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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI NAPOLI
“FEDERICO II”
FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI
CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE
TESI DI LAUREA
IN
BIOLOGIA MOLECOLARE
ISOLAMENTO DI UN NUOVO GENE (TANGERINA)
ESPRESSO NEL TESTICOLO DI RATTO:
LOCALIZZAZIONE SPAZIALE E TEMPORALE
Relatore Candidato
Ch. mo Prof. Ivan Saletta
Francesco Aniello Matr. 432/764
ANNO ACCADEMICO 2002/2003
2
“Per mia madre e mio padre, per mia nonna e per Emilia
che mi hanno sempre sostenuto e sopportato”
3
INDICE
INTRODUZIONE.........................................................................pag. 6
STRUTTURA GENERALE DEL TESTICOLO…………………pag. 7
Organizzazione ampollare……………………………...............pag. 8
Organizzazione cistica………………………………………….pag. 9
Organizzazione tubulare………………………………………..pag. 10
LA SPERMATOGENESI………………………………………...pag.11
Regolazione della spermatogenesi……………………………..pag.13
Ruolo dell’ambiente……………………………………………pag.14
Ruolo degli ormoni…………………………………………….pag.14
Controllo genico della spermatogenesi………………………...pag.16
SCOPO DELLA RICERCA........................................................pag.19
MATERIALI E METODI...........................................................pag.22
Preparazione di RNA totali da tessuti di Rattus Norvegicus………pag.23
Purificazione degli mRNA poli A+……………………………….pag.24
Sintesi del cDNA…………………………………………………pag.26
Analisi semi-quantitativa dei trascritti mediante rt-PCR………...pag.27
Analisi del prodotto di PCR e estrazione del
DNA dal gel di agarosio………………………………………….pag.28
Clonaggio in TOPO TA Vector…………………………………..pag.29
4
Trasformazione dei batteri per elettroporazione………………….pag.30
Minipreparazione di DNA plasmidico……………………………pag.31
Maxipreparazione di DNA plasmidico…………………………...pag.32
Sequenziamento del DNA plasmidico……………………………pag.33
Analisi delle sequenze…………………………………………….pag.34
Marcatura radioattiva di sonde mediantela tecnica dei
“Random Primers”………………………………………………..pag.35
Trasferimento del DNA su filtro mediante
“Southern blot” ed ibridazione……………………………………pag.36
Enzimi di restrizione………………………………………...……pag.38
Trascrizione in vitro………………………………………………pag.38
Quantizzazione delle sonde di RNA………………………………pag.40
Preparazione dei tessuti per l’ibridazione in situ………………….pag.42
Ibridazione in situ…………………………………………………pag.42
TABELLE......................................................................................pag.45
RISULTATI...................................................................................pag.54
Prima evidenza dell’espressione di tang-A
nel testicolo di ratto di tre settimane………………………………pag.55
Localizzazione cromosomiale del gene della
Tangerina nel ratto………………………………………………...pag.62
Analisi della sequenza amminoacidica
predetta dalla sequenza nucleotidica di tang-A……………………pag.63
Analisi temporale dell’espressione delle tre isoforme
della Tangerina nel testicolo di ratto……………………………....pag.70
5
Localizzazione spaziale della Tangerina…………………………..pag.83
DISCUSSIONE...............................................................................pag.85
BIBLIOGRAFIA............................................................................pag.91
6
INTRODUZIONE
7
STRUTTURA GENERALE DEL TESTICOLO NEI VERTEBRATI
I testicoli sono organi pari deputati alla formazione dei
gameti maschili e alla produzione degli ormoni steroidei.
Una capsula fibrosa, l’albuginea, delimita esternamente un
epitelio germinale organizzato in ampolle e tubuli seminiferi nei
quali avviene la spermatogenesi.
Gli spermatozoi maturi si staccano dalla parete dei tubuli e
raggiungono la rete testis (un complesso di canali collettori
intratesticolari) e da qui sono portati all’esterno tramite collettori
extra testicolari.
I testicoli originano dall’interazione di cellule somatiche e
cellule germinali. Le cellule somatiche più caratterizzanti del
tessuto sono le cellule di Leydig e le cellule di Sertoli che formano
lo stroma.
Le cellule di Leydig derivano dal mesonefro, sono ubicate
negli interstizi tra le unità germinative e sono deputate alla
secrezione degli ormoni steroidei. Il loro differenziamento in cellule
steroidosecernenti è regolato direttamente dalle gonadotropine
ipofisarie (FSH-LH).
Le cellule di Sertoli, invece, derivano dall’epitelio celomatico
e si trovano frammiste alle cellule germinali, nei confronti delle
quali hanno un ruolo di sostegno e protezione e con le quali
effettuano scambi metabolici attraverso meccanismi di tipo
paracrino. Inoltre, tali cellule, hanno il compito di fagocitare gli
elementi che degenerano nel corso della spermatogenesi e
secernono Androgen Binding Protein (ABP) grazie al quale sono
in grado di modulare la concentrazione di testosterone.
8
Le cellule germinali derivano dalle cellule germinali
primordiali che durante lo sviluppo embrionale migrano lungo il
mesentere dorsale ed entrano nelle creste genitali. Esse sono
deputate alla produzione dei gameti.
Le cellule della linea germinale sono: gli spermatogoni che si
ottengono per divisione mitotica delle cellule germinali primordiali,
gli spermatociti di primo ordine, gli spermatociti di secondo ordine,
gli spermatidi e gli spermatozoi. L’organizzazione delle cellule
germinali è diversa nei vari Vertebrati, tant’è vero che il testicolo
presenta differenti tipi di organizzazione a seconda dell’animale
preso in considerazione: esistono l’organizzazione ampollare,
cistica e tubulare.
ORGANIZZAZIONE AMPOLLARE
E’ presente negli Anamni. Il testicolo consta di una serie di
sacche chiuse circondate da una lamina basale, dette ampolle o
lobuli. Esse contengono cellule di Sertoli e cellule germinali a un
differente stadio di maturazione.
Negli interstizi tra un’ampolla e l’altra, ci sono le cellule di
Leydig (Fasano e Pierantoni,1993).
Le ampolle si trovano in una zona germinativa e contengono
1 o 2 spermatogoni e le cellule del Sertoli; durante la
spermatogenesi, tali ampolle progrediscono verso una zona
inferiore arricchendosi man mano di spermatogoni, spermatociti,
spermatidi e spermatozoi. Una volta piene di spermatozoi, queste
si aprono in posizione apicale riversando il loro contenuto nei dotti
collettori intratesticolari.
9
E’ possibile trovare, in siti adiacenti, ampolle con cellule a
diverso stadio di maturazione, perché alcune volte la disposizione
dei lobuli è irregolare. In ogni ampolla un paio di spermatogoni
rimangono quiescenti in modo tale da poter riprendere la
spermatogenesi: ciò garantisce la produzione di nuovi
spermatozoi.
ORGANIZZAZIONE CISTICA
E’ un tipo di organizzazione testicolare che ha caratteristiche
in comune sia con l’organizzazione ampollare che con quella
tubulare ed è tipica degli Anfibi Anuri.
Ogni singola linea germinale è confinata, insieme con le
cellule del Sertoli, in una cisti germinativa, all’interno dei tubuli dei
quali si compone il testicolo. Tale cisti, quando sono presenti gli
spermatozoi, si apre e libera il suo contenuto nel lume del tubulo.
Caratteristica fondamentale in questo tipo di organizzazione,
è che gli spermatogoni primari sono cellule individuali avvolte da
prolungamenti citoplasmatici delle Sertoli, mentre gli spermatogoni
secondari sono raggruppati all’interno di spermatocisti. Esistono
due tipi di spermatogoni morfologicamente distinti: spermatogoni
di tipo chiaro e di tipo scuro. I primi sono molto voluminosi e
presentano un nucleo lobato; per mitosi sono in grado di dare
spermatogoni di tipo chiaro e di tipo scuro. Questi ultimi sono
“committed”, cioè danno origine alle cisti di spermatogoni
secondari. Ne segue che gli spermatogoni di tipo chiaro
rappresentano la linea di cellule staminali che permettono il
continuo rinnovo di cellule germinali all’interno del testicolo. Gli
10
spermatogoni sono confinati vicino alla membrana basale del
tubulo (Rastogi et al.,1985).
ORGANIZZAZIONE TUBULARE
La si può trovare in Rettili, Uccelli e Mammiferi. L'unità
fondamentale di tale organizzazione è il tubulo seminifero, un
cilindro cavo lungo e sottile, la cui parete è costituita da una
membrana propria e da un epitelio pluristratificato.
La membrana propria consta di una lamina basale più
interna e di uno strato esterno di natura fibroelastica; l’epitelio
pluristratificato o germinativo è costituito dalle cellule germinali e
dalle cellule di Sertoli. Adiacenti alla lamina basale del tubulo si
trovano gli spermatogoni primari che hanno carattere di cellule
staminali, e dalla periferia al lume del tubulo si distinguono cellule
germinali in stadi di maturazione via via più avanzati, con gli
spermatozoi che sporgono nel lume stesso.
Le cellule di Sertoli sono elementi epiteliali allungati che
occupano tutto lo spessore della parete del tubulo e stabiliscono
connessioni con tutte le componenti della linea germinale, che
vengono in parte accolte e contenute in “cripte” scavate nelle
Sertoli.
Nei Mammiferi, cellule del Sertoli contigue sono connesse da
giunzioni occludenti e giunzioni gap: ciò porta alla formazione
della barriera ematotesticolare che suddivide l’epitelio seminifero
in un compartimento basale e uno adluminale. Il primo contiene le
cellule diploidi, quali spermatogoni e spermatociti di primo ordine
fino allo stadio di diplotene; il secondo contiene gli stadi più
11
avanzati della spermatogenesi e cioè gli spermatociti di secondo
ordine, gli spermatidi e gli spermatozoi.
Sezioni traverse dei tubuli seminiferi di Mammiferi, mostrano
che le cellule germinali sono raggruppate in associazioni cellulari
comprendenti 4 o 5 tipi cellulari, ognuna delle quali si trova in un
preciso stadio differenziativo. Un’associazione cellulare occupa
per l’intera sezione un tratto del tubulo; nell’uomo queste
associazioni sono disposte secondo una spirale di Archimede
(Nieschlag et al.,1992). La distanza tra due identiche e
consecutive associazioni cellulari lungo un tubulo seminifero
costituisce l’onda dell’epitelio seminifero. L’intervallo di tempo che
intercorre tra la comparsa di due associazioni cellulari identiche in
un determinato segmento del tubulo seminifero è definito ciclo
dell’epitelio seminifero (Kierszenbaum, 1994).
LA SPERMATOGENESI
La spermatogenesi è il processo attraverso il quale cellule
germinali immature subiscono divisione, differenziamento e meiosi
per dare origine a spermatidi aploidi allungati.
Gli elementi chiave della spermatogenesi, comuni a tutti i
Vertebrati sono: la fase proliferativa o spermatogoniale, la
produzione di cellule aploidi e la loro trasformazione in
spermatozoi.
La fase proliferativa consiste in una preventiva
moltiplicazione degli spermatogoni per mitosi, in modo da
assicurare sia una riserva di spermatogoni primari con caratteri di
cellule staminali, sia l’apporto di nuovi spermatogoni per la
12
progressione negli stadi successivi. La mitosi di ogni
spermatogone primario dà origine a 2 cellule figlie, una sola delle
quali formerà alla fine i gameti. Questa cellula si divide un numero
variabile di volte seconda la specie, fino alla formazione degli
spermatogoni secondari. Nei Mammiferi i prodotti finali di questa
serie di mitosi sono gli spermatogoni B che, fino allo stadio di
spermatide, rimangono uniti mediante ponti citoplasmatici: tale
condizione, chiamata sincizio, permette lo scambio di fattori
solubili tra le cellule e assicura, in ogni ondata proliferativa, la
sincronia della maturazione. Dai suddetti spermatogoni secondari
derivano gli spermatociti primari che, dopo un periodo di
accrescimento, entrano in meiosi. Prodotto della prima divisione
meiotica saranno gli spermatociti di secondo ordine (aploidi
duplicati: n 2c), che subiranno la seconda divisione meiotica e
daranno origine agli spermatidi (n c). Durante questa fase
meiotica, molti spermatociti degenerano o vengono fagocitati dalle
cellule di Sertoli.
Gli spermatidi così prodotti, sono cellule sferiche con
abbondante quantità di citoplasma, contengono un numero
aploide di cromosomi, ma non sono mobili. Essi subiscono una
serie di modificazioni morfologiche (spermioistogenesi) che li
trasformano in spermatozoi.
Il processo di spermiogenesi (o spermioistogenesi) inizia
quando, a partire dall'apparato del Golgi, vescicole ricche di
sostanze di natura polissaccaridica e di enzimi proteolitici si
fondono insieme a formare l'acrosoma. Questo si posiziona
anteriormente al nucleo e si accresce, per la continua
aggregazione di nuove vescicole dal Golgi, fino a coprire le parti
anteriori e medie del nucleo stesso.
13
Nel frattempo i centrioli migrano posteriormente al nucleo e
si dispongono perpendicolarmente ad esso: da quello distale ha
origine il flagello.
Lo spermatide comincia ad affusolarsi allungandosi in senso
antero-posteriore per una migliore locomozione. La cromatina si
condensa permettendo una notevole riduzione del volume
nucleare. Tale condensazione si ha in seguito alla sostituzione
delle proteine istoniche con le protammine, proteine basiche
caratteristiche dello spermatozoo. Il flagello si accresce e vi è
accumulo di mitocondri alla sua base. Terminato l'allungamento
del flagello, si rompono i ponti citoplasmatici tra gli spermatidi, se
sussistono, e la quasi totalità del citoplasma è eliminata sotto
forma di corpi residui che verranno fagocitati dalle Sertoli: gli
spermatozoi ora completi, sono liberati nel lume.
REGOLAZIONE DELLA SPERMATOGENESI
I fattori che regolano la spermatogenesi sono di tipo
ambientale e ormonale. Soprattutto questi ultimi fanno sentire la
loro influenza negli animali a riproduzione stagionale. Infatti,
mentre in alcuni Mammiferi, compreso l'uomo, la produzione di
gameti nel maschio avviene continuamente per tutta la vita
dell'individuo, nella maggior parte dei Vertebrati assume un
andamento stagionale in relazione con le variazioni ambientali che
si traducono in un'alternanza stimolazione/inibizione dei
meccanismi ormonali che la controllano.
14
RUOLO DELL'AMBIENTE
Fattori ambientali esterni, mediante una regolazione
dell'asse ipotalamo/ipofisi/gonadi, determinano l'inizio e l'arresto
della stagione riproduttiva nella maggior parte dei Vertebrati.
Particolari condizioni ambientali inducono l'ipotalamo a produrre
GnRH (fattore di rilascio delle gonadotropine ipofisarie) e questo,
raggiunta attraverso un circolo portale l'adenoipofisi, media il
rilascio delle gonadotropine ipofisarie, le quali hanno come
bersaglio il testicolo (Turner e Bagnara,1974).
In alcune specie, l'inizio della stagione riproduttiva coincide
con i periodi in cui il numero delle ore di luce aumenta, mentre per
altre specie è il contrario.
L'epifisi è l'organo preposto alla captazione della luce; essa
produce maggiori quantità di melatonina quanto più lunga è
l'esposizione al buio.
Inoltre, si riscontra un'involuzione dell'attività testicolare nei
mesi più caldi (quando la temperatura è più alta) ed una
successiva ripresa con l'abbassamento della temperatura.
Quindi si può affermare che le condizioni ambientali che
maggiormente influenzano la gametogenesi sono il fotoperiodo e
la temperatura.
RUOLO DEGLI ORMONI
L'ipotalamo è un organo encefalico che riceve stimoli
endogeni o esogeni che provocano il rilascio nel circolo ematico di
GnRH, un neurotrasmettitore destinato all'ipofisi. Tale ghiandola,
15
in risposta al GnRH, secerne le gonadotropine LH e FSH, che,
veicolate dal sangue, raggiungono il testicolo: le cellule di Leydig,
sotto lo stimolo di LH, producono testosterone, 17β-estradiolo e
5β-diidrotestosterone; le cellule di Sertoli rispondono all'FSH,
sintetizzando ABP e modulando così la concentrazione di
testosterone nel tubulo seminifero.
Le modalità con cui il testosterone partecipa alla
spermatogenesi non è ben conosciuta, ma è noto il meccanismo
che provoca la sua produzione nelle cellule di Leydig. Queste
presentano sulla loro membrana dei recettori per l'LH, per cui tale
ormone vi si lega formando un complesso che attiva l'adenilato
ciclasi con conseguente aumento del livello di cAMP intracellulare.
Questo secondo messaggero media il rilascio di chinasi che
attivano le idrolasi degli esteri del colesterolo, precursore del
testosterone.
Le cellule di Leydig di Mammifero contengono anche
recettori per gli androgeni, per gli estrogeni, per i glucocorticoidi e
la prolattina, mentre le cellule del Sertoli possiedono recettori per
gli estrogeni ed il testosterone.
Tutto ciò mette in evidenza come un complesso sistema di
regolazione endocrina promuova la produzione degli spermatozoi
e come questo sistema sia sotto il controllo delle gonadotropine
ipofisarie e degli androgeni secreti dal testicolo.
Si osserva, infatti, in animali ipofisectomizzati, un blocco
della spermatogenesi ed una progressiva perdita di cellule
germinali. Studi condotti su ratti ipofisectomizzati, hanno mostrato
una graduale degenerazione dell'epitelio seminifero, con totale
assenza di spermatozoi (anche se qualche spermatogone è in
grado di formare spermatociti e spermatidi). Solo un trattamento
16
con gonadotropine ravvicinato all'ipofisectomia previene la
completa degenerazione dell'epitelio seminifero e ne consente la
rigenerazione (Turner e Bagnara,1974).
CONTROLLO GENICO DELLA SPERMATOGENESI
Nel laboratorio presso il quale ho svolto il mio lavoro di tesi vi
è una particolare attenzione verso lo studio della spermatogenesi
nell’anfibio rana esculenta e nel mammifero rattus norvegicus.
Poco si conosce riguardo i geni che controllano la
spermatogenesi dell’anuro. Cobellis et al. (2002) hanno dimostrato
che la proteina codificata dal protooncogene Fos viene prodotta
dagli spermatogoni e che nei mesi di attiva spermatogenesi è
presente maggiormente nel nucleo, mentre quando la
proliferazione delle cellule germinali è bassa la proteina Fos viene
fosforilata e si trova principalmente nel citoplasma in una forma
inattiva. Recentemente Aniello et al. (2002) hanno messo in
evidenza che la protimosina-a (prot-a), una proteina ubiquitaria
implicata in diversi eventi, quali la proliferazione cellulare e la
compattazione della cromatina, sembrerebbe avere un ruolo
specifico durante la spermatogenesi della rana in quanto la sua
espressione varia durante il ciclo annuale raggiungendo un
massimo nel mese di settembre, quando l’anfibio si prepara alla
successiva ondata spermatogenetica. Il trascritto della prot-a è
presente quasi esclusivamente negli spermatociti primari e
secondari indicando un probabile ruolo di questa proteina durante
la meiosi. Altro gene implicato nella spermatogenesi di rana
esculenta è la relaxina (frog relaxin, fRLX). Tale gene è la prima
17
forma di relaxina ad essere stata isolata e caratterizzata a livello
molecolare in una specie non mammifero (De Rienzo et al., 2001).
Tra i mammiferi il processo della spermatogenesi è simile
ma vi sono sostanziali differenze tra le varie specie che lo rendono
unico. Nel ratto il fenomeno ha una durata complessiva di 51
giorni diversamente ripartiti tra le tre fasi principali che lo
compongono.
Durante il processo meiotico attuato dagli spermatociti, si
verificano una serie di eventi, riscontrabili prevalentemente nella
lunga profase della meiosi I, che ha una durata di 16 giorni
(Clermont e Harvey, 1965).
L’appaiamento e la ricombinazione dei cromosomi omologhi,
infatti, sono eventi specifici ed unici della profase I, individuabili
rispettivamente in zigotene ed in pachitene.
Il loro scopo è quello di consentire il giusto allineamento in
piastra equatoriale dei cromosomi omologhi durante la metafase I
e la loro regolare segregazione in anafase, in modo da garantire la
formazione di gameti bilanciati (Hawley R.S., 1988). La durata
particolarmente estesa del pachitene I rispetto alle altre fasi della
profase I sembra sia dovuta al bisogno di sintesi di prodotti
necessari al corretto proseguimento della spermatogenesi stessa
e tale sintesi è attiva ai massimi livelli a metà del pachitene
(Meiestrich et al., 1981). Il perfetto mantenimento dell’integrità
genomica e la prevenzione di mutagenesi sono molto importanti
durante la meiosi, per assicurare la fedeltà sufficiente al progredire
dell’ereditarietà. La sintesi di precursori avviene in una fase
precoce nel processo della spermatogenesi a causa della
18
progressiva inattivazione del materiale genetico dovuto alla
condensazione della cromatina.
Tale condensazione maschera siti particolari sul DNA che
normalmente sono bersaglio di proteine specifiche e degli stessi
enzimi del complesso replicativo. Pertanto solo spermatogoni,
spermatociti pachitenici e spermatidi precoci mostrano una certa
attività trascrizionale, confermata anche tramite analisi di
ipersensibilità alla DNAsi I (Mc Pherson e Longo, 1992). Negli
spermatidi rotondi si riscontrano elevati livelli di RNA polimerasi II
e di fattori trascrizionali (Schmidt e Schibler, 1995) che inducono
l’espressione di proteine importanti in fase differenziativi nonché di
numerosi oncogeni ( Thomas et al.,1989).
L’espressione di geni implicati nella spermatogenesi è
coordinata e sequenziale, infatti si distingue l’espressione di geni
codificanti proteine implicate direttamente durante la meiosi e geni
per proteine post-meiotiche. Il significato biologico di molti di questi
e’ ancora sconosciuto. Il gene CREM (cyclic AMP-responsive
element modulator) e’ altamente espresso nelle cellule post-
meiotiche ,a partire dagli spermatidi rotondi, e il fattore ad esso
correlato potrebbe essere responsabile dell’attivazione di specifici
geni coinvolti nella formazione dello spermatozoo durante la
spermiogenesi (Blendy et al.,1996).
Durante gli studi sul gene del recettore per la melatonina
identificato nel testicolo di ratto effettuati nel laboratorio presso il
quale ho svolto la mia attività di tesi è stato isolato un gene la cui
espressione era stata dimostrata in precedenza solo nel Mus
musculs: La Tangerina.
19
SCOPO DELLA RICERCA
20
La spermatogenesi è un processo differenziativo complesso
che richiede la sintesi coordinata di diverse proteine stadio
specifiche, inoltre, nonostante dal punto di vista morfologico sia le
cellule germinali sia la spermatogenesi siano stati ben
caratterizzati, restano ancora molti interrogativi sui meccanismi
che regolano l'intero processo. Sono, infatti, sconosciuti gran
parte dei meccanismi che la innescano, dei geni coinvolti e dei
fattori molecolari che determinano la progressione delle cellule
germinali da uno stadio all'altro.
La spermatogenesi è un processo di sviluppo che
comprende l’aumento delle cellule germinali, il loro
differenziamento in spermatociti, le divisioni meiotiche ed infine la
trasformazione in spermatozoi maturi. Proprio per questo motivo
essa rappresenta un interessante modello per lo studio della
regolazione dell’espressione genica durante lo sviluppo e il
differenziamento.
Dallo studio dell’espressione dei geni coinvolti nella
spermatogenesi si possono ricavare informazioni utili a chiarire i
meccanismi che permettono la progressione e la regolazione delle
singole fasi del processo. Queste informazioni, pertanto,
potrebbero essere importanti per la prevenzione e/o risoluzione
delle anomalie che si verificano durante la spermatogenesi e che
potrebbero essere causa dell’infertilità maschile.
In questo contesto, lo scopo della mia ricerca è stato quello
di contribuire all’identificazione di nuovi geni specificamente o
altamente espressi nel testicolo di Rattus Norvegicus, da poter
essere utilizzati come “markers” dell’attività testicolare.
Nel laboratorio presso il quale ho svolto la tesi, le ricerche
erano indirizzate all’isolamento e caratterizzazione del gene
21
codificante per il recettore della melatonina (MT1) nel testicolo di
ratto essendoci evidenze sperimentali sull’influenza della
melatonina sul sistema riproduttivo maschile (Limanowski et al.,
1991) e in particolare sulla funzionalità del testicolo (Olivares et
al.:1989). Un risultato singolare si ottenne dagli esperimenti di
rtPCR. Tra i diversi cloni di cDNA isolati, infatti uno di questi
risultava essere codificante per la Tangerina A. Stranamente
dall’analisi comparativa delle sequenze dei cDNA per “Tangerina”
e “recettore della melatonina” non risultava esserci alcun tipo di
omologia.
Come spesso accade, sperimentalmente, si possono
ottenere risultati inaspettati che però possono essere ugualmente
interessanti e stimolanti. Infatti, la presenza abbondante del
trascritto della Tangerina nel testicolo di ratto suggerisce un
probabile ruolo di questa proteina durante la spermatogenesi.
Proprio per questo motivo, il mio lavoro di tesi è stato rivolto allo
studio dell’espressione temporale e spaziale di questo gene
isolato dal testicolo di ratto, sia durante lo sviluppo post-natale sia
nell’adulto.
22
MATERIALI E METODI
23
PREPARAZIONE DI RNA TOTALI DA TESSUTI DI RATTUS
NORVEGICUS
E’ stata seguita la metodica di Sprenger et al. (1995)
come di seguito descritto
Soluzione A: Tiocianato di guanidina 4 M
Na-Citrato pH 7 25 mM
Sarkosyl 0,5 %
2-ß mercaptoetanolo 100 mM
I tessuti venivano rapidamente prelevati e congelati in
azoto liquido e successivamente omogeneizzati con un Ultra-
Turrax nella soluzione A nella proporzione di 10 ml per ogni
grammo di tessuto (peso umido).
All’omogenato sono stati aggiunti:
0,1 volumi di Na-Acetato pH 4,2 (2M)
1 volume di fenolo acido (pH 4,2) e cloroformio (V/V 5:1).
Dopo agitazione su vortex, il campione è stato lasciato
per 15
minuti a 4°C e centrifugato a 10000 rpm per 20 minuti a 4°C.
Il supernatante contenente RNA, veniva precipitato con
un volume di alcool isopropilico e conservato a -20°C per una
notte.
Gli RNA precipitati sono stati centrifugati in Beckman con
rotore JA20 per 30 minuti a 10000 rpm a 4°C, solubilizzati, in
mezzo volume iniziale, in tampone TE (tabella 2), 0,5% SDS e 0,5
mg/ml di proteasi K e incubati a 45°C per 1 ora. Gli RNA vengono
estratti con un volume di fenolo pK 4,2-cloroformio (V/V 5:1) e
24
centrifugati come sopra descritto. Al supernatante è stato
aggiunto 1 volume di cloroformio-alcool isoamilico (V/V 24:1) e
nuovamente centrifugati nelle stesse condizioni.
Gli RNA sono stati riprecipitati con l’aggiunta di 250mM NaCl
finale e 2,5 volumi di alcool etilico e conservati a –20°C per una
notte.
Il precipitato e stato raccolto per centrifugazione nel modo
precedentemente descritto, lavato con etanolo al 70% e ridisciolto
in ddH2O sterile.
Ne è stata infine determinata la concentrazione mediante
lettura dell’assorbanza alla lunghezza d’onda di 260 nm in uno
spettrofotomentro VARIAN DMS-90, utilizzando la relazione 1
O.D.=40µg/ml di RNA.
Aliquote di 5µg delle preparazioni di RNA totali sono state
separate elettroforicamente per circa 1-2 ore in condizioni native
con una d.d.p. di 80 Volt per controllare l’integrità degli RNA
ribosomiali 18 S e 28 S.
PURIFICAZIONE DEGLI mRNA poli A+
Gli mRNA poli A+ sono stati purificati mediante cromatografia per
affinità su colonne di Oligo-dT cellulosa (Boehringer). Sono state
usate colonnine della Biorad del diametro di 0,5 cm impaccate
con Oligo-dT cellulosa nella proporzione di 25 mg/mg di RNA.
Dopo un lavaggio della resina con due volumi di NaOH 0,1 N, per
inattivare eventuali RNAsi, seguito dal passaggio con H2O sterile
per riportare il pH alla neutralità, la colonna è stata equilibrata con
la seguente soluzione:
25
Tampone di caricamento:
Tris-HCl 20 mM pH 7,6
NaCl 500 mM
EDTA 1 mM
SDS 0,1%
La soluzione di RNA totali alla concentrazione di 2 mg/ml, è stata
riscaldata a 65°C per 5 minuti e raffreddata rapidamente a
temperatura ambiente e quindi è stato aggiunto ad essa un egual
volume di tampone di caricamento 2x. Il campione è stato quindi
applicato sulla colonna e lasciato filtrare lentamente; l'eluato è
stato riapplicato sulla colonna per due volte.
La colonna è stata quindi lavata con il tampone di caricamento
per allontanare tutti gli RNA non legati. Il lavaggio è stato
continuato finchè i valori di assorbanza delle frazioni non sono
stati prossimi allo zero.
Gli mRNA poli A+ legati alla resina sono stati eluiti con la
seguente soluzione:
Tris-HCl 10 mM pH 7,6
EDTA 1 mM
SDS 0,05 %
Agli mRNA poli A+ eluiti è stato aggiunto sodio acetato 3 M pH
5,2 per una concentrazione finale di 0,3 M e, dopo aver mescolato
bene, gli mRNA poli A+ sono stati precipitati con 2,5 volumi di
etanolo assoluto per la notte a -20°C.
Successivamente il precipitato contenente gli mRNA poli A+ sono
stati lavati con etanolo al 70%, disciolti in acqua sterile e,
determinate le concentrazioni a 260nm, conservati a -80°C.
26
SINTESI DEL cDNA
Per la sintesi del primo filamento di cDNA si sono utilizzati come
stampo RNA messaggeri poli A+.
La miscela di reazione era composta da: 3 µg di mRNA, 2,5 pmoli
di innesco ed H2O trattata con DEPC per un volume finale di 15,5
µl.
Dopo 5 minuti a 70°C la miscela è stata portata immediatamente
a 0°C in ghiaccio fondente.
Successivamente sono stati aggiunti :
Tampone di sintesi 10x 2 µl
dNTP mix 10 mM 1 µl
DTT 100 mM 2 µl
Il tutto è stato portato alla temperatura di 42°C per 2 minuti,
dopodiché è stato aggiunto 1 µl di Trascrittasi inversa
“SuperScript III-Invitrogen” (200 U/ml).
La reazione è stata condotta a 50°C per 60 minuti e al termine
l’enzima è stato inattivato a 70°C per 5 minuti.
27
ANALISI SEMI-QUANTITATIVA DEI TRASCRITTI MEDIANTE
rt-PCR
La PCR è una tecnica che permette l'amplificazione di una
regione di DNA compresa tra due oligonucleotidi. Il DNA stampo
viene denaturato per far sì che ai singoli filamenti prodotti
possano associarsi due inneschi complementari alle sequenze
che delimitano la regione che si desidera amplificare .
Una DNA polimerasi termoresistente utilizza questi inneschi per
polimerizzare il secondo filamento e le doppie eliche così ottenute
vengono nuovamente denaturate.
La reazione si ripete per il numero di volte desiderato, producendo
una grande quantità della regione di DNA compresa tra i due
inneschi.
Il cDNA ottenuto mediante il protocollo precedentemente descritto
può essere direttamente amplificato senza una precedente
purificazione o diluizione dal momento che il tampone utilizzato
per il la sintesi del cDNA è compatibile con la Taq DNA
polimerasi.
Ogni reazione di amplificazione è stata condotta in un volume
totale di 50 µl con i seguenti componenti:
Soluzione di cDNA 3 µl
Tampone di sintesi 10x 5 µl
MgCl2 25 mM 1,5 µl
dNTP 2.5 mM 1 µl
innesco1 10 pmoli /µl 1 µl
innesco2 10 pmoli /µl 1 µl
Taq polimerasi 5U/µl 0,5 µl
28
H2O 37 µl
I successivi cicli di amplificazione, di seguito descritti, sono stati
condotti mediante un Thermal cycler Perkin-Elmer.
Gli inneschi utilizzati sono i seguenti:
tangA(1) primer 5’-caaagaacacttggacccaag-3’;
tangA(2) primer 5’-cacttgtgccttattcaggctg-3’;
tangBC(1) primer 5’-cgctcaggttccacttcga-3’;
tangBC(2) primer 5’-gtgatgcagacaccacggtag-3’;
gapdh R1 primer 5’-caccatcttccaggagcga-3’;
gapdh R2 primer 5’-tcagatccacaacggatacattg-3’. La grandezza dei prodotti derivati dall’rt-PCR sono stati 460 cb
per tang-A; 450 cb per tang-C. Tang-B non è stato amplificato
dalla PCR
Un’appropriata regione per il cDNA della GAPDH è stata utilizzata
come controllo della PCR. La grandezza del prodotto era di 500cb
Le amplificazioni sono state condotte per 30 cicli nelle seguenti
condizioni:
94°C per 45 secondi
60°C per 45 secondi
72°C per 45 secondi
ANALISI DEL PRODOTTO DI PCR E
ESTRAZIONE DEL DNA DAL GEL DI AGAROSIO
10 µl della reazione di PCR sono stati analizzati su un gel di
agarosio 1% in TBE 1x (Tabella 2) per verificare se il prodotto di
amplificazione era quello atteso e successivamente i rimanenti 40
µl della reazione di PCR sono stati analizzati su gel di agarosio
29
1% in TBE 1x per prelevare la banda di DNA dal gel. Per eluire la
banda corrispondente al prodotto di amplificazione di interesse, è
stato utilizzato il kit “QIAquick Gel Extraction Kit” della Qiagen
seguendo le istruzioni della casa produttrice. Al tassello di gel
contenente il frammento di interesse sono stati aggiunti 3 volumi
di tampone QG. Il campione è stato incubato a 50°C per 10 minuti
e sottoposto ad agitazione su vortex ogni 2 minuti. Al termine
dell’incubazione al campione è stato aggiunto 1 volume di
isopropanolo ed agitato. Il campione è stato poi caricato sulle
colonnine del kit e centrifugato per 1 minuto a 14000 g in
centrifuga Eppendorf. La soluzione centrifugata è stata eliminata e
nella colonnina alla cui resina era ora legato il DNA sono stati
aggiunti 500 µl di tampone QG, ricentrifugato e lavato 2 volte con
tampone PE per rimuovere eventuali sali presenti. Infine il DNA è
stato eluito dalla resina mediante aggiunt di 50 µl di H2O
ciascuna.
CLONAGGIO IN TOPO TA Vector
Il clonaggio dei frammenti ottenuti dall’amplificazione mediante
PCR e purificati dal gel, come sopra descritto, è stato effettuato
utilizzando il kit “TOPO TA cloning’’ della Invitrogen, seguendo le
istruzioni della casa produttrice. Il kit permette di ottenere il
clonaggio di prodotti di PCR con un alta resa. Il vettore TOPO TA
possiede un ‘’polilinker’’ con tredici siti di clonaggio unici e due siti
di riconoscimento per l’enzima EcoRI, posti rispettivamente a
monte e a valle del punto di inserzione del frammento da clonare.
Tale vettore presenta inoltre i geni per la resistenza all’ ampicillina
30
e alla canamicina, il prodotto Lac per l’espressione genica e il
promotore per la trascrizione. La reazione di clonaggio è stata
effettuata come segue:
Prodotto di PCR (10-20 ng/µl) 4 µl
PCR Topo vector (10 ng/µl) 1 µl
La miscela è stata prima sottoposta a leggera agitazione e poi
incubata a temperatura ambiente per 5 minuti.
Al termine della reazione di ligasi, la miscela è stata raffreddata in
ghiaccio e microdializzata utilizzando filtrini Millipore 0,25 µm,
contro H2O sterile, per 1 ora.
TRASFORMAZIONE DEI BATTERI PER ELETTROPORAZIONE
Sono stati utilizzati batteri competenti del ceppo TOP 10, preparati
per
l’elettroporazione dal Servizio di Biologia Molecolare della
Stazione Zoologia “Anton Dohrn” di Napoli (Dower et al., 1988;
Dower, 1990) con un’efficienza di trasformazione mediamente
superiore a 5x108/µg di DNA. Per ogni trasformazione sono stati
usati 40 µl di batteri e 5 µl di reazione di ligasi (Ymer, 1991).
L’elettroporazione è stata effetuata a 2500 Volts,
200 Ω e 25 µF con un elettroporatore Biorad Gene PulserTM.
Subito dopo il passaggio di corrente elettrica, le elettrocuvette
sono state riempite con 1 ml di terreno liquido SOC (Tabella 1); i
batteri trasformati sono stati prontamente recuperati, trasferiti in
tubo da inoculo e lasciati crescere a 37°C per 1 ora sotto
31
agitazione costante (280 rpm). Al termine dell’incubazione
aliquote di 5, 10 e 15 µl sono state piastrate su agar in LB
(Tabella 1) contenente ampicillina (50µg/ml) per determinare il
titolo dei batteri trasformati.
MINIPREPARAZIONE DI DNA PLASMIDICO
Per poter isolare il DNA plasmidico dalle cellule batteriche il
protocollo che è stato utilizzato è basato sul metodo della lisi
alcalina (Birnboim e Doly, 1979). Dalle piastre di agar in LB, usate
per determinare il titolo dei batteri per ogni trasformazione, sono
state prese singole colonie e messe a crescere per la notte in 5ml
di LB+ampicillina sotto agitazione costante a 280 rpm. Al mattino
dai 5 ml di ciascuna coltura batterica in LB con 50 µg/ml di
ampicillina(Tabella 1) sono state prelevate aliquote di 500 µl, cui è
stato aggiunto un egual volume di una soluzione sterile di
glicerolo al 40%; dopo accurata agitazione su vortex, le aliquote
sono state conservate a -20°C, al fine di ottenere una riserva di
batteri trasformati. Il restante volume è stato centrifugato a 3000
rpm per 5 minuti in centrifuga Beckman GS-6R con rotore GH 3.7,
è stato eliminato il supernatante ed il precipitato batterico è stato
risospeso in 100 µl di soluzione GTE fredda (Tabella 4). Sono
stati aggiunti 200 µl di soluzione 2 (Tabella 4) preparata al
momento, e, dopo aver mescolato delicatamente per inversione, i
campioni sono stati posti in ghiaccio. Trascorsi 5 minuti, sono stati
aggiunti 150 µl di soluzione 3 (Tabella 4) e sono stati lasciati i
campioni in ghiaccio per altri 5 minuti.
32
Dopo centrifugazione di 5 minuti a 14000 rpm in microcentrifuga
Eppendorf, il supernatante è stato estratto con un egual volume di
fenolo (preequilibrato a pH 7,8 con Tris-HCl 0,1M pH
8,0):cloroformio:alcol isoamilico (25:24:1), agitando con cura e
centrifugando per 5 minuti come sopra descritto. Per precipitare il
DNA plasmidico al supernatante sono stati aggiunti 2,5 volumi di
etanolo assoluto; il tutto è stato lasciato alla temperatura di -20°C
per 30 minuti; il DNA plasmidico è stato recuperato con una
centrifugazione di 20 minuti. Il precipitato è stato lavato con
etanolo 70% e risospeso in 40 µl di TE.
Si è effettuata una lettura dell'assorbanza allo spettrofotometro
alla lunghezza d'onda di 260 nm, utilizzando uno spettrofotometro
VARIAN DMS 90 e la concentrazione del plasmide è stata
determinata utilizzando la relazione:
1 O.D. ?260 nm= 50 µg/ml di DNA plasmidico.
Per valutare il grado di purezza del DNA plasmidico estratto ed
escludere la presenza di RNA, aliquote di 1µg sono state
analizzate su gel di agarosio 1% in TBE 1x (Tabella 2) contenente
0,5 µg/µl di bromuro di etidio.
MAXIPREPARAZIONE DI DNA PLASMIDICO
Per ottenere preparazioni di maggiori quantitativi di DNA
plasmidico sufficientemente purificato, necessario per le
successive fasi sperimentali, è stato effettuato un inoculo di 100 µl
dalla riserva di batteri trasformati in 200 ml di SB (Tabella 1); la
coltura batterica è stata messa a 37°C con agitazione costante
(280 rpm) per tutta la notte.
33
Il giorno successivo, i batteri sono stati raccolti centrifugando a
3000 rpm per 10 minuti in centrifuga Beckman con rotore GH 3.7.
Il precipitato è stato risospeso in 10 ml di tampone P1 (Tabella 4)
e lasciato 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver aggiunto
10 ml di tampone P2 (Tabella 4), ed aver mescolato per
inversione ripetutamente, è stato incubato a temperatura
ambiente altri 5 minuti. Dopo aver aggiunto 10 ml di tampone P3
(Tabella 4), aver mescolato delicatamente e incubato in ghiaccio
per 20 minuti, i campioni sono stati centrifugati a 10000 rpm per
30 minuti a 4°C, in centrifuga Beckman J2-MC con rotore JA 20.
Il supernatante è stato fatto passare su di una colonna
Qiagen™-tip-500,
preequilibrata con 10 ml di tampone QBT (Tabella 4). Dopo aver
lavato la resina tre volte con 10 ml di tampone QC, (Tabella 4) il
DNA è stato eluito con 15 ml di tampone QF (Tabella 4),
precipitato a temperatura ambiente con 0,7 volumi di
isopropanolo, e centrifugato 30 minuti a 4°C come sopra descritto.
Eliminato il supernatante, il precipitato di DNA plasmidico è stato
lavato con etanolo 70%, e risospeso in 200-500 µl di TE (Tabella
2).
Si è effettuata una lettura dell'assorbanza allo spettrofotometro
alla lunghezza d'onda di 260 nm, utilizzando uno spettrofotometro
Varian Dms 90 e la concentrazione del plasmide è stata
determinata utilizzando la relazione:
20 O.D.λ260 nm= 1 mg/ml di DNA plasmidico.
Per valutare il grado di purezza del DNA plasmidico estratto ed
escludere la presenza di RNA, aliquote di 1 µg sono state
analizzate su gel di agarosio 1% in TBE 1x (Tabella 2) contenente
34
0,5 µg/µl di bromuro di etidio. Da questo protocollo si sono
ottenuti generalmente 0,5-1 mg di DNA plasmidico.
SEQUENZIAMENTO DEL DNA PLASMIDICO
La sequenza dei plasmidi sono state determinate impiegando il
metodo di marcatura Dye terminator della Beckman mediante
sequenziamento ciclico. La procedura, completamente
automatizzata, è stata eseguita dal Servizio di Biologia Molecolare
della Stazione Zoologica “Anton Dohrn” di Napoli. Viene preparata
una miscela contenente :
DNA plasmidico (100ng/µl) 12,5
fmol/µl Oligonucleotide per la sequenza (5 pmol/µl)
12,5 fmol/µl Aggiungendo acqua sterile fino ad un volume di 10 µl
Con questa metodica si ottiene il 97,5 % di accuratezza e l’analisi
delle sequenze avviene mediante analisi dell’elettroferogramma
.
ANALISI DELLE SEQUENZE
Le sequenze di DNA sono state confrontate con i cDNA e il
genoma del ratto e del topo depositate nella banca dati NCBI.
35
MARCATURA RADIOATTIVA DI SONDE MEDIANTE LA
TECNICA DEI “RANDOM PRIMERS”
Le sonde costituite da DNA a doppio filamento della tang-A e
della tang-C impiegate per l'ibridazione dei filtri sono state
marcate radioattivamente mediante la tecnica del “random primer”
(Feinberg et al., 1984).
Il DNA viene denaturato e posto in presenza di una miscela di
esanucleotidi statistici che, legandosi al singolo filamento,
fungono da innesco per la polimerizzazione operata dal
frammento di Klenow della DNA polimerasi I di E. Coli. La
reazione è stata eseguita in presenza dei deossinucleotidi
[a32P]dCTP e [a32P]dATP che vengono incorporati nel filamento di
DNA neosintetizzato e lo rendono radioattivo.
A 40 ng del DNA da marcare sono state aggiunte 1,5 picomoli
di esanucleotidi statistici ed acqua sterile per un volume totale di
37µl. Il DNA stampo è stato denaturato a 95°C per 5 minuti. La
miscela è stata riportata a temperatura ambiente e sono stati
aggiunti i seguenti componenti alle concentrazioni indicate, in un
volume finale di 65 µl :
dGTP 50 µM
dTTP 50 µM
BSA 0,5 mg/ml
HEPES pH 6,6 200 µM
Tris-HCl pH 7 200 µM
EDTA 10 µM
[a-32P]dATP (3000 Ci/mmole) 30 µCi
[a -32P]dCTP (3000 Ci/mmole) 30 µCi
36
frammento di Klenow della DNA
polimerasi di E.coli 3 U
La marcatura del DNA è stata condotta a 37°C per 2 ore. Dopo
l'incubazione, per separare il DNA marcato dai precursori liberi, la
soluzione è stata applicata su di una colonna riempita con la
resina Sephadex-G50 “Nick column” della Pharmacia equilibrata
con TE 1x (Tabella 2) e SDS 0,1%.
L'eluato è stato raccolto in frazioni di 150 µl ed 1 µl di ognuna di
esse è stata analizzata per determinare la quantità di radioattivo
incorporato utilizzando lo scintillatore LS1701 Beckman con il
liquido di scintillazione Insta-Gel (Packard).
Le prime 2 frazioni radioattive, contenenti circa il 90% della
radioattività incorporata, sono state unite ed utilizzate come
sonda.
TRASFERIMENTO DEL DNA SU FILTRO MEDIANTE
"SOUTHERN BLOT" ED IBRIDAZIONE
I frammenti di DNA, separati elettroforeticamente su gel di
agarosio, sono stati trasferiti su filtri di nylon (Hybond-N,
Amersham) secondo la metodica seguente: il gel è stato trattato
per 10 minuti in HCl 0,25 M allo scopo di depurinare il DNA
presente, successivamente esso è stato trattato per 2 volte in una
soluzione NaCl 1,5M ed NaOH 0,5M per un totale di 30 minuti, ed
ancora per 2 volte in SSC 10x per un totale di 1 ora.
Al termine dei lavaggi, il gel è stato posto su di una lastra di vetro
e su di esso è stato poggiato il filtro di nylon. Sul filtro sono stati
37
poggiati 3 fogli di carta Whatmann 3MM, una pila di carta da
banco ed un peso di circa 500 grammi. Dopo circa 2 ore a
temperatura ambiente, a trasferimento avvenuto, il DNA è stato
legato stabilmente al filtro mediante esposizione per 20 secondi
ad una lampada a luce UV dell'apparecchio Stratalinker 2400
(Stratagene).
Dopo tale trattamento, i filtri sono stati posti in buste ed è stata
aggiunta una miscela di preibridazione così composta :
Soluzione di Denhardt (Tabella 3) 5x
SSC 5x
SDS 0,5%
EDTA 5 mM
NaPi pH 6,8 50 mM
DNA di sperma di salmone denaturato (SSS) 100 µg/ml
Dopo 2 ore d'incubazione a 65°C, la sonda marcata
radioattivamente mediante "random primer" e precedentemente
denaturata con incubazione a 95°C per 5 minuti, è stata aggiunta
in una quantità pari a 1,5x106 cpm/ml. L'ibridazione è stata
effettuata a 65°C per 18 ore. Dopo l'incubazione i filtri sono stati
sottoposti ad una serie di lavaggi per allontanare il radioattivo non
legato. Un primo lavaggio di 20 minuti a 65°C in:
SSC 2x
SDS 0,1%
seguito da uno o due lavaggi di 20 minuti, sempre a 65°C, in:
SSC 0,2x
SDS 0,1%
L'autoradiografia è stata condotta mettendo i filtri a contatto con
lastre Kodak X-OMAT AR a -80°C, per una notte, in cassette di
esposizione provviste di uno schermo intensificatore.
38
ENZIMI DI RESTRIZIONE
Gli enzimi di restrizione delle ditte Boehringher e New England
Biolabs sono stati usati con i tamponi raccomandati dalle stesse
case produttrici.
TRASCRIZIONE IN VITRO
Per la sintesi di RNA messageri senso ed antisenso
corrispondenti al frammento di cDNA codificante per tang-C
inserito all'interno del plasmide TOPO TA, si è proceduto
inizialmente alla linearizzazione del plasmide in questione.
Tale plasmide presenta a monte e a valle del sito di clonaggio due
promotori, SP6 e T7, riconosciuti da specifiche RNA polimerasi
che possono produrre, perciò, trascritti su ognuno dei due
filamenti stampo.
Nel mio caso la linearizzazione è stata condotta utilizzando
separatamente gli enzimi di restizione Not I e Kpn I in una miscela
di reazione così composta:
DNA 20 µg
Enzima (10 U/ml) 4 µl
Tampone 10x 10 µl
aggiungendo H2O per un volume finale di 100 µl.
La digestione con Kpn I genera un plasmide linearizzato su cui
per trascrizione a partire dal promotore T7 si ottiene un mRNA
antisenso; la digestione con Not I, invece, consente di trascrivere
un mRNA senso a partire dal promotore SP6.
39
I plasmidi così linearizzati sono stati separati elettroforeticamente,
sono stati eluiti dal gel di agarosio 1% con l'utilizzo del kit
QIAquick.
Per liberarsi della presenza di eventuali proteine contaminanti che
potrebbero dare dei problemi nei passaggi successivi, si è
proceduto al trattamento dei campioni con proteinasi K (50 µg/ml)
ed SDS 1% ad una temperatura di 45°C per 30 minuti.
Si è effettuata, quindi, un'estrazione con un volume di
fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (25:24:1) ed una seconda
estrazione con un volume di cloroformio:alcool isoamilico (24:1).
Infine una precipitazione di DNA plasmidico con:
Sodio Acetato pH 5,2 0,3 M finale
Etanolo assoluto 2,5 volumi
alla temperatura di - 80°C per la notte.
Dopo la precipitazione il DNA è stato lavato con etanolo al 70%
per allontanare eventuali sali presenti e quindi risospeso in H2O
sterile in un opportuno volume.
Aliquote di ogni campione vengono analizzate su gel di agarosio
1% in TBE 1x per valutarne la concentrazione e la qualità.
La trascrizione in vitro è stata effettuata utilizando il kit “DIG-RNA
labeling” fornito dalla ditta Boehringer.
Con questo sistema è possibile marcare l'RNA messaggero
prodotto in vitro usando la digossigenina, un composto steroide,
isolato dalla pianta Digitalis planaria; esso funziona come aptene
legato covalentemente, attraverso un braccio spaziatore
contenente undici atomi di carbonio, alla posizione C-5 di uno dei
precursori della sintesi di RNA : l'UTP.
40
Il precursore DIG-UTP verrà incorporato nel frammento di RNA
neosintetizzato in quanto riconosciuto come un comune
nucleotide dalle RNA polimerasi utilizzate, producendo così sonde
di RNA marcati.
Per produrre gli RNA messaggeri, senso ed antisenso, è stata
preparata la seguente miscela di reazione :
DNA plasmidico linearizzato 1 µg
Miscela di NTP 10x 2 µl
Tampone di trascrizione 10x 2 µl
Inibitore delle RNAsi 20U/ml 1 µl
T7 RNA polimerasi 20U/ml 2 µl
oppure
T3 RNA polimerasi 20U/ml 2 µl
aggiungendo H2O trattata con DEPC fino ad un volume finale di
18 µl.
La reazione di sintesi è stata effettuata alla temperatura di 37°C
per 2 ore, successivamente sono stati aggiunti 2 µl di DNAsi I
(10U/µl), priva di attività RNAsica ed il tutto incubato a 37°C per
15 minuti, per rimuovere il DNA stampo. La reazione è stata,
infine, bloccata mediante aggiunta di 2 µl di EDTA 0,2 M pH 8.
QUANTIZZAZIONE DELLE SONDE DI RNA
Per valutare la concentrazione degli RNA prodotti per trascrizione
in vitro, è stato utilizzato un saggio immunoenzimatico, ricorrendo
all'utilizzo di anticorpi anti-digossigenina coniugati con l'enzima
fosfatasi alcalina.
41
Fatta avvenire l'interazione tra l'anticorpo ed il corrispondente
aptene, DIG-UTP, la visualizzazione delle molecole di RNA viene
realizzata attraverso una successiva reazione colorimetrica
catalizzata dalla fosfatasi alcalina. Tale enzima in presenza di due
substrati, il 5-bromo 4-cloro 3-indolilfosfato (BCIP) ed il sale
Nitroblu di tetrazolio (NBT) produce un substrato insolubile di
colore blu.
Dal confronto qualitativo dell'intensità dei precipitati colorati
prodotti dalle diverse diluizioni di un RNA controllo con quelli
prodotti dagli RNA da quantizzare, si risale alla determinazione
della concentrazione.
Sono state preparate varie diluizioni dell'RNA controllo e dell'RNA
del quale era necessario determinare la concentrazione
utilizzando il tampone 1 (Tabella 5); 1 µl di ogni diluizione è stato
quindi deposto su un filtro di nylon che è stato quindi esposto a
radiazioni U.V. per 30 secondi per consentire all'RNA di legarsi al
filtro.
Il filtro è stato posto 2 minuti in una soluzione di SSC 2x con una
leggera agitazione, quindi per 30 minuti nel tampone 2 (Tabella
5), lo stesso in cui verrà aggiunto l'anticorpo anti-DIG AP (0,15
U/ml) che sarà incubato a temperatura ambiente per un ora.
Per rimuovere gli anticorpi non legati sono stati effettuati due
lavaggi di 15 minuti con il tampone 1.
Il filtro è stato, poi, equilibrato per 5 minuti nel tampone 3 (Tabella
5) di rivelazione e, successivamente, incubato al buio in una
soluzione di rivelazione così composta:
Tampone 3 10 ml
BCIP 50 mg/ml 33 µl
NBT 50 mg/ml 66 µl
42
Il precipitato colorato comincia a formarsi dopo pochi minuti e la
reazione viene quindi bloccata lavando il filtro per 5 minuti in un
opportuno volume di tampone 4 (Tabella 5).
PREPARAZIONE DEI TESSUTI PER L’IBRIDAZIONE IN SITU
I testicoli prelevati allo stadio di 2 settimane, 1 mese, 6 mesi, 12
mesi sono stati fissati nel fissativo di Bouin (costituito da
formalina: acido picrico: acido acetico glaciale, nel rapporto di 15:
5: 1) per 24 ore, poi disidratati nella serie crescente degli alcooli
ed infine incluse in paraffina.
IBRIDAZIONE IN SITU
L'ibridazione in situ con gli RNA marcati con digossigenina è stata
effettuata su sezioni di 6 µm ottenute dal testicolo di Rattus
norvegicus.
Dopo la sparaffinatura, condotta mediante il passaggio in xilene e
l'idratazione nella serie decrescente degli alcooli, le sezioni sono
state fissate, al fine di preservarne la morfologia, per 30 minuti a
temperatura ambiente, utilizzando una soluzione contenente:
Parafomaldeide 4 %
MOPS pH 7,5 0,1 M
NaCl 0,5 M
Dopo la fissazione le sezioni sono state lavate in PBS (Tabella 5)
e poi incubate 2 volte in una soluzione contenente:
43
Proteasi K 10 µg/ml
Tris-HCl pH 7,2 20 mM
EDTA 1 mM
Il trattamento con la proteasi serve per aumentare l'accessibilità
all'RNA messaggero bersaglio, idrolizzando eventuali proteine ad
esso legate. Dopo la digestione con proteinasi, le sezioni sono
state lavate per 5 minuti in PBS e successivamente sottoposte ad
una postfissazione per 30 minuti a temperatura ambiente nella
stessa soluzione utilizzata in precedenza.
Dopo 2 lavaggi di 5 minuti in PBS a temperatura ambiente, altri 2
lavaggi di 2 minuti in SSC 2x ed un lavaggio di 30 minuti in un
tampone Tris-glicina (Tabella 5), le sezioni erano pronte per
l'ibridazione. I campioni sono stati quindi incubati nella soluzione
di ibridazione (Tabella 5) per la notte.
Per evitare il rischio di ibridazioni aspecifiche vengono effettuati
una serie di lavaggi, variando la temperatura e le condizioni di
salinità; le sezioni sono state infatti lavate nelle seguenti soluzioni:
3 volte per 20 minuti in SSC 5x a temperatura ambiente,
1 volta per 40 minuti in SSC 0,5x, formammide 20 % a 60°C,
1 volta in SSC 0,5 %, formammide 20 % a temperatura ambiente
per il tempo necessario affinchè la temperatura diventi 37°C.
Successivamente i campioni sono stati trattati con il tampone NTE
(Tabella 5) per 5 minuti a 37°C. Per eliminare gli RNA non legati
ai corrispondenti mRNA endogeni, le sezioni sono state trattate
con il tampone NTE contenente RNAsi A (10 µg/ ml) per 30 minuti
a 37°C, quindi lavati con il tampone NTE per 30 minuti a 60°C.
A questo punto è stata eseguita un'altra serie di lavaggi nelle
seguenti soluzioni:
44
SSC 0,5 %, formammide 20 % per 30 minuti a 60°C,
SSC 2x per 30 minuti a temperatura ambiente.
Prima dell'aggiunta dell'anticorpo anti-digossigenina, le sezioni
sono state incubate per 10 minuti a temperatura ambiente in 1 %
di “blocking solution” (Tabella 5). In una soluzione con la stessa
composizione è stato diluito l'anticorpo anti-digossigenina (750U/
ml); 500 µl di questa soluzione sono stati aggiunti ad ogni
campione ed il tutto è stato incubato a 4°C per tutta la notte. I
campioni sono stati lavati a temperatura ambiente nelle seguenti
soluzioni:
4 volte per 10 minuti in TBS (Tabella 5),
1 volta per 10 minuti nella soluzione B (Tabella 5),
quest’ultimo trattamento è importante per eliminare le fosfatasi
endogene.
Per individuare la localizzazione degli RNA di interesse marcati
con digossigenina e riconosciuti da anticorpi anti DIG coniugati
con fosfatasi alcalina, viene fornito l'opportuno substrato che sarà
convertito dall'enzima in un precipitato di colore marrone.
Le sezioni vengono, perciò, incubate con "BM purple" e per ogni
ml di questo vengono aggiunte 10 µl di soluzione B 100x. Il tutto è
incubato a temperatura ambiente per 12 ore, dopodichè si effettua
un lavaggio di 10 minuti in PBS 1x, EDTA 10 mM, si montano i
vetrini e si osserva al microscopio.
45
TABELLE
46
TABELLA 1
COMPOSIZIONE DEI TERRENI DI COLTURA
LB:MEZZO DI LURIA-BERTANI (1 lt)
NaCl 10 gr
Bacto-Triptone 10 gr
Estratto di lievito 5 gr
LB – AGAR
LB + 15 gr/lt di Agar
SB:SUPER BRODO (1 lt)
NaCl 5 gr
Estratto di lievito 20 gr
Bacto-Triptone 35 gr
NaOH 5 mM
SOC (1lt)
NaCl 0,6 gr
KCl 0,186 gr
Estratto di lievito 5 gr
Triptone 20 gr
Sterilizzare ed aggiungere
MgSO4 10 mM
MgCl2 10 mM
Glucosio 0,4 %
47
TABELLA 2
SOLUZIONI PER ELETTROFORESI E "COLONY
HYBRIDIZATION"
TBE 10x (1 lt)
Tris 108 gr
Acido Borico 55 gr
EDTA 20 mM
TE
Tris-HCl pH 8,0 10 mM
EDTA pH 8,0 1 mM
48
TABELLA 3
SOLUZIONI IMPIEGATE PER L’IBRIDAZIONE CON
OLIGONUCLEOTIDI
SSC 20x (1 lt)
NaCl 175,3 gr (3 M)
Citrato Trisodico 88,2 gr (0,3 M)
Aggiungere 800 ml di acqua deionizzata,
aggiustare il pH a 7 con NaOH e portare a volume.
SOLUZIONE DI DENHART 10x (500 ml)
Ficoll 400 10 gr
Polivinilpirrolidone 10 gr
Sieroalbumina bovina 10 gr
49
TABELLA 4
SOLUZIONI PER MAXI PREPARAZIONI DI PLASMIDI
SOLUZIONE 1 (GTE)
Glucosio 50 mM
Tris-HCl pH 8 25 mM
EDTA pH 8 10 mM
SOLUZIONE 2
NaOH 0,2 M
SDS 1%
SOLUZIONE 3
Potassio Acetato 3 M pH 5,5
TAMPONE P1
Tris-HCl pH 8 50 mM
EDTA 10 mM
Ribonucleasi A 100 µg/ml
TAMPONE P2
NaOH 0,2 mM
SDS 1 %
TAMPONE P3
Potassio Acetato 2,55 M pH 4,8
50
TAMPONE QBT
NaCl 0,75 M
MOPS pH 7 50 mM
Etanolo 15 %
Triton X-100 0,15 %
TAMPONE QC
NaCl 1 M
MOPS pH 7 50 mM
Etanolo 15 %
TAMPONE QF
NaCl 1,25 M
MOPS pH 8,2 50 mM
Etanolo 15 %
Abbreviazioni
SDS: sodio dodecilsolfato
51
TABELLA 5
TAMPONI IMPIEGATI PER LA TRASCRIZIONE IN VITRO, LA
IMMUNORIVELAZIONE E L'IBRIDAZIONE IN SITU
TAMPONE 1
Acido maleico pH 7,5 0,1 M
NaCl 0,15 M
BLOCKING STOCK SOLUTION
“Blocking reagent” (Boehringer) disciolto nel tampone 1 ad una
concentrazione finale di 10 % (w/v)
TAMPONE 2
“Blocking stock solution” (Boehringer) diluita 1 : 10
TAMPONE 3
Tris-HCl pH 9,5 100 mM
NaCl 100 mM
MgCl2 50 mM
TAMPONE 4
Tris-HCl pH 8,0 10 mM
EDTA 1 mM
TAMPONE DI DILUIZIONE
H2O-DEPC : SSC 20x : Formaldeide 5:3:2
52
NTP MISCELA DI MARCATURA
ATP 10 mM
CTP 10 mM
GTP 10 mM
UTP 6,5 mM
DIG-UTP 3,5 mM
TAMPONE DI TRASCRIZIONE
Tris-HCl pH 8 400 mM
MgCl2 60 mM
DTT 100 mM
Spermidina 20 mM
TAMPONE TRIS-GLICINA (1lt)
Tris 12,1 gr.
Glicina 7,5 gr.
SOLUZIONE DI IBRIDAZIONE
Formammide 40 %
SSC 5x
Soluzione di Denhardt 1x
DNA di sperma di salmone 100 µg/ml
tRNA 100 µg/ml
Sonda 100 ng a vetrino
volume finale 60-80 µl
53
TAMPONE NTE
NaCl 0,5 M
Tris-HCl pH 7,0 10 mM
EDTA pH 8 0,5 M
TBS (1 lt)
Tris 1,21 gr
NaCl 8,77 gr
NaH2PO4 1,38 gr
PBS
NaCl 200 mM
KCl 3 mM
Na2PO4 10 mM
KH2PO4 2 mM
Abbreviazioni
DEPC: dietilpirocarbonato
SSC: sodio salino citrato
PBS: tampone salino fosfato
54
RISULTATI
55
PRIMA EVIDENZA DELL’ ESPRESSIONE DI TANG-A NEL
TESTICOLO DI RATTO DI TRE SETTIMANE
Da un analisi elettroforetica di una rtPCR effettuata su cDNA
di testicolo di animali dell’età di tre settimane con oligonucleotidi
costruiti per il gene del recettore della melatonina, si è ottenuta
una banda della grandezza di 460 cb diversa dalla grandezza
attesa per il frammento del recettore della melatonina che si
voleva amplificare. Si è provveduto all’estrazione dal gel di
agarosio del cDNA amplificato e successivamente lo si è sub-
clonato tramite vettore di clonaggio “topo ta vector” in cellule
competenti “top ten”. Successivamente il plasmide contenente
l’inserto è stato recuperato tramite procedimento di
minipreparazione (miniprep) di DNA plasmidico e usato per una
analisi di sequenza.
I risultati indicavano che il frammento amplificato tramite
rtPCR (figura 1) apparteneva non al trascritto per il recettore della
melatonina ma bensì al trascritto della Tangerina e corrispondeva
ad una sequenza specifica del trascritto della isoforma A (figura
2).
Al momento di questa comparazione gli unici dati esistenti
sulla Tangerina erano le sequenze degli mRNA di tre isoforme
dovute a splicing alternativo presenti in topo: Tangerina A (tang-
A)di 5705 nucleotidi; Tangerina B (tang-B) di 3179 nucleotidi;
Tangerina C (tang-C) di 2834 nucleotidi. Dall’analisi delle
sequenza emerge che la isoforma più grande è la tang-A (figura
3).
56
Figura 1: Analisi in gel di agarosio 1% in TBE 1x del prodotto di PCR
effettuata su cDNA di ratto di tre settimane con
oligonucleotidi specifici per il recettore della melatonina.
460cb Marker 100
57
Query: 6 aaagacagct-tggacccaagaaatagagccaggggatgctggggtctccaggccagagg 64 |||||||||| ||| |||||||||| | || ||| ||||||||||||| ||||||| tang-A:3322 aaagacagctcggga-tgaagaaatagaactagtggaccctggggtctccagtccagagg 3380 Query: 65 ccgaggcaccgagggcccagtggaca-gaacctatagttttggagtcaggggaggtaaag 123 | ||||||| ||||| ||||||| || | | || ||||||||||||| ||||| |||||| tang-A:3381 ctgaggcactgagggtccagtgggcaggga-ctgtagttttggagtctggggaagtaaag 3439 Query: 124 actgacattttgggggtccagaaaccaggggcttggggagctcttaaatgtgaggcctta 183 |||||||||||||||||||||| || || |||||||||||||||||| |||||||||| tang-A:3440 gctgacattttgggggtccagaagcctggatcttggggagctcttaaatatgaggcctta 3499 Query: 184 gga-gtccctatgactaagcaagggttttctggggccaaggaagtagtgccagaggtatc 242 || ||||| | ||||||||| || ||||||||||||||||||| |||||||||||| | tang-A:3500 -gatgtccccgtaactaagcaaaggctttctggggccaaggaagtggtgccagaggtacc 3558 Query: 243 cagagtacaagagccagaaactaaagttttggggatagaagaagccaaatcttggacttt 302 ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| ||| ||||||||||||||||| tang-A:3559 cagagcacaagagccagaaactaaagttttggggatagtagaggccaaatcttggacttt 3618 Query: 303 ggggcaacagaaagcggagagggaggggtttgaatctccagagaataaatctgatatttt 362 |||||| ||| |||| |||| |||||||||||| |||||||||||||||||| ||||||| tang-A:3619 ggggcagcaggaagcagagatggaggggtttgagtctccagagaataaatctaatatttt 3678 Query: 363 tgaggcccaggaaacagaatctggggtcttgggaaccatgaaggggaaagaagccgatga 422 ||||||||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| | ||| tang-A:3679 tgaggcccaggaagcagattctggggtcttgggaaccatgaaggggaaagaagctgttga 3738 Query: 423 aagcctcaaggaggccagccatgaataaggcacaagtg 460 ||||||| |||||||| ||| ||| ||||||||||||| tang-A:3739 aagcctcgaggaggccggcc-tgagtaaggcacaagtg 3775 Figura 2: Analisi comparativa effettuata in rete che evidenzia la grande
omologia pari all’ 88% tra la sequenza nucleotidica del frammento
di PCR con la tang-A di topo.
Query = tang-A di ratto
tang-A = tang-A di topo
58
Figura 3: Sequenze degli mRNA delle tre isoforme di Tangerina di topo
dovute a splicing alternativo presenti in banca dati (Melichar et
al., 2000). Evidenziate in giallo le regioni 5’-UTR e in celeste le
regioni 3’-UTR.
Tang-B: 1349_(rimosse 2526cb rispetto a tang-A) 1350
Tang-C: 995_(rimosse 2860cb rispetto a tang-A)_996
59
Tang-A 1 gctcgctact cttgagctga caccagctcg acgcgccgcg acggccccgc tgactcagcc 61 agcccaccag gcggaccccg ggcaaactca gcctaggtct aaacctcaga catatctaca 121 cggacggggc ggacagatcc ggtgacaaag aaaagagctc cagagaccat ggggaccctg 181 gctgagccag cagtggtggg caagagggag tcccaagcct gagaagagat ccggcagagt 241 tcctcaggcc atgacttcag tgtggaagcg cctgcagcgg gttggcaagc gggccgccaa 301 gttccagttt gtggcgtgtt accatgaact ggtgttggag tgcaccaaga agtggcagcc 361 tgacaagctg gtggtggtat ggactcggcg gaaccgaagg atctgctcca aggcccacag 421 ctggcagcct ggcatccaga acccataccg tggcaccgtg gtatggatgg ttcctgagaa 481 cgtggacatc tcggtgacct tgtacaggga ccctcatgtg gaccagtatg aaaccaaaga 541 gtggactttt attattgaaa atgagtccaa gggacagcgg aaggtactgg ccacagttga 601 tgtgaaccta gcccaccatg cagggcctgt gcctgctcag gttccacttc gactgcggct 661 gaagcccaaa tctgtgaagg tggtgcatgc cgaactgagc ctcacccttt ctggggtgct 721 gctgcgagaa ggccgtgcca cggatgatga catgcagagt ctggccagcc tcatgagtgt 781 gaagcctagt gacgtgggaa acctggatga ctttgctgag agtgatgagg aggaagctaa 841 tggccctggg gctcctgagg tccggactcg aggcccccag tcagatctgt ctcgagagct 901 gaagacactc tgtgaagaag aagatgaagg ccacatacgg ccccagcagg cagctgccag 961 accctctagt gctgaagaca ccagccctgc cccagtgagt gcccctgcac ccccggtcag 1021 ggccttccgg ggccaggggt cagaaccagc tgctataacc gggggccagg tggggcctga 1081 aaccccagag cccccgccat ccccaccaga gacaaggtcc actgggcagc caggccagac 1141 catggtcccc accccagccc ctcggctccg gaaaggctct gatgcaccct cgtccccagt 1201 cccctgcagt ggggatgagg tccccaatac ctcagaggat cctccaacag gaatgggctc 1261 ttctggggag acccaggctc agataagctc tcaggaaggg acagaggccc atgaagccag 1321 gccagaacca gacattgagg tcagaggctc caaagattct ctgggaggag aaagatccaa 1381 agttgaagag gaggaacgcg gggacgggcc gggggctagt gggacaggga atagagagaa 1441 gaacactaag aagtcggaca ccacagccgg cgaggctgga gagagctcag aacttcatca 1501 agtagatgct gagcacaagt caaaggttca acacagagcc acagagggac cagaggctgc 1561 agggctgacg cccaaggcaa ggcttgggga cactcctgag gcccctccta ggagtgctca 1621 gaggaggatg ggggttagga cccaggaaga ggctcccagt gacctgaacc cacctccagc 1681 tgagcctgaa gaacatctag gggacctcag ggatgccagg cctgcaggcc aggagaaagg 1741 aagtgcagag gtgaggagta aagtccctgc tattgggagg gcaggcccgg agcagggctc 1801 ctctgctaga gcagcaagtg ctgggcccca ggtgagctgc gttcagacag tcccatcaga 1861 tggccagggg gtgaaatcta gagatcagag ggctcaggag gcagaagttg gggagtcaag 1921 ggttctagaa acagaggctg agtgggtgcc atgggaggtt atagggacat caaagacaga 1981 tgctgggata ccagaatccc tggatacaga ggctggcaca gcagagtctg aaatattgga 2041 ggcccaggag tcagaagcag caaggtcaga gggcctggaa cccgaggctg ctgggacagc 2101 agagtctgag gtgctgagga cccagaataa cgagattgtg gttctgggga tgccgaggac 2161 agggcctgag ataagggagc ctgaggaatt tggggaaaca gaagttgggg gttttacagt 2221 tccagatacc aagacagtga tagcagaaac tgagatatta gaaacccagg gggtagtgga 2281 tggtgaggct gcagtgctga agacacaagc tgagatatcg gaaacccaga agacagaggc 2341 tggggaggca gaagcgggaa cactggagtc ccagaaggta gcagccgaag gtttgggggc 2401 tccagaagtg ggggcagaga tggcagaggc tgagaaattg ggggtgcagg agacagaggt 2461 ggagatttgg aggattccaa gaatagagac cgaaacagca ggaactgaga cattggggat 2521 ccacaaaata gggcccccac agatgcaacc tagactagta ggggaccagg agacagatgt 2581 ttcagtgatg gagacagcag aagatgctat actggggacc cgggagataa cagcaggttg 2641 tggagtactt ttgatagaag caaagatacc agaatccaag attgacagat ccctggagac 2701 agaggaagga gatttagggg ttctagaggt agatactggg atagcagagg ctaagatctt 2761 agggatacca gagagagcac caggggttca gaaggctctg ggagctggaa ctgaggtagc 2821 cagggtcttg gaagcagagg ctgcctcttc agaagtccca gagacagacg ctgaagaagc 2881 tgagacactg caggccaagg agcgatctga gagttctgtg gcgctgagag tagtggccaa 2941 cctaccagaa tctgagctct tagggaccca gaagacagag gtgggaggca ctgggatatc 3001 acagagagag gttagagagg cagagaccga aatcccgaag acccaggaaa tatcatctga 3061 gggttcagga gttccagact tggaggctaa gatggaagag tctgggagga aaatggagat 3121 ttgggagacc ccagaggtag agaaagtgaa ttctgagtta tttggaaccc agaaaggctc 3181 agagatccca gaactagaaa ctaagaccat aaagtctgag attctggacg ctcaggagac 3241 agaagtaagg gacttggggc ttcgtcgagg agaggctgag aaagcagaag ctgagatgtt 3301 agaaacccaa aagatggaag caaagacagc tcgggatgaa gaaatagaac tagtggaccc 3361 tggggtctcc agtccagagg ctgaggcact gagggtccag tgggcaggga ctgtagtttt
60
3421 ggagtctggg gaagtaaagg ctgacatttt gggggtccag aagcctggat cttggggagc 3481 tcttaaatat gaggccttag atgtccccgt aactaagcaa aggctttctg gggccaagga 3541 agtggtgcca gaggtaccca gagcacaaga gccagaaact aaagttttgg ggatagtaga 3601 ggccaaatct tggactttgg ggcagcagga agcagagatg gaggggtttg agtctccaga 3661 gaataaatct aatatttttg aggcccagga agcagattct ggggtcttgg gaaccatgaa 3721 ggggaaagaa gctgttgaaa gcctcgagga ggccggcctg agtaaggcac aagtggccag 3781 tgaggcaggg gctggggtgc ccaggccctc aggggcctct tccctagagg aacctgaaga 3841 ggacaggagg ctgccgggca gccaggcacc acctaccctg gtcagctcca gccagtccct 3901 gttggagtgg tgccaagagg tcaccaacgg ctaccgtggt gtctgcatca ccaacttcac 3961 cacgtcctgg cgcaatggcc tggccttctg tgctatttta catcgattct acccagacaa 4021 gatcgattat ttctcccttg atcccctcaa catcaaacag aacaacaagc aggcttttga 4081 tggcttcgct gccctgggtg tgtctcggct gctcgagccg gcggacatgg tacttctgtc 4141 cgtacctgac aagctcatcg tcatgacgta cctgtgccag atccgtgcct tctgcactgg 4201 gcaggagctg cagctggtgc aactggaggg cggcggtggc tctggcactt atcgtgtggg 4261 caacgcccag ccgagcctgc ccgactgtct ggacgcagga gacctggcgc agcgattacg 4321 cgagcatggg gctgaagtgc ccacagaacc taaggaggct gtgaaccgcg ggactggggc 4381 aataccaaag gtggcctcca gggacacgga cctgagctgc tcctctaagg atggggaggc 4441 agaggttgcc caggaagcaa tccctcaaga ggcgcccacc gacggcccta gagccaggtc 4501 gtccacaacc ccggtggtcc ctgcagaggg gctggtgaac ggagtggggg cgtcaggtgg 4561 tgtgagactg agacggtcct ctgtcaatgg ggaggctggg ccagtacctc caccccgagc 4621 acatggctct ttctcccacg tgcgggacgc cgatttgcta aagaagaggc gatcgaggtt 4681 aaggaatagt aactctttct ctgtggatga ccaggactct ggagctgcag ttggagcagg 4741 gcctgcaggg cctggagctg tggaaggtcc aaaccctgcc tccagccctg acgctaaccc 4801 actcccagcc ccagtcccac agcagccgcc cggtgggccc cctcctactg aggagtcatc 4861 acccagcctg ggggaagagg caggcctgca acggttccag gacacaagtc agtacgtgtg 4921 cgcagagctg caagccctgg agcaggaaca gggacagata gacgggaggg ccgctgaggt 4981 ggagaagcag ctgaggagcc tcatggaatc aggtgccaac aggctgcagg aggaggtgct 5041 gattcaggaa tggttcaccc tggtcaacaa gaagaatgcg ctcatccgga ggcaggacca 5101 gctgcagctg ctcatcgagg agcaagactt ggagcggagg tttgaactgc tgagccgaga 5161 gttgcgggcc atgctggcca ttgaagagtg gcagaaaaca gttgcgcagc agcaccgcga 5221 gcaactcctg ttggaggagc tggtgtctct ggtgaaccag agggatgaac tggtccggga 5281 cctggaccag aaggaacgga tcgctctgga ggaagatgag cgcctagaac gaggcctgga 5341 gcagagacgt cgcaaggtga gccggcagct gagcaggcgg gaacgctgta ccctgagctg 5401 agtctcctgt ctggtttgtc cctttctctg gtcgtggacc gtcttcgcca ctcccccagc 5461 ctgcacagca gaggccaggt ccccatgctc cttcagcgag cagaagcaag actgaccaga 5521 ctctcgggct ggagcagtga gcctgctagt gtttatttat ccgagtgtat gtgaatgttt 5581 tggcggtggt ggccaggatc ccaggcaagg gatggtgtgg ggactgacac ccacatcctc 5641 cttctcttct ggagggagca ataaagttgg agtagaacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5701 aaaaa Tang-B
1 gctcgctact cttgagctga caccagctcg acgcgccgcg acggccccgc tgactcagcc 61 agcccaccag gcggaccccg ggcaaactca gcctaggtct aaacctcaga catatctaca 121 cggacggggc ggacagatcc ggtgacaaag aaaagagctc cagagaccat ggggaccctg 181 gctgagccag cagtggtggg caagagggag tcccaagcct gagaagagat ccggcagagt 241 tcctcaggcc atgacttcag tgtggaagcg cctgcagcgg gttggcaagc gggccgccaa 301 gttccagttt gtggcgtgtt accatgaact ggtgttggag tgcaccaaga agtggcagcc 361 tgacaagctg gtggtggtat ggactcggcg gaaccgaagg atctgctcca aggcccacag 421 ctggcagcct ggcatccaga acccataccg tggcaccgtg gtatggatgg ttcctgagaa 481 cgtggacatc tcggtgacct tgtacaggga ccctcatgtg gaccagtatg aaaccaaaga 541 gtggactttt attattgaaa atgagtccaa gggacagcgg aaggtactgg ccacagttga 601 tgtgaaccta gcccaccatg cagggcctgt gcctgctcag gttccacttc gactgcggct 661 gaagcccaaa tctgtgaagg tggtgcatgc cgaactgagc ctcacccttt ctggggtgct 721 gctgcgagaa ggccgtgcca cggatgatga catgcagagt ctggccagcc tcatgagtgt 781 gaagcctagt gacgtgggaa acctggatga ctttgctgag agtgatgagg aggaagctaa
61
841 tggccctggg gctcctgagg tccggactcg aggcccccag tcagatctgt ctcgagagct 901 gaagacactc tgtgaagaag aagatgaagg ccacatacgg ccccagcagg cagctgccag 961 accctctagt gctgaagaca ccagccctgc cccagtgagt gcccctgcac ccccggtcag 1021 ggccttccgg ggccaggggt cagaaccagc tgctataacc gggggccagg tggggcctga 1081 aaccccagag cccccgccat ccccaccaga gacaaggtcc actgggcagc caggccagac 1141 catggtcccc accccagccc ctcggctccg gaaaggctct gatgcaccct cgtccccagt 1201 cccctgcagt ggggatgagg tccccaatac ctcagaggat cctccaacag gaatgggctc 1261 ttctggggag acccaggctc agataagctc tcaggaaggg acagaggccc atgaagccag 1321 gccagaacca gacattgagg caccacctac cctggtcagc tccagccagt ccctgttgga 1381 gtggtgccaa gaggtcacca acggctaccg tggtgtctgc atcaccaact tcaccacgtc 1441 ctggcgcaat ggcctggcct tctgtgctat tttacatcga ttctacccag acaagatcga 1501 ttatttctcc cttgatcccc tcaacatcaa acagaacaac aagcaggctt ttgatggctt 1561 cgctgccctg ggtgtgtctc ggctgctcga gccggcggac atggtacttc tgtccgtacc 1621 tgacaagctc atcgtcatga cgtacctgtg ccagatccgt gccttctgca ctgggcagga 1681 gctgcagctg gtgcaactgg agggcggcgg tggctctggc acttatcgtg tgggcaacgc 1741 ccagccgagc ctgcccgact gtctggacgc aggagacctg gcgcagcgat tacgcgagca 1801 tggggctgaa gtgcccacag aacctaagga ggctgtgaac cgcgggactg gggcaatacc 1861 aaaggtggcc tccagggaca cggacctgag ctgctcctct aaggatgggg aggcagaggt 1921 tgcccaggaa gcaatccctc aagaggcgcc caccgacggc cctagagcca ggtcgtccac 1981 aaccccggtg gtccctgcag aggggctggt gaacggagtg ggggcgtcag gtggtgtgag 2041 actgagacgg tcctctgtca atggggaggc tgggccagta cctccacccc gagcacatgg 2101 ctctttctcc cacgtgcggg acgccgattt gctaaagaag aggcgatcga ggttaaggaa 2161 tagtaactct ttctctgtgg atgaccagga ctctggagct gcagttggag cagggcctgc 2221 agggcctgga gctgtggaag gtccaaaccc tgcctccagc cctgacgcta acccactccc 2281 agccccagtc ccacagcagc cgcccggtgg gccccctcct actgaggagt catcacccag 2341 cctgggggaa gaggcaggcc tgcaacggtt ccaggacaca agtcagtacg tgtgcgcaga 2401 gctgcaagcc ctggagcagg aacagggaca gatagacggg agggccgctg aggtggagaa 2461 gcagctgagg agcctcatgg aatcaggtgc caacaggctg caggaggagg tgctgattca 2521 ggaatggttc accctggtca acaagaagaa tgcgctcatc cggaggcagg accagctgca 2581 gctgctcatc gaggagcaag acttggagcg gaggtttgaa ctgctgagcc gagagttgcg 2641 ggccatgctg gccattgaag agtggcagaa aacagttgcg cagcagcacc gcgagcaact 2701 cctgttggag gagctggtgt ctctggtgaa ccagagggat gaactggtcc gggacctgga 2761 ccagaaggaa cggatcgctc tggaggaaga tgagcgccta gaacgaggcc tggagcagag 2821 acgtcgcaag gtgagccggc agctgagcag gcgggaacgc tgtaccctga gctgagtctc 2881 ctgtctggtt tgtccctttc tctggtcgtg gaccgtcttc gccactcccc cagcctgcac 2941 agcagaggcc aggtccccat gctccttcag cgagcagaag caagactgac cagactctcg 3001 ggctggagca gtgagcctgc tagtgtttat ttatccgagt gtatgtgaat gttttggcgg 3061 tggtggccag gatcccaggc aagggatggt gtggggactg acacccacat cctccttctc 3121 ttctggaggg agcaataaag ttggagtaga acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa
Tang-C
1 gctcgctact cttgagctga caccagctcg acgcgccgcg acggccccgc tgactcagcc 61 agcccaccag gcggaccccg ggcaaactca gcctaggtct aaacctcaga catatctaca 121 cggacggggc ggacagatcc ggtgacaaag aaaagagctc cagagaccat ggggaccctg 181 gctgagccag cagtggtggg caagagggag tcccaagcct gagaagagat ccggcagagt 241 tcctcaggcc atgacttcag tgtggaagcg cctgcagcgg gttggcaagc gggccgccaa 301 gttccagttt gtggcgtgtt accatgaact ggtgttggag tgcaccaaga agtggcagcc 361 tgacaagctg gtggtggtat ggactcggcg gaaccgaagg atctgctcca aggcccacag 421 ctggcagcct ggcatccaga acccataccg tggcaccgtg gtatggatgg ttcctgagaa 481 cgtggacatc tcggtgacct tgtacaggga ccctcatgtg gaccagtatg aaaccaaaga 541 gtggactttt attattgaaa atgagtccaa gggacagcgg aaggtactgg ccacagttga 601 tgtgaaccta gcccaccatg cagggcctgt gcctgctcag gttccacttc gactgcggct 661 gaagcccaaa tctgtgaagg tggtgcatgc cgaactgagc ctcacccttt ctggggtgct
62
721 gctgcgagaa ggccgtgcca cggatgatga catgcagagt ctggccagcc tcatgagtgt 781 gaagcctagt gacgtgggaa acctggatga ctttgctgag agtgatgagg aggaagctaa 841 tggccctggg gctcctgagg tccggactcg aggcccccag tcagatctgt ctcgagagct 901 gaagacactc tgtgaagaag aagatgaagg ccacatacgg ccccagcagg cagctgccag 961 accctctagt gctgaagaca ccagccctgc cccagcacca cctaccctgg tcagctccag 1021 ccagtccctg ttggagtggt gccaagaggt caccaacggc taccgtggtg tctgcatcac 1081 caacttcacc acgtcctggc gcaatggcct ggccttctgt gctattttac atcgattcta 1141 cccagacaag atcgattatt tctcccttga tcccctcaac atcaaacaga acaacaagca 1201 ggcttttgat ggcttcgctg ccctgggtgt gtctcggctg ctcgagccgg cggacatggt 1261 acttctgtcc gtacctgaca agctcatcgt catgacgtac ctgtgccaga tccgtgcctt 1321 ctgcactggg caggagctgc agctggtgca actggagggc ggcggtggct ctggcactta 1381 tcgtgtgggc aacgcccagc cgagcctgcc cgactgtctg gacgcaggag acctggcgca 1441 gcgattacgc gagcatgggg ctgaagtgcc cacagaacct aaggaggctg tgaaccgcgg 1501 gactggggca ataccaaagg tggcctccag ggacacggac ctgagctgct cctctaagga 1561 tggggaggca gaggttgccc aggaagcaat ccctcaagag gcgcccaccg acggccctag 1621 agccaggtcg tccacaaccc cggtggtccc tgcagagggg ctggtgaacg gagtgggggc 1681 gtcaggtggt gtgagactga gacggtcctc tgtcaatggg gaggctgggc cagtacctcc 1741 accccgagca catggctctt tctcccacgt gcgggacgcc gatttgctaa agaagaggcg 1801 atcgaggtta aggaatagta actctttctc tgtggatgac caggactctg gagctgcagt 1861 tggagcaggg cctgcagggc ctggagctgt ggaaggtcca aaccctgcct ccagccctga 1921 cgctaaccca ctcccagccc cagtcccaca gcagccgccc ggtgggcccc ctcctactga 1981 ggagtcatca cccagcctgg gggaagaggc aggcctgcaa cggttccagg acacaagtca 2041 gtacgtgtgc gcagagctgc aagccctgga gcaggaacag ggacagatag acgggagggc 2101 cgctgaggtg gagaagcagc tgaggagcct catggaatca ggtgccaaca ggctgcagga 2161 ggaggtgctg attcaggaat ggttcaccct ggtcaacaag aagaatgcgc tcatccggag 2221 gcaggaccag ctgcagctgc tcatcgagga gcaagacttg gagcggaggt ttgaactgct 2281 gagccgagag ttgcgggcca tgctggccat tgaagagtgg cagaaaacag ttgcgcagca 2341 gcaccgcgag caactcctgt tggaggagct ggtgtctctg gtgaaccaga gggatgaact 2401 ggtccgggac ctggaccaga aggaacggat cgctctggag gaagatgagc gcctagaacg 2461 aggcctggag cagagacgtc gcaaggtgag ccggcagctg agcaggcggg aacgctgtac 2521 cctgagctga gtctcctgtc tggtttgtcc ctttctctgg tcgtggaccg tcttcgccac 2581 tcccccagcc tgcacagcag aggccaggtc cccatgctcc ttcagcgagc agaagcaaga 2641 ctgaccagac tctcgggctg gagcagtgag cctgctagtg tttatttatc cgagtgtatg 2701 tgaatgtttt ggcggtggtg gccaggatcc caggcaaggg atggtgtggg gactgacacc 2761 cacatcctcc ttctcttctg gagggagcaa taaagttgga gtagaacaaa aaaaaaaaaa 2821 aaaaaaaaaa aaaa
63
LOCALIZZAZIONE CROMOSOMIALE DEL GENE DELLA
TANGERINA NEL RATTO
Da analisi effettuate mediante l’uso delle banche dati è
emerso che il gene della Tangerina è localizzato sul cromosoma 1
del ratto (figura 4-A) e sul cromosoma 19 del topo (figura 4-B).
ANALISI DELLA SEQUENZA AMMINOACIDICA PREDETTA
DALLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DI TANG-A
I risultati riportati nel grafico (figura 5) mostrano l’analisi
incrociata con due diversi software della sequenza di tang-A.
Entrambe le analisi hanno indicato nella proteina predetta di 1673
aa due probabili domini transmenbrana.
Inoltre questa proteina è caratterizzata dalla presenza di un
calponin homolgy domain (CH) (figura 6). Il CH-domain è
coinvolto nel legame ai filamenti di actina di una buona parte della
famiglia di proteine citoscheletriche e proteine trasduttrici del
segnale. Il CH-domain presente nei trascritti della Tangerina ha
un’omologia di sequenza maggiore con il CH-domain della ß-
spectrina umana (figura 7).
64
Figura 4: Analisi comparative della sequenza del frammento ottenuto
per rtPCR con il genoma di A) Ratto; B) Topo.
65
Rattus norvegicus chromosome 1 WGS supercontig Length = 31546473 Identities = 452/456 (99%), Gaps = 2/456 (0%) Query:6 aaagacagcttggacccaagaaatagagccaggggatgctggggtctccaggccagaggc 65 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct:16875956 aaagacagcttggacccaagaaatagagccaggggatgctggggtctccaggccagaggc 16875897 Query:66 cgaggcaccgagggcccagtggacagaacctatagttttggagtcaggggaggtaaagac 125 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct:16875896 cgaggcaccgagggcccagtggacagaacctatagttttggagtcaggggaggtaaagac 16875837 Query:126 tgacattttgggggtccagaaaccaggggcttggggagctcttaaatgtgaggccttagg 185 |||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct:16875836 tgacattttgggggtccagaaacctggggcttggggagctcttaaatgtgaggccttagg 16875777 Query:186 agtccctatgactaagcaagggttttctggggccaaggaagtagtgccagaggtatccag 245 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct:16875776 agtccctatgactaagcaagggttttctggggccaaggaagtagtgccagaggtatccag 16875717 Query:246 agtacaagagccagaaactaaagttttggggatagaagaagccaaatcttggactttggg 305 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct:16875716 agtacaagagccagaaactaaagttttggggatagaagaagccaaatcttggactttggg 16875657 Query:306 gcaacagaaagcggagagggaggggtttgaatctccagagaataaatctgatatttttga 365 |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct:16875656 gcaacagaaagcagagagggaggggtttgaatctccagagaataaatctgatatttttga 16875597 Query:366 ggcccaggaaacagaatctaggggtcttgggaaccatgaaggggaaagaagccgatgaaa 425 ||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct:16875596 ggcccaggaaacagaatct-ggggtcttgggaaccatgaaggggaaagaagccgatgaaa 16875538 Query:426 gcctcaaggaggccagccatgaataaggcacaagtg 461 |||||||||||||||||| ||||||||||||||||| Sbjct:16875537 gcctcaaggaggccagcc-tgaataaggcacaagtg 16875503
Query = cDNA tang-A Subject = sequenza genomica di ratto
A
66
Mus musculus chromosome 19 genomic contig, strain C57BL/6J
Length = 3511205 Identities = 405/459 (88%), Gaps = 8/459 (1%) Query:6 aaagacagct-tggacccaagaaatagagccaggggatgctggggtctccaggccagagg 64 |||||||||| ||| |||||||||| | || |||| ||||||||||||| ||||||| Sbjct:970986 aaagacagctcggga-tgaagaaatagaactagtggatcctggggtctccagtccagagg 971044 Query:65 ccgaggcaccgagggcccagtggaca-gaacctatagttttggagtcaggggaggtaaag 123 | ||||||| ||||| ||||||| || | | || ||||||||||||| ||||| |||||| Sbjct:971045 ctgaggcactgagggtccagtgggcaggga-ctgtagttttggagtctggggaagtaaag 971103 Query:124 actgacattttgggggtccagaaaccaggggcttggggagctcttaaatgtgaggcctta 183 |||||||||||||||||||||| || || |||||||||||||||||| |||||||||| Sbjct:971104 gctgacattttgggggtccagaagcctggatcttggggagctcttaaatatgaggcctta 971163 Query:184 gga-gtccctatgactaagcaagggttttctggggccaaggaagtagtgccagaggtatc 242 || ||||| | ||||||||| || ||||||||||||||||||| |||||||||||| | Sbjct:971164 -gatgtccccgtaactaagcaaaggctttctggggccaaggaagtggtgccagaggtacc 971222 Query:243 cagagtacaagagccagaaactaaagttttggggatagaagaagccaaatcttggacttt 302 ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| ||| ||||||||||||||||| Sbjct:971223 cagagcacaagagccagaaactaaagttttggggatagtagaggccaaatcttggacttt 971282 Query:303 ggggcaacagaaagcggagagggaggggtttgaatctccagagaataaatctgatatttt 362 |||||| ||| |||| |||| |||||||||||| |||||||||||||||||| ||||||| Sbjct:971283 ggggcagcaggaagcagagatggaggggtttgagtctccagagaataaatctaatatttt 971342 Query:363 tgaggcccaggaaacagaatctaggggtcttgggaaccatgaaggggaaagaagccgatg 422 ||||||||||||| |||| ||| |||||||||||||||||||||||||||||||| | || Sbjct:971343 tgaggcccaggaagcagattct-ggggtcttgggaaccatgaaggggaaagaagctgttg 971401 Query:423 aaagcctcaaggaggccagccatgaataaggcacaagtg 461 |||||||| ||||||| ||| ||| ||||||||||||| Sbjct:971402 aaagcctcgaggaggctggcc-tgagtaaggcacaagtg 971439
Query = cDNA tang-A Subject = sequenza genomica di topo
B
67
Figura 5: I risultati riportati in grafico mostrano l’analisi incrociata della
sequenza di tang-A effettuata con due diversi software, DAS
della Stockholm University, e TMpred della EMBnet.
Entrambe le analisi hanno indicato nella proteina due probabili
domini transmenbrana evidenziati in rosso, uno localizzato
nella zona carbossi-terminale e un altro nella zone ammino-
terminale.
68
A
B
Figura 6: A)Rappresentazione lineare computerizzata della proteina
predetta tang-A con in evidenza la zona dove è presente il CH-
domain.
B)Rappresentazione tridimensionale computerizzata del CH-
domain della ß-spectrina umana visto perpendicolarmente (a) o
parallelamente (b) rispetto ai due core a-elica C e G (Gimona et
al., 2001)
69
Identities = 42/98 (42%), Positives = 62/98 (62%), Gaps = 2/98 (2%)
Query: 1229 SSSQSLLEWCQEVTKGYRGVCITNFTTSWRNGLAFCAILHRFYPDKIDYFSLDPLNIKQN 1288 S+ +LL WCQ T GY V I NFTTSWR+G+AF A++H+ PD ID+ L N N Sbjct: 3 SAKDALLLWCQMKTAGYPNVNIHNFTTSWRDGMAFNALIHKHRPDLIDFDKLKKSNAHYN 62 helix 59 **** helix 35 ********** helix 5 ************ Domain 1 3 ************************************************************ Query: 1289 NKQAFD-GFAALGVSRLLEPADMVLLSVPDKLIVMTYL 1325 + AF+ LG+++LL+P D + + PD+ ++TY+ Sbjct: 63 LQNAFNLAEQHLGLTKLLDPED-ISVDHPDEKSIITYV 99 helix 63 ********** Domain 1 63 ******************** helix 92 ********
Query = CH-domain della ß-spectrina umana
Subject = CH-domain della Tangerina
Figura 7: Confronto per allineamento delle sequenza amminoacidiche
delle regioni CH-domain della ß-spectrina umana e della
Tangerina di ratto.
70
ANALISI TEMPORALE DELL’ESPRESSIONE DELLE TRE
ISOFORME DELLA TANGERINA NEL TESTICOLO DI RATTO
Dall’indagine di bioinformatica si è evidenziata la presenza di tre
varianti del cDNA della Tangerina in topo e si è deciso, nell’ambito
di interesse della spermatogenesi, di indagare per la presenza dei
vari prodotti dello splicing alternativo anche nel ratto. A tal fine,
siamo riusciti a costruire coppie di oligonucleotidi specifici per
evidenziare la presenza delle tre isoforme anche nel ratto (figura
8).
Una coppia era specifica per la isoforma A mentre l’altra
coppia di oligonucleotidi doveva produrre l’amplificazione sia della
isoforma B che della isoforma C. La distinzione tra le due
avveniva in base alle dimensioni.
La grandezza attesa dei prodotti era:
Tang-A: 450cb
Tang-B: 700cb
Tang-C: 450cb
71
TangA(1): 5’-caaagaacacttggacccaag-3’
TangA(2): 5’-cacttgtgccttattcaggctg-3’
TangBC(1): 5’-cgctcaggttccacttcga-3’
TangBC(2): 5’-gtgatgcagacaccacggtag-3’
Figura 8: a) Coppia di oligonucleotidi specifici per l’amplificazione di
un frammento della tang-A di ratto della lunghezza di 460cb
b) Coppia di oligonucleotidi specifici per l’amplificazione di un
frammento della tang-B di 700cb e di un frammento della
tang-C di 450cb
T.M. 62°C
LUNGH. 21cb
T.M. 62°C
LUNGH. 22cb
T.M. 62°C
LUNGH. 19cb
T.M. 61,5°C
LUNGH. 21cb
(a)
(b)
72
Il primo obiettivo del mio lavoro di tesi era quello di verificare
la presenza dei trascritti della Tangerina nel testicolo di ratto a vari
stadi di sviluppo. Quelli presi in esame sono: due settimane; un
mese; sei mesi; dodici mesi.
Si è quindi provveduto all’estrazione degli RNA totali da
testicoli di animali dell’età prestabilita e si è controllata l’integrita
degli RNA ribosomiali 18S e 28S tramite corsa elettroforetica su
gel di agarosio (figura 9). Da questi sono stati purificati i
messaggeri.
Gli mRNA sono stati utilizzati per fare i rispettivi cDNA
tramite l’enzima trascrittasi inversa, con i quali è stato allestito un
esperimento di rtPCR con gli oligonucleotidi specifici per le
isoforme della Tangerina. Come controllo sono stati utilizzati
oligonucleotidi per il gene della gliceraldeide 3-fosfato
deidrogenasi (GAPDH).
Dai risultati visibili in figura 10 si può osservare che mentre
l’andamento per la tang-C durante lo sviluppo è pressoché
costante quello della tang-A aumenta progressivamente.
Le bande contenenti i frammenti risultanti dalla PCR di tang-
A e tang-C rispettivamente di 12 mesi e 6 mesi, sono state
estratte dal gel di agarosio e clonate nel vettore TOPO TA.
Successivamente il plasmide contenente l’inserto è stato
recuperato tramite procedimento di minipreparazione (miniprep) di
DNA plasmidico (figura 11-A), linearizzato con l’enzima di
restrizione Eco RI i cui siti di azione sono posti al 5’ e 3’
dell’inserto, per determinarne la grandezza, e successivamente il
plasmide è stato usato anche per una analisi di sequenza (figura
11-B).
73
Figura 9: Corsa elettroforetica in gel di agarosio all’ 1% in TBE 1x di
RNA totali (5 µg) estratti da testicoli di ratto a diversi stadi di
sviluppo.
2 se
ttim
ane
3 m
esi
6 m
esi
12 m
esi
28 S
18 S
74
Figura 10: Analisi su gel di agarosio 1% in TBE 1x dei prodotti di rt-PCR
per la tang-A e la tang-C nel testicolo agli stadi di sviluppo
presi in esame nel ratto. Dagli esperimenti eseguiti la tang-B è
poco espressa o del tutto assente.
Si può osservare che mentre l’andamento per la tang-C durante
lo sviluppo è pressoché costante quello della tang-A aumenta
progressivamente durante lo sviluppo.
La GAPDH è il controllo usato per normalizzare perché ha un
andamento dell’espressione costante durante lo sviluppo.
75
22 SS
EE TT TT
II MMAA N
NEE
11 MM
EE SS E
E
66 MM
EE SS I
I
1122
MMEE SS
II
446600 ccbb
445500 ccbb
550000 ccbb
770000 ccbb
ttaanngg--AA
ttaanngg--BB
ttaanngg--CC
GGAAPPDDHH
76
Figura 11: A) Elettroforesi su gel di agarosio del plasmide in cui sono
stati clonati i prodotti di PCR di tang-A e tang-C digerito
con l’enzima Eco RI.
B) Sequenze nucleotidiche dei prodotti di PCR. Come atteso
corrispondono alle isoforme A e C della Tangerina
77
Plas
mid
e no
n di
geri
to
Pla
smid
e di
geri
to c
on E
coR
I
+ ta
ng-C
M
arke
r 10
0cb
Plas
mid
e di
geri
to c
on E
coR
I
+ ta
ng-A
A
78
TANG-A CCCTTAAAGACAGCTTGGACCCAAGAAATAGAGCCAGGGGATGCTGGGGTCTCCAGGC
CAGAGGCCGAGGCACCGAGGGCCCAGTGGACAGAACCTATAGTTTTGGAGTCAGGGGA
GGTAAAGACTGACATTTTGGGGGTCCAGAAACCAGGGGCTTGGGGAGCTCTTAAATGT
GAGGCCTTAGGAGTCCCTATGACTAAGCAAGGGTTTTCTGGGGCCAAGGAAGTAGTGC
CAGAGGTATCCAGAGTACAAGAGCCAGAAACTAAAGTTTTGGGGATAGAAGAAGCCAA
ATCTTGGACTTTGGGGCAACAGAAAGCGGAGAGGGAGGGGTTTGAATCTCCAGAGAAT
AAATCTGATATTTTTGAGGCCCAGGAAACAGAATCT-
GGGGTCTTGGGAACCATGAAGGGGAAAGAAGCCGATGAAAGCCTCAAGGAGGCCAGCC
ATGAATAAGGCACAAGTGAAGGGC
TANG-C: GGCCAGCCTGAATAAGGCACAAGTGGCCAGTGAGGCAGGGGCTGGGGTACCCAGGCCC
TCAGGGGCCTCTTCCCCAGAGGAGCCTGAAGAGGACAGGAGGCTGCCGGGCAGCCAGG
CACCATCTGCCCTGGTCAGCTCCAGCCAGTCCCTGTTGGAGTGGTGCCAAGAGGTCAC
CAAGGGCTACCGTGGTGTCTGCATCACCAATTTCACCACATCCTGGCGCAACGGCCTG
GCCTTCTGTGCTATTTTACTCGATTCTACCCAGACAAGATTGACTATTTCTCCCTTGA
TCCACTCAACATCAAACAGAACAACAAGCAGGCTTTTGATGGCTTCGCTGCCCTGGGC
GTGTCTCGGCTGCTCGAGCCAGCGGCATGGTGCTTCTGTCCGTACCTGACAAGCTCAT
CGTCATGACGTACCTGTGCCAGATCCGTGCCTTCTGCACTGGGCAG
B
79
La reazione di PCR è stata fatta correre nuovamente su gel di
agarosio all’1% in TBE 1x e i suoi prodotti sono stati trasferiti su
un filtro Hybond mediante la tecnica del Southern Blot descritta in
materiali e metodi. Successivamente si sono ibridati i frammenti di
DNA utilizzando i cDNA di tang-A e tang-C, ottenuti con la
precedente PCR, marcati mediante la tecnica del Random Primer.
Con questo esperimento si è potuta verificare la presenza dei
trascritti di tang-A e tang-C anche negli altri stadi di sviluppo
studiati. Il frammento di GAPDH è stato utilizzato come controllo
(figura 12).
80
Figura 12:A) Ibridazione dei prodotti di PCR ottenuti con oligonucleotidi
specifici per tang-A e GAPDH con cDNA marcato di tang-A
e GAPDH
B) Ibridazione dei prodotti di PCR ottenuti con
oligonucleotidi specifici per tang-C e GAPDH con cDNA
marcato di tang-C e GAPDH
81
2 se
ttim
ane
3 m
esi
6 m
esi
12 m
esi
tang-A
GAPDH
A
82
tang-C
GAPDH
2 se
ttim
ane
3 m
esi
6 m
esi
12 m
esi
B
83
LOCALIZZAZIONE SPAZIALE DELLA TANGERINA
Per il gene Tangerina è stato determinato il profilo di
espressione cellulare tramite la tecnica dell’ibridazione in situ su
sezioni di testicolo di animali adulti di Rattus norvegicus. A tal
scopo, il plasmide contenente l’inserto è stato linearizzato con Not
I e Kpn I, i cui siti di restrizione sono posti a monte e a valle
dell’inserto per produrre rispettivamente l’RNA senso e antisenso,
marcati successivamente con digossigenina (DIG-UTP). La sonda
utilizzata è un RNA messaggero antisenso, presente in tutte e tre
le isoforme. Su preparati di sezioni istologiche di testicolo di tre
mesi si è proceduto con l’ibridazione in situ. Alla fine la rilevazione
del trascritto marcato avviene attraverso l’uso dell’anticorpo anti-
DIG coniugato con la fosfatasi alcalina e, sfruttando una reazione
colorimetrica catalizzata dall’enzima stesso, in presenza dei
substrati BCIP ed NBT, si possono apprezzare le cellule dove
sono presenti i vari trascritti della Tangerina.
Dalla figura 13 si evince che il segnale è presente negli
spermatociti e negli spermatidi rotondi.
84
Figura 13: A e B: Ibridazione in situ con cRNA antisenso di tang-C su
sezioni di testicoli di ratto di 3 mesi di età (A x200; B x325).
C e D: Ibridazione in situ con cRNA senso di Tang su sezioni
di testicoli di ratto di 3 mesi di età (C x200; D x325).
L’analisi di ibridazione in situ evidenzia che il trascritto della
Tangerina è specificamente localizzato nel citoplasma degli
spermatociti e dei spermatidi rotondi.
A
D
C
B
85
DISCUSSIONE
86
La spermatogenesi è un complesso processo di sviluppo
che coinvolge la moltiplicazione delle cellule germinali, il loro
differenziamento, la divisione meiotica e la trasformazione in
spermatozoi maturi. La spermatogenesi è regolata
sostanzialmente da differenti ormoni endocrini sia di tipo
proteico sia di tipo steroideo; meccanismi di regolazione di tipo
paracrino e/o di tipo autocrino sono stati anche evidenziati
(Pescovitz, et al.1994). I tipi cellulari che prevalentemente
giocano un ruolo fondamentale affinché la spermatogenesi
possa realizzarsi sono le cellule di Leydig e quelle del Sertoli, le
quali intervengono sia nella regolazione di tipo endocrina sia in
quella paracrina e/o autocrina.
Per cercare di chiarire i meccanismi che si realizzano
durante la gametogenesi si è provato ad isolare geni espressi
nelle gonadi in maniera specifica o ad alti livelli.
Esperimenti condotti sull’anfibio Rana esculenta presso il
laboratorio dove ho svolto il lavoro di tesi hanno messo in
evidenza che la protimosina-a (prot-a), una proteina ubiquitaria
implicata in diversi eventi, quali la proliferazione cellulare e la
compattazione della cromatina, sembrerebbe avere un ruolo
specifico durante la spermatogenesi della rana in quanto la sua
espressione varia durante il ciclo annuale raggiungendo un
massimo nel mese di settembre, quando l’anfibio si prepara alla
successiva ondata spermatogenetica. Il trascritto della prot-a è
presente quasi esclusivamente negli spermatociti primari e
secondari indicando un probabile ruolo di questa proteina
durante la meiosi (Aniello et al., 2002). Altro gene di cui sono
state studiate le implicazioni nella spermatogenesi di Rana
esculenta è la relaxina (frog relaxin, fRLX). Tale gene è la prima
87
forma di relaxina ad essere stata isolata e caratterizzata a
livello molecolare in una specie non mammifero (De Rienzo et
al., 2001).
Dai dati presenti nella letteratura si evidenzia che fino a
questo momento, nei mammiferi, sono stati isolati solo pochi
geni coivolti con la spermatogenesi. Uno di questi, la
protammina, codifica per componenti delle cellule germinali
(Bolbarth et al., 1984), altri controllano l’attività metabolica
come la fosfoglicerato chinasi 2 (PHG-2) (Kramer et al., 1981) o
altri ancora come Hox 1’4 (Wolfenith et al., 1987) e CREM
(cyclic AMP-responsive element modulator) (Blendy et al.,1996)
possono regolare l’espressione di geni specifici. Dodici nuove
sequenze geniche espresse durante la spermatogenesi di ratto
sono state isolate tramite la tecnica del differential display (Luk
et al., 2003).
Recentemente è stato isolato attraverso tecniche di RNA
differential display un gene denominato “Calmin” che è
espresso negli stadi finali della spermatogenesi e produce una
proteina che presenta due domini ad omologia calponinica (CH-
domain) in tandem che permettono il legame con il
citoscheletro. Questa proteina sembrerebbe essere implicata
nella spermioistogenesi (Ischisaki Z. et al., 2001).
Nei laboratori dove ho svolto il mio lavoro di tesi ci si è
interessati dello studio di geni coinvolti con la spermatogenesi
dei mammiferi oltre a quella degli anfibi. Esperimenti condotti
sul testicolo di Rattus norvegicus hanno portato ad isolare un
clone di cDNA per il gene “Tangerina”. La Tangerina è un gene
che dà più messaggeri grazie al fenomeno dello splicing
alternativo. In precedenza isoforme di questo gene sono state
88
isolate e caratterizzate come proteine associate all’apparato del
Golgi nel mammifero Mus musculus e la loro sequenza è stata
inserita in banca dati da Melichar e collaboratori nel 2000. In
base alla grandezza i trascritti sono stati chiamati tang-A; tang-
B; tang-C.
Ci sono evidenze sperimentali che l’espressione di tang-A
sia regolata nel cristallino del topo da Pax6 (Chauhan et al.,
2002)
Le sequenze amminoacidiche codificate da tutti i trascritti
sono caratterizzate dalla presenza di un dominio ad omologia
calponinica (CH-domain).
Il CH-domain è coinvolto nel legame ai filamenti di actina
di una buona parte della famiglia di proteine citoscheletriche e
proteine trasduttrici del segnale (Galkin et al., 2001).
Comunque nella Calponina ci sono evidenze sperimentali che il
CH-domain non è direttamente coinvolto nel legame della
proteina con l’actina (Gimona e Mital, 1998) . Molte proteine
hanno due copie del CH-domain, tuttavia anche altre proteine
ne possiedono una singola copia, come la Calponina stessa
(Czurylo, 2000) o anche il proto-oncogene umano vav (Katzav
et al., 1989). Il CH-domain presente nei trascritti della
Tangerina ha un’alta omologia di sequenza con il CH-domain
della ß-spectrina umana. Nella spectrina e nelle proteine
spectrine-like la regione che lega l’actina è presente
all’estremità N-terminale in duplice copia (Gimm et al., 2002).
Sempre dalla analisi della struttura amminoacidica risulta
possibile la presenza di due domini transmembrana posti uno
nella porzione C-terminale e uno nella porzione N-terminale.
89
Per valutare il profilo di espressione nel testicolo durante
lo sviluppo del ratto sono stati condotti esperimenti di rt-PCR su
tessuti di animali di due settimane, 1, 6 e 12 mesi.
I risultati mostrano un andamento crescente durante lo
sviluppo per la tang-A e un andamento pressoché costante per
tang-C, mentre tang-B risulta assente o poco espressa in tutti
gli stadi esaminati.
Questo esperimento è stato importante per verificare
l’espressione del gene Tangerina nel testicolo dall’età post
natale fino all’adulto e per conoscere quali trascritti maturi del
gene si trovavano nel citoplasma e in quali quantità. Inoltre,
essendo i livelli di espressione di tang-A, nei testicoli prelevati
da animali ancora sessualmente immaturi, estremamente
ridotti, mentre in animali che hanno raggiunto la maturazione
sessuale questi sono ben più elevati, si può ipotizzare un ruolo
diretto di questa isoforma nella spermatogenesi.
Dalle analisi mediante ibridazione in situ effettuate sui
testicoli di ratto adulto si è potuta evidenziare la localizzazione
spaziale dei trascritti della Tangerina. Questi sono localizzati
quasi esclusivamente nelle cellule germinali e in particolare,
elevate concentrazioni si sono osservate a livello degli
spermatociti e degli spermatidi.
Negli spermatozoi maturi ormai spermiati nel lume del
tubulo seminifero, non ci sono evidenze della presenza degli
mRNA della Tangerina.
Gli spermatidi attraversano il processo della
spermioistogenesi, fenomeno caratterizzato dalla
trasformazione di queste cellule rotonde in cellule
morfologicamente molto diverse: gli spermatozoi. Durante
90
questo processo l’apparato del Golgi ha una intensa attività
dovuta soprattutto alla produzione e allo smistamento di tutte
quelle proteine che andranno a formare il pool enzimatico
acrosomiale. L’insieme dei risultati di questi esperimenti e la
attestata associazione dei prodotti proteici con l’apparato del
Golgi, suggerisce per i trascritti della Tangerina (ed in
particolare per tang-A) un ruolo attivo durante la
spermatogenesi e più precisamente, durante la
spermioistogenesi.
Questa ipotesi dovrà essere confermata da ulteriori studi
che tra l’altro comprendono esperimenti necessari per
caratterizzare la reale natura dei prodotti proteici dei vari
trascritti.
91
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