AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES HIGIÊNICO-SANITÁRIAS DE INDÚSTRIA DE PESCADO NO ESTADO DO RIO DE

JANEIRO E ASPECTOS RELATIVOS À CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILMES BACTERIANOS.

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PESQUISA E MONITORAMENTO DE PRODUTOS PARA SAÚDE

NITERÓI 2014

KELLY FERNANDA CAMPOS JOSÉ

KELLY FERNANDA CAMPOS JOSÉ

AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES HIGIÊNICO-SANITÁRIAS DE INDÚSTRIA DE PESCADO NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO E ASPECTOS RELATIVOS À

CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILMES BACTERIANOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre. Área de Concentração: Pesquisa e Monitoramento de Produtos para Saúde.

Orientadora: Profa. Dra. LUCIANA MARIA RAMIRES ESPER

Co-orientadora: Profa. Dra. ALICE GONÇALVES MARTINS GONZALEZ

NITERÓI

2014

KELLY FERNANDA CAMPOS JOSÉ

AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES HIGIÊNICO-SANITÁRIAS DE INDÚSTRIA DE PESCADO NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO E ASPECTOS RELATIVOS À

CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILMES BACTERIANOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre. Área de Concentração: Pesquisa e Monitoramento de Produtos para Saúde.

Aprovada em 24 de fevereiro de 2014.

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. LUCIANA MARIA RAMIRES ESPER - Orientadora Universidade Federal Fluminense - UFF

Prof. Dr. ZANDER BARRETO MIRANDA Universidade Federal Fluminense - UFF

Profa. Dra. KAREN SIGNORI PEREIRA Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ

Niterói 2014

AGRADECIMENTOS

À Deus em primeiro lugar, pela minha existência, por me dar condições

físicas, mentais e emocionais, permitindo- me em vida, atingir as metas que busquei,

com muito esforço e dedicação, como a etapa que ora se concretiza, a busca do

Título de Mestre;

À minha mãe Marlene Campos e ao meu tio José Campos, exemplos de

caráter, dignidade e princípios, a quem me orgulho e agradeço pela educação,

carinho e por me incentivarem sempre a seguir em frente, independente das

dificuldades;

Ao meu namorado, Rafael Xavier, por todo amor, amizade, dedicação,

confiança e, sobretudo, pela paciência inesgotável, durante meus muitos momentos

de estresse, sempre tentando me confortar nas situações mais difícies. Mais do que

me incentivar, você fez parte desta conquista, que não é só minha, é nossa. Muito

obrigada por seus apoios psicológico e emocionais ao longo de todo o trabalho, e

principalmente na etapa final, assim como seus conhecimentos técnicos, que

certamente foram primordiais para que esse trabalho existisse. MUITO OBRIGADA

POR FAZER PARTE DA MINHA VIDA! TE AMO!

À minha orientadora, professora Dra. Luciana Maria Ramires Esper, pela

amizade, compreensão, paciência, discussões, ensinamentos e risadas. Com

certeza foi mais fácil concluir esta etapa com a sua ajuda;

À minha co-orientadora, professora Dra. Alice Gonçalves Martins Gonzalez,

pela amizade e ensinamentos transmitidos;

Aos professores Geraldo e Lenise, por todos os ensinamentos ao longo de

nossos seminários, contribuindo assim para minha formação e para a construção

deste trabalho;

Aos meus amigos do mestrado e colegas de trabalho, em especial à Gabi

pelos momentos de descontração e à Thalita, pela dedicação, comprometimento e

seriedade, sempre me apoiando na execução das análises;

Ao Programa de Apoio a Planos de Reestruturação e Expansão das

Universidades Federais (REUNI) pelo auxílio financeiro;

A todos aqueles que me apoiaram, direta ou indiretamente, e me levaram ao

crescimento pessoal e profissional.

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS, p. 3

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS, p. 7

LISTA DE ILUSTRAÇÕES, p. 10

LISTA DE TABELAS, p. 11

RESUMO, p. 12

ABSTRACT, p. 13

1 INTRODUÇÃO, p. 14

2 OBJETIVOS, p. 16

2.1 OBJETIVO GERAL, p. 16

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p. 16

3 REVISÃO DE LITERATURA, p. 18

3.1 A PESCA NO BRASIL E NO MUNDO, p. 18

3.2 O PESCADO NA ALIMENTAÇÃO, p. 20

3.3 QUALIDADE DO PESCADO E PRESENÇA DE MICRORGANISMOS, p. 22

3.4 FORMAÇÃO DE BIOFILMES BACTERIANOS, p. 24

3.5 BIOFILMES BACTERIANOS NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS E SEUS

RISCOS, p. 26

3.6 PROCEDIMENTOS DE HIGIENIZAÇÃO NA INDÚSTRIA, p. 27

3.7 AÇÃO DE SANITIZANTES SOBRE BIOFILMES BACTERIANOS, p. 28

3.8 RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS, p. 29

4 MATERIAL E MÉTODOS, p. 32

4.1 AMOSTRAS E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL, p. 32

5

4.2 AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES HIGIÊNICO-SANITÁRIAS DA PLANTA, p.32

4.3 ANÁLISE DOS PONTOS CRÍTICOS E AMOSTRAGEM, p. 33

4.4 ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS, p. 34

4.4.1 Contagem de Bactérias Heterotróficas Aeróbias Mesófilas, p. 34

4.4.2 Isolamento e identificação de Salmonella spp., p. 35

4.4.2.1 Pré-enriquecimento, enriquecimento e plaqueamento seletivo, p. 35

4.4.2.2 Reações nos meios TSI e LIA, p. 36

4.4.2.3 Confirmação sorológica, p. 38

4.4.3 Contagem de Staphylococcus coagulase positiva, p. 38

4.4.3.1 Provas confirmatórias, p. 39

4.4.4 Contagem de coliformes totais e Escherichia coli, p. 40

4.4.4.1 Interpretação e contagem, p. 41

4.4.4.2 Teste de sensibilidade a antimicrobianos, p. 42

4.4.5 Isolamento e identificação de Listeria spp., p. 43

4.4.5.1 Interpretação e contagem, p. 44

4.4.5.2 Provas bioquímicas, p. 46

4.4.6 Pesquisa de Bacillus cereus, p. 48

4.4.6.1 Caracterização de Bacillus cereus, p. 48

4.5 PREPARO DOS CUPONS DE AÇO INOXIDÁVEL, p. 49

4.6 FORMAÇÃO DE BIOFILMES EM SUPERFÍCIE DE AÇO INOXIDÁVEL, p. 50

4.7 DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS SÉSSEIS, p. 50

4.8 PREPARO DAS SOLUÇOES SANITIZANTES, p. 51

4.9 ANÁLISE DA EFICÁCIA DE SANITIZANTES NA REMOÇÃO DE BIOFILMES,

p. 51

4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA, p. 52

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO, p. 53

5.1 AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES HIGIÊNICO-SANITÁRIAS DA PLANTA, p. 53

5.2 ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS, p. 55

5.2.1 Contagem de Bactérias Heterotróficas Aeróbias Mesófilas, p. 55

5.2.2 Isolamento e identificação de Salmonella spp., p.57

5.2.3 Contagem de Staphylococcus coagulase positiva, p. 58

5.2.4 Contagem de coliformes totais e Escherichia coli, p. 59

5.2.4.1 Teste de sensibilidade a antimicrobianos, p. 61

5.2.5 Isolamento e identificação de Listeria spp., p. 62

5.2.6 Pesquisa de Bacillus cereus, p. 63

5.3 AVALIAÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME EM SUPERFÍCIE DE AÇO

INOXIDÁVEL, p. 64

5.4 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE SANITIZANTES NA REMOÇÃO DE BIOFILMES

FORMADOS, p. 68

6 CONCLUSÕES, p. 72

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p. 74

8 APÊNDICES, p. 90

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

#4 Acabamento 4

APC Ágar Padrão para Contagem

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AISI “American Iron and Steel Institute”

APHA “American Public Health Association”

ATCC “American Type Culture Collection”

NH3 Amoníaco

APPCC Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle

ANOVA Análise de Variância

AOAC “Association of Official Analytical Chemists”

BHAM Bactérias Heterotróficas Aeróbias Mesófilas

BAM “Bacteriological Analytical Manual Online”

BHI “Brain Heart Infusion”

BP Baird-Parker

BS Bismuto Sulfito

BPF Boas Práticas de Fabricação

cm centímetro

cm2 centímetro quadrado

CLSI “Clinical and Laboratory Standards Institute”

EHEC Escherichia coli Enterohemorrágica

EIEC Escherichia coli Entero-Invasiva

EPEC Escherichia coli Enteropatogênica

ETEC Escherichia coli Enterotoxigênica

EPS Exopolissacarídeo

FAO “Food and Agriculture Organization”

CO2 Gás Carbônico

g/L grama por litro 0C Grau Celsius

HE Entérico de Hektoen

LIA “Lysine Iron Agar”

log logaritmo decimal

+ mais

mais ou menos

MYP “Mannitol Yolk Polymyxin”

< menor que

mg.L-1 miligrama por litro

mL mililitro

MH Müller Hinton

N Normalidade

no número

NMP/cm2 Número Mais Provável por centímetro quadrado

OMS Organização Mundial da Saúde

p/v peso por volume

PBS “Phosphate Buffered Saline”

% porcentagem

pH potencial Hidrogeniônico

PPHO Procedimentos Padrão de Higiene Operacional

RVS Rappaport-Vassidilis Soja

RIISPOA Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem

Animal

RDC Reunião Diretiva Colegiada

SIF Serviço de Inspeção Federal

H2S Sulfeto de Hidrogênio

SRK “Swabs Rinse Kits”

TT Tetrationato

TSA Ágar Triptona de Soja

TSI “Triple Sugar Iron”

TSA-YE “Trypticase Soy Agar with Yeast Extract”

TSB “Tryptic Soy Broth”

TSB-YE “Tryptic Soy Broth with Yeast Extract”

UV Ultra-Violeta

UFC Unidade Formadora de Colônia

UFC/cm2 Unidade Formadora de Colônia por centímetro quadrado

UFC/g Unidade Formadora de Colônia por grama

UFF Universidade Federal Fluminense

VRB “Vilolet Red Bile”

v/v volume por volume

XLD Xilose Lisina Desoxicolato

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Produção de pescado (t) nacional em 2010 e 2011 discriminada por

região, p. 19

Figura 2 Representação esquemática da formação de biofilme bacteriano, p. 26

Figura 3 Fluxograma de processamento do pescado em conserva, p. 33

Figura 4 Material com suspeita de Salmonella spp. em meio TSI. p. 37

Figura 5 Coloração Gram de lâmina de Staphylococcus spp. p. 39

Figura 6 Placas Petrifilm com colônias de coliformes e Escherichia coli, p. 42

Figura 7 Placa Petrifilm com colônias de Listeria spp. p. 45

Figura 8 Galeria pré-incubação e caixa de incubação com água destilada nos

alvéolos, p. 47

Figura 9 Galerias API

– Listeria pós-incubação (A e B) e ficha dos resultados

(B), p. 48

Figura 10 Colônias sugestivas de Bacillus cereus em placa de petri com MYP,

p.49

Figura 11 Percentuais de não-conformidades dos grupos de itens avaliados

segundo lista de verificação aplicada à indústria, p. 53

Figura 12 Evolução da população de células sésseis de Escherichia coli isoladas

de superfície de equipamentos sobre cupons de aço inoxidável AISI

304 # 4, p. 65

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Resultados das análises bacteriológicas de amostras de superfície em

indústria de pescado para: Bactérias Heterotróficas Aeróbias Mesófilas (BHAM),

Stapylococcus coagulase positiva (Staphy. C+), Salmonella spp. (Salm.), Escherichia

coli (EC), Listeria spp. (List.) e Bacillus cereus (BC), p. 101

Tabela 2 Perfil de susceptibilidade das cepas de Escherichia coli isoladas em

superfície de equipamentos frente aos antimicrobianos, p. 102

Tabela 3 Percentual de classificação do comportamento das cepas de

Escherichia coli isoladas frente aos antimicrobianos testados, p. 103

Tabela 4 Formação de biofilme por cepa controle e cepas de E. coli isoladas de

superfícies de equipamentos sobre cupons de aço inoxidável AISI 304 #4, p. 65

Tabela 5 Efeito da aplicação de sanitizantes sobre biofilmes de E. coli (EED1)

formados em cupons de aço inoxidável AISI 304 #4 a partir de ponto amostrado em

indústria de pescado, p. 69

Tabela 6 Efeito da aplicação de sanitizantes sobre biofilmes de E. coli (EED2)

formados em cupons de aço inoxidável AISI 304 #4 a partir de ponto amostrado em

indústria de pescado, p. 69

Tabela 7 Efeito da aplicação de sanitizantes sobre biofilmes de E. coli (EED3)

formados em cupons de aço inoxidável AISI 304 #4 a partir de ponto amostrado em

indústria de pescado, p. 70

RESUMO

O pescado é um alimento de excelente valor nutritivo devido às suas vitaminas,

proteínas e ácidos graxos insaturados, no entanto, pode veicular uma variedade de

microrganismos patogênicos ao homem, aumentando a preocupação com a

qualidade sanitária. Nesse contexto, a formação de biofilme na indústria de

alimentos representa uma preocupação por sua potencialidade em resistir a

tratamentos sanitizantes, além da possibilidade de perda da qualidade por

deterioração e/ou veiculação de patógenos, justificando assim, a importância de uma

correta higienização na indústria. Neste estudo objetivou-se identificar

microrganismos presentes nas superfícies de processamento de pescado, assim

como avaliar a capacidade de formação de biofilmes bacterianos em equipamentos

e sinalizar maneiras de evitar sua formação. Para tal, foi realizada a avaliação de

superfícies através do método “swab”, com coleta de amostras das superfícies do

tanque de lavagem, esteira de evisceração e descabeçamento e tanque de

armazenamento de molho de cobertura, em uma indústria de pescado do Estado do

Rio de Janeiro, através de três visitas aleatórias realizadas em diferentes meses do

ano. As referidas amostras foram encaminhadas sob refrigeração para o Laboratório

de Higiene e Microbiologia de Alimentos da Faculdade de Farmácia – UFF, onde

foram processadas conforme métodos e recomendações oficiais. Em relação aos

resultados foram constatadas não conformidades na lista de verificação, com

situação mais crítica observada no item manipuladores. Na análise bacteriológica

evidenciou-se elevadas contagens de bactérias heterotróficas aeróbias mesófilas,

presença de Salmonela spp., Listeria spp., Bacillus spp., coliformes totais e

Escherichia coli. Demonstrou-se capacidade de formação de biofilme por cepas de

E. coli isoladas nas três visitas realizadas. Na avaliação da eficácia de sanitizantes

de uso industrial, foram observados melhores resultados na exposição à biguanida

polimérica e taxas elevadas de resistência ao quaternário de amônio. Diante dos

resultados, constatou-se ausência de condições higiênico-sanitárias adequadas e

circunstâncias propícias para formação de biofilmes bacterianos.

Palavras chave: pescado, biofilme, superfície, contaminação e sanitizantes.

ABSTRACT

Fish is a food of great nutricional value due to their vitamins, proteins and

unsaturated fatty acids, however, can convey a variety of pathogenic microorganism

to man increasing the concern about ensuring health standards. In this context, the

formation of biofilms in the food industry represent a preoccupation because of its

potencial to resist sanitizing treatments, besides the possibility of causing quality loss

due to deterioration and/or transmission of pathogens, justifying the importance of

proper hygiene in industry. This study aimed to identify microorganisms present on

the surfaces of fish processing and assess the ability of formation of microbial

biofilms on equipament and to signal ways to avoid their formation. In this sense, the

evaluation of surfaces contact was performed from samples collected on the surfaces

of the washing tank, gutting and beheading mat and of storing tank coverage sauce,

at seafood industry in a state of Rio de Janeiro, through three randomized visits in

different months of the year. These samples were sent under refrigeration to the

Laboratory of Food Microbiology and Hygiene, Faculty of Pharmacy – UFF, which

were processed by methods and official recommendations. Regarding the results,

non-conformities were found by checklist, with more critical situation in the item

handlers. Bacteriological analysis revealed a high count of aerobic mesophilic,

presence of Salmonella spp., Listeria spp., Bacillus spp., total coliforms and

Escherichia coli. It was demonstrated ability of biofilm formation by strains of E.coli

isolated in three visits. In evaluating the effectiveness of sanitizers industrial use was

observed better results in exposure to polymeric biguanide and high rates resistance

to quaternary ammonium. Considering the results, it has been found a lack of

adequate sanitary conditions and circumstances conducive to the formation of

bacterial biofilms.

Keywords: fish, biofilm, surface, contamination and sanitizers.

14

1 INTRODUÇÃO

Entende-se por pescado tudo aquilo que pode ser retirado de águas

oceânicas ou interiores e que possa ser usado na alimentação humana. É um termo

genérico, envolvendo peixes, crustáceos, moluscos, anfíbios, quelônios e mamíferos

de água doce ou salgada (BRASIL, 2007; BARROS, 2003).

Como qualquer alimento, o pescado possui suas características próprias de

sabor, cor, odor, e aparência. Os microrganismos em geral utilizam os alimentos

como fonte de nutrientes para seu crescimento e podem desta forma promover

alterações significativas em tais características. Dependendo da alteração causada,

o alimento pode ser rejeitado pelo consumidor devido às mudanças ocorridas,

somando-se ainda, à possibilidade de causar intoxicações (FRAZIER; WESTHOFF,

1993).

Muitas contaminações ou recontaminações ocorrem em indústrias de

diferentes tipos de alimentos, grande parte está diretamente relacionada com a

formação de biofilmes nas linhas de processamento, com envolvimento de muitos

microrganismos (HAUN, 2004).

Nas mais diversas indústrias de processamento de alimentos, microrganismos

aderidos à superfícies que entram em contato direto ou indireto com alimentos já

foram identificados, como: Salmonella spp., Campylobacter spp., Yersinia

enterocolitica, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas

aeruginosa, P. fragi, Micrococcus spp., Enterococcus faecium e Bacillus cereus

(HOOD; ZOTTOLA, 1995).

Dentre vários microrganismos isolados em diferentes indústrias de

processamento de pescado, grande parte apresentou capacidade de formação de

biofilme, como bactérias do grupo das enterobactérias, Pseudomonas spp. e

Staphylococcus spp. (BAGGE-RAVN et al., 2003).

Do ponto de vista da segurança dos alimentos e da sua deterioração, os

biofilmes são importantes devido à possibilidade de sua formação em alimentos,

utensílios e superfícies, e à dificuldade encontrada em sua remoção. Se formados

em materiais da linha de produção da indústria de alimentos, podem acarretar risco

à saúde do consumidor e prejuízo financeiro à indústria (FLACH et al., 2005).

15

Diante do exposto, este trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar as

condições higiênico-sanitárias de uma indústria de pescado, localizada no Estado do

Rio de Janeiro, isolar e identificar microrganismos das superfícies de determinados

equipamentos da linha de produção e a sua capacidade de formação de biofilmes,

pontuando sobre suas consequências, relacionadas às perdas econômicas da

matéria-prima e aos agravos e riscos ao consumidor. Nesse âmbito, realizou-se

também a análise da resistência de bactérias formadoras de biofilmes a

antimicrobianos e avaliação da eficiência de sanitizantes de uso industrial na

remoção de biofilmes formados, visando obter um produto com qualidade e

segurança ao consumidor.

16

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O trabalho pretendeu avaliar as condições higiênico-sanitárias de uma

indústria de pescado e identificar a presença de microrganismos em superfícies de

determinados equipamentos da linha de produção, bem como a possibilidade destes

formar biofilmes em cupons de aço inoxidável, material amplamente empregado na

fabricação de utensílios destinados à indústria alimentícia. Nesse âmbito, realizou-se

também análise da resistência de bactérias formadoras de biofilmes frente a

antimicrobianos e avaliação da eficiência de dois tipos de sanitizantes industriais

(biguanida polimérica e quaternário de amônio), pretendendo-se com isso sinalizar o

risco da presença de biofilmes bacterianos na indústria de alimentos e sugerir

formas de minimizar e/ou evitar sua formação em tais ambientes.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar as condições higiênico-sanitárias da indústria de pescado em estudo,

através de “checklist” baseado no Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de

Produtos de Origem Animal (R.I.I.S.P.O.A.) (BRASIL, 2007) e nas circulares nº 175

(BRASIL, 2005a), nº 176 (BRASIL, 2005b) e nº 25 (BRASIL, 2009).

Realizar análise da superfície de determinados equipamentos da linha de

produção que entram em contato direto com alimento e identificar microrganismos

presentes, de acordo com o padrão estabelecido pela Reunião Diretiva Colegiada

(RDC) nº 12 (BRASIL, 2001) para Salmonella spp. e Staphylococcus coagulase

positiva, além de Listeria spp., coliformes totais e Escherichia coli, Bacillus cereus e

bactérias heterotróficas aeróbias mesófilas.

17

Avaliar em diferentes tempos a capacidade dos microrganismos isolados formar

biofilme, utilizando como corpo de prova o aço inoxidável AISI 304 (#4).

Avaliar a resistência de bactérias formadoras de biofilmes frente a

antimicrobianos.

Avaliar a eficiência de sanitizantes industriais (biguanida polimérica e quaternário

de amônio) de amplo uso na indústria alimentícia, sob a persistência dos biofilmes

formados pelos microrganismos isolados, em diferentes tempos.

18

3 REVISAO DE LITERATURA

3.1 A PESCA NO BRASIL E NO MUNDO

A pesca é considerada uma das atividades econômicas mais antigas e

importantes do Brasil, se fazendo presente desde o período colonial e estando entre

as quatro maiores fontes de proteína consumida (SANTOS, 2006).

Até a década de 60, a atividade pesqueira no Brasil era predominantemente

artesanal e sua produção voltada basicamente para o mercado interno. A partir de

então, através de uma política de incentivos fiscais à pesca, desenvolveu-se a

chamada pesca industrial, voltada preferencialmente, para o mercado externo

(FINCO; ABDALLAH, 2000).

Estimativas datadas do ano de 2003 revelaram que o parque industrial das

atividades pesqueiras nacionais era composto por cerca de 25.000 barcos, dos

quais, aproximadamente 2.000 formavam a frota industrial e o restante da frota

destinada à pesca artesanal ou para pesca de pequena escala (IBAMA, 2003).

Segundo dados do Registro Geral da Atividade Pesqueira (RGP), o número

de brasileiros, homens e mulheres, que se dedicam diretamente à produção primária

de peixe em captura ou aquicultura atingiu, em 2010, um total de 853.213 mil,

estando concentrado na região nordeste o maior número de pescadores

profissionais, representando 43,7% do total do país (BRASIL, 2011).

Considerando-se que a pesca nacional é uma das poucas atividades que

absorve mão-de-obra de baixa ou nenhuma qualificação, quer seja de origem

urbana ou rural (sendo em alguns casos a única oportunidade de emprego para a

população excluída), demonstra que a pesca é um componente fundamental para a

socioeconomia brasileira (IBAMA, 2003).

A produção de pescado nacional para o ano de 2011 foi de 1.431.974

toneladas, registrando-se um incremento de aproximadamente 13,2% em relação a

2010. A pesca extrativa marinha continuou sendo a principal fonte de produção de

pescado nacional, responsável por 38,7% do total de pescado, sendo o grupo dos

peixes o que apresentou uma maior produção total (87%). Dentre as espécies que

19

apresentaram maior volume de captura estão: a sardinha-verdadeira (Sardinella

brasiliensis), seguida pela corvina (Micropogonias furnieri), pescada-amarela

(Cynoscion acoupa) e bonito-listrado (Katsuwonus pelamis) (BRASIL, 2011).

A região nordeste foi, novamente em 2011, responsável pela maior produção

de pescado do país, com 454.216 toneladas, respondendo por 31,7% da produção

nacional. Logo em seguida vieram as regiões sul, norte, sudeste e centro-oeste,

nesta mesma ordem, registrando 23,5%, 22,8%, 15,8% e 6,2% da produção

nacional, respectivamente, conforme Figura 1. Entretanto, na análise por Unidade da

Federação, o Estado de Santa Catarina continua sendo o maior pólo produtor de

pescado do Brasil, com 194.886 toneladas, seguido pelos estados do Pará com

153.332 toneladas e Maranhão com 102.868 toneladas, ficando o Estado do Rio de

Janeiro em 7º lugar, com 86.218 toneladas (BRASIL, 2011).

FIGURA 1: Produção de pescado (t) nacional em 2010 e 2011

discriminada por região. Fonte: BRASIL, 2011.

A produção mundial de pescado (proveniente tanto da pesca extrativa quanto

da aquicultura) atingiu aproximadamente 168 milhões de toneladas em 2010, sendo

a China o maior país produtor, com aproximadamente 63,5 milhões de toneladas,

seguida pela Indonésia, Índia e Japão. O Brasil, neste contexto, contribuiu com

1.264.765 toneladas, representando 0,75% da produção mundial de pescado,

ocupando assim o 19° lugar no ranking geral dos maiores produtores de pescado do

mundo (FAO, 2011).

Segundo estudos estatísticos, no ano de 2011 os principais mercados

importadores de pescado do Brasil foram os Estados Unidos, tanto em volume

quanto em valor, seguido pela Espanha e Japão, respectivamente, enquanto que os

20

nossos principais fornecedores internacionais de pescado foram o Chile, seguido

pela China e a Noruega, que caiu uma posição em relação a 2010 (BRASIL, 2011).

Os principais produtos importados pelo Brasil em 2011 foram o bacalhau

(gênero Gadus), proveniente principalmente da Noruega, filés congelados oriundos

da China, Argentina, Chile e Vietnã, salmão vindo do Chile, conservas de pescado

proveniente do Equador, Tailândia, Argentina e Peru, e sardinhas oriundas do

Marrocos e Holanda, cujo produto apresenta bom preço de venda, sendo os maiores

volumes direcionados para o abastecimento da indústria de conservas (BRASIL,

2011).

3.2 O PESCADO NA ALIMENTAÇÃO

O peixe é uma excelente fonte de proteína animal e de outros nutrientes

essenciais, representando um valioso complemento nas dietas pobres em vitaminas

e minerais essenciais. A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda o

consumo per capita de 12 quilos de peixe por habitante por ano. A média global de

consumo é de 18 quilos por ano; porém, a média da América Latina é de apenas 9

quilos por ano. Segundo dados da “Food and Agriculture Organization” (FAO) em

2013, o consumo per capita aumentou de 4 quilos por ano para 9 quilos por ano nos

últimos 8 anos, devido a políticas e campanhas adotadas para incentivar o consumo.

Neste sentido, espera-se que até 2030 este consumo deva alcançar 20 quilos por

pessoa por ano (ONUBR, 2013).

De acordo com dados da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

(EMBRAPA, 2013), o consumo de pescado no Brasil é bastante variado e com

grande potencial a ser desenvolvido: na região Norte, especificamente no Estado do

Amazonas, o consumo por pessoa é de 54 quilos por ano, já no Rio de Janeiro é de

16 quilos por pessoa por ano, enquanto a média brasileira está ao redor de 6 quilos

por pessoa por ano, bastante baixa quando comparado aos países europeus e

americanos. Contudo, há uma tendência de aumento do consumo, principalmente,

através de produtos beneficiados/industrializados, tais como filés e empanados.

21

Ogawa e Maia (1999) descreveram que o peixe constitui a base da dieta de

diversos grupos populacionais, pois apresenta uma concentração de protídeos

comparável ao ovo, à carne e ao leite.

Diversos elementos químicos são encontrados no tecido do pescado, dentre

eles: o potássio, cálcio, zinco, sódio e fósforo. O pescado também é rico em

vitaminas hidrossolúveis do complexo B, porém, destacando-se como majoritárias as

vitaminas lipossolúveis A e D (HUSS, 1999; OGAWA; MAIA, 1999; SANTOS, 2006).

De acordo com Kinsella (1988) os peixes contêm níveis de proteínas de 17 a

25%, sendo estas altamente digeríveis, pois contêm quantidades mínimas de tecido

conjuntivo. Também são ricas em metionina e lisina, possuindo ainda, um excelente

teor de outros aminoácidos essenciais, que podem variar de acordo com a espécie.

A quantidade de tecido conjuntivo presente nos peixes apresenta relação inversa

com o teor de gordura, logo, os peixes considerados magros são os que apresentam

maior digestibilidade. Esta classificação do valor calórico dos peixes é baseada no

teor de gordura presente, classificando-os assim em peixes magros (com menos que

1% de gordura); semi-gordos (com 7% a 8 % de gordura) e gordos (com mais de

15% de gordura) (LEDERLE, 1991).

A carne do peixe é constituída principalmente por água, proteína e lipídios. O

teor de umidade da carne do pescado fresco está diretamente relacionado à

quantidade de lipídios, uma vez que a concentração de proteínas é praticamente

constante. Os peixes magros apresentam um alto teor de umidade, enquanto os

gordurosos possuem uma quantidade menor, que pode ser inferior a 58%

(FAO,1997).

Diversos fatores podem contribuir para a grande variedade na composição da

parte comestível dos peixes, tais como: espécie, sexo e grau de maturidade sexual,

tamanho e local de captura (BADOLATO et al., 1994).

De acordo com Huss (1999) a fração lipídica é o conteúdo que mais

apresenta variação entre as espécies de pescado (0,2% - 25%), sendo os lipídios de

peixes caracterizados pelo elevado grau de insaturação de seus ácidos graxos,

podendo em função disto apresentar alterações degradativas, como ranço

oxidativo/hidrolítico, quando se tem início a deterioração microbiana. Alguns

exemplos de peixes gordurosos e de fácil oxidação são as sardinhas, tainhas e

tunídeos (NUNES, 1994).

22

Segundo Pigott e Tucker (1987), os lipídios de alimentos marinhos possuem

baixa quantidade total de óleos saturados, que favorece a formação do colesterol do

tipo “Low Density Lipoprotein” - LDL (lipoproteína de baixa densidade), variando sua

concentração de 11 à 17%, enquanto em carne de suínos a proporção é, em média,

de 36% e em bovinos de 48%.

Além de fonte energética, os lipídios são ricos em ácidos graxos, apresentam

20 a 22 átomos de carbono, altamente insaturados, destacando-se o

eicosapentaenóico (EPA) e o docosahexaenóico (DHA), da série ômega-3, os quais

não ocorrem em outros animais em quantidades além de traços. A estes ácidos são

atribuídos vários efeitos benéficos, como a capacidade de reduzir o risco de doenças

coronarianas, além de outros efeitos imunológicos e antiinflamatórios, principalmente

no caso de asma, artrite reumatóide e autoimunidade. Tais efeitos são resultantes

da capacidade destes ácidos reduzirem o teor de lipídeos séricos, formando

compostos eicosanóides, que possuem ação direta sobre a fisiologia do sistema

vascular (KINSELLA et al., 1990; OGAWA; MAIA, 1999).

3.3 QUALIDADE DO PESCADO E PRESENÇA DE MICRORGANISMOS

De acordo com Huss (1998), a qualidade do produto pode se referir à

aparência e frescor ou ao grau de deterioração do mesmo. Também pode estar

relacionada a aspectos de segurança, tais como: ausência de parasitas, bactérias

patogênicas ou compostos químicos.

Um dos parâmetros mais importante a ser avaliado na qualidade do pescado

é o frescor, uma vez que as características sensoriais do pescado são facilmente

visualizadas pelos consumidores, sendo o frescor responsável por fornecer a melhor

ideia de aceitação do consumidor (CONNEL, 1988).

Para Farias e Freitas (2008) o pescado pode albergar e ter multiplicada a sua

microbiota inicial ou mesmo ser contaminado, em qualquer um dos segmentos da

cadeia produtiva. Por isso, a legislação sanitária impõe limites à presença de

microrganismos patogênicos e/ou deteriorantes, para garantir a segurança dos

alimentos e a qualidade deste tipo de alimento ao consumidor.

23

No Brasil, a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 12, de 2 de janeiro de

2001, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), estabelece nos itens 7,

20 e 22 os padrões microbiológicos para o pescado e produtos derivados, bem como

os limites microbiológicos para alimentos expostos à comercialização (BRASIL,

2001).

A contaminação microbiológica dos alimentos é uma preocupação em muitos

países, especialmente devido aos elevados índices de doenças veiculadas por

alimentos crus, mal-preparados e conservados de forma inadequada. O local de

preparo ou armazenamento do alimento, quando contaminado por bactérias

patogênicas, pode acarretar em uma fonte de contaminação cruzada. Visando

minimizar tal risco ao consumidor, as atividades de controle da qualidade do

pescado iniciam-se na avaliação de fornecedores, concepção do sistema de

qualidade, atividades de inspeções, avaliações nas operações de produção ou de

prestação de serviços, incluindo atividades de treinamento geral e específico do

pessoal (ARRUDA, 2002).

Um alimento produzido ou manipulado em condições precárias de higiene

pode oferecer risco à saúde de quem o ingere. Alguns microrganismos que podem

contaminar o alimento são patogênicos causando doenças em seu hospedeiro,

outros não causam enfermidade nos seres humanos, mas são indicativos de

condições higiênicas inadequadas. Além disso, alguns microrganismos fazem parte

da microbiota natural de peixes, mas, se ingeridos pelo homem, podem ocasionar

doenças (BASTI et al., 2006).

Segundo Albuquerque et al. (2006) o pescado pode ser contaminado como

consequência direta da manipulação inadequada do mesmo. Dentre os

microrganismos que merecem destaque encontram-se os Staphylococcus spp.,

presente nas mucosas, superficies da pele e trato intestinal de mamíferos e, que

encontra no pescado, ambiente favorável para sua multiplicação. Algumas cepas de

Staphylococcus spp. são produtoras de enterotoxina termoestável e responsáveis no

homem por quadros de intoxicação alimentar (FRANCO;LANDGRAF, 2003).

Espécies de Salmonella spp. estão amplamente distribuídas na natureza,

sendo o principal reservatório natural o trato intestinal de mamíferos, pássaros e

répteis. Tais cepas podem alcançar o ambiente aquático através de contaminação

fecal e então, serem detectadas em peixes e produtos pesqueiros (FRANCO;

LANDGRAF, 2003). Nesse contexto, a ingestão de peixe in natura tem sido

24

responsável por quadros de gastroenterite em humanos, tendo como principal

responsável a Salmonella spp. (HATHA; LAKSHMANAPERUMALSAMY, 1997).

A presença de coliformes termotolerantes nos peixes frescos ou congelados e

produtos industrializados, está, em sua maioria, relacionada à qualidade da água

utilizada na fabricação do gelo, utilizado para conservação e/ou com os

procedimentos inadequados de higiene pós-captura (HUSS et al., 2000; HSU et al.,

2009).

Entre os mais importantes microrganismos causadores de infecções

alimentares destaca-se a presença de Listeria monocytogenes, agente causador da

listeriose, doença grave que pode levar ao aborto e a problemas neurológicos

(Painter; Slutsker, 2007). A presença de L. monocytogenes já foi detectada em

diversos alimentos, tanto de origem animal quanto vegetal, e já foi isolada também

na linha de processamento de superfícies que entram direta ou indiretamente em

contato com o alimento e de manipuladores de alimento (DESTRO, 2000).

Outros agentes bacterianos podem, também, contaminar o pescado e causar

risco à saúde. Cepas psicrotróficas de Bacillus cereus produzem enterotoxinas nos

preparados de peixe, acarretando surtos de diarréia. A facilidade de tais cepas em

formar esporos garante sua sobrevivência durante todas as etapas de

processamento dos alimentos, exceto após tratamento em autoclave

(FRANCO;LANDGRAF, 2003).

3.4 FORMAÇÃO DE BIOFILMES BACTERIANOS

A maior parte das atividades bacterianas na natureza ocorre, não com as

células individualizadas crescendo de maneira planctônica (livres; em suspensão),

mas com as bactérias organizadas em comunidades de diferentes graus de

complexidade, associadas a superfícies diversas, geralmente compondo um

biofilme, este pode ser definido como uma comunidade de células bacterianas

embutidas em uma matriz de exopolissacarídeos produzidas por elas mesmas,

(Substâncias Poliméricas Extracelulares – EPS) aderidas a uma superfície abiótica

ou biótica (DUNNE, 2002). Para o processo de aderência bacteriana são variáveis

importantes: a espécie bacteriana, as propriedades físico-químicas da superfície de

25

adesão, fatores ambientais e a expressão de genes responsáveis pela formação do

biofilme (DUNNE, 2002; Di BONAVENTURA et al., 2008).

Os biofilmes mais comuns na natureza são heterogêneos, compostos por

duas ou mais espécies, podendo os produtos do metabolismo de uma espécie

auxiliar o crescimento das demais e a adesão de uma dada espécie fornecer

substâncias que promovem a ligação de outras. Inversamente, a competição pelos

nutrientes e a acumulação de metabólitos tóxicos produzidos pelas espécies

colonizadoras poderão limitar a diversidade de espécies num biofilme (IST, 2008).

O biofilme contém partículas de proteínas, lipídeos, fosfolipídeos,

carboidratos, sais minerais e vitaminas, entre outros, que formam uma espécie de

crosta denominada matriz, abaixo da qual, os microrganismos continuam a crescer,

formando um biofilme mono-espécie ou uma associação com outros microrganismos

(biofilme multi-espécie), aumentando assim sua proteção contra a ação de

desinfetantes, raios UV, radiação, alterações do pH e dessecação (PARIZZI et al.,

2004; VESTBY et al., 2009).

Segundo Hall-Stoodley et al. (2004) os biofilmes maduros são compostos por

microcanais internos, úteis na distribuição de nutrientes e água, no escoamento de

metabólitos, alguns potencialmente patogênicos ao homem e, enzimas

alginatoliases e protease, necessárias ao destacamento de células do biofilme.

Um biofilme maduro pode levar de algumas horas até várias semanas para

desenvolver-se, dependendo das condições de seu meio ambiente. Sendo assim,

existem na literatura várias teorias propostas para formação de biofilmes

(MEDONLINE, 2008).

A primeira teoria foi de Marshall et al. (1971), que descrevem a formação do

biofilme em duas fases: na primeira ocorre adesão do microrganismo na superfície

por forças de Van der Walls e atração eletrostática, onde o processo é ainda

reversível; na segunda etapa, ocorre a interação física da célula com a superfície por

meio de material extracelular de natureza polissacarídea ou protéica, produzida pela

bactéria, que é denominada matriz de glicocálix (ZOTTOLA, 2001). Outra teoria

propõe a divisão do processo de adesão em cinco etapas, conforme Figura 2, que

podem ser colocadas na seguinte ordem: aderência inicial à superfície (1), produção

de matriz de exopolissacarídeos (2), crescimento celular e início do desenvolvimento

do biofilme (3), maturação do biofilme (4) e dispersão das células do biofilme (5)

(MACEDO, 2006; MEDONLINE, 2008).

26

FIGURA 2: Representação esquemática da formação

de biofilme bacteriano. Fonte: LASA, 2006.

Quando o biofilme atinge uma determinada massa crítica e o equilíbrio

dinâmico é alcançado, as camadas mais externas do biofilme começam a liberar

células em estado planctônico, que podem rapidamente se dispersar e multiplicar,

colonizando novas superfícies e organizando novos biofilmes em outros locais.

Existem três tipos de processos de dispersão: expansiva, quando parte das células

de uma microcolônia sofre lise e outra retoma a motilidade, sendo então liberadas da

estrutura; fragmentação, onde porções de matriz extracelular associadas a

microrganismos são liberada, e superficial, que ocorre pelo crescimento do próprio

biofilme como um todo (KYAW, 2008).

Com a ausência de nutrientes e/ou de oxigênio ou dificuldades na sua

difusão, a diminuição do pH e acúmulo de metabólitos secundários tóxicos, inicia-se

um processo de morte celular junto à superfície e subsequente desintegração do

biofilme (IST, 2008).

3.5 BIOFILMES BACTERIANOS NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS E SEUS RISCOS

A contaminação dos alimentos por microrganismos patogênicos e

deteriorantes durante seu processamento tem despertado grande preocupação para

Saúde Pública. A contaminação de equipamentos nas indústrias de alimentos foi um

27

dos fatores relevantes em 59% dos surtos de doenças de origem alimentar

investigados na França em 2001 (MIDELET; CARPENTIER, 2004).

Na indústria de alimentos, a colonização das superfícies onde se processam

os alimentos pode ocasionar vários problemas, tanto de ordem econômica como de

saúde pública. No ponto de vista econômico, as bactérias deteriorantes podem

contaminar produtos alimentícios, alterando suas características e levando a perdas

econômicas, entretanto, o risco à saúde pública é considerado um problema mais

grave, pois o biofilme pode ser fonte de contaminação crônica e veicular

microrganismos patogênicos (CAIXETA, 2008).

Segundo Zottola (2001) especialistas sugerem que a maioria dos surtos,

cujos agentes etiológicos são veiculados por alimentos, parece estar associado a

biofilmes e justificam tal teoria com o fato dos surtos serem esporádicos, e não

contínuos, assim como somente algumas porções dos produtos estarem

contaminadas.

Na indústria de alimentos os biofilmes podem se acumular em uma variedade

de substratos, por exemplo: aço inoxidável, vidro, borracha, polipropileno, entre

outros. Convém ressaltar que o biofilme, quando submetido ao calor, pode cristalizar

e formar depósitos ou crostas que são muito aderentes, protegendo novos

microrganismos e dificultando ainda mais os procedimentos de higiene (PARIZZI et

al., 2004).

Uma vez formados, os biofilmes são de difícil remoção das superfícies de

indústrias de alimentos devido a produção de substâncias poliméricas extracelulares

e pelas dificuldades associadas à limpeza de complexos equipamentos e ambiente

de processamento, transformando-se assim em potenciais fontes de contaminação

(WONG, 1998; PARIZZI et al., 2004; MACEDO, 2006).

3.6 PROCEDIMENTOS DE HIGIENIZAÇÃO NA INDÚSTRIA

Após o processamento, os equipamentos, utensílios, pisos, paredes e o

ambiente de maneira geral, na indústria de alimentos apresentam elevada carga de

resíduos com alto valor nutritivo, já que resulta de uma mistura de carboidratos,

gordura, proteínas e minerais. Tais resíduos orgânicos e minerais capazes de

28

suportar o crescimento de microrganismos devem ser removidos das superfícies

antes da aplicação dos agentes sanificantes. Por isso, fica claro que os

procedimentos de higienização na indústria de alimentos devem ser efetuados em

duas etapas distintas: a limpeza e a sanificação (ANDRADE; MACÊDO, 1996).

O objetivo primordial da limpeza é a remoção de resíduos orgânicos e

minerais das superfícies, constituídos principalmente por gorduras e sais minerais. A

sanificação visa à redução dos microrganismos a níveis consideráveis seguros,

utilizando para isso produtos denominados sanificantes (MACEDO; BARRA, 2002).

A limpeza e a desinfecção são consideradas as operações mais importantes

na indústria de alimentos. Diversos casos de alterações dos produtos alimentícios e

de contaminação inaceitável por microrganismos patogênicos, envolvendo custos

elevados, têm sido atribuídos à falhas ou insuficiência destes procedimentos

(BRASIL, 2007).

Para se evitar a formação de biofilmes na indústria de alimentos é necessário

a utilização de cuidados rigorosos de higienização, favorecendo assim o controle de

qualidade, viabilizando os custos de produção, satisfazendo os consumidores e não

oferecendo riscos à sua saúde e, respeitando as normas e padrões microbiológicos

estabelecidos pela legislação vigente (GERMANO; GERMANO, 2003).

3.7 AÇÃO DE SANITIZANTES SOBRE BIOFILMES BACTERIANOS

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através da portaria n0

15, de 23 de agosto de 1988, define sanitizantes ou desinfetantes como formulações

que apresentam na sua composição substâncias microbicidas que possuem efeito

letal sobre microrganismos não esporulados. Os sanitizantes mais utilizados em

superfícies de equipamentos e utensílios nas indústrias alimentícias brasileiras são

aqueles que possuem princípios ativos dos grupos: quaternários de amônio,

compostos inorgânicos liberadores de cloro ativo, compostos orgânicos liberadores

de cloro ativo, compostos à base de ácido peracético, iodo e derivados, sendo a

escolha do agente sanitizante de acordo, principalmente, com o tipo de

contaminação microbiana, bem como da natureza do equipamento a ser sanitizado

(BRASIL, 1988).

29

Para a “American Public Health Association” (APHA, 2001), agentes

sanitizantes devem eliminar as bactérias patogênicas e reduzir o número de

microrganismos deteriorantes em níveis aceitáveis, como, por exemplo, 2 unidades

formadoras de colônias (UFC)/cm2 de microrganismos aeróbios mesófilos para

superfícies de aço inoxidável ao fim do processo de higienização. Segundo Andrade

et al. (2003), muitas vezes a recomendação americana é considerada rígida para as

condições brasileiras e, por isso, alguns pesquisadores e instituições admitem

contagens de até 5,0 x 101 UFC/cm2 de superfície, valor preconizado pela

Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS) e pela Organização Mundial de

Saúde (OMS).

Inúmeras pesquisas, baseadas na redução do número de microrganismos

aderidos à superfície, após tratamento com sanitizantes químicos, têm sido

realizadas. Rossoni e Gayllarde (2000) observaram redução do número de células

de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, aderidas

sobre superfície de aço inoxidável, após tratamento com hipoclorito de sódio. Em

estudo similar Cabeça et al. (2006) verificaram redução do número de células de

Listeria monocytogenes, após tratamento com diferentes sanitizantes (quaternário

de amônio, ácido peracético e hipoclorito de sódio).

A ação dos sanitizantes pode ser afetada pelas características da superfície;

pelo tempo e pela temperatura de contato, pela concentração de uso e pelos tipos

de resíduos presentes na superfície, pelo pH, pelas propriedades físico-químicas da

água e por substâncias inativadoras, por tanto, o modo de aplicação do sanitizante é

tão importante quanto a sua seleção, pois a simples adição do produto poderá

reduzir pouco ou até mesmo não reduzir as contaminações microbiológicas,

podendo com isso agravar os problemas de contaminação cruzada do alimento e

colocar em risco à saúde do consumidor (ANDRADE, 2008).

3.8 RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS

Segundo Jay (2005), os agentes antimicrobianos são substâncias de origem

biológica e/ou sintética, que produzem toxicidade seletiva sobre os microrganismos,

sendo classificados de acordo com seu mecanismo de ação em: drogas que atuam

30

sobre a parede celular; sobre a membrana celular; que afetam a síntese protéica;

que afetam o metabolismo dos ácidos nucléicos interferindo na sua síntese e, que

interferem em alguma fase do metabolismo intermediário das bactérias (BAUER et

al., 1966).

O uso excessivo de antibióticos no tratamento de animais doentes e/ou como

medida profilática em animais produtores de alimentos, vem acelerando o

surgimento da resistência bacteriana. Tal prática é muito comum, o que favorece a

presença de resíduos de antibióticos nos alimentos e consequentemente a seleção

de bactérias resistentes, que podem ser transferidas aos humanos comprometendo

uma possível antibioticoterapia (MENG et al., 1998).

Tavares (2000) descreveu que a resistência aos antimicrobianos é um

fenômeno genético, relacionado à existência de genes contidos no microrganismo

que codificam diferentes mecanismos bioquímicos que impedem a ação das drogas.

A resistência pode ser originada em mutações que ocorrem durante seu processo

reprodutivo e resultam em erros de cópia na sequência de bases que formam o DNA

cromossômico, responsáveis pelo código genético. A outra origem da resistência é a

aquisição dos genes causadores do fenômeno, consistindo na resistência

transferível. Esta resistência faz-se através dos mecanismos de transdução,

transformação e conjugação e, frequentemente, envolve genes situados em

plasmídios e transposons.

Franco (2002) e Schroeder et al. (2002), analisando a resistência de cepas de

E. coli isoladas em carne de suíno, frente a determinados antibióticos, ressaltaram a

importância da existência de plasmídios e transposons. Estes constituem elementos

de transferência genética de uma célula para outra, capazes de se replicarem,

contribuindo para a disseminação de genes de resistência aos antimicrobianos.

Oliveira et al. (1999), ao isolarem E. coli em 100% de amostras de

hambúrguer de frango avaliadas, verificaram resistência a carbenicilina,

clindamicina, eritromocina e rifampicina, e sensibilidade a gentamicina.

Martins et al. (2003), a partir de amostras de produtos de origem animal

comercializados no estado do Ceará, isolaram 124 cepas de E. coli e analisaram o

perfil antimicrobiano frente a 11 antibióticos, sendo que aproximadamente 63%

demonstraram resistência entre dois a 11 antibióticos. A sulfonamida e a amicacina

foram os agentes que apresentaram menor e maior eficiência respectivamente. O

maior nível de resistência individual foi para a sulfonamida com 69,3%, seguida da

31

tetraciclina com 43,4%, nitrofurantoína, 42% e estreptomicina, 32%.

No caso das infecções por EPEC (Escherichia coli Enteropatogênica), os

biosorotipos mais frequentemente isolados são resistentes à maioria dos

antimicrobianos; as EIEC (Escherichia coli Entero-invasiva) são sensíveis à maioria

dos antibióticos, sendo a ampicilina o mais indicado para o tratamento e as ETEC

(Escherichia coli Enterotoxigênica) e EHEC (Escherichia coli Enterohemorrágica)

podem apresentar resistência múltipla com relativa frequência. Nesse âmbito,

quando necessária antibioticoterapia, torna-se fundamental uma seleção pelo

antibiograma, sendo o exame de eleição para tal, o teste de difusão em ágar,

conforme o “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI) (2012a). Reforçando

nesse sentido a importância de sua realização, uma vez que a sensibilidade aos

antimicrobianos dependerá muito da cepa isolada (TRABULSI; TOLEDO, 1989).

32

4 METODOLOGIA

4.1 AMOSTRAS E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

As amostras foram coletadas através do método “swab” em superfície, em

uma indústria de pescado, localizada no Estado do Rio de Janeiro, sob Serviço de

Inspeção Federal (SIF 1950), com produção diária de 150.000 latas de pescado em

conserva e 350 funcionários. A matéria-prima originária de Angra dos Reis, Cabo

Frio e/ou Maricá era transportada em monoblocos de polipropileno no interior de

caminhões refrigerados, sendo recebida resfriada, e acondicionada em gelo de

fabricação própria.

O material foi coletado através de “swabs” embebido em solução de rinsagem

tamponada fosfatada, não nutriente, adicionada de agentes neutralizantes (SRK

)

(LABORCLIN), coletado com o auxílio de delimitadores de área de amostragem, de

plástico, estéreis, com dimensões de 10 x 10 cm – 100cm2 (LABORCLIN

) e

encaminhados sob refrigeração no mesmo dia da colheita, para o laboratório de

Higiene e Microbiologia de Alimentos da Faculdade de Farmácia na Universidade

Federal Fluminense – RJ, onde foram realizadas as análises bacteriológicas no

mesmo dia da chegada das amostras.

4.2 AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES HIGIÊNICO-SANITÁRIAS DA PLANTA

Para a verificação das condições higiênico-sanitárias da indústria foi

elaborado e aplicado um “checklist” baseado no Regulamento da Inspeção Industrial

e Sanitária de Produtos de Origem Animal, R.I.I.S.P.O.A. (BRASIL, 2007), nas

Circulares nº 175 (BRASIL, 2005a), nº 176 (BRASIL, 2005b) e nº 25 (BRASIL, 2009).

Esta lista de verificação foi estruturada em 4 itens, subdivididos em 117 sub-

itens, a saber: 1) Instalações, equipamentos e edificações; 2) Manipuladores; 3)

Avaliação da produção e 4) Avaliação do armazenamento do produto final e seu

33

transporte, e estes avaliados quanto à conformidade ou não com os parâmetros

oficiais (APÊNDICE). Sua aplicação foi praticada visando à melhoria contínua do

processo produtivo e contribuindo desta forma para a oferta de alimentos seguros,

sob o ponto de vista microbiológico.

4.3 ANÁLISE DOS PONTOS CRÍTICOS E AMOSTRAGEM

Acompanhou-se todo o processamento do pescado em conserva através do

fluxograma da indústria, observando e avaliando criticamente todas as etapas do

processo, conforme Figura 3, visando identificar os pontos críticos para formação de

biofilme e a possibilidade de contaminação do produto por este.

Para essa avaliação crítica de determinação dos pontos de amostragem,

foram estudados e usados como ferramentas, legislações brasileiras vigentes e

pesquisas científicas de autores já citados anteriormente.

FIGURA 3: Fluxograma de processamento do pescado em conserva.

34

Com base nestes dados foram realizadas análises da superfície dos

equipamentos da linha de produção, sendo definidos como pontos para análise o

tanque de lavagem, a esteira de evisceração e descabeçamento e o tanque de

armazenamento de molho de cobertura.

As amostras foram coletadas após os Procedimentos Padrão de Higiene

Operacional (PPHO), ou seja, antes do início do 1º turno de trabalho e durante as

atividades do 1º turno de trabalho. Para tal, utilizou-se o método do “swab”,

considerado como metodologia-padrão para a remoção de microrganismos de

superfícies (APHA, 2001).

A coleta por “swab” foi feita umedecendo-se sua ponta com o meio de

rinsagem (SRK), retirando o excesso deste através da compressão contra as

paredes do tubo com movimentos giratórios. Em seguida, segurando o “swab” de

modo a formar um ângulo de 30º com a superfície a ser amostrada, esfregou-se sua

ponta com lentos movimentos em toda a área delimitada. A operação foi repetida por

3 vezes, invertendo os sentidos percorridos pelo “swab”, de forma a atingir toda a

área demarcada, conforme orientações do fabricante.

As amostras foram coletadas através de uma visita aleatória por mês, durante

o período de três meses.

4.4 ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS

4.4.1 Contagem de Bactérias Heterotróficas Aeróbias Mesófilas

Para a contagem de Bactérias Heterotróficas Aeróbias Mesófilas (BHAM) foi

utilizado o método de plaqueamento em profundidade, segundo a “American Public

Health Association” do “Compendium of Methods for the Microbiological Examination

of Foods” (APHA, 2001). Para tal, utilizou-se o meio Ágar Padrão para Contagem

(APC) (Difco

).

O preparo da subamostra foi realizado através da homogeneização em

vórtex, por 120 segundos, de 1 mL da amostra em 9 mL de água peptonada 1%

35

(p/v). Assim, foi preparada a diluição 10-1. A partir desta, foram preparadas as

demais diluições desejadas em tubos contendo 9 mL de água peptonada 1%.

Posteriormente, inoculou-se 1 mL das diluições seriadas 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4 em

placas de Petri estéreis e vazias. Em seguida, foi vertido nas placas inoculadas

cerca de 15 a 20 mL de meio APC fundido e mantido em banho-maria a 46-480C até

o momento da vazagem. O inóculo foi misturado ao meio através de movimentos

circulares e suaves das placas, sob uma superfície plana; cerca de oito a dez

movimentos no sentido horário e oito a dez movimentos no sentido anti-horário. As

placas foram mantidas em câmara de fluxo de ar até a completa solidificação do

meio.

Sucessivamente, as placas foram incubadas invertidas em estufa

bacteriológica a 36°C ± 1°C por 48 horas. Para a leitura, foram selecionadas as

placas que continham entre 25 e 250 colônias. A partir dos resultados obtidos,

calculou-se o número de bactérias presentes na amostra em análise, expressando o

resultado em unidades formadoras de colônias (UFC)/cm2.

4.4.2 Isolamento e identificação de Salmonella spp.

De acordo com o método da “Food and Drug Administration” do

“Bacteriological Analytical Manual Online” (BAM, 2007) para a detecção de

Salmonella spp. foi necessário a realização de algumas etapas, tais como: pré-

enriquecimento; enriquecimento seletivo; plaqueamento seletivo e prova de

soroaglutinação.

4.4.2.1 Pré-enriquecimento, enriquecimento e plaqueamento seletivo

Para o preparo da subamostra foi feita a homogeneização em vórtex, por 120

segundos, de 1 mL da amostra em 9 mL de Caldo Lactosado (Himedia

). Assim, foi

preparada a diluição 10-1. Incubou-se em estufa a 350C +20C por 24 +2 horas.

36

Para o enriquecimento seletivo foi transferido 0,1 mL da cultura para 10 mL de

Caldo Rappaport-Vassidilis Soja (RVS) (Himedia

) e 1 mL para o Caldo Tetrationato

(TT) (Merck

). O tubo contendo o meio RVS foi incubado em banho-maria com

agitação a temperatura de 420C +20C por 24 +2 horas e o tubo com o meio TT a

350C +20C por 24 +2 horas, para que fosse possível a realização da etapa seguinte,

o plaqueamento seletivo. Nessa etapa, onde o objetivo era o isolamento de

Salmonella spp., dos tubos contendo RVS e TT transferiu-se com alça de platina por

estrias de esgotamento, pequena alíquota da cultura para placas de Petri contendo

os meios Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) (Oxoid

), Ágar Bismuto Sulfito (BS)

(Difco

) e Ágar Entérico de Hektoen (HE) (Difco

). Sucessivamente as placas foram

incubadas a 35ºC +2ºC por 24 ±2 horas.

Nas placas onde foram observadas colônias típicas de Salmonella spp., com

auxílio de uma agulha de inoculação, estas foram inoculada em tubos inclinados

contendo meios Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) (Himedia

) e Ágar Lisina Ferro

(LIA) (Himedia

), por picadas e estrias na rampa e em seguida, incubados a 35ºC

+2ºC por 24 +2 horas para provas de triagem.

4.4.2.2 Reações nos meios TSI e LIA

No ágar TSI estão presentes: glicose (1,0 g/L), lactose (10,0 g/L) e sacarose

(10,0 g/L). Como a glicose é um monossacarídeo e está em baixa concentração, é

rapidamente fermentada anaerobiamente, formando ácido no fundo do tubo, o que o

torna amarelo pela viragem do indicador vermelho de fenol. A fermentação aeróbia

da glicose que ocorre na superfície do bisel resulta em ácido pirúvico, que é

posteriormente degradado a CO2 e água. A grande maioria das bactérias do gênero

Salmonella spp. não fermenta a sacarose e a lactose, não provocando alterações no

meio TSI. Como a fonte de carbono utilizável (glicose) é rapidamente esgotada, a

salmonela passa a degradar anaerobicamente o substrato protéico do meio,

produzindo amoníaco (NH3), o que confere ao meio um pH alcalino, modificando a

37

coloração do bisel para rosa intenso. A maioria das salmonelas apresenta no TSI as

seguintes reações: ácido na base; com ou sem produção de gás, alcalino ou

inalterado no bisel, com ou sem produção de H2S (FIGURA 4) (JOHNSON et al.,

1966).

FIGURA 4: Material com suspeita de

Salmonella spp. em meio TSI.

No ágar LIA pode ser observada a descarboxilação da lisina pela

alcalinização do meio, o que é demonstrado pela não alteração de cor do indicador

presente. A atividade da enzima lisina descarboxilase é dependente do pH, sendo

mais ativa em pH abaixo de 5,5. A acidificação do meio é obtida pela fermentação

da glicose presente. Nessa etapa do processo ocorre a viragem do indicador

púrpura de bromocresol, de violeta para amarelo. Na condição anaróbica obtida na

base ágar LIA, todo o oxigênio não combinado é consumido pelo microrganismo

presente na fase inicial do crescimento. A descarboxilação da lisina posteriormente,

resulta na produção de uma diamina (cadaverina) e CO2, que conferem ao meio

características de alcalinidade e nova viragem da cor do indicador, que passa de

amarelo para violeta. A diamina é estável quando produzida em condições

anaeróbicas. A maioria das salmonelas é capaz de produzir lisina descarboxilase,

apenas 4% das cepas de salmonela não descarboxilam a lisina (JOHNSON et al.,

1966).

As colônias que apresentaram comportamento típico de Salmonella spp. em

TSI e LIA, foram submetidas ao teste de soroaglutinação, permitindo assim a

diferenciação entre Proteus spp. e Salmonella spp.

38

4.4.2.3 Confirmação sorológica

O cultivo obtido em ágar nutriente inclinado (Difco

), após incubação por 18

a 24 horas a 35C, foi ressuspenso em aproximadamente 2 mL de solução salina

0,85% (p/v). Em lâmina de vidro, depositou-se separadamente uma gota de solução

salina 2% (p/v) e uma gota do soro anti-Salmonella polivalente "O" (PROBAC DO

BRASIL). Em seguida, acrescentou-se uma gota da suspensão em teste. Foram

realizados movimentos de inclinação e rotação da lâmina por um a dois minutos até

obtenção do resultado. Como controle foi utilizada cepa padrão Salmonella enterica

ATCC 14028.

A leitura da reação deu-se da seguinte forma:

Positiva: presença de aglutinação somente na mistura cultivo + anti-soro;

Negativa: ausência de aglutinação em ambas as misturas.

4.4.3 Contagem de Staphylococcus coagulase positiva

Para pesquisa de Staphylococcus coagulase positiva foi realizado o método

de contagem direta em placas segundo a “American Public Health Association” do

“Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods” (APHA,

2001).

Para o preparo da subamostra foi feita a homogeneização em vórtex, por 120

segundos, de 1 mL da amostra em 9 mL de água peptonada 1% (p/v). Assim, foi

preparada a diluição 10-1. A partir desta, foram preparadas as demais diluições

desejadas em tubos contendo 9 mL de água peptonada 1% (p/v). Posteriormente,

semeou-se 0,1 mL das diluições seriadas 10-1, 10-2 e 10-3 sobre a superfície seca do

Ágar Baird-Parker (BP) (Difco

), previamente preparado com a adição de telurito de

potássio e gema de ovo esterilizada, vazado e solidificado em placas de Petri. Com

o auxílio de alça de Drigalski descartável (LABORCLIN

), espalhou-se o inóculo

cuidadosamente por toda a superfície do meio, até sua completa absorção. Em

seguida, as placas foram incubadas a 350C +2ºC por 24-48 horas.

39

Após leitura das placas de BP constatou-se apenas colônias atípicas:

acinzentadas ou pretas brilhantes, sem halo ou com apenas um dos halos. Não

foram encontradas colônias típicas (pretas brilhantes com anel opaco, rodeadas por

um halo claro, transparente e destacado sobre a opacidade do meio). Foram

registradas as contagens das colônias atípicas e selecionadas três a cinco colônias

de cada placa. Semeou-se cada colônia em tubos contendo caldo Infusão de

Cérebro e Coração (BHI) (Difco

) incubando em seguida a 350C +2ºC por 18-24

horas, para posterior realização de provas confirmatórias.

4.4.3.1 Provas confirmatórias

O teste de catalase foi feito em uma lâmina de vidro estéril e seca, onde a

uma alíquota do cultivo bacteriano, a partir do ágar BHI, foi adicionado uma gota de

peróxido de hidrogênio 3% (v/v). A observação de reação de borbulhamento

imediato considerou-se teste positivo para catalase. A não formação de borbulhas,

considerou-se teste negativo para catalase. Todas as amostras apresentaram

resultado positivo para catalase. Como controle foi utilizada cepa padrão S. aureus

ATCC 25923.

Também foram realizadas avaliações das características morfo-tintoriais

através de esfregaço com coloração pelo método Gram. A presença de cocos Gram

positivos confirmaram os resultados obtidos na prova da catalase (FIGURA 5).

FIGURA 5: Coloração Gram de lâmina

de Staphylococcus spp.

40

Para confirmação, foi realizado o teste da coagulase, a partir da transferência

de 0,1 mL de cada cultura obtida em caldo BHI para tubos estéreis contendo 0,3 mL

de plasma de coelho (Coagu-plasma

). Para misturar o inóculo com o plasma foram

feitos suaves movimentos de rotação, sem agitar os tubos, para não interferir na

coagulação. Em seguida, os tubos foram incubados a 350C +2ºC, com observação

periódica, durante seis horas, para avaliação da formação de coágulo. Como

controle foi utilizada cepa padrão S. aureus ATCC 25923. A leitura foi feita

considerando os critérios segundo Varnam (1991), como se segue:

Reação negativa: não formação de coágulo;

Reação 1+ : coágulo pequeno e desorganizado;

Reação 2+ : coágulo pequeno e organizado;

Reação 3+ : coágulo grande e organizado;

Reação 4+ : coagulação de todo o conteúdo do tubo, que não se desprende

mesmo quando o tubo é invertido.

Não foi observada a formação de coágulos em nenhuma das amostras,

desconsiderando-se assim a possibilidade de a espécie presente ser

Staphylococcus coagulase positiva.

4.4.4 Contagem de coliformes totais e Escherichia coli

Para o preparo da subamostra foi feita a homogeneização em vórtex, por 120

segundos, de 1 mL da amostra em 9 mL de água peptonada 1%. Assim, foi

preparada a diluição 10-1. A partir desta, foram preparadas as demais diluições

desejadas em tubos contendo 9 mL de água peptonada 1%.

Para a contagem de coliformes e E. coli foram utilizadas placas de Petrifilm

(EC) (3MPetrifilm). Estas foram colocadas dispostas dentro de câmara de fluxo

lâminar, em superfície lisa e plana, onde foi realizada a inoculação de 1 mL de cada

diluição nas placas EC. Para tal, levantou-se o filme superior e com a pipeta

posicionada perpendicularmente à placa dispensou-se 1 mL de cada diluição no

centro do filme inferior. Após, desceu-se cuidadosamente o filme superior de forma a

41

evitar a formação de bolhas de ar. Em seguida, foi colocado o difusor plástico, no

centro da placa, com o lado liso para baixo. Pressionou-se delicadamente o centro

do difusor para distribuir o inóculo uniformemente em toda a área de crescimento da

placa antes do gel se formar. Com a completa dispersão, removeu-se o difusor e

deixou-se a placa em repouso durante, pelo menos, um minuto, para permitir a

formação do gel. Sucessivamente, as placas foram incubadas em estufa

bacteriológica com a face transparente para cima, em pilhas de no máximo 20

placas. Foi fixada a temperatura de 35ºC +1ºC por 24-48 +2 horas, conforme

metodologia AOAC

Official MethodsSM 991.14 (“Coliform and Escherichia coli

Counts – Dry Rehydratable Film Methods”).

4.4.4.1 Interpretação e contagem

As placas 3MPetrifilmpara Contagem de E. coli e Coliformes (EC) contêm

nutrientes do meio Vermelho Violeta Bile (VRB), um agente geleificante solúvel em

água fria, um indicador de atividade glicuronidásica e um indicador tetrazólico que

facilita a enumeração da colônia. O filme superior da placa EC retem o gás formado

pela fermentação metabólica da lactose pelos coliformes e E. coli.

A maioria das E. coli, cerca de 97%, possui beta-glicuronidase, que forma um

precipitado azul associado à colônia e aproximadamente 95% das E. coli produzem

gás, sendo indicadas nas placas EC por colônias azuis à vermelho-azuladas,

associadas ao gás retido na placa (dentro de, aproximadamente, o diâmetro de uma

colônia). As colônias de coliformes produzem ácido, fazendo com que o indicador de

pH torne a cor do gel vermelho mais escuro. O gás retido ao redor das colônias

vermelhas indica coliformes confirmados (FIGURA 6).

42

FIGURA 6: Placas Petrifilm com colônias de

coliformes e Escherichia coli.

A faixa ideal de contagem nesta placa é de 15 a 150 colônias. Quando o

número de colônias ultrapassava esse valor a contagem era estimada através da

contagem em um ou mais quadrados representativos e multiplicando-se a média de

um quadrado por 20 (cada placa tem uma área de 20 cm2). A contagem das placas

EC foi feita pela seguinte conta: 100 cm2 de área amostrada, colocado em 10 mL da

solução diluente e semeado 1 mL deste em placa EC determina a contagem em

UFC/cm2.

Também foram realizadas avaliações das características morfo-tintoriais

através de esfregaço com coloração pelo método Gram.

4.4.4.2 Teste de sensibilidade a antimicrobianos

As cepas de Escherichia coli típicas isoladas foram testadas frente a

antimicrobianos, segundo método recomendado pelo CLSI (2012a), que se baseia

no originalmente descrito por Kirby-Bauer (BAUER et al., 1976), com preparo de

inóculo para leitura de dezoito horas, com uso de polidiscos da Polisensidisc DME

(SENSIDISC

). O meio base utilizado foi o Ágar Müller Hinton (MH) (Difco

).

As cepas isoladas foram semeadas em Ágar Triptona de Soja (TSA) (Difco

)

e incubadas a 37ºC por 24 horas. A partir dos subcultivos crescidos foram

selecionadas três a quatro colônias iguais e emulsionadas em 5 mL de solução

43

salina 0,9% (p/v) esterilizada, padronizando-se a suspensão para uma turvação

semelhante ao padrão 1 da escala de McFarland (1 mL de cloreto de Bário a 1%

com 99 mL de ácido sulfúrico a 1% (0,36 N) que corresponde a 3,8 x 108 bactérias

por mililitro).

Foram semeadas em placas de Petri com 20 a 25 mL de Ágar MH, com pH

em torno de 7,2-7,4, utilizando-se para tal “swab” estéril embebido em inóculo,

sendo espalhado homogeneamente em toda a superfície do meio, em pelo menos

três sentidos, girando a placa após cada semeadura. Após a absorção do inóculo

por alguns minutos, foram colocados os discos, utilizando-se pinça previamente

flambada e resfriada; sendo em seguida as placas incubadas a 37ºC por 18 horas.

Como controle foi utilizada cepa padrão E. coli ATCC 25922.

Empregou-se os discos de sensibilidade para E. coli correspondentes aos

módulos I, II e III, por serem os indicados para realização de antibiogramas de

microrganismos Gram-negativos. Do módulo I foram utilizados os antibacterianos

Ampicilina e Gentamicina, seguido pela Piperacilina-Tazobactam, Cefoxitina,

Ciprofloxacina, Meropenem e Sulfametoxazol, correspondentes ao módulo II e,

Aztreonam e Tetraciclina correspondentes ao módulo III.

A leitura dos resultados de sensibilidade aos antimicrobianos foi realizada

medindo-se o tamanho dos halos de inibição de crescimento bacteriano com um

halômetro, sendo a cepa bacteriana classificada em sensível, intermediário ou

resistente, em função do diâmetro da zona de sensibilidade padrão estabelecida

para cada antimicrobiano (CLSI, 2012b).

4.4.5 Isolamento e identificação de Listeria spp.

A pesquisa de Listeria spp. foi realizada a partir de placas de Petrifilm™ para

Listeria em Monitoramento Ambiental (EL) (3MPetrifilm). Para a coleta das

amostras foi utilizado “swab” estéril pré-hidratado com 1mL de caldo Letheen,

utilizado como um caldo de recuperação em conjunto com a placa EL para recuperar

a listeria estressada, devido às condições ambientais ou sanitizantes, sem aumentar

o número de células.

44

Dentro de câmara de fluxo lâminar foi procedida a inoculação de 2 mL de

água peptonada tamponada estéril, entre 20 a 30ºC, à amostra coletada. Em

seguida, fez-se a homogeneização da amostra em vórtex, por um minuto, deixando-

a em repouso por 60 minutos. Após, misturou-se vigorosamente, para a recuperação

das células injuriadas. Sucessivamente, foi feita a inoculação de 3 mL da amostra no

centro das placas EL previamente identificadas, dispostas dentro de câmara de fluxo

lâminar, em superfície lisa e plana. Após, desceu-se cuidadosamente o filme

superior de forma a evitar a formação de bolhas de ar. Em seguida, foi colocado o

difusor plástico, no centro da placa, com o lado liso para baixo, para permitir que o

inóculo fosse distribuído uniformemente em toda a área de crescimento da placa

(sendo dispensado o uso do difusor quando o inóculo se espalhava sozinho).

Aguardou-se, ao menos, dez minutos, para permitir a formação do gel.

Posteriormente, as placas EL foram incubadas em estufa bacteriológica com a face

transparente para cima, em pilhas de no máximo 10 placas. Foi fixada a temperatura

de 35ºC +1ºC por 24 +2 horas, conforme metodologia da APHA (2001).

4.4.5.1 Interpretação e contagem

As placas EL contêm agentes seletivos, nutrientes, um agente geleificante

solúvel em água fria, e um indicador cromogênico que facilita a detecção das

colônias de listeria. As placas EL permitem analisar amostras ambientais e ajudar a

aumentar a eficiência do monitoramento da sanitização da planta. A presença do

indicador listeria, como Listeria innocua, evidencia que as condições ambientais

estão propícias para a ocorrência de Listeria monocytogenes. A placa EL detecta a

maioria das espécies de listeria ambiental, como: Listeria monocytogenes, Listeria

innocua e Listeria welshimeri.

Todas as colônias que após o período de incubação das placas EL

apresentaram coloração vermelho-violeta intenso foram interpretadas como Listeria

spp. (FIGURA 7). A contagem das placas EL foi feita da seguinte forma: número de

colônias contadas na placa dividido pela área amostrada (100 cm2), sendo o

resultado expresso em UFC/cm2.

45

FIGURA 7: Placa Petrifilm com

colônias de Listeria spp.

A partir das colônias típicas obtidas e isoladas nas placas EL, cinco foram

selecionadas e cultivadas por picada em placas contendo ágar TSA enriquecido com

0,6% (p/v) de extrato de levedura (TSA-YE) (Merck

) e 5% (v/v) de sangue de

carneiro. Incubou-se a 35°C por 24 horas para posterior observação de uma zona

clara ao redor da perfuração, que seria uma indicação da ação beta hemolítica do

microrganismo, quando presente. Concomitantemente, confeccionou-se esfregaços

em lâmina, corados pelo método Gram, para verificação das características morfo-

tintoriais das bactérias. As listerias são bastonetes Gram positivos pequenos e

curtos, em cadeias curtas, paralelamente ou em forma de “V”.

Alíquotas dos cultivos positivos, identificados como Listeria spp., foram

transferidas para tubos contendo caldo TSB enriquecido com 0,6% (p/v) de extrato

de levedura (TSB-YE) e incubados a 35°C por 24 horas. Posteriormente, transferiu-

se para criotubos estéreis 1 mL do inóculo adicionado de glicerol (80:20), sendo

estes mantidos a temperatura de 0°C. Partindo destes subcultivos foram realizadas

as provas bioquímicas, sendo para tal, a cultura ativada e repicada por duas vezes

consecutivas em 10 mL de caldo TSB-YE e incubada a 30 ±1°C por 24 horas.

46

4.4.5.2 Provas bioquímicas

As provas bioquímicas realizadas seguiram a metodologia de Pagotto et al.

(2001), como se segue:

Produção de catalase: sobre os cultivos crescidos nos tubos de ágar TSA-YE

inclinado, incubados a 30°C por 24 horas, adicionou-se 1 mL de peróxido de

hidrogênio a 3%. O teste foi considerado positivo quando ocorreu

efervescência sobre o crescimento bacteriano. As cepas de Listeria spp. são

catalase positivas.

Teste de motilidade: as cepas em estudo foram semeadas em tubos contendo

ágar Sulfeto Indol Motilidade (Merck

) por picada no centro do meio de

cultura e até uma distância de 1 cm do fundo do tubo. Após o período de

incubação de 7 dias a temperatura ambiente (25°C), o crescimento, que na

presença de Listeria spp. forma turbilhonamento no formato de “guarda-

chuva”, caracterizou a prova como positiva.

Fermentação de carboidratos: utilizou-se como meio base o caldo Púrpura de

Bromocresol (Difco

), adicionado separadamente dos seguintes carboidratos:

glicose, manitol, maltose, xilose e rhamnose na concentração final de 1%

(p/v). A esterilização dos tubos contendo manitol e maltose foi feita a 121°C

durante 15 minutos, e dos tubos com xilose e rhamnose, a 121°C por 10

minutos. As provas foram consideradas positivas quando ocorreu viragem do

indicador púrpura de bromocresol e a coloração do meio, originalmente

púrpura, tornou-se amarela devido à produção de ácido.

Também foi realizado teste bioquímico complementar pelo Kit API

– Listeria

(bioMérieux), que consiste em um sistema padronizado para identificação de

bactérias do gênero listeria, através da utilização de mini testes e uma base de

dados. O princípio baseia-se em dez microtubos contendo substratos desidratados

que permite a realização de testes enzimáticos ou fermentações de açúcares.

47

Para tal, dentro de uma câmara de fluxo de ar, preparou-se cada galeria,

distribuíndo cerca de 3 mL de água destilada nos alvéolos do fundo das mesmas,

criando assim uma atmosfera úmida. Em seguida, as galerias foram devidamente

identificadas (FIGURA 8). Procedeu-se a preparação do inóculo, transferindo com o

auxílio da alças bacteriológicas descartáveis, colônias de culturas recentes (18 a 24

horas) e bem isoladas, para a ampola de API “Suspension Medium” (2mL) até

alcançar uma suspensão com opacidade equivalente a 1 na escala McFarland. Esta

suspensão foi imediatamente distribuída nos microtubos de cada galeria, inclinando-

se a caixa de incubação para frente, e colocando a ponta da pipeta perpendicular à

cúpula, evitando assim a formação de bolhas, tomando cuidado para que nenhum

tubo ficasse insuficiente ou demasiadamente cheio, evitando-se assim resultados

falsamente positivos ou negativos. Posteriormente, as caixas de incubação foram

fechadas para gerar um ambiente de anaerobiose e levadas à estufa bacteriológica

por 18 a 24 horas a 36 ±2°C.

FIGURA 8: Galeria pré-incubação e caixa de

incubação com água destilada nos alvéolos.

As reações traduzidas durante o período de incubação foram reveladas pelas

mudanças de cor espontâneas ou demonstradas através da adição de reagentes

(FIGURA 9-A). A leitura dessas reações foi efetuada após 3 minutos da adição de

uma gota do reagente ZYM B ao teste DIM. Sucessivamente, procedeu-se a leitura e

interpretação de todas as reações observadas com auxílio das anotações na ficha

de resultados (FIGURA 9-B) e consultando-se a lista dos perfis do folheto

48

informativo do fabricante e/ou através de um sistema de identificação online no site

do mesmo.

FIGURA 9: Galerias API

– Listeria pós-incubação (A e B) e ficha dos resultados (B)

4.4.6 Pesquisa de Bacillus cereus

A contagem de Bacillus cereus foi realizada pelo método de contagem direta

em placas, preconizado pela “American Public Health Association” do “Compendium

of Methods for the Microbiological Examination of Foods” (APHA, 2001). Para o

preparo da subamostra foi feita a homogeneização em vórtex, por 120 segundos, de

1 mL da amostra em 9 mL de água peptonada 1%. Assim, foi preparada a diluição

10-1. Para o preparo das diluições seguintes, foi pipetado sempre 1 mL e transferido

para 9 mL do referido diluente. Posteriormente, semeou-se 0,1 mL das diluições

seriadas 10-1, 10-2 e 10-3 sobre a superfície seca do Ágar Manitol Gema de Ovo

Polimixina (MYP) (Difco

) e com o auxílio da alça de Drigalski foi espalhado o

inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio até completa absorção. As

placas foram incubadas a 30 0C ±2 ºC por 20 a 24 horas para posterior leitura.

4.4.6.1 Caracterização de Bacillus cereus

A partir das placas que continham colônias típicas (esféricas, com bordas

perfeitas, planas e secas, translúcidas ou levemente creme, rodeadas por um

49

grande halo róseo de precipitação, devido a reação da gema de ovo com o meio)

foram selecionadas pelo menos cinco colônias para realizar a confirmação. Nas

placas onde havia menos de cinco colônias, selecionou-se todas (FIGURA 10).

FIGURA 10: Colônias

sugestivas de Bacillus cereus

em placa de petri com MYP.

Em seguida, estas foram semeadas em tubo contendo ágar nutriente

inclinado e incubadas a 30 ºC por 24 horas. A partir das colônias puras em ágar

nutriente inclinado foram realizados exames morfo-tintoriais visando confirmar a

presença de Bacillus cereus. Na coloração Gram foram observados bastonetes

Gram positivos corroborando os resultados obtidos nas placas com MYP.

4.5 PREPARO DOS CUPONS DE AÇO INOXIDÁVEL

Foram utilizados como corpo de prova cupons de aço inoxidável AISI 304

com acabamento número 4 (#4) em ambas as faces, fabricados pelo Centro de

Tecnologia da UNICAMP com dimensões de 10 x 10 x 1 milímetro de espessura, a

partir de chapas de aço inoxidável da empresa Açomedi Aços Ltda (Barueri-SP). A

escolha pelo aço inoxidável se deu pelo fato deste ser o principal material

empregado na fabricação de equipamentos para indústrias processadoras de

alimentos.

50

Antes de serem utilizados para a avaliação da formação de biofilme, os

cupons eram limpos e descontaminados individualmente seguindo a seguinte

sequência: limpeza manual com auxílio de esponja de poliuretano, água e

detergente neutro líquido; enxágue com água destilada; imersão em álcool etílico

70% (v/v) por 1 hora a temperatura ambiente; enxágue com água destilada e

esterilização em autoclave a 121°C por 15 minutos (ESPER, 2004).

4.6 FORMAÇÃO DE BIOFILMES EM SUPERFÍCIE DE AÇO INOXIDÁVEL

A capacidade de formação de biofilme foi testada em aço inoxidável apenas

para Escherichia coli, único microrganismo isolado nas três visitas realizadas. Para

tal, os cupons previamente esterilizados foram transferidos com o auxílio de uma

pinça estéril para tubos tipo Falcon estéreis, contendo 9 mL de Caldo Triptona de

Soja (TSB) (Difco

) e inoculados com 1 mL de suspensão de células do

microrganismo isolado. Como controle (branco), utilizou-se cupons imersos em meio

de cultivo (TSB) não inoculado (PARIZZI et al., 2004 modificado).

As amostras foram incubadas a temperatura de 25 ºC e avaliadas quanto a

formação de biofilme nos tempos 6, 12, 24 e 72 horas. Foram realizados três

experimentos independentes em duplicata.

4.7 DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE CÉLULAS SÉSSEIS

Os cupons de aço inoxidável foram retirados dos meios de cultivo (9 mL de

TSB) com auxílio de uma pinça estéril e introduzidos em 10 mL de “Phosphate

Buffer Salt” (PBS), por 1 minuto, para remoção de células planctônicas. Em seguida,

foram colocados em tubos tipo Falcon estéreis, contendo 5 mL de PBS e agitados

em vórtex (FLEXVORTEX

), durante 2 minutos, para remoção de células sésseis

(PARIZZI et al., 2004 modificado). Diluições adequadas foram transferidas pelo

método de plaqueamento em superfície para placas de Petri contendo TSA e

51

incubadas a 35 ±1°C por 24 horas, determinando-se desta forma, o número de

unidades formadoras de colônia (UFC)/cm2 aderidas a cada cupom.

4.8 PREPARO DAS SOLUÇÕES SANITIZANTES

Foram utilizados os sanitizantes de uso industrial Primmax Sanida

(Indeba)

1,0% p/v, a base de biguanida polimérica 8,0% e, Primmax Sanquat

(Indeba) 0,5%

p/v, sendo o princípio ativo deste o cloreto de alquil dimetil benzil amônio 25%. Para

cada experimento os sanitizantes foram preparados com no máximo 15 minutos de

antecedência ao uso e diluídos em água purificada até obtenção da concentração

recomendada pelo fabricante (CRUZ; FLETCHER, 2012).

4.9 ANÁLISE DA EFICÁCIA DE SANITIZANTES NA REMOÇÃO DE BIOFILMES

Foram retirados dos meios de cultivo 2 cupons, com auxílio de uma pinça

esterilizada e, imersos cada um em tubos contendo 10 mL de PBS por 1 minuto,

para a remoção de células planctônicas. Posteriormente cada cupom foi colocado

em tubos contendo 10 mL de cada solução sanitizante. Após 15 minutos de contato,

os cupons foram removidos e transferidos para tubos contendo 4,5 mL de PBS

acrescido de 0,5 mL de caldo Letheen, para neutralizar a ação dos referidos

sanitizantes.

Em seguida os tubos foram agitados em vórtex por 2 minutos, para a remoção

das células sésseis. Foram preparadas diluições apropriadas e estas transferidas

para placas de Petri contendo meio TSA pelo método de plaqueamento em

superfície e incubadas a 35 ±1°C por 24 horas (CRUZ; FLETCHER, 2012,

modificado). Simultaneamente foi realizada a contagem de UFC/cm2 dos cupons

controles, ou seja, os que não receberam os sanitizantes, com o intuito de avaliar o

efeito destes sobre os biofilmes formados por cada microrganismo.

52

4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para se obter a distribuição normal, os dados reais das contagens foram

colocados em logaritmo na base 10 para uniformização dos mesmos.

Foram realizados três experimentos independentes, em duplicata, tendo sido

o tratamento estatístico dos resultados obtido pela análise de variância (ANOVA) em

delineamento inteiramente casualizado, com nível de significância de 5% (p<0,05).

Para comparação entre as médias foi utilizado o teste de comparação múltipla de

Tukey. Para tal, foi utilizado o programa GraphPad Prism

, versão 5.01.

53

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES HIGIÊNICO-SANITÁRIAS DA PLANTA

De acordo com a aplicação da lista de verificação (ANEXO 7.1) baseada nos

diversos grupos de itens previstos nas Circulares n 25 (BRASIL, 2009), n 175

(BRASIL, 2005a) e n 176 (BRASIL, 2005b) e, considerando que o estabelecimento

possuía o Manual de Boas Práticas, foi possível constatar através desta checagem o

quanto este instrumento estava sendo aplicado no estabelecimento, permitindo

assim verificar quais as áreas da indústria apresentavam maior deficiência (FIGURA

11).

Figura 11: Percentuais de não-conformidades dos

grupos de itens avaliados segundo lista de

verificação aplicada à indústria.

Com relação ao item Instalações, equipamentos e edificações (I) constatou-se

35,7% de não-conformidades, dentre elas destacam-se: pisos impróprios à prática

de fabricação de alimentos, paredes com pintura descascando, tetos mofados e com

condensação incidindo diretamente sobre a matéria-prima, ventiladores em péssimo

estado de conservação; sujos e com ar ventilado sendo lançado diretamente sob a

matéria-prima, equipamentos e utensílios que entram em contato direto com o

pescado mal higienizados e, área externa apresentando focos de insalubridade,

54

propiciando assim uma condição favorável ao abrigo e proliferação de pragas. Tal

fato pode ser parcialmente justificado em função de a indústria utilizar um prédio

antigo, o que dificulta sua adaptação à funcionalidade que a instalação física deveria

possuir, gerando assim um alto índice de não-conformidade para este requisito.

Resultados similares foram descritos por Munhoz e Rossi (2012) em indústria

de charque, onde encontraram 61,2% de não-conformidades em relação às

edificações e instalações, pois os itens observados não atendiam às epecificações

legais, como paredes em inadequado estado de conservação e área externa com

presença de objetos em desuso, sendo a indústria também instalada em prédio com

infra-estrutura antiga.

A situação mais crítica observada foi no item Manipuladores (II), que

apresentou as maiores porcentagens de não-conformidades, com 54,5%. Apesar de

a indústria ter um programa de treinamento dos funcionários no momento da

admissão e a cada 6 meses, foram constatados uso de adornos e maquiagem

durante manipulação da matéria-prima, uniformes em mau estado de conservação,

além destes serem higienizados pelos próprios funcionários em suas residências.

Estes dados corroboram com os obtidos por Medeiros et al. (2012) que revelaram

que mesmo após treinamento, alguns funcionários não seguiam as normas de

segurança e continuavam utilizando bijuterias ao manipular os alimentos. Tais

resultados demonstram a ineficácia dos métodos utilizados para treinamento dos

manipuladores, reforçando o despreparo dos mesmos com relação à higiene dos

alimentos, bem como a baixa motivação para o desempenho do seu ofício.

Silva et al. (2013) constataram resultados semelhantes, sendo as principais

não-conformidade encontradas também relacionada ao item manipuladores, com 0%

de atendimento, em decorrência por exemplo de vestuários inadequados e

inexistência de preocupação com o asseio pessoal. Não obstante, Munhoz e Rossi

(2012) observaram 81,5% de conformidade, devido um controle de qualidade eficaz

presente na indústria.

A indústria apresentou menor percentual de não-conformidade no item

Avaliação da produção (III), apenas 4,1%, sendo este responsável pelo não

atendimento ao item de manutenção da temperatura sem oscilação, em todos os

ambientes de trânsito de matérias-primas, a partir do seu resfriamento (BRASIL,

2009). Observou-se temperaturas acima do recomendado no interior da ante-câmera

55

e câmara frigorífica, em decorrência destas permanecerem abertas durante toda a

produção, descarregamento e acondicionamento da matéria-prima no seu interior.

No item Avaliação do armazenamento do produto final e seu transporte (IV)

foi detectado 14,3% de não-conformidades, este resultado se deu a alguns pontos

analisados, como o armazenamento feito em local sujo e em alguns pontos junto à

parede, dificultando assim a higienização. Tais dados demonstraram-se mais

satisfatórios do que os obtidos Munhoz e Rossi (2012), com 45,3% de não-

conformidades, devido ao armazenamento de ingredientes e embalagens de forma

inadequada, falta de isolamento da “área suja” e da “área limpa” e falta de análises

químicas e microbiológicas do produto final.

5.2 ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS

Os resultados das análises bacteriológicas das superfícies dos equipamentos

estão representados de forma detalhada na tabela 1, localizada no apêndice no item

7.2 e, foram comparados com os valores preconizados pela “American Public Health

Association” (APHA, 2001) e pela Reunião Diretiva Colegiada (RDC) n 12 para

pescado in natura, resfriado ou congelado não consumido cru (BRASIL, 2001).

5.2.1 Contagem de Bactérias Heterotróficas Aeróbias Mesófilas

Em relação a contagem de Bactérias Heterotróficas Aeróbias Mesófilas

(BHAM) foram encontradas contagens que variaram de 2,0 x 101 UFC/cm2 a 6,9 x105

UFC/cm2, tendo sido estes microrganismos isolados em todos os pontos

amostrados, nas três visitas realizadas.

A legislação brasileira (BRASIL, 2001) não prevê limites para a contagem de

BHAM em pescado, entretanto, a “American Public Health Association” recomenda

que a contagem em superfície não ultrapasse 0,2 x 101 UFC/cm2 (APHA, 2001) e a

Organização Mundial de Saúde (OMS), o limite máximo de 5,0 x 101 UFC/cm2.

Nesse contexto, das três superfícies testadas em diferentes momentos, 80%

56

apresentaram contagens médias superiores ao valor preconizado pela OMS, sendo

responsável pelos maiores valores o Tanque de Recepção Durante o

processamento (TRD), seguido pela Esteira de Evisceração, tanto Antes do

processamento (EEA) quanto na avaliação realizada Durante o processamento

(EED). Apenas as superfícies do Tanque de Molho de Cobertura (TMC) e do Tanque

de Recepção Antes do processamento (TRA), testadas na primeira visita, e a

superfície do TRA, avaliada na segunda visita, apresentaram-se em condições

higiênico-sanitárias satisfatórias, com 0,2 x 101 UFC/cm2.

Oliveira et al. (2008) relataram resultados semelhantes em máquinas de moer

carne, com contagem de mesófilos superiores a 2,62 x 104 UFC/cm2 em todos os

estabelecimentos analisados, sendo considerada a possibilidade de formação de

biofilmes bacterianos.

Também similares, foram os resultados obtidos por Sousa et al. (2011), em

pesquisa realizada em superfícies de equipamentos e utensílios de indústria de

processamento de pescado, na qual evidenciaram contagens elevadas em 27% das

amostras, quando comparada as recomendações da APHA (2001).

Resultados mais satisfatórios foram obtidos por Queiroz et al. (2007),

apresentando 50% de contagem de BHAM das superfícies de equipamentos de

indústrias de alimentos, abaixo ou igual ao preconizado pela OMS (5,0 x 101

UFC/cm2).

Para Vieira et al. (2004), as condições higiênicas de equipamentos que

entram em contato com o pescado determinam a qualidade do produto em função

deste ser altamente perecível, podendo a eficiência do processo de higienização ser

confirmada através de análises bacteriológicas, tornando assim a análise dos

equipamentos um importante indicativo da aplicação das boas práticas de fabricação

(SILVA JR., 2001).

Nas análises das amostras de ar do ambiente de processamento o número de

BHAM variou entre 1,7x103 UFC/cm2/semana e 1,3 x104 UFC/cm2/semana, sendo

também observado presença de fungos filamentosos. Tais resultados confirmam a

ausência de condições sanitárias satisfatórias, ultrapassando as recomendações da

APHA, máximo 3,0x101/cm2/semana (APHA, 2001), e corroboram com os resultados

relatados por Coelho et. al (2010), que descreveram contagens variando entre

4,1x101 UFC/cm2/semana e 1,1 x103 UFC/cm2/semana, dados também superiores

ao limite preconizado pela APHA.

57

As variabilidades de contagens de BHAM observadas entre as diferentes

coletas neste estudo reforçam a ideia de que o estabelecimento possuia falhas

relativas às condições higiênico-sanitárias das superfícies dos equipamentos, dando

suporte a falta de padronização nos procedimentos de higienização, favorecendo

assim a contaminação da matéria-prima presente na area de processamento e,

consequentemente, comprometendo a qualidade higiênico-sanitária do produto final.

5.2.2 Isolamento e identificação de Salmonella spp.

No que diz respeito à pesquisa de Salmonella spp., todas as amostras

analisadas apresentaram-se isentas, com exceção da superfície da Esteira de

Evisceração Antes do processamento (EEA), na terceira visita. Tais resultados foram

mais satisfatórios do que os obtidos por Ferreira e Junqueira (2009), onde

constataram 100% de contaminação por Salmonella spp. nas superfícies de

processamento amostradas, levando a contaminação do produto final e

consequentemente, tornando-o impróprio para o consumo (BRASIL, 2001).

Silva (2006) também observou a presença deste patógeno em superficies de

manipulação de alimentos, no entanto, após treinamento dos funcionários e,

aplicação de procedimentos de higienização, o microrganismo não mais foi

detectado.

Kumar et al. (2003) evidenciaram a presença de Salmonella spp. em peixes,

mas acreditam que a incidência de bactérias deste gênero em pescado seja oriunda

de contaminação durante processamento e manipulação. Basti et al. (2006) em

pesquisa com peixes recém-capturados, não identificaram microrganismos do

gênero Salmonella como naturais da microbiota de pescado.

Tais dados confirmam a hipótese do presente estudo, da identificação deste

patógeno em superfície de processamento ser decorrente de falhas no controle e

higiene operacional, e não por fazerem parte da microbiota natural de peixes.

Conforme pode ser observado na Tabela 1, a constatação da presença de

Salmonella spp. na superfície da EEA caracteriza condições higiênico-sanitárias

insatisfatórias no momento da análise, segundo padrões científicos (APHA, 2001), e

portanto, podendo comprometer a inocuidade do produto final. A contaminação do

58

alimento como consequência de contaminações cruzadas já foram propostas por

Jay (2005), Forsythe (2002) e Silva Junior (2001).

A identificação de Salmonella spp. apenas em uma das visitas pode ser

justificada pela presença de outras bactérias no meio, provocando assim

competições entre os microrganismos contaminantes presentes, e/ou produção de

bacteriocinas excretadas por outras espécies de bactérias, presentes em maior

número, tornando o ambiente desfavorável à sobrevivência da Salmonella spp. A

ocorrência de bacteriocinas, inclusive colicinas, foi descrita por Jay (2005) e

Forsythe (2002).

Outra provável explicação para o resultado obtido seria a existência de

portadores assintomáticos para Samonella spp. na linha de produção. Tais falhas

podem ser minimizadas ou eliminadas com educação sanitária, treinamentos sobre

a segurança dos alimentos e um programa de higienização operacional eficiente,

que embora existisse no local, pôde-se constatar que houve falha na execução das

orientações.

5.2.3 Contagem de Staphylococcus coagulase positiva

Na análise de Staphylococcus coagulase positiva, observou-se ausência para

100% das superfícies testadas, atendendo portanto aos critérios sugeridos pela

APHA (2001), bem como os recomendados pela RDC n 12 (BRASIL, 2001) em não

ultrapassar concentração superior a 1,0 x103 UFC/g. De acordo com Huss (1998), tal

fato pode ser explicado em função dos estafilococos serem fracos competidores e

consequentemente não conseguirem crescer bem na presença de outros

microrganismos, ou seja, outras bactérias poderiam estar inibindo o crescimento dos

estafilococos por competição.

Resultado equivalente ao obtido foi relatado por Malavota (2008), em

superfícies de manipulação de restaurantes japoneses e, por Nora et al. (2009), em

superfícies de equipamentos de indústria de pescado.

Todavia, em estudo conduzido por Vargas e Quintaes (2003), encontrou-se

Staphylococcus coagulase positiva em 37,5% dos monoblocos de contato direto com

peixes comercializados em São Paulo, que diferem dos valores encontrados na

59

presente pesquisa e representam um grave risco à saúde da população, devido

estes microrganismos serem produtores de enterotoxinas, oferendo assim risco de

intoxicações aos consumidores (JAY, 2005).

Diante dos resultados constatados, a probabilidade da ocorrência deste

patógeno foi eliminada e, portanto este microrganismo não pôde ser considerado

como um fator contaminante das superfícies em questão.

5.2.4 Contagem de coliformes totais e Escherichia coli

A presença de coliformes totais deu-se em todos os pontos amostrados nas

três visitas realizadas, com enumerações que variaram de 1,4x103 UFC/cm2 a

5,8x104 UFC/cm2, deixando apenas de ser identificado na superfície do Tanque de

Molho de Cobertura (TMC). Tal ausência justifica-se em função da empresa não

estar utilizando o referido equipamento nos dias das análises.

Na contagem de E. coli, conforme Tabela 1, na primeira visita, sua

identificação realizou-se nas superfícies do Tanque de Recepção Durante o

processamento (TRD), Esteira de Evisceração Antes do processamento (EEA) e

Esteira de Evisceração Durante o processamento (EED), com contagens de 7,5x101,

1,2x102 e 2,0x101 UFC/cm2, respectivamente. Na segunda visita, apenas a

superfície da EED foi responsável pela presença de E. coli, com contagem de

1,7x101 UFC/cm2. O maior índice de contaminação foi observado na terceira visita,

onde todas as superfícies amostradas apresentaram-se contaminadas por E. coli,

com contagens variando de 1,1x101 UFC/cm2 a 6,3x102 UFC/cm2, para o TRA e

EED respectivamente, ficando isenta apenas a superfície do TMC pela sua não

utilização no momento da análise.

Resultados próximos foram relatados em estudo realizado por Battaglini

(2010), com E. coli isolada em 16,2% das superfícies analisadas, apresentando

contagens de 0,9 a 3,0x101 UFC/cm2, indicando contaminação de origem fecal e

ausência de condições higiênico-sanitárias adequadas, uma vez que algumas

superfícies já se encontravam contaminadas no início dos trabalhos, ou seja, logo

após os procedimentos de higienização, enquanto outras contaminaram-se ao longo

dos procedimentos de manipulação.

60

Dados semelhantes foram descritos por Oliveira et al. (2008), que

identificaram em 100% dos estabelecimentos avaliados, coliformes totais, com

contagens variando de 0,43x101 a 2,4x102 UFC/cm2. Para E. coli, os mesmos

autores observaram contaminação em 40% dos estabelecimentos, com enumeração

variando de 0,23x101 a 3,0x101 UFC/cm2. Resultados diferentes foram observados

por Asam e Asooriya (2006), para E. coli em superfície de mesa de processamento

de pescado, com valores de inferiores a 1,0x100 UFC/cm2.

Silva (2006) demonstrou coliformes totais em superfícies de equipamentos,

com contagens médias de 3,0x102 NMP/cm2, sendo esta enumeração reduzida para

valores inferiores a 1,0x100 NMP/cm2, após treinamento e conscientizações dos

funcionários. Nora et al. (2009) em estudo semelhante também isolou coliformes

totais a partir de superfície de esteira transportadora e mesa operacional de material

inoxidável.

Os dados do presente estudo também corroboram com as elevadas

contagens para coliformes totais, observadas por Junqueira e Ferreira (2009) em

superfície de manipulação de alimentos, com 1,0x103 UFC/cm2, alertando assim,

para possíveis riscos à saúde humana na transmissão do patógeno da superfície

para o produto final.

Farias e Freitas (2008) não confirmaram a presença de E. coli em pescado

beneficado em indústria paraenses. O mesmo foi relatado por Uddin et al. (2013) e

Basti et al. (2006), que em pesquisa com peixes recém-capturados demonstra que

tal microrganismo não faz parte da microbiota natural de peixes e aparece, em

decorrência de falhas no processo de higiene durante a manipulação.

Com os resultados obtidos na enumeração de coliformes e E. coli e,

considerando a recomendação da APHA (2001) de 0,2 x 101 UFC/cm2 para a

contagem total de microrganismos, nenhuma das superfícies estudadas estaria

dentro dos padrões recomendados, já que em todas foi constatada presença de

coliformes totais e E. coli, com exceção apenas da superfície do TMC. Demonstra-se

com isso que no estabelecimento em questão, ocorreram erros graves em uma ou

mais etapas da elaboração do produto, deixando evidente a falta de procedimentos

de higienização adequados, visto que foi constatada presença de E.coli logo após os

procedimentos de higienização, com presença também de sujidades macroscópicas

nas superficies analisadas. Tal fato representa risco ao consumidor, já que estas

superfícies contaminadas entram em contato direto com a matéria-prima para

61

elaboração do produto final, podendo desta forma contaminá-las com

microrganismos de origem fecal, sendo um fator de risco para a população que

consumir o alimento.

5.2.4.1 Teste de sensibilidade a antimicrobianos

No teste de sensibilidade antimicrobiana para as cepas de E. coli, observou-

se grande percentual de resistência frente aos antimicrobianos testados,

principalmente para a tetraciclina, gentamicina, cefoxitina e meropenem, que

apresentaram igualmente 87,5% de resistência, e a maior sensibilidade

demonstrada à sulfametoxazol e aztreonam, com 62,5% de susceptibilidade,

conforme Tabela 3. Resultados semelhantes foram observados por Kumaran et al.

(2010) a partir de cepas de E. coli isoladas de pescado na Índia, que apresentaram

56,25% de resistência à ampicilina e mais de 35% de resistência a ciprofloxacina,

corroborando com a presente pesquisa.

Onyuka et al. (2011) em estudo de isolados de E. coli de duas espécies de

peixe no Quênia, obtiveram como resultado a tetraciclina, igualmente com o maior

número de cepas resistentes (73,7%), para uma das espécies avaliada. Entretanto,

a maior freqüência de resistência entre as duas espécies de peixe foi demonstrada

para a ampicilina, com 73,7 e 72,2%, enquanto a ciprofloxacina apresentou somente

cepas sensíveis, divergindo dos resultados contidos na Tabela 3. Jeyasanta et al.

(2012) também ressaltaram a importância da variabilidade de resistência antibiótica

de cepas de E. coli, demonstrando entretanto, maior frequência em relação a

vancomicina e penicilina, e baixa resistência para gentamicina e ciprofloxacina,

contradizendo os achados na atual pesquisa.

Resultados divergentes foram constatados por Seung-Hee et al. (2012), a

partir de 179 cepas de E. coli isoladas em peixes comerciais, das quais 109 (60,9%)

não apresentaram resistência a nenhum dos antibióticos testados, enquanto as

demais cepas apresentaram resistência para tetraciclina, ampicilina e

sulfametoxazole, com 30,7%, 6,7% e 6,7%, respectivamente.

62

Os achados inclusos na Tabela 3 estão em conformidade com os de Franco

(2002), que afirma serem as cepas de E. coli em sua grande maioria, resistentes aos

antibióticos testados.

A literatura consultada e os dados obtidos neste trabalho advertem para uma

possível evolução quantitativa de cepas de E. coli resistentes, além do risco de

formação de biofilmes na indústria, constituíndo assim um sério problema de Saúde

Pública pela transferência destas cepas resistentes para a matéria-prima e

consequentemente na dificuldade do tratamento das infecções adquiridas.

A presença de cepas E. coli em pescado pode ser atribuída às más condições

sanitárias de armazenamento, manipulação e transporte da matéria-prima, uma vez

que esse microrganismo não faz parte da microbiota natural do pescado (AUTIO et

al., 1999; BASTI et al., 2006; FARIAS; FREITAS, 2008; UDDIN et al., 2013). Tal fato

demonstra a necessidade de se colocar em prática padrões de higiene, como as

Boas Práticas de Fabricação (BPF), Procedimentos Padrão de Higiene Operacional

(PPHO) e Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), já

implementados no estabelecimento ora estudado, porém não aplicados

corretamente, objetivando assim proporcionar ao consumidor um alimento seguro e

de melhor qualidade.

5.2.5 Isolamento e identificação de Listeria spp.

Com relação à Listeria spp. verificou-se que das amostragens realizadas, nos

pontos considerados críticos para a produção, apenas na primeira visita, foi

detectada sua presença; na superfície do Tanque de Recepção Durante o

processamento (TRD). Os dados encontrados corroboram com os descritos por

Gudbjornsdóttir et al. (2004), com observação de Listeria spp. em equipamentos de

indústria de pescado, tanto antes quanto durante o processamento dos peixes. Chen

et al. (2010), também detectaram Listeria spp. em superfície de indústrias de

pescado.

Cruz e Fletcher (2011) confirmaram a presença de Listeria spp. no ambiente

de processamento de indústrias de mexilhão na Nova Zelândia, acarretando assim

em fonte de contaminação para o produto final.

63

Resultados similares foram descritos por Conter et al. (2008), em estudo

realizado em planta de processamento de salmão defumado, na Itália, onde os

principais pontos identificados de contaminação foram a mesa de aço inoxidável e o

fatiador. Os autores relataram ainda que o número de amostras positivas no

pescado foram maiores no produto final, comprovando assim a contaminação pelo

patógeno em toda a linha de produção.

Autio et al. (1999) avaliaram os pontos de contaminação de peixes na

indústria, e concluíram que, na maioria dos casos, a contaminação da carne desses

animais ocorre durante o seu processamento.

Nesse contexto, os dados da presente pesquisa refletem uma condição

deficiente na higienização das superficies dos equipamentos. Mesmo tendo sido

identificado Listeria spp. somente na primeira visita, sua presença torna-se um fator

de risco para a contaminação do produto final e para a saúde do consumidor.

Ratifica-se assim a importância dos procedimentos de higiene serem realizados de

forma eficaz pela indústria, objetivando melhorar a qualidade e segurança dos seus

produtos.

5.2.6 Pesquisa de Bacillus cereus

A presença de bactérias do grupo B. cereus foi observada nas superfícies da

Esteira de Evisceração Antes (EEA) e Durante o processamento do pescado (EED),

com contagens de 1,4x103 UFC/cm2 e 2,5x103 UFC/cm2, respectivamente. Tais

resultados correspondem apenas a análise das amostras referentes à terceira visita,

não tendo sido constatada sua presença nas demais.

Em pesquisa semelhante, conduzida por Asam e Asooriya (2006), também

foi relatado isolamento de B. cereus a partir de superfícies de indústria de

processamento de pescado.

Coelho et. al (2010) observaram em 85% do total de amostras analisadas,

microrganismos do gênero Bacillus, sendo equipamentos e utensílios os

responsáveis pelas maiores contagens, 1,6x100 UFC/cm2 em superfícies de pré-

preparo de carnes e 1,2x104 UFC/cm2 em cubas de aço inoxidável.

64

Apesar dos resultados constatados no presente estudo, com a observação de

Bacillus cereus na superfície de equipamentos, em apenas uma das visitas, e da

falta de parâmetros para tal na legislação brasileira, sugere-se a adoção de medidas

eficazes de controle higiênico-sanitário, pela indústria em questão, visando reduzir

esta contaminação, principalmente pela detecção ter sido realizada antes do início

das operações, o que demontra falhas nos procedimentos de higienização. Vale

ressaltar a resistência destas bactérias, devido sua capacidade de formação de

esporos e, consequentemente, a dificuldade em removê-las, facilitando assim sua

permanência no ambiente operacional, podendo ocasionar a contaminação da

matéria-prima e colocando assim em risco a saúde dos consumidores.

5.3 AVALIAÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME EM SUPERFÍCIE DE AÇO

INOXIDÁVEL

As médias obtidas da formação de biofilmes a partir de cepas de Escherichia

coli isoladas de superfície de equipamentos encontram-se dispostas na tabela 4. A

evolução do crescimento do biofilme pode ser observada graficamente na figura 12.

65

Tabela 4: Formação de biofilme por cepa controle e cepas de E. coli isoladas de superfícies de equipamentos sobre cupons de aço inoxidável AISI 304 #4

*Média de três repetições em duplicata. **Desvio Padrão (DP). Diferença entre letras minúsculas nas colunas indica presença de diferença estatística (p<0,05) entre os tempos analisados. Diferença entre letras maiúsculas na mesma coluna indica presença de diferença estatística (p<0,05) entre as amostras. Controle (ATCC 00033). EED1 (Esteira de Evisceração Durante processamento do pescado primeira visita). EED2 (Esteira de Evisceração Durante processamento do pescado segunda visita). EED3 (Esteira de Evisceração Durante processamento do pescado terceira visita).

Figura 12: Evolução da população de células sésseis de

Escherichia coli isoladas de superfície de equipamentos

sobre cupons de aço inoxidável AISI 304 # 4.

Contagem (log UFC/cm2 *± DP**) E. coli

6h 12h 24h 72h

C

EED1

1.180aAB ± 0.273

0.401aA ± 0.044

4.563bA ± 0.328

2.905bB ± 0.458

4.723bA ± 0.252

6.127cB ±0.351

5.958cA ± 0.689

5.630cA ± 0.792

EED2

1.190aAB ± 0.359

3.858bAB ± 0.755

5.766cAB ± 0.827

6.404cA ± 0.332

EED3

1.473aB ± 0.407

4.685bA ± 0.374

4.773bA ± 0.119

5.461bA ± 0.787

log

UF

C/c

m2

Tempo (h)

7 6 5 4 3 2 1 0

66

Na análise dos resultados, evidenciou-se capacidade de aderência e

formação de biofilmes por todas as cepas de E. coli, isoladas da superfície da

Esteira de Evisceração Durante o processamento (EED), nas três visitas realizadas.

As maiores contagens de células sésseis foram observadas após 72 horas de

incubação, para as cepas isoladas na segunda (EED2) e terceira visitas (EED3),

com 6,40 e 5,40 log UFC/cm2, respectivamente. Todavia, o isolado EED1

apresentou maior contagem com 24 horas de exposição, 6.1 log UFC/cm2,

demonstrando um decréscimo em sua evolução, quando comparado com 72 horas,

5.6 log UFC/cm2. Tal fenômeno pode ser observado em biofilmes maduros, o que

segundo alguns autores pode levar de algumas horas até semanas para acontecer,

quando passam a apresentar padrões de crescimento alterados, podendo suas

células se desprender e contaminar o alimento que entrar contato (KASNOWSKI et

al., 2010; OLIVEIRA et al., 2010; MEDONLINE, 2008; MACEDO, 2006).

Ortega et al. (2010) avaliaram o comportamento da adesão de cepas de

Escherichia coli em superfície de aço inoxidável e observaram que as células

planctônicas atingiram a fase estacionária com 3 a 4 horas de incubação, tempo

inferior ao observado no presente estudo.

De acordo com Stoodley et al. (2002) o aumento de células aderidas,

conforme figura 12, faz parte do processo de maturação do biofilme e decorre da

divisão celular e da coadesão de outras células.

Segundo Andrade et al. (1998), para se considerar um biofilme é necessário

um número mínimo de 7 log UFC/cm2 de células aderidas à superfície. Por outro

lado, Ronner e Wong (1993) e Wirtanen et al. (1996) consideram como biofilme

qualquer contagem de células após remoção das células planctônicas. Diante disso,

pode-se afirmar que as cepas do presente trabalho apresentaram capacidade de

formação de biofilme em superfície de aço inoxidável e, desta forma, representam

risco potencial por serem capazes de formar biofilme nas linhas de processamento.

Neste contexto, mesmo biofilmes mono-espécies são preocupantes em uma

indústria de alimentos, pois a produção da matriz exopolissacarídea pelo biofilme,

pode ser fator predisponente para a adesão de células de outros microrganismos,

formando assim biofilmes multi-espécies, como relatado por Sasahara e Zottola

(1993), que verificaram que a formação de biofilmes por Listeria monocytogenes foi

aumentada na presença de Pseudomonas fragi.

67

Ainda com relação a tabela 4, observa-se que as contagens apresentaram

diferença significativa entre os tempos 6, 12 e 24 horas, para todas os isolados,

porém não diferiram estatisticamente entre 24 e 72 horas de incubação. Na análise

entre as cepas amostradas, constatou-se diferença significativa entre EED1 e EED3,

com exceção do tempo 72 horas, onde não houve diferença significativa, enquanto

EED1 e EED2 não apresentaram diferença estatística durante todo o experimento.

Dados semelhantes foram relatados por Rivas et al. (2007), em trabalho para

avaliar a formação de biofilmes em aço inoxidável, por cepas de E. coli. A

capacidade de adesão apresentou diferença significativa entre as cepas, tanto para

24 horas como para 48 horas de incubação, não tendo sido constatada diferença

significativa após 48 horas. As contagens variam de <3 log UFC/cm2 a 5 log

UFC/cm2 para 24 e 48 horas, respectivamente.

Os resultados obtidos corroboram em parte com Asam e Asooriya (2006), que

observaram formação de biofilme de E. coli em superfícies de indústrias de

processamento de pescado, no Sri Lanka, com contagens de células sésseis <1

UFC/cm2 ao longo de 72 horas de exposição, em mesa de filetagem e monobolocos.

Apesar da aderência de células sésseis relatada pelos autores ter sido menor do

que a identificada no presente estudo, ambas refletem a necessidade de

implantação de sistemas de qualidade e aplicação efetiva de agentes de limpeza e

sanitizantes. Caso contrário, os microrganismos aderidos podem não ser

completamente removidos das superfícies e instalações que entram em contato

direto com o pescado, contribuindo para o desenvolvimento de biofilmes, que podem

atuar como fonte de contaminação crônica para o produto, reduzindo seu prazo de

vida comercial, além do risco de veicular doenças ao consumidor (CAIXETA, 2008).

Para Meyer (2003) não é possível higienizar as superfícies com frequência

suficiente para impedir a ligação de células à superfície, uma vez que a adesão pode

ocorrer em questão de poucos minutos. Porém, sugere que a remoção de biofilmes

durante a limpeza é significativamente aumentada pela aplicação de força mecânica

e uso de sanitizantes à superfície, desde que não gerem aerossóis, o que poderia

espalhar ainda mais bactérias pelo ambiente.

De acordo com Johnson et al. (2000) biofilmes são hidrofóbicos e resistem

bem a lavagem com água, ou seja, mesmo utilizando água fervente no enxágue, não

removeria completamente as células aderidas das superfícies se não fosse aplicada

força mecânica.

68

Resultados adversos foram obtidos por Guðbjörnsdóttir (2005), com

observação de bactérias aderidas em vários pontos nas linhas de processamento de

frutos do mar, apesar da limpeza completa e desinfecção serem realizados

regularmente pela indústria. Tal fato talvez justifique-se pela ausência de força

mecânica adequada durante os procedimentos de higienização.

Uma provável explicação para os resultados encontrados seria devido a rotina

de higienização antes e após o processamento remover somente sujidades

superficiais, quando as removia. Para solucionar este problema, seria necessário

além da utilização de agentes sanitizantes, conforme já dito anteriormente, a

realização de ação mecânica suficiente nas superfícies de contato com os alimentos,

atendendo desta forma a um correto programa de higienização e objetivando com

isso, minimizar a formação de biofilmes bacterianos. Desta forma evitar-se-ia assim

risco de veiculação de doenças para a população consumidora, uma vez que após

maduros, os biofilmes podem destacar suas células e contaminar os alimentos que

entram em contato direto com a superfície colonizada, sendo as BPF e o PPHO

requisitos mínimos para a obtenção de alimentos seguros, devendo por isto serem

utilizados por todas as indústrias alimentícias que desejam produzir alimentos com

tal característica.

5.4 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE SANITIZANTES NA REMOÇÃO DE BIOFILMES

FORMADOS

Os resultados da avaliação da ação dos sanitizantes a base de biguanida

polimérica e quaternário de amônio sobre as células sésseis de E. coli em biofilme

formado nas superfícies de aço inoxidável, encontram-se dispostos nas Tabelas 5, 6

e 7.

69

Tabela 5 Efeito da aplicação de sanitizantes sobre biofilmes de E. coli (EED1)

formados em cupons de aço inoxidável AISI 304 #4 a partir de ponto amostrado em

indústria de pescado.

*Média de três repetições em duplicata. EED1 (Esteira de Evisceração Durante processamento do pescado - primeira visita).

Tabela 6 Efeito da aplicação de sanitizantes sobre biofilmes de E. coli (EED2)

formados em cupons de aço inoxidável AISI 304 #4 a partir de ponto amostrado em

indústria de pescado.

*Média de três repetições em duplicata. EED2 (Esteira de Evisceração Durante processamento do pescado - segunda visita).

Tempo

Contagem Inicial

(log UFC/cm2)

Contagem Final (log UFC/cm2)

biguanida polimérica quaternário de amônio

(500mg.L-1) (495mg. L-1)

6 horas <1 <1 <1

12 horas 2,007 <1 <1

24 horas 6,519 3,635 3,792

Tempo

Contagem Inicial

(log UFC/cm2)

Contagem Final (log UFC/cm2)

biguanida polimérica quaternário de amônio

(500mg.L-1) (495mg. L-1)

6 horas <1 <1 <1

12 horas <1 <1 <1

24 horas 4,424 <1 1,484

70

Tabela 7 Efeito da aplicação de sanitizantes sobre biofilmes de E. coli (EED3)

formados em cupons de aço inoxidável AISI 304 #4 a partir de ponto amostrado em

indústria de pescado.

*Média de três repetições em duplicata. EED3 (Esteira de Evisceração Durante processamento do pescado - terceira visita).

Para os biofilmes produzidos foram constatadas reduções nas contagens

iniciais de células sésseis de E. coli, isoladas na primeira e segunda visitas, EED1 e

EED2 respectivamente, a níveis inferiores a 1 log UFC/cm2, após sanitização com

biguanida ou quaternário de amônio, para os tempos 6 e 12 horas de incubação,

atendendo assim ao padrão internacional de contagens inferiores a 1 log UFC/cm2

para superfícies devidamente sanitizadas (ICMSF, 2008). Entretanto, para os

biofilmes produzidos com 24 horas de incubação a contagem bacteriana apresentou

redução de apenas 3 log, mesmo após contato com soluções sanitizantes, sendo

reduzido para valores < 1 log UFC/cm2 apenas no isolado EED2, após exposição a

biguanida, demonstrando maior resistência ao quaternário de amônio, conforme

tabelas 5 e 6.

Os dados obtidos corroboram com os relatos de Germana e Germano (2003),

que observaram que sanitizantes a base de quaternário de amônio apresentam

pouca eficácia sobre bactérias Gram negativas.

Para Maillard (2002) a atividade antimicrobiana dos sanitizantes pode variar

entre diferentes cepas de uma mesma espécie, o que justificaria os resultados

obtidos no presente estudo. Não obstante, outra explicação para a resistência ao

processo de desinfecção, seria a presença de biofilmes pré-formados nas

superfícies amostradas, possibilitando assim a persistência e sobrevivência da E.

coli no ambiente operacional (OLIVEIRA et al., 2010).

Tempo

Contagem Inicial

(log UFC/cm2)

Contagem Final (log UFC/cm2)

biguanida polimérica quaternário de amônio

(500mg.L-1) (495mg. L-1)

6 horas <1 <1 <1

12 horas <1 <1 <1

24 horas 5,383 <1 <1

71

A resistência das células aos sanitizantes é descrita como a habilidade que

alguns microrganismos apresentam em produzir substâncias poliméricas

extracelulares, sendo estas responsáveis por conferir proteção aos microrganismos,

pois agem como barreira física impedindo que sanitizantes cheguem a seus sítios de

ação (WONG, 1998; DUNNE, 2002; PARIZZI et al., 2004; MACEDO, 2006 e

VESTBY et al., 2009)

Resultados mais satisfatórios foram constatados com a cepa EED3, isolada

na terceira visita, com redução das contagens iniciais após sanitização com

biguanida polimérica e quaternário de amônio, para níveis inferiores a 1 log UFC/cm2

para todos os tempos avaliados, conforme tabela 7, atendendo desta forma a

recomendação internacional de contagens inferiores a 1 log UFC/cm2 (ICMSF,

2008).

De acordo com o padrão internacional, para que um sanitizante seja

considerado efetivo, é necessária a redução da contagem de microrganismos em 4

log ou mais (Anon, 2001 apud VESTBY et al., 2009), o que demonstra que no

estudo em questão, a eficácia dos sanitizantes testados só foi confirmada para os

biofilmes formados após 24 horas pela cepa EED3, isolada na terceira visita.

Guðbjörnsdóttir (2005) constatou eficácia do quaternário de amônio em

estudo laboratorial simulando condições de processamento industriais de bacalhau e

arenque.

Bagge-Ravn et al. (2003) relatam redução na contagem bacteriana após os

procedimentos de higienização em indústrias de salmão defumado, semi-conservas

de arenque e em indústrias de processamento de caviar.

Os resultados apresentados nas tabelas 5, 6 e 7 refletem a inadequação dos

procedimentos descritos no PPHO implementado na indústria, uma vez que o

sanitizante biguanida, utilizado pela mesma e recomendado para a higienização de

superfícies e equipamentos de indústria de pescado, apresentou os melhores

resultados em quase a totalidade dos tempos analisados, com contagens em sua

maioria, dentro do preconizado pelo padrão internacional (<1 log UFC/cm2). Tal fato

inviabilizaria o isolamento de cepas de E. coli de superfícies devidamente

sanitizadas, excetuando-se pela presença de biofilmes pré-formados, ratificando a

inadequação dos procedimentos de limpeza e sanitização aplicados, e

demonstrando a necessidade de adequação dos mesmos.

72

6 CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos neste experimento, pode-se concluir que: Diante das não-conformidades constatadas através da lista de verificação

aplicada, sugere-se a revisão do manual de boas práticas de fabricação, já

documentado e implementado na indústria, além de um maior monitoramento e

supervisão das boas práticas durante o período de manipulação. Recomenda-se

a realização de um treinamento efetivo dos manipuladores e reformas na parte de

edificações para adequação do espaço físico às legislações vigentes.

Os resultados das análises bacteriológicas de superfícies de contato direto com o

produto apresentaram resultados insatisfatórios de acordo com os padrões

científicos estabelecidos. O pescado processado sob esta superfície contaminada

pode constituir fator de risco para o consumidor e possibilidade de formação de

biofilmes por cepas resistentes, uma vez que foram constatadas ausência de

procedimentos higiênicos eficazes, com elevada contagem de BHAM, coliformes

totais e E. coli, inclusive antes de começarem os procedimentos operacionais, ou

seja, logo após a higienização dos equipamentos.

As cepas de E. coli isoladas das superfícies dos equipamentos apresentaram

grande espectro de resistência aos antimicrobianos testados e de uso rotineiro na

antibioticoterapia, constituindo-se em um problema de saúde pública,

principalmente para indivíduos classificados como grupo de risco, pela

possibilidade de colonização do trato gastrientestinal com microrganismos de

múltipla resistência.

Os resultados obtidos comprovaram que os isolados de E. coli foram capazes de

formar biofilmes em superfície de aço inoxidável, reforçando a evidência de um

procedimento ineficaz de higienização e/ou presença já existente de biofilmes nas

superfícies avaliadas, uma vez que estes microrganismos foram encontrados nas

mesmas superfícies, em todas as visitas realizadas. Vale ressaltar que, a

presença de biofilmes na indústria de alimentos pode acarretar sérios problemas

73

de saúde pública pela contaminação da matéria-prima com a superfície

colonizada.

Na avaliação da eficácia dos sanitizantes observou-se melhores resultados para o

sanitizante biguanida, o mesmo utilizado pela indústria avaliada. Este foi capaz de

reduzir as contagens “in vitro” dos biofilmes formados, atendendo ao padrão

internacional de contagem de microrganismos para superfícies devidamente

sanitizadas. O que deixa claro a possibilidade de existência de biofilmes pré-

formados, e consequentemente, inadequação dos procedimentos padrões de

higiene operacional.

74

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90

8 APÊNDICE

8.1 “CHECK-LIST” APLICADO À INDÚSTRIA

1) INSTALAÇÕES , EQUIPAMENTOS E EDIFICAÇÕES C NC NA

a) Forro ou teto (cor clara), paredes (cor clara) e piso são de material durável, impermeável e de fácil higienização e em adequado estado de conservação (sem necessitar de reparos – livre de defeitos, rachaduras, trincas, buracos e outros?

b) Há existência de ângulos abaulados entre as paredes e o piso e entre as paredes e o teto?

c) Há correta vedação de portas, janelas e outras aberturas impedindo a entrada de vetores e outros animais atarvés de telas milimétricas ou outro sistema? Estão em adequado estado de conservação (livres de falhas, rachaduras, umidade, descascamento e outros)?

d) A declividade do piso permite o rápido escoamento das águas residuais e resultante da higienização, sem que haja acúmulo de resíduos?

1.1) AVALIAÇÃO DE VESTIÁRIOS E SANITÁRIOS (PARA OS MANIPULADORES) E AVALIAÇÃO DE BARREIRAS

SANITÁRIAS

C

NC

NA

a) Os vestiários e sanitários comunicam-se diretamente com as seções de produtos comestíveis?

b) Quando localizados isolados da área de produção seu acesso é feito através de passagens cobertas e calçadas?

c) As referidas instalações com vasos sanitários, mictórios e lavatórios íntegros estão em número suficiente (em proporção e tamanho adequados ao número de funcionários)?

d) São independentes para cada sexo, identificados e de uso exclusivo para os manipuladores de alimentos?

e) se os vestiários, sanitários e barreiras sanitárias foram projetados e construídos de forma que permitam uma boa manutenção das condições higiênico-sanitárias destas instalações?

91

f) A manutenção das condições higiênicas é praticada nas referidas instalações?

g) As instalações sanitárias dispõem de água, torneiras sem fechamento manual, sabão liquido e toalha de papel não reciclado para as mãos ou outros sistema higiênico e seguro para secagem?

h) Há a presença de lixeiras com tampas e acionamento não manual?

i) A coleta do lixo é feita com frequência para não permitir o acúmulo e possibilidade de atrair vetores?

j) Na entrada das seções as barreiras sanitárias dispõem de equipamentos para higienização de botas (pedilúvio) e mãos, água e sabão liquido, sendo esta prática exercitada eficientemente pelos trabalhadores?

l) O estabelecimento disponibiliza pessoas que efetuam registro de controle da manutenção de higiene do ambiente e do pessoal?

m) Os cuidados referentes à troca de uniformes nos vestiários são atendidos?

1.2) AVALIAÇÃO DA ILUMINAÇÃO C

NC

NA

a) A intensidade e qualidade da iluminação são adequadas às operações realizadas nos diferentes setores do estabelecimento?

b) A intensidade e qualidade da iluminação permitem avaliar as condições higiênicas de utensílios e equipamentos?

c) A intensidade e qualidade da iluminação nas barreiras sanitárias, vestiários, armários e sanitários permitem avaliar as condições higiênicas dos mesmos?

d) As luminárias dispõem de protetores contra quebra e estão em adequado estado de conservação?

e) A disposição das luminárias evita a formação de zonas de sombreamento, reflexos fortes e contrastes excessivos?

92

 

1.4) AVALIAÇÃO DO CONTROLE INTEGRADO DE VETORES E PRAGAS URBANAS

C

NC NA

a) O estabelecimento possui programa de controle de vetores e pragas urbanas?

b) O estabelecimento possui programa escrito como parte das Boas Práticas de Fabricação?

c) O programa de controle de pragas é monitorado regularmente?

d) As áreas externas são mantidas de maneira a evitar a proliferação de insetos e roedores (sem a presença de entulhos, restos de alimentos e acúmulo de água, com a grama aparada e o pátio urbanizado)?

e) Todas as áreas internas do estabelecimento são mantidas de forma a evitar o acesso, abrigo e a proliferação de insetos, roedores e outras pragas?

f) Os produtos químicos utilizados no estabelecimento são aprovados no órgão competente para tal finalidade?

g) Os produtos possuem instruções de uso?

h) As substâncias são mantidas em locais específicos e sob controle restrito?

i) Existem dispositivos para controle de pragas na área externa e no perímetro industrial?

1.3) AVALIAÇÃO DA VENTILAÇÃO E CLIMATIZAÇÃO C NC NA

a) A ventilação é adequada ao controle de odores indesejáveis e vapores que possam alterar os produtos ou mascarar odores de deterioração?

b) A ventilação é adequada ao controle da condensação evitando condições sanitárias inadequadas que levem à alteração do produto?

c) A ventilação gera conforto térmico aos operadores?

d) Os equipamentos utilizados para ventilação artificial são higienizados e apresentam manutenção adequada ao equipamento?

e) Há registros periódicos dos procedimentos de limpeza e manutenção dos componentes do sitema de climatização afixados em local visível?

f) Há sistema de exaustão e/ou insuflamento com troca de ar capaz de prevenir contaminações e dotados de filtros adequados?

93

j) Os produtos incluídos nos dispositivos apresentam proteção contra intempéries e são renovados sistematicamente?

1.5) AVALIAÇÃO DA ÁGUA DE ABASTECIMENTO E GELO

C

NC

NA

a) O estabelecimento dispõe de documentos que comprovam que a água de abastecimento atende à legislação para água potável e hiperclorada?

b) A água está presente em pressão adequada e à temperatura indicada, nas áreas de processamento de produtos e demais setores do estabelecimento, tais como: sala de limpeza de equipamentos, utensílios e recipientes, instalações sanitárias da fábrica e outros?

c) Se o estabelecimento utiliza água exclusivamente da rede pública, a potabilidade da água é comprovada pelo boletim de análise semestral da agência fornecedora?

d) Se o estabelecimento utiliza gelo de fabricação própria ou de terceiros há comprovação da qualidade por meio de laudo laboratorial?

e) O meio de acondicionamento e transporte do gelo evita a sua contaminação?

f) Se o estabelecimento utiliza água da rede privada, ou de terceiros a potabilidade da água é comprovada por análise laboratorial?

g) O abastecimento de água e gelo atende às necessidades do estabelecimento?

h) Os reservatórios de água, fábrica e silo de gelo são mantidos em condições adequadas?

i) O estabelecimento dispõe de planta hidráulica identificando os pontos de colheita de amostras para análise?

j) Há controle diário do pH e cloro nos pontos indicados na planta?

94

1.6) AVALIAÇÃO DE ÁGUAS RESIDUAIS C NC NA

a) O sistema de escoamento das águas residuais é stisfatório?

b) O sistema de tubulação conduz as águas residuais ao destino correto?

c) O sistema de tubulação proporciona adequada drenagem dos pisos?

d) O sistema de tubulação é instalado de maneira a evitar o refluxo de água e gases?

e) Existe conexão cruzada entre águas residuais e água de abastecimento?

1.7) AVALIAÇÃO DA HIGIENIZAÇÃO DE INSTALAÇÕES, EQUIPAMENTOS, MÓVEIS E UTENSÍLIOS

C

NC

NA

a) Todas as dependências da indústria, assim como as superfícies dos equipamentos com contato direto com os produtos - equipamentos, utensílios ou instrumentos de trabalho (facas, ganchos, grelhas, etc.) são mantidos em condições de higiene (limpas e sanitizadas), antes, durante e após a realização dos trabalhos para evitar condições anti-higiênicas ou alterações nos produtos?

b) As câmaras frias atendem às mais rigorosas condições de higiene, iluminação e ventilação e, são limpas e desinfetadas pelo menos uma vez por ano?

c) A higienização dos instrumentos de trabalho é feita através da lavagem e esterilização dos mesmos com temperatura mínima de 82,2ºC, por um tempo mínimo de 20 segundos, ou outros procedimentos de esterilização com eficácia comprovada?

d) Na existência de uma central de esterilização, anexa ao setor, permite-se a troca de facas de cabo de cores diferentes a períodos regulares?

e) Os agentes de limpeza, sanitizantes e produtos químicos (lubrificantes e outros) utilizados no estabelecimento são previamente aprovados pelo DIPOA, atóxicos, não transferem odor ou sabor estranho aos produtos e são eficazes sob as condições previstas de uso?

f) Os recipientes são resistentes durante sua utilização, não alteram as características gerais do produto, são de fácil limpeza e encontram-se em bom estado de conservação?

95

g) O estabelecimento executou os procedimentos pré-operacionais previstos no PPHO?

h) Foram identificados instalações e equipamentos mal higienizados no estabelecimento?

i) O Plano PPHO contempla a freqüência do monitoramento?

j) Mesmo que o plano não contemple a freqüência de monitoramento, o estabelecimento supre esta deficiência com o monitoramento diário dos procedimentos previstos no plano?

l) O estabelecimento, rotineiramente, avalia a eficiência do PPHO para prevenir a contaminação direta dos produtos?

m) O estabelecimento realiza controle de superfícies ou adota outro procedimento para avaliar se o PPHO é efetivo?

n) Se ocorreram mudanças nas instalações e equipamentos, utensílios, operações ou de pessoal, o PPHO foi revisado visando a manutenção da eficiência?

o) Se há contaminação direta ou outro tipo de alteração de produtos, o estabelecimento implementa ações corretivas que restaurem as condições sanitárias, previnam novas ocorrências e dêem o destino apropriado ao produto?

p) O estabelecimento mantém registros suficientes assinados, carimbados e datados, documentando a execução dos procedimentos previstos no PPHO?

q) Há funcionário responsável pela implementação e monitoramento dos procedimentos previstos no PPHO? Os registros são assinados, carimbados e datados por esse funcionário?

r) Os registros são devidamente arquivados, no mínimo, por 12 meses?

s) Os registros do PPHO refletem as condições higiênico-sanitárias do estabelecimento?

2) MANIPULADORES

2.1) AVALIAÇÃO DO VESTUÁRIO C NC NA

a) Os uniformes (de cor clara) e acessórios usados pelo manipulador estão em bom estado de limpeza e conservação?

96

b) Os uniformes são trocados na freqüência necessária, lavados na indústria e, em caso contrário, há contrato adequado p/a atividade?

c) O manipulador utiliza adornos pessoais, relógio, maquiagem, unhas compridas, cosméticos em geral, barba/bigode, cabelos desprotegidos e roupas civis expostas?

2.2) AVALIAÇÃO DOS HÁBITOS HIGIÊNICOS C NC NA

a) Todo pessoal que trabalha, direta ou indiretamente, com as matérias primas ou produtos em quaisquer fases do processo, exercitam práticas higiênicas que possam evitar a alteração de produtos ou a contaminação cruzada, como lavagem e desinfecção de mãos e antebraços à entrada das unidades industriais?

b) Há cartazes de orientação aos manipuladores sobre a correta lavagem das mãos e demias hábitos de higiene, afixados em locais apropriados?

c) Os manipuladores espirram sobre os alimentos, cospem, tossem, fumam ou praticam outros atos que possam contaminar o alimento?

 

2.3) AVALIAÇÃO E CONTROLE DO ESTADO DE SAÚDE C NC NA

a) Todos os funcionários que trabalham no interior da indústria são portadores de atestados de saúde atualizados para o exercício de manipulação de alimentos?

b) A ocorrência de doenças infecciosas, lesões abertas, purulentas, portadores inaparentes ou assintomáticos de agentes de toxinfecções alimentares e semelhantes, implica no afastamento temporário do manipulador envolvido em atividades com matérias-primas ou produtos de pescado?

2.4) AVALIAÇÃO DO PROGRAMA DE CAPACITAÇÃO E SUA SUPERVISÃO

C

NC

NA

a) Os manipuladores recebem treinamento adequado e contínuo com bordagem dos procedimentos necessários para garantir a inocuidade do produto manipulado?

b) Existem registros dessas capacitações?

97

c) Existe um supervisor comprovadamente capacitado para verificar a higiene pessoal e a manipulação dos alimentos pelos funcionários?

3) AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO

3.1) MATÉRIA PRIMA, INGREDIENTES E EMBALAGENS C NC NA

a) As matérias primas contidas nos veículos de transporte são acompanhadas de Certificado Sanitário ou Guia de Trânsito, em que estejam preenchidos todos os detalhes pertinentes à sua correta identificação, inclusive as suas eventuais habilitações?

b) Durante a obtenção da material prima, as operações são executadas de forma a prevenir a contaminação do produto (evitando contato com plataformas, colunas, paredes e outras superfícies)?

c) O pescado fresco recebido apresenta as características organolépticas próprias para consumo (1 - superfície do corpo limpa, com relativo brilho metálico; 2 - Olhos transparentes, brilhantes e salientes, ocupando completamente as órbitas; 3 - guelras róseas ou vermelhas, úmidas e brilhantes com odor natural, próprio e suave; 4 - ventre roliço, firme, não deixando impressão duradoura à pressão dos dedos; 5 - escamas brilhantes, bem aderentes à pele e nadadeiras apresentando certa resistência aos movimentos provocados; 6 - carne firme, consistência elástica, de cor própria à espécie; 7 - vísceras íntegras, perfeitamente diferenciadas; 8 – ânus fechado; 9 - cheiro específico, lembrando o das plantas marinhas.) ?

d) As matérias-primas recebidas têm seu destino corretamente observado durante o processamento, conforme habilitação lançada na certificação?

e) As matérias primas e produtos são mantidos em temperaturas compatíveis com a sua natureza (resfriadas, congeladas e outras) e de forma organizada que permita procedimentos eficazes de inspeção?

f) Depois de submetido ao congelamento o pescado é mantido em câmara frigorífica a -15oC ?

g) Após descongelado o pescado é novamente recolhido às câmaras frigoríficas?

98

h) As matérias-primas armazenadas no mesmo ambiente apresentam compatibilidade e estão separadas por habilitação?

i) As seções de manipulação, processamento e estocagem de produtos comestíveis são isoladas daquelas de produtos não comestíveis?

j) As seções de manipulação de matérias-primas ou produtos acabados em diferentes fases de produção são isoladas uma das outras para prevenir ou reduzir contaminações cruzadas?

l) Nas etapas de manipulação e processamento, as operações são executadas de forma a prevenir a contaminação do produto (evitando acúmulo de produto, contaminação cruzada, contrafluxos e embalagens desprotegidas)?

m) Os operários que trabalham em setores com subprodutos não comestíveis são utilizados na manipulação de produtos comestíveis?

n) Os ingredientes são manipulados e empregados de acordo com as instruções de uso na formulação aprovada e mantidos no local de preparação do produto em quantidades suficientes ao seu consumo por períodos restritos?

o) Os ingredientes são armazenados em local separado, mantido em condições higiênicas e, se preparados previamente, o suficiente e em porções para cada uso?

p) A embalagem original que acondiciona o ingrediente o acompanha até o ambiente de preparação da formulação?

q) Ingredientes com embalagens rompidas ou acúmulos de líquidos são reavaliados quanto ao seu destino?

r) Os produtos, logo após sua obtenção, recebem embalagem primária previamente à secundária?

s) A embalagem secundária é realizada em ambiente separado e com temperatura controlada? Caso essa operação seja realizada no mesmo ambiente da primária, há risco sanitário?

t) As embalagens secundárias são previamente aprovadas, de primeiro uso, de modo a garantir as características gerais do produto (inocuidade e odor) e também são resistentes quando do transporte e armazenagem?

99

3.2) CONTROLE DE TEMPERATURA DURANTE ETAPAS DO PROCESSAMENTO

C

NC

NA

a) O estabelecimento realiza com eficiência e regularidade, todos os controles de temperatura?

b) Todos os ambientes de trânsito de matérias-primas e produtos, a partir do seu resfriamento, tem temperaturas controladas?

c) As temperaturas dos referidos ambientes são mantidas com uniformidade, sem oscilações consideráveis durante todo o processo?

d) As oscilações indesejáveis ou as não conformidades de temperatura são objeto de ações corretivas e preventivas para evitar novos desvios?

e) O equipamento destinado à esterilização é provido de manômetro para controle da pressão e termógrafo para registro gráfico da operação?

f) Há certificados que comprovem a calibração de instrumentos de controle do processo em instituições especializadas?

g) Os instrumentos de controle do processo estão corretamente identificados?

h) Procede-se rotineiramente a comparação entre as temperaturas mensuradas, simultaneamente, por termômetro e termorregistrador?

4) AVALIAÇÃO DO ARMAZENAMENTO DO PRODUTO FINAL E SEU TRANSPORTE

C

NC

NA

a) Há compatibilidade dos produtos armazenados no mesmo ambiente, quanto a sua natureza, temperatura e embalagens?

b) Os produtos são armazenados observando a separação estrita por destino, lote ou partida?

100

LEGENDA: C (conforme), NC (não conforme), NA (não avaliado).

c) Os produtos são armazenados sobre estrados distantes do piso, ou sobre paletes, bem conservados e limpos ou sobre outro sistema aprovado, afastados das paredes e distantes do teto de forma a permitir apropriada higienização, iluminação e circulação de ar?

d) As conservas de pescado submetidas à esterilização só podem ser liberados para o consumo após amostras representativas de todas as partidas dos produtos enlatados, na proporção mínima de 1% (um por cento), terem sido observadas por no mínimo por 10 (dez) dias em estufa a 37o C (trinta e sete graus centígrados). Este procedimento está sendo cumprido?

e) Há controle adequado e existência de planilha de registro de temperatura, para ambientes com controle térmico (pescado congelado/resfriado)?

f) Existe algum tipo de controle de qualidade para o produto final atrelado à programa de amostragem para análise laboratorial do mesmo?

g) A permanência de produtos na expedição observa o tempo estrito necessário às operações de revisão de suas condições higiênico-sanitárias, bem como do atendimento aos requisitos de identificação e certificação exigidos?

h) Os veículos de transporte e contentores de produtos são projetados, construídos e dotados de equipamentos que assegurem a manutenção da temperatura e a ordenação do pescado no seu interior respeitando a natureza do produto (congelados, resfriados, defumados, conservas enlatadas, peixe fresco, etc.) com gelo suficiente, equipamentos de frio e de controle da temperatura em perfeito funcionamento?

i) Os veículos possuem paredes lisas, de fácil limpeza, que não alterem as características originais do produto, vedados perfeitamente ao ingresso de pragas e estanques ao escoamento de líquidos?

101

8.2 ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS

Tabela 1 Resultados das análises bacteriológicas de amostras de superfície em indústria de pescado para: Bactérias Heterotrófica Aeróbias

Mesófilas (BHAM), Stapylococcus coagulase positiva (Staphy. C+), Salmonella spp. (Salm.), Coliformes Totais (Colif. Totais), Escherichia coli

(EC), Listeria spp. (List.) e Bacillus cereus (BC).

Visitas Pontos Amostrados BHAM (UFC/cm2) Staphy. C+ (UFC/cm2)

Salm. (P/A)

Colif. Totais (UFC/cm2)

EC (UFC/cm2)

List. (UFC/cm2)

BC (UFC/cm2)

1

TRA TRD EEA EED TMC

2.0x101 6.9x105

4.4x104 1.5x104 2.0x101

- - - - -

- - - - -

3.9x103 6.8x103 1.4x104 1.8x104

0

- 7.5x101 1.2x102 2.0x101

-

- 4.7x101

- - -

- - - - -

2

TRA TRD EEA EED TMC

2.0x101 6.1x102

2.9x105 3.1x102 1.4x103

- - - - -

- - - - -

1.8x103 3.0x103 3.8x103 9.2x103

0

- - -

1.7x101 -

- - - - -

- - - - -

3

TRA TRD EEA EED TMC

5.5x105 3.4x105

2.5x105 6.5x105 5.5x102

- - - - -

- - + - -

1.4x103 3.1x103 1.1x104 5.8x104

0

1.1x101

2.7x101

2.0x101 6.3x102

-

- - - - -

- -

1.4x103

2.5x103

-

* Média de três repetições em duplicata. **TRA (Tanque de Recepção antes do processamento do pescado). TRD (Tanque de Recepção durante processamento do pescado). EEA (Esteira de Evisceração antes do processamento do pescado). EED (Esteira de Evisceração durante processamento do pescado). TMC (Tanque de Molho de Cobertura). *** (P/A) = Presença/ Ausência. (-) = negativo/ausência.

101

102

Tabela 2 Perfil de susceptibilidade das cepas de Escherichia coli isoladas em superfície de equipamentos frente aos

antimicrobianos.

Cepas de Escherichia coli Antimicrobiano

EED1 EED2 EED3 EEA1 EEA3 TRD1 TRA3 TRD3

Tetraciclina S R R R R R R R

Gentamicina S R R R R R R R

Ciprofloxacina S S R R R R S S

Meropenem S S I S S S S S

Sulfametoxazol S S R S I I S S

Ampicilina R R S S R R R R

Piperacilina/

Tazobactam I S S I I R S S

Cefoxitina S S S S I S S S

Aztreonam S S S R S I S R

*R = Resistente. I = Intermediário. S = Sensível. **EED1 (Esteira de Evisceração Durante processamento – primeira visita). EED2 (Esteira de Evisceração Durante processamento – segunda visita). EED3 (Esteira de Evisceração Durante processamento – terceira visita). EEA1 (Esteira de Evisceração Antes do processamento – primeira visita). EEA3 (Esteira de Evisceração Antes do processamento – terceira visita). TRD1 (Tanque de Recepção Durante o processamento – primeira visita). TRA3 (Tanque de Recepção Antes do processamento – terceira visita).

102

103

Tabela 3 Percentual de classificação do comportamento das cepas de Escherichia

coli isoladas frente aos antimicrobianos testados.

* (-) = ausência

Antimicrobiano Resistente Intermediário Sensível

Tetraciclina 7(87.5%) - 1(12.5%)

Gentamicina 7(87.5%) - 1(12.5%)

Ciprofloxacina 4(50.0%) - 4(50.0%)

Meropenem 7(87.5%) 1(12.5%) -

Sulfametoxazol 1(12.5%) 2(25.0%) 5(62.5%)

Ampicilina 6(75.0%) - 2(25.0%)

Piperacilina/

Tazobactam

1(12.5%) 3(37.5%) 4(50.0%)

Cefoxitina 7(87.5%) 1(12.5%) -

Aztreonam 2(25.0%) 1(12.5%) 5(62.5%)