50 e 60 mg/kg de extrato aquoso apontaram
uma supressão na formação do edema induzido por xilol com um percentual de
inibição de 78,36, 81,07, 73,18%, respectivamente. Quando apenas o extrato
aquoso na dose de 60mg/kg foi administrado intraperitonealmente, foi
observado que o extrato aquoso não foi capaz de induzir a formação do edema
pela via intraperitoneal.
Seguindo o estudo, os grupos tratados com rutina pela via
intraperitoneal nas doses de 2,5, 5 e 10 mg/kg foram capazes de reduzir a
formação do edema em 76,94, 83,29 e 97,78%, respectivamente. Enquanto
que os grupos tratados com ácido clorogênico (i.p.) nas de doses de 10, 12,5 e
15mg/kg, mostraram uma redução no edema de 85,82, 83,17 e 79,84,
respectivamente. Todos os grupos foram estatisticamente significativos na
redução do edema, comprovando que o extrato aquoso e seus compostos
identificados foram eficazes na atividade anti-edematogênica, quando
comparados com o grupo que recebeu solução salina estéril (i.p.) como
tratamento. A dexametasona foi utilizada como grupo controle e observou-se
que os grupos tratados com extrato aquoso, rutina e ácido clorogênico
apresentaram um percentual de inibição bastante semelhante ao medicamento
já disponível no mercado (79,66%). A tabela 5 mostra o efeito anti-
edematogênico do extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, rutina e ácido
clorogênico no modelo de edema de orelha induzido por xilol.
69
Tabela 5 - Atividade anti-edematogênica do extrato aquoso dos frutos de Hancornia
speciosa, rutina e ácido clorogênico em modelo de edema de orelha induzido por xilol
Grupos Dose (mg/kg)
Diferença (mg)
Inibição (%)
salina
dexametasona
----
0,5
32,450 + 2,603
6,600 ± 2,448***
79,66
extrato aquoso 40 7,020 + 3,820*** 78,36
extrato aquoso 50 6,140 ± 2,385*** 81,07
extrato aquoso 60 8,700 ± 2,719*** 73,18
rutina 2,5 7,480 ± 2,221*** 76,94
rutina 5 5,420 ± 2,328*** 83,29
rutina 10 0,720 ± 1,253*** 97,78
ácido clorogênico 10 4,600 ± 2,795*** 85,82
ácido clorogênico
ácido clorogênico
12,5
15
5,460 ± 2,579***
6,540 ± 3,917***
83,17
79,84
Valores são médias ± desvios padrão (D.P.), n = 5, ***p<0,001, grupos testados comparados com grupos salina. Fonte: Dados obtidos e analisados
O edema de orelha foi usado como modelo primário da inflamação
aguda, e o xilol foi usado como agente flogístico. O xilol é uma substância
irritante que aumenta a permeabilidade vascular induzindo a formação do
edema, um dos sinais cardinais da inflamação. O processo de inflamação inicia
com a ativação de mediadores inflamatórios originados de neurônios
sensoriais, tais como serotonina, acetilcolina, histamina, bradicinina e
prostaglandinas. Estes mediadores inflamatórios induzem a liberação de
neuropeptídios, pela excitação dos neurônios, que ativam receptores,
causando a inflamação neurogênica (BANKI et al., 2014; RICHARDSON;
VASKO, 2002). Neurônios sensoriais são sensíveis a algumas substâncias
químicas, como a capsaicina, responsável pela despolarização e liberação
direta de mediadores e liberação de neuropeptídios, em especial a substância
P, um potente vasodilatador que atua na liberação de óxido nítrico nas células
endoteliais, o qual causa vasodilatação e extravasamento do plasma, induzindo
a formação do edema (BARRY et al., 2011; HOLZER, 1988). Os resultados
mostram claramente uma porcentagem de inibição acima de 73% em todos os
grupos testados, demonstrando que o extrato aquoso dos frutos de H.
70
speciosa, rutina e ácido clorogênico apresentaram um efeito antiflogístico
bastante promissor. Sobre o mecanismo de ação, ainda não foi estabelecido,
porém é provável que o extrato aquoso ou moléculas bioativas revelem um
efeito estabilizador de membrana reduzindo a vasodilatação, uma vez que já é
descrito na literatura que a rutina promove resistência e integridade nas
paredes dos vasos (Pathak et al., 1991). Outra possibilidade está relacionada
com a inibição dos mediadores inflamatórios que ativam os receptores que
causam a inflamação neurogênica ou bloqueio dos próprios receptores que
estão envolvidos com este processo inflamatório.
6.4 Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa, rutina e
ácido clorogênico em modelo de bolsa de ar induzido por zimosam
Outro modelo escolhido para avaliar a ação anti-inflamatória do extrato
aquoso dos frutos de H. speciosa e os compostos rutina e ácido clorogênico foi
o de bolsa de ar no dorso de camundongos utilizando o zimosam como
inflamógeno. Neste modelo, após os animais receberem a injeção subcutânea
(s.c.) de zimosam na bolsa de ar, ocorre à indução de uma resposta
inflamatória aguda, caracterizada pela migração de leucocitos e exsudação de
plasma para cavidade (bolsa de ar). Camundongos Swiss tratados por via
intraperitoneal (i.p.) com solução salina estéril e trinta minutos depois
desafiados com zimosam (s.c) apresentaram uma intensa migração leucocitária
para bolsa de ar. Entretanto, todos os grupos tratados por via intraperitoneal
com diferentes doses (40, 50 ou 60 mg/kg) do extrato aquoso mostraram uma
inibição significativa da migração leucocitária, quando comparados com o
grupo que recebeu apenas solução salina estéril (i.p) e zimosam (s.c.). Quando
apenas o extrato aquoso (50 mg/kg) foi administrado intraperitoneal, foi
observado uma migração celular para cavidade dorsal semelhante ao grupo
salina (Figura 17).
71
Figura 17 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa na migração
leucocitária a partir do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam
Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), extrato
aquoso na dose de 40, 50 e 60 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois
zimosam (1 mg/mL) ou solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar. Um
grupo (EA) recebeu apenas extrato aquoso na dose de 50 mg/kg. Depois de 6 horas o
exsudato foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e
realizada a contagem total de células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada
coluna representa a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam
o erro padrão da média (EPM). ###
p<0,001 e ##
p<0,01 comparando com o grupo solução salina
estéril (Sal); ***p<0,001 comparando com o grupo zimosam. Sal, solução salina estéril; Dex,
dexametasona (2,0 mg/kg), EA, extrato aquoso (50 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
Após avaliar o efeito dose-efeito do extrato aquoso no modelo de bolsa
de ar induzido por zimosam, foi avaliado o efeito do extrato aquoso na cinética
de migração celular e contagem diferencial nos intervalos de tempo de 6, 24 e
48 horas utilizando o mesmo modelo de inflamação. Para isto uma dose foi
escolhida para dar continuidade aos experimentos.
A administração de zimosam (s.c.) induziu um aumento na migração de
leucócitos para bolsa de ar em todos os intervalos de tempo (6, 24 e 48 horas).
Observou-se que o grupo que recebeu zimosam e foi tratado com solução
salina estéril (i.p.) apresentou um aumento no número de leucócitos com um
72
pico de 6 horas e diminuição gradativa dessas células na cavidade dorsal dos
camundongos à medida que o tempo foi passando. Entretanto os resultados
demonstram que um tratamento prévio com extrato aquoso (i.p.) na dose de 50
mg/kg (Figura 18), inibiu significativamente a migração de leucócitos em todos
os intervalos de tempo, também de forma gradativa com o passar do tempo. Os
dados apontam a eficiência do extrato aquoso no processo de inibição celular
de até 48h, levantando a possibilidade da realização de estudos de inflamação
crônica, como asma e doenças autoimunes (BITENCOURT et al., 2011).
Da mesma forma, na contagem diferencial relativa, o extrato aquoso
(50 mg/kg) foi avaliado no tempo de 6, 24 e 48 horas. Os grupos tratados com
solução salina estéril (i.p.) após trinta minutos serem desafiados com o
zimosam (i.p.) apresentaram um aumento no número de polimorfonucleares no
tempo de 6 horas, com diminuição do número de polimorfonucleares e
aumento progressivo de mononucleares no exsudato com o passar do tempo.
Com a administração do extrato aquoso na dose de 50 mg/kg ocorreu a
redução de polimorfonucleares (Figura 19A) e aumento no número de
mononucleares (Figura 19B) nos três tempos, quando comparado com o grupo
que recebeu solução salina estéril como tratamento.
73
Figura 18 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa sobre
cinética de migração leucocitária em modelo de bolsa de ar induzida por
zimosam
Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), extrato
aquoso na dose de 50 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois zimosam (1
mg/mL) ou solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar. No tempo de 6,
24 e 48 horas após a aplicação do zimosam, os animais o exsudato foi coletado da bolsa de ar
com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem total de células
leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. ###
p<0,001, ##
p<0,01 e #p<0,05 comparando
com o grupo solução salina estéril (Sal); ***p<0,001 comparando com o grupo zimosam. Sal,
solução salina estéril; Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex, dexametasona (2,0 mg/kg), EA, extrato
aquoso (50 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
74
Figura 19 - Efeito do extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa sobre cinética de
migração de polimorfonucleares (A) e mononucleares (B) em modelo de bolsa de ar
induzida por zimosam
Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com extrato aquoso na dose de 50 mg/kg, ou
dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois 1 mL de zimosam (1 mg/mL) foi injetado (s.c)
dentro da bolsa de ar. No tempo de 6, 24 e 48 horas após a aplicação do zimosam, o exsudato
foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a
contagem relativa de polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN). **p<0,001 e *p<0,05
comparando com o grupo zimosam. Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex, dexametasona (2,0 mg/kg),
EA, extrato aquoso (50 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
75
O padrão de rutina foi avaliado no experimento dose-efeito e foi
verificado que entre as doses (2,5, 5 e 10 mg/kg) não houveram diferenças
estatísticas quanto ao efeito de inibição de migração celular. Os dados exibem
uma semelhança estatística entre com a dexametasona na dose de 2 mg/kg
(Figura 20).
Figura 20 - Efeito rutina na migração leucocitária a partir do modelo de bolsa de ar
induzido por zimosam
Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), rutina na
dose de 2,5, 5 e 10 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois zimosam (1
mg/mL) ou solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar. Depois de 6
horas o exsudato foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e
realizada a contagem total de células leucocitárias utilizando a câmara de Neubauer. Cada
coluna representa a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas verticais indicam
o erro padrão da média (EPM). ###
p<0,001 comparando com o grupo solução salina estéril
(Sal); ***p<0,001, comparando com o grupo carragenina. Sal, solução salina estéril; Dex,
dexametasona (2,0 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
A dose de 2,5 mg/kg da rutina foi escolhida para realizar o experimento
de cinética de migração leucocitária. Ao contrário do extrato aquoso que
apresentou um perfil gradativo na redução de leucócitos total com o passar do
76
tempo, a rutina se comportou de maneira constante nos três intervalos de
tempo (Figura 21).
Figura 21 - Efeito da rutina sobre cinética de migração leucocitária em modelo de bolsa
de ar induzida por zimosam
Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), rutina na
dose de 2,5 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois zimosam (1 mg/mL) ou
solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar. No tempo de 6, 24 e 48
horas após a aplicação do zimosam, o exsudato foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de
solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem total de células leucocitárias
utilizando a câmara de Neubauer. ###
p<0,001 e ##
p<0,01 comparando com o grupo solução
salina estéril (Sal); ***p<0,001 comparando com o grupo zimosam. Sal, solução salina estéril;
Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex, dexametasona (2,0 mg/kg), Rt, rutina (2,5 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
No que diz respeito à contagem diferencial relativa, a rutina induziu a
diminuição de polimorfonucleares no tempo inicial (6 horas) e manteve a
redução gradativa no tempo de 24 e 48 horas (Figura 22A). Paralelamente, os
mononucleares revelaram que à medida que avançava o tempo, esta
subpopulação aumentava (Figura 22B).
77
Figura 22 - Efeito da rutina sobre cinética de migração de polimorfonucleares (A) e
mononucleares (B) em modelo de bolsa de ar induzida por zimosam
Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com rutina na dose de 2,5 mg/kg, ou dexametasona
(2mg/kg), trinta minutos depois 1 mL de zimosam (1 mg/mL) foi injetado (s.c) dentro da bolsa
de ar. No tempo de 6, 24 e 48 horas após a aplicação do zimosam o exsudato foi coletado da
bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem relativa de
polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN). Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex,
dexametasona (2,0 mg/kg), Rt, rutina (2,5 mg/kg). Fonte: Dados obtidos e analisados
O ácido clorogênico também foi avaliado no experimento dose-efeito foi
verificado que as doses de 10, 12,5 e 15 mg/kg foram capazes de inibir a
migração celular (Figura 23).
78
Figura 23 - Efeito do ácido clorogênico na migração leucocitária a partir do modelo de
bolsa de ar induzido por zimosam
Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), ácido
clorogênico na dose de 10, 12,5 e 15 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois
zimosam (1 mg/mL) ou solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar.
Depois de 6 horas o exsudato foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril,
centrifugado e realizada a contagem total de células leucocitárias utilizando a câmara de
Neubauer. Cada coluna representa a média dos valores obtidos em cinco animais, e as linhas
verticais indicam o erro padrão da média (EPM). ###
p<0,001, ##
p<0,01 e #p<0,05 comparando
com o grupo solução salina estéril (Sal); ***p<0,001, comparando com o grupo zimosam. Sal,
solução salina estéril; Dex, dexametasona (2,0 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
A dose de 10 mg/kg do ácido clorogênico foi escolhida para realizar o
experimento de cinética de migração leucocitária. Semelhante ao extrato
aquoso, o ácido clorogênico apresentou um perfil gradativo na redução de
leucócitos total com o passar do tempo (6, 24 e 48 horas) (Figura 24).
No que diz respeito a contagem diferencial relativa utilizando a dose de
10 mg/kg do ácido clorogênico analisado, em três intervalos de tempo, foi
possível verificar que o efeito do composto foi semelhante a dexametasona,
diminuindo o número de polimorfonucleares (Figura 25A) e aumentando o
número de mononucleares (Figura 25B), quando comparado com o grupo que
recebeu apenas a solução salina estéril (i.p.) como tratamento.
79
Figura 24 - Efeito do ácido clorogênico sobre cinética de migração leucocitária em
modelo de bolsa de ar induzida por zimosam
Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com solução estéril salina (0,9 mg/mL), ácido
clorogênico na dose de 10 mg/kg, ou dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois zimosam
(1 mg/mL) ou solução salina estéril, 1 mL, foi injetado (s.c) dentro da bolsa de ar. No tempo de
6, 24 e 48 horas após a aplicação do zimosam o exsudato foi coletado da bolsa de ar com 2
mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a contagem total de células leucocitárias
utilizando a câmara de Neubauer. ###
p<0,001 e ##
p<0,01 comparando com o grupo solução
salina estéril (Sal); ***p<0,001 comparando com o grupo zimosam. Sal, solução salina estéril;
Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex, dexametasona (2,0 mg/kg), AC, ácido clorogênico (10 mg/kg).
Fonte: Dados obtidos e analisados
80
Figura 25 - Efeito do ácido clorogênico sobre cinética de migração de
polimorfonucleares (A) e mononucleares (B) em modelo de bolsa de ar induzida por
zimosam
Camundongos Swiss foram tratados (i.p.) com ácido clorogênico na dose de 10 mg/kg, ou
dexametasona (2mg/kg), trinta minutos depois 1 mL de zimosam (1 mg/mL) foi injetado (s.c)
dentro da bolsa de ar. No tempo de 6, 24 e 48 horas após a aplicação do zimosam o exsudato
foi coletado da bolsa de ar com 2 mL de solução salina estéril, centrifugado e realizada a
contagem relativa de polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN). **p<0,01 e *p<0,05
comparando com o grupo zimosam. Zim, zimosam (1 mg/mL); Dex, dexametasona (2,0 mg/kg),
AC, ácido clorogênico (10 mg/kg). Fonte: Dados obtidos e analisados
81
O modelo de bolsa de ar induzido por zimosam é um modelo de
inflamação semelhante à resposta inflamatória em um tecido sinovial, uma vez
que a injeção de ar estéril introduzida no dorso dos animais forma uma
cavidade que se assemelha ao ambiente da articulação (CABRERA et al.,
2001; YOON et al., 2005). O zimosam é um polissacarídeo derivado do fungo
Saccharomyces cerevisiae e sua administração promove uma intensa reação
inflamatória caracterizada pelo aumento do influxo leucocitário (MAKNI-
MAALEJ et al., 2013). Os resultados mostram que o extrato aquoso dos frutos
de H. speciosa, rutina e ácido clorogênico inibiram significativamente a
migração leucocitária para bolsa de ar em camundongos em todas as doses e
tempos testados, mesmo após 48 horas da administração do zimosam. Os
resultados se assemelham ao o efeito anti-inflamatório da dexametasona,
fármaco anti-inflamatório de referência. Além disso, na contagem diferencial
relativa foi observada uma redução dos polimorfonucleares, bem como um
aumento do número de mononucleares, mostrando a capacidade do extrato
aquoso e compostos identificados em controlar a inflamação por reduzir o
número de neutrófilos no lugar da inflamação.
O mecanismo envolvido na inibição da resposta inflamatória pelo
extrato aquoso e suas moléculas bioativas ainda é desconhecido. Entretanto o
zimosam pode interagir com receptor semelhante ao ”Toll 2” (TLR-2) e
desencadear a resposta inflamatória. O zimosam é reconhecido pelo receptor
de Dectina 1 presente em macrófagos, neutrófilos, monócitos e células T. Após
o reconhecimento, é necessário a interação com o receptor semelhante ao
TLR-2. Estudos mostram que o sinergismo na ativação de Dectina 1 e o TLR-2
melhora a resposta desencadeada por cada receptor (BROWN; GORDON,
2003). A interação induz cascatas intracelulares com ativação do recrutamento
seletivo de proteínas adaptadoras do gene de resposta primária de
diferenciação mielóide 88 (MyD88), que leva a ativação do fator de transcrição
nuclear kappa B (NF-κB), o qual é responsável pela transcrição de genes pro-
inflamatórios responsáveis pela produção de citocinas inflamatórias, bem como
da expressão de moléculas co-estimulatórias (GUERRERO et al., 2011).
Estudos prévios têm revelado também que a rutina e o ácido clorogênico são
dotados de algumas atividades farmacológicas, especialmente anti-
inflamatórias (LIMA et al., 2014; ZHANG et al., 2010). Foi demonstrado que
82
tanto a rutina como o ácido clorogênico inibem a ativação do fator nuclear
kappa B (NF-κB) suprimindo a produção de prostaglandinas E2 (PGE2) por
inibir a expressão da COX-2 (CHOI et al., 2013; SHAN et al., 2009), como
também diminui a expressão de proteínas relacionada com a inflamação, como
o óxido nítrico sintase (iNOS) (RUIZ et al., 2007). Portanto, é possível que
estes metabólitos secundários atuem sinergicamente inibindo a resposta
inflamatória induzida pelo inflamógeno zimosam, uma vez que o mecanismo de
ação está diretamente relacionado com a ativação do fator nuclear kappa B.
Outra possibilidade pode estar relacionada com o extrato ou moléculas
bioativas em se ligar de maneira competitiva ou inibitória com o receptor TLR-2
e/ou receptor de Dectina 1 e inibir a cascata intracelular da inflamação.
Além disso, a inibição da migração celular para o local da inflamação
não pode ser descartada como outro mecanismo de atividade anti-inflamatória.
Sabe-se que no processo inflamatório ocorre aumento da permeabilidade
vascular, levando a migração e ativação de polimorfonucleares, especialmente
neutrófilos (PICK et al., 2013). Em geral os primeiros leucócitos que chegam ao
local da inflamação são os neutrófilos. Estes predominam nos tecidos
inflamados durante as primeiras 6 a 24 horas. Em seguida ocorre um perfil de
substituição células e os mononucleares, em especial os monócitos, que
predominam nas 24 a 48 horas seguintes (SIQUEIRA, 2000). É importante
considerar que apesar do recrutamento de neutrófilos ser uma resposta
protetora do organismo, a ocorrência de uma resposta exacerbada gera efeitos
indesejáveis, o que pode levar a um progressivo dano tecidual no local
inflamado, portanto o bloqueio do tráfego de neutrófilos durante o processo
inflamatório, vem sendo um alvo promissor na descoberta de novos fármacos
anti-inflamatórios (MALECH; GALLIN, 1987). Então, é possível que as
moléculas bioativas presentes no extrato aquoso dos frutos de H. speciosa
apresentem interação com os receptores presentes nas células endoteliais,
inibindo a migração celular, bem como a ativação produção mediadores
inflamatórios envolvidos na diapedese e quimiotaxia de polimorfonucleares.
83
7 CONCLUSÂO
A análise fitoquímica realizada por Cromatografia líquida de alta
eficiência acoplado ao detector de arranjo de diódo (CLAE-DAD) e
Cromatografia líquida acoplado ao detector de arranjo de diodo acoplado ao
espectrômetro de massas (CL-DAD-EM) revelou a presença dos metabólitos
secundários rutina e o ácido clorogênico no decocto dos frutos de H. speciosa;
O extrato aquoso de H. speciosa, rutina e ácido clorogênico
administrados por via intravenosa, em todas as doses testadas, inibiram a
migração celular para a cavidade peritoneal de camundongos induzida por
carragenina, bem como reduziram os níveis de citocinas IL-1β, IL-6, IL-12 e
TNF-α;
O extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, rutina e ácido clorogênico
foram capazes de inibir significantemente a formação de edema de orelha
induzido por xilol, quando administrado pela via intraperitoneal;
O extrato aquoso dos frutos de H. speciosa, rutina e ácido clorogênico,
administrado por via intraperitoneal, reduziram significativamente o influxo de
leucócitos para a cavidade dorsal em modelo de bolsa de ar em camundongos
induzida por zimosam, sendo essa inibição observada 6, 24 e 48 horas após o
tratamento;
Em conclusão, no presente estudo foi possível demonstrar pela
primeira vez, que o extrato aquoso dos frutos de Hancornia speciosa, bem
como rutina e ácido clorogênico foram capazes de exercer efeito anti-
inflamatório nos modelos experimentais em estudo. Com os resultados
apresentados, é possível evidenciar o uso popular dos frutos da mangabeira
para o tratamento de doenças de caráter inflamatório. Estes resultados também
sugerem que a rutina e o ácido clorogênico contribuem, em parte, para o efeito
anti-inflamatório do extrato aquoso, havendo a necessidade de estudos
adicionais para identificação de outros constituintes presentes no extrato.
Portanto é possível sugerir que o extrato aquoso dos frutos de Hancornia
84
speciosa e seus constituintes identificados podem representar, em um futuro
mais próximo, uma nova opção terapêutica para o tratamento de desordens
inflamatórias.
85
REFERENCIAS
AGRA, M. D. F.; SILVA, K. N.; BASÍLIO, I. J. L. D.; FREITAS, P. F. DE; BARBOSA-FILHO, J. M. Survey of medicinal plants used in the region Northeast of Brazil. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, n. 3, p. 472–508, 2008.
AKIRA, S.; HIRANO, T.; TAGA, T.; KISHIMOTO, T. Biology of multifunctional cytokines: IL 6 and related molecules (IL 1 and TNF). The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 1990.
ALLER, M. A.; ARIAS, J. L.; ARIAS, J. I.; SÁNCHEZ-PATÁN, F.; ARIAS, J. The inflammatory response recapitulates phylogeny through trophic mechanisms to the injured tissue. Medical Hypotheses, v. 68, n. 1, p. 202–209, 2007.
ALMEIDA, L. M.; FLORIANO, J. F.; RIBEIRO, T. P.; et al. Hancornia speciosa latex for biomedical applications: physical and chemical properties, biocompatibility assessment and angiogenic activity. Journal of Materials Science. Materials in Medicine, v. 25, n. 9, p. 2153–62, 2014.
ALMEIDA, S. P.; PROENÇA, C. E. B.; SANO, S. M.; RIBEIRO, J. F. Cerrado: espécies vegetais úteis. EMBRAPA, Planaltina, D.F, p. 38, 1998.
ALWANI, M. EL; WU, B. X.; OBEID, L. M.; HANNUN, Y. A. Bioactive sphingolipids in the modulation of the inflammatory response. Pharmacology and Therapeutics, v. 112, n. 1, p. 171–183, 2006.
ANDRADE, F. D. P. Investigação química de chás brasileiros. 2002. 178f.
Tese (Doutorado em Química) – Instituto de Química, Universidade Estadual
Paulista, Araraquara, 2002.
BANDEIRA-MELO, C.; SERRA, M. F.; DIAZ, B. L.; et al. Cyclooxygenase-2-derived prostaglandin E2 and lipoxin A4 accelerate resolution of allergic edema in Angiostrongylus costaricensis-infected rats: relationship with concurrent eosinophilia. Journal of immunology, v. 164, n. 2, p. 1029–1036, 2000.
BANKI, E.; HAJNA, Z.; KEMENY, A.; et al. Neuropharmacology The selective PAC1 receptor agonist maxadilan inhibits neurogenic vasodilation and edema formation in the mouse skin. Neuropharmacology, v. 85, p. 538–547, 2014.
BARRY, C. M.; HELPS, S. C.; HEUVEL, C. VAN DEN; VINK, R. Characterizing the role of the neuropeptide substance P in experimental subarachnoid hemorrhage. Brain Research, v. 1389, p. 143–151, 2011. Elsevier B.V.
BAUTISTA, L. E. Inflammation, endothelial dysfunction, and the risk of high blood pressure: epidemiologic and biological evidence. Journal of human hypertension, v. 17, n. 4, p. 223–230, 2003.
86
BENAROYO, L. How do we define inflammation? Schweizerische Rundschau
fur Medizin Praxis, v. 83, p. 1343-1347, 1994.
BITENCOURT, M. A. O. Efeito de extratos da alga marinha Caulerpa mexicana em modelos de inflamação em murinos., 2011. 86f. 2011. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Natal.2011.
BITENCOURT, M. A. O.; DANTAS, G. R.; LIRA, D. P.; et al. Aqueous and methanolic extracts of Caulerpa mexicana suppress cell migration and ear edema induced by inflammatory agents. Marine drugs, v. 9, n. 8, p. 1332–45, 2011.
BOLDI, A. M. Libraries from natural product-like scaffolds. Current Opinion in Chemical Biology, v. 8, n. 3, p. 281–286, 2004.
BROWN, G. D.; GORDON, S. Fungal beta-Glucans and Mammalian Immunity. Immunity, v. 19, p. 311–315, 2003.
BURIAN, M.; GEISSLINGER, G. COX-dependent mechanisms involved in the antinociceptive action of NSAIDs at central and peripheral sites. Pharmacology and Therapeutics, v. 107, n. 2, p. 139–154, 2005.
CABRERA, P. V; BLANCO, G.; GRAVISACO, M. J.; ALVAREZ, E.; HAJOS, S. Zymosan Modulates CD44 Isoform Expression in a Murine Model of Inflammation Resembling Rheumatoid Arthritis Synovitis. The journal of Rheumatology, v. 28, n. 5, p. 944–949, 2001.
CALIXTO, J. B. Twenty-five years of research on medicinal plants in Latin America: A personal view. Journal of Ethnopharmacology, v. 100, n. 1-2, p. 131–134, 2005.
CALIXTO, J. B.; CAMPOS, M. M.; OTUKI, M. F.; SANTOS, A. R. S. Anti-inflammatory compounds of plant origin. Part II. Modulation of pro-inflammatory cytokines, chemokines and adhesion molecules. Planta Medica, v. 70, n. 2, p. 93–103, 2004.
CARVALHO, W.; LEMÔNICA, L. Artigo de Revisão Mecanismos Celulares e Moleculares da Dor Inflamatória. Modulação Periférica e Avanços Terapêuticos. Revista Brasileira de Anestesiologia, v. 48, n. 2, p. 137–158, 1998.
CASSATELLA, M. A. The production of cytokines by polymorphonuclear neutrophils. Immunology Today, v. 16, n. 1, p. 21–26, 1995.
CASTELLHEIM, A.; BREKKE, O.L.; ESPEVIK, T.; HARBOE, M.; MOLLNES, T.E. Innate Immune Responses to Danger Signals in Systemic Inflammatory response Syndrome and Sepsis. Scandinavian Journal of Immunology, v. 69, p. 479–491, 2009.
87
CHOI, S.; LIM, T.; KYUNG, M.; et al. Rutin inhibits B [ a ] PDE-induced cyclooxygenase-2 expression by targeting EGFR kinase activity. Biochemical Pharmacology, v. 86, n. 10, p. 1468–1475, 2013. Elsevier Inc.
COSTA, E. S.; HIRUMA-LIMA, C. A.; LIMA, E. O.; et al. Antimicrobial Activity of Some Medicinal Plants of the Cerrado , Brazil. Phytotherapy Research, v. 22, p. 705–707, 2008.
CUNHA, F. Q.; SOUZAT, G. E. P.; SOUZAT, C. A. M.; CERQUEIRA, B. C. S.; FERREIRA, S. H. In-vivo blockage of neutrophil migration by LPS is mimicked by a factor released from LPS-stimulated macrophages. The British Journal of Experimental Pathology, v. 70, n. 1, p. 1–8, 1989.
DINARELLO, C. A. Biologic basis for interleukin-1 in disease. Blood. v. 87, n. 6, p.2095-2147, 1989.
DOLAN-O’KEEFE, M.; NICK, H. S. Inhibition of cytoplasmic phospholipase A2 expression by glucocorticoids in rat intestinal epithelial cells. Gastroenterology, v. 116, n. 4, p. 855–864, 1999.
DRAY, A. Inflammatory mediators of pain. British journal of anaesthesia, v. 75, n. 2, p. 125–131, 1995.
ENDRINGER, D. C.; PEZZUTO, J. M.; BRAGA, F. C. NF-kappaB inhibitory activity of cyclitols isolated from Hancornia speciosa. Phytomedicine : International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology, v. 16, n. 11, p. 1064–1069, 2009.
ENDRINGER, D. C.; VALADARES, Y. M.; CAMPANA, P. R. V; et al. Evaluation of Brazilian Plants on Cancer Chemoprevention Targets In Vitro. Phytotherapy Research, v. 933, p. 928–933, 2010.
FERREIRA, H. C.; SERRA, C. P.; ENDRINGER, D. C.; et al. Endothelium-dependent vasodilation induced by Hancornia speciosa in rat superior mesenteric artery. Phytomedicine : International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology, v. 14, n. 7-8, p. 473–8, 2007.
FERREIRA, H. C.; SERRA, C. P.; LEMOS, V. S.; BRAGA, F. C.; CORTES, S. F. Nitric oxide-dependent vasodilatation by ethanolic extract of Hancornia speciosa via phosphatidyl-inositol 3-kinase. Journal of ethnopharmacology, v. 109, n. 1, p. 161–164, 2007.
GANGA, R. M. D.; CHAVES, L. J.; NAVES, R. V. Parâmetros genéticos em progênies de Hancornia speciosa Gomes do Cerrado. Scientia Forestalis/Forest Sciences, n. 84, p. 395–404, 2009.
GAZZINELLI, R. T.; HIENY, S.; WYNN, T. A; WOLF, S.; SHER, A. Interleukin 12 is required for the T-lymphocyte-independent induction of interferon gamma by an intracellular parasite and induces resistance in T-cell-deficient hosts.
88
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 90, n. 13, p. 6115–6119, 1993.
GOLENIOWSKI, M. E.; BONGIOVANNI, G. A.; PALACIO, L.; NUÑEZ, C. O.; CANTERO, J. J. Medicinal plants from the “Sierra de Comechingones”, Argentina. Journal of Ethnopharmacology, v. 107, n. 3, p. 324–341, 2006.
GRUNDY, S. M. Inflammation, hypertension, and the metabolic syndrome.
JAMA, v.290, n. 22, 3000-3002, 2003.
GUERRA, P. M.; NODARI, O. R. Biodiversidade: aspectos biológicos,
geográficos, legais e éticos. In: SIMÕES, M. O. et al.
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3. ed. Porto Alegre: UFRGS;
Florianópolis: UFSC, 2001. p.15.
GUERRERO, A. T. G.; CUNHA, T. M.; VERRI, W. A.; et al. Toll-like receptor 2/MyD88 signaling mediates zymosan-induced joint hypernociception in mice: Participation of TNF-α, IL-1β and CXCL1/KC. European Journal of Pharmacology, v. 674, n. 1, p. 51–57, 2011.
HARADA, Y.; KAWAMURA, M. T.; HATANAKA, K.; SAITO, M.; OGINO, M.; OHNO, K.; YANG, Q. Differing profiles of protaglandins formation inhibitors between selective prostaglandin H synthase-2 inhibitors and conventional NSAIDs in inflammatory and non -inflammatory sites of rats. Prostaglandins & Others Lipid Mediators, v.55, p.345-358, 1998.
HIGGS, G.A.; EAKINS, K.E.; MUGRIDGE, K.G.; MONCADA, S.;
VANE,J.R. The effects of non-steroid anti-inflammatory drugs on
leukocytes migration in carrageenan-induced inflammation. Europ.J.of
Pharmacol., v. 66, p. 81-86, 1980
HIRSCHMANN, G. S.; ARIAS, A. R. A Survey of medicinal plants of Minas Gerais, Brazil. Journal of Ethnopharmacology, v. 29, p. 159–172, 1990.
HOLZER, P. Local effector functions of capsaicin-sensitive sensory nerve endings: involvement of tachykinis, calcitonin gene related peptide and other neuropeptides.Neuroscience 24, 739-768, 1988. HONDA, N. K.; GARCEZ, W. S.; GARCEZ, F. R.; CONCEIÇÃO, C. A. Estudo
químico de plantas do Mato Grosso do Sul. I. Triagem fitoquímica. Revista
Científica e Cultural UFMS, v.5, p.37–46, 1990.
HOPKINS, S. J. The pathophysiological role of cytokines. Legal Medicine, v. 5, p. 45–57, 2003.
ITOKAWA, H.; MORRIS-NATSCHKE, S. L.; AKIYAMA, T.; LEE, K.-H. Plant-derived natural product research aimed at new drug discovery. Journal of natural medicines, v. 62, n. 3, p. 263–280, 2008.
89
JANSEN-OLESEN, I.; OTTOSSON, A; CANTERA, L.; et al. Role of endothelium and nitric oxide in histamine-induced responses in human cranial arteries and detection of mRNA encoding H1- and H2-receptors by RT-PCR. British journal of pharmacology, v. 121, n. 1, p. 41–48, 1997.
KAWAMURA, M.; HATANAKA, K.; SAITO, M.; et al. Are the anti-inflammatory effects of dexamethasone responsible for inhibition of the induction of enzymes involved in prostanoid formation in rat carrageenin-induced pleurisy? European Journal of Pharmacology, v. 400, n. 1, p. 127–135, 2000.
KELLY, M.; HWANG, J. M.; KUBES, P. Modulating leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 120, n. 1, p. 3–10, 2007.
KOLEWE, M. E.; GAURAV, V.; ROBERTS, S. C. Pharmaceutically active natural product synthesis and supply via plant cell culture technology. Molecular Pharmaceutics, v. 5, n. 2, p. 243–256, 2008.
KUMAR, V.; ABBAS, A. K.; FAUSTO, N. Inflamação aguda e crônica. In: KUMAR, V.; ABBAS, A. K.; FAUSTO, N. (eds.) Robbins e Contran. Patologia – bases patológicas das doenças. 7. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005. p. 49-90, 1592 p.
LARCHE, J.; LANCEL, S.; HASSOUN, S. M.; et al. Inhibition of Mitochondrial Permeability Transition Prevents Sepsis-Induced Myocardial Dysfunction and Mortality. Journal of the American College of Cardiology, v. 48, n. 2, p. 377–385, 2006.
LEE, J. L.; MUKHTAR, H.; BICKERS, D. R.; KOPELOVICH, L.; ATHAR, M. Cyclooxygenases in the skin: Pharmacological and toxicological implications. Toxicology and Applied Pharmacology, v. 192, n. 3, p. 294–306, 2003.
LEHMANN, J. C. U.; JABLONSKI-WESTRICH, D.; HAUBOLD, U.; et al. Overlapping and selective roles of endothelial intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and ICAM-2 in lymphocyte trafficking. Journal of immunology, v. 171, n. 5, p. 2588–2593, 2003.
LIMA, G. V. M. Metabolismo Antioxidativo e Atividade biológica de látex mangabeira (Hancornia speciosa Gomes), 2014. 130f. Tese (Doutorado em Botânica) - Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, 2014.
LIMA, M. C. J. D. S.; BITENCOURT, M. A. O.; FURTADO, A. A.; et al. Ipomoea asarifolia neutralizes inflammation induced by Tityus serrulatus scorpion venom. Journal of Ethnopharmacology, v. 153, n. 3, p. 890–895, 2014.
LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas do Brasil. 2. Ed. Nova Odessa: Plantarum, v.1, p.28, 1998.
90
LUIZ-FERREIRA, A.; COLA-MIRANDA, M.; BARBASTEFANO, V.; et al. Should Anacardium humile St. Hil be used as an antiulcer agent? A scientific approach to the traditional knowledge. Fitoterapia, v. 79, p. 207–209, 2008.
MABRY, T.J., MARKHAM, K.R., THOMAS, M.B. The systematic identification of flavonoids. New York: Springer-Verlag, 354, 1970.
MAGALHÃES, A.; SANTOS, G. B. DOS; VERDAM, M. C. D. S.; et al. Inhibition of the inflammatory and coagulant action of Bothrops atrox venom by the plant species Marsypianthes chamaedrys. Journal of Ethnopharmacology, v. 134, n. 1, p. 82–8, 2011.
MAKNI-MAALEJ, K.; CHIANDOTTO, M.; HURTADO-NEDELEC, M.; et al. Zymosan induces NADPH oxidase activation in human neutrophils by inducing the phosphorylation of p47phox and the activation of Rac2: Involvement of protein tyrosine kinases, PI3Kinase, PKC, ERK1/2 and p38MAPkinase. Biochemical Pharmacology, v. 85, p. 92–100, 2013.
MALECH H.L., GALLIN, J. Neutrophils in human diseases. The New England
Journal of Medicine. 317:687–94, 1987.
MARINHO, D. G.; ALVIANO, D. S.; MATHEUS, M. E.; ALVIANO, C. S.; FERNANDES, P. D. The latex obtained from Hancornia speciosa Gomes possesses anti-inflammatory activity. Journal of Ethnopharmacology, v. 135, n. 2, p. 530–537, 2011.
MATOS, F. J. A. Introdução à Fitoquímica Experimental. 3rd ed, UFC, Fortaleza, 2009.
MIDDLETON, J.; NEIL, S.; WINTLE, J.; et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell, v. 91, n. 3, p. 385–395, 1997.
MORAES, T. D. M.; RODRIGUES, C. M.; KUSHIMA, H.; et al. Hancornia speciosa: indications of gastroprotective, healing and anti-Helicobacter pylori actions. Journal of Ethnopharmacology, v. 120, n. 2, p. 161–168, 2008.
NATHAN, C. Points of control in inflammation. Nature, v.420, p. 846-852, 2002. NATHAN, J. D.; LIDDLE, R. A. Neurohormonal control of pancreatic exocrine secretion. Curr Opin Gastroenterol. 18(5): 536-44, 2002.
OLIVEIRA, C. M. B. DE; SAKATA, R. K.; ISSY, A. M.; GEROLA, L. R.; SALOMÃO, R. Citocinas e Dor. Revista Brasileira Anestesiologia, v. 61, p. 260–265, 2011.
OPAL, S. M.; DEPOLO, V. A. Impact of basic research on tomorrow ’ s medicine Proinflammatory Cytokines. Impact of basic research on tomorrow’s medicine, v. 117, n. 2, p. 1162–1172, 2000.
91
PARVEEN, Z.; DENG, Y.; SAEED, M.K.; DAI, R.; AHAMAD, W.; YU, Y. . Antiinflammatory and Analgesic Activities of Thesium chinense Turcz Extracts and its Major Flavonoids, Kaempferol and Kaempferol-3-O-glucoside. Pharmaceutical Society Japan, v. 127, n. 8, p. 1275–1279, 2007.
PATHAK, D., PATHAK, K., SINGLA, A.K. Flavonoids as medicinal agents: recent advances. Fitoterapia, v.57, n.5, 371–389, 1991.
PEDRIALI, C. A. Síntese química de derivados hidrossolúveis da rutina : determinação de suas propriedades físico-químicas e avaliação de suas atividades antioxidantes, 2005. 127f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica) - Universidade de São Paulo, São Paulo, 2005.
PEREIRA, A. C.; PEREIRA, A. B. D.; MOREIRA, C. C. L.; et al. Hancornia speciosa Gomes (Apocynaceae) as a potential anti-diabetic drug. Journal of Ethnopharmacology, v. 161, p. 30–35, 2015.
PICK, R.; BRECHTEFELD, D.; WALZOG, B. Intraluminal crawling versus interstitial neutrophil migration during inflammation. Molecular Immunology, v. 55, n. 1, p. 70–75, 2013.
PLAEGER, S. F. Clinical immunology and traditional herbal medicines. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, v. 10, n. 3, p. 337–339, 2003.
POBER, J. S.; SESSA, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature reviews. Immunology, v. 7, n. 10, p. 803–815, 2007.
POTT, A.; POTT, V.J. Plantas do pantanal. EMBRAPA, Planaltina, 1994. p.320 RANG, H. P. Rang & Dale Farmacologia. 6ª edição. Rio de Janeiro: Editora Elsevior, 2007. RENNEN, H. J. J. M.; BOERMAN, O. C.; OYEN, W. J. G.; CORSTENS, F. H.
M. Imaging infection/inflammation in the new miliennium. European
Association of Nuclear Medicine, v. 28, n. 2, p. 241-252, 2001.
RICHARDSON, J. D.; VASKO, M. R. Cellular Mechanisms of Neurogenic Inflammation. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, v. 302, n. 3, p. 839–845, 2002.
RINGVALL, M.; RÖNNBERG, E.; WERNERSSON, S.; et al. Serotonin and histamine storage in mast cell secretory granules is dependent on serglycin proteoglycan. Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 121, n. 4, p. 1020–1026, 2008.
RODRIGUES, C. M.; BRITO, A. M. S. HIRUMA-LIMA, C. A.; VELEGAS, W. Constituintes químicos das cascas da Hancornia speciosa Gom. (Apocynaceae). 29º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia, 2006.
92
RODRIGUES, C. M.; RINALDO, D.; SANTOS, L. C.; et al. Metabolic fingerprinting using direct flow injection electrospray ionization tandem mass spectrometry for the characterization of proanthocyanidins from the barks of Hancornia speciosa. Rapid Communications in Mass Spectrometry, v. 21, p. 1907–1914, 2007.
RODRIGUES, V. E. G.; CARVALHO, D. A. DE. Levantamento Etnobotânico De Plantas Medicinais No Domíniodo Cerrado Na Região Do Alto Etnobotanical. Ciência e Agratecnologia, v. 25, p. 102–123, 2001.
RUIZ, P. A. et al. Quercetin inhibits TNF-induced NF-κB transcription factor recruitment to proinflammatory gene promoters inmurine intestinal epithelial cells. Journal of Nutrition. v. 137, n. 5, p. 1208-1215, 2007.
SAKLANI, A.; KUTTY, S. K. Plant-derived compounds in clinical trials. Drug discovery today, v. 13, n. 3-4, p. 161–71, 2008..
SAMPAIO, T. S. Estudo Fitoquímico de Hancornia speciosa Gomes: Isolamento, Determinação Estrutural e Atividade Biológica, 2008. 190f. Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal de Sergipe, Sergipe, 2008.
SAMPAIO, T. S.; L. NOGUEIRA, P. C. Volatile components of mangaba fruit (Hancornia speciosa Gomes) at three stages of maturity. Food Chemistry, v. 95, n. 4, p. 606–610, 2006.
SANTOS, P. O.; BARBOSA, A. M.; MÉLO, D. L. F. M.; TRINDADE, R. C. Investigação da atividade antimicrobiana do látex da mangabeira (Hancornia speciosa GOMES). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 9, n. 2, p. 108–111, 2007.
SCHMID-SCHÖNBEIN, G. W. Analysis of inflammation. Annual review of biomedical engineering, v. 8, p. 93–131, 2006.
SCOTT, A.; KHAN, K. M.; DURONIO, V. What is “inflammation”? Are we ready to move beyond Celsus? British Journal of Sports Medicine, v. 38, n. 3, p. 248–249, 2004.
SERHAN, C. N.; CHIANG, N.; DYKE, T. E. VAN. Resolving inflammation: dual anti-inflammatory and pro- resolution lipid mediators. Nature Reviews Immunology, v. 8, n. 5, p. 349–361, 2009.
SHAN, J.; FU, J.; ZHAO, Z.; et al. Chlorogenic acid inhibits lipopolysaccharide-induced cyclooxygenase-2 expression in RAW264.7 cells through suppressing NF-kappaB and JNK/AP-1 activation. International immunopharmacology, v. 9, n. 9, p. 1042–8, 2009.
SHERWOOD, E. R.; TOLIVER-KINSKY, T. Mechanisms of the inflammatory response. Best Practice and Research: Clinical Anaesthesiology, v. 18, n. 3, p. 385–405, 2004.
93
SILVA, A. K. A. Efeito antiinflamatório de fucana extraida da alga parda Spatoglossum schroederii em modelos experimentais de peritonite, choque não séptico e colite, 2011. 88f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2011.
SILVA JUNIOR, J.F.; ARAÚJO, I.A. de; BARREIRO NETO, M.; ESPÍNDOLA, A. C. de M.; CARVALHO, N.S.G. de, Recursos genéticos nos tabuleiros costeiros e baixada litorânea do nordeste. Cap.4.1. 2006.
SILVA JUNIOR, J. F. A cultura da mangaba. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 26, n. 1, 2004.
SILVA JÚNIOR, M. C. 100 Árvores do cerrado: guia de campo.Brasília: Rede de sementes do cerrado, 2005. 278p.
SILVA, T. F. DA; COELHO, M. R. R.; VOLLÚ, R. E.; et al. Bacterial community associated with the trunk latex of Hancornia speciosa Gomes (Apocynaceae) grown in the northeast of Brazil. Antonie van Leeuwenhoek, v. 99, n. 3, p. 523–532, 2011.
SIQUEIRA JR J. F. Inflamação aguda: resposta vascular e celular. In: Siqueira Jr JF, Dantas C. J. S. (eds). Mecanismos celulares e moleculares da inflamação. 1ª ed. São Paulo, SP, 2000. p.73-82.
SOARES, F. P.; PAIVA, R.; NOGUEIRA, R. C.; OLIVEIRA, L. M. de; SILVA, D. R. G.; PAIVA, P. D de O. Cultura da mangabeira (Hancornia speciosa Gomes). Boletim Agropecuário, v.67 p.1-12. Lavras, MG: UFLA. 2001.
SOSTRES, C.; GARGALLO, C. J.; ARROYO, M. T.; LANAS, A. Adverse effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs, aspirin and coxibs) on upper gastrointestinal tract. Best practice & research. Clinical gastroenterology, v. 24, n. 2, p. 121–132, 2010. Elsevier Ltd.
SUNDERKOTTER, C.; MOSSER, D.; RIDLEY, A.; SORG, C.; ROTH, J. Meeting report: molecular mechanisms of inflammation: how leukocytes come, see and seize. European Journal of Cell Biology, v. 82, n. 7, p. 379–383, 2003.
SYAM, S.; BUSTAMAM, A.; ABDULLAH, R.; et al. β Mangostin suppress LPS-induced inflammatory response in RAW 264.7 macrophages in vitro and carrageenan-induced peritonitis in vivo. Journal of ethnopharmacology, v. 153, n. 2, p. 435–45, 2014.
SZELENYI, I.; BRUME, K.. Herbal remedies for asthma treatment: between myth and reality. Drugs Today, v. 38, p. 265-303, 2002.
TANIKAWA, N.; OHMIYA, Y.; OHKUBO, H.; et al. Identification and characterization of a novel type of membrane-associated prostaglandin E synthase. Biochemical and biophysical research communications, v. 291, n. 4, p. 884–889, 2002.
94
TAYAL, V.; KALRA, B. S. Cytokines and anti-cytokines as therapeutics - An update. European Journal of Pharmacology, v. 579, n. 1-3, p. 1–12, 2008.
TRAVIS, J. Biotech gets a grip on cell adhesion. Science, v. 260, n. 5110, p. 906–908, 1993.
VIEGAS JR., C.; BOLZANI, V.S.; BARREIRO, E.J. Os produtos naturais e a química medicinal moderna. Química Nova, v. 29, p.326-337, 2006.
VIEIRA NETO, R. D.; CINTRA, F. L. D.; LEDO, A. DA S.; et al. Sistema de produção de mangaba para os tabuleiros costeiros e baixadas litorâneas. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, EMBRAPA, p. 22, 2002.
VIGIL, S. V. G.; LIZ, R. DE; MEDEIROS, Y. S.; FRÖDE, T. S. Efficacy of tacrolimus in inhibiting inflammation caused by carrageenan in a murine model of air pouch. Transplant immunology, v. 19, n. 1, p. 25–9, 2008.
VINEGAR, R.; SCHREIBER, W.; HUGO, R. Biphasic Development of carrageenin edema in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, v. 166, p. 96–103, 1969.
WAGNER, H.; BLADT, S. Plant drug analysis: a thin layer chromatography atlas. 2nd ed. Germany: Springer, 2001. 384 p.
WAGNER, J. G.; ROTH, R. A. Neutrophil migration mechanisms, with an emphasis on the pulmonary vasculature. Pharmacological reviews, v. 52, n. 3, p. 349–374, 2000.
WHITEHOUSE, M. W. Anti-inflammatory glucocorticoid drugs: Reflections after 60 years. Inflammopharmacology, v. 19, p. 1–19, 2011.
XU, Y.; CHEN, J.; YU, X.; et al. Protective effects of chlorogenic acid on acute hepatotoxicity induced by lipopolysaccharide in mice. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society, v. 59, n. 10, p. 871–877, 2010.
YASEEN, G.; AHMAD, M.; SULTANA, S.; SULEIMAN, A. Ethnobotany of Medicinal Plants in the Thar Desert ( Sindh ) of Pakistan. Journal of Ethnopharmacology, 2015.
YOON, S.-Y.; KWON, Y.-B.; KIM, H.-W.; et al. Intrathecal neostigmine reduces the zymosan-induced inflammatory response in a mouse air pouch model via adrenomedullary activity: involvement of spinal muscarinic type 2 receptors. Neuropharmacology, v. 49, n. 3, p. 275–282, 2005.
ZARBOCK, A.; LEY, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation, v. 16, n. 1, p. 31–42, 2009.
95
ZHANG, J.-M.; JIANXIONG, A. Cytokines, Inflammation and Pain. International Anesthesiol Clinical, v. 45, n. 2, p. 27–37, 2007.
ZHANG, X.; HUANG, H.; YANG, T.; et al. Chlorogenic acid protects mice against lipopolysaccharide-induced acute lung injury. Injury, v. 41, n. 7, p. 746–52, 2010
ZUCOLOTTO, S. M.; GIORDANI, R. B. Roteiro para aulas práticas, Disciplina
de Farmacognosia, Curso de Farmácia, Departamento de Farmácia, UFRN,
2013.
96
PRODUÇÕES CIENTÍFICAS
Artigo de Mestrado submetido como autora
ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY OF AQUEOUS EXTRACT, RUTIN AND
CHLOROGENIC ACID IDENTIFIED FROM THE FRUITS OF Hancornia
speciosa Gomes (APOCYNACEAE)
Manoela Torres-Rêgo1, Mariana Angélica Oliveira Bitencourt1, Allanny Alves
Furtado1, Maira Conceição Jerônimo de Souza Lima1, Rafael Caetano Lisbôa
Castro de Andrade1, Thaciane da Cunha Soares3, Eduardo Pereira de
Azevedo2, José Carlos Tomaz4, Norberto Peporine Lopes4, Arnóbio Antônio da
Silva Júnior1, Silvana Maria Zucolotto3, Matheus de Freitas Fernandes-
Pedrosa1.
1 Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica, Departamento de Farmácia, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil. 2 Laboratório de Farmacotécnica, Departamento de Farmácia, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil. 3 Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil. 4 Núcleo de Pesquisas em Produtos Naturais e Sintéticos, Departamento de Física e Química, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil.
Correspondence
Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa, Laboratório de Tecnologia e
Biotecnologia Farmacêutica, Departamento de Farmácia, Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, Av. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, Petrópolis,
Natal, RN, Brasil. E-mail: [email protected] Phone: +55 84 3342-9820.
97
Artigo Publicado como co-autora
98
Artigo Submetido como co-autora
Aspidosperma pyrifolium HAS ANTI-INFLAMMATORY PROPERTIES: AN
EXPERIMENTAL STUDY IN MICE WITH INDUCED PERITONITIS BY Tityus
serrulatus VENOM AND CARRAGEENAN-INDUCED PERITONITIS
Maíra Conceição Jerônimo de Souza Lima1, Mariana Angélica Oliveira
Bitencourt1, Allanny Alves Furtado1, Manoela Torres do Rêgo1, Emerson
Michell da Silva Siqueira2, Hugo Alexandre Oliveira Rocha3, Ruth Medeiros
Oliveira3, Keyla Borges Ferreira Rocha4, Denise V. Tambourgi5, Arnóbio
Antônio da Silva-Júnior1, Silvana Maria Zucolotto2, Matheus de Freitas
Fernandes-Pedrosa1
1 Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia Farmacêutica, Departamento de
Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.
2 Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia, Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.
3 Laboratório de Biotecnologia de Biopolímeros Naturais, Departamento de Bioquímica,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.
4 Laboratório de Patologia, Departamento de Patologia, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, Natal, RN, Brasil.
5 Laboratório de Imunoquímica, Instituto Butantan, São Paulo, SP, Brazil.
Correspondence
Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa, Laboratório de Tecnologia e
Biotecnologia Farmacêutica, Departamento de Farmácia, Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, Av. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, Petrópolis,
Natal, RN, Brazil. E-mail: [email protected] Phone: +55 84 3342 9820