Upload
others
View
2
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
KAJA ANTONČIČ
VPLIV RAZLIČIC TOKSINA CDTBAKTERIJE
AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS
NA PREŢIVELOST PRODUCENTSKIH BAKTERIJ
DIPLOMSKO DELO
LJUBLJANA, 2015
UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
DVOPREDMETNI UČITELJ: BIOLOGIJA, GOSPODINJSTVO
KAJA ANTONČIČ
Mentor: doc.dr. Matej BUTALA
VPLIV RAZLIČIC TOKSINA CDTBAKTERIJE AGGREGATIBACTER
ACTINOMYCETEMCOMITANS NA PREŢIVELOST PRODUCENTSKIH
BAKTERIJ
DIPLOMSKO DELO
LJUBLJANA, 2015
ZAHVALA
Zahvaljujem se mentorju doc. dr. Mateju Butali, za pomoč pri diplomskem delu in dosledno
izvajanje mentorstva, kakršnega si ţeli vsak študent. Za spremljanje in pomoč pri
laboratorijskem delu se zahvaljujem tudiasistentu Davorju Obradoviću. Velika zahvala gre
moji mami Tanji, ki mi je študij omogočila,in drugim članom druţine, prijateljem in
prijateljicam za spodbudo pri študiju. Na koncu bi se zahvalila še svojim kolegicam na
fakulteti, ki so mi bile vedno pripravljene pomagati in so vsaka po svoje sooblikovale moja
študijska leta.
POVZETEK
V diplomskem delu sem predstavila pomen ustne higieneza nastajanje zobnega plakain s tem
povezano teorijo temeljnega kamna predvsem pri razvoju parodontoze. Poudarek naloge je na
lastnostih bakterijeAggregatibacter actinomycetemcomitans in toksinu Cdt, ki ga omenjena
bakterija sintetizira. Namen diplomske naloge je bil sproţiti sintezo različice
rekombinantnega toksina CdtB in preveriti vpliv toksina na bakterijsko rast. Za cilj smo si
zadali izvedbo testa za analizo vpliva različice toksina CdtB na preţivelost producentske
bakterije Escherichia coli. Uporabili smo metodo veriţne reakcije s polimerazo in druge
osnovne molekularno biološke tehnike. Dokazali smo, da— posamezna varianta toksina CdtB
različno vpliva na rast producentskih bakterij in da različica in ne divji tip toksina Cdt
prepreči rast bakterije Escherichia coli.
ABSTRACT
In my diploma I am presenting oral hygiene, dental plaque formation and in association with
that, keystone pathogen hypothesis for periodontitis development.The characteristics of
bacterium Aggregatibacter actinomycetemcomitans, which is strongly connected to
periodontal disease and its Cdt toxin are described. The purpose of the diploma, was to
determine the effect of the synthesis of recombinant Cdt toxinand its varianton the growth of
the producing bacteria. The aim wasto implement a test to analyze the effect of recombinant
CdtB toxin variants on the survival of the producingEscherichia coli. To accomplish this, we
applied basic molecular-biology techniques. We showed that we can discriminate between the
CdtB toxin according to the count of the colony forming, and that the toxin variant, but not
the wild type CdtB toxin prevent growth of theEscherichia coli.
KLJUČNE BESEDE: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, toksin Cdt, parodontalna
bolezen, zobni plak
KEY WORDS: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Cdt toxin, periodontal disease,
dental plaque
KAZALO VSEBINE
1. UVOD .................................................................................................................................... 1
2. USTNA HIGIENA ................................................................................................................. 3
2.1 Zobni plak ........................................................................................................................ 3
2.2 Nastajanje zobnega plaka ................................................................................................. 4
2.3 Spremembe v mikrobni sestavi oralnega biofilma ........................................................... 7
2.4 Zobna gniloba ................................................................................................................... 8
3. Teorija temeljnega kamna ...................................................................................................... 9
3.1 Hipoteza temeljnega patogena na primeru parodontoze ................................................ 10
4. Parodontoza .......................................................................................................................... 11
4.1 Razvrstitev parodontalnih bolezni .................................................................................. 12
5. Bakterija Aggregatibacter actinomycetemcomitans ............................................................. 13
6. Toksin Cdt ............................................................................................................................ 16
6.1 Sinteza in sekrecija toksina Cdt ..................................................................................... 17
6.2 Vstop aktivne komponente CdtB v jedro ....................................................................... 18
6.3 Apoptoza, povzročena s Cdt ........................................................................................... 19
7. Test preţivelosti producentskih bakterij .............................................................................. 20
7.1 V delu uporabljene metode ............................................................................................ 20
7.2 Priprava kompetentnih celic in transformacija ............................................................... 21
7.4 Rezultati ......................................................................................................................... 22
8. ZAKLJUČEK IN SKLEPI ................................................................................................... 23
VIRI IN LITERATURA .......................................................................................................... 24
KAZALO SLIK
Slika 1: Shematski prikaz bakterij, ki oblikujejo arhitekturo zobnega plaka v ustni votlini
(povzeto po Kolenbrander idr., 2010) ........................................................................................ 5
Slika 2: Model vpliva molekule AI2 na tvorbo zobnega plaka (povzeto po Kolenbrander idr.,
2010) ........................................................................................................................................... 6
Slika 3: Tvorba biofilma iz treh oralnih bakterij. Posnetek pridobljen s konfokalno
mikroskopijo (povzeto po Kolenbrander idr., 2010) .................................................................. 8
Slika 4: Modela poteka infekcije. (A) Infekcija s P. gingivalis in (B) infekcija z bakterijo S.
typhimurium (povzeto po Hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012) ....................................... 10
Slika 5: Kategorije parodontalne bolezni (povzeto po Armitage, 2004) .................................. 12
Slika 6: Posnetek bakterij A. actinomycetemcomitans, pridobljen z elektronsko mikroskopijo
(povzeto po Dennis Kunkel Microscopy, 2008) ...................................................................... 13
Slika 7: Struktura holotoksina Cdt, določena z rentgensko kristalografijo, bakterije
Haemophillus ducreyi. Podenota CdtA modro, CdtC rdeče in CdtB zeleno (povzeto po Nešić,
Hsu in Stebbins, 2004) ............................................................................................................. 17
Slika 8: Model sinteze in sekrecije AaCdt pri bakteriji E. coli (povzeto po DiRienzo, 2014) 18
Slika 9: Model razvrščanja toksina Cdt v evkariontski celici (povzeto po DiRienzo, 2014) . 19
Slika 10: Transformante s plazmidnim konstruktom za divji tip (desno) ali njegovo različico
toksina CdtB (levo), (plošči, prikazani spodaj) ali hkrati še s plazmidom pLysS (plošči,
prikazani zgoraj) ....................................................................................................................... 22
1
1. UVOD
Sevi bakterije Aggregatibacter actinomycetemcomitanssintetizirajo toksin Cdt, ki toksično
deluje na nekatere celice evkariontov. Bakterija je oportunistični oralni patogen, ki je močno
povezana z nastankom in razvojem parodontoze. V preteklem letu so pri dveh pacientih s
parodontozo v Sloveniji odkrili seva z zapisom za identično različico toksina Cdt(Obradović,
Gašperšič, Seme, Maček in Butala, 2014).
Toksin Cdt ali angleško »cytolethal distending toxin« je podrazred superdruţine toksinov AB.
Sintetizirajo ga Gram-negativne bakterije, kot so Aggregatibacter actinomycetemcomitans
(Cdt toksin te baktije lahko skrajšamo kot AaCdt), Campylobacter jejuni Escherichia coli,
Haeophilius ducreyi,Helicobacter hepaticus, Providencia alcalifaciens, Shigella boydii in
Shigella dysenteriae. Toksin Cdt je holotoksin, zgrajen iz podenote A, B in C. V večini
primerov okuţenih kultur CdtB povzroča lome dvojne vijačnice DNA tarčnih celic, kar
aktivira kontrolne točke celičnega cikla in vodi v prenehanje rasti ter celično smrt (DiRienzo,
J. M., 2014).
V diplomski nalogi bom predstavila ustno higieno in v povezavi z njo nastajanje zobnega
plaka terustnih bolezni. Razloţila bom teorijo temeljnega kamna na primeru razvoja
parodontoze in opisala različne vrste oziroma oblike parodontalne bolezni. Osredotočila se
bom na bakterijo Aggregatibacter actinomycetemcomitans in toksin Cdt.Prikazala bom,kako
poteka njegova sinteza in izločanje iz celice, korake v procesu zastrupitve ter vpliv Cdt na
celično smrt. V zaključku bom predstavila izvedbo testa vpliva toksina Cdt na preţivelost
producentskih bakterij.
Cilj diplomske naloge je predstaviti parodontozo in vpliv bakterije Aggregatibacter
actinomycetemcomitans na razvoj te bolezni ter izvedba testa za analizo vpliva različic
toksina Cdt na rast producentske celice Escherichiacoli.
Diplomska naloga bo temeljila na dveh raziskovalnih vprašanjih oziroma hipotezah:
– Sevi bakterije Aggregatibacter actinomycetemcomitanssintetizirajo številne virulenčne
dejavnike, s katerimi vplivajo na razvoj parodontoze.
– Derivat divjega tipa toksina Cdt bakterije Aggregatibacter actinomycetemcomitansprepreči
rast producentske bakterije Escherichia coli.
2
Glede na zastavljeni hipotezi v delubom predstavila vsebino strokovne literature o vplivu
bakterije Aggregatibacter actinomycetemcomitansna razvoj parodontoze in robusten test za
ločevanje med dvema oblikama toksina CdtB.
3
2. USTNA HIGIENA
Oralno zdravje je stanje brez kroničnih ustnih in obraznih bolečin, oralnega raka ter raka na
grlu, ustnih ran, prirojenih okvar, kot je razcepljena ustnica, parodontalne bolezni, zobne
gnilobe, izpadanja zob in drugih motenj, ki vplivajo na ustno votlino (Coker, Ploeg,
Kaasalainen in Fisher, 2013).
Dobra higiena ust in zob vpliva na preprečevanje mnogih obolenj, katera pogosto niso
direktno vezana zgolj na ustno votlino. Najpogostejša obolenja ust in zob, kot sta karies in
parodontalna bolezen, sta med drugim posledica tudi slabe ustne higiene. Ustrezna ustna
higiena pa ne ohranja le zdravja zob in ustne votline, temveč tudi drugih organov, kot so srce,
krvne ţile, ledvice in sklepi. Preprečevanje kariesa in parodontalnih bolezni vključuje
pravilno in redno umivanje zob in ustne votline ter redne preglede pri zobozdravniku. Poleg
tega je priporočljivo tudi odstranjevanje zobnega plaka z zobno nitko in občasna uporaba
ustne vodice(Ljaljević, Matijević, Terzić, Andjelić in Mugoša, 2010).
2.1 Zobni plak
Ustna votlina s svojimi področji, kot so površina zob, prostori med zobmi, prostor med
dlesnijo in zobom, jezik, lična ter nebna sluznica in slina, predstavlja posebno okolje, ki ga
naseljujejo specifične populacije mikroorganizmov normalne ustne flore. Bakterijske zobne
obloge ali zobni plak so organiziran skupek čvrsto pritrjenih bakterijskih kolonij na površini
zob in v obzobnem ţepu. Med imunskim sistemom telesa in bakterijami, ki sestavljajo zobni
plak, se ob pravilni in redni ustni higieni vzpostavi ravnoteţno stanje, ki ohranja zdravje zob
in obzobnih tkiv (Kolenbrander, Palmer, Periasamy in Jakubovics, 2010). Ker pa je ustna
votlina ves čas podvrţena spremembam in prilagoditvam zaradi neučinkovitega
odstranjevanja oblog, vnašanja hrane in vstopa novih mikroorganizmov, se spreminja tudi
ravnoteţje med odzivom gostitelja in mikroorganizmi, kar lahko vodi v povečanje deleţa
patogenih bakterij v zobnem plaku.Ta lahko v neugodnih razmerah povzroča bolezni ne samo
v ustni votlini, temveč tudi na drugih delih telesa (Gašperšič, 2009).Zobni plak sestavljajo
metabolno aktivne, neaktivne in mrtve celice (Peterson idr., 2014).
Ustni mikrobiom odraslega posameznika torej predstavlja zelo usklajeno skupnost vrst,
izbrano za preţivetje v izjemno tekmovalnem in zahtevnem okolju s pogostimi spremembami
4
v prehranskih hranilih, kisiku, temperaturi, pH in energijskem metabolizmu. Faktorji, ki
vplivajo na sestavo oralnega mikrobioma, so genetski, imunološki, vedenjski in
okoljski.Molekularne analize so pokazale, da v ustni votlini ljudi najdemo več kot 700 vrst
bakterij, medtem ko je v zdravih ustih vsakega posameznika prisotnih od 100 do 200 različnih
vrst (Paster, Olsen, Aas in Dewhirst, 2006).
Kolenbrander idr.(2010) ustno votlino primerjajo z otokom, unikatnim okoljem v človeškem
telesu, za katerega je značilna skoraj konstantna prisotnost tekoče vode, kratkoročna, vendar
ekstremna nihanja temperature, izpostavljena trdna površina (zobje) in velike razlike v
dostopnosti ogljika in dušika. Posledično ustna votlina predstavlja edino ekološko nišo za
številne bakterije, izolirane iz ust.
Zobni plak lahko v grobem delimo na supragingivalni biofilm, lociran na izpostavljeni
sklenini, in subgingivalni biofilm, ki se nahaja pod dlesnijo in znotraj parodontalnega ţepa
oziroma sulkusa (Kolenbrander idr., 2010).
Določene vrste bakterij v zobnem plaku iz enostavnih sladkorjev tvorijo kislino, kar zniţa
vrednost pH mikrookolja in predstavljajo glavni faktor za demineralizacijo zobne površine.
Dostopnost ogljikovih hidratov v prehrani je torej pomembna za začetek in razvoj biofilma.
Nadalje, nekatere bakterije, npr. bakterija Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
sinetizirajo številne virulentne dejavnike, ki vplivajo na zdravje dlesni (Peterson idr., 2014).
2.2 Nastajanje zobnega plaka
Model kolonizacije bakterij v ustih(slika 1) prikazuje, da zgodnji kolonizatorji prepoznavajo
receptorje na površini zob in dlesni in so namenjeni pričvrstitvi drugih bakterij na površini
zob. Pritrditev mikrobnih celic na imobilizirane bakterije imenujem koadhezija, vezavo
bakterij v suspenziji pa koagregacija. Zgoraj opisane interakcije interakcije omogočijo razvoj
zobnega plaka. Prvotno bakterije Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus
oralis in Streptococcus sanguinis veţejo na komplementarne receptorje na prevleki zobne
površine. Pozni kolonizatorji, kot so na primer Fucobacterium nucleatum, Prevotella
denticola, Aggregatibacter actinomycetescomitans in Porphyromonas gingivalis se nato
vključijo v biofilm preko koagregacije z vezavo na predhodno vezane bakterije. Pomembno
5
pri tem je, da sevi bakterij lahko interacirajo le s posameznimi ali mnogimi,genetsko
različnimi bakterijami.(Kolenbrander idr., 2010).
Zobna površina predstavlja substrat, ki omogoča sledenje in karakterizacijo zgodnjih vrst
zobnega plaka in določanje večvrstnih skupnosti. Sklenino bakterije redko kolonizirajo v
prvih osmih urah po čiščenju, v tem času pogosto zasledimo skupnosti vrst iz rodov
aktinomicet, streptokokov in velionela.
Slika 1: Shematski prikaz bakterij, ki oblikujejo arhitekturo zobnega plaka v ustni
votlini(povzeto po Kolenbrander idr., 2010)
Začetni kolonizatorji izkoristijo unikatne karakteristike, ki omogočajo oblikovanje zobnega
plaka. Predstavljajo temelje za ponovno rast biofilma po vsakem čiščenju zob in ustne votline.
Ker sevi Fusobacterium nucleatum koagregirajo z začetnimi, zgodnjimi in poznimi
kolonizatorji, predstavljajo tako imenovani most znotraj biofilma, povezavo med sevi bakterij
v biofilmu. Bakterije pa znotraj biofilma tudi komunicirajo, ena izmed bolje opisanih je
signalna molekula zaznavanja celične gostote, molekula AI2, ki ima osrednjo vlogo pri
signaliziranju med vrstami in je pomemben del razvoja biofilma(slika 2) (Kolenbrander idr.,
2010).
6
Slika 2: Model vpliva molekule AI2 na tvorbo zobnega plaka (povzeto po Kolenbrander idr.,
2010)
Primarni kolonizatorji, streptokoki in aktinomicete (slika 2), se odzivajo na najniţjo
koncentracijo AI2 (pod 100 pM), da uskladijo rast zgodnjega biofilmaPrvotno vezanim
bakterijam na ustno sluznico, ki prekriva sklenino, se pridruţijo sevi iz rodu veilonela (2.
stopnja). Ko se masa začetnikov zaradi njihove celične delitve poveča, se zveča koncentracija
AI2, kar izboljša komunikacijo s prehodnimi bakterijskimi vrstami, kot so fusobacteria (3.
stopnja). Ko je koncentracija AI2 v zobnem plaku najvišja (4. stopnja), se lahko razrastejo
tudi patogeni(Kolenbrander idr., 2010).
Oralni mikroorganizmi, ki se ne morejo pričvrstiti na površino, potujejo skupaj s slino iz ust
navzdol po prebavnem traktu. Ravno zaradi tegavelika večina oralnih bakterij sintetizira
proteine in kemične agense, ki jim omogočijo pritrjevanje na trdne površine, prekrite z ustno
sluznico, kot so zobje in epitelno tkivo. Pozni kolonizerji pa izkoriščajo koagregacijo z
drugimi bakterijami, torej sintetizirajo molekule, ki jim omogočajo specifičen kontakt z
genetsko raznolikimi mikroorganizmi. Koagregacija ali koadhezija bakterij je posledica
K
on
ce
nt
ra
cij
a
AI
2
(p
M
)
Vzajemnost in
začetna
bakterijska rast
(1. in 2. stopnja)
Prehodna
bakterijska rast
(3. stopnja)
Razrast
patogenih
bakterij
(4. stopnja)
Začetniki Patogeni
Ovojnica sline Zobna površina
2. stopnja
1.stopnja Tok
Tok
Tok
Tok
3. stopnja
4. stopnja
7
specifične interakcije med genetsko različnimi celicami, na primer med oralno bakterijo
Capnocytophaga gingivalis in Actinomyces israelii. Odtod izhaja dejstvo, da sta tako kohezija
kot tudi koagregacija pomembna mehanizma za rast in stabilnost večvrstnega
biofilma(Kolenbrander idr., 2010).
Ščetkanje in nitkanje zob odstrani večino mikrobov zobnega plaka, lokalna koncentracija AI2
je za tiste, ki ostanejo, izrazito zmanjšana,potem pa se proces vrne v 1. stopnjo, ko začetniki
spet prevladujejo. Prva in druga stopnja predstavljata stanje zdravja, ki ga z rutino in dosledno
ustno higieno lahko vzdrţujemo. Če se redna ustna higiena ne izvaja, pride do sestave
skupnosti, prikazane v stopnji 3 in 4, ki izzovejo vnetje dlesni, to pa lahko vodi do nastanka
parodontoze (Kolenbrander idr., 2010).
2.3 Spremembe v mikrobni sestavi oralnega biofilma
Spremembe mikrobne sestave supragingivalnega biofilma pogosto povzročijo streptokoki, ki
fermentirajo ogljikove hidrate z nizko molekulsko maso do kislin, kot so acetat, format in
laktat. Velik pritok sline sicer vzdrţuje vrednost pH zobne površine nad 6.0, med uţivanjem
hrane in pijače pa postane koncentracija ogljikovih hidratov z nizko molekulsko maso visoka,
ko zaradi intenzivnega bakterijskega metabolizma lokalni pH pade do 5. To je kritična
vrednost, pri kateri pride do raztapljanja sklenine, kar vodi v karies oziroma zobno gnilobo.
Ko so prehranski ogljikovi hidrati izčrpani, pH naraste in preneha raztapljanje sklenine
(Kolenbrander idr., 2010).
V subgingivalnem biofilmu pod dlesnijo gingivalna tekočina pronica do površine korenin
zoba in tvori tekočo fazo, ki je po svoji sestavi podobna serumu. Drugačna je tudi sestava
mikroflore, saj je raznolikost vrst zelo velika.Nekatere izmed teh anaerobnih bakterij štejejo
med parodontopatogene, na primer Porphyromonas gingivalis, ki povzročajo parodontozo. Te
bakterije zavrejo gostiteljev obrambni sistem inzvečajo vnetje tkiv. Pri zdravih posameznikih
prevladujejo zgodnji kolonizerji, med tem ko so parodonto-patogeni prisotni v relativno
majhnem številu. Slaba ustna higiena spremeni okolje in spodbuja povečano biomaso
parodontopatogenov, kar vodi v odstopanje dlesni ter izpadanje zob (Kolenbrander idr.,
2010).
8
Slika 3 predstavlja konfokalni posnetek vzajemnih skupnosti Fusobacterium nucleatum
(rdeče), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (zeleno) in Veillonella sp. (modro), ki so
oblikovane kot večvrstna omreţja, zrasla v slini, v 18 urah. Razviden je intimen znotrajvrstni
celični kontakt. Bakterijske celice so obarvane z vrstno-specifičnim imunoglobulinom G,
konjugiranim s fluorom (Kolenbrander idr., 2010).
Slika 3: Tvorba biofilma iz treh oralnih bakterij.Posnetek pridobljen s konfokalno
mikroskopijo(povzeto po Kolenbrander idr., 2010)
2.4 Zobna gniloba
Karies ali zobna gniloba je ena najbolj razširjenih kroničnih bolezni na svetu. Posamezniki so
vse ţivljenje dovzetni za to bolezen. Je primarni vzrok bolečin v ustih in lahko vodi v izgubo
zob. V zgodnjih fazah ga lahko zaustavimo in spremenimo, vendar zaradi neustrezne nege
pogosto napreduje in zob popolnoma uniči. Karies se oblikuje skozi časpo zapleteni
interakciji med bakterijami, ki proizvajajo kislino, fermentirajočimi ogljikovimi hidrati in
številnimi dejavniki gostitelja, kot so zobje in slina. Pojavlja se tako na zobni kroni kot na
korenini zoba, razvije pa se lahko ţe v zgodnjem otroštvu kot agresivna zobna gniloba
mlečnih zob pri dojenčkih in malčkih. Znaki demineralizacije so vidni na trdnih zobnih tkivih,
sama bolezen pa se začne na površini bakerijskega biofilma oziroma zobnega plaka, ki
pokriva površino zob. Zelo zgodnje spremembe sklenine s tradicionalnimi kliničnimi
tehnikami in radiografičnimi metodami ni mogoče zaznati. Luknja v zobu je nadaljevanje tega
procesa in predstavlja napredovanje bolezni. Demineralizacijo lahko v zgodnjih stopnjah
zaustavimo z vnosom kalcija, fosfata in fluorida. Zadnji deluje kot katalizator v difuziji
kalcija in fosfata v zob, kar povzroči remineralizacijo kristalnih struktur v leziji.
Napredovanje, zaustavitev in sprememba zobne gnilobe je odvisna od ravnoteţja med
omenjenima procesoma. Kariozne lezije se razvijejo, kjer oralni biofilmi ostanejo in zorijo na
9
zobeh daljše obdobje. Zobno gnilobo na sklenini najprej opazimo kot lezije belih pik oziroma
majhnih območij podpovršinske demineralizacije pod zobnim plakom. Karies na površini
korenin je podoben tistemu na sklenini, vendar pri njem za razliko lahko pride do zmehčanja
površine, kar bakterijam v zgodnji fazi razvoja omogoča globlji prodor v tkivo. Diagnoza
kariesa poteka kot vizualni pregled zobnih površin. Mednarodni trend v obvladovanju zobne
gnilobe se oddaljuje od kirurškega modela in se pribliţuje k pristopu preprečevanja, kar
pomeni nadzor samega začetka in napredovanja procesa v času posameznikovega ţivljenja.
Sami lahko za oskrbo poskrbimo z uporabo fluoridne zobne paste(Selwitz, Ismail in Pitts ,
2007).
Tveganje za razvoj kariesa vključuje fizične, biološke, okoljske, vedenjske dejavnikein
dejavnike, vezane na ţivljenjski slog. Med zadnje štejemo visok odstotek kariogenih bakterij,
nezadostno izpostavljenost fluoridu in dotok sline, slabo ustno higieno, neprimerne metode
hranjenja dojenčkov in revščino. Pomanjkanje sline povzroča katastrofalne posledice, kot je
hitro napredujoči karies, ki prizadene več področij v ustni votlini. Pomembno je tudi, da
zobozdravniki ozaveščajo tveganja za nastanek kariesa (Selwitz, Ismail in Pitts, 2007).
3.Teorija temeljnega kamna
V arhitekturi je »keystone« ali temeljni kamen osrednji podporni kamen na vrhu oboka
(Hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012).Predstavlja zadnji del konstrukcije in drţi vse
kamne v pravilnem poloţaju, kar oboku omogoča nositi teţo(Webster, 2007).Izraz
seuporablja tudi za označevanje bioloških vrst, ki imajo nesorazmerno velike učinke na
skupnosti glede na njihovo številnost, o katerih menijo, da tvorijo temelj za
strukturoskupnosti ekosistema. Koncept obravnava moţnost prevlade ene od vrst
mikroorganizmov v mikrobni zdruţbi in s tem porušitev, disbiozo ekosistema v biofilmu.
Identifikacija takšnih vrstomogoči boljši vpogled v dinamiko mikrobnih zdruţbin njihovo
prepletanje z gostiteljem ali okoljem. Pomembno je pojasniti mehanizme, ki vzdrţujejo ali
motijo homeostazo, kar vodi v disbiozo. Ključni mikroorganizem, ki podpira in stabilizira
disbiotične mikrooganizme, povezane z boleznijo, poimenujemo »keystone pathogen« ali
temeljni patogen. Ti za razliko od dominantnih patogenov sproţijo vnetje tudi, ko
tvorijomanjšinski deleţ mikrobne druţbe, a hkrati zatirajo razrast primarnih kolonizatorjev.
10
Njihova identifikacija omogoči terapije proti omenjenem naboru bakterij, ki sproţijo in
promovirajo disbiozo(Hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012).
Na sliki 4 je predstavljen nastanek disbioze ob prisotnosti ključnega patogena. Kljub nizkemu
številu bakterijPorphyromonas gingivalis v ustni votlini lahko ta bakterija vodi v disbiozo, to
pa lahko vodi do vnetja dlesni oziroma parodontoze. Nadalje v primeru, ko vnetje povzroči
prevladujoči patogen, na primer Salmonella enterica, sevi te bakterije izkoristijo nastalo
stanje in vplivajo na zgradbo mikrobne zdruţbe komenzalov v črevesju. S. typhimuriumlahko
postane prevladujoča bakterija inspodbuja vnetje(Hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012).
Slika 4: Modela poteka infekcije. (A) Infekcija s P. gingivalis in (B) infekcija z bakterijo S.
typhimurium(povzeto po Hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012)
3.1 Hipoteza temeljnega patogena na primeru parodontoze
Parodontalna bolezen je vnetje, ki prizadene parodont in hkrati poveča pacientovo tveganje za
razvoj ateroskleroze, sladkorne bolezni in revmatoidni artritis. Čeprav imajo ključno vlogo pri
nastanku in razvoju te bolezni mikroorganizmi, je primarno gostiteljev vnetni odgovor tisti, ki
Porphyromonas
gingivalis
»ključni patogen«
Normalno stanje
mikroorganizmov v
ustih
Vnetje
Okvarjeno
ubijanje
levkocitov
Disbiotično stanje
mikroorganizmov v
ustih
Od dopolnila
odvisno
vnetje in
izpadanje zob
Normalno stanje
mikroorganizmov v
črevesu
S. typhimurium
Dominantni patogen
Vnetje
Nadvlada S. typhimurium in zmanjšana
raznovrstnost mikroorganizmov
11
poškoduje tkivo. Sestava mikrobne zdruţbe se spremeni ob stanju bolezni, kar lahko
interpretiramo na dva načina. Tolahkorazumemo kot znak, da je v etiologijo parodontitisa
vpletena specifična patogena bakterija.Lahko pa namiguje na to, da je bolezen povzročena z
disbiozo normalne mikrobne zdruţbe v ustni votlini, kar vodi v spremembe v odnosu
gostitelja in mikroorganizmado vnetja. Pri identifikaciji specifičnih parodontalnih
patogenovso tri vrste (Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola in Tannerella
forythia), ki sestavljajo tako imenovani rdeči kompleks in so pogosto izolirane skupaj ter
močno povezane z obolelimi področji ust(Hajishengallis, Darveau in Curtis, 2012).
Hipoteza, da patogeni spremenijo normalno mikrobno komenzalno floro v ustih, je podprta
tudi z dejstvi, da bakterije kot A. actinomcetemcomitans in P. gingivalissintetizirajo
imunosupresivne molekule. Ti bakteriji sta razvili napredne strategije za izognitev
komponentam gostiteljevega obrambnega mehanizma. Bakterija oslabi prirojeno odpornost
tako, da spremeni rast in razvoj celotnega biofilma. Posledično bi ti bakteriji lahko bili
temeljna patogenaparodontalnega biofilma, ki izzove bolezen(Hajishengallis, Darveau in
Curtis, 2012).
4. Parodontoza
Parodontoza ali parodontalna bolezen je kronična infekcija, pri kateri imajo ključno vlogo
bakterije v ustni votlini. Bolezen prizadene podporne strukture zob, če je nenadzorovana, pa
vodi v rahljanje in izpadanje zob. Prepoznavamo jo kot povečano globino sulkusa dlesni,
nastanku parodontalnih ţepkov in izgubo parodontalne pritrditve na alveolarno kost.
Parodontitis je pogosto povezan z vnetjem dlesni, ki lahko vključuje spontano krvavenje tkiv
dlesni. Diagnoza bolezni vključuje klinični pregled s sondo oziroma pregled mehkega tkiva
dlesni okoli zob. Drugi postopek pa je tako imenovana radiografična preiskava, torej pregled
pacientovih rentgenskih posnetkov, katerim določijo količino izgubljene kosti okrog zob. V
šestdesetih letih je parodontoza veljala za počasi napredujočo kronično bolezen, ki jo je teţko
zatreti. Tudi mladostni parodontitis, ena izmed oblik parodontalne bolezni, je danes široko
razširjen v populaciji. Stalni zobje, zlasti sekalci in prvi stalni kočniki, ki zrastejo v otroštvu,
lahko izpadejo v dobi zgodnje odraslosti. Diferenciacija kliničnih mikrobnih podskupin
znotraj parodontoze je privedla do opisa in prepoznave različnih bakterij za parodontalno
bolezen. Za obliko hitro uničujočega parodontitisa pri odraslih je značilna bakterija
Aggregatibacter actinomycetemcomitans(Tanner, 2014).
12
V Sloveniji je kronični parodontitis pogost, saj bolezen pri 50 letih prizadene ţe več kot 40 %
populacije(Obradović, Gašperšič, Seme, Maček in Butala, 2014).
4.1 Razvrstitev parodontalnih bolezni
Sistem razvrščanja parodontalnih bolezni in stanj iz leta 1999 navaja sedem večjih kategorij,
od katerih se kategorije 2—6 imenujejo destruktivne parodontalne bolezni, ker je njihova
škoda nepovrnljiva (Armitage, 2004).Nekaj primerov iz sedmih kategorij bolezni je
predstavljenih na sliki 5.
Slika 5: Kategorije parodontalne bolezni(povzeto po Armitage, 2004)
Slika 5 prikazuje (A) kronični parodontitis, ki je povezan s slabo ustno higieno: vnetje,
poškodbe dlesni in vpliv bolezni na zasidranost zob v dlesni. To je pogosta bolezen ustne
votline, ki jo sestavlja kronično vnetje parodontalnih tkiv. Povzroči ga kopičenje obilne
količine zobnega plaka (Armitage G. C., 1999). Simptomi vključujejo rdečico ali krvavenje
dlesni ob ščetkanju ali uporabi zobne nitke, otekanje dlesni, slab zadah in okus po kovinah.
Vnetje je pogosto neboleče, vendar krvavenja kljub temu ne gre zanemariti, saj bolezen lahko
napreduje. Pomemben dejavnik tveganja predstavlja tudi kajenje, zato zobozdravniki glede
13
zdravljenja bolezni poleg dobre ustne higiene priporočajo tudi prenehanje kajenja (Heitz-
Mayfield idr., 2003). (B) Napredovani lokalizirani agresivni parodontitis (LAP), poškodbe
dlesni lokalizirane. (C) Generalizirani agresivni parodontitis (GAP), večja območja vnetja in
bakterijskega plaka in zobnega kamna, zvečana izguba zobne kosti je opaţena pri vseh zobeh.
Agresivni parodontitis se pojavlja manj pogosto in splošno prizadene mlajše paciente kot
kronični parodontitis. LAP in GAP se ne razlikujeta zgolj v obsegu, temveč tudi v etiologiji in
patogenezi. Zdravljenje vključuje mehanično terapijo, zdruţeno z antibiotiki (Albandar in
Tinoco, 2002). (D) Parodontitis v povezavi s sistemsko boleznijo, oseba z Downovim
sindromom, območja močnih vnetij dlesni. (E) Nekrotizirajoči ulcerozni gingivitis, prisotne
boleče lezije na dlesnih. Ponavadi nenaden nastop te bolezni, zato diagnozi pogosto dodajajo
izraz akuten (Munksgaard, 2008). (F) Nekrotizirajoči ulcerozni gingivitis pri zdravem
posamezniku. (G) Parodontalni absces so lokalizirani gnojni odseki dlesni (Hupp, Ellis in
Tucker, 2008).
5.Bakterija Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Znanstvena klasifikacija (Nørskov-Lauritsen in Killian, 2006) bakterije A.
actinomycetemcomitans (slika 6):
Kraljestvo: Bakterije
Deblo: Proteobakterije
Razred: Gamaproteobakterije
Red: Pasteurellales
Druţina: Pasteurellaceae
Rod: Aggregatibacter
Vrsta: actinomycetemcomitans
Slika 6: Posnetek bakterij A.
actinomycetemcomitans, pridobljen
z elektronsko mikroskopijo (povzeto
po Dennis Kunkel Microscopy, 2008)
14
Aggregatbacter actinomcetemcomitans je po Gramu-negativna, negibljiva, fakultativno
anaerobna, paličasta bakterija. Pogosto jo povezujemo z lokaliziranim agresivnim
parodontitisom, čeprav jo povezujejo tudi z nekaterimi okuţbami srca in oţilja. Ob primarni
izolaciji iz tkiva imajo kolonije grobo teksturo zvezdaste oblike(Nørskov-Lauritsen in Killian,
2006). Ob naknadnih sub-kultivacijah kultura postane gladke okrogle oblike.
Bakterija nosigenetske zapise za virulentne dejavnike, ki ji omogočajo, da se ogne
imunskemu odzivu gostitelja in poškoduje celice obzobnega tkiva. Med virulentne dejavnike
te bakterije uvrščamo tudi levkotoksine, citotoksin Cdt, lipopolisaharide, površinske antigene,
ki omogočajo kolonizacijo, in determinante odpornosti proti antibiotikom(Africa, Nel in
Stemmet, 2014).Levkotoksin povzroči razpad človeških levkocitov in eritrocitov, medtem ko
citotoksin CdtB ustavi celični cikel številnih evkariontskih celic, kar vodi v celično smrt ali
apoptozo (Obradović idr., 2014).Med sevi te bakterije obstajajo razlike v nivoju sinteze
določenega virulentnega dejavnika, npr. sev JP2 je v primerjavi z drugimi sevi zmoţen
proizvesti znatno višje količine levkotoksina inima močan vpliv na nastanek agresivne oblike
parodontitisa(Äberg, Haubek, Kwamin, Johansson in Claesson, 2014).
Obstaja vsaj 6 serotipov (a–f) te bakterije. Serotipi se genotipsko razlikujejo zlasti v
prisotnosti številnih otokov patogenosti, ki nosijo zapis za dejavnike virulence, v gostitelju pa
se običajno stabilizira le po en serotip. Razporeditev določenih serotipov po svetu je različna.
Serotip b je prisoten zlasti v ZDA, pri bolnikih z agresivnim parodontitisom, serotip cpa je
razširjen na Kitajskem, Japonskem, v Koreji in Turčiji. Na Finskem, Švedskem in Danskem
so enakomerno razširjeni serotipi a, b in c. Razporeditev glede na zemljepisni poloţaj je
odvisna od zmoţnosti prilagoditve posameznih sevov bakterije na genetske raznolikosti med
populacijami ljudi (Obradović idr., 2014).
Do zdaj je ustna votlina ljudi edini poznani naravni habitat bakterije A.
actinomycetemcomitans, ki poleg zobnih oblog kolonizira tudi druge predele ustne votline in
je lahko del normalne ustne flore. Zaradi dejavnikov virulence, ki povzročajo razvoj nekaterih
oblik parodontalne bolezni, je ozdravitev parodontoze odvisna od odstranitve sevov bakterije
A. actinomycetemcomitans, ki nosijo zapis za virulentne dejavnike. Najuspešnejši postopek
zdravljenja predstavlja kombinacija mehanske odstranitve zobnih oblog in antibiotika
amoksicilina, metronidazola ali antibiotikov iz skupine tetracilinov. Do zdaj poznamo 14
celotnih genomov A. actinomycetemcomitans,iz katerih je razvidno, da je organizacija in
15
zastopanost genov v genomih zelo različna, kar nakazuje na visoko plastičnost genoma te
bakterije(Obradović idr., 2014).
Človeško telo predstavlja za mikroorganizme okolje z zelo ugodnimi pogoji, kot so stabilna
temperatura, zaloga hrane in dostop do kisika. V resnici pa je ţivljenje patogenov, npr.
bakterije A. actinomycetemcomitans,zmoţnost njihovega preţivetja in razmnoţevanja znotraj
gostitelja zelo stresno. Imunski sistem in okolje,v katerem bakterije ţivijo in tudi preţivijo,
predstavljajo omejitve za rast mikroorganizmov. Obrambni sistem se je skozi milijone let
razvil, da gostitelja obvaruje pred vdorom tujih organizmov, predvsem patogenov. Prvo
obrambo gostitelja ne predstavlja imunski sistem, temveč fizične in kemične ovire gostitelja
in komenzalna mikrobna flora. Zunanja plast koţe sestavlja suha plast keratiniziranih mrtvih
celic, skozi katere ni lahko prodreti. Poleg tega komenzali na površinah človeškega telesa
preprečujejo pritrditev patogenov. Druga ovira, ki preprečuje bakterijsko invazijo, pa je
ţelodčni pH, ki je tako ekstremen, da večina ţivljenjskih oblik z njim ni kompatibilna.
Posledično morajo bakterije razviti specialne prilagoditve, da se prilagodijo na te razmere v
okolju. Poseben primer je črevo, ki patogenom predstavlja drugačen izziv. Hrane je obilno,
vendar tekmovalnost med več kot 3000 vrstami predstavlja velik stresni faktor. Vrste pa imajo
druga od druge tudi koristi. Tudi gostitelj v tej zgodbi ni pasivni opazovalec, njegova vloga je
pomembna, saj ima posameznik unikatno sestavo mikrobne skupnosti. Ko mikroorganizmom
uspe napasti gostiteljevo tkivo in se ustaliti na mestu infekcije, so stresni pogoji še vedno
prisotni. Prvi cilj je pridobiti dovolj hranil, ki jih je za potrebe gostiteljevih celic dovolj,
vendar so omejene na evkariontske celice. Dostopnost ţeleza je za mikroorganizme zelo
omejena in povzroča velik stres. Največjo groţnjo pa predstavlja imunski sistem s fagociti in
antimikrobni peptidi, ki bakterije ubijejo v sekundi. Gostitelj pa lahko aktivira tudi
prilagodljiv imunski sistem ali popolno mobilizacijo antimikrobnega oroţja. Dejstvo je, da se
sčasoma bakterijam vedno uspe prilagoditi na ekstremno okolje, in prav stres je tisti
evolucijski pritisk, ki poganja prilagoditev. Najboljši primer teh je adaptacija na zdravila.
Odpornost mikroorganizmov na antibiotike ni stvar prihodnosti, temveč se dogaja v tem
trenutku in predstavlja naravni fenomen. Neustrezna uporaba antimikrobnih zdravil, slabo
preprečevanje okuţb je naklonjena selekciji odpornih sevov in njihovem širjenju(Van Strijp,
2014).
Bakterija A. actinomycetemcomitans kot modelni patogen omogoča raziskave parodontoze.
Kako pogosto naseljuje subgingivalni biofilm pacientov s kroničnim parodontitisom v
Sloveniji, pa še ni raziskano. Obradović idr. (2014)so s presečno raziskavo ugotavljali
16
pogostost naseljevanja subgingivalnega biofilma A. actinomycetemcomitans in prisotnosti
posameznih serotipov te bakterije, izolirane pri slovenskih bolnikih s kroničnim
parodontitisom. Raziskali so tudi, kako pogosto sta prisotna virulentna dejavnika levkotoksin
in citotoksin Cdt. 30 vključenim bolnikom, napotenim na zdravljenje parodontoze v UKC,so
diagnosticiralizmerni do napredovalni parodontitis. Ugotovili so, da bakterija A.
actinomycetemcomitansnaseljuje subgingivalni zobni plak sedemnajstih bolnikov. Analiza
pomnoţkov genomske DNA je pokazala, da 60% izolatov predstavlja serotip c, medtem ko so
preostale dejavnike virulence (ltxA, flo-1, cdtA, cdtB in cdtC) odkrili pri vseh izolatih. Med
izolati niso identificirali seva JP2, vendar v skladu z dosedanjimi ugotovitvami menijo, da
med posamezniki obstajajo druge genske specifičnosti sevov bakterije A.
actinomycetemcomitans.Kljub pogostosti kroničnega parodontitisa v Sloveniji je sestava
bakterijskega biofilma slabo poznana. Pri vseh bakterijskih izolatihA. actinomycetemcomitans
so ugotovili, da imajo izolati zapis za vse testirane virulentne dejavnike. To nakazuje, da so
sevi A. actinomycetemcomitans pri slovenskih bolnikih s kroninim parodontitisom visoko
virulentni. Identifikacija krajše različice gena za katalitsko podenoto toksina Cdt (cdtB),
najdena pri dveh izolatih, nakazuje na specifike sevov A. actinomycetemcomitans. Krajša
različica naj bi imela spremenjeno aktivnost glede na divji tip toksina, kar lahko vpliva na
virulentnost izolatov(Obradović idr., 2014).
6. Toksin Cdt
Toksikologija je veda, ki se ukvarja s preučevanjem strupov, identifikacijo zdravil, učinkovin
in drugih snovi, ki jim je bila oseba izpostavljena iz različnih razlogov. Poleg tega
toksikologija preučuje tudi škodljive učinke strupov in zdravil na telo (Bertino A. J., 2008).
Toksin Cdt ali angleško »cytolethal distending toxin« uvrščamo med toksine AB. Toksine Cdt
sintetizirajo po Gramu-negativne bakterije, kot so A.actinomycetemcomitans, Campylobacter
jejuni Escherichia coli, Haeophilius ducreyi,Helicobacter hepaticus, Providencia
alcalifaciens, Shigella boydii in Shigella dysenteriae. Podenota A, CdtB, je encim s
povprečno molekulsko maso 29 kDa, medtem ko je komponenta B sestavljena iz dveh
podenot, CdtA (23 kDa) in CdtC (21 kDa), ki kooperativno sodelujeta pri vezavi holotoksina
CdtABC na površino tarčnih celic (slika 7).CdtC med endocitozo olajša vstop CdtB v celico.
CdtB si utre pot proti jedru z degradacijo, povezano z endoplazmatskim retikulumom (ERAD)
ki ji sledi translokacija skozi jedrno membrano. V jedru CdtB povzroči lome dvojne vijačnice
17
DNA tarčnih celic, kar vodi v inhibicijo celičnega cikla in prenehanje rasti ter smrt
celice(DiRienzo, 2014).
Slika 7: Struktura holotoksina Cdt, določena z rentgensko kristalografijo, bakterije
Haemophillus ducreyi. Podenota CdtA modro, CdtC rdeče in CdtB zeleno (povzeto poNešić,
Hsu in Stebbins, 2004)
6.1 Sinteza in sekrecija toksina Cdt
Podenote toksina Cdt se sestavijo znotraj celice (periplazmatski prostor) in se izločijo kot
biološko aktiven holotoksin iz celice (slika 8). Hidrofobna signalna zaporedja na posamezni
podenoti usmerijo podente skozi plazmalemo.Prekurzorski proteini so v periplazmi
procesirani s signal peptidazo I in II. AaCdtA vsebuje motiv za vezavo lipidov (lipobox),
LVAC, blizu mesta cepitve na amino-terminalnem koncu proteina. Korak cepitve spusti
lipoCdtA iz celične membrane in tako se hidrofobna podenota zasidra v notranji sloj zunanje
membrane. Vsepodenote se v holotoksin sestavijo na zunanji membrani. Nastali hidrofilni
holotoksin se kopiči v okolju zunaj bakterije, dokler ne prepozna specifičnega receptorja na
površini tarčne celice(DiRienzo, 2014).
18
Slika 8: Model sinteze in sekrecije AaCdt pri bakteriji E. coli(povzeto po DiRienzo, 2014)
6.2 Vstop aktivne komponente CdtB v jedro
Tako kot pri drugih toksinih AB je veriga A tista, ki holotoksinu daje biološko aktivnost in
mora biti transportirana skozi plazmalemo v tarčno celico. Predvsem podenota CdtA je
pomembna za vezavo holotoksina na receptor evkariontske celice (slika 9). Poleg prepoznave
specifičnega receptorja je drugi pomemben element vezave Cdt na celico vpletenost območja
na plazmalemi, poznanega kot lipidni raft. Lipidni rafti so samoorganizirani deli lipidnega
dvosloja, bogati s sfingolipidi,holesterolom in proteini,in so namenjeni specifičnim biološkim
funkcijam. Po vezavi na receptor, lociran na lipidnem raftu, ostane podenota CdtA na
površini. Nadalje z endocitozo vstopita podenoti B in C, ki z endosomi dostavijo kompleks v
Golgijev aparat. Podenota CdtB se s pomočjo retrogradnega transporta premakne iz
19
Golgijevega aparata v endoplazmatski retikulum. CdtB najverjetneje stopi v jedro skozi
komplekst jedrnih por in v jedru deluje genotoksično (DiRienzo, 2014).
Slika 9: Model razvrščanja toksina Cdt v evkariontski celici(povzeto po DiRienzo, 2014)
6.3 Apoptoza, povzročena s Cdt
Apoptoza je programirana celična smrt. Raznoliki dejavniki in draţljaji lahko sproţijo
signalne poti, ki vodijo v apoptozo celic po intrinzični ali ekstrinzični poti. Ekstrinzična pot
vključuje aktivacijo receptorjev smrti, medtem ko intrinzično ali mitohondrijsko pot lahko
aktivira več draţljajev, ki izzovejo celični stres. V nekaterih primerih lahko ekstrinzično pot
aktivira določena učinkovina, ki poškoduje DNA. Bakterijski toksini, kot tudi Cdt, lahko med
infekcijosproţijo apoptozo celic gostitelja. Protein p53 nadzoruje celične procese, skupaj z
zaustavitvijo celične rasti pri apoptozi, diferenciaciji in popravljanju DNA. Njegov status je
medključnimi dejavniki, ki določajo občutljivost evkariontskih celic na apoptozo, kar je
kritično za apoptozo, sproţeno –od genotoksina. Toksin Cdt lahko sproţi apoptozo v celicah
zelo različnih tipov. Mednje spadajoneproliferajoče primarne celice fibroblastnega,
endotelnega in hematopoetskega izvora, CD4+ T celice, CD14+ monociti in vzpostavljene
celične linije epitelnih, endotelnih in hematopoetskih rodbin(Jinadasa, Bloom, Weiss in
Duhamel, 2011).
20
7. Test preživelosti producentskih bakterij
Kot ţe zgoraj navedeno, so Obradović idr. (2014) prepoznali izolata s nukleotidnim zapisom
za krajšo različico genotoksina CdtB v primerjavi z zapisom, najdenem pri divjem tipu.
Derivat je za 219 nukleotidov krajši od nukleotidnega zapisa divjega tipa. V praktičnem delu
naloge smo analizirali preţivelost bakterij Escherichia coli z zapisom za posamezno od
različic CdtB. Uporabili smo plazmidni konstrukt, ki ima gen za različico CdtB po uravnavi
promotorja, ki je šibko aktiven med normalno rastjo bakterij. Hoteli smo preveriti, ali toksina
različno vplivata na preţivetje producentske bakterije. Glede na to, da se je derivat toksina
ohranil kar pri dveh izolatih, predvidevamo, da je pomemben za patogenezo. Posledično
menimo, da je krajša različica toksina še vedno in celo bolj aktivna od divjega tipa toksina.
Hipotetično tako lahko predvidimo, da derivat divjega tipa toksina Cdt bakterije A.
actinomycetemcomitansprepreči rast producentske bakterije E. coli.
7.1 V delu uporabljene metode
V delu uporabljeni bakterijski sev in plazmidi
Pri delu smo uporabili sev BL 21 (DE3) bakterije E. coli z genotipom F-ompT gal dcm lon
hsdSB(rB- mB
-) λ(DE3). Sev ima v gen int vstavljen fragment DNA, z zapisom za RNA-
polimerazo faga T7, s promotorjem lacUV5. V tem sevu se konstitutivno in šibko izraţa
polimeraza T7. Z dodatkom IPTG lahko dodatno sproţimo prepisovanje RNA-polimeraze
T7. Tako se izrazijo rekombinantni proteini, ki so zapisani na vektorjih pod kontrolo
promotorja T7. Sev ima okvarjena tudi gena lon in ompT, z zapisom za proteazi (Mizusawa in
Ward, 1982), kar nam omogoči stabilnost sintetiziranega rekombinantnega proteina. Pogosto
se v sev BL 21 (DE3) z vstavljenim ekspresijskim plazmidom transformira tudi plazmid
pLysS (odpornost proti kloramfenikolu), ki omogoči zavrtje bazalne ekspresije promotorja T7
s produkcijo lizocima T7, naravnega inhibitorja T7 RNA polimeraze (PortEco, 2011). V
študiji smo kot ekspresijski plazmid uporabili pHis, z zapisom za različici toksina CdtB. V
sevu brez pLysS se je toksin sintetiziral v nizkih koncentracijah, a je bila njegova sinteza
zavrta v sevu s plazmidom pLysS.
21
Bakterijska gojišča
Tekoče gojišče LB pripravimo tako, da enemulitru destilirane vode dodamo 10 g kazeinskega
hidrolizata, 10 g NaCl in 5 g kvasnega ekstrakta. Sledi 15-minutna sterilizacija v avtoklavu
pri 121°C.
Tekoče gojišče LBApCm, ki ga pripravimo tako kot osnovno tekoče gojišče LB. Ohlajenemu
gojišču po avtoklaviranju dodamo 100 µg/ml ampicilina (LBAp) in 34 µg/ml kloramfenikola
(LBCm).
Trdno gojišče LB (Luria-Bertani) pripravimo tako, da zmesi za pripravo tekočega gojišča
dodamo 15 g agarja na en liter gojišča. Sledi avtoklaviranje in hlajenje ter vlivanje v sterilne
petrijevke.
Trdno gojišče LBApCm, ki ga pripravimo tako kot osnovno trdno gojišče LB. Ohlajenemu
gojišču (50°C) po avtoklaviranju dodamo 100 µg/ml ampicilina (LBAp) in 34 µg/ml
kloramfenikola (LBCm). Gojišče aseptično razlijemo v sterilne petrijevke.
Gojišče SOB (ang. »Super Optimal Broth«) vsebuje 20 g triptona, 5 g kvasnega ekstrakta, 0,5
g NaCl, 10 mL 250 mM KCl in 5 mL 2 M MgCl.
7.2Priprava kompetentnih celic in transformacija
Bakterijske celice Bl21 (DE3),zrasle pri 37°C, in s 180 obrati na minuto, smo čez
nočprecepili (1: 100, v/v) v sveţe, 50-mililitrsko gojišče LB. Bakterijsko rast smo spremljali
do optične gostote 0,4 izmerjene pri 600 nm. Celice smo nato posedli s centrifugiranjem pri
4000xg v ohlajeni centrifugi (Eppendorf) na 4°C. Vsi nadaljnji koraki priprave kompetentnih
celic ali transformacije so potekali na ledu. Celice smo dvakrat resuspendirali v 50 mM
CaCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 7,0), 10-odstotni (w/v) glicerol, da smo pripravili kompetentne
celice. Celice smo takoj uporabili za transformacijo plazmida pHis z genom za različico
toksina CdtB brez lastnega promotorja pod uravnavo promotorja T7 oziroma, kjer navedeno,
hkrati še s plazmidom pLysS. Transformacijo smo izvedli s toplotnim šokom. 50 µl
kompetentnim celic smo dodali 1 µl plazmidne DNA in reakcijsko zmes inkubirali na ledu 30
minut. Nato smo celice izpostavili 42°C za 90 s in jih nato hranili 3 minute na ledu.
Transformantam smo nato dodali 400 µl gojišča LB in jih inkubirali s stresanjem pri 37°C za
50 minut. Transformante smo nacepili na agarne plošče z dodanim ampicilinom (100 µg/ml) v
primeru celic z pHisCdtB (krajši ali daljši) ter na agarnih ploščah Ap (100 µg/ml), Cm (50
µg/ml) v primeru celic s plazmidoma pHisCdtB in pLysS. Transformante smo dokumentirali s
fotoaparatom (Nikon).
22
7.4 Rezultati
Rezultati na sliki 10 prikazujejo, da transformante z različico toksina CdtB divjega tipa rastejo
normalno, a v primeru toksina s krajšo razliico CdtB zrastejo le transformante, ki imajo
vstavljen tudi plazmid pLysS, ki zavre sintezo genotoksina. Ti rezultati močno nakazujejo, da
posamezna varianta toksina CdtB različno vpliva na rast producentskih bakterij E. coli. S tem
smo potrdili drugo zastavljeno hipotezo.
Slika 10: Transformante s plazmidnim konstruktom za divji tip (desno) ali njegovo različico
toksina CdtB (levo), (plošči, prikazani spodaj) ali hkrati še s plazmidom pLysS (plošči,
prikazani zgoraj)
Test je bil izveden v dveh ponovitvah, prikazane so reprezentativne slike plošč.
23
8. ZAKLJUČEK IN SKLEPI
V diplomski nalogi sem opisala ustno higienoinv povezavi z neustrezno higienonastajanje
zobnega plaka in zobne gnilobe. Poudarila sem pomenbakterije A. actinomycetemcomitansin
toksina Cdt na razvoj parodontoze. Prikazala sem, kako poteka sinteza in sekrecija toksina
Cdt, korake v procesu zastrupitve, vpliv Cdt na celično smrtin razvoj parodontoze. S tem sem
potrdila hipotezo, da virulentni dejavniki A. actinomycetemcomitans značilno vplivajo na
bolezni v ustni votlini.
Da bi zavrgla ali potrdila drugo zastavljeno hipotezo, sem izvedla test preţivelosti
transformant z zapisom za kratko ali daljšo razliico citotoksina CdtB. Dokaţemo, da dobimo
transformante celic, ki sintetizirajo CdtB divjega tipa, a ne tistih, ki sintetizirajo krajšo
različico toksina. Ta rezultat nakazuje, da je samo produkt gena CdtB, ki je za 219 baznih
parov krajši od gena divjega tipa, toksičen za producentske celice E coli. S tem sem potrdila
drugo zastavljeno hipotezo.
Od odkritja toksina Cdt leta 1987 je razumevanje ekologije bakterijskih vrst, ki toksin
sintetizirajo izjemno naraslo. Hkrati pa se je izboljšala tudi molekularna biologija celične
genotoksičnosti, povzročene s Cdt. Prispevek omenjenega toksina pri začetku in trajanju
infekcije in bolezni pa še vedno ni popolnoma razumljen (Jinadasa, Bloom, Weiss in
Duhamel, 2011). Posledično so študije lastnosti oralnih bakterij in razumevanje biokemije
njihovih produktov pomembne, da bi razumeli biologijo teh bakterij in z njim povezane ustne
bolezni.
24
VIRI IN LITERATURA
Äberg, C. H., Haubek D., Kwamin, D., Johansson, A. in Claesson, R. (2014). Leukotoxic
activity of Aggregatibacter actinomycetemcomitans and periodontal attachment loss. Plos
one, 9 (8), 1—11.
Africa, C., Nel, J. in Stemmet, M. (2014). Anaerobes and bacterial vaginosis in pregnancy;
Virulence factors contributing to vaginal colonsation. International Journal of Environmental
Research and Public Health, 71(7), 6979—7000.
Albandar, J. M. in Tinoco, E. M. (2002). Global epidemiology of periodontal diseases in
children and young persons. Periodontology 2000, 29, 76—153.
Armitage, G. C. (1999). Development of a classification system for periodontal diseases and
conditions. Annals of Periodontology, 4(1), 1—6.
Armitage, G. C. (2004). Periodontal diagnoses and classification of periodontal diseases.
Periodontology 2000, 34, 9—21.
Bertino, A. J. (2008). Forensic Science: Fundamentals and Investigations. Mason: South-
Western Cengage Learning.
Blackwell Munksgaard. (2008).V Lindhe, J., Lang, N.P. in Karring, T. (ur) Clinical
periodontology and implant dentistry. 5, 413—459.
Coker, P., Ploeg, J., Kaasalainen, S. in Fisher, A. (2013). A concept analysis of oral hygiene
care in dependent older adults. Journal of advanced nursing69 (10) 2360—2371.
DiRienzo, J. M. (2014). Uptake and processing of the cytolethal distending toxin by
mammalian cells. Toxins, 6, 3098—3116.
Gašperšič, R. (2009). Oskrba ustne votline pri parodontalnih boleznih in drugih ustnih
boleznih. V Zbornik prispevkov Ustna nega – vloga zdravstvene nege za zdravje ustne
votline(str. 51—57) Ljubljana: Sekcija medicinskih sester v vzgoji in izobraţevanju.
Hajishengallis, G., Darveau, R. P. in Curtis, M. A. (2012). The keystone-pathogen hypothesis.
Nature reviews, 10, 717—725.
25
Heitz-Mayfield, L. J. in drugi. (2003). Clinical course of chronic periodontitis. II. Incidence,
characteristics and time of occurrence of the initial periodontal lesion. Journal of Clinical
Periodontology, 30 (10),8—902.
Hupp, J. R., Ellis, E. in Tucker, M. R. (2008). Contemporary oral and maxillofacial
surgery.Mosby Elsevier, 5, 293.
Jinadasa, R. N., Bloom, S. E., Weiss, R. S. in Duhamel, G. E. (2011). Microbiology, 157,
1851—1875.
Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S. in Jakubovics, N. S. (2010). Oral
multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nature Reviews, 8,
471—480.
Ljaljević, A., Matijević, S., Terzić, N., Andjelić, J. in Mugoša, B. (2012). Značaj odrţavanja
oralne higijene za zdravlje usta i zuba. Vojnosanitetski pregled, 69(1), 16—21.
Nørskov-Lauritsen, N. in Kilian, M. (2006). Reclassification of Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Haemophilus aphrophilus, Haemophilus paraphrophilus and
Haemophilus segnis as Aggregatibacter actinomycetemcomitans gen. nov., comb. nov.,
Aggregatibacter aphrophiluscomb. nov. and Aggregatibacter segnis comb. nov., and emended
description of Aggregatibacter aphrophilus to include V factor-dependend and V factor-
independent isolates. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,
56(9), 46—2135.
Nešić, D., Hsu, Y. in Stebbins C. E. (2004). Assembly and function of a bacterial genotoxin.
Nature, 429, 429—433.
Obradović, D., Gašperšič, R., Seme, K., Maček, P. in Butala, M. (2014). Genotipska
karakterizacija sevov oportunističnega patogena Aggregatibacter actinomycetemcomitans pri
slovenskih bolnikih s kroničnim parodontitisom, preliminarna raziskava. Zobozdravstveni
vestnik, 69 (1/2), 21—27.
Paster, B. J., Olsen, I., Aas, J. A. & Dewhirst, F. E. (2006).The breadth of bacterial diversity
in the human periodontal pocket and other oral sites. Periodontology. 200042, 80—87.
Peterson, S. N., Snesrud, E., Liu, J., Ong, A. C., Kilian, M., Schork, N. J. in Bretz, W. (2013).
The dental plaque Microbiome in health and disease. Plos one, 8(3), 1—10.
26
Peterson, S. N., Meissner, T., Su, A. I., Snesrud, E., Ong, A. C., Schork, N. J. in Bretz W. A.
(2014). Functional expression of dental plaque microbiota.Frontiers in Cellural and Infection
Microbiology, 4, 1—13.
PortEco. (2011). Pridobljeno s: http://www.porteco.org/strains/index.jsp
Selwitz, R. H., Ismail, A. in Pitts, N. B. (2007). Dental caries.Lancet, 368, 51—59.
Tanner, A. C. R. (2014). Anaerobic culture to detect periodontal and caries pathogens.Journal
of Oral Biosciences, 57, 18—26.
Van Strijp J. A. G. (2014). Pathogens under stress. FEMS Microbiology reviews, 38, 1089—
1090.
Webster, M. Keystone. (2007). Dostopno na URL:
https://en.m.wikipedia.org/wiki/Keystone_(architecture) [Povzeto 20.7.2015]