UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA TANJA MURNpefprints.pef.uni-lj.si/3883/1/DIPLOMA_koncna_PDF.pdf · HNO 3 dušikova(V) kislina HCl klorovodikova kislina IS inertni standard

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

TANJA MURN

VPLIV RAZLIČNIH ZDRUŽB TALNIH

MIKROORGANIZMOV NA PRIVZEM ŽIVEGA SREBRA

PRI SONČNICI (Helianthus annuus L.)

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2016

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

DVOPREDMETNI UČITELJ

TANJA MURN

Mentor: PROF. DR. KATARINA VOGEL MIKUŠ

VPLIV RAZLIČNIH ZDRUŽB TALNIH MIKROORGANIZMOV NA

PRIVZEM ŽIVEGA SREBRA PRI SONČNICI (Helianthus annuus L.)

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2016

Murn T. Vpliv različnih združb talnih mikroorganizmov na privzem živega srebra pri sončnici (Helianthus annuus L.). Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2016.

II

Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študija kemije in biologije. Večina poskusov

je bilo izvedenih na Katedri za fiziologijo rastlin Oddelka za biologijo Biotehniške

fakultete Univerze v Ljubljani. Meritve koncentracij živega srebra v koreninah in

poganjkih sončnic so bile izmerjene z metodo masne spektroskopije z induktivno

sklopljeno plazmo (ICP-MS) na Kemijskem inštitutu Ljubljana, v Laboratoriju za analizno

kemijo.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: prof. dr. Mateja GERM

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Mentorica: prof. dr. Katarina VOGEL-MIKUŠ


Član: prof. dr. David STOPAR


Datum zagovora: 29.8.2016

Podpisana izjavljam, da je diplomska naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Izjavljam, da je elektronska oblika identična tiskani. Na univerzo prenašam pravico objave

svoje diplomske naloge v polnem tekstu na svetovnem spletu preko Digitalne knjižnice

Pedagoške fakultete.

Tanja Murn


III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK UDK 581.1.543.272.81(043.2)=163.6

KG živo srebro/Idrija/mikrobni inokulum/akumulacija v sončnicah

AV MURN, Tanja

SA VOGEL MIKUŠ, Katarina (mentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta

LI 2016

IN VPLIV RAZLIČNIH ZDRUŽB TALNIH MIKROORGANIZMOV NA PRIVZEM ŽIVEGA SREBRA PRI SONČNICI (Helianthus annuus L.)

TD Diplomsko delo

OP VIII, 37 str., 11 pregl., 15 sl., 37 vir.

IJ Sl

JI sl/en

AI Mesto Idrija je znano po 500-letnem rudarjenju živega srebra (Hg), ki spada med najbolj strupena (an)organska onesnažila. Tekom procesa pridobivanja Hg se je kar četrtina celotne proizvodnje sprostila v okolje. Posledično je to vplivalo na tamkajšnje rastline in mikrobe v tleh, ki so se bili primorani prilagoditi na onesnaževanje z razvojem različnih tolerančnih mehanizmov. Namen raziskave je bil ugotoviti, kako inokulacija sončnic z različnimi talnimi mikrobi vpliva na privzem Hg in na njeno rast. Mikrobe smo izolirali iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto (MIBF) in na vrtu v Idriji (MII), uporabili pa smo tudi

komercialni mikrobni inokulum EM (Micronatura) (MIEM). Določili smo suho maso korenin in poganjkov ter vsebnost fotosinteznih pigmentov. Koncentracije Hg smo določili z metodo masne spektroskopije z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS). Pri tem smo potrdili hipotezo, da so koncentracije Hg v koreninah večje kot v poganjkih in da MII negativno vpliva na privzem Hg. Hkrati smo zavrnili hipotezo, da MII v prisotnosti Hg vpliva na boljšo rast sončnic. Biomasa korenin in koncentracija Hg je bila največja pri sončnicah, ki so bile izpostavljene MIEM.


IV

KEY WORDS DOCUMENTATION

ŠD Dn

DK UDK 581.1.543.272.81(043.2)=163.6

CX mercury/Idrija/microbial inoculum/sunflower accumulation

AU MURN, Tanja

AA VOGEL MIKUŠ, Katarina (supervizor)

PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

PB University of Ljubljana, Faculty of Education, Biotechnical Faculty

PY 2016

TI EFFECTS OF DIFFERENT SOIL MICROBIAL COMMUNITIES ON THE UPTAKE OF MERCURY IN SUNFLOWER (Helianthus annuus L.)

DT Graduation Thesis

NO VIII, 37 p., 11 tab., 15 fig., 37 ref.

LA Sl

AL sl/en

AB Idrija is a small city known for its 500 year history of mercury (Hg) mining, one of the most toxic (an)organic pollutants. A quarter of the processed mercury was lost in the surrounding countryside. Therefore the plants and microbes growing in such environment were forced to adapt by developing of different tolerance mechanisms. The goal of this study was to investigate the effects of different soil microbial communities on the uptake of mercury and growth and development of sunflower. The microbes were isolated from soil collected in the field near Biotechnical Faculty (MIBF) and in the garden in Idrija (MII). Commercial microbial inoculum

EM (Micronatura) (MIEM) was also utilized. Dry weight of roots and shoots and the concentrations of photosynthetic pigments were determined. The mercury levels were determined by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS). Our results show that Hg is mainly concentrated in sunflower roots. We have confirmed the hypothesis that MII negatively affects Hg uptake and rejected the hypothesis that MII increases the sunflower growth in the presence of mercury when compared to the other treatments. The biomass of roots and shoots was the biggest in the sunflowers inoculated with MIEM in the substrate with Hg.


V

KAZALO VSEBINE

1 UVOD ........................................................................................................................................... 1

2 PREGLED OBJAV ...................................................................................................................... 3

2.1 ŽIVO SREBRO ........................................................................................................................ 3

2.1.1 Fizikalne in kemijske oblike živega srebra .............................................................................. 3

2.1.2 Živo srebro v okolju ................................................................................................................. 4

2.2 MIKROBNE TRANSFORMACIJE ŽIVEGA SREBRA ....................................................... 4

2.2.1 Metilacija živega srebra ........................................................................................................... 4

2.2.2 Demetilacija živega srebra ....................................................................................................... 5

2.2.2.1 Redukcija živega srebra ...................................................................................................... 6

2.2.2.2 Oksidacija živega srebra ...................................................................................................... 6

2.3 ODPORNOST BAKTERIJ PROTI ŽIVEMU SREBRU S POMOČJO MER OPERONA ... 6

2.4 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA RASTLINE ........................................................................... 6

2.4.1 Fitoremediacija ........................................................................................................................ 8

3 METODE DELA ........................................................................................................................ 10

3.1 PRIPRAVA SUBSTRATA .................................................................................................... 10

3.2 PRIPRAVA INOKULUMA ................................................................................................... 10

3.3 ŠTETJE KOLONIJ ............................................................................................................... 11

3.4 GOJENJE SONČNIC ............................................................................................................ 12

3.5 DOLOČANJE BIOMASE RASTLIN ................................................................................... 12

3.6 DOLOČANJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV............................................................... 12

3.7 DOLOČANJE KONCENTRACIJE ŽIVEGA SREBRA V POGANJKIH IN KORENINAH SONČNIC ........................................................................................................................................... 13

3.7.1 Priprava vzorcev .................................................................................................................... 14

3.7.1.1 Kislinski razklop vzorcev ................................................................................................... 14

3.7.2 Priprava Standardov ............................................................................................................. 14

3.7.2.1 Induktivno Sklopljena Plazemska Masna Spektroskopija (ICP-MS) ............................... 15

3.8 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV ............................................................................. 16

4 REZULTATI .............................................................................................................................. 17

4.1 ŠTETJE KOLONIJ ............................................................................................................... 17

4.2 BIOMASA SONČNIC ........................................................................................................... 18

4.2.1 Korenine ................................................................................................................................. 18

4.2.2 Poganjki ................................................................................................................................. 19

4.3 DOLOČANJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV............................................................... 20


VI

4.3.1 Klorofil a ................................................................................................................................ 20

4.3.2 Klorofil b ................................................................................................................................ 21

4.3.3 Karotenoidi ............................................................................................................................ 22

4.4 DOLOČANJE KONCENTRACIJE ŽIVEGA SREBRA V POGANJKIH IN KORENINAH SONČNIC ........................................................................................................................................... 23

4.4.1 Koncentracije živega srebra .................................................................................................. 23

4.4.1.1 Korenine ............................................................................................................................ 23

4.4.1.2 Poganjki ............................................................................................................................. 24

4.4.2 Translokacijski faktor za Hg ................................................................................................. 25

4.4.3 Vsebnost živega srebra ........................................................................................................... 26

4.4.3.1 Korenine ............................................................................................................................ 26

4.4.3.2 Poganjki ............................................................................................................................. 27

4.4.3.3 Skupna vsebnost Hg v sončnicah ....................................................................................... 28

5 DISKUSIJA ................................................................................................................................ 30

5.1 KOLONIJE ............................................................................................................................ 30

5.2 BIOMASA SONČNIC ........................................................................................................... 30

5.3 FOTOSINTEZNI PIGMENTI .............................................................................................. 30

5.4 KONCENTRACIJE Hg V SONČNICAH ............................................................................. 31

6 SKLEPI ...................................................................................................................................... 33

7 VIRI ............................................................................................................................................ 34

ZAHVALA


VII

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Priprava standardnih raztopin za Hg (IS – inertni standard). .............................. 15

Preglednica 2: Rezultati faktorske ANOVA za suho maso korenin ............................................ 18

Preglednica 3: Rezultati faktorske ANOVA za suho maso poganjkov ....................................... 19

Preglednica 4: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo klorofila a .................................. 20

Preglednica 5: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo klorofila b .................................. 21

Preglednica 6: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo karotenoidov .............................. 22

Preglednica 7: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo Hg v koreninah .......................... 23

Preglednica 8: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo Hg v poganjkih .......................... 24

Preglednica 9: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v koreninah .................................. 26

Preglednica 10: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v poganjkih ................................ 27

Preglednica 11: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v koreninah. ............................... 28

KAZALO SLIK

Slika 1: Kroženje živega srebra v okolju ...................................................................................... 4

Slika 2: Oznake izpostavitev....................................................................................................... 11

Slika 3: Primer kalibracijske krivulje ......................................................................................... 15

Slika 4: Agarne plošče z razvitimi kolonijami ............................................................................ 17

Slika 5: Suha masa korenin sončnic pri različnih izpostavitvah ................................................. 18

Slika 6: Suha masa poganjkov sončnic pri različnih izpostavitvah ............................................ 19

Slika 7: Koncentracija klorofila a v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah ................... 20

Slika 8: Koncentracija klorofila b v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah .................. 21

Slika 9: Koncentracija karotenoidov v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah ............... 22

Slika 10: Koncentracija Hg v koreninah sončnic pri različnih izpostavitvah ............................. 24

Slika 11: Koncentracija Hg v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah ............................. 25

Slika 12: Translokacijski faktor za Hg v sončnici pri različnih izpostavitvah ........................... 25

Slika 13: Vsebnost Hg v koreninah sončnic pri različnih izpostavitvah .................................... 27

Slika 14: Vsebnost Hg v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah .................................... 28

Slika 15: Skupna vsebnost Hg korenin in poganjkov pri različnih izpostavitvah ...................... 29


VIII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

ADP adenozin difosfat

ATP adenozin trifosfat

CO2 ogljikov dioksid

CH4 metan

Cd kadmij

Ca(CO)3 kalcijev karbonat

DMHg ((CH3)2Hg) dimetil živo srebro

H2O voda

Hg živo srebro

Hg0 elementarno živo srebro

Hg+ enovalentno živo srebro

Hg2+ dvovalentno živo srebro

HgCl2 živosrebrov(II) klorid

Hg(OH)2 živosrebrov hidroksid

HgS živosrebrov sulfid (cinabarit)

H2S vodikov sulfid

CH3- metilni anion

HNO3 dušikova(V) kislina

HCl klorovodikova kislina

IS inertni standard

ICP-MS sklopljena plazemska masna spektrometrija

MeHg (CH3Hg+) metil živo srebro

NaCl natrijev klorid

O3 ozon

PO4- fosfatni(V) ion

-SH tiolna oz. sulfhidrilna skupina

SRB sulfat reducirajoče bakterije

SO42- sulfatni(VI) ion

S2- sulfidni ion


1

1 UVOD

Po legendi pripovedujoč, je v 15. stoletju pod curkom idrijske studenčnice »škafar« odkril

neznano tekočo, svetlečo in težko snov, kasneje prepoznano kot živo srebro (Hg). Pričelo

se je petstoletno neprekinjeno rudarjenje v idrijski kotlini, kar se odraža v povečanih

vsebnostih Hg v okolju. Idrijski rudnik je veljal za drugi največji rudnik na svetu, z več kot

13 % svetovne proizvodnje Hg. Prekašal ga je le španski Almaden, katerega začetki so

segali v antični čas. V celotni zgodovini rudnika je bilo izkopane več kot 12 milijonov ton

živosrebrove rude. Med procesom pridobivanja se je okoli 38.000 ton Hg izgubilo v

okolju, predvsem v obliki hlapov Hg ali deponiranega v reki Idrijci (Urbanc, 2010).

Živo srebro uvrščamo med najbolj znane in najbolj problematične kovine v okolju. Živo

srebro in njegove spojine v okolju so naravnega (preperevanje kamnin, erozija, vulkani) in

antropogenega izvora (rudarjenje, industrija) v vseh medijih in v več oblikah. Vse oblike

Hg so za ljudi in živali strupene, najbolj pa organske oblike, kot sta metil-Hg (MeHg) in

dimetil-Hg (DMHg) (Gochfeld, 2003).

Pri biogeokemijskem kroženju Hg pomembno vlogo igrajo rizosferni mikroorganizmi, ki

delujejo kot vmesnik med tlemi in rastlino. Uporaba talnih mikroorganizmov je velikega

pomena pri fitoremediaciji, saj mikroorganizmi lahko vplivajo na mobilnost težkih kovin

in s tem dostopnost rastlinam (Yan-de in sod., 2007).

Živo srebro v organizmih nima znane biološke vloge, lahko pa že v zelo majhnih

koncentracijah negativno vpliva na rast in razvoj rastlin (Patra in Sharma, 2000). Mikrobi,

ki so dalj časa izpostavljeni povečanim koncentracijam Hg, lahko razvijejo biokemijske

zaščitne sisteme, s pomočjo katerih preprečujejo učinke strupenosti živosrebrovih ionov

(Hg2+) (Wood, 1984).

Cilj diplomske naloge je bil ugotoviti vpliv različnih talnih mikrobnih združb na privzem

Hg ter na rast sončnic (Helianthus annuus L.). Rast sončnic smo preverjali z merjenjem

rastnih parametrov (suha masa korenin in poganjkov, koncentracija fotosinteznih

pigmentov) in analizo koncentracij živega srebra v koreninah in poganjkih ob dodatku

različnih mikrobnih izvlečkov (mikrobni inokulum). Dobljene vrednosti merjenih rastnih

parametrov, smo nato primerjali z vrednostmi merjenih parametrov na kontrolnih

sončnicah. Zanimal nas je tudi vpliv komercialnega inokuluma EM (Micronatura) na rast


2

sončnic. Ta inokulum naj bi vseboval mlečnokislinske bakterije in kvasovke, za katere

proizvajalci trdijo, da izboljšajo rast rastlin preko izboljšane absorpcije mineralnih hranil.

Ni pa znano, ali vplivajo tudi na privzem težkih kovin.

HIPOTEZE

• Predvidevamo, da bodo sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom,

izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji, v prisotnosti Hg, rasle bolje od

sončnic, inokuliranih z mikrobnimi inokulumi, izoliranimi iz neonesnaženih

okoljih.

• Največje koncentracije Hg bomo zasledili v koreninah sončnic.

• Predvidevamo, da bodo mikroorganizmi, izolirani iz vzorca tal, nabranega na vrtu v

Idriji, vplivali na privzem Hg pri sončnicah.


3

2 PREGLED OBJAV

2.1 ŽIVO SREBRO

2.1.1 Fizikalne in kemijske oblike živega srebra

Ime živo srebro (Hg) izhaja iz grške besede hydrargyrium (hidros – voda in agyrum –

srebro). Je kemijski element s simbolom Hg, atomskim številom 80 in relativno atomsko

maso 200,59. Nahaja se v II. stranski skupini periodnega sistema, znani kot skupini

prehodnih elementov. Od drugih prehodnih elementov se razlikuje v tem, da je pri sobni

temperaturi v tekočem agregatnem stanju. Je srebrno-bele barve, ima veliko gostoto

(13,456 g cm-3 pri 20 °C), tališče pri –38,87 °C in vrelišče pri 357 °C (Brenčič in Lazarini,

1995).

Živo srebro lahko nastopa v treh oksidacijskih stanjih: elementarno živo srebro (Hg0),

enovalentno živo srebro (Hg+) in dvovalentno živo srebro (Hg2+). Kemijske lastnosti Hg so

močno odvisne od oksidacijskega stanja. Elementarno Hg0 je večinoma prisotno v

atmosferi, včasih tudi v vodnih medijih. Enovalentno in dvovalentno živo srebro običajno

ne obstajata v ionski obliki, ampak tvorita številne anorganske in organske spojine v vodi,

tleh in sedimentih (EPA, 1997).

Najpogostejše anorganske spojine v okolju so živosrebrov klorid (HgCl2), živosrebrov

hidroksid (Hg(OH)2) in živosrebrov sulfid (HgS). Spojine so v obliki belega prahu ali

kristalov, razen HgS, ki je rdeč in potemni, če je izpostavljen svetlobi. V različnih

toksikoloških študijah se navadno uporablja HgCl2, ker se kljub veliki hlapljivosti dobro

topi in je kemično bolj aktivna spojina kot elementarno Hg0. Organske spojine so tiste, pri

katerih je Hg2+ s kovalentno vezjo neposredno vezan na vsaj en C atom, najpogosteje na C

atom iz metilne skupine (CH3-). Najpomembnejši organski obliki sta metil-Hg - MeHg

(CH3Hg+) in dimetil-Hg - DMHg ((CH3)2Hg) (EPA, 1997). Obe metilni obliki - MeHg in

DMHg sta hlapni in dobro topni v lipidih. Od vseh oblik Hg, največjo stopnjo strupenosti

predstavlja nevrotoksin MeHg, ki se akumulira v prehranjevalni verigi in na ta način

ogroža zdravje ljudi in živali (Robinson in Tuovinen, 1984).


4

2.1.2 Živo srebro v okolju

Glavna oblika živega srebra v atmosferi je elementarno Hg0, ki je zelo hlapljivo in se lahko

v interakciji z ozonom (O3) in ob prisotnosti vode (H2O) oksidira v Hg2+. Veliko Hg2+ z

dežjem prehaja iz atmosfere v oceane, kjer poteka fotoredukcija ali bakterijska redukcija v

Hg0. Elementarno Hg0 na ta način ponovno hlapi nazaj v atmosfero. V vodi in sedimentih

je Hg2+ glavni substrat za bakterijsko pretvorbo v MeHg, ki se nato bioakumulira v

prehranjevalni verigi (Nascimento in Chartone-Souza, 2003) (Slika 1).

Slika 1: Kroženje živega srebra v okolju

Glavne oblike živega srebra, katerim smo ljudje izpostavljeni, so Hg0 in MeHg, ki so zelo

strupene za vse živeče organizme. Strupenost organskih in anorganskih oblik Hg

pripisujejo njihovi močni afiniteti do tiolnih (-SH) skupin organskih molekul. Zaradi tega

so bakterije, glive in rastline, ki živijo na s Hg onesnaženih območjih, razvile različne

mehanizme za zaščito oz. odpornost na različne oblike Hg (Osborn in sod., 1997).

2.2 MIKROBNE TRANSFORMACIJE ŽIVEGA SREBRA

Različni mikroorganizmi lahko s transformacijami Hg zmanjšajo ali povečajo strupenost za

večcelične organizme, saj se Hg spojine med seboj razlikujejo po strupenosti.

2.2.1 Metilacija živega srebra

Raziskave o Hg metilaciji so se pričele leta 1960, ko se je v zalivu Minamata (Japonska)

zgodila tragedija, ki je povzročila zastrupitev na tisoče ljudi z MeHg, prisotnim v

kontaminiranih ribah (Bakir in sod., 1973).


5

Benoit in sod. (2003) poročajo, da je metilacija Hg znotrajcelični proces v bakterijah, ki

Hg2+ metilirajo tako, da nastane MeHg. Donor metilne skupine so metilkorinoidi (analogi

vitamina B12), ki so sposobni prenesti negativno nabiti CH3- na pozitivno nabiti Hg2+

(Wood, 1974). Transformacije Hg2+ v MeHg s pomočjo mikroorganizmov, sta prvič

dokazala Jensen in Jernelov (1969) z usedlinami sladkih vod in jezer, ki so metilirale

HgCl2, medtem ko sterilizirani sedimenti niso.

Na hitrost nastajanja in kopičenje MeHg vplivajo različni dejavniki. Med te dejavnike

sodijo koncentracija razpoložljivega Hg2+, koncentracija celokupnega Hg2+, kemijska

oblika Hg, struktura mikrobne združbe in okoljski dejavniki, med katere prištevamo

temperaturo, pH, redoks potencial, koncentracijo in dostopnost organskih spojin za

sulfatne reducente (Kelly in sod., 1995).

Mikrobna metilacija najbolj intenzivno poteka v anaerobnih sedimentih, kjer jo v večji

meri opravljajo sulfat-reducirajoče bakterije (SRB). Povezavo med sulfatno respiracijo in

metilacijo Hg sta dokazala Compeau in Bartha (1985), ko sta ob dodatku molibdena

(specifičen inhibitor sulfatne redukcije) zaznala inhibicijo sulfatne redukcije in s tem upad

tvorbe MeHg v gojiščih s SRB.

Hitrost metilacije pozitivno korelira s hitrostjo redukcije sulfata, vendar z naraščanjem

koncentracije reduciranega žvepla pada. SRB v anaerobnih pogojih in bogatih organskih

sedimentih reducirajo sulfat (SO42-) v vodikov sulfid (H2S). Nastali sulfid (S2-) reagira s

Hg2+ v netopen HgS, ki močno inhibira metilacijo in s tem tvorbo MeHg v tleh in

sedimentih (Barkay, 2005). Metilacijo inhibirajo tudi huminske in fulvo kisline. Te s Hg2+

tvorijo kemično zelo stabilne komplekse in s tem zmanjšajo biodostopnost Hg2+ za

metilacijo (Stamenkovič in sod., 2004).

2.2.2 Demetilacija živega srebra

Demetilacija je bila prvič odkrita v letu 1970. Vzorce sedimentov so inkubirali z 14C-

MeHg, produkt razgradnje sta bila 14CH4 in Hg0. Billen je s sodelavci leta 1974 ugotovil,

da se hitrost demetilacije poveča ob prisotnosti povečanih koncentracij MeHg, povezana z

bogatitvijo populacije bakterij, ki so odporne na MeHg (Barkay, 2005).


6

Metil-Hg se lahko demetilira po oksidativni ali reduktivni poti. Na abiotsko razgradnjo

MeHg lahko vpliva tudi ultravijolično sevanje (UV-A in UV-B). Tako lahko ob prisotnosti

sončne svetlobe poteka fotorazgradnja MeHg v Hg2+ (Barkay, 2003).

2.2.2.1 Redukcija živega srebra

Reduktivna demetilacija MeHg večinoma poteka v aerobnih okoljih. Vršijo jo lahko

bakterije, ki vsebujejo mer operon. Na njem je zapis za encim liazo, ki cepi vez med Hg in

ogljikom iz metilne skupine. Pri tem nastane metan (CH4) in Hg2+. Po drugi strani encim

Hg-reduktaza reducira Hg2+ v hlapen Hg0 (Robinson in Tuovinen, 1984).

2.2.2.2 Oksidacija živega srebra

Mehanizmi oksidativne demetilacije organizmov, vpletenih v ta proces, naj bi bili za enkrat

še neznani. Gre za biokemične poti metabolizmov z enim ogljikovim atomom (metilirani

amini, metanol), katerih končni produkt je CO2, manjša količina CH4 in Hg2+, ki se pozneje

lahko metilira (Oremland, 1991).

2.3 ODPORNOST BAKTERIJ PROTI ŽIVEMU SREBRU S POMOČJO MER OPERONA

Mehanizem obrambe bakterij pred Hg omogoča mer operon, ki bakterijam preko encimske

redukcije omogoči razstrupljanje Hg2+ v hlapljivo elementarno Hg0. Prenos in redukcija

potekata s pomočjo -SH skupin cisteinov, ki so tarče za vezavo Hg. Ne strupen Hg0 nato

difundira v citoplazmo, kjer zaradi svojega visokega parnega tlaka izhlapi v zunajcelično

okolje oz. atmosfero. Encim, ki sodeluje pri redukciji Hg2+, je Hg-reduktaza, znotrajcelični

flavoprotein, ki so ga zasledili v sevih Pseudomonas sp., Escherichia coli in

Staphylococcus aureus. Mer operon je prisoten tako v Gram negativnih bakterijah, kot tudi

v Gram pozitivnih bakterijah. Ponavadi so mer operoni locirani na plazmidih, kromosomih,

pogosto so tudi komponente transpozonov in integronov (Barkay, 2003).

2.4 VPLIV ŽIVEGA SREBRA NA RASTLINE

Zastrupitev s Hg je posledica onesnaževanja okolja v svetovnem merilu. K onesnaževanju

s Hg dve tretjini prispevajo naravne emisije, eno tretjino pa človek sam, ko na kmetijska

zemljišča dodaja različne pripravke (gnojila, apno, itd.). Najpomembnejši vir

kontaminacije kmetijske zemlje s Hg predstavlja uporaba živosrebrovih organskih spojin,


7

ki se tlem dodajajo za preprečevanje razvoja glivnih bolezni semen. Če se ga uporablja v

priporočenih odmerkih, ima le ta ugoden vpliv na kalitev semen (Patra in Sharma, 2000).

Koncentracija Hg v rastlini, ki ga privzame iz zemlje, je odvisna od koncentracije Hg v

tleh, pH tal, vsebnosti glinenih, mineralnih in organskih snovi, kationske izmenjevalne

kapacitete, redoks razmer, prisotnost kalcijevega karbonata (CaCO3) v tleh, kot tudi

lastnosti posameznih rastlinskih vrst. Znano je, da več kot je organskih in mineralnih snovi

v tleh, več Hg se veže nanje in posledično se zmanjša biodostopnost in mobilnost Hg za

rastline (Patra in Sharma, 2000).

Živo srebro v organizmih nima znane biološke vloge, lahko pa že pri zelo nizkih

koncentracijah povzroča različne fitotoksične učinke, podobno kot druge težke kovine, npr.

Cd in Pb. Večina Hg se akumulira v korenine rastlin, ki služijo kot ovira za prenos Hg v

nadzemne dele, zato so koncentracije Hg v nadzemnih delih odvisne predvsem od

foliarnega privzema Hg0, ki prvotno izvira iz tal (Gracey in Stewart, 1974). Koncentracija

Hg v rastlinah je višja, če je Hg na voljo v organski obliki. Na privzem Hg vpliva sama

vrsta rastline, sezonske spremembe v prirastku in kemijska oblika Hg, ki ga absorbira.

(Patra in Sharma, 2000)

Glavni znaki vpliva Hg na rastline se kažejo predvsem na rastlinskem zarodku in

semenskem endospermu. Živo srebro ima veliko afiniteto do tiolnih skupin –(SH), zato so

tarče zlasti proteini, bogati z cisteinom, ker vsebujejo –SH skupine. Posledica tega je

nastanek –S-Hg-S- mostu. Tak način vezave Hg vpliva na kalitev in posledično rast

mladega zarodka, saj so ravno ta tkiva še posebej bogata z –SH skupinami. Živo srebro

rado reagira tudi z fosfatnimi skupinami (PO42-) ADP in ATP-ja in DNK, kar vodi v

zaviranje funkcij. Velikokrat nadomesti atome magnezija v klorofilu, s čimer zavira

fotosintezo. Poleg tega rastlinske celice vsebujejo tudi veliko akvaporinov, ki so prav tako

pogoste tarče Hg in na ta način je omejen transport vode v tonoplast, kar posledično vpliva

na transpiracijo (Patra in Sharma, 2000).

Celična stena koreninskih celic rastline je v neposrednem stiku s kovinami v tleh. Proteini,

ki so v celični membrani in na površini membrane so torej prva tarča strupenosti težkih

kovin. Znano je, da se kar 90 % Hg nahaja v celični steni koreninskih celic (Patra in

Sharma, 2000).


8

2.4.1 Fitoremediacija

Fitoremediacija je tehnologija, ki uporablja za to primerne rastline za čiščenje oziroma

stabilizacijo onesnaženega okolja. Gre za učinkovito, poceni in okolju prijazno tehnologijo

odstranjevanja onesnaževal (Glick, 2010).

Poznamo več tehnik fitoremediacije (Yan-de, 2007):

1. Fitoekstrakcija je postopek koncentriranja težkih kovin iz tal v korenine in

poganjke rastlin.

2. Rizofiltracija je uporaba rastlinskih korenin za absorpcijo, koncentriranje ali

obarjanje težkih kovin iz odpadnih voda.

3. Fitostabilizacija je zmanjšanje mobilnosti težkih kovin na podlagi absorpcije na/v

rastline, kar zmanjša njihovo biodostopnost.

4. Fitovolatilizacija je vnos težkih kovin v rastline, kjer se nato sprostijo v obliki

hlapov v ozračje. Primarna težka kovina za odstranitev preko fitovolatilizacije je

živo srebro, kjer poteka razstrupljanje Hg2+ v hlapljivo elementarno Hg0.

Posledica je volatilizacija Hg0 v atmosfero, kjer se razredči. Globalno gledano je

omenjena metoda deloma problematična, ker se pare Hg0 v atmosferi oksidirajo v

Hg2+ in v obliki padavin vračajo nazaj v kopenske in vodne ekosisteme.

Volatilizacija Hg tako prispeva k globalnemu onesnaževanju s Hg. (Henry, 2000).

Za fitoremediacijo se torej uporabljajo rastline, ki so se bile za svoje preživetje primorane

prilagoditi na onesnaževanje z razvojem različnih obrambnih mehanizmov pred strupenimi

kovinami. Ti mehanizmi delujejo na osnovi preprečevanja akumulacije težkih kovin v

rastline ali pa kopičenja velikih količin težkih kovin v tkivih rastline (Khan in sod., 2000).

V primeru Hg je najbolj priporočljiva uporaba rastlin, ki Hg zadržijo v svojem

koreninskem sistemu, pri čemer se zmanjša volatilizacija in izpiranje v okoliške vodotoke.

Pomembno vlogo v učinkovitosti fitoremediacije Hg predstavljajo tudi rizosferni

mikroorganizmi in njihove interakcije z koreninami rastlin, saj lahko le-ti vplivajo na

mobilnost Hg v tleh in s tem dostopnost rastlinam (Yan-de, 2007).

Dolgoročna izpostavljenost mikroorganizmov substratu s Hg lahko vodi v razvoj različnih

tolerančnih mehanizmov. V splošnem ti sistemi zajemajo protonske črpalke, ki aktivno


9

odstranjujejo Hg2+ iz celice, encime, ki reducirajo Hg2+ v manj strupeno elementarno

obliko (Hg0), proteinske receptorje na celični površini, ki vežejo Hg2+ in tako preprečujejo

njegov vstop v celico, sisteme, ki omogočajo tvorbo in obarjanje netopnih Hg sulfidov, kot

tudi metilacijo z difuznim izločanjem MeHg v okolje (Wood, 1984).

Obstajajo pa tudi mikroorganizmi, ki s svojim delovanjem in mehanizmi povečajo

akumulacijo Hg v rastlinah (de Souza in sod., 1999)

i) mikroorganizmi v rizosferi lahko povečajo površino korenin, s čimer se poveča

privzem težkih kovin (Kapulnik in Okon, 1996)

ii) mikroorganizmi lahko anorganski Hg transformirajo v organske oblike, npr.

MeHg, ki se korenine privzame hitreje (Zayed in sod., 1998)

iii) mehanizem privzema Hg2+ v višje rastline še ni dobro raziskan. Znano je, da

mikroorganizmi znižajo pH tal in na ta način se poveča akumulacija Hg

(Moorby in sod., 1988)

Diplomsko delo je nastalo zaradi pomanjkanja raziskav na področju mikrobov, izoliranih iz

okolij, onesnaženih s Hg, in slabo raziskanega prispevka k akumulaciji Hg v rastline.


10

3 METODE DELA

3.1 PRIPRAVA SUBSTRATA

Za poskus smo substrat pripravili tako, da smo zmešali substrat za rože in substrat iz tal,

nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, v razmerju 1:1. Pripravljen substrat smo

sterilizirali z avtoklaviranjem v razmiku dveh dni (121°C, 101 Pa), da smo odstranili

morebitne že prisotne mikroorganizme. Avtoklaviran substrat smo razporejenega na vrečki

za smeti, štiri dni sušili na zraku pri sobni temperaturi. Nato smo polovico suhega substrata

kontaminirali s 50 mg kg-1 Hg v obliki HgCl2 raztopljenega v destilirani vodi.

Kontaminacijo substrata s Hg smo izvedli v digestoriju. Polovico substrata smo

kontaminirali s HgCl2 (Merck, Nemčija). Zatehtali smo 0,29 g HgCl2/4,3 kg substrata. Bel

prah HgCl2 (Merck, Nemčija) smo raztopili v 2 dcl destilirane vode. To smo nato razlili po

substratu in ga dobro premešali. Substrat smo pospravili v vrečko za smeti, jo dobro

zavezali in jo pustili stati 10 dni, da se je Hg dobro razporedil po substratu. Preostali

polovici substrata nismo dodajali HgCl2.

3.2 PRIPRAVA INOKULUMA

V poskusu smo pripravili dva različna inokuluma mikroorganizmov. V dva merilna valja

(1000 ml) smo do volumna 200 ml natresli posamezen vzorec tal (vzorec tal, nabran na

vrtu v Idriji (MII) in na njivi za Biotehniško fakulteto (MIBF)), nato pa do 800 ml

dopolnili z destilirano vodo in to pustili stati en dan. Mikrobni izvleček smo nato pripravili

tako, da smo po treh dneh vsebino prefiltrirali skozi sito s porami velikosti 45 µm. Tretji

inokulum je bil komercialni mikrobni inokulum EM (Micronatura) (MIEM), redčen z

vodo v razmerju 1:10. Proizvajalci trdijo, da gre za mikrobno združbo fototrofnih in

mlečnokislinskih bakterij ter kvasovk (http://www.micronatura.si). Četrta izpostavitev je

bila kontrola – destilirana voda (Slika 2).


11

Slika 2: Oznake izpostavitev (N=5 za vsako posamezno izpostavitev). Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji.

3.3 ŠTETJE KOLONIJ

V naših pripravljenih inokulumih smo opravili štetje kolonij. Uporabili smo metodo z

razmazovanjem (Čadež in Mahne 2005). Običajno je število mikroorganizmov v

osnovnem vzorcu preveliko, da bi ga lahko po metodi z razmazovanjem neposredno

določili, zato iz osnovnega vzorca pripravimo serijo redčitev.

Iz tekočih mikrobnih inokulumov MII in MIBF smo s sterilno pipeto odpipetirali 1 ml

posameznega inokuluma, ki smo ga v nadaljevanju uporabili za redčitev. Iz tega smo

ponovno s sterilno pipeto odpipetirali 100 µl posameznega vzorca in ga prenesli v sterilno

centrifugirko z 0,9 ml fiziološke raztopine (0,9 % NaCl). Dobljeno razredčitev 10-1 smo

nato mešali na mehanskem mešalniku približno 10 sekund ter nato iz nje z novo sterilno

pipeto odpipetirali 100 µl in prenesli v novo sterilno centrifugirko z 0,9 ml 0,9 % NaCl.

Dobili smo razredčitev 10-2. Postopek smo ponavljali do želene razredčitve 10-5.

100 µl posamezne razredčitve smo nanesli na površino trdnega gojišča in jo razmazali po

celotni površini s pomočjo sterilne steklene trikotne lopatice. Pri MIEM smo na površino

trdnega gojišča direktno nanesli 100 µl osnovnega vzorca. Po inkubaciji (2 dni) na 37 ⁰C

smo nastale kolonije prešteli na tistih ploščah, kjer je bilo od 30 do 300 kolonij. S pomočjo

preštetih kolonij in razredčitvenega faktorja smo izračunali koncentracijo kultivabilnih

celic v osnovnem vzorcu (Formula 1).


12

N=�� (1)

N – število mikroorganizmov v vzorcu (cfu/ml)

np – povprečno število kolonij

R – razredčitev vzorca, pri kateri smo prešteli kolonije

3.4 GOJENJE SONČNIC

Za poskus smo izbrali sončnico vrste Helianthus annuus L. Sončnice smo kalili v

vermikulitu, po dveh tednih pa smo sončnice enakih velikosti prenesli v substrat z ali brez

dodanega HgCl2. Kontrolni in kontaminirani substrat smo razporedili v lončke. Za vsako

izpostavitev (kontrola, Hg) smo uporabili po 20 lončkov, skupaj 40 lončkov. Četrtino

lončkov (pet lončkov s kontrolnim substratom in pet lončkov s kontaminiranim

substratom) s sončnicami smo zalili z destilirano vodo, četrtino z MIBF, četrtino z MII in

četrtino z MIEM, redčen v razmerju 1:10. Lončke smo prekrili s plastičnimi vrečkami, da

bi omejili izhlapevanje Hg iz substrata.

Sončnice smo gojili 5 tednov v kontroliranem okolju, v rastnih komorah pri 50 % relativni

zračni vlagi, 16/8 h dnevno/nočni periodi in temperaturi 24 0C. Zalivanje sončnic je

potekalo dvakrat tedensko, po petih tednih pa smo sončnice pripravili za nadaljnje analize.

3.5 DOLOČANJE BIOMASE RASTLIN

Po petih tednih smo poskus končali. Korenine sončnic smo namočili v vodovodno vodo za

lažjo odstranitev substrata, jih sprali z vodo in jih osušili s pomočjo papirnatih brisač.

Poganjke smo ločili od korenin, jih zavili v aluminijasto folijo, vsak paket ustrezno

označili in jih zmrznili v tekočem dušiku. Zmrznjene pakete sončnic smo nato posušili v

liofilizatorju (liofilizer Alpha 2-4 Christ). Rastlinski material se je sušil 5 dni. Po

končanem sušenju smo določili suho maso poganjkov in korenin ter strli ves material v

terilnici s pomočjo tekočega dušika.

3.6 DOLOČANJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV

Liofilizirane poganjke smo strli v terilnici s pomočjo tekočega dušika. V čiste centrifugirke

smo zatehtali 30 mg uprašenih liofiliziranih poganjkov, vzorcu dolili 5 mL 80 % acetona

(Empatra ASC, Nemčija) ter premešali z vorteksom. Centrifugirke smo pokrili z

gumijastimi pokrovčki, označili nivo acetona in jih shranili čez noč v hladilniku. Naslednji


13

dan smo do označene črte vzorca dopolnili z 80 % acetonom. Vzorce smo ponovno

premešali na vorteksu in centrifugirali 2 minuti pri 2500 obratih/minuto pri sobni

temperaturi.

Absorbanco smo izmerili na spektrofotometru 8452A (HP-Hewlett Packard) pri valovnih

dolžinah 647 nm, 664 nm in 470 nm. Za kalibracijo smo pomerili absorbanco slepega

vzorca, in sicer 80 % acetona (Monni in sod., 2001). Program smo nastavili tako, da je od

vsakega izmerjenega vzorca odštel izmerjeno vrednost slepega vzorca. Iz dobljenih

absorpcij smo preračunali koncentracije pigmentov v µmol/l za klorofil a, klorofil b in

karotenoide (Graan in Ort, 1984) (Formule 2-4). Na koncu smo upoštevali še maso

rastlinskega materiala in volumen ekstrakta, da smo dobili končne koncentracije

fotosinteznih pigmentov v mg/g suhe mase (Formula 5).

�ℎ��(�� ) = 13,19 × �� − 2,57 × �� (2)

�ℎ�� = 22,10 × �� − 5,26 × �� (3)

∑$%&'()*'+,'-(�� ) = .///×01234.,56×78 945:,/6×78 ;

.<5 (4)

× �== = >��7�?@ABCD9×EBFGDH9FD9

��I@9CJFIK×./// (5)

3.7 DOLOČANJE KONCENTRACIJE ŽIVEGA SREBRA V POGANJKIH IN KORENINAH SONČNIC

Analize koncentracije živega srebra v vzorcih so bile opravljene z masno spektroskopijo z

induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS) na Kemijskem inštitutu Ljubljana, v Laboratoriju

za analizno kemijo ob pomoči dr. Bojana Budiča.


14

3.7.1 Priprava vzorcev

3.7.1.1 Kislinski razklop vzorcev

Za razklop vzorcev smo potrebovali posebne teflonske posodice. Vanje smo zatehtali po

100 mg uprašenega liofiliziranega rastlinskega materiala. V vsako teflonko smo dodali po

3 ml 65 % dušikove kisline (HNO3, Sigma aldrich). Pripravljene vzorce smo dali v

mikrovalovno pečico MarsXpress (CEM) za razklop. Mineralizacija je potekala tako, da

smo vzorce najprej dvajset minut segrevali do 180 oC pri 1600 W, nato pa trideset minut

vzdrževali konstantno temperaturo pri 180 oC. Zaradi čim manjših izgub Hg v segretih

parah HNO3, smo vzorce ohlajali čez noč v zaprtih teflonskih posodicah na sobni

temperaturi. Ohlajene vzorce smo naslednji dan prelili v epruvete t.i. falkonke in jih redčili

z bidestilirano vodo do 5 ml. Pri vsakem razklopu smo sočasno naredili še slepi vzorec.

Raztopine vzorcev za merjenje koncentracij Hg smo pripravili tako, da smo v nove

epruvete odpipetirali 1 ml našega razklopljenega vzorca, mu dodali 50 µL inertnega

standarda (IS) (Se, Ge, Y, Ga, 10 mg kg-1) in 750 µL HCl za stabilizacijo Hg v raztopini,

ter redčili do končnega volumna 10 ml z bidestilirano vodo Mili Q.

3.7.2 Priprava standardov

Najprej smo pripravili tri založne raztopine za Hg s koncentracijo 0,2, 1 in 5 mg kg-1. Za

0,2 mg kg-1 založno raztopino smo odpipetirali 2 µl 1000 mg kg-1 standardne raztopine Hg

(Merck, Nemčija). Za 1 mg kg-1 založno raztopino smo odpipetirali 10 µl 1000 mg kg-1

standardne raztopine Hg, za 5 mg kg-1 založne raztopine pa smo odpipetirali 50 µl 1000 mg

kg-1 standardne raztopine Hg. Vsem trem raztopinam smo še dodali 200 µl 2 % HNO3 in

redčili z bidestilirano vodo do končnega volumna 10 ml.

V nadaljevanju smo pripravljene založne raztopine pomerili z ICP-MS, vrednosti (sunki/s)

pa uporabili za izdelavo umeritvene krivulje, iz katere smo odčitali koncentracije Hg v

naših vzorcih (Preglednica 1) (Slika 3).


15

Slika 3: Primer kalibracijske krivulje

Preglednica 1: Priprava standardnih raztopin za Hg (IS – inertni standard).

Koncentracija Hg (ppb)

V Hg (0,2 ppm) (µL)

IS (Ge, Y, Ga, Sc) (µL)

V HNO3 (µL) V (HCl) (µL) Končni volumen

0 0 50 250 750 10 0,01 0,5 50 250 750 10 0,05 2,5 50 250 750 10

Koncentracija Hg

(ppb) V Hg (1

ppm) (µL) IS (Ge, Y,

Ga, Sc) (µL) V HNO3 (µL) V (HCl) (µL) Končni

volumen 0,1 1 50 250 750 10

0,25 2,5 50 250 750 10 0,5 5 50 250 750 10

Koncentracija Hg

(ppb) V Hg (5

ppm) (µL) IS (Ge, Y,

Ga, Sc) (µL) V HNO3 (µL) V (HCl) (µL) Končni

volumen 1 2 50 250 750 10 5 10 50 250 750 10

10 20 50 250 750 10 20 40 50 250 750 10 50 100 50 250 750 10 100 200 50 250 750 10

3.7.2.1 Induktivno sklopljena plazemska masna spektroskopija (ICP-MS)

Metoda ICP-MS se zaradi svoje velike občutljivosti (0,01 – 1 µg g-1) uporablja za

elementno analizo, ki temelji na ionizaciji vzorca v plazmi, ki je raztopljen v kislini.

y = 7324x + 594,51R² = 1

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 20 40 60 80 100 120

sun

ki/s

Koncentracija


16

ICP-MS deluje na način, da združuje visoko temperaturo ICP (induktivno sklopljeno

plazmo) z masnim spektrometrom. ICP najprej sprejme aerosole, ki jih aparatura po cevki

posrka iz vzorca. Aerosoli se pod vplivom visoke temperature ionizirajo, nato pa se v

masnem spektrometru ločijo na podlagi njihove mase.

Koncentracije živega srebra smo odčitali iz kalibracijske krivulje, ki smo jo dobili iz

pripravljenih standardnih raztopin (Slika 3).

Sposobnost transporta težke kovine (TK) iz korenin v poganjke rastline se meri s

translokacijskim faktorjem (TF).

(&%*L�'$%�+ML$+N%$('& = $'*�)*(&%�+M%OP-Q'R%*M$+ℎ$'*�)*(&%�+M%OP-$'&)*+*%ℎ

Ker na koncentracijo kovin vpliva hitrost rasti rastline in prihaja do t.i. redčitvenega oz.

koncentracijskega efekta, smo uvedli še parameter, ki smo ga poimenovali »vsebnost Hg«.

»Vsebnost Hg« (µg) v koreninah in poganjkih smo določili tako, da smo koncentracijo Hg

(µg/g) v posameznem organu pomnožili z njegovo biomaso (g).

3.8 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV

Za analizo podatkov smo uporabili standardne statistične metode. Podatke smo obdelali v

programu MS Excel 2007 in programu Statistica (Statsoft 7.0.61.0.). Statistično značilne

razlike smo določili v programu enosmerna ANOVA, Duncanov test (p < 0,05), pri čemer

smo predpostavili, da so vzorci normalno porazdeljeni.


17

4 REZULTATI

4.1 ŠTETJE KOLONIJ

Nastale kolonije, ki so zrasle po inokulaciji agarnih plošč z MII, MIBF in MIEM, smo šteli

s prostim očesom. Določili smo makromorfološke lastnosti kolonij. Makromorfološke

lastnosti opredeljuje oblika, površina, prerez in čvrstost. Kolonije vseh inokulumov so bile

bele barve. Na trdnem gojišču je bilo prisotnih več različnih oblik kolonij. Kolonije so bile

točkaste oblike, pravilno okrogle in nitaste. Robovi kolonij so bili pretežno gladki, razen

pri nitastih, kjer so bili robovi nakodrani. Površina kolonij pri vseh inokulumih je bila

gladka, prerez kolonij pa ploščat.

V petrijevkah, kjer je zraslo števno število kolonij (splošno velja, da je števna plošča za

bakterije 30-300 kolonij), smo izračunali število mikroorganizmov v 1 ml vzorca (cfu/ml)

(Formula 1) (Slika 4).

MIEM

2,91*105 cfu/ml

MIBF

8,4*107 cfu/ml

MII

8,2*107 cfu/ml

Slika 4: Agarne plošče z razvitimi kolonijami. Legenda: MIEM – komercialni mikrobni inokulum EM, MIBF – mikrobni inokulum, izoliran iz vzorca tal, nabranega na vrtu za Biotehniško fakulteto (redčitev 10-3),

MII – mikrobni inokulum, izoliran iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji (redčitev 10-3), cfu – enota za oceno števila viabilnih bakterijskih celic v vzorcu.


18

4.2 BIOMASA SONČNIC

4.2.1 Korenine

Znotraj kontrolnega substrata med izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik.

Največjo biomaso korenin so imele sončnice, izpostavljene MIEM v substratu s Hg, ki se

statistično značilno razlikujejo od ostalih izpostavitev. Biomasa kontrolnih sončnic in

sončnic, inokuliranih z MII, ki so rasle v substratu s Hg, je bila primerljiva (Slika 5).

Faktorska analiza variance je pokazala, da je na suho maso korenin vplivala izpostavitev

Hg, inokulum in tudi njuna interakcija (Preglednica 2).

Preglednica 2: Rezultati faktorske ANOVA za suho maso korenin. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.

SS df MS F P

Izpostavitev Hg 2,15076 1 2,15076 33,8079 0,000006

Inokulum 1,63177 2 0,81589 12,8250 0,000181

Izpostavitev Hg*Inokulum 1,15537 2 0,57768 9,0806 0,001240

Napaka 1,46319 23 0,06362

Slika 5: Suha masa korenin sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

abab

aba

c

d

bc

ab

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

K MIEM MIBF MII

SM

kor

enin

(g)

Izpostavitev

kontrolni substrat s Hg kontaminiran substrat


19

4.2.2 Poganjki

Tako znotraj kontrolnega substrata, kot tudi znotraj s Hg kontaminiranega substrata, med

izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik (Slika 6). Suha masa poganjkov sončnic,

izpostavljenih Hg, je bila statistično večja od suhe mase poganjkov kontrolnih sončnic.

Faktorska analiza variance je pokazala, da je na suho maso poganjkov vplivala samo

izpostavitev Hg, ne pa tudi vrsta inokuluma ali njuna interakcija (Preglednica 3).

Preglednica 3: Rezultati faktorske ANOVA za suho maso poganjkov. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.

SS df MS F P

Izpostavitev Hg 34,2455 1 34,2455 91,1672 0,000000

Inokulum 0,1795 2 0,0897 0,2389 0,789425


Napaka 8,6396 23 0,3756

Slika 6: Suha masa poganjkov sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

aa

aa

bb b

b

0

1

2

3

4

5

6

K MIEM MIBF MII

SM

pog

anjk

ov (

g)

Izpostavitev



20

4.3 DOLOČANJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV

4.3.1 Klorofil a

Tako znotraj kontrolnega substrata, kot znotraj s Hg kontaminiranega substrata, med

izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik. V povprečju imajo sončnice, ki so rasle v

substratu s Hg, v poganjkih manjšo koncentracijo klorofila a (kontrolni substrat – 5,9 mg/g

SM, s Hg kontaminirani substrat – 3,4 mg/g SM) (Slika 7). S faktorsko analizo variance

smo dokazali, da je imela na koncentracijo klorofila a v poganjkih statistično značilen

vpliv samo prisotnost Hg (p < 0,05) (Preglednica 4).

Preglednica 4: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo klorofila a. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.

SS Df MS F P

Izpostavitev Hg 54,7818 1 54,7818 176,646 0,000000

Inokulum 0,7881 2 0,3941 1,271 0,299611


Napaka 7,1328 23 0,3101

Slika 7: Koncentracija klorofila a v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

a a a a

bc

cbc

bc

0

1

2

3

4

5

6

7

K MIEM MIBF MII

Kon

cen

trac

ija

klo

rofi

la a

(mg/

g S

M)

Izpostavitev



21

4.3.2 Klorofil b


izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik. V povprečju imajo sončnice, ki so rasle v

substratu s Hg, v poganjkih manjšo koncentracijo klorofila b (kontrolni substrat – 5,9 mg/g

SM, s Hg kontaminirani substrat – 1,3 mg/g SM) (Slika 8). S faktorsko analizo variance

smo dokazali, da je imela na koncentracijo klorofila b v poganjkih statistično značilen

vpliv samo prisotnost Hg (p < 0,05) (Preglednica 5).

Preglednica 5: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo klorofila b. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.

SS Df MS F P

Izpostavitev Hg 164,5419 1 164,5419 161,8667 0,000000

Inokulum 1,5857 2 0,7928 0,7799 0,470185


Napaka 23,2801 23 1,0165

Slika 8: Koncentracija klorofila b v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

a

a

aa

b

b b b

0

1

2

3

4

5

6

7

8

K MIEM MIBF MII

Kon

cent

raci

ja k

loro

fila

b(m

g/g

SM

)

Izpostavitev



22

4.3.3 Karotenoidi

Pri sončnicah, inokuliranih z MIEM, je prišlo do statistično značilnih razlik v koncentraciji

karotenoidov v poganjkih pri izpostavitvi sončnic različnim substratom (kontrola, Hg). Pri

ostalih izpostavitvah so bile koncentracije karotenoidov v poganjkih primerljive. V

povprečju imajo sončnice, ki so rasle v substratu s Hg, v poganjkih večjo koncentracijo

karotenoidov (kontrolni substrat – 10,5 mg/g SM, s Hg kontaminirani substrat – 17,4 mg/g

SM) (Slika 9). S faktorsko analizo variance smo dokazali, da je imela na koncentracijo

karotenoidov v poganjkih statistično značilen vpliv samo prisotnost Hg (p < 0,05)

(Preglednica 6).

Preglednica 6: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo karotenoidov. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.

SS Df MS F P

Izpostavitev Hg 24,4264 1 24,4264 8,7580 0,007028 Inokulum 6,3858 2 3,1929 1,1448 0,335763 Izpostavitev Hg*Inokulum 2,6144 2 1,3072 0,4687 0,631662

Napaka 64,1479 23 2,7890

Slika 9: Koncentracija karotenoidov v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

ab

b

abab

aa

aa

0

1

2

3

4

5

6

K MIEM MIBF MIIKon

cent

raci

ja k

arot

enoi

dov

(m

g/g

SM

)

Izpostavitev



23

4.4 DOLOČANJE KONCENTRACIJE ŽIVEGA SREBRA V POGANJKIH IN KORENINAH SONČNIC

4.4.1 Koncentracije živega srebra

4.4.1.1 Korenine

Korenine, ki so bile izpostavljene substratu s Hg, so imele statistično značilno višje

koncentracije Hg v koreninah v primerjavi s kontrolami. Pri sončnicah, ki so rasle v

substratu s Hg, so imele najmanjšo koncentracijo Hg v koreninah sončnice, inokulirane z

MII, medtem ko je bila koncentracija Hg v koreninah ostalih izpostavitev primerljiva in

večja. Znotraj kontrolnega substrata ni bilo statistično značilnih razlik (Slika 10). S

faktorsko analizo variance smo dokazali, da je na koncentracijo Hg v koreninah vplivala

samo izpostavitev Hg (Preglednica 7).

Preglednica 7: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo Hg v koreninah. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.

SS df MS F P

Izpostavitev Hg 0,000446 1 0,000446 259,1056 0,000000

Inokulum 0,000011 2 0,000005 3,1825 0,060233


Napaka 0,000040 23 0,000002


24

Slika 10: Koncentracija Hg v koreninah sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.4.1.2 Poganjki

Živo srebro je bilo prisotno v poganjkih vseh izpostavitev. Tako znotraj kontrolnega

substrata, kot znotraj s Hg kontaminiranega substrata, med izpostavitvami ni bilo

statistično značilnih razlik. V povprečju pa imajo sončnice, ki so rasle v substratu s Hg,

statistično značilno večjo koncentracijo Hg v poganjkih (Slika 11). S faktorsko analizo

variance smo dokazali, da je na koncentracijo Hg v poganjkih vplivala samo izpostavitev

Hg (Preglednica 8).

Preglednica 8: Rezultati faktorske ANOVA za koncentracijo Hg v poganjkih. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.

a a a a

c c

c

b

0

2

4

6

8

10

12

K MIEM MIBF MII

Kon

cen

trac

ija

Hg

v k

oren

inah

(µ

g/g

SM

)

Izpostavitev


SS df MS F P

Izpostavitev Hg 0,000000 1 0,000000 9,1548 0,006213

Inokulum 0,000000 2 0,000000 0,4596 0,637447


Napaka 0,000001 22 0,000000


25

Slika 11: Koncentracija Hg v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.4.2 Translokacijski faktor za Hg

S translokacijskim faktorjem za Hg smo pokazali statistično značilen vpliv MII na

translokacijo Hg iz korenin v poganjke sončnic (Slika 12).

Slika 12: Translokacijski faktor za Hg v sončnici pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji.

aab

ab

abcac

c

acac

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

K MIEM MIBF MII

Kon

cen

trac

ija

Hg

v po

gan

jkih

(µ

g/g

SM)

Izpostavitev


a

a a

b

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

K MIEM MIBF MII

Tra

nsl

okac

ijsk

i fak

tor

za H

g

Izpostavitev


26

Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.4.3 Vsebnost živega srebra

4.4.3.1 Korenine

Znotraj kontrolnega substrata je bila vsebnost Hg v koreninah primerljiva oziroma pod

mejo detekcije. V povprečju imajo sončnice, ki so rasle v substratu s Hg, statistično

značilno višje vsebnosti Hg v koreninah v primerjavi s sončnicami iz kontrolnega

substrata. Pri izpostavitvi sončnic v substratu s Hg so bile prisotne statistično značilne

razlike v vsebnosti Hg v koreninah med inokulumi. Največjo vsebnost Hg v koreninah smo

zabeležili pri sončnicah, inokuliranih z MIEM, najmanjšo pa pri sončnicah, inokuliranih z

MII (Slika 13). Faktorska analiza variance je pokazala, da je na vsebnost Hg v koreninah

vplivala izpostavitev Hg, inokulum in tudi njuna interakcija (Preglednica 9).

Preglednica 9: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v koreninah. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.

SS df MS F P

Izpostavitev Hg 621,5575 1 621,5575 57,70407 0,000000

Inokulum 158,0920 2 79,0460 7,33846 0,003428


Napaka 247,7437 23 10,7715


27

Slika 13: Vsebnost Hg v koreninah sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.4.3.2 Poganjki


izpostavitvami ni bilo statistično značilnih razlik. Vsebnost Hg v poganjkih, izpostavljenih

s Hg, je bila statistično značilno večja od vsebnosti Hg v poganjkih kontrolnih sončnic

(Slika 14). Faktorska analiza variance je pokazala, da je na vsebnost Hg v poganjkih

vplivala samo prisotnost Hg, ne pa tudi vrsta inokuluma ali njuna interakcija (Preglednica

10).

Preglednica 10: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v poganjkih. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.

SS Df MS F P

Izpostavitev Hg 22,9473 1 22,9473 25,4395 0,000042

Inokulum 0,5498 2 0,2749 0,3047 0,740241


Napaka 20,7467 23 0,9020

a a a a

c

d

bc

b

0

5

10

15

20

25

K MIEM MIBF MIIVse

bno

st H

g v

kore

nin

ah (

µg)

Izpostavitev



28

Slika 14: Vsebnost Hg v poganjkih sončnic pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

4.4.3.3 Skupna vsebnost Hg v sončnicah

Kot že omenjeno na koncentracijo kovin vpliva hitrost rasti rastline in tako prihaja do

redčitvenega oziroma koncentracijskega efekta. Znotraj kontrolnega substrata v skupni

vsebnosti Hg v rastlini ni bilo statistično značilnih razlik. Pri izpostavitvi sončnic s Hg so

bile prisotne statistično značilne razlike v vsebnosti Hg v rastlini med inokulumi, kjer smo

pri MIEM zabeležili najvišjo skupno vsebnost Hg v rastlini, pri sončnicah inokuliranih z

MII, pa najmanjše (Slika 15). Faktorska analiza variance je pokazala, da je na skupno

vsebnost Hg na rastlino vplivala izpostavitev Hg, inokulum in tudi njuna interakcija

(Preglednica 11).

Preglednica 11: Rezultati faktorske ANOVA za vsebnost Hg v koreninah. Faktorji s statistično značilnim vplivom so podani z odebeljenimi črkami (p<0,05). Simboli: SS – vsota kvadratov, df – stopnja prostosti, MS – povprečje kvadratov, F – F-test.

SS df MS F P

Izpostavitev Hg 883,361 1 883,361 67,71621 0,000000

Inokulum 175,735 2 87,868 6,73570 0,004982


Napaka 300,036 23 13,045

a a aa

b

b

b

b

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

K MIEM MIBF MII

Vse

bnos

t H

g v

poga

njk

ih (µ

g)

Izpostavitev



29

Slika 15: Skupna vsebnost Hg korenin in poganjkov pri različnih izpostavitvah. Legenda: K – kontrola, MIEM – sončnice, inokulirane s komercialnim mikrobnim inokulumom EM (Micronatura), MIBF – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na njivi za Biotehniško fakulteto, MII – sončnice, inokulirane z mikrobnim inokulumom, izoliranim iz vzorca tal, nabranega na vrtu v Idriji. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p < 0,05).

a a a a

c

d

c

b

0

5

10

15

20

25

K MIEM MIBF MII

Vse

bn

ost

Hg

v ra

stli

ni (

µg)

Izpostavitev



30

5 DISKUSIJA

5.1 KOLONIJE

Kontrolo kakovosti pripravljenih mikrobnih inokulumov smo preverjali z metodo štetja

kolonij z razmazovanjem. V MII in MIBF je bilo prisotno podobno število

mikroorganizmov, medtem ko smo v MIEM našteli bistveno manj kolonij. Čeprav je bilo

prisotnih manj mikroorganizmov, je MIEM v primerjavi z drugimi, še vedno imel močnejši

vpliv na biomaso korenin sončnic in vsebnost Hg v koreninah.

Kolonije so bile med različnimi mikrobnimi inokulumi po makromorfoloških lastnosti

podobne. Na podlagi pridobljenih rezultatov predvidevamo, da kljub tem podobnostim,

združbe mikroorganizmov niso bile enake, saj so bile prisotne statistično značilne razlike v

biomasi korenin in koncentracijah Hg v koreninah med inokulumi.

5.2 BIOMASA SONČNIC

V našem poskusu se je pri biomasi korenin pokazal statistično značilen vpliv MIEM na

korenine sončnic, ki so rasle v substratu s Hg, medtem ko so bile vrednosti med ostalimi

izpostavitvami primerljive. Sončnice, ki so bile izpostavljene MIEM v substratu s Hg, so

imele v povprečju enkrat večjo biomaso korenin. Predvidevamo, da so ti rezultati posledica

delovanja fototrofnih in mlečnokislinskih bakterij ter kvasovk, za katere proizvajalci trdijo,

da pripomorejo k močnejšemu koreninskemu sistemu. Ta vpliv ni bil opazen pri kontrolnih

sončnicah in ga ne znamo pojasniti.

Do podobnih zaključkov so leta 2013 prišli tudi Quinones in sod. Semena od Lupinus

albus so kalili v substratu z različnimi koncentracijami Hg (0, 50, 100, 150 in 200 mg/kg)

in jih ob tem inokulirali s Hg-tolerantnimi in s Hg-občutljivi sevi. Opazili so, da rastline, ki

so rasle do koncentracije 50 µM substratu s Hg, niso imele značilnih fenotipičnih razlik v

odvisnosti od vrste bakterij. To so pripisali dejstvu, da so rastline, kljub izpostavitvi Hg

sposobne obdržati homeostazo, ne da bi pri tem prišlo do učinkov strupenosti.

5.3 FOTOSINTEZNI PIGMENTI

Prisotnost prekomerne koncentracije kovin v rastlinah lahko negativno vpliva na njihovo

delovanje, zlasti na fotosintezo. Težke kovine so sposobne zavirati delovanje nekaterih

fotosinteznih encimov in biosintezo klorofila. Kovine lahko poškodujejo tudi tilakoidno


31

membrano in na ta način motijo elektronsko prenašalno verigo elektronov (Aggarwal in

sod., 2011).

S poskusom smo dokazali, da tako znotraj kontrolnega substrata, kot znotraj s Hg

kontaminiranega substrata, med različnimi izpostavitvami ni bilo statistično značilnih

razlik, kar kaže na to, da mikrobne združbe niso imele vpliva na koncentracijo klorofilov v

poganjkih. Koncentracija klorofila a in b je bila pri sončnicah, ki so rasle v substratu s Hg,

manjša. Znano je, da Hg velikokrat nadomesti atome magnezija v klorofilu, s čimer zavira

fotosintezo (Patra in Sharma, 2000). Kot posledico Hg, so zmanjšano vsebnost klorofilov

na sadikah kumar ugotovili tudi Cargnelitti in sod. (2006). To so pripisali sintezi prostih

kisikovih radikalov, ki povzročajo peroksidacijo membran in zavirajo sintezo klorofila. V

našem poskusu so bile koncetracije Hg v poganjkih relativno majhne (pod 1 µg g-1), zato

zmanjšanje koncentracije klorofilov ne moremo neposredno pripisati Hg, nakopičenem v

poganjkih. Najverjetneje gre za posredne vplive preko koreninskega sistema, kjer Hg

zaradi negativnih interakcij s celično steno in membrano moti privzem mineralnih hranil,

kot so magnezij (Mg) in železo (Fe), ki sta potrebna za sintezo klorofila (Boening, 2000).

5.4 KONCENTRACIJE HG V SONČNICAH

S pridobljenimi rezultati smo potrdili našo hipotezo, da se bo večina Hg akumuliralo v

koreninah, saj služijo kot ovira za prenos Hg v nadzemne dele. Pri kontrolnih sončnicah

smo v poganjkih zasledili Hg kot posledica volatilizacije Hg0 iz lončkov, medtem ko je bil

v koreninah kontrolnih sončnic Hg pod mejo detekcije.

Naši rezultati so pokazali statistično značilen vpliv MII na koncentracijo Hg v koreninah.

Koncentracija Hg je bila statistično značilno manjša v primerjavi z ostalimi izpostavitvami.

Pri rastlinah učinkovitost privzema in translokacijo kovine v poganjke ocenimo s

translokacijskim faktorjem (TF). Gre za razmerje med koncentracijami težkih kovin v

poganjkih in koreninah. Če je razmerje med poganjki in koreninami >1, se težke kovine v

manjši meri zadržujejo v koreninah, ker se po ksilemu transportirajo v poganjke (Baker,

1981). V našem poskusu je bil TF značilno <1, vendar so bile med izpostavitvami opazne

razlike. TF se je pri MII statistično značilno razlikoval od ostalih izpostavitev.

V koreninah, ki so rasle v substratu s Hg, je bila koncentracija Hg ob dodatku MII

statistično značilno nižja, medtem ko v poganjkih statistično značilnih razlik ni bilo. Zato


32

predvidevamo, da so bile pri MII prisotne takšne bakterije, ki znižujejo koncentracijo Hg v

koreninah s tem, da povečujejo translokacijo Hg v poganjke. Predvidevamo, da je šlo več

Hg iz korenin po ksilemu v poganjke, ki je nato volatiliziral v atmosfero in se usedal nazaj

na liste. Ker koncentracije volatiliziranega Hg nismo izmerili, tega ne moremo z gotovostjo

trditi.

Do podobnih rezultatov so prišli tudi Heaton in sod. (1998), ki so rastline, izpostavljene

Hg, inokulirali z bakterijami, ki vsebujejo gene merA in merB. Predpostavljali so, da lahko

merA rastline transformirajo koreninam dostopen Hg2+ v manj toksično Hg0, ki nato

volatilizira in posledično zniža koncentracijo Hg v koreninah. Tega pri našem poskusu ne

moremo potrditi, saj imamo le podatek, da so bili mikrobi izolirani iz vrta v Idriji. Da bi

ugotovili, ali smo imeli znotraj MII bakterije, ki so vsebovale gene merA, bi bilo potrebno

opraviti verižno reakcijo s polimerazo.

V nasprotju z našim poskusom so de Souza in sod. (1999) na močvirnatih rastlinah

preučevali vpliv rizosfernih bakterij na akumulacijo selena (Se) in Hg. V rastlini se je v

prisotnosti rizosfernih bakterij akumuliralo za 70-80 % več Se v koreninah in za 40-60 %

več Se v poganjkih, v primerjavi z neinokuliranimi rastlinami. V prisotnosti bakterijskega

inokuluma se je povečala tudi koncentracija Hg v koreninah, in sicer za 35-65 %.

S pomočjo koncentracij Hg (µg/g SM) in celotne mase korenin in poganjkov (g) smo

preračunali tudi vsebnost Hg v rastlini. Rezultati so pokazali statistično značilen vpliv

MIEM na biomaso in koncentracijo Hg v sončnicah. Vsebnost Hg v koreninah sončnic,

izpostavljenih MIEM, je bila v povprečju enkrat večja kot pri ostalih izpostavitvah, zaradi

enkrat večje biomase korenin.

V poganjkih med različnimi izpostavitvami v substratu s Hg, so bile koncentracije Hg

primerljive in večje od kontrolnih. Kontrolne sončnice so rasle v drugi komori pri istih

razmerah, vendar so kljub temu vsebovale nekaj Hg. Verjetno gre za kopičenje Hg0 v

zračnem prostoru komor, ki je lahko posledica kontaminacije z predhodnjimi poskusi na

Hg.


33

6 SKLEPI

• Sončnice, inokulirane z MII, v prisotnosti Hg, niso rasle bolje od rastlin,

inokuliranih z MIBF in MIEM.

• Največje koncentracije Hg so bile prisotne v koreninah sončnic.

• MII je zmanjšal akumulacijo Hg v korenine s tem, da je povečal translokacijo iz

korenin v poganjke.

• Različne združbe mikrobnih inokulumov niso vplivale na rast sončnic v substratu s

Hg, razen MIEM, ki je povečal maso koreninskega sistema, s tem pa tudi privzem

Hg v korenine. Na to temo predlagam nadaljnje raziskave ali je MIEM dejansko

dobro uporabljati, kadar so v tleh prisotne težke kovine.


34

7 VIRI

Aggarwal ., Sharma I., Tripathi B.N., Munjal A.K., Baunthiyal M., Sharma V. 2011. Metal

toxicity and photosynthesis. Department of bioscience and biotechnology, 16:

229-236.

Baker A.J.M. 1981. Accumulators and excluders: strategies in the response of plants to

heavy metals. J. Plant Nutrition, 3: 643-654.

Bakir F., Damluji S.F., Amin-Zaki L., Murtadha M., Khalidi A., Al-Rawi N.Y., Tikriti S.,

Dhahir H.I., Clarkson T.W., Smith J.C., Doherty R.A. 1973. Methylmercury

poisoning in Iraq. Science, 181, 4096: 230-241.

Barkay T., Miller S.M., Summers A.O. 2003. Bacterial mercury resistance from atoms to

ecosystems. FEMS Microbiology reviews, 27: 355-384.

Barkay T., Wagner-Dobler I. 2005. Microbial transformation of mercury: potentials,

challenges and achievements in controlling mercury toxicity in the environment.

Advances in applied microbiology, 57: 1-52.

Benoit J.M., Gilmour Cynthia C., Heyes A., Mason R.P., Miller C. 2003. Geochemical and

biological controls over methylmercury production and degradation in aquatic

ecosystems. Biogeochemistry of environmentally important trace elements, 262-

297.

Boening D.W. 2000. Ecological effects, transport and fate of mercury: a general review.

Chemosphere, 40, 12: 1335-51.

Brenčič J., Lazarini F. 1995. Splošna in anorganska kemija. Ljubljana: DZS.

Cargnelutti D., Tabaldi L.A., Spanevello R.M., Jucoski G.O., Battisti V., Redin M.,

Linares C.E.B., Dressler V.L., Flores M.M., Nicoloso F.T., Morsch V.M.,

Schetinger M.R.C. 2006. Mercury toxicity induces oxidative stress in growing

cucumber seedlings. Chemosphere, 65, 6: 999–1006.

Compeau G.C., Bartha R. 1985. Sulfate-Reducing Bacteria: principal methylators of

mercury in anoxic estuarine sediment. Applied and environmental microbiology,

50, 2: 498-502.


35

Čadež P., Mahne I. 2005. Praktikum iz fiziologije mikroorganizmov, http://web.bf.uni-

lj.si/zt/mikro/homepage/Praktikumfiziologija.pdf

EPA: Rice G.E., Bullock O.R., Ambrose R.B., Swartout J. 1997. Fate and transport of

mercury in the environment. Mercury study report to congress, 3.

Glick B.R. 2010. Using soil bacteria to facilitate phytoremediation. Biotechnology

advances, 28, 367-374.

Gochfeld M. 2003. Cases of mercury exposure, bioavailability, and absorption.

Ecotoxicology and environmental safety, 56, 1: 174-179.

Graan T., Ort D.R. 1984. Quantitation of the rapid electron donors to P700, the functional

plastoquinone pool and the ratio of the photosystems in spinach chloroplasts. J.

Biol. Chem. 259: 14,003-14,010.

Gracey, H. I. & J. B. W. Stewart. 1974. Canad. J. Soil Sci. 54: 105.

Heaton A.C.P., Rugh C.L., Wang N., Meagher R.B. 1998. Phytoremediation of mercury-

and methylmercury- polluted soils using genetically engineered plants. Journal of

Soil Contamination, 7, 4:497-509.

Henry J.R. 2000. An overview of the phytoremediation od lead and mercury. NNEMS

Report. Washinton, D.C.

Jensen S., Jernelov A. 1969. Biological methylation of mercury in aquatic organisms.

Nature, 223, 753-754.

Kapulnik Y., Okon Y. 1996. Plant growth promotion by rhizosphere bacteria. University of

Michigan Library, 48, 869-885.

Khan A.G., Kuek C., Chaudhry T.M., Khoo C.S., Hayes W.J. 2000. Role of plants,

Mycorrhizae and phytochelators in heavy metal contaminated land remediation.

Chemosphere, 41: 197-207.

Kelly C.A., Rudd J.W.M., Louis V.L. Heyes A. 1995. Is total mercury concentration a

good predictor of methyl mercury concentration in aquatic systems. Water, air and

soil pollution, 80, 1: 715-724.


36

Monni S., Uhlig C., Junttila O., Hansen E., Hynynen J. 2001. Chemical composition and

ecophysiological responses of Empetrum nigrum to above ground element

application. Environmental Pollution 112: 417-426.

Moorby H., White R.E., Nye P.H. 1988. The influence of phosphate nutrition on H+ ion

efflux from the roots of young rape plants. Plant and Soil, 105: 247-256.

Nascimento A.M.A., Chartone-Souza E. 2003. Operon mer: Bacterial resistance to

mercury and potential for bioremediation of contaminated environments. Genetics

and molecular research, 2, 1: 92-101.

Oremland R.S., Culbertson C.W., Winfrey M.R. 1991. Methylmercury decomposition in

sediments and bacterial cultures: involment of methanogens and sulfate reducers

in oxidative demethylation. Applied and environmental microbiology, 57, 1: 130-

137.

Osborn A.M., Bruce K.D., Strike P., Ritchie D.A. 1997. Distribution, diversity and

evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon. FEMS

Microbiological reviews, 19, 4: 239-262.

Patra A., Sharma A. 2000. Mercury toxicity in plants. The Botanical review, 66, 3: 379-

422.

Quiñones M.A., Ruiz-Díez B., Fajardo S., López-Berdonces M.A., Higueras P.L.,

Fernández-Pascual M. (2013). Lupinus albus plants acquire mercury tolerance

when inoculated with an Hg-resistant Bradyrhizobium strain. Plant physiology

and biochemistry, 73: 168-175.

Robinson J.B., Tuovinen O.H. 1984. Mechanisms of microbial resistance and

detoxification of mercury and organomercury compounds: physiological,

biochemical and genetic analyses. Microbiological Reviews, 48, 2: 95-124.

Stamenkovic J., Gustin M.S., Marvin-DiPasquale M.C., Thomas B.A., Agee J.L. 2004.

Distribution of total and methyl mercury in sediments along Steamboat Creek

(Nevada, USA). Science of the total environment, 300: 167-177.


37

de Souza M.P., Huang C.P., Chee N., Terry N. 1999. Rhizosphere bacteria enhance the

accumulation of selenium and mercury in wetland plants. Planta, 209, 2: 259-263.

Urbanc M. 2010. Idrijski rudnik živega srebra. DEDI - digitalna enciklopedija naravne in

kulturne dediščine na Slovenskem, http://www.dedi.si/dediscina/220-idrijski-

rudnik-zivega-srebra.

Wood J.M. 1974. Biological cycles for toxic elements in the environment. Science, 183,

4129: 1049-1052.

Wood J.M. 1984. Alkylation of metals and the activity of metal alkyls. Toxicological and

environmental chemistry, 7, 3: 229-240.

Yan-de J., Zhen-li H., Xiao-e Y. 2007. Role of soil rhizobacteria in phytoremediation of

heavy metal contaminated soils. Journal of Zhejiang university-Science B, 8, 3:

192-207.

Zayed A.M., Lytle C.M., Terry N. 1998. Accumulation and volatilization of different

chemical species of selenium by plants. Planta, 206: 284-292.

ZAHVALA

Iskreno se zahvaljujem svoji mentorici prof. dr. Katarini Vogel Mikuš, ki mi je prijazno

pomagala in svetovala pri izdelavi diplomske naloge. Iz srca se ji zahvaljujem za ves

trud in čas, ki mi ga je namenila; le z njeno pomočjo in strokovnim znanjem je lahko

nastalo to diplomsko delo.

Zahvaljujem se tudi ostalima članoma komisije za hiter pregled diplomskega dela in

predlagane popravke.

Najlepše se zahvaljujem dr. Evi Kovačec, ki mi je pri izdelavi diplomske naloge ves čas

pomagala in me usmerjala pri praktičnem in teoretičnem delu naloge.

Zahvaljujem se tudi mladim raziskovalkam (doktorantkam) Anji Kavčič, Mateji Potisek

in Marti Debeljak za njihovo pomoč, nasvete in usmeritve.

Hvala Mileni Kubelj za praktično usmeritev poskusa in Nini Brudar za pomoč pri

izvajanju praktičnega dela.

Navsezadnje se najbolj zahvaljujem svoji družini, ki so mi omogočili študij in mi s tem

odprli svet. Hvala za vso njihovo podporo, razumevanje in potrpežljivost v času študija.

Documents

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA TANJA MURNpefprints.pef.uni-lj.si/3883/1/DIPLOMA_koncna_PDF.pdf · HNO 3 dušikova(V) kislina HCl klorovodikova kislina IS inertni standard