1959 H. H. SCHLUBACH, G. HOHN und K. REPENNING I23

in unpolaren Losungsmitteln wurden mit dem Dipolmeter 01 nach Dr. habil. K. SLEVOGT durchgefiihrt, die benutzte Einfiillvorrichtung war ahnlich der von W. STROHMEIER und K. N U T Z E L ~ ~ ) beschriebenen. Die DK-Werte in den polaren Losungsmitteln wurden rnit dem Dekameter 03 nach Dr. SLEVOCT gemessen. Zur Messung der Brechungsindices wurde ein ABBE-Refraktometer der Fa. ZEISS benutzt. Die UV-Spektren wurden mit einem Spektro- photometer PMQ 11 der Fa. ZEISS (Konzentrationen 10-3 bis 10-5 Mol/l) aufgenommen, die IR-Spektren mit dem Doppelstrahlgerat der Fa. LEITZ. Der vNH-Bereich wurde dabei ge- sondert in einem l : 3 gespreizten Wellenzahlbereich untersucht. Zur Messung der Rotations- dispersionen diente ein Prazisions-Halbschattenpolarimeter mit Monochromator der Fa. SCHMIDT & HAENSCH.

28) W. STROHMEIER 538 (1955).

und K. NUTZEL, Z. Elektrochem., Ber. Bunsenges. physik. Chem. 59,

Untersuchungen iiber Polyfructosane, LVI 1)

Z W E I POLYFRUCTOSANASEN AUS ASPERGILLUS NIGER

von HANS HEINRICH SCHLUBACH, GABRIELE HOHN und KLAUS REPENNING

Aus dem Physiologisch-Chemischen Institut der Universitat Munchen Eingegangen am 14. Mai 1959

I n Trockenpraparaten aus Aspergillus niger und oryrne konnten zwei ver- schiedene Polyfructosane hydrolysierende Enzyme nachgewiesen werden. Das auf Inulin wirkende Enzym wird durch Streptomycin gehemmt, das die Hydrolyse von Loliin bewirkende wird durch Streptomycin nicht beeinflufit.

Das gleichzeitige Vorkommen von Polyfructosanen vom Inulin- und vom Phleintyp, das H. H. SCHLUBACH und E. HABERLAND~) in der Gerste und H. H. SCHLUBACH und H. 0. A. KOEHN~) im Roggen nachgewiesen haben, ist auf die Wirkung zweier verschiedener Enzyme zuruckgefuhrt worden, von denen das eine die 2-t 1 -Bindun- gen der Polyfructosane vom Inulintyp aufzubauen und zu hydrolysieren vermag, wahrend das andere auf die 2+6-Bindungen der Polyfructosane vom Phleintyp ge- richtet ist. Bei den beiden Getreidearten ergibt sich aus der gleichzeitigen Wirkung der beiden Enzyme der Aufbau verzweigter Polyfructosane. Wenn es gelang, die Ver- schiedenheit beider Enzyme nachzuweisen, war damit ein Beweis fur die Richtig- keit dieser SchluBfolgerungen erbracht.

I ) LV. Mitteilunp: H. H. SCHLUBACH und H. 0. A. KOEHN. Liebigs Ann. Chem. 614, I -

126 (1958). 2) H. H. SCHLUBACH und E. HABERLAND, Liebigs Ann. Chem. 614, 119 (1958).

124 H. H. SCHLUBACH, C . HOHN und K. REPENNING Bd. 627

Schon H. PRINGSHEIM und W. G. H E N S E L ~ ) haben gezeigt, daI3 sich aus Aspergillus nigev Praparate gewinnen lassen, welche Inulin rasch und vollstandig hydrolysieren. Wie wir a n einem Phlein aus Lolium perenne feststellen konnten, gilt das gleiche auch fur dieses Polyfructosan. Demnach waren in Aspergillus niger beide Enzymarten anzunehmen.

Nun ist von M. STACEY und Mitarbeitern4) gezeigt worden, da8 Streptomycin bci einer Reihe von enzymatischen Kohlenhydratspaltungen spezifische Hemmungen zu bewirken vermag. Die Ubertragung dieser Erfahrungen auf die vorliegende Frage hat zu dem Ergebnis gefuhrt, da13 in Aspergilliis niger ein Enzym vorhanden ist, dessen Wirkung auf Inulin durch Streptomycin gehemmt wird, wahrend die Wirkung eines anderen Enzyms, das Phleine spaltet, durch die gleiche Verbindung unbeein- flul3t bleibt.

Herrn Prof. Dr. A. BUTENANDT danken wir fur die gastfreie Aufnahme im lnstitut fur Physiologische Chemie in Munchen, der DEUTSCHEN FORSCHUNGSGEMEINSCHAFT fur perso- nelle, dem FONDS DER CHEMIE fur die Gewahrung von materiellen Mitteln.

B E S C H R E I B U N G D E R V E R S U C H E

Um einen AnschluB an die Untersuchungen von M. STACEY zu gewinnen, haben auch wir rnit dem Stamm 152 von Aspergillus niger gearbeitet, von dem uns Herr Professor STACEY dankenswerter Weise eine Kulturprobe iiberlassen hat. Als Nahrboden wurde der von S. A. BARKER und T. R. CARRINGTONS) angegebene verwandt. Es wurde vor dem Auftreten der Sporenbildung geerntet. Das Mycel wurde mit dest. Wasser gewaschen, im Starmix zer- rieben, auf der Zentrifuge von Zelltriimmern und Substratresten befreit und bei o" in die zehnfache Menge Aceton eingetragen. Darauf wurde abgegossen und erneut in die gleiche Menge Aceton eingetragen. Es wurde wiederum abgegossen und mit absol. Ather gewaschen. SchlieBlich wurde i. Vak. getrocknet und bei 0" aufbewahrt.

15 g des Trockenpraparates wurden unter Kiihlung rnit Eiswasser in der von W. ZILLIG und H. HOLZEL~) beschriebenen Apparatur rnit der 2--3fachen Menge an Glasperlen in einem Stahlzylinder geschuttelt (3000 StoBe/Min.). Das Produkt wurde rnit Standard-Citrat- puffer von PH 5 bei 0" angeruhrt, nach 30 Min. auf einer Glasfritte abgesaugt und mit soviel Pufferlosung nachgewaschen, daB lOOccm Filtrat erhalten wurden. Dieses wurde durch Zentri- fugieren von Zelltrummern befreit. Je 20 ccm einer 1.62-proz. waBrigen Losung von Inulin bzw. Loliin von [a],, = -36" wurden rnit 20ccm der Enzymlosung versetzt und rnit der Pufferlosung auf 50 ccm aufgefiillt. Ebenso wurden je 20 ccm der Losungen der Polyfructosane mit je 4 ccm einer 8-proz. Losung von Streptomycin ,,BAYER" versetzt und durch Zentrifu- gieren von einer dabei auftretenden Triibung befreit. Dann wurde ebenfalls rnit der Puffer-

3 ) H. PRINGSHEIM und W. G. HENSEL, Ber. dtsch. chem. Ges. 64, 1431 (1931). 4) S. A. BARKER, E. J. BOURNE, M. STACEY und R. B. WARD, J. chem. SOC. [London] 1957,

5 ) S. A. BARKER und T. R. CARRINGTON, J . chem. SOC. [London] 1953, 3588. 6) W. ZILLIG und H. HOLZEL, Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 312, 140 (1958).

2994; Biochem. J . 69, 60 (1958).

1959 Polyfructosanasen aus Aspergillus niger I25

losung auf 50 ccm aufgefullt und der Ansatz bei 30" gehalten. Gemessen wurde die Dre- hungsanderung im 1-dm-Rohr.

Stunden 3.5 --

5 Difierenz

Inulin -0.47" -1.37" -1.41" -1.46" 0.99"

Loliin -0.54" -0.97" --0.97" -0.98" 0.42" Loliin + Streptomycin -0.74" -1.15" -1.17" -1.19" 0.45"

Inulin + Streptomycin -0.91" -0.94" -0.93" -0.93" 0.02"

Bei einem anderen, aus einem selbst gezuchteten Aspergillus niger gewonnenen Trocken- praparat und Losungen von 1.63 g Inulin bzw. 1.64 g Loliin in je 50 ccm Puffer sowie in ebensolchen Ansatzen unter Zusatz von je 4 ccm einer 8-proz. Streptomycin-Losung wurden gemessen :

_ _ _ _ _ _ _ ~ _ _ _ _ _ _ ~ ~- -~ ~- - -

Differenz ~-

Stunden 0.5 2.0 3.5 5

Inulin -0.49" -1.31" -1.39" -1.41" 0.92"

Loliin --0.58" --0.81" -0.86" -0.87" 0.29" Loliin + Streptomycin --0.79' --1.12" --1.18" --1.20" 0.41"

-~ ~ - - .- ~

Inulin + Streptomycin -0.79" -0.80" -0.81" -0.80" 0.01"

Bei einem dritten Versuch wurde ein aus Aspergillus oryzae gewonnenes technisches Hydro- lasengemisch von C. F. BOEHRINGER & SOHNE, Mannheim-Waldhof, verwendet. Bei Ansatzen von je 20 ccm 3.24-proz. Zucker-Losungen, 5 ccm 2.6-proz. Enzym-Losungen in Standard- Citratpuffer von PH 4 (in den Hemmungsversuchen unter Zusatz von je 5 ccm einer 4-proz. Streptomycin-Losung) und Auffullung mit Stardard-Citratpuffer auf 50 ccm wurde gemessen :

Stunden 0 1 2.5 4 Differenz

Inulin -0.47" -0.52" -0.57" -0.59" 0.12" Inulin + Streptomycin -0.80" --0.80" -0.82" -0.82" 0.02' Loliin --0.55" -0.58" -0.64" -0.66 0.1 1" Loliin f Streptomycin -0.89" -0.90' -0.95" -1.00' 0.11"

In allen drei Fallen ist also mit Streptomycin beim Inulin eine nahezu vollstandige Hem- mung eingetreten, wahrend eine solche beim Loliin ausgeblieben ist. Sowohl in Aspergillus niger als auch in Aspergillus oryzae sind also zwei verschiedene Polyfructosanasen enthalten, von denen die eine die 2+l-Bindungen, die andere die 21-6-Bindungen der Polyfructosane hydrolysiert.

Von STACEY und Mitarbeitern ist papierchromatographisch die Anwesenheit von zwei ver- schiedenen Carbohydrolasen in Aspergillus niger nachgewiesen worden. Da aber angegeben wird, daU sie weder Inulin noch Laevan zu hydrolysieren vermogen, miissen sie als von den von uns nachgewiesenen Enzymen als verschieden angesehen werden.