Univerzita Palackého v Olomouci

Bakalárska práca

Olomouc 2013 Romana Vidová

Univerzita Palackého v Olomouci

Prírodovedecká fakulta

Katedra bunkovej biológie a genetiky

Cytologická charakterizácia nových položiek v

medzinárodnej génovej banke banánovníku

(Musa sp.)

Bakalárska práca

Romana Vidová

Študijní program: Biológia

Študijní odbor: Molekulárna a bunková biológia

Forma štúdia: Prezenčná

Olomouc 2013 Vedúca práce: Mgr. Eva Hřibová, Ph.D.

Prehlásenie

Prehlasujem, že som túto bakalársku prácu vypracovala samostatne pod vedením

Mgr. Evy Hřibové, Ph.D. a uviedla som kompletnú literatúru a použité zdroje.

V Olomouci dňa 22.4.2013 .........................................

Súhrn

Predkladaná bakalárska práca sa zaoberá cytologickou charakterizáciou vybraných

zástupcov rodu Musa (čeľaď Musaceae, rad Zingiberales) novo začlenených do génovej

banky – International Transit Centre (ITC) Lovaň, Belgicko. K metódam charakterizácie

patrila hlavne prietoková cytometria na určenie obsahu jadrovej DNA a stupňa ploidie

a tiež cytogenetické metódy, ktorými bol určovaný počet chromozómov farbením DAPI.

Cieľom teoretickej časti bakalárskej práce bolo vypracovanie literárnej rešerše na

zadanú tému.

Cieľom praktickej časti bola cytologická charakterizácia 23 nových položiek rodu

Musa pochádzajúcich z ITC kolekcie v génovej banke banánovníka. Získané výsledky

prispeli k porozumeniu genetickej diverzity a evolúcie rodu Musa a v kombinácii

s fragmentačnou analýzou pomohli objasniť pôvod analyzovaných položiek.

V rámci predkladanej štúdie bolo analyzovaných celkom 23 položiek rodu Musa,

ktoré boli charakterizované len na základe morfo-taxonomických znakov. Tento súbor

obsahoval zástupcov všetkých štyroch sekcií – Eumusa, Rhodochlamys, Australimusa

a Callimusa a u jednej položky – M. yunnanensis, ktorá na základe morfo-taxonómie

nebola zaradená do sekcie. Z hľadiska konštitúcie genómu boli študované ako

pravdepodobné diploidné plané druhy, tak ich pravdepodobné hybridné klony. Najmenšiu

veľkosť genómu v rámci skúmaných druhov bola zistená u klonu M. itinerans var.

itinerans (sekcia Eumusa). Naopak u klonu M. borneensis (sekcia Callimusa) bola

stanovená doposiaľ najväčšia zistená veľkosť genómu.

Summary

The propounded bachelor’s thesis deals with cytological characterization of

selected species of genus Musa (family Musaceae, order Zingiberales) which were newly

integrated into Musa gene bank – International Transit Centre (ITC) Leuven, Belgium. The

flow cytometry was used to estimate the nuclear genome size and the ploidy level of 23

analyzed accessions. Additionally to flow cytometry, cytological methods were used to

estimate the basic chromosome number of most of all evaluated Musa accessions.

The aim of this work was cytological characterization of 23 species of genus Musa

which were obtained from ITC collection.The results contributed to understanding of

genetic diversity and evolution of genus Musa and in combination with SSR genotyping

using 19 microsatellite markers helped to clarify the origin of analyzed species.

Within the frame of propounded, the DNA content and the basic chromosome

number of 23 accessions from genus Musa were analyzed and in combination with SSR

results, their taxonomy was clarified. 23 analyzed species represented accessions from all

four Musa sections – Eumusa, Rhodochlamys, Australimusa and Callimusa and one

species – M. yuannensis and were not assigned to section, based on morpho-taxonomy.

The smallest genome size was in clone M. itinerans var. itinerans (Eumusa section). On

the contrary, M. borneensis (Callimusa section) contains the biggest genome size estimated

so far.

Poďakovanie

Chcela by som poďakovať vedúcej bakalárskej práce Mgr. Eve Hřibové, Ph.D. za

jej ochotu, trpezlivosť a hodnotné rady, ktoré mi poskytla počas písania mojej bakalárskej

práce. Ďakujem tiež Mgr. Jane Čížkovej, za jej trpezlivosť a praktické rady pri tvorbe

experimentálnej časti mojej bakalárskej práce.

Obsah

1 Úvod ................................................................................................................................... 1

2. Súčasný stav riešenej problematiky ................................................................................... 3

2.1 Všeobecná charakteristika banánovníkov .................................................................... 3

2.1.1Charakteristika banánovníkov ................................................................................ 3

2.1.2 Morfológia banánovníkov ..................................................................................... 4

2.1.3 Taxonomická klasifikácia ..................................................................................... 5

2.1.4 Význam banánovníkov .......................................................................................... 8

2.2 Jadrový genóm ............................................................................................................. 8

2.2.1 Jadrový genóm banánovníka ............................................................................... 10

2.3 Prietoková cytometria ................................................................................................ 13

2.3.1 Základné princípy a súčasti ................................................................................. 13

2.3.2 Príprava suspenzie jadier ..................................................................................... 15

2.3.3 Stanovenie ploidie a obsahu jadrovej DNA ........................................................ 16

2.3.4 Kľúčový parameter cytometrických analýz – presnosť ...................................... 19

2.4 Génové banky ............................................................................................................ 20

2.4.1 Génová banka banánovníkov .............................................................................. 21

2.4.2 Problémy v génovej banke banánovníkov .......................................................... 22

2.4.3 Uchovávanie diverzity z pohľadu génových bánk .............................................. 22

2.4.4 Charakterizácia nových položiek v génovej banke ............................................ 23

3 Ciele práce ........................................................................................................................ 26

4 Materiál a metodika .......................................................................................................... 27

4.1Materiál ....................................................................................................................... 27

4.1.1 Rastlinný materiál ............................................................................................... 27

4.1.2 Prístroje ............................................................................................................... 28

4.1.3 Roztoky a pufry ................................................................................................... 29

4.2 Metodika .................................................................................................................... 31

4.2.1 Fixácia korienkov ................................................................................................ 31

4.2.2 Príprava suspenzie protoplastov a nakvapkávaných preparátov ......................... 32

4.2.3 Určenie počtu chromozómov .............................................................................. 32

4.2.4 Príprava preparátov pre prietokovú cytometriu .................................................. 33

4.2.5 Určenie obsahu jadrovej DNA ............................................................................ 33

5 Výsledky ........................................................................................................................... 34

5.1 Výsledky z fluorescenčného mikroskopu .................................................................. 35

5.2 Analýza dát z prietokového cytometra ...................................................................... 37

6 Diskusia a záver ................................................................................................................ 39

7 Literatúra .......................................................................................................................... 43

8 Zoznam použitých skratiek a symbolov ........................................................................... 49

9 Prílohy .............................................................................................................................. 51

1

1 Úvod

Banánovník (Musa spp.) patrí k trvácnym jednoklíčnolistovým rastlinám, ktoré už

dnes rastú takmer v celej oblasti subtrópov a trópov. Samotný rod Musa však patrí spolu

s rodmi Ensete a Musella do čeľade Musaceae. V rode Musa sa rozlišujú štyri ďalšie

sekcie, a to Australimusa, Callimusa, Eumusa a Rhodochlamys. Z týchto sekcií je najviac

skúmaná a rozšírená Eumusa, keďže sa v nej nachádza väčšina jedlých druhov

banánovníkov. Taxonomická klasifikácia rodu Musa, jeho štyroch sekcií a celej čeľade

Musaceae však nie je doposiaľ jasná, stále prebiehajú molekulárne a cytologické výskumy.

Tieto skúmania už z časti objasnili a spresnili tradičný systém, ktorý sa zakladal hlavne na

stupni ploidie a morfológii banánovníkov.

Cytologické a genetické štúdie preukázali, že prevažná väčšina jedlých druhov

vznikla prirodzenou hybridizáciou dvoch diploidných druhov Musa acuminata (genóm A)

a Musa balbisiana (genóm B). Tieto plané druhy pôvodne pochádzajú z juhovýchodnej

časti Ázie. Vačšina dnes kultivovaných druhov sú sterilné, množia sa len vegetatívne a sú

buď diploidné, triploidné alebo tetraploidné klony na základe rôznych kombinácií

pôvodných genómov A a B.

Banány odrody 'Cavendish' (genóm AAA) sú sladké a sú základným vývozným

a konzumným tovarom mnohých krajín strednej Ameriky a je na nich založená ich

ekonomická stabilita. Približne 90% celkovej svetovej produkcie banánov je zdrojom

obživy pre desiatky miliónov ľudí vo vyše 120 krajinách, prevažná väčšina sú rozvojové

krajiny vo svete. Veľká väčšina pestovaných druhov banánov sú tzv. škrobové banány,

ktoré sa smú konzumovať až po ich tepelnej úprave. Nazývajú sa „cooking“ banány

(genóm ABB) a „plaintains“ (AAB) nie sú prednostne určené na vývoz, ale výlučne na

spotrebu pre miestnych obyvateľov.

Banánovníky sú náchylné k rôznym bakteriálnym a hubovým ochoreniam, ktoré

neustále ohrozujú produkciu banánov. Na ochranu pred patogénmi sa používajú veľké

množstvá pesticídov, ktoré sú zaťažujúce ako pre životné prostredie, tak pre konzumentov.

Stúpajú tým však aj náklady na pestovanie. Štúdium banánovníkov, znalosť štruktúry ich

genómu, pôvodu a genetickej diverzity je veľmi dôležité z hľadiska šľachtenia nových

rezistentných druhov. Nie je to však jednoduchá úloha, pretože genóm banánovníkov je

2

zložitý, hlavne kvôli medzidruhovej hybridizácii, heterozygotnosti a ich kombinovanej

polyploidii.

3

2. Súčasný stav riešenej problematiky

2.1 Všeobecná charakteristika banánovníkov

2.1.1Charakteristika banánovníkov

Banánovníky patria do skupiny jednoklíčnolistových trvácnych bylín a dnes ich

nájdeme hlavne v tropických i subtropických oblastiach. Ich domestifikácia začala

približne pred 7000 rokmi v oblasti juhovýchodnej Ázie, kde pravdepodobne aj vznikli

a odkiaľ boli následne rozšírené do ďalších oblastí. A približne pred 3500 rokmi ich začali

používať a využívať ľudia. Do Európy, resp. najprv do Stredomoria priniesli banánovník

vojská Alexandra Veľkého a neskôr sa o rozšírenie zaslúžili Arabi. Na Obr. 1 je zaznačený

pôvodný areál rozšírenia jednotlivých sekcií rodu Musa.

Obr. 1 Pôvodný areál rozšírenia jednotlivých sekcií rodu Musa

4

Plané druhy sa rozmnožujú vegetatívne oddenkami, ale i semenami na rozdiel od

partenokarpických jedlých typov, ktoré sa množia výhradne vegetatívne a tvoria

bezsemenné plody.

Napriek tomu, že banány patria k jedným z najdôležitejších plodín na svete,

odhadom zhruba 87% produkcie je určené výhradne len pre potrebu a spotrebu lokálnych

obyvateľov (De Langhe et al., 2009). Banánovníky ale majú široké využitie, ich

konzumácia je len jednou z ich predností. Miestni obyvatelia konzumujú plané banány

tepelne spracované, ale i surové a sú pre nich plodina porovnateľná so zemiakmi u nás. Po

fermentácii takmer zrelých banánov je možné pripraviť banánové pivo a z nápojov sú to

i banánové likéry a mlieko. Škrobové banány je možné nasušiť a pomlieť na banánovú

múčka a z nezrelých plodov sa tiež praží nepravá káva. Často sa využívajú aj listy

niektorých druhov, z ktorých sa získava pevné vlákno pre textilný priemysel. Používajú sa

aj ako strešná krytina a vyrába sa z nich krmivo pre dobytok a vosk.

2.1.2 Morfológia banánovníkov

Banánovníky patri k trvalým rastlinám, ktoré dorastajú do výšky 2-3m. Niektoré

plané druhy však môžu dosahovať výšku 10-15m. Nepravý kmeň (pseudostem)

banánovníkov je tvorený zavinutými pošvami listov, ktorého stredom vyrastá stvol

ukončený kvetom (Obr. 2). Listy majú pozdĺžny až oválny tvar. Koreňový systém

banánovníka je radiálny. Banánovník kvitne, keď na ňom narastie 50-60 listov a kvety sú

zygomorfné a usporiadané do vrcholíkovitého kvetenstva. Kvety majú spodný semenník

obklopený 5 tyčinkami a 1 staminodiom a chránený 5 zrastenými a 1 voľným okvetným

lístkom. Plodom u jedlých druhov je bezsemenná bobuľa, no planých druhov sa vyskytujú

semená, ktoré znemožňujú konzumáciu týchto druhov.

Najčastejšie pestovaným typom banánovníku určeného na export je triploidný klon

– 'Cavendish' (AAA). Dosahuje len 2,5m, ale je menej náročný na pestovateľské

podmienky – stačí jej nižšia teplota a menšia vlhkosť vzduchu. Vďaka tomu rastie takmer

celoročne, s teplotou od 22-28°C. Je to najmä od jari do jesene, keď je aj dostatok svetla.

5

Obr. 2 Morfológia banánovníka

(http://old.iita.org/medialib/displayimage.php?pid=6756&fullsize=1)

2.1.3 Taxonomická klasifikácia

Rod Musa patrí do čeľade Musaceae. Tá sa taxonomicky zaraďuje do systému:

ríša Plantae (rastliny)

oddelenie Magnoliophyta (magnóliorasty)

trieda Liliopsida (jednoklíčnolistové)

podtrieda Commelinidae (podenkové)

rad Zingiberales (ďumbierotvaré)

čeľaď Musaceae (banánovníkovité).

radiálny koreňový systém

nová rastlina

vyrastená oddenkami

samčí kvet

plody

nepravý koreň -

pseudostem

listy

6

čeľaď

rod

príbuzné sekcie

Obr. 3 Taxonomická klasifikácia čeľade Musaceae

Podtrieda Commelinidae obsahuje okrem radu Zingiberles ešte rady Commelinales,

Poales a Arecales, ktoré patria k ekonomicky veľmi významným rastlinám a plodinám.

Rad Zingiberales zahŕňa okrem čeľade Musaceae ešte ďalších sedem čeľadí, ktorých

zástupci sa využívajú predovšetkým ako dekoračné rastliny, ale tiež vo farmaceutickom či

kozmetickom priemysle. Celkovo sa do rodu Musa počíta viac než 2000 kultivarov. Čeľaď

Musaceae (Obr. 3) pozostáva z troch rodov: Musa, Ensete a Musella. Taxonomická

klasifikácia na úrovni druhu pramení z tradičného systému, ktorý berie do úvahy

morfologickú charakterizáciu a základné chromozómové číslo.

Rod Musa zahŕňa približne 50 druhov a obsahuje všetky jedlé typy banánovníkov.

Tento rod sa delí do ďalších štyroch (niekedy piatich) pomocných taxonomických

skupín/sekcií, Eumusa a Rhodochlamys s chromozómovým číslom x = 11, Australimusa

(x = 10) a Callimusa (x = 9 alebo x = 10) (Cheesman, 1947; Simmonds a Weatherup, 1990;

Doležel a Bartoš, 2005). Argent (1976) popísal samotnú piatu sekciu Igentimusa, ktorá

obsahuje len jediný druh M. igens, x = 7. Wong et al. (2002) na základe AFLP analýzy

navrhol, aby sa zlúčili sekcie Eumusa-Rhodochlamys a Australimusa-Callimusa. Tento

návrh podporila aj fylogenetická analýza ITS sekvencií (Li et al., 2010; Liu et al., 2010;

Hřibová et al., 2011). Sekcia Eumusa je druhovo najpočetnejšia a patrí sem prevažná

väčšina jedlých typov banánovníkov. Vznikali prirodzenou hybridizáciou dvoch planých

diploidných druhov – M. acuminata (genóm A, x = 11) a M. balbisiana (genóm B, x = 11)

(Simmonds a Stepherd, 1955). V ďalších hybridoch banánovníkov sa nachádza S genóm

pochádzajúci od M. schizocarpa (sekcia Eumusa). Jedlé typy banánovníkov sa vyskytujú

tiež v rámci sekcie Australimusa. Sú to klony známe ako Fe'i banány alebo pacifické

banány a vznikli nezávisle na jedlých typoch zo sekcie Eumusa.

Musaceae

Musa Musella

x= 9

Ensete

x=9

Callimusa

Australimusa Rhodochlamys Eumusa

7

Ako už bolo spomenuté, všetky jedlé typy banánov sú diploidné druhy alebo

triploidné klony, ktoré vznikli prirodzenou hybridizáciou diploidných druhov. Tradičné

šľachtenie banánovníkov je zamerané na triploidné druhy, ktoré vznikajú buď

hybridizáciou diploidnej a tetraploidnej rastliny alebo, častejšie sa vyskytujúcim procesom,

kedy nastane disfunkcia počas meiózy a vznikne tak neredukovaná gaméta nesúca 2n od

jedného z rodičov. Výsledný potomok je potom triploidný. Triploidné klony sú sterilné

a ich plody neobsahujú semená. V prírode, a to hlavne na hraniciach areálu rozšírenia

jednotlivých druhov banánovníkov stále dochádza k medzidruhovej hybridizácii

a vznikajú tak nové hybridné klony. Týchto jedincov je s použitím morfo-taxonomických

znakov veľmi náročné až nemožné identifikovať, respektíve objasniť ich pôvod a zaradiť

do fylogenetického systému (Häkkinen, 2004, 2005). Preto sa dnešný výskum zaoberá tiež

štúdiom zloženia jadrových genómov s využitím molekulárno-biologických metód, ktoré

zahŕňajú analýzu jadrového genómu pomocou prietokovej cytometrie, cytogenetickú

analýzu, rovnako tak aplikáciu rôznych typov molekulárnych markerov pre štúdium

diverzity a evolúcie jadrového genómu.

Rod Ensete pozostáva z 8 alebo 9 druhov trvalých rastlín, ktoré pochádzajú

z tropických oblastí Afriky a Ázie (De Langhe et al., 2009). Existuje totiž jeden druh

v Thajsku, E. superbum, ktorý však zatiaľ oficiálne nebol popísaný. Tento rod je

monokarpný a rastie priemerne 4-5 rokov. Rastú na nich aj plody, tvarom podobné

banánom, ale nie sú jedlé. Konzumuje sa však koreňový systém E. ventricosum, ktorý je

hlavným zdrojom potravy v južnej a juhozápadnej Etiópii.

Rod Musella obsahuje jeden alebo dva druhy (Musella lasiocarpa, Musella

splendida), vyskytujúce sa v horách juhovýchodnej Ázii ako endemické druhy. Je síce

vedený ako samostatný rod, no stále je to veľmi kontroverzná diskusná téma. V roku 1947

E.E.Cheesman okomentoval rod Musella: „čokoľvek to je, určite to nie je Musa, sensu

stricto.“ Odvtedy je stále niektorými systematickými biológmi považovaný za samostatný

rod, no niektorí ho naopak považujú za anomáliu rodu Musa. Analýza ITS oblastí tiež

nepotvrdila rod Musella ako monofyletický taxón, no označila ho ako vysoko príbuzný

rodu Ensete. Nedávno, vo februári 2013 vydal vyhlásenie World Checklist of Selected

Plant Families, že považuje rod Musella za synonymum rodu Ensete.

8

2.1.4 Význam banánovníkov

Banánovníky sú jednou z najdôležitejších rastlín, nie len z ekonomického ale

hlavne z poľnohospodárskeho hľadiska. Banány sú štvrtou najdôležitejšou plodinou na

svete, sú základnou potravou pre 400 miliónov obyvateľov našej planéty. Ročne narastie

cca. 100 mil. ton na viac než 10 mil. hektároch pôdy. Ako už bolo spomenuté,

rozoznávame niekoľko typov banánovníkov a majú všestranné využitie.

Nevýhodou jedlých typov a zároveň obmedzením pre tradičné prístupy pri

šľachtení však ostáva ich partenokarpia a vegetatívny spôsob množenia. Vzhľadom

k tomu, že sa jedlé typy rozmnožujú oddenkami a pochádzajú od jednej materskej rastliny

– sú to teda geneticky totožné klony, sú i celé plantáže ohrozené bakteriálnymi,

vírusovými, či hubovými ochoreniami a parazitmi. Existuje ich mnoho druhov. Kvôli tomu

sú ohrozené veľké pestovateľské výnosy na export i pre lokálnu spotrebu. Na postreky sa

ročne minie väčší obnos peňazí a aplikujú sa minimálne 10 krát ročne. Medzi bakteriálne

ochorenia patria napr. „Bugtok“ (Pseudomonas solanacearum) či „Blood disease“

(Pseudomonas spp.). K hubovým ochoreniam patria napr. „Black Cross“ (Phyllachora

musicola), „Cordana leaf spot“ (Cordana johnstonii, C. musae), „Black leaf streak“

(Mycosphaerella fijiensis), „Malayan leaf spot“ (Haplobasidion musae), „Panama disease“

(Fusarium oxysporum f.sp. cubense) a „Yellow Sigatoka“ (Mycosphaerella musicola).

Vírusové ochorenia spôsobujú aj tieto vírusy: „Banana streak virus“, „Banana virus X“

alebo „Banana bract mosaic virus“.

2.2 Jadrový genóm

Jadrový genóm je veľmi variabilný a u prokaryot sa jeho veľkosť pohybuje do

5 Mbp, zatiaľ čo u eukaryot je to od 10 Mbp až po 100 000 Mbp, viď Obr. 4. Väčšina

genetickej informácie je uložená v DNA, ktorá sa nachádza v bunkovom jadre. Jadrový

genóm teda označuje DNA prítomnú v bunkovom jadre, ktorá predstavuje jednu úplnú

kópiu dedičnej informácie (1C).

9

Obr. 4 Schéma zobrazujúca veľkosti jadrových genómov rastlín. Rastlinou s doposiaľ

najmenším zisteným jadrový genómom je druh Genlinsea aurea z čeľade

Lentibulariaceae. Naopak najväčší jadrový genóm bol doposiaľ zistený u druhu Paris

japonica z čeľade Melanthiaceae. Jadrový genóm jedného z pôvodných druhov

banánovníkov druh Musa acuminata patrí teda k tým s menším genómom.

Množstvo DNA v bunkovom jadre sa vyjadruje pomocou C-hodnoty, ktorá

označuje množstvo DNA v jednej haploidnej sade chromozómov (n) pred replikáciou

DNA. Udáva sa pomocou dvoch veličín: v pg DNA a v počte bp (1 pg DNA = 0,978 ∙ 109

bp). U polyploidných organizmov sa udáva tiež hodnota 1Cx, ktorá špecificky označuje

množstvo DNA v základnej sade chromozómov (napr. pšenica siata, 2n = 6x = 42).

Veľkosť genómu sa v rámci druhu nemení, ale nájdeme rozdiely napr. medzi cytotypmi.

Nutné uviesť, že s C-hodnotou je spojený tzv. „Paradox C-hodnoty“, ktorý hovorí

o tom, že C-hodnota nekoreluje so zložitosťou daného organizmu. A tiež, že morfologicky

podobné organizmy môžu mať veľmi odlišnú veľkosť genómu. Napr. u krytosemenných

rastlín variuje veľkosť genómu 2300 krát (od 0,065 pg DNA u Genlisea margaretae až po

152 pg DNA u Paris japonica)

DNA je tvorená génmi a génom podobnými sekvenciami, do ktorých patria

štruktúrne gény a gény pre funkčnú RNA nachádzajú sa tam vo viac kópiách. Väčšinu

10

genómu ale tvoria negénové sekvencie. Tie spôsobujú rozdiely vo veľkosti genómu

rôznych druhov a organizmov. Sú to repetitívne sekvencie DNA, ktoré sú usporiadané buď

tandemovo za sebou, alebo rozptýlené v genóme.

Medzi tradičné metódy stanovenia veľkosti genómu patria predovšetkým

cytometrické techniky, ktoré sú založené na stanovovaní väčšieho množstva buniek naraz,

alebo postupne po jednej bunke. Metódy založené na stanovení veľkosti jadrového genómu

pomocou väčšieho množstva buniek sú: kinetika reasociácie DNA, spektrofotometria

i fluorometria. Ďalej k cytometrickým metódam stanovujúcim veľkosť genómu pomocou

jednotlivých buniek patrí prietoková cytometria, o ktorej sa zmienim nižšie a tiež statická

cytometria zahŕňajúca mikrospektrofotometriu, cytofluorometriu, denzitometriu a laserová

rastrovaciu cytometriu.

2.2.1 Jadrový genóm banánovníka

Veľkosť genómu rodu Musa sa pohybuje v rozmedzí 552 – 607 Mbp (Doležel et

al., 1998; Bartoš et al., 2005). Nedisponuje teda rozsiahlym genómom a veľkosť genómu

A je preukázateľne väčšia než genómu B. Jedny z najmenších genómov v rámci rodu má

sekcia Eumusa, kam sa zaraďuje M. acuminata, M. balbisiana i M. schizocarpa, ktorá

disponuje v rámci sekcie najväčším genómom. Naproti tomu zástupci Fe'i banánovníkov

zo sekcie Australimusa a druh M. beccarii zo sekcie Callimusa disponujú zatiaľ najväčším

zmeraným obsahom DNA.

Chromozómy banánovníkov sú pozdĺžneho tvaru a niektoré majú aj sekundárnu

konstrikciu. V priemere má každý chromozóm banánovníka 50 Mpb a každý banánovník

má minimálny počet 18 chromozómov až po najviac 33 chromozómov v závislosti na

ploidii daného druhu. Na Obr. 5 je FISH na metafáznych chromozómoch rôznych druhov

rodu Musa, ktoré boli farbené pomocou DAPI (modrá).

11

Obr. 5 Fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH) na metafáznych chromozómoch

rodu Musa. Na konkrétnejšiu identifikáciu niektorých chromozómov bola použitá FISH so

špecifickými sondami pre 5S rRNA gény a BAC klon 2G17. Pri druhoch M. acuminata, M.

ornata a M. textilis sú signály 5S rRNA génu červené a signály jednokópiového BAC

klonu 2G17 zelené. Pri druhu M. balbisiana je to naopak. Merítko = 5 μm.

Sekvenovanie DNA značí determináciu presného poradia štyroch nukleotidových

báz – adenín, guanín, cytozín, a tymín uložených na dvojzávitnici DNA. Prvá známa

sekvencia DNA pochádza z roku 1970 a odvtedy sa techniky a metódy sekvenovania DNA

zjednodušili, urýchlili a spresnili. Existujú klasické metódy sekvenovania ako Maxam-

Gilbertovo sekvenovanie či Sangerovo sekvenovanie. Z požiadaviek na čo najrýchlejšie

a najlacnejšie sekvenovanie vzišlo tzv. Next-generation metódy, medzi ktoré patrí

454 pyrosekvenovanie, Illumina sekvenovanie, SOLiD sekvenovanie, polóniové

sekvenovanie, či MPSS (Massively paralel signature sequencing). Na sekvenovanie

genómu banánovníka bola použitá Sangerova metóda (ABI 3730xl) spolu s Illumina

sekvenovaním (Roche/454 GSFLX and Illumina GAIIx).

12

Kompletný genóm banánovníka M. acuminata cv. 'Pahang' sa podarilo rozlúštiť

v roku 2012 (D'Hont et al., 2012). Na významnom medzinárodnom projekte mapovania

genómu banánovníku sa podieľalo 18 tímov zo 7 rôznych krajín sveta, vrátane Českej

republiky. Cieľom projektu bolo zostaviť úplnú genetickú informáciu dihaploidného druhu

M. acuminata ssp. malaccensis 'DH Pahang' s genómovým zložením AA (Obr. 6).

Skúmaný druh obsahoval 2n = 22 chromozómov a veľkosť jeho genómu 1C = 523 Mb.

Bolo identifikovaných približne 37000 pravdepodobných génov (napr. pre zrenie plodov,

odolnosť voči hubových ochoreniam, rôzne agronomické vlastnosti – výnos, kvalita

a pod.). Aj napriek relatívne malej veľkosti genómu, podstatnú časť genómu tvoria

repetitívne sekvencie DNA.

Obr. 6 Distribúcia identifikovaných génov a hlavných typov repetitívnych DNA

sekvencií na chromozómoch druhu M. acuminata 'DH Pahang'. Jednotlivé typy DNA

sekvencií, ktoré boli identifikované a charakterizované boli zmapované na sekvencie

jednotlivých chromozómov zostavených v rámci celogenómového sekvenačného projektu

banánovníku. Prevzaté z D'Hont et al., 2012.

Poznatky zo spomínaného medzinárodného významného výskumu budú využité nie

len ako vzor pri sekvenovaní ďalších a nových typov banánovníkov, ale i pri šľachtení

týchto rastlín najmä ich odolnosť voči škodcom, parazitom, vírusom a baktériám

a dopomôžu pochopiť evolúciu rodu Musa. Vyšľachtením odolnejších druhov by sa zvýšila

produkcia banánov v lokalitách, kde sú každodennou potravou miestnych obyvateľov.

13

2.3 Prietoková cytometria

Prietoková cytometria je analytická metóda založená na detekcii optických

parametrov častíc unášaných prúdom kvapaliny, ktorý pretína svetelný lúč intenzívneho

zdroja žiarenia (Obr. 7). Táto metóda patrí posledných dvadsať rokov k prevládajúcim

metódam pri určovaní veľkosti genómu, stupni plodie a triedení chromozómov. Podstatne

sa odlišuje od iných kvantitatívnych analýz, ako napr. mikrospektrofotometria alebo

cytofluorometria, keďže preparáty musia byť fixované na pevnom povrchu, zatiaľ čo

prietoková cytometria to umožňuje za pohybu v suspenzii. Hlavnými výhodami

prietokového cytometra sú nenáročná príprava preparátov, rýchla analýza a vyhodnotenie

výsledkov, vďaka ktorým je možné vykonať až 200 analýz denne. Prietokový cytometer

býva pripojený k počítaču so špecifickým programom, ktorý dokáže digitalizovať a

vyhodnotiť výstupné dáta z cytometra. Spomínaný program dokáže vyhodnotiť plochu

píku či variačný koeficient CV a ďalšie štatistické hodnoty.

Vo všeobecnosti je prietoková cytometria široko využívaná v biologických

odboroch rôzneho zamerania. Využitie nachádza ako u prokaryotických organizmov, tak

prevažne u eukryotických. Dôležitými odvetviami skúmania sú predovšetkým rastliny

a ľudia, za ktorými nasledujú živočíchy. S ohľadom na zameranie bakalárskej práce sa

bude táto kapitola zaoberať využitím prietokovej cytometrie u rastlín.

2.3.1 Základné princípy a súčasti

K základným súčastiam cytometru patria: prietoková komôrka, zdroj excitačného

svetla (laser alebo vysokotlaková ortuťová výbojka), optická sústava s dichroickými

zrkadlami, fotonásobiče a v neposlednej rade počítač so špecifickým softwarom. Hlavnou

časťou je prietoková komôrka, kde nastáva jav hydrodynamickej fokusácie (Obr. 8), čo

znamená, že suspenzia jadier je po jednom vedená do komôrky, kde dochádza k excitácii.

Unášacia tekutina je prevažne deionizovaná voda, alebo slabý roztok solí. Keďže je

unášacia kvapalina privádzaná do oblasti komôrky pod vyšším tlakom než suspenzia

častíc, núti častice prechádzať len v centrálnom toku.

Následne prechádzajú jadrá miestom dopadu excitačného lúča, ktorého vlnová

dĺžka musí byť zvolená tak, aby nastala excitácia fluorescenčného farbiva, ktorým sú

skúmané jadrá zafarbené. U zložitejších cytometrov a analýzach viacerých parametrov je

14

niekoľko zdrojov excitačného svetla, aby nastala excitácia viacerých fluorescenčných

farbív nezávisle na sebe. Zároveň s emisiou fluorescencie nastáva aj rozptyl svetla, priamy

i bočný. Každý z nich je snímaný samostatným objektívom a u priameho rozptylu sú

jednotlivé pulzy prevedené na elektrické pulzy pomocou fotonásobiča. Bočný rozptyl

svetla vnikne v 90° uhle ku smeru excitačného lúča a nachádza sa za ním sústava

optických filtrov. Tie oddeľujú emitované svetlo, aby bolo možné analyzovať

fluorescenciu všetkých farbív samostatne.

Nakoniec, po zosilnení a spracovaní nastáva digitalizácia elektrických signálov, aby

ich bolo možné spracovať pomocou softwaru na počítači. Pre relevantnú analýzu je

potrebné analyzovať 5 – 20 000 jadier, čo znamená aj pri pomalších analýzach len

niekoľko minút.

Obr. 7 Všeobecná schéma prietokového cytometra. K základným častiam patrí

prietoková komôrka so vzorkou, komôrka s unášajúcou kvapalinou spôsobujúcou

hydrodynamickú fokusáciu. Nasleduje excitácia jadier zdrojom svetla a ich odplavenie do

nádoby s odpadom.

vzorka

unášajúca kvapalina

objektív

odpad

prietoková

komôrka

15

Obr. 8 Hydrodynamická fokusácia v prietokovom cytometri. Jednotlivé analyzované

jadrá sú pod tlakom unášajúcej kvapaliny, ktorá spôsobuje oddelenie jadier a ich jednotlivú

excitáciu zdrojom svetla.

2.3.2 Príprava suspenzie jadier

Suspenzia jadier sa obvykle pripravuje nasekaním čerstvého pletiva

v prostredí izolačného pufru. Rastlinný materiál je nenáročný, zo skúmanej rastliny

postačuje v priemere 10 mg, zvyčajne, listového pletiva. Zloženie izolačného pufru by

malo zaistiť uvoľnenie dostatočného množstva intaktných jadier, ochrániť DNA proti

pôsobeniu endonukleáz a uľahčiť farbenie DNA fluorescenčnými farbivami (Doležel et al.,

2005). Medzi najčastejšie používané izolačné pufry patrí Tris-MgCl2 pufor (Pfosser et al.,

1995), Galbraithov pufor (Galbraith et al., 1983), LB01 pufor (Doležel et al., 1989) alebo

pufry Otto I a Otto II (Otto, 1990; Doležel a Göhde, 1995). Žiadny z týchto pufrov nie je

univerzálne použiteľný pre všetky rastliny. Pre každý druh je teda dôležité nájsť

najvhodnejší pufor, prípadne optimalizovať jeho zloženie.

Z celého spektra fluorescenčných farbív sa v prietokovej cytometrii najčastejšie

využívajú tri skupiny farbív charakteristické rôznym spôsobom väzby na DNA. Prvú

skupinu tvoria tzv. interkalátory, ktoré sa kvantitatívne vmedzerujú medzi páry báz

dvojzávitnice DNA a ich fluorescencia je teda úmerná celkovému obsahu DNA v jadre.

Medzi tieto farbivá patrí etídium bromid a propídium jodid. Obidve tieto farbivá sa ale

viažu i na dvojzávitnicovú RNA a na presnú analýzu je nutné pridať do vzorky dostatočné

vzorka unášajúca kvapalina

zdroj svetla

hydrodynamická fokusácia

16

množstvo ribonukleázy. Druhú skupinu predstavujú farbivá, ktoré sa na DNA viažu do

oblastí bohatých na AT báze. Typickými zástupcami tejto skupiny sú Hoechst 33258

a DAPI. Tretie skupinu potom tvoria tzv. fluorescenčné antibiotiká (chromomycín,

mitramycín a olivomycín), ktoré sa špecificky viažu na dvojzávitnicovú DNA do oblastí

bohatých na GC báze. Farbivá špecifické na AT alebo GC báze však nie sú vhodné na

meranie veľkosti genómu a využívajú sa skôr na určenie ploidie alebo na štúdium

zastúpenia báz v genómoch (Doležel et al., 2005).

2.3.3 Stanovenie ploidie a obsahu jadrovej DNA

Stanovenie ploidie a obsahu jadrovej DNA je jednou z najčastejších aplikácii

prietokovej cytometrie pri taxonomických štúdiách najmä u rastlín. Predpokladá sa totiž,

že 60-80% rastlinných druhov vzniklo polyplodizáciou. Polyploidné druhy obsahujú vo

svojich bunkách niekoľkokrát zmnožené sady chromozómov, oproti druhom s bežnejšou

diploidnou sadou chromozómov. Stanovenie ploidie tiež napomáha v zaradení takých

druhov do taxónov, kde sú morfologické znaky nedostačujúce, pretože stupeň ploidie jasne

určí zaradenie daného druhu . Na Obr. 9 je možné vidieť široké spektrum stupňov ploidie,

konkrétne analýza triploidného hybrida Empetrum s možným diploidným a tetraploidným

rodičom. Na Obr. 10 je zobrazený histogram rôznych cytotypov Lythrum salicaria

identifikovaných pomocou prietokovej cytometrie.

17

Obr. 9 Rôzne stupne ploidie rodu Empetrum analyzované pomocou prietokového

cytometra. Vzorky obsahovali diploidný i triploidný druh rodu Empetrum, reprezentovaný

dvoma samostatnými píkmi.

Obr. 10 Rôzne cytotypy rodu Lythrum analyzované pomocou prietokového

cytometra. Každý samostatný pík reprezentuje jeden cytotyp, viditeľný diploid, triploid,

tetraploid a dokonca i hexaploid. Prevzaté z Kubátová et al. (2007).

18

Pre správne určenie ploidie i stanovenie veľkosti jadrového genómu je potrebné

používať tzv. štandardy, rastliny so známou ploidiou alebo už zmeranou veľkosťou

genómu. V Tab. 1 sú zaznamenané používané štandardy pre rastlinné merania. Jadrá

meranej rastliny a štandardu sa izolujú a farbia spoločne a na základe pomeru intenzity

fluorescencie štandardu a skúmanej vzorky je potom možné určiť ploidiu alebo veľkosť

genómu (Doležel et al., 2005). Táto tzv. interná štandardizácia nahradila predtým

používanú externú štandardizáciu, pri ktorej bola analyzovaná vzorka a štandard

pripravené a merané nezávisle na sebe. Použitie externého štandardu sa môže ľahko stať

zdrojom chýb kvôli prístrojovej odchýlke medzi oboma meraniami a rozdielu pri nafarbení

vzorky a štandardu fluorescenčným farbivom. Keďže sa pri každej vzorke robí aj základná

štatistická analýza, štandardne sú tri rastlinky či semienka a každé z nich sa meria trikrát

počas troch rôznych dní. Výstupom je vždy histogram, ktorý v zásade obsahuje dva píky,

meranú vzorku a štandard pre porovnanie. Šírka píku na ose x predstavuje množstvo DNA

obsiahnutej v chromozóme a celková plocha píku zodpovedá relatívnemu počtu jadier

(Obr. 11).

Absolútne množstvo DNA obsiahnuté v jadre je potom počítané na základe hodnôt

G1 píkov vzorky a štandardu podľa vzorca:

obsah jadrovej DNA 2C vzorky [pg] = obsah jadrovej DNA 2C štandardu x G1 pík

vzorky/ G1 pík štandardu.

Tab. 1 Štandardy používané pri meraní rastlinných genómov

Zoznam DNA štandardov vhodných pre rastlinnú DNA prietokovú cytometriu

Druh Kultivar Obsah DNA

2C (pg)*

Veľkosť genómu

1C (Mbp)** Referencie

Raphanus sativus Saxa 1.11 543 Doležel et al. (1998)

Lycopersicon

esculentum

Stupicke polni

tyckove rane 1.96 958 Doležel et al. (1992)

Glycine max Polanka 2.50 1 223 Doležel et al. (1994)

Zea mays CE-777 5.43 2 655 Lysák a Doležel (1998)

Pisum sativum Ctirad 9.09 4 445 Doležel et al. (1998)

Secale cereale Dankovske 16.19 7 917 Doležel et al. (1998)

Vicia faba ssp.

faba var equina Inovec 26.90 13 154 Doležel et al. (1992)

Allium cepa Alice 34.89 17 061 Doležel et al. (1998)

19

*) Obsah jadrovej DNA bol stanovený pomocou ľudských (mužských) leukocytov

(2C = 7.0 pg DNA; Tiersch et al., 1989) ako primárny referenčný štandard.

**) 1 pg DNA = 978 Mbp (Doležel et al., 2003)

Všetky kultivary spĺňajú kritériá ako rastlinné DNA štandardy, pretože sú: a) vhodné na

analýzu obsahu DNA prietokovou cytometriou; b) semienka rozmožiteľné; c) prístupné

ako elitné línie od pestovateľov

Obr. 11 Stanovenie obsahu jadrovej DNA. Histogram relatívneho obsahu DNA získaný

prietokovou cytometriou, jadrá farbené PI. Simultánna analýza vzorky Ensete gilletii

a štandardu Glycine max, ktorého pík bol umiestnený na kanál 200. Hodnota G1 píku

(Ensete: Glycine) sa rovná 0,484 a teda obsah DNA 2C bola určená ako 1,210 pg pomocou

jednoduchého vzorca:

obsah jadrovej DNA 2C vzorky [pg] = 2,5 x G1 pík vzorky/ G1 pík štandardu

(Prevzaté z Doležel a Bartoš, 2005).

2.3.4 Kľúčový parameter cytometrických analýz – presnosť

Meranie veľkosti genómu pomocou prietokového cytometra vyžaduje presnosť

prístroja a jeho presnú kalibráciu na vytvorenie relevantnej a spoľahlivej analýzy. Presnosť

Relatívny obsah DNA v jadre

20

danej analýzy je vyjadrená variačným koeficientom CV, ktorý je meraný na každom píku

histogramu cytometrickej analýzy. Na výpočet CV sa používa jednoduchý vzorec:

[%]

Za predpokladu, že sú píky rovnaké, je možné od seba odlíšiť také objekty, ktorých rozdiel

v obsahu DNA zodpovedá dvojnásobku CV. Čím je teda koeficient variability nižší, tým je

analýza presnejšia a výsledky relevantnejšie. Väčšinou sa prípustne pohybuje v rozmedzí

1-10 %, ale kritické analýzy vyžadujú koeficient variability do 3 %. Analyzované vzorky

obsahujúce sekundárne metabolity vytvárajúce pozadie alebo nízky obsah DNA

(napr. Arabidopsis spp.) poskytujú analýzy s prípustným CV do 5 %. Koeficient variability

by však nemal presiahnuť 6 %, keďže relevantnosť analýzy tým klesá. Dnes už nie sú

vôbec ojedinelým prípadom analýzy s CV okolo 1 % (Suda, 2005), keď jej predchádza

starostlivá príprava vzoriek a správna kalibrácia prístroja. Kalibrácia prístroja sa robí

pomocou štandardov s nízkou hodnotou rozptylu a tendenciou tvoriť zhluky. Využívajú sa

ľudské leukocyty či ofarbené pstružie erytrocyty (Suda, 2005).

2.4 Génové banky

Hlavným poslaním a cieľom génových bánk po celom svete je dlhodobé

uchovávanie diverzity génových zdrojov rastlinného, živočíšneho, mikrobiálneho, ale aj

iného pôvodu. Na celom svete existujú rôzne zamerané, ale i všeobecné génové banky.

Najväčšia zbierka semien rastlín je v Kráľovskej botanickej záhrade vo Veľkej Británií

a k ďalším významným génovým bankám patria Nordgen vo Švédsku a Nórsku, IITA

v Nigérií, národné génové banky v Číne, či Iráne, Národná génová banka ryže na

Filipínach, ale aj Génová banka banánovníka v Belgicku.

Rastlinný materiál je najčastejšie uchovávaný vo forme semien v semennej banke.

Semená je potrebné vysušiť na optimálny obsah vody a následne sú vložené do hermeticky

uzatvorenej sklenenej nádoby a uchovávané pri -18°C. Na dlhodobé uchovávanie sa však

využíva kryoprezervácia, kedy sa vzorky uchovávajú v tekutom dusíku s -196°C. Zo

živočíšneho materiálu sa uchovávajú najmä spermie, embryá, kmeňové bunky, tkanivá,

alebo aj mlieč. Väčšinou sa využíva kryoprezervácia, no zatiaľ nie sú overené protokoly

pre všetky druhy. Napr. koraly sa uchovávajú v nádobách s vodou pri kontrolovaných

21

podmienkach. Ďalšími možnosťami sú tkanivové banky s kultúrami tkanív alebo výsadba

rastlinných druhov a tým umelo vytvorený ekosystém.

2.4.1 Génová banka banánovníkov

Génová banka banánovníkov sa nachádza v International Transit Centre v Lovani

v Belgicku a je to najväčšia zbierka banánovníkov na celom svete – The International

Musa Germplasm Collection, ktorú zastrešuje Biodiversity International a vznikla v. r.

1974. Génová banka banánovníkov bola založená v roku 1985 INIBAP (International

Network for the Improvement of Banana and Plaintain – 1985, Francúzsko). INIBAP sa

však v roku 2003 premenoval na Biodiversity International. Do kolekcie v ITC boli

zaradené položky z niekoľkých významných kolekcií z celého sveta, ako napr. z CIRAD

v Guadalupe, z FHIA v Hondurase, IITA v Nigérií, alebo CATIE na Kostarike a súčasnej

dobe obsahuje viac než 1400 položiek. Pôvodne boli do ITC kolekcie umiestňované

predovšetkým jedlé triploidné kultivary banánovníkov s cieľom ich distribúcie ako

vedeckej komunite, tak pestovateľom. V dnešnej dobe tieto typy banánovníkov v ITC

kolekcii prevažujú, ale v posledných rokoch Biodiversity International v spolupráci

s ďalšími inštitúciami začlenila do ITC kolekcie veľké množstvo planých zástupcov

čeľade Musaceae s cieľom uchovania genetickej diverzity tejto významnej čeľade.

Génová banka banánovníka má vyše 500 spolupracovníkov vo viac než 60

krajinách po celom svete a tiež spolupracuje s mnohými lokálnymi výskumnými tímami.

Vzhľadom k sterilite jedlých triploidných typov banánovníkov a nízkej fertilite

semien planých zástupcov čeľade Musaceae sú génové zdroje banánovníku v génovej

banke uchovávané ako in vitro rastliny. Uchovávanie položiek v génovej banke

banánovníka má svoj poriadok a každá položka je označená kódom a uchovávaná

v rôznych podmienkach. Z každej položky je jej duplikát uložený vo Francúzskom

výskumnom inštitúte v Montpeliéri vo Francúzsku. Každá z položiek je zastúpená 20

kultúrami pestovanými na živnom médiu pri stálych svetelných podmienkach a konštantnej

teplote 16°C a presádza sa priemerne raz ročne. Ďalej majú časť položiek dlhodobo

uchovávaných kryoprezerváciou pri -196°C v tekutom dusíku. Každá položka, ktorá bola

negatívne otestovaná na prítomnosť vírusov je možné zaslať na vyžiadanie alebo

objednávku (možná tiež cez internet) výskumných alebo šľachtiteľských ústavov. Zásielka

sa riadi Dohodou o štandardnom prenose materiálu (SMTA).

22

Požadovaná položka je vždy zasielaná v piatich vzorkách a je možné ju zaslať

v rôznom stave: ako proliferujúce pletivové kultúry, zakorenené rastlinky in vitro

pripravené k vysadeniu do zeme alebo aj forme lyofilizované listy zbierané z rastlín zo

skleníka. Je však potrebné si uvedomiť, že po odoslaní objednávky je potrebné počkať

určitú dobu, kým výskumníci pripravia požadovaný materiál. Príprava a odoslanie

lyofilizovaných listov trvá najkratšie a to dva týždne, dva mesiace trvajú kultúry

s proliferujúcim pletivom a najdlhšie, teda približne štyri mesiace potrebujú na zakorenené

rastlinky. Zasielaná položka má vždy priložené prehlásenie o neškodnosti, fytosanitárny

certifikát a kópiu SMTA.

MGIS (Musa Germplasm Information System) je databáza, kde sú uložené

informácie o viac než 22 kolekciách banánovníkov a sú prístupné pre užívateľov z rôzneho

zázemia (od farmárskych komunít až po vedeckých pracovníkov). Obsahuje údaje na

prevoz, morfotaxonomický popis a tiež zopár fotografií. MGIS je úzko prepojený

s MGBMS (Musa Gene Bank Management System), spolupracujú a tak sa takmer ihneď

novo spracované dáta z génovej banky banánovníka objavia v MGIS a sú tak prístupné

okamžite všetkým užívateľom.

2.4.2 Problémy v génovej banke banánovníkov

Napriek tomu, že génové banky sú špičkovo vybavené a vedené zariadenia, nesú so

sebou aj nedostatky. Keďže tu pracujú ľudia a ľudský faktor nie je bezchybný, môže nastať

popletenie nejakých položiek. Je to samozrejme veľmi zriedkavé, no takýto omyl by mohol

mať hlbokosiahly dopad na výskum, kde by s týmito položkami pracovali. Problémy môžu

nastať aj vo financovaní týchto zariadení a ich aktivít a výskumov. Umelo vytvorené

ekosystémy, ako už boli vyššie spomenuté, sú finančne náročné na chod, nie sú vhodné na

dlhodobé uchovávanie a sú vystavené rôznym biologickým rizikám.

2.4.3 Uchovávanie diverzity z pohľadu génových bánk

Založenie génových bánk pre rastlinné i živočíšne druhy bol veľký pokrok pre

vedeckú oblasť zaoberajúcu sa zachovaním diverzity genetických zdrojov na našej planéte.

K dnešnému dňu disponujú génové banky širokým spektrom genetického materiálu, ktorý

23

sa najmä u rastlín využíva na poli poľnohospodárskom a agrárnom k vyvíjaniu odolnejších

a nutrične bohatších plodín. Každá génová banka uchováva duplikáty svojich položiek

v ďalšej vedeckej inštitúcii, pre prípad, že by s ich vlastnou zbierkou stalo niečo

nepredvídateľné.

2.4.4 Charakterizácia nových položiek v génovej banke

Všetky položky, ktoré sa nachádzajú v génovej banke, alebo tam pribudnú, majú

vždy svoje označenie. Sú na ňom všeobecné informácie, ale tiež špecifické pre danú

inštitúciu, ktorá položku eviduje. Na Obr.12 je typický čiarový kód označenia položiek

v génovej banke banánovníka. Pod týmto označením je potom jednoduché v systéme

vyhľadať o danej položke informácie, ktoré obsahujú aj ďalšiu charakterizáciu doplňujúcu

poznatky. Všetky položky prešli charakterizáciou, ktorá zahŕňa niekoľko metód –

cytometriu, cytológiu, molekulárne markery, a pod. Pomocou týchto metód sa zisťuje

stupeň ploidie, počet chromozómov, aj príslušnosť k sekcii rodu Musa či fylogenetická

príslušnosť.

Obr. 12 Čiarový kód označenia položky v génovej banke banánovníka v kolekcii ITC

v Lovani v Belgicku. Obsahuje všetky potrebné informácie, ktoré charakterizujú

danú položku a zabraňujú zameneniu či popleteniu uchovávaných položiek. Prevzaté

z posteru od Ruas M. et al. (2009).

Vzhľadom na systém uchovávania položiek v génovej banke banánovníka, ktorý,

ako už bolo povedané, je založený na uchovávaní živých in vitro rastlín a samozrejme

vzhľadom k vyššie uvedeným diskutovaným problémom sprevádzajúcich charakterizáciu

jednotlivých rastlín použitím morfo-taxonomických metód je dôležitá podrobnejšia

miesto uloženia položky

súbežne označenie

deň označenia položky

číslo čiar. kódu

ITC číslo

názov položky

24

charakterizácia uchovávaných položiek. Za týmto účelom bola v Laboratóriu molekulárnej

cytogenetiky a cytometrie (dnes Centrum štruktúrnej a funkčnej genomiky rastlín), ÚEB

AV ČR, v. v. i. v spolupráci s Biodiversity International vypracovaná metodika

molekulárnej charakterizácie, ktorá využíva prietokovú cytometriu, SSR analýzu

a v niektorých prípadoch i molekulárnu cytogenetiku a/alebo analýzu nukleotidovej

sekvencie ITS1-5,8-ITS2 oblasti 45S rDNA lokusu (Christelová et al., 2011; Obr. 13) Ich

cieľom je stanovenie ploidie jednotlivých položiek a genotypovanie pomocou 19

špecifických mikrosatelitových markerov (Christelová et al., 2011). Výsledky ploidie

a SSR analýzu sú následne využité na konštrukciu kladogramu s cieľom zistiť diverzitu

jednodtlivých položiek a identifikovať príbuzných jedincov uchovávaných v ITC kolekcii,

respektíve odhaliť chybne popísané položky.

Jednu z alternatív predstavuje analýza DArT markerov (Risterruci et al., 2009),

ktorá je založená na redukcii genómu pomocou štiepenia DNA reštrikčnými enzýmami

a následne vytvorenie tzv. DArT čipu, ktorý obsahuje konštantné a polymorfné fragmenty

DNA daného druhu. Takto vytvorený čip je následne použitý ako templát na hybridizáciu

s celkovou genomovou DNA druhov, u ktorých chceme analyzovať ich genetickú

diverzitu. Na rozdiel od SSR markerov, ktoré sú kodominantné, DArT technológiou sa

detegujú hlavne dominantné markery pochádzajúce z jednonukleotidového polymorfizmu

reštrikčných miest. Obmedzením tohto prístupu je vývoj DArT čipu, ktorý by mal

obsahovať markery izolované priamo zo skupiny študovaných taxónov. Pri použití DArT

čipu, ktorý obsahuje markery z fylogeneticky vzdialenejších druhov – v prípade

banánovníka to sú napr. odlišné sekcie alebo v rámci sekcie rozdielne genómy, môže byť

konečná analýza do istej miery skreslená alebo málo presná.

V dnešnej dobe je tiež možnosť využiť nových tzv. Next Gen sekvenačných

technológií (napr. Illumina, 454, SOLID, Helicos, SMRT; Degnan a Ochman, 2012;

Galan et al., 2010, Hudson, 2008; Vera et al., 2008) využívajúcich redukciu komplexity

genómu a následné sekvenovanie, predovšetkým Illumina technológiou, ktorá je schopná

vyprodukovať miliardy sekvenačných čítaní v jednej reakcii. Táto metóda sa na štúdium

diverzity rodu Musa zatiaľ len testuje. Obmedzením tejto metódy je jej relatívne vysoká

cena, avšak doba a množstvo sekvenačných dát, ktoré je možné získať, je neporovnateľné

s inými experimentálnymi prístupmi. Prístupy využívajúce nové sekvenačné technológie,

rovnako ako DArT analýza, sú teda výhodné na štúdium diverzity a fylogenézy súboru

väčšieho počtu taxónov.

25

Obr. 13 Schéma metodiky molekulárnej charakterizácie položiek uložených v génovej

banke banánovníka (prevzaté a upravené od Hřibová et al., submitted).

26

3 Ciele práce

1. Stanovenie obsahu jadrovej DNA zadaných položiek banánovníka

2. Príprava protoplastových preparátov

3. Počítanie chromozómov zadaných položiek banánovníka

27

4 Materiál a metodika

Praktická časť bakalárskej práce bola vykonaná na ÚEB AV ČR v Centre

štruktúrnej a funkčnej genomiky rastlín ako súčasť jedného rozsiahleho projektu.

Spomínaný projekt sa zaoberal analýzou genetickej diverzity nových položiek

banánovníkov v čeľadi Musaceae. Cieľom praktickej časti bola analýza vybraných druhov

čeľade Musaceae pomocou prietokového cytometra a určenie obsahu jadrovej DNA,

príprava fixovaných preparátov metafáznych chromozómov a ich následné počítanie vo

fluorescenčnom mikroskope.

4.1Materiál

4.1.1 Rastlinný materiál

Všetky rastliny banánovníka, ktoré boli v danej praktickej časti použité sú

zaznamenané v tab. 2. Boli získané zo zbierky International Transit Centre (ITC, Katolícka

univerzita, Lovaň, Belgicko, avšak položka M.bauensis pochádza zo súkromnej zbierky

profesora Markku Häkkinena a preto nemá zatiaľ pridelený ITC kód. Všetky položky však

patria do rodu Musa. Dovezené rastlinky či semienka (M. bauensis) boli zasadené do

živnej pôdy a pestované v skleníku za určených podmienok.

Tab. 2 Analyzované položky banánovníkov

Názov položky ITC kód Sekcia

Musa cf. uranoscopos 1532 Australimusa

Musa monticola 1528 Australimusa

Musa borneensis 1531 Callimusa

M. campestris var. sarawakensis 1517 Callimusa

M. campestris var. limbangensis 1535 Callimusa

Musa barioensis 1568 Callimusa

Musa beccarii var. beccarii 1516 Callimusa

Musa beccarii var. hottana 1529 Callimusa

Musa violascens 1514 Callimusa

Musa bauensis Callimusa

28

Názov položky ITC kód Sekcia

M. itinerans var. xishuangbannaensis 1526 Eumusa

Musa itinerans var. itinerans 1571 Eumusa

Musa siamensis 1534 Rhodochlamys

Musa rubinea 1518 Rhodochlamys

Musa mannii 1574 Rhodochlamys

Musa laterita 1575 Rhodochlamys

Musa rosea x ornata 1572 Rhodochlamys

M. x fennicae (M. siamensis (male) x M. rosea (female)) 1522 Rhodochlamys

Musa rubra 1590 Rhodochlamys

Musa rosea x siamensis 1592 Rhodochlamys

Musa rosea (hybrid) 1598 Rhodochlamys

Musa lutea 1515 Rhodochlamys

Musa yunnanensis 1573 nezaradené

4.1.2 Prístroje

Lupa

Prietokový cytometer PARTEC PAS, Partec GmbH, Münster, Nemecko

Fluorescenčný mikroskop Olympus AX70, Olympus Corporation, Japonsko

Centrifúga IEC Micromax RF, Thermo Scientific, Waltham, Massachusettes, USA

Termoblok Digital Dry Bath, Labnet International, Rutland, Velká Británie

29

4.1.3 Roztoky a pufry

50mM fosfátový pufor na 250 ml

rozpustiť každé zvlášť v 250 ml :

KH2PO4 2,267 g

Na2HPO4 ∙ 12 H2O 5,97 g

zmiešať 175 ml Na2HPO4∙ 12 H2O + 75 ml KH2PO4

upraviť pH na 7

50mM fosfátový pufor s 0,2 % merkaptoetanolom

50mM fosfátový pufor 50 ml

merkaptoetanol 100 μl

0,05% oxychinolín na 500 ml

8-hydroxychinolín 0,25 g do 500 ml Erlenmayerovej banky

redestilovaná voda pridať 500 ml

zahrievať a miešať do úplného rozpustenia

Fixáž etanol:kyselina octová (3:1) na 4 ml

96% etanol 3 ml

Ľadová kyselina octová 1 ml

Vždy pripravovať čerstvú

30

Pufor 75mM KCl + 7,5mM EDTA na 500ml

rozpustiť každé zvlášť v 200 ml:

KCl 2,796 g

EDTA 0,396 g

zmiešať a doplniť redestilovanou vodou do 500 ml

upraviť pH na 4

Roztok enzýmov 2a

rozpustiť každé zvlášť v 1 ml pufru 75mM KCl + 7,5mM EDTA:

pektináza (426 U /g) 74,8 mg

celuláza (1 U/mg) 44 mg

zmiešať a centrifugovať 15 min pri 2000 rpm

rozpipetovať po 200-300 ml do 0,5 ml mikroskúmaviek

OTTO I na 500 ml

0,1M kyselina citrónová monohydrát 10,5 g

Tween 20 (0,5%) 2,5 ml

redestilovaná voda doplniť do 500 ml

filtrácia cez 0,22 μm filter

31

OTTO II na 500 ml

0,4M Na2HPO4 ∙ 12 H2O 71,62 g

redestilovaná voda doplniť do 500 ml

filtrácia cez 0,22 μm filter

OTTO II – PI

OTTO II 10 ml

propídium jodid (1 mg/ml) 500 μl

RNáza (30 mg/ml) 16,7 μl

merkaptoetanol 30 μl

4.2 Metodika

4.2.1 Fixácia korienkov

Táto metóda je prvým krokom na prípravu nakvapkávaných preparátov vhodných

na farbenie mitotických chromozómov a následnú mikroskopiu. Týmto spôsobom bol

zisťovaný počet chromozómov v zadaných položkách banánovníkov.

Najprv bolo nutné odobrať korienky rastliniek, ktoré sú pestované v skleníku za

zadaných podmienok. Najlepšie obdobie na odoberanie korienkov je počas dlhých letných

dní, kedy sa rastlinkám darí najlepšie. Odobrané korienky boli ihneď vložené do 50mM

fosfátového pufru s 0,2 % merkaptoetanolom. Po odbere boli tieto korienky následne

vložené na predpôsobenie do roztoku 0,05 % oxychinolínu na 3 hodiny pri izbovej teplote.

Nasledovala čerstvá fixáž 3:1 (96 % etanol a kyselina octová) cez noc pri 4°C. Korienky

boli následne premyté 2 krát po 5 minút v 70 % etanole. Boli uchovávané v 70 % etanole

v mrazničke pri -20°C.

32

4.2.2 Príprava suspenzie protoplastov a nakvapkávaných preparátov

Korienky uchovávané v mrazničke pri -20°C boli pred použitím premývané 3 krát

po 5 minút pri izbovej teplote v pufre 75mM KCl + 7,5mM EDTA. Následne bolo

potrebné narezať disky z koreňových špičiek pod lupou na Petriho miske, kde je stále malé

množstvo pufru, aby korienky nevyschli. Narezané korienkové disky bolo nutné

macerovať 1,5 hodiny pri 30°C v roztoku enzýmov 2a. Po macerácii bola suspenzia

protoplastov prefiltrovaná cez 150 μm nylonové sitko, ktoré bolo predtým navlhčené

pufrom 75mM KCl + 7,5mM EDTA. Potom nasledovala centrifugácia pri 1100 rpm/100 g

na 5 minút a následne odpipetovanie supernatantu a premytie studeným pufrom 75mM

KCl + 7,5mM EDTA, cca. 200 – 400 μl. Centrifugáciu a premytie bolo opakované 2-3

krát, podľa stavu suspenzie. Následne sa suspenzie uchovávajú s pridaním 70 % etanolu

v mrazničke pri - 20°C. Pri tejto teplote môžu byť uchovávané aj niekoľko mesiacov.

K príprave nakvapkávaných preparátov bola použitá vopred pripravená suspenzia

protoplastov. Na vychladené podložné sklíčko bolo nakvapkaných cca. 4 μl suspenzie

s odstrihnutou špičkou na pipete, spolu so 7 µl čerstvej fixáže 3:1 (96% etanol: kyselina

octová). Po rozpraskaní protoplastov, ktoré bolo možné pozorovať pod mikroskopom, bolo

sklíčko ponorené do 96 % etanolu na približne 1 minútu. Nakoniec bolo sklíčko vysušené

na vzduchu a dané sklíčko bolo pripravené k farbenie pomocou DAPI.

4.2.3 Určenie počtu chromozómov

Od každého analyzovaného zástupcu bolo odobraných minimálne 10-15 korienkov

a z nich bola pripravená suspenzia protoplastov. Protoplasty boli nakvapkané na

mikroskopické sklíčko a pomocou ľadovej fixáže boli pripravené preparáty metafáznych

chromozómov. Z každej pripravenej suspenzie boli pripravené aspoň tri sklíčka. Sklíčka

boli farbené pomocou DAPI a pozorované v mikroskope s cieľom nájsť kompletné

metafáze. Metafázne chromozómy boli nasnímané čiernobielou CCD kamerou s vysokým

rozlíšením a pomocou počítačového programu MicroImage boli uložené vo formáte .tiff.

Od každého analyzovaného zástupcu bolo nasnímaných aspoň 10 kompletných

metafáz a to z dvoch a viac mikroskopických preparátov. Cieľom bolo nájsť takú

metafázu, pri ktorej boli jednotlivé chromozómy dobre viditeľné, viď Obr. 14.

33

4.2.4 Príprava preparátov pre prietokovú cytometriu

Najprv bolo nutné odobrať zdravé, nepoškodené, čo najmladšie listy stanovovaného

banánovníka. Tie boli spolu so štandardom (lístky Glycine max; 2C = 2,5 pg DNA)

nasekané žiletkou v Petriho miske s 500 μl roztoku OTTO I. Použitých bolo približne 50 g

listu banánovníka a 10 g Glycine max. Nasekaný homogenát bol prefiltrovaný cez 50 μm

nylonové sitko, centrifugovaný pri 300 g 5 minút a opätovne rozpustený v 300 μl roztoku

OTTO I. Potom nasledovala inkubácia 1 hod. pri izbovej teplote. Po pridaní roztoku OTTO

II – PI boli vzorky pripravené k použitiu a analyzované v prietokovom cytometri

PARTEC.

4.2.5 Určenie obsahu jadrovej DNA

Pre stanovenie obsahu jadrovej DNA požadovaných vzoriek bolo analyzovaných

minimálne 5000 jadier každej položky. Od jednotlivej položky boli k dispozícii tri

rastlinky, ktoré boli merané trikrát počas troch rôznych dní. Na výpočet obsahu DNA bol

požitý nasledovný vzorec:

obsah jadrovej DNA 2C [pg] = 2,5 x G1 pík Musa/ G1 pík Glycine

Následne bol pre všetky rastlinky vypočítaný obsah DNA a prevedený na počet báz, keď

1 pg DNA sa rovná 0,978 x 109 bp.

34

5 Výsledky

Celkovo bolo analyzovaných 23 nových položiek z ITC kolekcie z génovej banky

banánovníka v Belgicku. Pochádzalo odtiaľ 22 položiek a 1 položku (M. bauensis)

poskytol prof. Markku Häkkinen zo svojej osobnej zbierky. Z každej položky boli

k dispozícii tri rastlinky a každá z nich bola meraná tri krát počas troch rôznych dní.

V Tabuľke č. 3 je zaznamenaný celkový prehľad cytologickej charakterizácie

skúmaných položiek banánovníkov, kde je zaznamenaný názov, ITC kód, počet

chromozómov, veľkosť genómu 2C v pg, smerodajnú odchýlku, veľkosť genómu 1C v Mb

a príslušnosť k sekcii, kde ju bolo možné dohľadať a určiť.

Spomedzi skúmaných položiek banánovníkov boli relatívne obsahy jadrovej DNA

rôznych hodnôt a siahali od 1,217 pg (M.itinerans var. itinerans, sekcia Australimusa) až

po 1,722 pg (M. borneensis, sekcia Callimusa). V rámci sekcií hodnoty tiež variovali,

najstabilnejšou sekciou sa zo skúmaných položiek ukázala sekcia Rhodochlamys, zatiaľ čo

najvariabilnejšou sekciou Callimusa. Zo sekcií Eumusa a Australimusa boli k dispozícii len

po 2 položky, z čoho sa nedá usúdiť variabilita relatívneho obsahu jadrovej v rámci sekcie.

Tab.3 Výsledky cytologickej charakterizácie

Názov položky ITC kód

počet chromozómov

veľkosť genómu 2C [pg] SD

veľkosť genómu 1C [Mb] sekcia

Musa monticola 1528 1,390 0,016 680 A

Musa cf. uranoscopos 1532 1,422 0,006 705 A

Musa bauensis 22 1,242 0,007 607 C

M. campestris var. sarawakensis 1517 20 1,417 0,008 693 C

Musa violascens 1514 1,428 0,011 698 C

M. campestris var. limbangensis 1535 1,454 0,003 711 C

Musa barioensis 1568 20 1,480 0,014 724 C

Musa beccarii var. beccarii 1516 18 1,537 0,017 752 C

Musa beccarii var. hottana 1529 18 1,673 0,020 818 C

Musa borneensis 1531 20 1,722 0,006 867 C

35

Názov položky ITC kód

počet chromozómov

veľkosť genómu 2C [pg] SD

veľkosť genómu 1C [Mb] sekcia

Musa itinerans var. itinerans 1571 1,217 0,004 595 E

M. itinerans var. xishuangbannaensis 1526 22 1,311 0,017 641 E

M. x fennicae (M. siamensis (male) x M. rosea (female)) 1522 22 1,261 0,012 617 R

Musa rosea x ornata 1572 1,270 0,005 621 R

Musa rosea x siamensis 1592 22 1,279 0,006 625 R

Musa siamensis 1534 22 1,280 0,006 626 R

Musa mannii 1574 22 1,282 0,008 627 R

Musa rosea (hybrid) 1598 22 1,285 0,002 628 R

Musa rubra 1590 22 1,306 0,010 639 R

Musa rubinea 1518 22 1,310 0,016 641 R

Musa laterita 1575 22 1,315 0,006 643 R

Musa lutea 1515 1,432 0,009 700 R

Musa yunnanensis 1573 22 1,306 0,011 639 nezaradené

5.1 Výsledky z fluorescenčného mikroskopu

Vzhľadom k relatívne vysokej variabilite veľkosti jadrových genómov, viď tab. 3,

nebolo jednoznačne možné určiť ploidiu skúmaných položiek banánovníka. Preto boli

pripravené nakvapkávané protoplastové kultúry z odobratých korienkov analyzovaných

položiek, ktoré boli následne použité na prípravu metafáznych chromozómov s cieľom

stanoviť počet chromozómov vo fluorescenčnom mikroskope. Metafázne chromozómy

boli nasnímané čiernobielou CCD kamerou a počítačovým programom MicroImage

a uložené vo formáte .tiff.

V Tab. 3 sú zapísané zistené výsledky skúmaných položiek banánovníkov

a zoradené podľa určených sekcií. V rámci sekcie Australimusa (x = 10) boli skúmané dve

položky a ich počet chromozómov nebolo možné doposiaľ zistiť a bude predmetom

ďalšieho skúmania. Ďalšou sekciou len s dvoma skúmanými položkami banánovníkov bola

Eumusa (x = 11). V rámci tejto sekcie bol zistený počet chromozómov len u jednej

z položiek a súhlasil so známym počtom chromozómov sekcie. Väčšie množstvo položiek

pochádzalo zo sekcie Rhodochlamys (x = 11) a počet chromozómov bolo možné doposiaľ

zistiť u 8 z 10 skúmaných položiek a všetky zistené počty chromozómov súhlasili so

36

známym počtom chromozómov v sekcii. Sekcia Callimusa (x = 9, x = 10) poskytuje väčšiu

variabilitu v počte chromozómov skúmaných položiek. V rámci skúmaných položiek bolo

možné určiť počet chromozómov u 6 z 8 analyzovaných položiek a u všetkých zistený

počet chromozómov súhlasil so známym počtom chromozómov, ale u M. bauensis bolo

zistených 2n = 22 chromozómov, čo so známym počtom chromozómov v sekcii nesúhlasí.

U nezaradenej položky bol stanovený počet chromozómov 22.

Obr. 14 Výsledné fotografie vybraných analyzovaných položiek rodu Musa

z fluorescenčného mikroskopu nakvapkávaných protoplastových preparátov

nafarbených DAPI. A – M. beccarii var. beccarii (ITC 1516). B – M. rubinea (ITC

1518). C – M. itinerans var. xishuangbannaensis (ITC 1526). D – M. borneensis (ITC

1531). E – M. siamensis (ITC 1534). F – M. barioensis (ITC 1568). G – M. yunnanensis

(ITC 1573). H – M. mannii (ITC 1574). I – M. rubra (ITC 1590).

37

5.2 Analýza dát z prietokového cytometra

Prietoková cytometria patrí k cytogenetickým metódam, vďaka ktorým je možné

určiť veľkosť genómu rastlinných i živočíšnych buniek. Je to relatívne rýchla, finančne

i materiálne nenáročná metóda. Skúmané položky je nutné vopred pripraviť, než budú

analyzované v prietokovom cytometri. Analyzovaný položkám banánovníkov bolo

odobraných 20 mg listového pletiva a spolu s listovým pletivom štandardu (Glycine max)

boli nasekané v lyzačnom pufre v Petriho miske, aby popraskala bunková stena

a protoplast. Nasekaný homogenát bol prefiltrovaný cez 50 μm nylonové sitko,

centrifugovaný pri 300 g 5 minút a opätovne rozpustený v 300 μl roztoku OTTO I. Potom

nasledovala inkubácia 1 hod. pri izbovej teplote. Po pridaní roztoku OTTO II – PI boli

vzorky pripravené k použitiu a analyzované v prietokovom cytometri PARTEC. Z každej

stanovovanej vzorky bolo analyzovaných minimálne 5000 jadier. Na výpočet obsahu DNA

bol použitý vzorec:

obsah jadrovej DNA 2C [pg] = 2,5 x G1 pík Musa/ G1 pík Glycine

V tab. 3 sú zaznamenané hodnoty jednotlivých meraní, ktoré boli štatisticky

vyhodnotené a bola tak stanovená priemerná relatívna veľkosť genómu. Najnižšia relativna

veľkosť genómu bola stanovená u Musa itinerans var. itinerans (sekcia Eumusa) a

najväčšia relatívna veľkosť genómu u Musa borneensis (sekcia Callimusa).

Na Obr. 15 je zoskupených 6 histogramov relatívneho obsahu jadrovej DNA, ktoré

boli získane pomocou prietokovej cytometrie s použitím PI ako fluorescenčného farbiva.

Všetky položky patria do skúmanej skupiny položiek rodu Musa. Ako štandard bol použité

Glycine max so známou veľkosťou genómu (2C = 2,5 pg).

38

Obr. 15 Histogramy relatívneho obsahu DNA vybraných analyzovaných položiek

rodu Musa získané analýzou pomocou prietokovej cytometrie. Analyzované jadrá boli

zafarbené PI a ako štandard bol použitý Glycine max (2C = 2,5 pg) Obsah jadrovej DNA

2C bol vypočítaný na základe pomeru pozície píkov G0/G1. A – M. itinerans var. itinerans

(ITC 1571). B – M. rosea (ITC 1598). C – M. cf. uranoscopos (ITC 1532). D – M. beccarii

var. beccarii (ITC 1516). E – M. yunnanensis (ITC 1573). F – M. bauensis (semienka od

prof. Markku Häkkinena).

39

6 Diskusia a záver

Génová banka banánovníka založená v roku 1985 vo Francúzsku a dnes sídliaca

v Lovani v Belgicku, si pôvodne kládla za cieľ zostaviť a uchovávať kolekciu jedlých

typov banánovníkov, prevažne triploidných klonov zo sekcie Eumusa a ich následnou

distribúciou širokej komunite pestovateľov a vedeckej komunite zaoberajúcej sa

šľachtením banánovníkov. Neskôr boli do tejto kolekcie zaradené tiež diploidné plané

druhy, o ktorých sa predpokladalo, že ich prirodzenou hybridizáciou v prírode došlo ku

vzniku jedlých typov banánovníkov – M. acuminata a M. balbisiana. Cieľom je vybrať

a uchovávať zástupcov, ktorý nie sú postihnutí žiadnym známym ochorením banánovníka.

Na druhej strane sa génová banka snažila vytvoriť čo najväčšiu zbierku rozdielnych

triploidných druhov. V posledných rokoch sa do génovej banky stále častejšie začleňujú

plané druhy rodu Musa a Ensete naprieč celou čeľaďou Musaceae s cieľom uchovať

a charakterizovať genetickú diverzitu tejto významnej čeľade.

Vzhľadom k nedostatkom morfo-taxonomického systému identifikácie, ktoré boli

spomenuté vyššie a súčasne nutnosť identifikácie a charakterizácie jednotlivých položiek

banánovníkov, sa génová banka banánovníku v posledných rokoch zamerala v spolupraci

so svojimi partnermi na túto oblasť. Podrobná genetická charakterizácia jednotlivých

položiek v génovej banke je charakterizovaná jednak pomocou prietokovej cytometrie,

ktorá sa využíva predovšetkým pre rýchle stanovenie ploidie jednotlivých klonov a tiež na

stanovenie obsahu DNA v jadre. Genetická diverzita zástupcov banánovníku v génovej

banke je charakterizovaná pomocou rôznych typov molekulárnych markerov. S týmto

cieľom bolo napr. vytvorené genotypovacie centrum banánovníku, ktoré pomocou 19

mikrosatelitových markerov analyzuje genetickú diverzitu a príbuzenské vzťahy zástupcov

čeľade Musaceae (Christelová et al., 2011).

Predkladaná bakalárska práca sa zaoberala štúdiom ploidie a stanovením

základného chromozómového čísla u 23 planých zástupcov rodu Musa, ktorí boli začlenení

do génovej banky v nedávnej dobe. Tieto druhy pochádzajú z Indonézie a s využitím

morfotaxonómie boli charakterizované a začlenené do jednotlivých sekcií. Predmetom

štúdie bolo určenie veľkosti genómu a ploidie pomocou prietokovej cytometrie a počet

chromozómov zadaných položiek vo forme nakvapkávaných protoplastových preparátov.

Pri stanovení ploidie pomocou prietokovej cytometrie bolo zistené, že nie je možné

s určitosťou určiť ploidný stupeň niektorých analyzovaných položiek, pravdepodobne

40

vzhľadom na rozdiely vo veľkosti jadrových genómov v rámci rôznych sekcií, ako

naznačuje štúdia Bartoš et al. (2005). Aby sme túto domnienku potvrdili, bola u každého

zástupcu jednak analyzovaná veľkosť jadrového genómu a súčasne boli odoberané

koreňové špičky jednotlivých rastlín s cieľom určiť presný počet mitotický metafáznych

chromozómov.

U všetkých analyzovaných druhov bol stanovený obsah jadrovej DNA. Presný

počet mitotických chromozómov sa vzhľadom k časovej náročnosti podarilo zistiť len u

16 položiek, táta práca bola naviac komplikovaná i relatívne nízkou fertilitou získaných

položiek.

Zo získaných výsledkov je možné povedať, že veľkosť genómu DNA v sekcii

Australimusa, ktorá obsahovala dve skúmané položky, kolísal od 1,390 – 1,422 pg, čo je

mimo zatiaľ publikovaných výsledkov (Doležel et al., Bartoš et al., 2005; Čížková et al.,

2012). Sekcia Callimusa preukázala jednu z najviac variabilnýh hodnôt veľkostí genómov

skúmaných položiek. Veľkosť genómu sa pohybovala od 1,417 – 1,722 pg a doposiaľ

najväčšia nameraná veľkosť genómu bola u M. borneensis. Veľkosť genómu v sekcii

Eumusa sa u dvoch analyzovaných položiek pohybovala od 1,217 – 1,311 pg, čo presne

koreluje s už publikovanými výsledkami. V sekcii Rhodochlamys sa veľkosť genómu

pohybovala od 1,261 – 1,432 pg, čo sa čiastočne zhoduje s publikovanými výsledkami, no

tiež poskytuje nové rozmedzie veľkostí genómov v rámci sekcie. U položky M.

yunnanensis, ktorá nebola doposiaľ zaradená do žiadnej zo sekcií, sa veľkosť genómu

pohybovala od 1,240 – 1,306 a počet mitotických chromozómov by korešpondoval so

zástupcami sekcií Eumusa alebo Rhodochlamys.

Ako už bolo spomenuté, ďalším z cieľov bolo stanovenie počtu mitotických

metafáznych chromozómov a to s využitím preparátov nakvapkávaných protoplastových

suspenzií. Napriek tomu, že klasickým typom rastlinného preparátu je roztlakový preparát,

u banánovníkov to nie možné, v podstate prakticky nevykonateľný, keďže korienky

banánovníkov sú relatívne veľké a hrubé.

Získané výsledky počtu chromozómov v daných sekciách preukázal, že u dvoch

položiek sekcie Australimusa, ktoré boli k dispozícii, nebolo možné do odovzdania práce

spočítať počet chromozómov a preto nebolo možné zhodnotiť koreláciu so známymi

výsledkami. Zo sekcie Eumusa boli analyzované tiež dve položky, z ktorých len u jednej

bol určený počet chromozómov 2n = 22 a súhlasil so známym počtom chromozómov

41

sekcie. V sekcii Rhodochlamys bolo k dispozícii celkovo 10 položiek, no počet

chromozómov bol určený u 8 položiek, 2n = 22 a teda súhlasil so známym počtom

chromozómov sekcie. Nakoniec v sekcii Callimusa bolo možné určiť počet chromozómov

u 6 z 9 položiek a v rámci sekcie koreloval počet chromozómov 2n = 18, 2n = 20 so

známym počtom v sekcii, no u M. bauensis bol stanovený počet chromozómov 2n = 22

a tým zjavne nezapadá do sekcie Callimusa, kam bol pôvodne umiestnený. Táto anomália

mohla byť spôsobená napr. nesprávnym popisom položky, jej zamenením v génovej banke

banánovníka alebo táto položka môže mať hybridný charakter a pomocou

morfometrických znakov ju nebolo možné presne určiť.

Zo získaných výsledkov je zjavné, že cytometrické techniky, spolu so stanovením

základného chromozómového čísla, pomohli overiť novo charakterizované plané druhy

rodu Musa, avšak k ich presnejšej charakterizácii je potrebné doplniť tieto klasické

cytologické a cytometrické techniky tiež o aplikáciu vhodných molekulárnych makrekov.

Vzhľadom na skutočnosť, že predkladaná práca bola súčasťou rozsiahleho projektu,

v rámci ktorého boli všetky analyzované položky, okrem M. bauensis, podrobené tiež SSR

analýze (viď Príloha 1), je možné pre každého analyzovaného zástupcu identifikovať jeho

najbližsie príbuzné druhy a zároveň sekciu v rámci čeľade Musaceae. Na základe tejto

analýzy tak môžeme napr. konštatovať, že druh M. yunnanensis (ITC 1573), patrí do sekcie

Rhodochlamys. SSR analýza tiež ukázala, že M. monticola a M. uranoscopos, ktoré boli

pôvodne začlenené do sekcie Australimusa, sú blízke príbuzné druhom zo sekcie

Callimusa. Avšak ako už bolo niekoľkokrát spomenuté, štúdie využívajúce molekulárne

markery k štúdiu diverzity a fylogenézy čeľade Musaceae naznačili spoločný pôvod

druhov sekcií Australimusa a Callimusa a bolo navrhnuté i zlúčenie týchto dvoch doposiaľ

samostatných sekcií. Podobné nezrovnalosti boli pomocou SSR analýzy zistené i u druhov

M. viridis a M. rubinea, ktoré su taxonomicky najbližšie ďalšiemu študovanému druhu –

M.itinerans var. xishuangbannensis a náleží do sekcie Eumusa. Zaujímavé bolo, že iná

varieta druhu M. itinerans sa nevyskytovala na spoločnej vetve s týmito zástupcami, ale je

blízko príbuzná druhom M. balbisiana zo sekcie Eumusa, ako sa predpokladalo. Na

základe získaných výsledkov môžeme špekulovať, že druh M. itinerans var.

xishuangbannensis môže mať buď hybridnú povahu alebo je to len nesprávne popísaná

položka. Každopádne, analyzovaní zástupci budú podrobení tiež analýze ITS oblastí

s cieľom zistiť ich hybridnú povahu (Hřibová et al., 2011; Christelová et al., 2011).

42

Predkladaná práca poskytla dôležité informácie o veľkosti genómov 23 diploidných

zástupcov, ktorí boli novo začlenení do génovej banky. Ploidia a počet chromozómov je

prvým krokom v tzv. genotypovacej platforme banánovníku (Christelová et al., 2011) a je

dôležitou informáciou pre následujúcu SSR analýzu.

43

7 Literatúra

Argent G.C.G. (1976) The wild bananas of Papua New Guinea – Notes of Royal Botanical

Garden 35: 77-114

Balint - Kurti P., Clendennen S., Doleželová M., Valárik M., Doležel J., Beetham P., May

G. (2000) Identification and chromosomal localization of the monkey retrotransposon in

Musa spp. – Molecular and General Genetics 263: 908-915

Bartoš J., Alkhimová O., Doleželová M., De Langhe E., Doležel J. (2005) Nuclear genome

size and genomic distribution of ribosomal DNA in Musa and Ensete (Musaceae):

taxonomic implications – Cytogenetic and Genome Research 109: 50-57

Cheesman E.E. (1947) Classification of the bananas – Kew Bull 2: 97-117

Cheesman E.E. (1950) Classification of the bananas. III. Critical notes on species – Kew

Bull 5: 151-155

Čížková J., Hřibová E., Humplíková L., Christelová P., Suchánková P. et al. (2013)

Molecular analysis and genomic organization of major DNA satellites in Banana (Musa

spp.) - PLoS ONE 8(1): e54808. doi:10.1371/journal.pone.0054808

D'Hont A., Denoeud F. et al. (2012) The banana (Musa acuminata) genome and the

evolution of monocotyledonous plants - Nature, doi:10.1038/nature11241

Doležel J. (1991) Flow cytometric analysis of nuclear DNA content in higher plants -

Phytochemical analysis 2: 143-154

Doležel J. et al. (2004) Cytogenetic and cytometric analysis of nuclear genome in Musa

Doležel J., Bartoš J. (2005) Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome

size – Annals of Botany. 95 (1): 99-110.doi: 10.1093/aob/mci005

Doležel J., Binarová P., Lucretti S. (1989) Analysis of nuclear DNA content in plant cells

by flow cytometry - Biologia Plantarum 31: 113–120

44

Doležel J., Doleželov M., Novak, F.J. (1994). Flow cytometric estimation of nuclear DNA

amount in diploid bananas (Musa acuminata and M.balbisiana) - Biol.Plant. 36:351-357

Doležel J., Göhde W. (1995) Sex determination in dioecious plants Melandrium album and

M. rubrum using high-resolution flow cytometry - Cytometry 19: 103–106.

Doležel J., Greilhuber J., Suda J. (2007) Flow cytometry with plant cells - Wiley-vch,

Weinheim

Doležel, J. (1997). Analýza a třídění chromozomů rostlin pomocí průtokové cytometrie -

Biologické listy 62 (2): 131-160

Doleželová M., Valárik M., Swennen R., Horry J., Doležel J. (1998) Physical mapping of

the 18S-25S a 5S ribosomal RNA genes in diploid bananas – Biologia Plantarum 41: 497-

505

Duran C., Appleby N., Edwards D., Batley J. (2009) Molecular genetic markers: discovery,

applications, data storage and visualisation – Current Bioinformatics 4: 16-27

Galan M., Guivier E., Caraux G., Charbonnel N., Cosson J.F. (2010) A 454 multiplex

sequencing methos for rapid and reliable genotyping of highly polymorphic genes in large-

scale studies – BMC Genomics 11: 296

Galbraith D.W., Harkins K.R., Maddox J.M., Ayres N.M., Sharma D.P., Firoozabady E.

(1983) Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues - Science

220: 1049–1051

Gawel N.J., Jarret R.L. (1995) Molecular markers, genetic diversity and systematics in

Musa – Banana and Plantain, Longman, New York

Gawel N.J., Jarret R.L., Whittemore A.P. (1992) Restriction fragment length

polymorphism (RFLP) – based phylogenetic analyses of Musa – Theoretical and Applied

Genetics 84: 286-290

Häkkinen M. (2004) Musa voonii, a new Musa species from nothern Borneo and

discussion of the section Callimusa in Borneo – Acta Phytotax Geobot 55: 79-88

45

Häkkinen M. (2005) Musa azizii, a new Musa species (Musaceae) from nothern Borneo –

Acta Phytotax Geobot 56: 27-31

Heslop-Harrison J.S., Schwarzacher T. (2007) Domestication, genomics and the future for

Banana

Heslop-Harrison P. et al. (1998) Fluorescent in situ hybridization of plant chromosomes:

illuminating the Musa genome – INIBAP annual report 1998. INIBAP: Montpellier (FRA),

1999. p. 26-29

Heslop-Harrison P., Osuji J. et al. (1999) Fluorescent in situ hybridization of plant

Hippolyte et al. (2012) Foundation characteristics of edible Musa triploids revealed from

allelic distribution of SSR markers

Horry J.P., Jay M. (1988) An evolution background of bananas as deduced from flavonoids

diversification: identification of genetic diversity of the genus Musa – International

network for improvement of banana and plantain 41-55

Hřibová E., Čížková J., Christelová P., Taudien S., de Langhe E., Doležel J. (2011) The

ITS1-5.8S-ITS2 sequence region in the Musaceae: structure, diversity and use in molecular

phylogeny. PLoS ONE 6 - IPGRI-INIBAP (Bioversity)

Hřibová E., Christelová P., Roux N., Doležel J. A Simple and Robust Approach for

Genotyping in Musaceae, Acta Hort., submitted

Hudson M.E. (2008) Sequencing breakthroughs for genomics ecology and evolutionary

biology – Molecular Ecology Resources 8: 3-17

Christelová, P., Valárik, M., Hřibová, E., De Langhe, E. et Doležel, J. (2011) A multi gene

sequence-based phylogeny of the Musaceae (banana) family - BMC Evolutionary Biology,

11, 103, 10.1186/1471-2148-11-103. doi:10.1186/1471-2148-11-103

Isobe M., Hashimoto K. (1994) The chromosome count of nine taxa in Musa and its allied

genus Musella - Bulletin of the Hiroshima Botanical Garden 15: 7-11

46

Jarret R.L., Litz R.E. (1986) Enzyme polymorphism in Musa acuminata Colla – Journal of

Heredity 77: 183-186

Jiming Jiang, Bikram S. Gill (2006) Current status and the future of fluorescence in situ

hybridization (FISH) in plant genome research - Genome, 49(9): 1057-1068, 10.1139/g06-

076

Langhe E., Vrydaghs L., Maret P., Perrier X., Denham T. (2009) Why bananas matter: an

introduction to the history of banana domestication – Ethnobotany Research and

Applications 7: 165-177

Lescot M. et al. (2008) Insight into the Musa genome: Syntenic relationships to rice and

between Musa species

Li L.F., Hakkinen M., Yuan Y.M., Hao G., Ge X.J. (2010) Molecular phylogeny and

systematice of the banana family (Musaceae) infferred from multiple nuclear and

chloroplast DNA fragments, with a special reference to the genus Musa – Molecular

Phylogenetics and Evolution 57: 1-10

Liao D. (1999) Concerted evolution: molecular mechanism and biological implications –

American Journal of Human Genetics 64: 24-30

Liu A.Z., Kress W.J., Li D.Z. (2010) Phylogenetic analyses of the banana family

(Musaceae) based on nuclear ribosomal (ITS) and chloroplast (trnL-F) evidence – Taxon

59: 4707-4711

M. Lescot, P. Piffanelli et al. (2008) Insights into the Musa genome: syntenic relationships

to rice and between Musa species - BMC Genomics, 9:58

Osuji O.J., Harrison G. et al. (1997) Identification of the Genomic Constitution of Musa L.

Lines (Bananas, Plaintains and Hybrids) Using Molecular Cytogenetics – Annals of

Botany 80: 787 – 793

Otto F.J. (1990) DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear

DNA. In: Darzynkiewickz Z, Crissman HA, eds - Methods in cell biology, Vol. 33. San

Diego: Academic Press, 105–110

47

Pfosser M., Amon A., Lelley T., Heberle-Bors E. (1995) Evaluation of sensitivity of flow

cytometry in detecting aneuploidy in wheat using disomic and ditelosomic wheat-rye

addition lines - Cytometry 21: 387–393

Pillay M. et al. (2006) Ploidy and genome composition of Musa germplasm at International

Institute of Tropical Agriculture (IITA)

Risterucci A.M., Hippolyte I., Perrier X et al. (2009) Development and assessment of

diversity arrays technology for high-throughput DNA analyses in Musa - Theoretical and

Applied Genetics 119: 1093–1103

Roux N., Rouard M., Huang X.L. and Smith M. (2011) Opportunities for bridging the gap

between genomics and genetic improvement in Musa spp. - Acta Hort. (ISHS) 897:509-

515

Semagn K., Bjornstad A., Ndjiondjop M.N. (2006) An overview of molecular marker

methods for plants – African Journal of Biotechnology 5: 2540-2568

Shepherd K. (1999) Cytogenetics of the genus Musa - INIBAP, Montpellier, France

Shepherd K. (1999) Cytogenetics of the genus Musa - International network for the

improvement of banana and plantain, Montpellier, France, p. 160

Simmonds N.W. (1954) Isolation in Musa, sections Eumusa and Rhodochlamys –

Evolution 8: 65-74

Simmonds N.W. (1962) The evolution of the bananas – London. Longmans

Suda J. (2005) Co se skrývá za rostlinnou průtokovou cytometrií

Valárik M., Šimková H., Hřibová E., Šafář J., Doleželová M., Doležel J. (2002) Isolation,

characterization and chromosome localization of repetetive DNA sequences in bananas

(Musa spp.) – Chromosome Research 10: 89-100

Vera J.C., Wheat C.W., Fescemyer H.W., Frilander M.J, Crawford D.L., Hanski I., Marden

J.H. (2008) Rapid transcriptome characterization for a nonmodel organism using 454

pyrosequencing – Molecular Ecology 17:1636-1647

48

Withers L.A. (1990) Prospects and problems in vitro genebanks – Musa: conservation and

documentation. Proceedings of a workshop, Leuven, Belgium, pp. 21-24

Wong C., Kiew R., Argent G., Set O., Lee S., Gan Y. (2002) Aseesment of the validity of

the sections in Musa (Musaceae) using AFLP – Annals of Botany 90: 231-238

Internetové zdroje:

www.musagenomics.org

http://banana-genome.cirad.fr/musa

www.promusa.org

www.fao.org

www.vurv.cz

http://www.crop-diversity.org/banana/

49

8 Zoznam použitých skratiek a symbolov

1C – množstvo jadrovej DNA v nereplikovanom haploidnom jadre

AFLP – dĺžkový polymorfizmus amplifikovných fragmentov (Amplified Fragment Length

Polymorphism)

bp – páry báz (Base Pairs)

CV – variačný koeficient

DAPI – 4',6-diamidino-2-phenylindole (fluorescenčné farbivo)

DART – Diversity Arrays Technology (molekulárny marker)

DNA – deoxyribonukleová kyselina

EDTA – etyléndiamíntetraoctová kyselina

EtBr – etídium bromid (fluorescenčné farbivo)

FISH – fluorescenčná in situ hybridizácia

IRAP – amplifikovaný polymorfizmus medzi retrotranspozónmi (Inter-Retrotranspozon

Amplified Polymorphism)

ITC – International Transit Centre

ITS – vnútorný prepisovaný medzerník (Internal Transcribed Spacer)

KCl – chlorid draselný

Mb – milión párov báz (Megabase pairs)

n – haploidná sada chromozómov

pg – pikogram (jednotka, v ktorej sa udáva DNA)

PI – propídium jodid (fluorescenčné farbivo)

RAPD – náhodne amplifikovaná polymorfná DNA (Random Amplified Polymorphic

DNA)

50

RFLP – dĺžkový polymorfizmus restrikčných fragmentov (Restriction Fragment Length

Polymorphism)

RNA – ribonukleová kyselina

SMTA – Dohoda o štandardnom prenose materiálu (Standard Material Transfer

Agreement)

SSR – jednoduché repetitívne sekvencie (Simple Sequence Repeats)

51

9 Prílohy

Príloha 1: Kladogram 100 diploidných položiek rodu Musa. SSR dáta získané

fragmentačnou analýzou 19 špecifických mikrosatelitových markerov boli použité na

konštrukciu nezakoreneného kladogramu pomocou UPGMA metódy (Christelová et. al.,

2011; Christelová et al., nepublikované). Pozície novo analyzovaných položiek je

v kladograme farebne zvýraznená a jedna, u ktorej nebola popísaná sekcia, je označené

hviezdičkou. Jednotlivé sekcie sú na strome farebne odlíšené: Eumusa – červená,

Rhodochlamys – zelená, Australimusa – ružová a Callimusa – fialová.