Aus der Ambulatorischen und Geburtshilflichen Tierklinik der Veterinärmedizinischen

Fakultät der Universität Leipzig

und der

Abteilung Veterinärmedizin des Landesbetriebes des Hessischen Landeslabors, Standort

Gießen

Untersuchungen zur Eutergesundheit in Milchviehbeständen des

Bundesstaates Jalisco, Mexiko

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)

durch die Veterinärmedizinische Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von

SYBILLE PETRA JÄGER

aus Frankfurt am Main

LEIPZIG, 2006

Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Dekan: Prof. Dr. Karsten Fehlhaber

Betreuer: Prof. Dr. Axel Sobiraj

Dr. Michael Zschöck

Gutachter: Prof. Dr. Axel Sobiraj, Ambulatorische und Geburtshilfliche Tierklinik,

Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig

Dr. Michael Zschöck, Landesbetrieb des Hessischen Landeslabors,

Gießen

Prof. Dr. Martina Hoedemaker, Klinik für Rinder,

Tierärztliche Hochschule Hannover

Doz. Dr. Peggy Braun, Institut für Lebensmittelhygiene,

Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig

Tag der Verteidigung: 13.06.2006

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

2 Literaturübersicht 2.1 Mastitisformen 3 2.2 Mastitiserreger 6

2.2.1 Kontagiöse, euterassoziierte Mastitiserreger 8

2.2.1.1 Staphylococcus (S.) aureus

2.2.1.2 Äskulin-negative Streptokokken 14

2.2.1.2.1 Streptococcus (S.) agalactiae

2.2.1.2.2 Streptococcus (S.) dysgalactiae 18

2.2.1.3 Corynebacterium (C.) bovis 19

2.2.2 Umweltassozierte Mastitiserreger 21

2.2.2.1 Koagulase-negative Staphylokokken

2.2.2.2 Äskulin-positive Streptokokken 23

2.2.2.2.1 Streptococcus (S.) uberis

2.2.2.2.2 Enterococcus spp. 26

2.2.2.3 Enterobacteriaceae (Coliforme) 27

2.3 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) 29

2.4 Wirtschaftliche Verluste durch Mastitiden 31

2.5 Klimatische Einflüsse auf das Mastitisgeschehen 35

2.6 Geschichte und heutiger Stand der Milchproduktion in Mexiko 36

2.7 Betriebsformen in Mexiko 41

2.7.1 Spezialisierte Betriebe

2.7.2 Halbspezialisierte Betriebe 42

2.7.3 Familiäre Hinterhofbetriebe 43

2.7.4 Doppelnutzungsbetriebe 44

2.8 Stand Jaliscos im mexikanischen Milchsystem 45

3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Milcherzeugerbetriebe und Kuhbestand 49

3.2 Datenerhebung auf den Betrieben 51

3.3 Probenentnahme und Transport 51

3.4 California-Mastitis-Test 52

3.5 Euterpalpation 52

3.6 Zytobakteriologische Untersuchung der Milchproben 53

3.6.1 Anzüchtungsmedien 53

3.6.2 Subkultvierung der Kulturen 54

3.6.3 Identifizierung der Bakterienkulturen 54

3.7 PCR-vermittelter Nachweis speziesspezifischer Genabschnitte 58

3.7.1 Präparation der bakteriellen DNA 58

3.7.2 Verwendete Oligonucleotidprimer und Temperaturprogramme 58

3.7.2.1 Staphylococcus aureus 58

3.7.2.2 Streptococcus agalactiae 59

3.7.2.3 Streptococcus uberis 60

3.7.3 Agarosegelelektrophorese 60

3.7.4 Ethidiumbromidfärbung 60

3.8 Makrorestriktion der chromosomalen DNA und PFGE 61

3.8.1 Präparation der bakteriellen DNA 61

3.8.2 Restriktionsverdau der Gesamtzell-DNA 62 3.8.3 Laufbedingungen der PFGE 62

3.8.4 Auswertung der PFGE-Muster 63

3.9 Statistische Methoden. 63

4 Ergebnisse 4.1 Beschreibung der besuchten Betriebe 64

4.2 Beurteilung der Fütterung 65

4.3 Beurteilung der Melkhygiene und des Trockenstellens 66

4.4 Ergebnisse des CMT 68

4.5 Befunde der Euterpalpation und Sekretbeurteilung 69

4.6 Ergebnisse der bakteriologischsen Untersuchungen 70

4.7 Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchungen 71

4.8 Ergebnisse der Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) 72

4.9 Ergebnisse der statistischen Auswertung 73

5 Diskussion 5.1 Hygienische Verhältnisse von Ausläufen und Melkständen 80

5.2 Vorkommenshäufigkeit subklinischer und klinischer Mastitiden 81

5.3 Prävalenz der einzelnen Mastitiserreger 84

5.4 Melkhygiene und –technik 90

6 Zusammenfassung 95

7 Summary 97

8 Literaturverzeichnis 99

Anhang

Abkürzungsverzeichnis A. dest. Aqua destillata Abb. Abbildung Bp Basenpaare bzw. beziehungsweise C. Corynebacterium ca. circa cAMP Cycloadenomysinmonophosphat cfu colony forming unit cm Zentimeter CMT California-Mastitis-Test D diskriminatoscher Index DGDG Direcion general de ganadería DIN Deutsches Institut für Normung DNA Desoxyribonukleinsäure DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft E. Escherichia EDTA Ethylen-Diamin-Tetraessigsure et al. et alii g Gramm h Stunde I.E. Internationale Einheit IDF International Dairy Federation INEGI Instituto Nacional de Estadíistica, Geografía e Informática km Kilometer KNS Koagulase-negative Staphylokokken m Meter mg Milligramm ml Milliliter min Minute nm Nanometer NOM Norma oficial mexicana PCR Polymerase-Kettenreaktion pH pondus hydrogenii PFGE Pulsfeldgelelektrophorese RNA Ribnukleinsäure S. Staphylococcus, Streptococcus SAGAR Statistisches Zentrum für Ackerbau und Viehzucht in Mexiko SE Staphyokokken-Enterotoxine spp. Spezies ssp. Subspezies Tab. Tabelle TSST-1 Toxic Shock Syndrome Toxin-1 U Unit U/min Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett V Volt Vol. Volumen WHO Weltgesundheitsorganisation

z.B. zum Beispiel ºC Grad Celsius μg Mikrogramm μl Mikroliter 0.5x halbkonzentriert 10x zehnfach konzentriert

Meinen Eltern

und Freunden aus Mexiko

1

1 Einleitung

Im mexikanischen Staat Jalisco werden täglich 4,7 Millionen Liter Milch produziert. Dieser

ist mit einer Beteiligung an der nationalen Milchproduktion von 17,4% der größte

Milchproduzent Mexikos (SAGAR 2004). So werden zurzeit in diesem westlichen Staat

Mexikos über 800.000 Milchkühe gehalten (JOSÉ ZORRILLA et al. 1996). Insbesondere

durch eine zunehmende Industrialisierung der Betriebe wächst die Milchproduktion im

Einzugsbereich Guadalajaras, der Hauptstadt Jaliscos und zweitgrößten Stadt Mexikos, stetig.

Da Mexiko zur Deckung des nationalen Konsums an Trinkmilch und Frischmilchprodukten

sowie Käse trotz stetig wachsender Produktion immer noch auf enorme Importe insbesondere

aus den USA und Europa angewiesen ist, eröffnen sich für kleine und mittlere

landwirtschaftliche Betriebe im Milcherzeugergebiet Jaliscos gute Verdienstmöglichkeiten

durch die Haltung von Milchkühen. Jedoch kann nur mit gesunden Kühen wirtschaftlich

Milch produziert und den Verbrauchern ein hochwertiges Lebensmittel angeboten werden.

Weltweit die wirtschaftlich und lebensmittelhygienisch bedeutendste Erkrankung der

Milchkuh ist die Mastitis, die Entzündung der Milchdrüse.

Klinische und subklinische Mastitiden sind in den Milchviehherden weit verbreitet und führen

zu Veränderungen in der Zusammensetzung der Milch, zu Leistungsrückgang bis hin zum

vollständigen Funktionsverlust der betroffenen Milchdrüse, selten auch zum Tod des Tieres.

Die Milch erkrankter Kühe ist darüber hinaus mit bakteriellen Krankheitserregern

kontaminiert und daher für den menschlichen Verzehr nicht geeignet. Die Milch klinisch

erkrankter Tiere darf nicht zur Herstellung von Lebensmitteln genutzt werden. Aus den

genannten Gründen stellt die Mastitis ein erhebliches wirtschaftliches Problem dar. Trotz

dieser Bedeutung stehen kaum Informationen zur Mastitissituation in Jalisco und

insbesondere zu den Vorkommenshäufigkeiten der verschiedenen Mastitiserreger zur

Verfügung. Untersuchungen in anderen Regionen Mexikos haben gezeigt, dass mit einer

Prävalenz der subklinischen Mastitis zwischen 40 und 78% gerechnet werden muss (JUÁREZ

et al. 1980; AVILA et al. 1991). Bei an Mastitis erkrankten Schlachttieren in Jalisco konnten

überwiegend kontagiöse Mastitiserreger wie Streptococcus (S.) agalactiae und

Staphylococcus (S.) aureus isoliert werden (WOLTER et al. 2002).

Die primären Ziele der vorliegenden Arbeit lagen in der Ermittlung der aktuellen

Mastitissituation in Jalisco. Es wurden 33 Milchbetriebe besucht, deren Haltungs- und

Melkhygiene beurteilt, Viertelanfangsgemelkproben zur Melkzeit entnommen sowie darauf

folgend die zytobakteriologische Untersuchung dieser Milchproben im Labor durchgeführt,

2

um die Vorkommenshäufigkeiten der einzelnen Mastitiserreger nachzuweisen. Die isolierten

Erreger wurden für weitergehende Untersuchungen subkultiviert und asserviert. Zur

abschließenden Identifizierung der Feldisolate wurden neben den herkömmlichen

phänotypischen Techniken molekulare Untersuchungsverfahren wie etwa der Nachweis

speziesspezifischer Gene bzw. Genabschnitte mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR)

durchgeführt. Zum Nachweis epidemiologischer Zusammenhänge wurde zusätzlich die

Makrorestriktionsanalyse der chromosomalen DNA mit anschließender

Pulsfeldgelelektrophorese eingesetzt. Desweiteren wurden von EL-SAYED et al. (im Druck)

durch PCR-vermittelte Analysen das Toxinbildungsvermögen bzw. das Toxin-Genmuster von

17 der asservierten S. aureus-Kulturen untersucht, wodurch die lebensmittelhygienische

Bedeutung dieses Erregers für die mexikanische Bevölkerung in Anbetracht der hohen

Rohmilchdirektvermarktung eruiert werden sollte. Mit Hilfe der statistischen

Datenauswertung wurde versucht, Zusammenhänge zwischen betriebswirtschaftlichen und

melkhygienischen Gegebenheiten und dem nachgewiesenen Erregerspektrum in den

Betrieben aufzuzeigen.

Nur durch genaue Kenntnis der Mastitissituation und Erregerhäufigkeiten wird es zukünftig

möglich sein, individuelle auf mexikanische Verhältnisse angepasste Sanierungsstrategien für

die Milchviehherden zu entwickeln und dauerhaft zu implementieren. Auf diese Weise könnte

die Milchproduktion gesteigert und der hohe wirtschaftliche Verlust der mexikanischen

Milchindustrie minimiert und gleichzeitig dem gesundheitlichen Verbraucherschutz genüge

getan werden.

3

2 Literaturübersicht

2.1 Mastitisformen Die Mastitis wird als eine Entzündung des Milchdrüsengewebes definiert (SMITS et al. 1998;

HERINDSTAD et al. 2000; RIFFON et al. 2001; ZADOKS et al. 2002). Sie gehört zu den

häufigsten Erkrankungen in Milchviehbetrieben und kommt weltweit vor. Wegen der

enormen wirtschaftlichen Verluste in der Milchproduktion und –verarbeitung ist sie der

wirtschaftlich bedeutendste Krankheitskomplex der Milchrinderhaltung. Diese Verluste

werden vor allem durch eine Verringerung der Milchleistung und ein frühzeitiges Merzen von

Milchkühen sowie ein Ansteigen der notwendigen tiermedizinischen Behandlungen

verursacht (CERON-MUÑOZ et al. 2002). Außerdem wird durch die Mastitis die hygienische

Wertigkeit der Milch beeinträchtigt. Aus diesem Grund wird diese Krankheit auch als eine der

teuersten Erkrankungen der Tierproduktion bezeichnet (KIELWEIN 1994; CORREA et al.

2002). Nach JAYARO et al. (1993) und FORSMAN et al. (1997) ist diese komplexe

Faktorenerkrankung ferner eine der am schwierigsten zu kontrollierenden Tierkrankheiten.

Nach WENDT (1998) lassen sich Differenzierungen der Erkrankung nach pathologischen,

klinischen und zeitlichen Aspekten sowie nach Art der auslösenden Ursache vornehmen.

Die Mastitis wird überwiegend durch pathogene Mikroorganismen verursacht, kann aber auch

durch Traumata sowie chemische, thermische oder andere nicht infektiöse Noxen ausgelöst

werden (DEGO u. TAREKE 2003). JAYARO et al. (1993) erwähnen, dass sich die Mastitis

vor allem dadurch von anderen Tierkrankheiten unterscheidet, dass viele verschiedene

Bakterienspezies eine Euterentzündung auslösen können. YANCEY (1999) gibt an, dass die

Mastitis durch ungefähr 135 verschiedene Agentien, zum Großteil Bakterien, hervorgerufen

werden kann.

Neben dem eigentlichen Drüsengewebe (Mastitis) können auch die Zitze (Thelitis) oder das

milchableitende Gangsystem (Galaktophoritis) von dem Entzündungsgeschehen betroffen

sein. Häufig treten Mischformen auf. In der Pathologie unterscheidet man je nach

Krankheitsverlauf, Sekretbeschaffenheit und Art der vorherrschenden Entzündungsmerkmale

katarrhalische, katarrhalisch-eitrige, hämorrhagisch-nekrotisierende, eitrig-abszedierende,

interstitielle und granulomatöse Mastitiden (WEISS 1999).

Anhand klinischer Gesichtspunkte lassen sich die klinische und die subklinische Mastitis

unterscheiden. Klinische Mastitiden sind hierbei durch sicht- und/oder tastbare Anzeichen

einer Entzündung erfassbar, während die subklinische Mastitis nur auf labordiagnostischem

4

Weg sowie die Änderung der kompositionellen Beschaffenheit der Milch zu ermitteln ist

(WENDT 1998; DVG, 2002).

Die klinischen Anzeichen reichen von Flocken und Fibrinklumpen im Vorgemelk mit leichter

Verringerung der Milchmenge bis hin zu deutlichen Entzündungszeichen des Euters wie

vermehrte Wärme, Rötung, Schwellung und Schmerzhaftigkeit. In solchen Fällen ist die

Milch makroskopisch meist deutlich in ihrem Charakter verändert, und es kann zum

vollständigen Versiegen des Milchflusses kommen. Das ermolkene Sekret kann hierbei

wässrig, blutig, serös, mukös, eitrig, jauchig oder breiig verändert sein. Gelegentlich tritt

begleitend eine starke Störung des Allgemeinbefindens mit Fieber auf. Mastitisbedingte

Todesfälle kommen vor.

Anhand ihres zeitlichen Verlaufs und der Ausprägung der Symptome können die akute,

subakute und chronische klinische Mastitis unterschieden werden. Während bei der akuten

Mastitis die oben erwähnten klinischen Symptome im Vordergrund stehen, fehlen bei der

subakuten Mastitis deutliche klinische Veränderungen des Euters. Meist zeigt sich lediglich

eine Flockenbildung im Anfangsgemelk. Als chronische Mastitis bezeichnet man ein

Stadium, in dem es nach einer klinischen Mastitis zu keiner Ausheilung des betroffenen

Euterviertels gekommen ist. Dieses neigt zur Atrophie oder zeigt dauerhaft anomale klinische

Befunde. Durch den vermehrten Ersatz des Drüsengewebes durch Bindegewebe kann es zu

einer fühlbaren Knotenbildung im Euterparenchym kommen. Die Milchbildung kann auf

einem Euterviertel auf Dauer versiegen, so dass es zur Ausbildung eines so genannten

Dreistrichs oder zum Abgang des Tieres wegen der Leistungsminderung kommt (WENDT

1998).

Bei der subklinischen Mastitis hingegen verhindern die Abwehrmechanismen der Kuh zwar

eine akute Entzündung, der Erreger bleibt aber im Euter nachweisbar und kann nicht

eliminiert werden. Es stellt sich ein krankhaftes Gleichgewicht zwischen Mastitiserreger und

Milchdrüse ein (ZSCHÖCK et al. 1998). Neben den drei Merkmalen Entzündung des Euters

ohne klinische Symptome, erhöhter Zellgehalt und Veränderung der chemischen

Zusammensetzung der Milch ist das vierte Charakteristikum der subklinischen Mastitis der

Nachweis von Mastitiserregern. Der Nachweis gilt als erbracht, wenn in zwei von drei

untersuchten Milchproben innerhalb eines Probeentnahmeintervalls von einer Woche

identische Erreger nachgewiesen werden können (DVG 2002).

Die Milch ist zwar grobsinnlich unauffällig, aber ihre chemische Zusammensetzung ist je

nach Grad der Erkrankung verändert. Es kommt zu einer Reduktion der Trockenmasse, und

die Konzentrationen an Gesamtkasein, Laktose, β-Laktoglobulin, α-Laktalbumin, Kalzium,

5

Phosphor, Kalium, Riboflavin und Ascorbinsäure sind unter anderem vermindert. Relativ

erhöht sind die Anteile an Immunglobulinen und an Serumalbumin. Ferner erhöhen sich die

Konzentrationen an Katalase, Natrium und Chlor (KIELWEIN 1994). Die subklinische

Infektion kann jedoch jederzeit zu einer klinisch apparenten Erkrankung werden, wenn der

Wirtsorganismus in seiner Abwehr z.B. durch Stressfaktoren geschwächt wird (ROLLE u.

MAYR 2002).

Die Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft (DVG 2002) charakterisiert die Kategorien

der Eutergesundheit wie folgt:

1.) Normale Sekretion: Diese liegt vor, wenn die Euterviertel äußerlich keine krankhaften

Veränderungen erkennen lassen und die Milch weder einen erhöhten Zellgehalt

aufweist, noch Mastitiserreger im Sekret nachweisbar sind.

2.) Latente Infektion: Hier bewegt sich die Zellzahl im Normbereich, es können jedoch

pathogene Mikroorganismen im Sekret nachgewiesen werden. Eine direkte

Unterscheidung einer Infektion des Drüsengewebes oder einer alleinigen Besiedelung

des Strichkanals ist hierbei nicht möglich.

3.) Unspezifische Mastitis: Trotz subklinischer Befunde oder klinischer Symptome

können trotz erhöhter Zellzahl wiederholt keine Mastitiserreger im Sekret

nachgewiesen werden.

4.) Mastitis: Liegt eine Mastitis vor, lassen sich sowohl erhöhte Zellzahlen als auch

pathogene Mikroorganismen in Sekret nachweisen.

Ein wichtiges Kriterium für die Beurteilung des Gesundheitszustandes des Euters ist der

Zellgehalt bzw. die Zellzahl der Milch. Dieser gibt den Gehalt an somatischen Zellen in der

Milch an und wird pro Milliliter Milch angegeben. Die somatischen Zellen setzen sich aus

überalterten, verbrauchten Epithelzellen des Drüsengewebes sowie aus Abwehrzellen des

Blutes, wie Leukozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen zusammen.

Während sich in der Milch gesunder Euterviertel nur wenige Zellen, vorwiegend

Epithelzellen, finden, steigt bei entzündlichen Veränderungen der Milchdrüse der Zellgehalt

an, wobei der Anteil der Abwehrzellen stark zunimmt (KIELWEIN 1994).

Eine strenge Grenze zwischen gesund und krank kann nicht gezogen werden. Allerdings kann

davon ausgegangen werden, dass ab einem bestimmten Zellzahlniveau mit hoher

Wahrscheinlichkeit eine entzündliche Erkrankung vorliegt, während in niedrigeren

Zellzahlbereichen die Wahrscheinlichkeit hierfür geringer ist.

6

Ein normaler Zellgehalt liegt auf Viertelgemelksebene bei 10.000 bis 100.000 Zellen/ml

Milch (KIELWEIN 1994; WENDT 1998). Bei Überschreitung dieses Wertes ist bereits eine

Änderung der kompositionellen Beschaffenheit der Milch zu erwarten (TOLLE et al. 1977).

Auf Herdensammelmilchebene liegt die Toleranzgrenze bei 150.000 Zellen/ml (ZSCHÖCK et

al. 1998).

Die Streubreite der Zellzahlwerte infizierter Euterviertel ist sehr hoch und bewegt sich

zwischen 100.000 und mehr als 10.000.000 Zellen/ml Milch (KIELWEIN 1994). Dabei

liegen teilweise erhebliche Schwankungen im Zellgehalt infizierter Euterviertel vor, die sich

durch das Wechselspiel zwischen den infektiösen Noxen und der Abwehrreaktion des

Organismus erklären lassen. Hierbei steht die Zellgehaltserhöhung nicht in linearer, sondern

in exponentieller Gesetzmäßigkeit zur Stärke der Noxe. Auch ist zu berücksichtigen, dass

Euterviertel in Bezug auf den Zellgehalt keine funktionelle Einheit darstellen, sondern dass

einzelne Bezirke der Milchdrüse in unterschiedlichem Grade zum Zellgehalt der Milch

beitragen. Die Höhe des Anstiegs des Milchzellgehaltes korreliert mit dem jeweiligen

Mastitiserreger (DJABRI et al. 2002).

Selbst in gut geführten Milchkuhherden macht ungefähr jede zweite Kuh pro Laktation eine

klinische Mastitis durch. Die Mastitisindex für klinisch euterkranke Tiere beträgt auch in

Herden mit geringeren Gesundheitsstörungen ständig 1,0 -1,5. Herden mit entsprechend

höheren Erkrankungsraten von über 2% können an den Rand der Rentabilität gelangen.

2.2 Mastitiserreger

Das Prinzip der ätiologischen Klassifizierung von Mastitiden ist insbesondere aus der Sicht

der mikrobiologischen Diagnostik zweckmäßig. Neben den Bakterien werden in weitaus

geringerem Umfang auch Hefen, Algen und Viren im infizierten Euter gefunden.

Letztgenannte treten jedoch meist nur bei Allgemeinerkrankungen mit Beteiligung der

Milchdrüse auf.

Die Mastitiserreger bestimmen in hohem Maße das Erscheinungsbild und den Verlauf der

Erkrankung. Ein eindeutiger Rückschluss vom klinischen Bild auf den ursächlichen Erreger

ist jedoch nicht möglich (KLEINSCHROTH et al. 1994; WENDT 1994; HEESCHEN 1998).

Die Mastitiserreger können entsprechend ihrer epidemiologischen Eigenschaften in

kontagiöse („klassische“) und konstitutionelle Erreger unterteilt werden (RIFFON et al.

2001).

Kontagiöse Mastitiserreger leben und vermehren sich ausschließlich in der Milchdrüse und

werden primär während des Melkvorgangs von Tier zu Tier übertragen. Dabei ist die

7

infizierte Milchdrüse das Reservoir für die Erreger, und sie können auf Dauer nur in diesem

überleben. Die Erreger sind stark an das Euter adaptiert und finden hier ideale Bedingungen

für ihre Vermehrung. Durch die Ausscheidung erregerhaltiger Milch kommt es zur

Kontamination von Euter- und Zitzenhaut, von wo die Erreger auf andere Körperstellen

übertragen oder in der Umwelt verbreitet werden können. Da die Melkerhände, die

Eutertücher und Melkbecher während des Melkvorgangs ebenfalls Kontakt mit der

kontaminierten Euterhaut und Milch haben, fungieren sie als Vektoren, mit deren Hilfe nicht

infizierte Euterviertel der selben oder anderer Kühe infiziert werden. Zu den kontagiösen

Mastitiserregern gehören Staphylococcus (S.) aureus, Streptococcus (S.) agalactiae, S.

dysgalactiae, S. canis, Mycoplasma spp. und Corynebacterium (C.) bovis (FOX u. GAY,

1993; SMITH et al. 1985; ZSCHÖCK 1999; RIFFON et al. 2001).

Die konstitutionellen Erreger hingegen sind ubiquitär in der Umgebung der Tiere verbreitet

und besiedeln von dort aus das Eutergewebe. Man findet sie auf der Euterhaut, im Haarkleid,

in der Einstreu, auf dem Stallboden und im Stallstaub. Auch die infizierte Milchdrüse stellt

eine Infektionsquelle dar, jedoch ist sie im Vergleich zu den kontagiösen Erregern von nur

untergeordneter Bedeutung (TOLLE et al. 1977; DVG 1994). Infektionen durch diese

Erreger entstehen insbesondere unter einem hohen Infektionsdruck infolge unhygienischer

Haltungsbedingungen und bei einem geschwächten Immunsystem. Das Infektionsrisiko ist in

der Zwischenmelkzeit am größten (DVG 2002), weswegen die durch umweltassoziierte

Erreger ausgelösten Mastitiden durch eine alleinige Verbesserung der Melkhygiene nicht

einzudämmen sind. Die Exposition des nicht infizierten Viertels mit den umweltassoziierten

Erregern tritt permanent auf (ZADOKS et al. 2001). Diese Form der Mastitis findet man

daher häufiger bei meist sehr gut geführten Milcherzeugerbetrieben, die ein Programm zur

Bekämpfung der kontagiösen Mastitiden durchführen und Durchschnittszellzahlen unter

200.000/ml Tankmilch aufweisen (PHUEKTES et al. 2001; ROSSITTO et al. 2002).

Zu der Gruppe der umweltassoziierten Mastitiserreger gehören verschiedene, meist Äskulin-

positive Streptococcus spp. außer den oben bereits genannten, verschiedenartige

gramnegative Bakterien, wie Escherichia (E.) coli, Klebsiellen und Enterobacter sowie die

Gruppe der Koagulase-negativen Staphylokokken (KNS). Unter den umweltassoziierten

Streptokokken ist insbesondere S. uberis zu erwähnen. Ebenfalls häufig nachweisbar sind S.

parauberis, S. bovis und die verschiedenen Enterokokkenspezies.

Die Mastitiserreger können auch entsprechend der Stärke des von ihnen im Kuheuter

ausgelösten Entzündungsgeschehens in majorpathogen und minorpathogen eingeteilt werden.

Als majorpathogen werden besonders häufig auftretende Keime, insbesondere mit hoher

8

Kontagiosität, Erreger klinischer Mastitiden, Erreger, die starke entzündliche Reaktionen

hervorrufen und Erreger, die besonders hohe finanzielle Verluste auslösen, angesprochen.

Hierzu gehören vor allem S. aureus, S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis sowie

Enterokokken, Mycoplasma spp. und die Gruppe der coliformen Keime (WILSON et al.

1997; ARIZNABARRETA et al. 2002; DJABRI et al. 2002).

Minorpathogen dagegen sind Erreger, die nur moderate Zellzahlerhöhungen hervorrufen und

selten klinische Symptome auslösen. Diese Infektionen treten häufig mit hohen Prävalenzen

auf. Zu diesen werden insbesondere verschiedene Corynebacterium spp., die KNS und

Mikrokokken gezählt.

Über 90% der Euterentzündungen des Rindes beruhen auf Infektionen mit S. aureus, S.

agalactiae, S. uberis und S. dysgalactiae (NEAVE 1975). Diese werden somit als die

dominierenden Mastitiserreger angesehen (BRAMLEY u. DODD 1984; JAYARAO et al.

1992; WILSON et al. 1997, FORSMANN et al. 1997, PHUEKTES et al. 2001). Die

Prävalenzen der verschiedenen Spezies variieren dabei geographisch, zeitlich und mit den im

Herdenmanagement verankerten Kontrollmaßnahmen (FORSMANN 1997).

2.2.1 Kontagiöse, euterassoziierte Mastitiserreger

2.2.1.1 Staphylococcus (S.) aureus Staphylococcus (S.) aureus wird zusammen mit den übrigen Vertretern der Gattung

Staphylococcaceae der Familie der Micrococcaceae zugeordnet. Der Gattungsname

Staphylococcus leitet sich aus dem griechischen Wort „staphyle“= Weintraube ab und wurde

vom schottischen Chirurgen OGSTON im Jahre 1882 geprägt, als dieser mikroskopisch

traubenförmig angeordnete Kugelmikroben in Eiter wahrnahm.

Staphylokokken sind Besiedler der Haut, der Hautdrüsen und der Schleimhäute des Menschen

und warmblütiger Tiere (KLOOS u. SCHLEIFER 1986).

Staphylokokken können aufgrund ihrer vorhandenen oder nicht vorhandenen Fähigkeit das

Enzym Koagulase zu bilden, welches zur Koagulierung von Blutplasma führt, in zwei große

Untergruppen, die Koagulase-positiven und –negativen Staphylokokken eingeteilt werden

(BAIRD-PARKER 1974). Die weitaus größere pathogene Bedeutung wird den Koagulase-

positiven Staphylokokken eingeräumt. Die Koagulase-positiven Staphylokokken lassen sich

durch Zuordnung zu unterschiedlichen Biovaren in S. aureus (Biovare A-D) und S.

intermedius (Biovare E und F) unterteilen. Von DEVRIESE (1977) wurde noch die Spezies S.

hyicus mit zwei Subspezies den Koagulase-positiven Staphylokokken zugeordnet.

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Der weitaus wichtigste veterinärmedizinische Vertreter dieser Gruppe ist S. aureus.

S. aureus verursacht vielgestaltige Krankheitsbilder bei Mensch und Tier. Häufig sind die

Erreger an eitrigen Infektionsprozessen beteiligt, denen meist eine Verletzung oder andere

Prädispositionen des Wirtsorganismus vorausgegangen sind. Ferner werden beim Menschen

Septikämien, Endokarditiden, Osteomyelitiden, Lungenerkrankungen und das toxische

Schock-Syndrom ausgelöst (SUTRA u. POUTREL 1994; WESSON et al. 1998;

FITZGERALD et al. 2001). Als fakultativer Krankheitserreger tritt S. aureus beim Tier vor

allem in Zusammenhang mit Mastitis, Synovitis, Furunkelbildung, eitriger Dermatitis,

Abszessen, Phlegmonen, Pyämien und Septikämien auf. Die Krankheitsprozesse können

örtlich begrenzt sein, flächenhaften Charakter annehmen, aber auch in eine Septikämie mit

schwerem Krankheitsverlauf münden (ROLLE u. MAYR 2002).

Die Staphylokokken-Mastitis des Rindes ist die veterinärmedizinisch bedeutendste

Staphylokokken-Infektion. S. aureus ist weltweit der bedeutendste Erreger der subklinischen

Mastitis dieser Tierart. Aus 20-60% der Milchproben von subklinischen Mastitiden beim Rind

können Staphylokokken nachgewiesen werden (SEFFNER u. BERGMANN 1994). SUTRA

und POUTREL (1994) geben an, dass S. aureus mit 25-30% an intramammären Infektionen

des Rindes beteiligt ist. Aber auch wenn die chronische, subklinische Form am häufigsten

vorkommt, so kommen auch schwerwiegende klinische Euterentzündungen vor (ZSCHÖCK

et al. 1998). Diese treten meist akut bis perakut als hämorrhagisch-nekrotisierende oder

gangräneszierende Mastitis mit unter Umständen tödlichem Verlauf auf (SEFFNER u.

BERGMANN 1994) und häufen sich vor allem am Ende der Laktation und kurz vor bzw.

nach der Abkalbung (BRÜCKLER u. SCHWARZ 1994). EDWARDS und SMITH (1966)

führten detaillierte Studien an drei Herden durch, und zeigten, dass 22% der S. aureus-

Infektionen mit klinischen Erscheinungen einhergingen. Die S. aureus-Mastitiden verlaufen

als katarrhalisch-eitrige Mastitis und Galaktophoritis und verursachen der Milchindustrie

große wirtschaftliche Verluste durch eine Minderung der Milchproduktion sowohl in

Quantität als auch in Qualität (SCHALM et al. 1971; BRÜCKLER u. SCHWARZ 1994). Da

die Erkrankung häufig als subklinische Mastitis unerkannt vorkommt, stellt sie auch eine

mögliche Gefahr für die Gesundheit des Menschen dar (GILMOUR u. HARVEY 1990).

Einige der von diesen Infektionen isolierten Kulturen sind nämlich in der Lage extrazelluläre,

auf den Verdauungstrakt des Menschen wirkende Toxine zu bilden, die

Lebensmittelvergiftungen hervorrufen können (BRÜCKLER u. SCHWARZ 1994).

S. aureus kommt als Kommensale vor allem in den vorderen Nasenpartien und auf der Haut

von Rindern vor (LACEY 1981). MATTHEWS et al. (1986) zeigten außerdem, dass 7% der

10

Strichkanäle der Färsen einer Herde, die kurz vor der Geburt standen, mit dem Erreger

besiedelt waren. Das Hauptreservoir ist die infizierte Milchdrüse (NEAVE et al. 1969;

MATOS et al. 1991). Neuinfektionen erfolgen in der Regel über den Strichkanal. Eine

Ausbreitung findet dann meist über die natürlichen Gangsysteme der Drüsen statt.

Daneben ist ein Eindringen der Erreger über Zitzen- und Zitzenhautverletzungen möglich

(SCHALM et al. 1971). Diese entstehen häufig durch nicht korrektes Melken. MATOS et al.

(1991) zeigten mit ihren Untersuchungen, dass 40% der Zitzenläsionen einer Herde mit S.

aureus kolonisiert waren. NEAVE (1971) wies nach, dass es in einer Herde mit ungenügender

Melkhygiene zu einer Kontamination der Strichkanalöffnungen mit S. aureus bei 60% der

gesunden Viertel und bei 85% der Viertel mit Zitzenhautverletzungen kommen konnte. S.

aureus ist bei weitem nicht so stark an das Euter adaptiert wie z.B. S. agalactiae. Daher

vergehen meist längere Zeiträume, bis Staphylokokken-Neuinfektionen einer Herde zu

nachweisbaren Erkrankungen führen (SEFFNER u. BERGMANN 1994).

Übertragen werden die Keime durch Kontakt- und Schmierinfektionen, hauptsächlich beim

Melken (NEWBOULD 1968; MATOS et al. 1991). Als Vektoren dienen hier insbesondere

die Melkerhände, Euterreinigungstücher und Melkzeuge. Insbesondere aus Haarrissen älterer

Zitzengummis kann in S. aureus-Problembetrieben der Erreger häufig isoliert werden

(SEFFNER u. BERGMANN 1994). Auch das Zurückfließen von Milch innerhalb eines

Melkzeugs nach Lufteinbrüchen kann zur Erregerausbreitung beitragen. MATOS et al. (1991)

konnten in 50% der Luftproben aus den Melkständen in Problembetrieben während der

Melkzeit S. aureus nachweisen, sodass von der möglichen Rolle von Aerosolen bei der

Erregerübertragung ausgegangen werden muss. Andere Quellen, vor allem in der Umwelt der

Tiere, werden für die Transmission der Erkrankung ebenfalls diskutiert (BRAMLEY u.

DODD 1984; ROBERSON et al. 1994).

Meist sind mehrere Viertel eines Tieres betroffen, wobei anfangs meist zunächst die

Hinterviertel infiziert sind (SEFFNER u. BERGMANN 1994).

Nach der Infektion über den Strichkanal lagert sich S. aureus bevorzugt an den Epithelzellen

des Strichkanals und in noch stärkerem Maße in der Drüsenzisterne und in den großen

Milchgängen an (FROST et al. 1977; ROLLE u. MAYR 2002). Diese selektive Adhärenz, die

auf Oberflächenstrukturen der Bakterien, Rezeptoren der Wirtszellen und hydrophoben

Interaktionen beruht, ist ein wichtiger Faktor in der Pathogenese der Staphylokokken-

Mastitis. Dieser initialen Adhärenz folgt die Multiplikation der Erreger und ihre Verbreitung

über das Gangsystem des Euters. WESSON et al. (1998) beschreiben eine durch S. aureus

verursachte Apoptose der Epithelzellen des Rindereuters.

11

Die weitere Ausbreitung der Staphylokokken im Gewebe erfolgt mit Hilfe mutmaßlicher

Virulenzfaktoren wie der Hämolysine, der Leukozidine, der Staphylokinase und der

Hyaluronidase (ROLLE u. MAYR 2002).

S. aureus dringt tief in das Eutergewebe ein und kann sich dort abkapseln. Besonders nach

Invasion der Epithelzellen kann der Erreger intrazellulär über mehrere Monate persistieren

und wird meist nicht einmal in der Trockenstehphase eliminiert (BRAMLEY u. DODD

1984). Ein Grund hierfür ist, dass S. aureus in der Lage ist, eine Reihe von Substanzen zu

bilden, mit deren Hilfe die Erreger den Abwehrmechanismen des Wirts widerstehen und

diesen schädigen können (BRÜCKLER u. SCHWARZ 1994).

Im fortgeschrittenen Stadium der S. aureus-Mastitis kann es durch Gewebsnekrosen zu

fibrotischen Veränderungen bis hin zu einer vollständigen bindegewebigen Atrophie eines

Euterviertels kommen (PLATONOW u. BLOBEL 1963).

Die Behandlung ist trotz moderner Chemotherapeutika und unterstützender Maßnahmen nicht

immer erfolgreich. Meist können im Euter trotz in vitro-Empfindlichkeit des Erregers keine

ausreichenden Wirkstoffkonzentrationen erreicht werden, da die Koagulase-bedingte

Plasmagerinnung und die Keimverklumpung die Erreger vor dem Chemotherapeutikum

abschotten. Durch die bei der chronischen Mastitis auftretenden Gewebsnekrosen und

fibrotischen Veränderungen wird zudem die Diffusion der Substanzen behindert oder sogar

unmöglich gemacht. Auch können viele Antibiotika nicht zu den in den Phagolysosomen der

Makrophagen vorliegenden Keimen vordringen (SUTRA u. POUTREL 1994). Durch zu

niedrige Wirkspiegel und zu kurze bzw. zu lange Behandlungszeiten kann es außerdem zur

Förderung einer Resistenzentwicklung kommen. Bezüglich der antibiotischen

Empfindlichkeit des Erregers resultierte in den vergangenen Jahren eine zunehmende

Resistenz gegenüber Penicillin G durch die Bildung von β-Laktamase.

Ferner können sich Staphylokokken im Gewebe vorübergehend in eine Art

Stoffwechselruhelage begeben, sodass Chemotherapeutika nicht wirksam werden. So ist bei

chronischen Rindermastitiden bedingt durch S. aureus kein Heilungserfolg über 80% zu

erwarten (BRÜCKLER u. SCHWARZ 1994). PHILPOT und NICKERSON (1991) sowie

PYÖRÄLÄ und PYÖRÄLÄ (1994) geben an, dass 20-70% der antibiotischen Behandlungen

während der Trockenstehphase effektiv sind und 10-30% der S. aureus-Mastitisfälle während

der Laktation durch eine antibiotische Behandlung geheilt werden können. Auch SUTRA und

POUTREL (1994) geben für eine antibiotische Therapie in der Laktation Heilungschancen

von weniger als 50% an. Therapieresistente Tiere sollten abgeschafft werden, da sie aufgrund

12

der Erregereigenschaften eine ständige Infektionsgefahr für die übrigen Tiere des Bestandes

darstellen.

Die Bekämpfung der S. aureus-Mastitis liegt vor allem in der Prävention der

Erregerübertragung von Tier zu Tier. Hierdurch kann die Mastitisinzidenz langfristig

reduziert werden (NEAVE et al. 1969). Jedoch ist die Sanierung einer Herde selbst bei

strengster Einhaltung der Hygienevorschriften schwierig, und es kann insbesondere durch die

ubiquitäre Verbreitung des Erregers und sein Vorkommen außerhalb des Wirtsorganismus

durch kontaminierte Einstreu, Futter, Equipment oder Kontakt mit der Haut anderer Tiere und

des Menschen immer wieder zu Neuinfektionen kommen (ROBERSON et al. 1994). Neuere

epidemiologische Untersuchungen von SOMMERHÄUSER 2002 und SOMMERHÄUSER et

al. (2003) von S. aureus-Isolaten aus mehreren hessischen Milchviehbetrieben zeigten, dass

der Erreger neben seiner typischen kuh- bzw. euterassoziierten kontagiösen Form auch mit

den epidemiologischen Charakteristika von umweltassoziierten Keimen auftreten kann. Diese

Isolate treten vor allem in Herden mit niedriger S. aureus-Prävalenz und geringer

Ausbreitungstendenz auf und scheinen die Kontrollmaßnahmen für kontagiöse Mastitiserreger

zu umgehen. Daher führen sie trotz Durchführung von Sanierungsprogrammen zu hohen

Neuinfektionsraten innerhalb der betroffenen Herden.

Lebensmittelhygienisch von besonderer Bedeutung ist das Vermögen einiger

Staphylokokken, Enterotoxine zu bilden. Dieses ist insbesondere für S. aureus beschrieben, es

wurden aber auch bei S. intermedius und bei verschiedenen KNS wie z.B. S. epidermidis und

S. haemolyticus Enterotoxine nachgewiesen (UNTERMANN 1994).

Staphylokokken-Enterotoxine (SE) sind einfache Proteine, die aus einer einzigen

Polypeptidkette bestehen. Sie haben ein Molekulargewicht von 28 000 bis 35 000 Dalton. Die

SE sind resistent gegenüber proteolytischen Enzymen wie Trypsin, Chymotrypsin, Renin und

Papain (UNTERMANN 1994). Aufgrund ihrer einfachen Struktur sind sie außerdem äußerst

hitzestabil. So überstehen sie die Pasteurisierung und das Abkochen, sodass in einem

pasteurisierten Milchprodukt noch aktives SE vorhanden sein kann, obwohl die

Staphylokokken selbst abgetötet sind (BONE et al. 1989; OTTO 1991). Es gibt verschiedene

serologisch unterschiedliche Typen dieser Toxine. Neben den bekannten klassischen

Enterotoxinen SEA, SEB, SEC, SED und SEE wurden in den letzten Jahren vier weitere

Enterotoxine beschrieben: SEG und SEI (MUNSON et al. 1998), SEH (REN et al. 1994) und

SEJ (ZHANG et al. 1998). Desweiteren wurden in jüngster Zeit mit den SEK, SEL, SEM,

13

SEN und SEO fünf ganz neue Typen von Enterotoxinen entdeckt (JARRAUD et al. 2001;

ORWIN et al. 2001; ORWIN et al. 2002; LETERTRE et al. 2003).

Das Toxinbildungsvermögen boviner S. aureus-Stämme variiert stark und wird daher in der

Literatur unterschiedlich angegeben. HEESCHEN (1994) gibt an, dass etwa 5-10% der

Erreger der bovinen Mastitis ein oder mehrere verschiedene Enterotoxine bilden können.

MÜLLER (1992) schätzt die Rate auf 4-40%. LARSEN et al. (2000) überprüften 414 bovine

S. aureus-Stämme, und nur einer von ihnen beherbergte Gene zur Produktion von SEC und

TSST-1. Von 166 bovinen S. aureus-Isolaten aus Korea, die LIM et al. (2004) mit Hilfe der

PCR auf das Vorkommen von Enterotoxingenen untersuchten, beherbergten 32 Isolate das

SEA-Gen, drei Isolate das SEB-Gen und nur ein Isolat das SEC-Gen. ZSCHÖCK et al.

(2004) überprüften ebenfalls mittels PCR 533 Mastitisisolate auf das Vorkommen von SEC-

Gen und TSST-1-Gen und fanden eine Prävalenz von 9,3%. In einer weiteren Untersuchung

konnten ZSCHÖCK et al. (2005) bei 58,7% von 104 untersuchten Stämme aus deutschen

Milchviehbetrieben eines oder Kombinationen der neuen Enterotoxine SEG-SEJ nachweisen.

Von diesen positiven Stämmen produzierten wiederum 60,7% zusätzlich eines der klassischen

Enterotoxine SEA-SEE und TSST-1.

Interessanterweise fanden PUIG de CENTORBI et al. (1992) bei der Untersuchung von 27

Stämmen aus Argentinien kein einziges Enterotoxin- oder TSST-1 produzierendes Isolat.

Die zur Enterotoxikose führende Kontamination von Milch und Milcherzeugnissen ist nach

Meinung von KIELWEIN (1994) und UNTERMANN (1994) nicht bedingt durch eine

primäre Kontamination durch das erkrankte Tier, sondern durch die sekundäre Kontamination

der Milch durch infizierte Wunden und Hautausschläge an den Händen des Personals. Andere

Autoren vermuten aber, dass die Milch erkrankter Tiere die Hauptquelle tierischen Ursprungs

für enterotoxinbildende Staphylokokken darstellt (BRYAN 1983; BERGDOLL 1989;

GILMOUR u. HARVEY 1990).

Bereits die Menge von 0,1-0,2 µg Enterotoxin kann bei in der Abwehrkraft geschwächten

Menschen Erkrankungen hervorrufen (EVENSON et al. 1988). Im Durchschnitt werden

jedoch bei oraler Aufnahme von 10 µg Intoxikationen ausgelöst (BERGDOLL 1970;

KIELWEIN 1994). Die klinischen Symptome reichen von Übelkeit, Erbrechen und Durchfall,

Kopfschmerzen und Wadenkrämpfen bis hin zu schweren Kreislaufstörungen, die bei

vorgeschädigten Personen zu lebensbedrohlichen Schockzuständen führen können. In der

Regel ist die Erkrankung bereits nach 1-2 Tagen überwunden.

Die Kontamination eines Lebensmittels mit geringen Mengen enterotoxinbildender

Staphylokokken stellt meist keine akute Gesundheitsgefährdung dar. Erst wenn es nach einer

14

intensiven Vermehrung der toxinbildenden Erreger im Lebensmittel auf Keimzahlen bis zu

105 - 106 Erreger/g kommt, ist mit einer Krankheitsauslösung durch Bildung von

Enterotoxinen zu rechnen (TATINI et al. 1971; GILBERT 1974; KIELWEIN 1994;

HEESCHEN 1998). In Rohmilch wird die Toxinbildung durch die natürliche Begleitflora aus

überwiegend proteolytischen und saccharolytischen Bakterien mit kurzen Generationszeiten

gehemmt. Besondere Verhältnisse bestehen jedoch, wenn Rückstände von Antiinfektiva in

der Milch vorhanden sind, die eine natürliche Milchflora in ihrer Entwicklung hemmen und

enterotoxinbildenden Staphylokokken, wenn diese eine Resistenz aufweisen, eine starke

Vermehrung ermöglichen (ZEHREN u. ZEHREN 1968; TATINI et al. 1971).

Die Häufigkeit von Staphylokokken-Lebensmittelvergiftungen lässt sich schwer einschätzen.

Nach MEAD et al. (1999) liegt die geschätzte jährliche Zahl der Erkrankungsfälle in den

USA bei über 180.000.

2.2.1.2 Äskulin-negative Streptokokken

2.2.1.2.1 Streptococcus (S.) agalactiae S. agalactiae ist der Erreger des so genannten „Gelben Galtes“, einer hochkontagiösen

Euterentzündung des Rindes, die in allen Ländern mit intensiver Milchwirtschaft

nachgewiesen werden kann (LÄMMLER u. HAHN 1994). Der Begriff Galt stammt aus dem

Süddeutschen bzw. Schweizerischen und bedeutet Milchrückgang bzw. völliges Versiegen

der Milch. Der Erreger wird serologisch der Lancefield-Gruppe B zugeordnet. Eine weitere

Subtypisierung von S. agalactiae ist mit Hilfe seiner Typenantigene, wie den Polysaccharid-

Antigenen Ia, Ib, II, III, IV, V und den Protein-Antigenen c, R und X möglich. Diese sind

besonders bei epidemiologischen Untersuchungen von Bedeutung (HEJLICEK 1994). Der

Erreger reagiert Äskulin-negativ, sein positives CAMP-Phänomen erlaubt eine zuverlässige

Diagnose. Die seit dem Ende des 19. Jahrhunderts bekannte Eutererkrankung stellt ein

schwerwiegendes wirtschaftliches und milchhygienisches Problem dar, weil es durch den

Erreger zu einer starken Erhöhung des Milchzellgehaltes sowie der Gesamtkeimzahl durch

Primärkontamination und somit zu einer Verminderung der Milchqualität, vor allem auch der

–quantität kommt.

Durch S. agalactiae ausgelöste Mastitiden nehmen meist einen subklinischen und chronischen

Verlauf, seltener löst der Erreger klinisch-katharrhalische Mastitiden aus (ERSKINE et al.

1996). Meist tritt die Erkrankung bestandsweise gehäuft auf. In betroffenen Betrieben liegt

die Herdenprävalenz zwischen 10 und 50% (KEEFE 1997). Ferner wird die Infektion zu den

15

Erkrankungen gezählt, die bei Tieren mit einer hohen Milchleistung häufiger vorkommt als

bei Tieren mit einer geringeren Laktationsleistung.

Mittels Genotypisierung von S. agalactiae-Isolaten konnte die Kontagiosität dieses Erregers

bestätigt werden. So zeigten BASSEGIO et al. (1997) und WANG et al. (1999) mit Hilfe der

Makrorestriktionsanalyse, dass meist ein einziger Klon für das Mastitisgeschehen in einer

Herde verantwortlich ist. Mit der gleichen Methode untersuchten MERL et al. (2003) 79 S.

agalactiae-Isolate aus sieben hessischen Milchviehbetrieben und konnten zeigen, dass in

jedem einzelnen Betrieb identische oder zumindest eng miteinander verwandte Stämme für

die Mastitissituation verantwortlich waren. Die Stämme der einzelnen Betriebe unterschieden

sich jedoch deutlich voneinander und ließen keinerlei epidemiologischen Zusammenhang

zwischen den Einzelbetrieben erkennen.

Insgesamt ist in Ländern mit intensiver Milchwirtschaft die Verbreitung des Erregers als

direkte Folge seiner hohen Empfindlichkeit gegenüber Penicillin G deutlich zurückgegangen

(BRAMLEY u. DODD 1984). Vor der Entwicklung der Antibiotika galt S. agalactiae als

einer der Haupterreger von Mastitiden (KEEFE 1997). Von allen Streptokokken-Arten kam er

mit Abstand am häufigsten vor (TOLLE 1982; VECHT et al. 1989).

Zwischen 1942 und 1962 fiel der prozentuale Anteil nachgewiesener S. agalactiae-

Infektionen durch den Einsatz von Antibiotika von 44% auf 4% aller nachgewiesenen

Erreger-bedingten Mastitiden (WILSON 1963). Im Bundesland Hessen konnte nach der

Einführung von flächendeckenden Präventiv- und Kontrollmaßnahmen die Prävalenz noch

weiter gesenkt werden (WOLTER et al. 1999). Durch die Auswertung der von KLOPPERT et

al. (1999) publizierten Daten des Eutergesundheitsdienstes Hessen kamen die Autoren auf

eine geschätzte Infektionsrate in Hessen für das Jahr 1998 von 0,5% aller Betriebe bzw. 0,3%

aller Milchkühe. In schlecht geführten Betrieben neigt der Erreger zur schnellen Ausbreitung

(WILSON et al. 1997).

S. agalactiae ist ein obligater Keim der Milchgänge des Kuheuters, welches im infizierten

Zustand das Hauptreservoir darstellt (SEELEMANN 1932; KEEFE 1997). Im Euter findet S.

agalactiae optimale Verhältnisse zur Vermehrung vor und wird mit der Milch in hohen

Mengen ausgeschieden (ROLLE u. MAYR 2002). In infizierten Herden kann der Erreger in

der Luft, der Einstreu, sämtlichen mit kontaminierter Milch in Berührung kommenden

Gegenständen, sowie an den Händen des Melkpersonals nachgewiesen werden. Laut

HEJLICEK (1994) bleibt er auf den Händen und der Kleidung des Melkpersonals bis zu 10

Tage infektionsfähig. Diese Vektoren gehören somit neben den Eutertüchern und

Melkbechern der Melkmaschine zu den häufigsten Überträgern (SEELEMANN 1954;

16

PHILPOT 1975). Auch durch kontaminierte Zitzentauchlösungen können die Erreger

verbreitet werden. Junge Kühe sind widerstandsfähiger gegen den Gelben Galt als ältere

(HEJLICEK 1994).

Der Erreger dringt über den Strichkanal ein und zeigt eine selektive Adhärenz zu den

Epithelzellen des Strichkanals, besonders aber zur Milchzisterne und den großen

Milchgängen, wo er sich in großer Zahl anlagert (ROLLE u. MAYR 2002). Hier findet laut

SCHULZ (1994) die erste intramammäre Auseinandersetzung zwischen Wirtsorganismus und

Erreger statt. Nach FOX und GAY (1993) dringt S. agalactiae nicht in das Drüsengewebe ein,

sondern heftet sich den Epithelzellen an, die unter anderem durch die Milchsäureproduktion

und toxischen Substanzen, die aus den zerfallenden Streptokokken freiwerden, zerstört

werden. Von den distalen Abschnitten der Milchdrüse breitet sich die Infektion kanalikulär in

die höher gelegenen Milchgänge und die Alveolen aus (HEJLICEK 1994). Ein einmal

infiziertes Euter kann mehrere Laktationsperioden hindurch den Erreger beherbergen und

somit eine ständige Infektionsquelle für alle Tiere des Bestandes darstellen (ROLLE u.

MAYR 2002). Dies liegt vor allem an der niedrigen Selbstheilungsrate (FARNSWORTH

1987).

Die Erkrankung verläuft meist chronisch, da das vorangehende akute Stadium durch seine

kurze Dauer klinisch oft unbemerkt bleibt. Die ersten Anzeichen sind Veränderungen der

Milch, wie eine schmutzige Rahmschicht und grau-weißes durchsichtiges Aussehen. Zu

Beginn der Erkrankung liegt eine katarrhalische Entzündung der Milchgänge und Alveolen

vor. Später kommt es zur Atrophie des Alveolarepithels, verbunden mit einer Verkleinerung

der Alveolen und einer Reduktion bzw. einer kompletten Einstellung der Milchsekretion in

den betroffenen Drüsenläppchen. Gleichzeitig entwickelt sich häufig eine proliferative

Entzündung der Milchgänge mit knotigen Verdickungen der Zisternenwand (HEIDRICH u.

RENK 1963). Zu diesem Zeitpunkt treten dann auch Eiterflocken im Anfangsgemelk auf. Es

kommt zu einer Vermehrung des interstitiellen Bindegewebes, und die Drüsenläppchen

atrophieren. In den seltener vorkommenden akuten Fällen steht eine katarrhalisch-eitrige

Galaktophoritis mit Hyperämie und Ödem des Unterhautbindegewebes im Vordergrund.

WENDT (1998) gibt den Anteil klinischer Mastitisfälle mit etwa 5% an. Die Tagesleistung

kann sich nach HEJLICEK (1994) auf bis zu einem Zehntel der sonstigen Menge verringern,

wobei die Milch meist mit zahlreichen Kasein- und Eiterflocken durchsetzt ist. STADTFELD

und NITZSCHKE (1980) beschrieben ferner, dass sich die klinische Form der S. agalactiae-

Mastitis durch eine mehr oder weniger deutliche Gelbverfärbung der Milch äußere.

17

Meist ist zunächst ein Euterviertel von der Infektion betroffen, nachfolgend erkranken dann

auch die übrigen Viertel der Kuh.

Im Verlauf der chronischen Form lassen sich eine Asymmetrie des Euters, strangförmige

Verdickungen der proliferierten Milchkanäle und knotige Bezirke im Drüsenteil feststellen

(ROLLE u. MAYR 2002). Der „Gelbe Galt“ führt meistens zu einem Verlust großer Teile des

milchbildenden Gewebes, das auch nach erfolgreicher Behandlung nicht mehr regeneriert

(HEJLICEK 1994). WENDT (1998) gibt die Milchverluste durch Gewebsuntergang mit 15-

35% an.

Da S. agalactiae längere Zeit nur im Euter überleben kann und gegenüber einer Penicillin G-

Therapie empfindlich ist, ist eine Eradikation des Keimes durch Verbesserung der

Melkhygiene und eine lokale Behandlung der infizierten Tiere mit Antibiotika aus

geschlossenen Herden möglich (KEEFE 1997).

Die antibiotische Therapie einer mit Galt infizierten Herde erreicht während der Laktation

Heilungsraten von über 90% und ist damit signifikant erfolgreicher als Spontanheilungen

(WILSON et al. 1999; WOLTER et al. 1999). Die Spontanheilungsrate während des

Trockenstehens wird von NATZKE et al. (1975) mit 36-42% angegeben. Bei der Behandlung

wird die hohe Empfindlichkeit des Erregers gegenüber Penicillin G genutzt. HEJLICEK

(1994) gibt diese mit 95,6-100% an.

ERSKINE und EBERHART (1990) konnten in ihrer Studie zeigen, dass in 12 Herden der

durchschnittliche Zellgehalt der Tankmilch mittels der Laktationstherapie innerhalb von 30

Tagen von 918.000 auf 439.000 Zellen/ml Milch gesenkt werden konnte. Durch eine weitere

Verbesserung der Herdenmanagements wie z.B. das Zitzendippen nach dem Melken und das

konsequente Trockenstellen aller Tiere mit Langzeitantibiotika gelang eine weitere Senkung

innerhalb eines Jahres auf durchschnittlich 268.000 Zellen. Die Autoren zeigten ferner, dass

durch die Durchführung dieses Programms ein Überschuss von 512 kg Milch und 14 kg Fett

pro Kuh innerhalb des ersten Jahres erwirtschaftet werden konnte, wodurch die

Kosteneffizienz der so genannten Blitztherapie eindeutig belegt werden konnte.

Die Infektionsmöglichkeit für den Menschen durch den Verzehr von kontaminierter Rohmilch

ist noch nicht vollkommen geklärt. Es können jedoch beim Melkpersonal verstärkt

Racheninfektionen auftreten. HAHN et al. (1972) konnten bei Patienten einen statistischen

Zusammenhang zwischen Rohmilchverzehr und dem Nachweis von B-Streptokokken

feststellen.

18

S. agalactiae ist ein Keim, der bei vielen Tierarten vorkommen kann. Neben dem Rind konnte

er unter anderem von Hund, Katze, Schwein und Nutria isoliert werden (SMOLA 1993,

YILDIRIM et al. 2002). Auch in der Humanmedizin besitzen Streptokokken der Lancefield-

Gruppe B eine herausragende Bedeutung. So sind sie ein bedeutender Krankheitserreger der

so genannten Neugeborenenseptikämien, die häufig perakut verlaufen und mit letal

verlaufenden Meningitiden einhergehen (BAKER, 1980; ROSS, 1984). Hier wird der Erreger

nach seinem antigenen Verhalten als Group B-Streptococcus (GBS) bezeichnet. Neben der

Infektion von Neugeborenen und Schwangeren sind B-Streptokokken als ursächliche Erreger

von Pneumonien, Pyelonephritiden, Arthritiden, Endokarditiden, abszedierenden Mastitiden

und Septikämien bekannt (ROSS 1984). Diese verlaufen häufig mit einer hohen

Mortalitätsrate und treten gehäuft bei älteren Patienten mit chronischen Erkrankungen bzw.

bei immunsupprimierten Personen auf (OPAL et al. 1988).

Das Vorkommen von B-Streptokokken bei Rind und Mensch wirft die Frage auf, inwieweit

zwischen den beiden Populationen ein epidemiologischer Zusammenhang besteht. Obwohl

die Bedeutung als Zooanthroponose beschrieben wurde (NIELSEN 1987), konnten von

zahlreichen Autoren deutliche Unterschiede in kulturellen, biochemischen, serologischen und

molekularbiologischen Eigenschaften zwischen vom Mensch und Rind isolierten Kulturen

aufgezeigt werden (FINCH u. MARTIN, 1984; DEVRIESE 1991; LÄMMLER et al. 1993;

BECKER 1994; KIELWEIN 1994; LÄMMLER u. HAHN 1994; DMITRIEV et al. 1999;

YILDIRIM et al. 2002). Danach scheinen Infektionen zwischen Mensch und Rind nur in

Ausnahmefällen möglich zu sein. Auch LÄMMLER und HAHN (1994) halten eine

Ansteckung über erkrankte Tiere oder rohe Milch für eher unwahrscheinlich. Es ist allerdings

experimentell gelungen, bei Rindern eine Mastitis mit Laktose-negativen B-Streptokokken

des humanen Biotyps auszulösen (JENSEN 1982).

2.2.1.2.2 Streptococcus dysgalactiae S. dysgalactiae wird der Lancefield-Gruppe C zugeordnet und gilt als bedeutende Ursache

von Infektionen bei Mensch und Tier. Auch dieser Erreger zählt zu den Äskulin-negativen

Streptokokken, lässt sich jedoch durch seine negative CAMP-Reaktion eindeutig von S.

agalactiae unterscheiden. Der Keim kommt hauptsächlich beim Rind und Schwein vor.

Außer in der Milchdrüse sind die Erreger vor allem in den Tonsillen (DALEEL u. FROST

1967), in Hautverletzungen, der gesunden sowie entzündeten Gebärmutter (HEJLICEK 1994)

und im Urogenitaltrakt zu finden, selten jedoch auf der gesunden Zitzenhaut (PHILPOT

19

1975). Diese Quellen spielen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung einzelner

Mastitisfälle innerhalb einer Herde.

Der Anteil dieses Erregers am Mastitisgeschehen wird zwischen 5,1 und 20% angegeben

(HEJLICEK 1994). Sowohl die akute klinische, als auch die subklinische Form verlaufen als

katarrhalische Galaktophoritis und Mastitis. EDWARDS und SMITH (1966) fanden in einer

detaillierten Studie unter Einbeziehung von drei Herden, dass S. dysgalactiae für 7,4% aller

klinischen Mastitisfälle verantwortlich war. Sie zeigten außerdem, dass 90% der S.

dysgalactiae-Infektionen des Euters ein klinisches Erkrankungsbild hatten und nur 10% der

Infektionen subklinisch verliefen. Meist beobachtet man bei einer S. dysgalactiae-Infektion

eine starke Erhöhung der Zahl somatischer Zellen. Da nur vereinzelt Mastitisfälle im Bestand

auftreten, wird dem Erreger im Gegensatz zu S. agalactiae keine hohe Kontagiosität

zugesprochen. Die kontaminierte Milch scheint dennoch auch hier der häufigste

Übertragungsvektor zu sein. Der Erreger besitzt die Fähigkeit, für 5-20 Monate in der einmal

infizierten Milchdrüse zu überleben. Diese persistierenden Infektionen konnten von WANG

et al. (1999) mit Hilfe der Makrorestriktionsanalyse und der Pulsfeldgelelektrophorese

nachgewiesen werden. Die meisten Infektionen entstehen galaktogen in der Trockenstehphase

und der frühen Laktation (SMITH et al. 1985; SMITH u. HOGAN 1993).

WANG et al. (1999) fanden bei ihren Untersuchungen von 52 Isolaten aus fünf Betrieben

mittels Pulsfeldgelelektrophorese sechs verschiedene Typen, wobei meist ein oder zwei pro

Bestand dominierten. Ein Typ konnte in drei der fünf Betriebe isoliert werden. Dies zeigt,

dass trotz der weit verbreiteten Annahme, dass es sich bei diesem Erreger um einen

Umweltkeim handelt, die Übertragung von Kuh zu Kuh während der Melkzeit durchaus auch

wahrscheinlich ist. Übereinstimmende Aussagen findet man bei SMITH und HOGAN (1993)

und BASSEGIO et al. (1997). Zusammenfassend ist S. dysgalactiae sowohl als kuhassoziiert

gleichermaßen auch als umweltassoziiert einzuordnen (DVG 2002).

2.2.1.3 Corynebacterium (C.) bovis Corynebakterien sind in der Natur weit verbreitet. Man findet sie im Erdboden, im Wasser

und auf der Haut von Tieren.

Corynebacterium (C). bovis kommt ausschließlich bei Rindern vor und wird sehr häufig im

Zitzenkanal gesunder Tiere nachgewiesen. Da der Erreger die Eigenschaft hat, Fett zu

hydrolysieren, wurde er zunächst Bacterium lipolyticum genannt. Corynebacterium spp.

zählen aufgrund ihres epidemiologischen Verhaltens zu den wenig kontagiösen

Mastitiserregern. Trotz ihrer häufigen Isolierung aus Milchproben ist ihre Bedeutung als

20

Mastitiserreger umstritten. Seit Jahrzehnten wurde C. bovis als Saprophyt angesehen. So

isolierte BOURLAND (1967) den Keim aus 90% der antiseptisch entnommenen Milchproben

einer Kuhherde, ohne dass Anzeichen einer Mastitis vorlagen. Bei den von WILSON und

RICHARDS (1980) durchgeführten Untersuchungen konnte in 70% der Milchproben ein

positiver Befund für C. bovis erbracht werden. BLACK et al. (1972) konnten durch Punktion

der Zitzenzisterne zeigen, dass gewisse C. bovis-Besiedlungen auf den Strichkanal beschränkt

sind, und die Erreger während der Probenentnahme aus dem Strichkanal in die Milchprobe

gespült werden.

COBB und WALLEY (1962) widersprachen erstmals der These, dass C. bovis nur als

Saprophyt im Milchsekret vorkommt. So nahmen sie intramammäre Inokulationen von 2ml

einer C. bovis-Serumbouillonkultur mit und ohne Inaktivierung durch Erhitzung vor. Die

Kühe zeigten nach Inokulation der nicht erhitzten Kultur teilweise geringe

Temperaturerhöhungen oder Flockenbeimengungen in der Milch. Dies wurde als Zeichen

einer Bedeutung des Erregers als Mastitis-Verursacher gewertet.

Auch RIZK und JANETSCHKE (1972) erwähnten, dass C. bovis unter bestimmten

begünstigenden Bedingungen, wie z.B. schlechter Melkhygiene eine Mastitis beim Rind

auslösen kann. Der Keim breitet sich vor allem dann in Beständen aus, wenn keine

Zitzendesinfektion nach dem Melken durchgeführt wird (BLOBEL 1980).

SELBITZ (1992) und ROLLE und MAYR (1993) bringen den Erreger mit milden klinischen

Mastitiden in Zusammenhang, und WATTS und ROSBACH (2000) beobachteten eine

verminderte Milchleistung beim Vorliegen von C. bovis-Infektionen. Auch BRAMLEY

(1975) beschreibt, dass der Erreger selten eine augenfällige Leukozytose auslöst, und

lediglich eine geringfügige Erhöhung des Zellgehaltes im Vergleich mit nicht C. bovis-

infizierten Nachbarvierteln nachweisbar ist.

Generell wird C. bovis heute zu den minorpathogenen Mastitiserregern gezählt, da er zwar zur

Infektion der Milchdrüse befähigt ist und auch Entzündungen auslösen kann, die aber meist

subklinisch verlaufen und im Bezug auf den Anstieg des somatischen Zellgehaltes eher milde

verlaufen (RÖDER 1985). SOBIRAJ et al. (1997) stufen den Erreger als nicht pathogen ein.

Weitere Diskussionen werden über einen schützenden Effekt von C. bovis vor einer Infektion

mit majorpathogenen Keimen geführt. So konnte gezeigt werden, dass eine Besiedelung mit

C. bovis vor Infektionen mit S. aureus und anderen kontagiösen Mastitiserregern schützt

(MATTHEWS et al. 1991). Die Inzidenz von C. bovis kann nach BRAMLEY (1975) durch

Zitzentauchen und gezieltes antibiotisches Trockenstellen aller Tiere deutlich gesenkt werden.

21

2.2.2 Umweltassoziierte Mastitiserreger

2.2.2.1 Koagulase-negative Staphylokokken (KNS) KNS sind Erreger, die in der Umgebung der Tiere häufig vorkommen. Derzeit werden 28

Spezies des Genus Staphylococcus unterschieden, von denen 25 zu den KNS gezählt werden.

Im Euter des Rindes lassen sich nach den Ergebnissen verschiedener Untersuchungen vor

allem S. xylosus, S. chromogenes, S. epidermidis, S. sciuri, S. haemolyticus, S. hyicus, S.

simulans, und S. cohnii nachweisen (DEVRIESE 1977; HARMON u. LANGLOIS 1989;

TODHUNTER et al. 1993). Nach KUDINHA und SIMANGO (2002) sind die KNS normale

Besiedler der gesunden Euterhaut und stellen somit eine ständige Quelle für die Kolonisation

des Zitzenendes und des Strickkanals dar, weswegen sie gleichzeitig auch zu den

kuhassoziierten Bakterien gerechnet werden. Die Autoren konnten in ihrer Studie zeigen, dass

die KNS heute zu den Hauptursachen boviner Mastitiden gehören.

MATOS et al. (1991) konnten S. xylosus neben den übrigen Staphylokokkenspezies als

dominierende Staphylokokkenart in 90% der von ihnen untersuchten Einstreuproben

nachweisen. KUDINHA und SIMANGO (2002) konnten S. chromogenes, S. epidermidis und

S. hominis am häufigsten aus Milchproben isolieren und stellen die Hypothese auf, dass es

sich bei diesen drei Erregern um die wichtigsten Mastitiserreger aus der Gruppe der KNS

handelt. S. epidermidis und S. chromogenes werden häufig auf der menschlichen Haut

gefunden, so dass eine Übertragung vom Menschen auf das Tier während des Melkens

möglich scheint.

Wegen ihrer geringen Pathogenität werden die KNS zu den minorpathogenen

Mastitiserregern gerechnet. So werden sie häufig mit einer milden Entzündungsform des

Euters und einer leichten Leukozytose ohne Auftreten klinischer Erscheinungen

nachgewiesen (TODHUNTER et al. 1993; SEFFNER u. BERGMANN 1994, KUDINHA u.

SIMANGO 2002). DAVIDSON et al. (1992) vertreten die Auffassung, dass der Nachweis

von KNS auf Einzeltierebene einen relativ unwichtigen Befund darstellt. Liegt jedoch eine

hohe Herdenprävalenz vor, kann ein signifikanter Anstieg der Tankmilchzellzahlen ausgelöst

werden. SOBIRAJ et al. (1997) sehen die Erreger eher als nicht pathogen an.

Der Anteil der KNS an Mastitisfällen, vor allem bei Färsen, hat im letzten Jahrzehnt jedoch

stark zugenommen (MYLLYS et al. 1998). Studien von JONES et al. (1982), TIMMS und

SCHULTZ (1987) sowie BENITES et al. (2002) zeigen außerdem, dass die KNS in

bestimmten Herden die am häufigsten isolierte Erregergruppe darstellten. KUDINHA und

SIMANGO (2002) zeigen, dass KNS häufig eine entzündliche Antwort des Euters

hervorrufen, die sich bei 95% der von ihnen isolierten KNS-Kulturen in erhöhten Zellgehalten

22

äußerte. Die Autoren vermuten, dass die Erreger wahrscheinlich eine höhere Pathogenität

besitzen, als bisher angenommen wurde. So beschrieben STABENFELDT und SPENCER

(1965) die histologischen Veränderungen von 13 mit KNS infizierten Eutern. Sie konnten

überwiegend chronisch entzündliche Veränderungen mit starker Infiltration mit neutrophilen

Granulozyten nachweisen.

Andererseits macht eine Infektion mit S. epidermidis das Euter weniger empfindlich für

nachfolgende Infektionen mit S. agalactiae oder E. coli (BRAMLEY 1978). Dieses Ergebnis

bestätigt die Hypothese, dass gering euterpathogene Infektionserreger, die den Zitzenkanal

und die Oberfläche der Zitzen besiedeln, die Gefahr einer Infektion durch majorpathogene

Mastitiserreger mindern können. Nach BRAMLEY (1975) ist diese günstige Wirkung jedoch

eher durch eine verstärkte Leukozytose bedingt und nicht einer direkten Hemmung durch

diese Keimart zuzuschreiben. Ferner wäre die Inhibition schon durch die Anwesenheit der

KNS im Strichkanal denkbar. DAVIDSON et al. (1992) konnten im Gegensatz dazu nicht

bestätigen, dass eine Infektion des Euters mit KNS das Viertel vor einer Superinfektion mit S.

aureus schützt. Die Untersuchungsergebnisse ergaben keinen statistisch signifikanten

Unterschied zwischen einer Untersuchungsgruppe mit KNS infizierten Eutervierteln und einer

Gruppe, deren Viertel nicht infiziert waren.

In neuer Zeit werden KNS immer öfter als wichtige Mastitiserreger, die Ursache von

ökonomischen Verlusten sind, angesprochen (TIMMS u. SCHULTZ 1987; DAVIDSON et al.

1992). Obwohl geographische Unterschiede auftreten, scheinen weltweit S. hyicus ssp.

chromogenes und S. simulans sowie S. epidermidis und S. xylosus die am häufigsten aus

bovinen Milchproben zu isolierenden Spezies zu sein (BIRGERSSON et al. 1992;

AARESTRUP et al. 1995).

S. hyicus ssp. chromogenes scheint hierbei der am stärksten pathogene Vertreter der Gruppe

der KNS zu sein und kann ernste Mastitiden hervorrufen (DEVRIESE et al. 2002). ZHANG

und MADDOX (2000) fanden bei ihren Studien keine statistisch signifikanten Unterschiede

in den Entzündungsparametern zwischen Euterinfektionen durch S. aureus bzw. S. hyicus ssp.

chromogenes. KUDINHA und SIMANGO (2002) zeigten jedoch, dass S. hyicus ssp.

chromogenes und S. epidermidis wesentlich häufiger bei subklinischen als bei klinischen

Mastitiden isoliert werden konnten. S. hominis und die übrigen KNS-Spezies konnten sie im

Gegensatz dazu fast ausschließlich in Fällen mit subklinischer Mastitis isolieren. Nach

AARESTRUP et al. (1995) werden vor allem bei S. xylosus-Infektionen hohe Zellgehalte

nachgewiesen. Nach DAVIDSON et al. (1992) steigt das Infektionsrisiko im Laufe der

Laktation an. So lag die Prävalenz für Euterinfektionen durch KNS in den ersten fünf

23

Laktationsmonaten zwischen 4,8 und 6,4%, während sie in den letzten vier Monaten der

Laktation 14,2-16,6% betrug.

MOELLER et al. (1999) konnten einige Pathogenitätsunterschiede zwischen den

verschiedenen KNS-Spezies feststellen. So konnte S. simulans weit häufiger aus klinischen

Mastitiden isoliert werden als die übrigen Spezies.

KNS-Infektionen neigen zur Chronizität. So ermittelten TODHUNTER et al. (1993) eine

durchschnittliche Infektionsdauer von 222 Tagen. Die Autoren zeigten, dass die Erkrankung

besonders häufig bei Erstkalbinnen sowie bei älteren Kühen nach der Trockenstehphase

auftrat. Die Prävalenz dieser Erreger kann durch die Verwendung eines Dippmittels nach dem

Melken gesenkt werden (HARMON et al. 1986).

2.2.2.2 Äskulin-positive Streptokokken

2.2.2.2.1 Streptococcus uberis S. uberis ist ein klassischer Mastitiserreger bei Rind, Schaf, Büffel, Schwein und Katze.

Etwa 15-50% der Stämme reagieren mit dem Streptokokken-E-Serum. Diese Spezies besitzt

gemeinsam mit den übrigen umweltassoziierten Streptokokken und Enterokokken die

Fähigkeit, Äskulin abzubauen. Daher zählen sie zur Gruppe der Äskulin-positiven

Streptokokken. S. uberis löst weltweit in einem hohen Prozentsatz katharralisch-klinische

Mastitiden aus (PHUEKTES et al. 2001). Als Krankheitserreger wird S. uberis außer bei

Mastitiden auch bei Endometritiden einschließlich Aborten sowie bei Endokarditiden

nachgewiesen. Nach SMITS et al. (1998) ist S. uberis für 12-14% der klinischen Mastitiden

verantwortlich, wird aber auch häufig bei subklinischen Mastitiden isoliert. KING (1981) gibt

an, dass es insbesondere bei fehlender Behandlung durch eine lange Erkrankungsperiode zu

großen Milchmengenverlusten kommen kann. EDWARDS und SMITH (1966) berichteten,

dass S. uberis für 7% der klinischen Mastitisfälle verantwortlich war, und dass in ihrem

Untersuchungsgut 50% der S. uberis-Infektionen mit klinischen Erscheinungen einhergingen.

BLOBEL (1980) hingegen beschreibt den Erreger als wenig Milchdrüsen-pathogen. Auch

KING (1981) beschreibt eine überwiegend milde Verlaufsform, die nur mit leichten

Sekretveränderungen einhergeht. Aber auch eine Verlaufsform, die bis zur Zerstörung des

betroffenen Euterviertels führen könne, sei möglich. Nach HEJLICEK (1994) sind für die

klinische Ausprägung prädisponierende Einflüsse notwendig. SOBIRAJ et al. (1988) fanden

neben mild verlaufenden Galaktophoritiden bei einem Drittel der mit S. uberis infizierten

Euterviertel akute Mastitiden der katharrhalischen und phlegmonösen Form bei

24

Erstkalbinnen. MILNE et al. (2002) untersuchten 2257 Milchproben klinischer Mastitiden

und konnten S. uberis als häufigsten Erreger in 37% der Proben nachweisen.

Die Verbreitung von S. uberis-Infektionen des Euters variiert stark in den verschiedenen

Regionen. KING (1981) gibt die durchschnittliche S. uberis-Inzidenz mit 4% der Kühe bzw.

1,5% der Viertel an, erwähnt jedoch, dass unter besonderen Umständen in bestimmten Herden

S. uberis der Leitkeim für Mastitiden werden könne. Hierfür kämen insbesondere häufige

antibiotische Euterbehandlungen und verschiedene umweltassoziierte Faktoren als Auslöser

in Betracht.

WANG et al. (1999) geben an, dass S. uberis mit 60-80% heute die am häufigsten

nachgewiesene Streptokokkenart in Kuhmilch ist. Von besonderem epidemiologischem

Interesse ist das Vorkommen dieses Erregers im Gegensatz zu den anderen Mastitis

auslösenden Streptokokken auch außerhalb der Milchdrüse des Rindes (KING 1981;

LÄMMLER u. HAHN 1994). Der Erreger kann von der Bauchwand, den Lippen, Tonsillen,

der Euterhaut, dem Urogenitaltrakt, aus dem Pansen sowie dem Kot und der Einstreu isoliert

werden (BEERWERTH u. KÖSER 1965; CULLEN 1966; WINKENWERDER 1966;

DALEEL u. FROST 1967; SCHALM et al. 1971; WENDT 1994). Eine wesentliche

Bedeutung für die Verbreitung scheint hierbei dem Rinderkot zuzukommen. So konnte aus

Bodenproben einer Weide, die von einer mit S. uberis infizierten Herde begangen worden

war, der Erreger mehrfach isoliert werden (CULLEN 1969). HUGHES (1960) und CULLEN

(1966) hingegen sahen als Hauptreservoir vor allem die Lippenhaut der Tiere an. Der Erreger

kann durch Belecken andere Körperstellen kontaminieren.

HEJLICEK (1994) gibt an, dass in Herden mit S. uberis-Euterinfektionen der Erreger aus

51,6% der Haut- und 85,8% der Umweltproben isoliert werden konnte. BRAMLEY et al.

(1978) konnten den Erreger in hohem Maße aus Einstreumaterial isolieren. Hier scheint sogar

eine Erregervermehrung möglich. Die Vorkommenshäufigkeit von S. uberis in der nächsten

Umgebung der Milchdrüse steht allerdings in keinem direkten Verhältnis zum

Infektionsrisiko. So folgt einer Besiedelung der Zitzenspitze nicht automatisch eine Infektion

des Drüsengewebes. KING (1981) vermutet, dass bei einem Nachweis von S. uberis

außerhalb des Euters eher von einer Kontamination als von einer Kolonisierung oder gar

pathogenen Aktivität auszugehen ist.

Ähnlich wie bei S. dysgalactiae haben auch die S. uberis-Mastitiden keinen seuchenhaften

Charakter. Mittels der Pulsfeldgelelektrophorese konnten WANG et al. (1999) nachweisen,

dass die Isolate innerhalb einer Herde genetisch sehr heterogen sind, da nur sehr selten

verschiedene Kühe Erreger mit identischen Makrorestriktionsmustern im Euter beherbergten.

25

Das zeigt, dass die Transmission von S. uberis von Kuh zu Kuh während des Melkaktes

unwahrscheinlich ist. Die Autoren konnten durch den Nachweis von bis zu fünf Monate lang

persistierenden S. uberis-Infektionen bei 18 von 20 Tieren ferner Hinweise für den

chronischen Charakter der Infektionen erbringen. Bei acht dieser 20 Kühe wurden die

Infektionen durch mehrere Makrorestriktionstypen hervorgerufen. HEJLICEK (1994)

beschreibt chronische S. uberis-Infektionen von 5-20, in seltenen Fällen mit über 20 Monaten

Dauer.

Aufgrund dieser Befunde erscheint eine Verbreitung des Erregers während der Melkzeit

unwahrscheinlich. Vielmehr wird angenommen, dass aufgrund seines ubiquitären

Vorkommens als Umweltkontaminante S. uberis in der Zwischenmelkzeit die Zitzenkuppen

kontaminiert und dann über den Strichkanal in die Milchdrüse eindringt. Er wird bei älteren

Kühen häufig in der Trockenstehperiode isoliert und scheint auch an den klinischen

Mastitiden in der Frühlaktation beteiligt zu sein (COUSINS et al. 1980; SMITH u. HOGAN

1993). OLIVER et al. (1956) konnten zeigen, dass der Erreger bei Kühen im ersten

Laktationsmonat zu 11% nachgewiesen wurde, diese Nachweisrate fällt bis zum neunten

Laktationsmonat auf 1,8%. Nach PHILPOT (1975) ist S. uberis der am häufigsten

nachgewiesene Mastitiserreger in der frühen Trockenstehperiode. NEAVE et al. (1950)

fanden, dass es insbesondere in den ersten drei Wochen des Trockenstehens zu

Neuinfektionen kommt. Auch HEJLICEK (1994) gibt die Neuinfektionsrate in der Zeit des

Trockenstehens mit 40% an und begründet dies damit, dass in diesem Zeitraum der

ausspülende Milchfluss fehle. LACY-HULBERT und HILLERTON (1994) beschreiben eine

signifikant höhere S. uberis-Infektionsrate bei Kühen mit kürzerer Länge des Strichkanals

sowie mit einem aus dem Strichkanal entfernbaren Keratingewicht von weniger als 1,8 mg.

Ferner tritt die S. uberis-Infektion vermehrt bei Erstkalbinnen auf (SOBIRAJ et al. 1988).

Bei der Behandlung werden gute Ergebnisse (87-95% iger Erfolg) mit Penicillin G und

halbsynthetischen Penicillin-Präparaten in der Trockenstehphase erzielt (HEJLICEK 1994).

Um das Überleben und die Vermehrung von S. uberis an Orten außerhalb des Euters

einzuschränken, wird den Milchviehhaltern verstärkte Sauberkeit im Fress-, Lauf- und vor

allem im Liegebereich empfohlen (WANG et al. 1999).

Neben S. uberis werden häufiger auch S. parauberis, S. bovis, S. mitis, S. salivarius, S.

saccarolyticus und Aerococcus viridans aus Milch Mastitis-kranker Kühe isoliert. Diese

werden zusammen hinsichtlich ihres biochemischen Verhaltens bei der Spaltung von Äskulin

als Äskulin-positive Streptokokken angesprochen. Aerococcus viridans wird beim Menschen

26

vor allem aus der Mundhöhle, dem Rachen, aus Zahnplaques, dem Blut, dem

Respirationstrakt, dem Intestinum und aus dem weiblichen Genitale isoliert. Beim Rind wird

er häufig aus der Milch, aus den Tonsillen und aus dem Genitaltrakt ohne Vorliegen von

Krankheitserscheinungen nachgewiesen.

2.2.2.2.2 Enterococcus spp. Enterokokken bilden innerhalb der Gattung Streptococcus eine Gruppe, die sich durch ihr

ubiquitäres Vorkommen, ihre auffallenden biologischen Eigenschaften und ihren

abweichenden Zellaufbau von den übrigen Streptokokken unterscheiden. Sie sind fakultativ

pathogen und werden als Verursacher von Lebensmittelinfektionen beim Menschen diskutiert.

Durch ihre weite Verbreitung und ihr massives Auftreten im Kot existieren breite

Infektionsmöglichkeiten, und Interpretationen bezüglich der ätiologischen Bedeutung bei

Infektionen werden erschwert. Obwohl Enterokokken sehr häufig aus Milch isoliert werden

konnten, lässt dies keine zuverlässige Aussage über ihre tatsächliche originäre Bedeutung in

der Milchdrüse zu, da oftmals eine postsekretorische Kontamination vorzuliegen scheint

(BLOBEL 1980). Enterokokken sind Kommensalen und Saprophyten des Magendarmtraktes

von Mensch und Tier und treten als fäkal kontaminierende Mikroflora in der Stallumwelt auf.

Aus der direkten Umgebung der Tiere können sie dennoch in die Milchdrüse des Rindes

eindringen und subklinische, gelegentlich auch klinische Mastitiden auslösen. In der

Milchdrüse können sie für längere Zeit persistieren.

Am häufigsten werden E. faecium, E. faecalis und E. avium aus Milchproben isoliert.

Enterokokken mit dem Lancefield-Gruppenantigen D verursachen beim Rind nur vereinzelt

Mastitiden. So beträgt nach HEJLICEK (1994) ihr Anteil an den Mastitisstreptokokken in

Frankreich 10%, in Österreich jedoch 56,9% (hiervon 5% S. bovis).

Von besonderer Bedeutung ist ihre natürliche Resistenz gegen die allgemein bei der

Mastitistherapie verwendeten Chemotherapeutika.

Umstritten ist bis heute die Rolle der Enterokokken bei den so genannten „unspezifischen“

Lebensmittelintoxikationen. Vergiftungen, bei denen aus den inkriminierten Lebensmitteln

hohe Keimzahlen an Enterokokken isoliert werden konnten, wurden häufig beschrieben.

Überwiegend wurden E. faecalis und E. faecium nachgewiesen. Die Inkubationszeit betrug 2-

36 Stunden, die Hauptsymptome waren Übelkeit, Erbrechen, Leibschmerzen und Durchfall.

In fast allen Fällen konnten aus den Proben aber auch andere Bakterien isoliert werden.

Tierexperimente und Versuche an menschlichen Freiwilligen haben unterschiedliche

Resultate und kaum Hinweise auf eine gesundheitsschädliche Eigenschaft der Enterokokken

27

ergeben. Man nimmt an, dass sowohl die Erregeranzahl, als auch die Beschaffenheit des

Substrates sowie das Wachstumsstadium des Erregers eine Bedeutung haben. Erwähnenswert

ist auch die Eigenschaft der Enterokokken zur Bildung von Aminosäure-Decarboxylase und

damit die Förderung der Entstehung von biogenen Aminen (FEHLHABER 2004).

In Rohmilch liegt der prozentuale Anteil von Enterokokken meist unter 5% (HAHN 1984).

Der Autor äußert die Meinung, dass die Bedeutung der Enterokokken als

Lebensmittelvergifter im Vergleich zu anderen mikrobiellen Ursachen sehr gering ist und

insgesamt keine nennenswerte Gefahr darstellt.

2.2.2.3 Enterobacteriaceae (Coliforme) Die Enterobacteriaceae sind als Bestandteil der natürlichen Darmflora von Mensch und

Säugetieren klassische Umwelterreger. Die im klinischen Verlauf etwa gleichartigen durch

Enterobacteriaceae verursachten Mastitiden werden überwiegend durch Escherichia (E.) coli

hervorgerufen, weswegen sie häufig auch als Coli-Mastitis bezeichnet werden. Mit größerem

Abstand folgen Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae,

Citrobacter diversus, Serratia marcescens, Serratia odorifera, Proteus spp. und Salmonella

spp., die in der Routinediagnostik oftmals nicht weiter differenziert und als coliforme Keime

zusammengefasst werden. E. coli besitzt eine Reihe von Virulenzfaktoren wie z.B.

Endotoxine, Adhäsionsfaktoren, Enterotoxine und Zytokine und ist an Krankheitsprozessen

wie Enteritiden, Septikämien und Arthritiden unterschiedlicher Tierspezies ursächlich

beteiligt.

Der Anteil von E. coli an der gesamten Darmflora beträgt im Zustand der Eubiose nicht mehr

als 1% (ROLLE u. MAYR 2002). Neben ihrer Beteiligung an den Verdauungsprozessen

haben die coliformen Keime mit der Produktion von Thiamin, Folsäure sowie Vitamin C und

K wichtige physiologische Funktionen. Die weite Verbreitung der Bakterienart in der Umwelt

steht in engem Zusammenhang mit der ständigen Ausscheidung über den Kot (SELBITZ

1992). Sowohl die Verteilung der Serovare, als auch das Resistenzverhalten berechtigen zu

der Annahme, dass der Darmkanal des Rindes Reservoir für Mastitis auslösende Stämme ist

(BERGMANN 1994). So dürfte für die Coli-Mastitis kontaminierte Einstreu die Quelle für

eine Euterbesiedelung und Infektion sein. Klebsiella und Enterobacter ssp. sind unabhängig

von einer fäkalen Kontamination in vielen Umweltmaterialien vorhanden. Nach

BERGMANN (1994) sind außerdem prädisponiernde Faktoren wie z.B. resistenzmindernde

Stresseinwirkungen und hohe Erregerkonzentration für die Infektion erforderlich. Der Grund

für die wachsende Bedeutung der Coli-Mastitis sind ihre zunehmende Inzidenz und die

28

ernsten Symptome der Erkrankung. Sie tritt überwiegend als perakut bis akut und bösartig

verlaufende, seltener chronische oder subklinische Euterentzündung vor allem peripartal bei

Einzeltieren auf. Die Erkrankung mehrer Kühe einer Herde zum gleichen Zeitpunkt kommt so

gut wie nicht vor. Eine Übertragung von Kuh zu Kuh wird daher nahezu ausgeschlossen. Im

Stall gehaltene Tiere erkranken weitaus häufiger als auf der Weide gehaltene. Überwiegend

ist nur ein Viertel, häufig ein Hinterviertel, betroffen. Eine Zunahme der Erkrankungen in den

letzten Jahren wird mit intensivierter Milcherzeugung unter den Bedingungen der Stallhaltung

in Verbindung gebracht. So kann ihr Anteil in Problembeständen 25% des

Mastitiserregerspektrums betragen (BERGMANN 1994).

Der Anteil der durch coliforme Keime ausgelösten Mastitisfälle variiert sehr zwischen

verschiedenen Regionen. So liegt dieser in Finnland unter 20%, während in Israel mehr als

60% der Mastitisfälle durch coliforme Keime bedingt sind (KAIPAINEN et al. 2002). Nach

HOGAN et al. (1989) und SCHUKKEN et al. (1990) ist E. coli der am meisten isolierte

Erreger bei klinischen Mastitisfällen in Herden mit einem niedrigen Tankmilchzellgehalt.

Beim perakuten Verlauf treten durch die Bakterien- und deren Endotoxinwirkung neben den

lokalen entzündlichen Veränderungen auch starke Allgemeinsymptome auf. Es kommt zu

hohem Fieber mit stark erhöhter Pulsfrequenz, Anorexie, Muskelzittern und Festliegen. Das

betroffene Viertel ist hochgradig geschwollen, vermehrt warm, schmerzhaft sowie von harter

Konsistenz. Das mengenmäßig verminderte Sekret ist klar, enthält kleine Fibrin- oder

Eiterflocken. Gehäuft tritt diese Form der Mastitis kurz nach dem Abkalben auf. Die

Krankheit endet ohne Therapie häufig letal oder mit völligem Funktionsverlust des

betroffenen Viertels. Hierfür verantwortlich ist insbesondere das schnelle Auftreten von

massiven Gewebsveränderungen in der Milchdrüse. So lassen sich bereits eine Stunde nach

einer experimentellen Infektion erste Nekrosen der Epithelzellen der Zitzen und Milchgänge

nachweisen. Bereits zwei Stunden post infectionem weisen entnommene Milchproben die

typischen Mastitis-bedingten Sekretveränderungen auf, und erste Allgemeinsymptome treten

in Erscheinung. Die Symptomatik einer akuten Mastitis ist etwa fünf Stunden post

infectionem voll ausgebildet (BERGMANN 1994).

Der galaktogene Infektionsweg gilt als der häufigste, jedoch wird auch der hämatogene aus

Darminfektionen und puerperalen Störungen diskutiert (ROLLE u. MAYR 2002). WEIGT

und DREIST (1988) hingegen sehen in jeweils 30% der Coli-Mastitiden Geburtsstörungen,

andere Organ- und Allgemeinerkrankungen sowie Euter- und Zitzenverletzungen als

Auslöser, während sie den galaktogenen Infektionsweg nur in 10% der Fälle und meist nach

melkhygienischen Mängeln als Ursache ansehen.

29

Coli-Mastitiden häufen sich zum Zeitpunkt der Geburt bis zu drei Monate post partum

(BERGMANN 1994). Durch die rasche Vermehrung der coliformen Keime und die sofort

einsetzende Endotoxinproduktion kommt es insbesondere durch die toxinbedingte Freisetzung

von Histamin und Prostaglandinen zu einer Schädigung der Gefäßmembranen und damit der

Mikrozirkulation. Es bilden sich Gefäßthromben und in der Folge Mangeldurchblutung mit

Nekrose größerer Euterabschnitte mit dem Ergebnis einer hämorrhagisch-nekrotisierenden

Mastitis.

LAM et al. (1996) konnten in ihren Untersuchungen 3-18 verschiedene E. coli-Genotypen in

unterschiedlichen Herden isolieren. Verschiedene Viertel einer Kuh waren dabei meist durch

verschiedene Genotypen infiziert worden. Dies spricht für die umweltassoziierte Übertragung

der Erreger. Eine Übertragung von Viertel zu Viertel wird als unwahrscheinlich angesehen.

Wenn allerdings mehr als eine klinische E. coli-Mastitis pro Kuh/Viertel und Laktation

auftrat, konnte meist derselbe Genotyp isoliert werden. Die Autoren äußern daher die

Vermutung, dass auch eine chronische subklinische Coli-Mastitis vorkommen kann.

2.3 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)

Im Laufe der vergangenen Jahre wurden neue molekularbiologische Typisierungssysteme zur

Klärung epidemiologischer Fragestellungen herangezogen. Theoretisch wird für jedes System

vorausgesetzt, dass epidemiologisch verwandte Bakterienisolate, die im Rahmen der klonalen

Expansion aus einem gemeinsamen Vorläuferstamm hervorgegangen sind, charakteristische

Eigenschaften teilen, welche sie von anderen, epidemiologisch nicht verwandten Isolaten

unterscheidet. Die Verwendungsmöglichkeit dieser speziellen Eigenschaften hängt dabei von

der Stabilität der Eigenschaften innerhalb eines Stammes und der Diversität innerhalb einer

Spezies ab. Die Diversität reflektiert die evolutionäre genetische Divergenz, die durch

zufällige, nicht letale Mutationen entsteht, welche im Laufe der Zeit akkumulieren. Solche

Mutationen sind dann nachweisbar, wenn sie an Stellen auftreten, für die mit den heutigen

Methoden Detektionsmöglichkeiten bestehen (MASLOW et al. 1993, SCHMITZ et al. 1995).

Durch Digestion der chromosomalen DNA mit selten schneidenden Restriktionsenzymen und

anschließender PFGE können z.B. Mutationen an den spezifischen Schnittstellen

nachgewiesen werden. Diese Schnittstellen dienen hierbei als selektionsneutrale Marker, die

im Verlauf der Evolution des Bakterienchromosoms über Rearrangements oder Mutationen an

einer Stelle verloren gehen und an anderer Stelle neu entstehen können.

Laut GOERING (1998) eignen sich für GC-reiche Sequenzen insbesondere Enzyme, die

Hexanukleotide aus A und T erkennen, und analog für AT-reiche Genome Enzyme, die eine

30

hexamere Sequenz aus G oder C erkennen. So schneidet die in vorliegender Arbeit

verwendete Endonuclease SmaI z.B. CCC-GGG. Idealerweise sollte nach Schneidung aus der

Gesamt-DNA eine überschaubare Anzahl von 7-20 Fragmente entstehen.

Bei der konventionellen Gelelektrophorese mit einem konstanten elektrischen Feld wandern

die durch ihr Phosphatgruppengerüst negativ geladenen DNA-Moleküle in Richtung auf die

Anode (SCHMITZ et al. 1995). Mit dieser Methode können Moleküle bis zu einer Größe von

50 Kilobasenpaaren (Kb) aufgetrennt werden. Die Moleküle wandern hierbei umso

langsamer, je größer sie sind (GARDINER 1991). Größere Moleküle können nicht horizontal

durch die Poren des Gels wandern, da die Porengröße des Gels hierfür zu klein ist. Deswegen

richten die Moleküle ihre Längsachse parallel zu den elektrischen Feldlinien aus und wandern

somit in Schlangenlinien durch die Poren des Gels. Direkte Folge ist, dass alle diese Moleküle

in einer einzigen Bande wandern, und eine Auftrennung und Größenbestimmung nicht mehr

möglich ist (WINTER u. DRIESEL 1988).

SCHWARTZ und CANTOR (1984) gelang die Entwicklung einer neuen Technologie zur

Überwindung dieses physikalischen Phänomens. Bei der PFGE werden mehrere Elektroden in

einem bestimmten Winkel zueinander angeordnet, welche abwechselnd ein elektrisches Feld

erzeugen, wodurch sich die Richtung der Feldlinien in bestimmten Zeitintervallen regelmäßig

verändert. Die DNA-Moleküle müssen daher ihre Ausrichtung und Konformation ständig

erneut ändern, um ihre Längsachse parallel zu den elektrischen Feldlinien ausrichten zu

können (SCHMITZ et al. 1995). Diese Umorientierung nimmt bei größeren Molekülen eine

längere Zeit in Anspruch als bei kleinen Molekülen, so dass die Nettowandergeschwindigkeit

der kleineren Moleküle größer ist (WINTER u. DRIESEL 1988). Folglich verbleibt den

Molekülen mit zunehmender Größe immer weniger Zeit für die Wanderung entlang der

Feldrichtung, wodurch es zur Auftrennung der linearen DNA-Moleküle nach deren

Molekulargewicht kommt. Mit Hilfe dieser Technologie können somit auch Moleküle mit

einer Größenordnung von 50 bis 6000 Kb aufgetrennt werden. Die ständig wechselnde

Richtung des Stromflusses wird über die gesamte Elektrophoresezeit aufrechterhalten, so dass

die DNA einem Zickzackpfad folgt, der in seiner Nettobewegung jedoch dem unteren Ende

des Gels entgegenstrebt.

Um alternierende elektrische Felder erzeugen zu können, wurden zahlreiche Apparaturen

entwickelt, die sich in der Geometrie ihrer Elektrophoresekammer sowie Form, Anzahl und

Stellung der Elektroden unterscheiden. Am häufigsten wird das "contour clamped

homogeneous electric field" (CHEF)-System eingesetzt, welches auch in der vorliegenden

Arbeit verwendet wurde. 24 Elektroden sind hier in einer Elektrophoresekammer hexagonal

31

im Winkel von 120° zueinander angeordnet, die beiden sich gegenüberliegenden Seiten des

Sechsecks werden abwechselnd aktiviert.

Laut GROTHEUS und TÜMMLER (1991) ist die PFGE ein geeignetes Verfahren, um

Infektionsquellen und Übertragungswege von bakteriellen Erregern zu ermitteln und die

Diversität und klonale Struktur von Bakterienkulturen aufzuklären. Nach Meinung von

RÖMLING et al. (1994 u. 1995) stellt die PFGE den Goldstandard für die epidemiologische

Typisierung fast aller infektiöser Mikroorganismen dar. Mit Hilfe des visuellen Vergleichs

der Fragmentlängenmuster kann der Verwandtschaftsgrad der Stämme bestimmt werden.

Nach TENOVER et al. (1995) definiert das Fragmentlängenmuster den Genotyp eines

Bakterienstammes. So zeichnen sich nicht miteinander verwandte Klone durch

unterschiedliche Fragmentlängenmuster aus, während Varianten eines Klons ähnliche oder

identische Muster besitzen. Isolate, die in bis zu drei Bandenpositionen differieren, können

aus einem einzigen genetischen Event entstanden sein und deshalb epidemiologisch eng

verwandte Untertypen eines Stammes darstellen. Liegen mehr als drei Abweichungen im

Bandenmuster vor, so können diese nach TENOVER et al. (1995) miteinander verwandt sein,

wobei der Verwandtschaftsgrad nicht ganz so eng liege.

Bei der PFGE werden die Bakterien in Agarosegelblöckchen eingebettet, die Organismen in

situ lysiert, wodurch das Bakterienchromosom gegen Scherbruch geschützt wird. Es folgt die

Digestion der chromosomalen DNA mit spezifischen Restriktionsenzymen, welche seltene

Schnittstellen haben, wodurch die DNA in eine überschaubare Zahl von Fragmenten

gespalten wird. Die Agaroseblöckchen mit den DNA-Fragmenten werden in die

Aussparungen eines 1%igen Agarosegels eingebettet, und die Fragmente werden in einer

Apparatur, welche die Richtung der elektrischen Strömung ändern kann, ihrer Größe nach in

ein bestimmtes Restriktionsmuster aufgetrennt. Durch den Vergleich dieser spezifischen

Muster kann der Verwandtschaftsgrad der Isolate bestimmt werden (TENOVER et al. 1995).

2.4 Wirtschaftliche Verluste durch Mastitiden Die geschätzten Kosten für die klinische Mastitis variieren von Land zu Land und beinhalten

die Ausgaben für die Behandlungs- und Tierarztkosten, die verminderte Milchleistung

während der verbleibenden Laktation, die wegen antibiotischer Rückstände zu verwerfende

Milchmenge, die frühzeitige Merzung von Tieren mit einem hohen genetischen Wert und

deren Remontierung, die Extraarbeit, die Verminderung der Milchqualität und das erhöhte

Risiko einer rezidivierenden Erkrankung zu einem späteren Zeitpunkt (HERINGSTAD et al.

2000). Die Mastitis ist von größter ökonomischer Bedeutung für die Milchindustrie, da sie

32

eine verminderte Milchqualität und einen großen Produktionsverlust sowie einen erhöhten

Bedarf an Medikamenten und tiermedizinischer Betreuung verursacht (WANG et al. 1999).

Alle Mastitiden haben Einfluss auf die substantielle Zusammensetzung und die

technologische Wertigkeit der Milch (TOLLE et al. 1977). Subklinische Mastitiden treten in

der Regel als Bestandsproblem auf. Der Milchverlust durch subklinische Mastitiden ist in der

Gesamtsumme um ein Vielfaches höher als durch klinische Mastitiden, da diese auf

Herdenbasis sehr viel verbreiteter sind als klinische Fälle (WENDT 1998). Nach ZSCHÖCK

et al. (1998) kommt die subklinische Mastitis 20-50mal häufiger vor als die klinische

Mastitis.

Ihre Bedeutung liegt im wirtschaftlichen Schaden, in erster Linie verursacht durch

Milchminderleistung, durch die eingeschränkte Verwertungsmöglichkeit infolge der

veränderten Milchzusammensetzung, durch erhöhte Arzneimittel- und Tierarztkosten, durch

das Verkehrsverbot für die Milch von mit Antibiotika behandelten Kühen und schließlich

durch frühzeitiges Merzen erkrankter Tiere (KIELWEIN 1994). So sind Eutererkrankungen

neben Fruchtbarkeitsstörungen die häufigste Abgangsursache für Kühe aus einem Bestand.

Nach Angaben von KIELWEIN (1994) ist für 70% der durch subklinische Mastitiden

verursachten Schäden die verminderte Milchproduktion und für 14% die frühzeitige Merzung

betroffener Kühe verantwortlich. Pro erkrankter Kuh entstehen in der BRD pro Jahr

finanzielle Einbußen von 100 Euro (KIELWEIN 1994; ZSCHÖCK et al. 1998).

Weitere Berechnungen ergaben, dass der Milchverlust durch subklinische Mastitiden im

Durchschnitt bei 17,1% pro Viertel und 9,7% pro Tier liegt (TOLLE et al. 1977; BLOBEL

1980). Nach JANZEN (1970) liegt die tägliche Milcheinbuße pro betroffenem Viertel

zwischen 0,76-5,86 Litern.

WENDT (1998) gibt den Verlust bei Milchzellgehalten von über 400.000 Zellen/ml Milch

zwischen 7,5 und 12% an. Die Verluste der Milchleistung nehmen mit steigendem

Milchzellgehalt linear zu. Die angegebenen Verluste entstehen nicht nur während der

Laktation, in der der Zellgehalt erhöht war, sondern ebenfalls abhängig vom Milchzellgehalt

auch in den Folgelaktationen. Nach KIELWEIN (1994) setzt die durch Mastitis bedingte

Leistungsminderung im Bereich um 100.000 Zellen/ml ein und kann bis zu 20% des

erkrankten Viertels betragen. Die technologische Wertigkeit der Milch mastitiskranker Kühe

ist beeinträchtigt durch den vermehrten Gehalt an Chlor- und Natriumionen, eine Reduktion

der fettfreien Trockenmasse, ein vermindertes Koagulierungsvermögen der Kaseine, eine

Erhöhung des Gehaltes an originären Enzymen, eine verminderte Hitzestabilität, eine

unspezifische Hemmung der Starterkulturen und durch die Gefahr des Auftretens von

33

Hemmstoffen in der Milch (KIELWEIN 1994). Nach JANZEN (1970) sinkt der Fett- bzw.

Laktosegehalt der Milch um 0,1-0,45% bzw. 0,1-0,77%. Weiterhin verändert sich der

prozentuale Anteil des Calciums, Magnesiums und Kaliums, wodurch es zu einer

Geschmacksbeeinflussung und zu Verarbeitungsschwierigkeiten in der Molkerei kommt, die

zu Qualitätsmängeln des Endproduktes führen können. Die Veränderungen der

Milchzusammensetzung bedingen auch eine verminderte ernährungsphysiologische

Wertigkeit der Milch. Erhöhte Milchzellgehalte korrelieren mit einer schlechten

Milchqualität, einer reduzierten Qualität der hergestellten Milchprodukte und einer

verringerten Haltbarkeit.

GRAY und SCHALM (1962) zeigten durch einen Vergleich mit CMT-negativen Vierteln,

dass es bei Vierteln mit einem CMT-Ergebnis von 1+, 2+ bzw. 3+ zu einer Verminderung der

Milchmenge um 10, 16 bzw. 24,5% kommt. Auch PHILPOT (1967) untersuchte den Einfluss

der subklinischen Mastitis auf die Milchmenge und kam zu dem Ergebnis, dass die

Milchleistung bei einem CMT-Ergebnis von 1+, 2+ bzw. 3+ um 11,4, 25,6 bzw. 45,5%

reduziert ist.

Nach WILSON et al. (1997) liegen die Verluste pro Fall einer intramammären Infektion

zwischen 130 und 320 US$. HERINGSTAD et al. (2000) geben die Kosten pro klinischem

Mastitisfall in den USA mit 108 bis 122 US$ an. WELLENBERG et al. (2002) schätzen den

weltweiten Verlust durch die Mastitis jährlich auf 35 Milliarden US$. Der finanzielle Verlust

pro Laktation war am höchsten für Pasteurella spp. mit 500,12 US$, Mycoplasma spp. mit

451,63 US$ und S. agalactiae mit 388,19 US$. Die Werte für S. aureus und Streptococcus

spp. lagen mit 185,51 US$ bzw. 143,65 US$ ebenfalls hoch. Für die KNS konnten WILSON

et al. (1997) einen finanziellen Verlust von ungefähr 100 US$ pro Fall ermitteln. Für die

Schätzungen dieser Werte verwendeten die Autoren die ermittelten Unterschiede der 305-

Tage Milchleistung von mit dem jeweiligen Erreger infizierten zu gesunden Tieren.

Die Kontrolle dieser kostenverursachenden Erkrankung muss auf ein kontinuierliches

Präventionsprogramm und die Eliminierung bestehender Infektionen aufbauen. Durch die

Einführung und konsequente Beibehaltung eines solchen Programms kann laut JANZEN

(1970) der durch die Mastitis verursachte finanzielle Verlust um 50% reduziert werden. Ein

spezielles Kontrollprogramm kann den durch Mastitiden verursachten Milchverlust, die

Anzahl der Euterbehandlungen und den ökonomischen jährlichen Verlust pro Kuh signifikant

reduzieren.

Da Gewinnspannen der Milchindustrie direkt von der Eutergesundheit abhängen, haben in

vielen Ländern wie z.B. auch in Deutschland die milchverarbeitenden Organisationen

34

begonnen, schlechte Milchqualität mit Milchgeldabzügen zu bestrafen und für gute

Milchqualität Prämien zu zahlen. Es hat sich gezeigt, dass die Milchviehhalter sehr gut auf

diese Systeme reagieren, und dass die Milchqualität in Ländern mit oben genannten

Vorgehensweisen stetig gesteigert werden konnte. In Finnland konnte der Zellgehalt der

Anlieferungsmilch durch Prämienzahlungen für besonders zellarme Milch auf den niedrigsten

Wert der gesamten EU mit 132.000 Zellen/ml gesenkt werden (HALLEN-SANDGREN

2000).

Auch in Mexiko haben einzelne Molkereien ähnliche Programme eingeführt, jedoch gibt es

bisher noch keinen im offiziellen Normenprogramm Mexikos (Norma Oficial de México =

NOM) verankerten oberen Zellzahlgrenzwert für Anlieferungsmilch. Auch ohne stützende

Gesetzgebung zeichnet sich bei den milchverarbeitenden Betrieben Mexikos der Trend ab,

Anlieferungsmilch mit geringen Zell- und Keimzahlen zu fordern. Das Ziel der Unternehmen

ist es, langfristig Milch mit einem Zellgehalt von weniger als 200.000 Zellen/ml mit einem

Keimgehalt von weniger als 10.000 cfu/ml aufzukaufen (ARREGUÍN 2003).

Momentan regeln in Mexiko die NOMs den Austausch von Produkten innerhalb eines Landes

und zwischen verschiedenen Ländern. Durch die Normen werden Regeln für die Qualität der

Produkte aufgestellt und so der Handel und der Wettbewerb stabilisiert.

Die NOMs liefern obligatorische Regeln, Attribute und Charakteristiken für ein bestimmtes

Produkt, einen Prozess, eine Aktivität, einen Service, eine Produktionsmethode, sowie

Symbole, Marken und Etikettierungen für die fertigen Produkte.

Da Milch und Milchprodukte eine Lebensmittelgruppe großer Wichtigkeit für die

menschliche Ernährung darstellen, wird in den 19 derzeit gültigen und zwischen 1980 und

2003 publizierten mexikanischen Normen festgesetzt, dass die Produkte vor ihrer

Kommerzialisierung und Konsumierung bestimmten hygienischen Behandlungsprozessen

unterzogen werden müssen, damit von den Produkten keinerlei Risiko für den Konsumenten

ausgehen kann. Basierend auf diesen Normen haben die Produzenten die Möglichkeit eine

gerechte Vergütung für das von ihnen erzeugte Produkt zu erhalten (ARREGUÍN 2003).

Die momentan für die mexikanische Milchwirtschaft gültigen Normen sind folgende:

- NOM-155-SCFI-2003

Diese Norm setzt die kommerziellen Namen der verschiedenen Milchtypen, deren

physiochemische Eigenschaften sowie die kommerziellen Informationen der Etiketten und

bestimmte Probemethoden fest. Sie beinhaltet eine Beschreibung für die Homogenisierung,

Pasteurisierung und thermische Verarbeitung von Milch.

35

- NOM-184-SSA1-2002

Diese Norm setzt sanitäre und hygienische Anforderungen fest, welche Milch für den

menschlichen Konsum erfüllen muss, wenn sie in Mexiko hergestellt und in Umlauf gebracht

oder aus dem Ausland importiert werden soll.

- NMX-F-026-1997-SCFI

In dieser Norm erfolgt die Namensgebung für die verschiedenen Milchtypen im Einklang mit

den Verarbeitungsprozessen sowie für die Mindestanforderungen an die Qualität. Sie besagt,

dass Milch von gesunden Kühen stammen muss und 15 Tage vor bis 5 Tage nach der Geburt

keine Milch für den menschlichen Konsum gewonnen werden darf. Sie muss für die

Unbedenklichkeit für den Verbraucher einer thermischen Behandlung unterzogen werden.

Weiter darf Milch einem Filtrationsprozess, der Homogenisierung oder anderen

Behandlungen ausgesetzt werden, wenn sie hierbei nicht kontaminiert und in ihren

ernährungsphysiologischen Werten verändert wird.

Neben den genannten Normen plant das nationale Komitee für Normierung die Aufnahme der

Rohmilch mit ihren physiochemischen und biologischen Eigenschaften sowie geeigneten

Probemethoden. Nach Vollendung dieses Projektes PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2003

soll die Norm NMX-F-026-1997-SCFI außer Kraft treten. Mit Hilfe dieser neuen Norm und

der gründlichen Revision und Aktualisierung der momentan gültigen Normen aus den 80er

Jahren könnte ein wichtiger Schritt in Richtung Mastitisprävention und Verbraucherschutz

erreicht werden.

2.5 Klimatische Einflüsse auf das Mastitisgeschehen Das Klima hat einen großen Einfluss auf das Wohlbefinden der Tiere und somit auch auf die

Mastitisinzidenz. Die Behaglichkeitszone im Bezug auf die Temperatur für Milchkühe liegt

zwischen 5 und 17°C. Innerhalb dieses Bereiches tritt für die Tiere kein Stress auf. Fallen die

Temperaturen unter 5°C, steigt lediglich der Erhaltungsbedarf der Tiere an. Bei Temperaturen

über 24°C sind die Tiere einer Stress-Situation ausgesetzt, so dass die Milchmengenleistung

bei gleichzeitigem Anstieg der Zellzahl sinkt (KIELWEIN 1994). Guadalajara liegt 20 Grad

05 `nördlicher Breite und 103 Grad 05 `östlicher Länge auf 1540 Metern Höhe. Die

durchschnittlichen Tagestemperaturen im Sommer liegen in Jalisco bei 28°C. In der Nacht

kühlt die Luft auf 23°C ab. Die Wintertemperaturen liegen bei 23°C am Tag und 10°C in der

Nacht.

36

Zu extreme Umgebungstemperaturen, die über dem biologischen Optimum liegen, führen bei

Milchkühen schnell zu hitzebedingtem Stress. Hierbei sinken die Abwehrkräfte, und die Tiere

werden anfälliger für Infektionen. Dabei erfolgt die Beeinflussung teils über die Erhöhung des

Energieumsatzes, teils über Veränderungen des intermediären Stoffwechsels sowie über

Veränderungen der Hormonkonstellationen. Der Hitzestress führt zu einer starken

Reduzierung der Raufutteraufnahme und des Wiederkauens, wodurch es zu einer verringerten

Produktion von Fettsäuren und zu Veränderungen im Acetat/Propionat-Verhältnis kommt.

Der pH-Wert sowie die Elektrolyt-Konzentration im Pansen sinken, was mit einem erhöhten

Natrium-Verlust über die Harnausscheidung und mit einem erhöhten Kalium-Verlust über die

Haut verbunden ist (MIELKE 1994).

Bei höheren Außentemperaturen, die oft mit einer erhöhten Luftfeuchte verbunden sind,

finden Keime außerdem ideale Wachstumsbedingungen, und durch ihre stärkere Vermehrung

steigt der Infektionsdruck auf die Kühe an. Durch die gesunkenen Abwehrkräfte infolge des

temperaturbedingten Stresses kann dann eine Invasion des Euters mit Mastitiserregern leichter

erfolgen (ZSCHÖCK et al. 1998). Bei Wärmestress steigt zudem die Wasseraufnahme,

wodurch die Tiere wiederum weniger Futter aufnehmen. Neben der erhöhten

Krankheitsanfälligkeit ist der Hitzestress der entscheidende limitierende Faktor für die

Milchproduktion in tropischen Regionen (KIELWEIN 1994).

Einen weiteren Einfluss auf die Mastitisinzidenz vor allem mit umweltassoziierten Erregern

haben nach SMITH und HOGAN (1993) die vermehrten Niederschläge in der Regenzeit, da

die Ausläufe und die Triebwege zum Melkstand zu diesem Zeitpunkt sehr matschig sind und

es zu einem erhöhten Kontaminationsrisiko für die Euter kommt. Insbesondere die teilweise

schlechten hygienischen Verhältnisse in Mexiko und die feuchten klimatischen Bedingungen

der Regenzeit begünstigen die Übersiedelung ubiquitärer Erreger vom Boden auf die

Milchdrüse der Tiere.

2.6 Geschichte und heutiger Stand der Milchproduktion in Mexiko Die Milchviehhaltung hat in Mexiko eine lange Tradition und begann etwa vor 400 Jahren,

als die Spanier die ersten Milchkühe einführten. Die Ureinwohner hielten bis dahin kaum

domestizierte Tiere, wenn man von einigen alten Rinderrassen, die aus Kuba eingeführt

worden waren, absieht. Es folgte eine Vergrößerung der Rinderpopulation, die mit der

extensiven Nutzung großer Landstriche einherging. Nachdem es zu einer staatlichen

Limitierung der Bodennutzung kam, folgte die Viehhaltung auf Haziendas, wo die Rinder zur

Produktion von Fleisch und Milch für den Binnenmarkt Mexikos gehalten wurden. Aus

37

diesen Haziendas entwickelten sich im 19. Jahrhundert produktive Einheiten mit

Bodenrechten und festangestellten Arbeitern für den internen Milch- und Fleischmarkt. Die

Milchwirtschaft entwickelte sich ohne jegliche Technisierung vor allem auf den Haziendas

nahe Mexiko Stadt und Guadalajara, den Hauptzentren des Milchkonsums. Die von den

Spaniern eingeführten Tiere waren jedoch keine reinen Milchviehrinder.

Die sozialen Umstrukturierungen im 19. Jahrhundert sowie die Revolution von 1910 setzten

der Entwicklung der Milchviehhaltung stark zu, da es durch Hungersnöte der mexikanischen

Bevölkerung zu einer extremen Dezimierung der Viehherden kam.

Zwischen 1910 und 1928 verstärkte man die Einfuhr von speziellen Milchviehrassen wie

Holstein Friesian, Jersey, Guernsey, Ayrshire und Brown Swiss, um die vorhandene

Tierpopulation genetisch zu verbessern und dadurch die nationale Milchproduktion zu

steigern. Ab 1940 folgte die Stabilisierung des mexikanischen Marktes durch einen

fortschreitenden Ausbau der Transportwege und eine industrielle Transformation. Diese

Entwicklung wurde durch die stetig steigende Nachfrage nach Kuhmilch gefördert. Etwa zur

gleichen Zeit traten erstmals Forderungen nach Lösung der lebensmittelhygienischen

Probleme, die mit der Milchproduktion verbunden waren, auf. Es kam zu ersten gesetzlichen

Festlegungen für die Produktion und Kommerzialisierung von Milchprodukten, da

insbesondere die Konservierung und die schlechte Hygiene im Umgang mit dem Produkt zu

Problemen führten.

So entstanden zwischen 1950 und 1970 die ersten Pasteurisierungsanlagen, um Milch mit den

nötigen hygienischen Erfordernissen anbieten zu können. Der Großteil der Bevölkerung

bevorzugte zu diesem Zeitpunkt noch Rohmilch als Nahrungsmittel.

In den 50er und 60er Jahren begann die Spezialisierung der Milchproduktion. Der Staat bot an

Milchprojekten interessierte Produzenten Kredite zur Unterstützung an. Hierdurch haben sich

allmählich große Milchviehbetriebe entwickelt, die sich in die Produktionskette der

milchverarbeitenden Industrie integrierten. Jedoch hielt trotz dieses Trends der Großteil der

mexikanischen Milchviehhalter an ihren traditionellen Produktions- und Haltungsformen fest.

Zwischen 1972 und 1994 zeigte die Milchproduktion ein relativ konstantes Wachstum. Der

Anteil der importierten Milchvolumina am nationalen Konsum verringerte sich demzufolge in

den 70er Jahren kontinuierlich, um schließlich unter die 10%-Marke zu fallen. Von den

importierten Volumina nimmt das Milchpulver aus Voll- bzw. entrahmter Milch die

wichtigste Stellung ein. In den 80er Jahren setzte eine erhöhte Nachfrage der Bevölkerung

nach dem Lebensmittel Milch ein, der die nationale Produktion nicht gewachsen war. Durch

eine drastische Erhöhung der Importmenge wurde versucht, die nationale Produktion zu

38

komplettieren. Diese Entscheidung hatte jedoch dramatische Auswirkungen: Durch das

internationale Angebot und die niedrigen Preise für importiertes Milchpulver fiel der den

mexikanischen Produzenten pro Liter ausbezahlte Preis unter die realen Produktionskosten, so

dass viele Betriebe an den Rand der Rentabilität gerieten. Das importierte Milchpulver und

andere Milchprodukte wie Laktose, Molke und Fette, welche im Einkauf noch günstiger als

Milchpulver waren, wurden von der mexikanischen Industrie aufgekauft und zur Herstellung

von Milchersatzprodukten verwendet, welche mit nationalen, aus Frischmilch hergestellten

Milchprodukten konkurrierten (JOSÉ ZORRILLA et al. 1996). Ferner überschwemmten im

Ausland hergestellte Milchprodukte den mexikanischen Markt. So wurden ausländische

Milchmarken und -produkte im Gegensatz zu den nationalen Marken zu einem bis zu 50%

niedrigeren Preis, der teilweise unter den nationalen Produktionskosten liegt,

kommerzialisiert (VELAZCO, 2002). Ein weiterer Punkt, der die Entwicklung der

mexikanischen Milchwirtschaft hemmte, war der seit 1974 zum Schutze des Konsumenten

durch den Staat fixierte Preis für pasteurisierte Milch. Als Grund für die Festsetzung des

Preises nannte man die Steigerung des Milchkonsums und die Ermöglichung des Erwerbs

dieses Grundnahrungsmittels für Jeden trotz des permanent sinkenden Einkommens. So lag

1987 trotz der hohen Importe die täglich pro Person verfügbare Milchmenge bei 267 ml. Seit

1989 steigerte sich die Verfügbarkeit durch das Wachstum der Produktion und der

Importmenge auf ein seit 25 Jahren nicht mehr erreichtes Niveau. Pro Person waren täglich

über 371 ml Milch verfügbar, diese Menge ist aber immer noch weit von der täglich

empfohlenen Aufnahmemenge der Food and Agriculture Organization (FAO) von 500 ml

entfernt.

Der dem Erzeuger gezahlte Milchpreis wird durch eine Reihe von Gegebenheiten festgesetzt,

die der industrielle Milchkäufer bestimmt. Hierbei spielen vor allem Qualitätserfordernisse,

die mit der Saisonalität schwankenden benötigten Milchvolumina und der durch die seit 1991

durchgeführten offiziellen Milchpulverversteigerungen aus den Importen festgesetzte

Referenzwert eine bedeutende Rolle.

Durch die extremen jahreszeitlichen Schwankungen der mexikanischen Produktion beträgt

der Milchpreis in der Trockenzeit 3 Pesos/kg Milch (ca. 0,23 €) und in der Regensaison, in

der die größten Volumina produziert werden, nur 2,53 Pesos/kg (ca. 0,19 €) Milch.

Durch die Abschaffung des staatlich kontrollierten Milchpreises seit Ende 1996, die

Förderung der Technisierung der Milchviehbetriebe in den 90er Jahren, den Rückgang der

Inflation und der Zinshöhe und den Zuwachs bei den Arbeitsstellen wurde von 1990-1998 ein

durchschnittliches jährliches Wachstum der Produktion von 3,9% ausgelöst. Durch die

39

erstgenannte Maßnahme wurde das Ende der Regulation von Seiten des Staates eingeleitet

und der Beginn für einen neoliberalen Markt gesetzt. DEL VALLE (2002) bemerkt, dass

durch die verstärkte Technisierung der Betriebe eine Reduzierung der Produktionskosten und

eine Verbesserung der Milchqualität erreicht werden konnte, die in einer verbesserten

Wettbewerbsfähigkeit Mexikos resultiert. Mit dem Wachstum der landeseigenen Produktion

kam es zu einer stetigen Verringerung der Importmenge. So betrug der prozentuale Anteil der

Importe am nationalen Konsum 1990 noch 46% und 1998 nur noch 15,8%. Seit 1998 werden

die importierten Milchmengen überwiegend für die sozialen Programme des Staates und zur

industriellen Weiterverarbeitung verwendet. Obwohl die mexikanische Milchproduktion in

den letzten Jahren ein ununterbrochenes Wachstum registriert, ist das Land immer noch der

größte Milchpulverimporteur weltweit, da es für Mexiko unmöglich ist, die Selbstversorgung

dieses Grundnahrungsmittels zu erlangen. So erwirbt Mexiko 33% des auf dem Weltmarkt

kommerzialisierten Milchpulvers (FIRA, 1996). Die kommerzielle Balance auf dem Gebiet

des Milchsektors ist stark defizitär, und 1993 wurde ein absoluter Tiefpunkt mit einem Defizit

von 433,9 Millionen US$ erreicht (DGDG, 1999).

Unter den beschriebenen Bedingungen verbesserten sich die Perspektiven und die

Produktionsvoraussetzungen für die mexikanischen Milchproduzenten wieder erheblich.

Gleichzeitig konnte die Rentabilität gesteigert werden.

Da es sich bei Kuhmilch um ein Grundnahrungsmittel handelt, besitzt der Milchsektor

Mexikos unter sämtlichen landwirtschaftlichen Aktivitäten eine hohe Priorität.

Die Wichtigkeit des Milchsektors gemeinsam mit der Milch verarbeitenden Industrie zeigt

sich durch seine Schaffung von 1,5 Millionen Arbeitsplätzen und seinen Beitrag zum

nationalen Bruttosozialprodukt mit 1,2%. Die Finanzierungsgruppe Serfin führte 1995 eine

Studie durch und ermittelte einen ungefähren jährlichen Verkaufswert für Milchprodukte von

12.000 Millionen Pesos. Dies entspricht ungefähr einer Milliarde US$ (DEL VALLE et al.

1997).

Die Situation des mexikanischen Milchsektors war von Anfang an stark mit den Bewegungen

der Milchproduktion in der Welt verbunden. Die Weltproduktion wird vor allem von den am

weitesten entwickelten Ländern wie den USA, Kanada, Neuseeland, Australien und einigen

europäischen Ländern bestimmt. Diese produzieren Überschüsse, und ihre transnationalen

Unternehmen dirigieren und kontrollieren den Weltmarkt, der bis zu den 90er Jahren ein

stetiges Wachstum zeigte. 1990 wurde der bisherige Höhepunkt der Weltproduktion mit 441,3

Millionen Tonnen Milch erreicht. Danach kam es jedoch zu einem Produktionsrückgang, so

dass 1999 noch 387 Millionen Tonnen produziert wurden.

40

Der Weltkonsum an Milchpulver zeigt einen langsamen aber konstanten Rückgang zwischen

1990 und 1998 mit einer leichten Wachstumstendenz im Jahr 1999. Die momentan negative

Tendenz auf dem internationalen Milchmarkt wird in Zukunft Auswirkungen auf die

Verfügbarkeit und den Preis des Produktes haben. Als Konsequenz dieser verminderten

Produktion einerseits und der kontinuierlichen Nachfrage auf der anderen Seite wird ein hoher

Druck auf den Preis für entrahmtes Milchpulver ausgeübt. So sind die Preise für eine Tonne

entrahmtes Milchpulver von Dezember 1994 bis Dezember 1995 von 7.000 auf 15.823

mexikanische Pesos gestiegen und seitdem auf diesem Niveau geblieben. 1994 kam es zum

Inkrafttreten des freien Handelsvertrags für Nordamerika, der im Bezug auf den Milchsektor

zwischen Mexiko und den USA, zwei aneinander angrenzenden Ländern, die jedoch

grundverschieden in ihren strukturellen Institutionen, der technologischen Ausstattung und

der Produktionshöhe sind, ausgehandelt wurde. Die USA und Kanada sind Exportländer und

Pioniere technologischer Innovationen mit einer hohen internationalen Wettbewerbsfähigkeit,

während Mexiko der führende Weltimporteur von Milchprodukten ist (DEL VALLE 1996).

In dem Vertrag wurde beschlossen, für die Milch Steuererleichterungen festzusetzen, und für

das Milchpulver als wichtigstes Handelsgut sollen sämtliche Zölle innerhalb von 15 Jahren

eliminiert werden. Es wird befürchtet, dass durch diese Maßnahme die ausländischen

Produkte zu wenig wettbewerbsfähigen Preisen in den mexikanischen Handel drängen.

0

1.000.000

2.000.000

3.000.000

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1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004

Jahr

Milc

hmen

ge in

l

Abb. 1 Entwicklung der Milchproduktion in Mexiko zwischen 1980 und 2004

41

2.7 Betriebsformen in Mexiko

Die aktuelle Milchproduktion in Mexiko setzt sich laut DEL VALLE (2002) sehr heterogen

zusammen. Dies ist unter anderem die Folge der unterschiedlichen Bodenbeschaffenheit,

Klimaverhältnisse und der Infrastruktur der einzelnen Regionen. Die verschiedenen

Betriebsformen lassen sich aufgrund der technischen Ausstattung, der Herdengröße und dem

erzielten Ertrag unterscheiden. Die DIRECION GENERAL DE GANDERÍA (1999) teilt die

mexikanischen Betriebe in vier verschiedene Gruppen ein: Auf Milchproduktion spezialisierte

Betriebe, halbspezialisierte Betriebe, familiäre Hinterhofbetriebe und

Doppelnutzungssysteme.

2.7.1 Spezialisierte Betriebe Die spezialisierten Betriebe in Mexiko arbeiten hauptsächlich mit einseitig auf Milchleistung

gezüchteten Rassen, vorwiegend mit Holstein Friesian und in weit geringerem Grade mit

Brown Swiss und Jersey. Die durchschnittliche Tierzahl liegt bei 300-400 Tieren (DGDG

1999) bzw. 100-300 Tieren (DEL VALLE 1997). In diesen Betrieben werden mit

durchschnittlichen Leistungen von 5.000-6.500 Litern pro Kuh und Laktation bei einer

Laktationsdauer von 305 Tagen die größten Renditen erzielt (FIRA 1996).

Laut DGDG (1999) sind die spezialisierten Betriebe im hohen Maße technisiert, so dass

sowohl auf den Feldern als auch bei der Melkarbeit moderne Maschinen eingesetzt werden

und die Möglichkeit zur Kühlhaltung und zum Abtransport der Milch besteht. Die Tiere

werden überwiegend aufgestallt gehalten. Große Bemühungen zur genetischen Verbesserung

des Tierbestandes und für eine optimale tiermedizinische Versorgung werden durchgeführt.

Eine Berechnung der optimalen Fütterungsmenge wird für die einzelnen Tiere bzw.

Tiergruppen vorgenommen. Es wird Silage und Kraftfutterkonzentrat gefüttert. Die

produzierte Milch wird ausschließlich an die großen Molkereien wie Lala oder Sello Rojo

abgegeben, Rohmilchabgabe an Privatpersonen findet keine statt (FIRA 1996). 1998 wurden

in den spezialisierten Betrieben 4.196 Millionen Liter Milch produziert, was einen Anteil von

50,5% der gesamten Produktion entspricht. Diese Menge wurde von 17% der

Milchviehpopulation ganz Mexikos produziert (DGDG 1999). Die durchschnittliche jährliche

Milchleistung pro Tier liegt bei 5.667 Litern Milch. Die spezialisierten Betriebssysteme sind

sehr empfindlich für Variationen des Wechselkurses und Veränderungen der

Importkonditionen für die benötigte technische Ausstattung und für den Zukauf von

Zuchttieren zum Zweck der genetischen Verbesserung (DEL VALLE 1997). Man findet diese

Betriebsform zumeist in den Hochflächen sowie den trockenen oder halbtrockenen Zonen des

42

Nordens wie in Durango, Coahuila, Guanajuato und Jalisco, wo sich auch die großen

milchverarbeitenden Unternehmen befinden (DGDG 1999).

2.7.2 Halbspezialisierte Betriebe Die halbspezialisierte Betriebsform charakterisiert sich mit einer Herdengröße von etwa 180-

200 Tieren, deren genetisches Potential jedoch nicht so hoch ist wie bei den Tieren der

spezialisierten Betriebe (DGDG 1999). Es dominieren auch hier die Milchviehrassen Holstein

Friesian und Brown Swiss, es kommen jedoch auch Criollos und Zebus vor (DEL VALLE

1997). Wegen des geringeren Grades der genetischen Reinheit werden nur Leistungen von

18-20 Litern täglich bei einer Laktationsdauer von 280-305 Tagen erreicht. Die Tiere werden

häufig halbaufgestallt auf fest eingezäunten Flächen gehalten, die teilüberdacht sein können.

Den in den halbspezialisierten Betrieben gehaltenen Tieren stehen pro Großvieheinheit etwa

10-50 Hektar Land zur Verfügung. Die Installationen sind an die Nutzung des Milchviehs

adaptiert. Es wird von Hand, mit Einzelmelkzeugen oder Melkanlagen mit wenigen

Melkzeugen gemolken. Oft mangelt es an Kühl- und Aufbewahrungsmöglichkeiten für die

Milch, wodurch nur ein mittleres technologisches Niveau in Infrastruktur und Ausstattung

erreicht wird. Sind keine Kühlmöglichkeiten vorhanden, wird die Milch nach der Melkzeit

behelfsmäßig in Kannen im Wasserbad gekühlt und direkt von der Molkerei abgeholt. Einige

Erzeuger transportieren ihre Milch selbst zum nächstgelegenen Sammelkühltank oder zu

Zwischenhändlern.

Die selbst erzeugten Agrarprodukte sowie täglicher Weidegang stellen die Basis der

Milchviehfütterung dar. In geringerem Maße, meist nur zur Melkzeit, wird Kraftfutter

zugefüttert (DEL VALLE 2002).

Die meisten halbspezialisierten Betriebe führen eine Kontrolle der Produktion und

Reproduktion durch. Die künstliche Besamung ist weit verbreitet. Jedoch erhält meist nur ein

kleiner Prozentteil der Tierpopulation Sperma eines Bullen mit hoher genetischer Qualität,

weswegen die genetische Entwicklung nur langsam vorangeht. Auf der anderen Seite kommt

es durch das kurze reproduktive Leben der Tiere häufig zu einem Verlust von genetischem

Potential.

1998 wurde in den halbspezialisierten Betrieben 15% der Milchviehpopulation Mexikos

gehalten, welche 1.717 Millionen Liter Milch produzierte. Dies entspricht 20,63% der

nationalen Produktion (DGDG 1999). Pro Kuh wurden durchschnittlich 2.786 Liter Milch pro

Jahr erwirtschaftet. Diese Betriebsform findet sich vor allem in Baja California, Colima,

Chihuahua (DGDG 1999) und häufig auch in Jalisco (DEL VALLE 1997).

43

2.7.3 Familiäre Hinterhofbetriebe

Die Betriebsform der familiären Hinterhofbetriebe stellt das traditionelle Haltungssystem

Mexikos dar (DGDG 1999). Die Tiere werden auf kleinen Flächen, meist in Hinterhofställen,

gehalten (LOSADA et al. 1998). Auch hier überwiegen die Rassen Holstein Friesian und

Brown Swiss (DVDG 1999), jeweils mit niedriger genetischer Qualität (DEL VALLE 1997).

Im Durchschnitt findet man 2-10 Tiere mit einer täglichen Leistung von 6-12 Litern bei einer

Laktationsdauer von 210-260 Tagen (LOSADA et al.1998; DGDG 1999). Das technologische

Niveau ist niedrig. Es dominiert das Handmelken, nur selten stehen einfache Melkzeuge zur

Verfügung. Nach LOSADA et al. (1998) wird in 66% der Betriebe die Arbeitskraft nur einer

Familie eingesetzt. Nur 20% der Familien leben allein von der Milchproduktion. Die übrigen

Familien supplementieren diesen Verdienst mit anderen Einkommensquellen. DDie Tierhalter

führen keine vorbeugenden tiermedizinischen Maßnahmen oder Bestrebungen zur

genetischen Verbesserung durch. Es überwiegt der Natursprung, nur vereinzelt wird die

künstliche Besamung angewendet. Die Futtergrundlage stellt Feldfutter, und falls vorhanden,

der Weidegang dar. Kraftfutter wird während des Melkvorgangs ohne Rationsberechnung

zugefüttert. In diesem System wurden 1998 etwa 780 Millionen Liter Milch von 8% der

Milchviehpopulation produziert. Diese Menge entspricht 9,4% der nationalen Produktion

(DGDG 1999). Jede Kuh gab durchschnittlich 2.230 Liter Milch im Jahr. DEL VALLE

(2002) gibt die durchschnittliche erzielte Jahresleistung der Tiere sogar nur 630 Litern an.

Die meiste Milch wird selbst konsumiert oder als Rohmilch an Zwischenhändler und die

Nachbarschaft verkauft. Dieses System findet sich vor allem in Jaslico, gefolgt von México,

Michoacán, Hidalgo und anderen Staaten.

Abb. 2 Prozentuale Verteilung der einzelnen Betriebsformen in Mexiko (DGDG 1999)

Doppelnutzung 60%

Familienbetriebe 8%

Spezialisiert 17%

Halbspezialisiert 15%

44

2.7.4 Doppelnutzungsbetriebe

Die Betriebsform der Doppelnutzung für Milch- und Fleischproduktion kommt vor allem in

den tropischen Regionen des Landes vor. Es werden meist 30-40 Tiere gehalten, die bei einer

durchschnittlichen Laktationsdauer von 120-180 Tagen täglich 3-9 Liter Milch produzieren

(DGDG 1999). DEL VALLE (2002) gibt die durchschnittliche jährliche Milchleistung der

Doppelnutzungsrinder mit etwa 600 Litern an.

Es werden überwiegend Zebus und Zebu-Kreuzungen und nur in geringem Maße Brown

Swiss, Holstein Friesian und Simmentaler extensiv auf der Weide gehalten (DOMÍNGUEZ

1996). Falls eine Zufütterung stattfindet, werden Nebenprodukte der Landwirtschaft

verwendet. Der große Vorteil dieser Haltungsform ist in seiner Flexibilität zu sehen. So kann

entsprechend der aktuellen Nachfrage des Marktes entweder verstärkt Milch oder Fleisch

produziert werden.

Es wird fast ausschließlich von Hand gemolken. Die Milch stellt die erste Einkommensquelle

für die Erhaltung und Weiterführung des Betriebes dar, bis die Tiere für die

Fleischgewinnung verkauft werden. Mittlerweile gibt es aber schon Betriebe, die den

kommerziellen Charakter spezialisierter Milchproduktion besitzen. Die Milch wird meist

direkt als Rohmilch an Konsumenten, an Zwischenhändler zur Produktion von Käse oder vor

allem in der Hauptsaison zu Billigpreisen an die Industrie verkauft. Generell ist das

Management stark verbesserungswürdig. Es werden keine tiermedizinischen Vorsorgungen

oder genetischen Verbesserungen angestrebt. Die Probleme dieser Systeme liegen vor allem

in der Tiergesundheit, der Milchkonservierung und dem Produkttransport (FIRA 1996). 1998

wurden in diesem System 60% der nationalen Milchviehpopulation gehalten, die 1.622

Millionen Liter Milch produzierten. Diese Menge entspricht 19,5% der nationalen Produktion

(DGDG 1999). Dies entspricht einer durchschnittlichen jährlichen Milchleistung pro Kuh von

662 Litern.

1991 wurden in ganz Mexiko 24.611.862 Rinder gezählt. 11.006.737 dieser Tiere sind über

dreijährige Kühe (INEGI 1991). Im Jahr 1997 wurden in den Betriebsformen Spezialisiert,

Halbspezialisiert und in den Familienbetrieben 3.480.199 Tiere gehalten, von denen

1.879.352 Kühe im reproduktiven Alter waren. Im System der Doppelnutzung befinden sich

6.090.752 Rinder mit 2.369.912 Kühen. Die übrigen Tiere werden zur reinen

Fleischproduktion gehalten (DGDG 1999). Im Staat Jalisco wurden 1999 2.263.698 Rinder

gehalten, mit denen 1.563.605 Liter Milch produziert wurden (INEGI 2000).

45

Tab. 1 Tierzahlen in den einzelnen Produktionsformen Mexikos und ihr Anteil an der

nationalen Produktion sowie Vergleichswerte für den Staat Jalisco (Quelle: DGDG 1999)

Betriebsform Kuhzahl

(Mexiko)

Anteil an

nationaler Produktion

Vergleichswert

für Jalisco

Spezialisiert 692.491 50,5% 25%

Halbspezialisiert 591.555 20,5% 37%

Familienbetriebe 316.844 9,5% 27%

Doppelnutzung 2.369.913 19,5% 11%

Gesamtanzahl 3.970.803 100% 100%

Der Vergleich der pro Betriebsform erwirtschafteten prozentualen Milchmenge der nationalen

Produktion mit dem Staat Jalisco zeigt insbesondere, dass die Familienbetriebe in Jalisco

einen weitaus größeren Stellenwert besitzen, als dies auf nationaler Ebene der Fall ist.

2.8 Stand Jaliscos im mexikanischen Milchproduktionssystem Der Staat Jalisco liegt im zentralen Westen Mexikos und wird von den Staaten Zacatecas,

Aguascalientes, San Luis Potosi, Guanajuato, Colima und Michoacan eingesäumt.

Guadalajara und seine Umgebung liegen im Zentrum des Staates auf einer Höhe von 1550 m

über dem Meeresspiegel, wodurch diese Zone mit ihrem moderaten Klima der gemäßigten

Zone zugeordnet wird. Laut DEL VALLE (2002) wird in der gesamten gemäßigten Zone

Mexikos insgesamt 47% der nationalen Milchproduktion produziert.

Der Staat Jalisco steuert mit seinem Bruttosozialprodukt von 24 Milliarden US$ im Jahre

1994 hinter dem Districto Federal und dem Staat México die drittgrößte Summe zum

nationalen Bruttosozialprodukt bei. Teilt man das nationale Bruttosozialprodukt in seine

einzelnen Sektoren, so belegt der Sektor Agrikultur, Viehzucht und Forst einen Anteil von

10%. Für den Einzelstaat Jalisco liegt dieser Sektor mit 11% hinter den Sektoren Handel und

Tourismus (29%) sowie Manufakturen (29%) an dritter Stelle (JOSÉ ZORRILLA et al. 1996).

Durch seine hohe Aktivität auf dem Sektor der Viehzucht liegt Jalisco auf nationaler Ebene

auf dem ersten Platz bei der Produktion von Milch, Eiern und Schweinefleisch, sowie auf dem

zweiten Platz bei der Produktion von Rinder- und Hühnerfleisch (JOSÉ ZORRILLA et al.

1996). Durch seine jährlich ansteigende Milchproduktion erreichte Jalisco von 1985 bis 1995

die nationale Spitze und ist seither der Staat mit der größten Milchproduktion in Mexiko. So

produzierte Jalisco im Jahr 2003 1.712.562 Millionen Tonnen Milch, was 17,4% der

46

nationalen Produktion entsprach, welche im Jahr 2003 insgesamt 9.842.422 Millionen Tonnen

betrug (SAGAR 2004).

Ein Grund für diese führende Stellung Jaliscos mag die traditionelle Milchviehhaltung des

Staates sein. So lebt in Jalisco eine große Anzahl milchviehhaltender Familien, die diese

Aktivität von Generation zu Generation weitergeben. Durch diese starke kulturelle

Verankerung kam es bereits in den 40er Jahren des letzten Jahrhunderts zu einer

Spezialisierung der Landwirtschaft dieses Staates auf die Milchproduktion (DEL VALLE et

al. 1997).

So beträgt der Milchkuhbestand Jaliscos mit 828.000 Tieren etwa 20% des nationalen

Viehbestandes (JOSÉ ZORRILLA et al. 1996).

Wie in der gesamten mexikanischen Milchindustrie zeigt sich jedoch auch im Staat Jalisco

eine große Heterogenität der milchproduzierenden Einheiten. So wirtschaften 10% der

Betriebe Jaliscos mit großen Herden von 100-500 Tieren. Diese hochspezialisierten

Produktionssysteme befinden sich überwiegend in den Regionen Lagos de Moreno,

Jalostotitlan und Tepatitlan (JOSÉ ZORRILLA et al. 1996). Weitere 20% halten Herden

zwischen 25-100 Tieren, während die übrigen 70% Familienbetriebe sind, die meist in

Hinterhöfen 6-20 Tiere melken (DEL VALLE et al. 1997). Diese Kleinbetriebe befinden sich

überwiegend in der Region Los Altos de Jalisco, der Region mit der größten Milchproduktion

Jaliscos, während sich an der tropischen Westküste des Staates überwiegend

Doppelnutzungsbetriebe befinden, die Milch und Fleisch gleichermaßen produzieren.

Die Kleinbetriebe führen nur 25% ihrer Produktion der industriellen Verarbeitung zu,

während die mittleren und großen Betriebe 100% des gewonnenen Produktes an die

Milchindustrie liefern.

Diese Kleinbetriebe zeigen eine flexible Spezialisierung. Es überwiegen die Rassen Holstein

Friesian, Criollo und Kreuzungen. Die durchschnittliche Leistung pro Kuh liegt bei 10 (8-24)

Litern pro Tag (DEL VALLE et al. 1997). Die Betriebe kommen mit einer minimalen

Infrastruktur zurecht. So wird meist von Hand gemolken, oder es kommen überwiegend

veraltete, dagegen nur selten moderne Melksysteme zum Einsatz. Oftmals werden die Tiere

ganztags auf Weiden gehalten und nur für den Melkvorgang in Ausläufe getrieben. Folglich

wird die Grundfutterversorgung durch den Weidegang sichergestellt, der durch Rationen von

Maissilage und Kraftfutter aufgebessert wird (DEL VALLE et al. 1997). Die genetische

Verbesserung erfolgt überwiegend durch die Selektion der Bullen für den Natursprung und

nur in etwa 15% durch die künstliche Besamung.

47

Generell hat das Milchgeld in Jalisco an Wichtigkeit für das familiäre Einkommen eingebüßt.

Die großen Betriebe produzieren vielerorts Luzerne, Hafer, Mais und Mastfutter für Schweine

und Hühner, um ein Zusatzeinkommen zu haben. Die kleinen Produzenten suchen eine zweite

Einnahmequelle außerhalb ihres Betriebs.

In Gegensatz zu vielen anderen Staaten Mexikos, in denen die milchverarbeitenden Industrien

eine Monopolstellung innehaben, existieren in Jalisco mehrere hundert verschiedene

Unternehmen, welche die Milch aufkaufen. Durch diese Marktlage erhalten die Produzenten

eine größere Beweglichkeit bei der Suche nach optimalen Konditionen für den Verkauf ihres

Produktes (DEL VALLE et al. 1997). Von den die Milch aufkaufenden Unternehmen

verlangen 67% keinerlei Qualitätsprüfung der Anlieferungsmilch. Die restlichen 33% fordern

eine Hygieneprüfung. In 65% der Fälle bestehen für die Milchabnahme nur mündliche

Vereinbarungen zwischen Abnehmer und Produzent.

Den Produzenten wird hierbei die Abnahme ihres Produktes zugesichert. Ferner fördern die

Unternehmen den Erwerb von Kühltanks durch Kommissionen für die individuellen

Produzenten und Produktionsgesellschaften und bieten technische Beratung sowie Bürgung

bei Krediten an.

Trotz des Wettbewerbs der vielen Unternehmen üben diese die Kontrolle über die Milchpreise

und die Qualität des Produktes aus. So fordern immer mehr Unternehmen die Lieferung von

gekühlter Milch, wodurch es 1990 in Jalisco zur Einführung des für das Land Mexiko

einmaligen Programms für den Erwerb von Kühltanks kam. Dieses Programm zählt zu einer

der erfolgreichsten Aktionen auf dem Milchsektor. Die Umsetzung erfolgte durch die

gemeinsame Beteiligung der privaten Industrie, der Regierung und der Produzenten. Der

Erfolg des Programms zeigt sich in der ständigen Zunahme der Anzahl der Kühltanks von 20

in Jahr 1992 auf 270 in Jahr 1995 (JOSE ZORRILLA et al. 1996).

Jedoch wurden durch die Einführung der Kühltanks die Kosten für die Einsammlung und

Kühlung der Milch von den Unternehmen auf die Produzenten übertragen. Und obwohl die

Produzenten nun bessere Preise für ihr Produkt erhalten, argumentieren viele, dass die

Kosten, die durch die Auflagen der Unternehmen ausgelöst wurden, über dem Mehrverdienst

durch die Lieferung einer qualitativ hochwertigeren Milch liegen. Obwohl dies in einigen

Fällen zutrifft, muss gleichzeitig darauf hingewiesen werden, dass die Unternehmen an der

Abnahme von ungekühlter Milch kein Interesse mehr zeigen, so dass außerhalb dieser neuen

Organisation kaum noch Möglichkeiten für den Produzenten bestehen, sein Produkt zu

verkaufen.

48

In Jalisco werden jährlich 1.451.560 Liter Milch produziert, von denen 54% für den Konsum

innerhalb des Staates und 46% für den Export in andere Bundesländer bestimmt sind. Von der

im Staat konsumierten Milch werden 21% als Rohmilch konsumiert, 23% als pasteurisierte

und ultrahochpasteurisierte Milch verwertet, 22% zu Frischkäse und -derivaten verarbeitet,

während die restlichen 24% für andere Produkte verwendet werden (JOSÉ ZORRILLA et al.

1996).

Diese Verbrauchsanalyse zeigt, dass Trinkmilch an sich an ökonomischer Wichtigkeit

gegenüber anderen Verwendungszwecken eingebüßt hat. Diese Tatsache muss kritisch

gesehen werden, da viele dieser Produkte häufig aus billig importiertem Milchpulver

hergestellt werden. In einer generalisierten Bilanz kann jedoch behauptet werden, dass zurzeit

in Jalisco günstige Konditionen vorliegen, um die Milchproduktion weiterhin auf einem

hohen Niveau zu halten (JOSÉ ZORRILLA et al. 1996).

0

2.000.000

4.000.000

6.000.000

8.000.000

10.000.000

1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

Jahr

Milc

hmen

ge in

l

JaliscoMexiko

Abb. 3 Jährliche Milchproduktion Jaliscos und Mexikos im Vergleich (Quelle: SAGAR 2004)

49

3 Tiere, Material und Methoden

3.1 Milcherzeugerbetriebe und Tierbestände Im Zeitraum von Oktober 2002 bis Juni 2003 wurden 33 milchproduzierende Betriebe aus

dem näheren Umfeld von Guadalajara, Jalisco, in die Studie aufgenommen.

Um eine möglichst große räumliche Streuung der Milcherzeugerbetriebe zu erreichen, war

neben einer Beprobung sämtlicher in Jalisco vorkommender unterschiedlicher

Betriebsstrukturen die geographische Lage Kriterium für die Aufnahme in die Studie.

Die Anzahl der ausgewählten Betriebe, nach Betriebsformen geordnet, lässt sich der

folgenden Tabelle entnehmen:

Tab. 2 Aufteilung der besuchten 33 Betriebe nach Betriebsformen

Betriebsform Anzahl Betriebe Prozentualer Anteil

Spezialisierte Betriebe 5 15,2%

Halbspezialisierte Betriebe 17 51,5%

Familiäre Hinterhofbetriebe 11 33,3%

Die räumliche Verteilung der Betriebe kann aus der Abb. 19 auf Seite XV des Anhangs

entnommen werden. Die Betriebe lagen zwischen 0,5 und ca. 120 km auseinander.

Die durchschnittliche Herdengröße der beprobten Betriebe lag bei 66 Tieren. Die folgende

Tabelle zeigt eine Aufteilung der Betriebe nach Anzahl der gehaltenen Tiere:

Tab. 3 Aufteilung der 33 Betriebe nach Anzahl der Milchkühe

Anzahl Kühe Anzahl Betriebe Prozentualer Anteil

<25 11 33,4%

25-75 7 21,2%

75-100 8 24,2%

>100 7 21,2%

50

Überwiegend setzten sich die Bestände aus Tieren der Rasse Holstein Friesian zusammen.

Nur vereinzelt wurden daneben Kühe der Rasse Brown Swiss, Criollo oder Jersey gehalten.

Die Kühe befanden sich in unterschiedlichen Laktationsstadien. Die durchschnittliche

Milchleistung der Betriebe lag bei 19,75 Litern pro Kuh und Tag. Die Angaben zur

Milchleistung wurden durch die Betriebsleiter im Rahmen einer Befragung gemacht, da in

Mexiko die Milchleistungsprüfung mit Erfassung der Milchmenge nicht üblich ist. Folgende

Tabelle zeigt die Aufteilung der Betriebe nach Milchleistung in Litern/Tag:

Tab. 4 Aufteilung der 33 Betriebe nach der Milchproduktion in Litern pro Kuh und Tag

Tägliche Milchleistung pro Kuh in Litern Anzahl Betriebe Prozentualer Anteil

<15 4 12,1%

15-20 10 30,3%

21-25 17 51,5%

26-30 2 6,1%

Die größeren Betriebe sind modern ausgestattet und Melkmaschinen, während in den

Kleinbetrieben überwiegend von Hand gemolken wird.

In der folgenden Tabelle wurden die Betriebe den verschiedenen Melksystemen zugeordnet:

Tab. 5 Aufteilung der 33 Betriebe nach Melksystemen

Melksystem Anzahl Betriebe Prozentualer Anteil

Handmelken 7 21,2%

Eimermelkanlage stationär 5 15,2%

Eimermelkanlage mobil 3 9,1%

Rohrmelkanlage 18 54,5%

16 Betriebe (48,5%) geben Rohmilch an Privatpersonen des näheren Umkreises ab. 17

Betriebe (51,5%) liefern die Milch ausschließlich an Molkereien oder an Zwischenhändler,

wo sie vor der weiteren Verarbeitung zum größten Teil einer Pasteurisierung unterzogen wird.

51

Da nicht alle mexikanischen Molkereien die Anlieferungsmilch auf die Zellzahl hin

untersuchen und deshalb nicht zu allen Betrieben genaue Daten zur Verfügung standen,

können nur die Durchschnittszellzahlen der Tankmilch von 15 der 33 Betriebe angegeben

werden. Die Tankmilchzellzahlen bewegten sich zwischen 234.000 und 1.500.000 Zellen/ml

mit einem geometrischen Mittel von 623.000 Zellen/ml Milch.

Die zu beprobenden Kühe wurden vor Ort nach dem Zufallsprinzip ausgewählt. Teilweise

wurden auf Wunsch des Betriebsleiters verdächtige Kühe oder laut Vorbericht bereits

mehrfach an Mastitis erkrankte Tiere zusätzlich beprobt.

Es wurden möglichst viele Proben pro Betrieb genommen. In Betrieben mit weniger als 35

Milchkühen wurden alle Tiere in die Untersuchung aufgenommen. Ansonsten wurden

Teilbestandsuntersuchungen von jeweils 25-35 Tieren durchgeführt.

3.2 Datenerhebung auf den Betrieben mit Beurteilung der Melk- und

Stallhygiene sowie weiterer betriebswirtschaftlicher Faktoren Zu Beginn eines Besuches wurde der Betrieb besichtigt. Hierbei wurden die Ausläufe und

Weideflächen, der Melkplatz mit den Melkzeugen und, falls vorhanden, die Milchkammer mit

dem zur Kühlung bestimmten Tank in Augenschein genommen und hinsichtlich ihrer

hygienischen Verhältnisse bewertet. Während des Melkens wurde eine Beurteilung der

körperlichen Verfassung der Tiere sowie des Melkregimes einschließlich der Euterreinigung,

des Vormelkens, der Einhaltung einer Melkreihenfolge, der Durchführung des Zitzendippens

und der allgemeinen Melkhygiene vorgenommen. Nach der Probenentnahme wurde der

Betriebsleiter zu allen milchhygienisch relevanten Daten, zur Fütterung und

Rationsberechung, dem Trockenstellen und zu weiteren gesundheitlichen Problemen der Tiere

befragt. Der Fragebogen sollte einen Einblick in die verschiedenen Betriebsformen geben und

Faktoren und Managementdetails aufdecken, die das Auftreten von Mastitiden begünstigen.

Soweit vorhanden erfolgte Einsicht in die Milchgeldabrechnungen.

3.3 Milchprobenentnahme und Transport Die Probenentnahme erfolgte gemäß den Leitlinien zur Entnahme von Milchproben unter

antiseptischen Bedingungen der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (2000). Die

Zitzen wurden von den Melkern wie zum normalen Melkvorgang gereinigt und das

Vorgemelk ermolken. Anschließend wurde ein Milchstrahl verworfen und je Zitze 2-3

Milchstrahlen zur Beurteilung der Sekretbeschaffenheit und zur darauf folgenden

Durchführung des CMT in eine Testschale gemolken. Die Zitzenkuppen wurden anschließend

52

gründlich mit einem separaten alkoholgetränkten Zellstofftupfer gereinigt und desinfiziert.

Dann wurden etwa 10ml Milch pro Viertel in sterile Plastikröhrchen gemolken, welche sofort

verschlossen und gekennzeichnet wurden. Die Röhrchen wurden für den Transport in

geeignete Behältnisse verbracht und umgehend bei 4-5°C gekühlt.

3.4 California-Mastitis-Test (CMT) Der CMT wurde nach SCHALM und NOORLANDER (1957) durchgeführt. In die vier

Schalen einer Prüfplatte wurden aus jedem Euterviertel 2-3 Milchstrahlen gemolken und unter

langsam kreisenden Bewegungen mit der gleichen Menge des Standard-Schalm-Reagenz

vermischt. Gleichzeitig wurde die Milch auf visuelle Abnormalitäten wie abnormale Farbe

oder Flocken überprüft.

Die Beurteilung erfolgte in Anlehnung an ROSENBERGER (1990):

0 Negativ: Probe bleibt flüssig und zeigt keinerlei Anzeichen von Schlierenbildung oder

Konsistenzveränderung (< 200.000 Zellen/ml)

1 Leicht positiv: Beim Kippen der Testschale von vorne nach hinten tritt eine leichte

Schlierenbildung auf, es zeigt sich jedoch keine Tendenz zur Gelbildung (200.000-

800.000 Zellen/ml)

2 Deutlich positiv: Mischung verdickt sich augenblicklich, geringgradige Gelbildung,

bei kreisenden Bewegungen der Testschale strebt die Mischung zur Mitte, bei

Beendigung der Bewegung verteilt sich die Mischung wieder (800.000-1.500.000

Zellen/ml)

3 Stark positiv: Gelformung mit konvexer Oberfläche, keine Verteilung nach

Beendigung der Bewegung (> 1.500.000 Zellen/ml)

Für die Auswertung der Daten wurde in Anlehnung an die Mastitis-Definition der DVG

(2002) bereits ein einfach positives CMT-Ergebnis als eine Sekretionsstörung bzw. bei

gleichzeitigem Nachweis eines Mastitiserregers als subklinische Mastitis bewertet.

3.5 Euterpalpation Nach dem vollständigen Ausmelken der Kühe wurde jedes Euter auf Anzeichen einer

klinischen Mastitis hin untersucht. Hierbei erfolgte eine Palpation der vier Drüsenkomplexe

nach ROSENBERGER (1990). Hierbei wurde auf die Körnung des Drüsenparenchyms,

53

Knotenbildung, diffuse Verhärtungen und Schwellungen sowie Schmerzhaftigkeit geachtet.

Die Dokumentation des Euterpalpationsbefundes erfolgte nach folgendem nach

ROSENBERGER (1990) modifizierten Schema:

0 Eutergewebe insgesamt feinkörnig und weich

1 Grobkörniges bzw. -knotiges Drüsengewebe

2 Prall-derbes Eutergewebe

3 Einzelne oder mehrere Knoten

4 Eutergewebe diffus verhärtet oder akut geschwollen (vermehrt warm, schmerzhaft)

3.6 Zytobakteriologische Untersuchung der Milchproben

3.6.1 Anzüchtungsmedien Die Anzüchtung und weitere Differenzierung der Erreger fand im Labor des Departamento de

Salud Publica der Universidad de Guadalajara statt. Der Ausstrich der Milchproben erfolgte

nach spätestens 12h auf Schafblutagarplatten, zu deren Herstellung Blutagar-Basis (Merck,

Darmstadt, Deutschland) verwendet wurde (s. Anhang).

Zur besseren Differenzierbarkeit von Streptokokken wurde dem Medium 0,01% Äskulin

zugesetzt. Das Glycosid Äskulin zeigt im UV-Licht Fluoreszenz. Durch Abbau des Äskulins

in Glucose und Äskuletin geht die Fluoreszenz in der Umgebung einer Kolonie verloren.

Somit lassen sich Äskulin abbauende von Äskulin nicht verwertenden Stämmen

unterscheiden. Das Medium wurde nach den Angaben des Herstellers angefertigt, 15min bei

120˚C autoklaviert und auf ca. 50˚C abgekühlt. Nach Zugabe von 5% aseptisch

entnommenem, defibriniertem Schafblut erfolgte das Gießen des Flüssigagars in sterile

Petrischalen. Vor dem Ausstreichen auf die Nährböden wurden die Proben auf

Zimmertemperatur erwärmt und sorgfältig durchmischt. Mit einem sterilen Glasstab wurde

anschließend pro Probe etwa 0,01 ml auf ein Viertel einer Blutagarplatte ausgestrichen. Die

Platten wurden bei 37˚C unter aeroben Bedingungen inkubiert und jeweils nach 24 und 48h

abgelesen.

Zur Differenzierung der Enterobactericae wurde der McConkey-Agar (Oxoid GmbH, Wesel,

Deutschland) eingesetzt (s. Anhang). Der Nährboden wurde nach Angaben des Herstellers

angefertigt, 15min bei 120˚C autoklaviert und auf 50˚C abgekühlt. Danach erfolgte das

Gießen des Flüssigagars in sterile Petrischalen.

54

Zur Identifizierung von Escherichia coli wurde das SIM (Schwefel-Reduktion, Indol-

Produktion, Motilität)-Medium von Merck (Darmstadt, Deutschland) eingesetzt (s. Anhang).

Das Medium wurde nach Herstellerangaben angefertigt und jeweils 4 ml in verschließbare

Reagenzgläser gefüllt. Diese wurden für 20min bei 121˚C autoklaviert.

Zum Nachweis von Hefen in Proben mit über einer Millionen Zellen/ml wurden diese auf

Sabouraud-2%-Glucose-Agar (Merck, Darmstadt, Deutschland) als Selektivnährboden

ausgestrichen (s. Anhang).

Das Medium wurde nach den Angaben des Herstellers angefertigt, 15min bei 120˚C

autoklaviert und auf 50˚C abgekühlt. Danach erfolgte das Gießen des Flüssigagars in sterile

Petrischalen. Die Inkubation erfolgte für 48h bei 20˚C.

Für die Kultivierung der Bakterien in flüssigem Medium, wie dies für die

Pulsfeldgelelektrophorese erforderlich war, kam Todd-Hewitt-Bouillon (THB; Oxoid GmbH,

Wesel, Deutschland) zum Einsatz (s. Anhang).

Die Bouillon wurde nach Angaben des Herstellers angefertigt, mit 0,2% Agar (Merck,

Darmstadt, Deutschland) versetzt, zu je 40 ml in Reagenzgläser abgefüllt und für 1h bei 95˚C

im Dampftopf erhitzt. Die Bebrütung erfolgte für 18-24h bei 37˚C.

3.6.2 Subkultivierung der Bakterienkulturen Die Bakterienkulturen wurden nach Anzüchtung bei 4˚C aufbewahrt und innerhalb eines

Zeitraums von zwei Wochen in Rinderserum mit 6% Glucose überführt und anschließend bei

-20˚C bis zur weiteren Untersuchung aufbewahrt. Die Wiederanzüchtung der Isolate erfolgte

nach Auftauen auf Raumtemperatur durch Ausstreichen der Suspensionen auf Schafblut-

Äskulin-Platten nach 3.6.1 und Bebrütung für 24h bei 37˚C.

3.6.3 Identifizierung der Bakterienkulturen Die nach 3.6.1 ausgestrichenen und bebrüteten Proben wurden nach 24 und 48h auf

bakterielles Wachstum überprüft. Die Koloniemorphologie, hämolytische Charakteristika, das

Gramfärbeverhalten und das Verhalten beim Katalase-Test wurden überprüft.

Es wurden drei Kategorien für die Anzahl der gewachsenen Kolonien verwendet:

1= < 6 gleichartige Kolonien (geringgradiges Wachstum)

2= 6-15 gleichartige Kolonien (mittelgradiges Wachstum)

3= > 15 gleichartige Kolonien (hochgradiges Wachstum)

55

Als S. aureus wurden solche Kulturen angesprochen, die 1-3 mm große, glatte, unregelmäßige

cremefarbene bis goldgelbe Kolonien auf Blutagar bildeten und von typischen

Hämolysezonen umgeben wurden. Das α-Hämolysin produziert eine klare Zone vollständiger

Hämolyse, während das β-Hämolysin eine deutlich abgegrenzte Zone einer unvollständigen

Hämolyse verursacht. Selten kann auch eine abgegrenzte schmale Zone einer vollständigen

Hämolyse auftreten, die durch das δ-Hämolysin ausgelöst wird.

Die Beurteilung der Bakterienmorphologie erfolgte nach Gram-Färbung im Lichtmikroskop

bei 1000facher Vergrößerung. Staphylokokken sind grampositive Bakterien mit einem

Durchmesser von ca. 1 µm. Sie sind kugelförmig und meist in Form von traubenartigen

Haufen unregelmäßig angeordnet. Zur Abgrenzung der Katalase-positiven Staphylokokken

von den Katalase-negativen Streptokokken kam der Katalase-Test nach BRÜCKLER und

SCHWARZ (1994) zur Anwendung. Bei diesem Test wurden einige Kolonien der zu

prüfenden Kultur mit einer sterilen Öse auf einem Objektträger mit einer 3%-igen H2O2-

Lösung verrieben. Eine positive Reaktion zeigte sich in einer deutlichen Bläschenbildung. Zur

Differenzierung zwischen S. aureus und der Gruppe der KNS wurde der Röhrchen-

Koagulase-Test nach KLOOS und LAMBE (1991) durchgeführt. Zu 300µl mit Citrat

ungerinnbar gemachten Kaninchenplasmas, gewonnen aus sterilem Citratblut (1 Vol. 4%

Natriumzitrat zu 9 Vol. Blut) in einer Verdünnung von 1:5 mit einer 0,14 mol/l

Natriumchlorid-Lösung, wurden je drei Kolonien der zu untersuchenden Bakterienkulturen

gegeben. Die Beurteilung erfolgte nach einer Bebrütung von 24h bei 37˚C.

Ein Isolat wurde als S. aureus angesprochen, wenn ein vollständiges oder überwiegend

zusammenhängendes Koagulum zu erkennen war. Blieb der Inhalt flüssig, wurden die

Kolonien als Koagulase-negative Staphylokokken (KNS) angesprochen.

Als Streptokokken wurden zarte, durchscheinende Kolonien mit bis zu 1 mm Größe

angesprochen, die von keiner (γ), einer unvollständigen vergrünenden (α) oder einer

vollständigen Hämolyse (β) umgeben sind. Nach Gramfärbung zeigen sich im

Lichtmikroskop grampositive Kokken, die einen Durchmesser unter 2 µm besitzen und in

Paaren oder unterschiedlich langen Ketten angeordnet sind. Der oben beschriebene Katalase-

Test ist bei Streptokokken negativ. Unter der UV-Lampe können Äskulin-abbauende und

Äskulin nicht verwertende Kulturen anhand der Fluoreszenz um die gewachsenen Kolonien

unterschieden werden und wurden je nach Verhalten als Äskulin-positive bzw. Äskulin-

negative Streptokokken angesprochen.

56

Zur Differenzierung der Äskulin-negativen Streptokokken wurde der CAMP-Test nach

CHRISTIE et al. (1944) herangezogen. Ein S. aureus- Stamm, der eine breite unvollständige

Hämolyse (β-Hämolysin) bildet, wird quer über eine Blutagarplatte nach 3.6.1 ausgestrichen.

Die zu untersuchenden Streptokokken-Stämme werden senkrecht zum S. aureus- Stamm

ausgestrichen, wobei ein Zwischenraum von 2-3 mm bestehen bleiben soll. Eine positive

Kontrolle wird mitgeführt. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37˚C erfolgt die Auswertung.

Ein CAMP-Phänomen liegt vor, wenn eine halbmondförmige Zone einer vollständigen

Hämolyse im Bereich der unvollständigen Hämolyse des S. aureus- Stammes vorliegt. Die

CAMP-Reaktion wird auf die synergistische Wirkung des Staphylokokken β-Toxins, einer

Sphingomyelinase, und dem B-Streptokokken CAMP-Faktor zurückgeführt. Der CAMP-

Faktor wird als thermostabiles Protein mit einem Molekulargewicht von 23.500 Dalton und

einem isoelektrischen Punkt bei pH 8,3 beschrieben (BERNHEIMER et al. 1979). Das

CAMP-Protein reagiert nicht enzymatisch mit Ceramid-Phosphat, welches nach vorheriger

Einwirkung der Staphylokokken-Sphingomyelinase C aus dem Sphingomyelin der

Erythrozytenmembran entsteht. Die Bindung des CAMP-Faktors führt zur Desorganisation

der Lipiddoppelschicht und schließlich zur Hämolyse (BERNHEIMER et al. 1979). S.

agalactiae reagiert positiv im CAMP-Test, während S. dysgalactiae keinen CAMP-Faktor

besitzt. S. agalactiae-Kolonien zeigen zumeist eine β-Hämolyse, während S. dysgalactiae

eine α-Hämolyse oder keine Hämolyse zeigt.

Zur weiteren Differenzierung der Äskulin-positiven Streptokokken in die verschiedenen

Streptokokken- und Enterokokkenspezies wurde bei einigen Stämmen das kommerziell

erhältliche api20 Strep-System (Biomérieux, Nürtingen, Deutschland) eingesetzt. Die meisten

Äskulin-positiven Streptokokken treten ohne Hämolyse auf. Nur Aerococcus viridans zeigt

eine α-Hämolyse mit deutlicher Vergrünung des Agars.

Als Corynebacterium spp. wurden Kolonien angesprochen, die erst nach 48-stündiger

Inkubation der beimpften Platten erkennbar wurden mit einem Durchmesser von maximal 1

mm. Die Kolonien befinden sich meist in dem Bereich des Ausstrichs, in dem die Milchfette

vorliegen. Es ist keine Hämolyse erkennbar. Die Kolonien besitzen eine raue Oberfläche und

wölben sich häufig nach oben. Im Gramausstrich zeigen sich grampositive pleomorphe

Stäbchen mit einer Größe von 0,5 x 2 µm. Auffällig ist häufig eine V-förmige oder parallele

Lagerung.

57

Enterobacteriaceae sind gramnegative, peritrich begeißelte Stäbchen, die keine Sporen bilden.

Sie sind fakultativ anaerob und verfügen über Katalase. In der milchhygienischen

Routinediagnostik wird zwischen E. coli und sonstigen coliformen Keimen unterschieden.

Als coliforme Keime werden 2-4 mm große gräuliche, feucht-glänzende runde Kolonien mit

scharfer Begrenzung angesprochen. Teilweise konnte ein stark schleimiges, mukoides

Wachstum oder eine deutliche Hämolyse beobachtet werden. Ein Wachstum auf Mc Conkey-

Agar nach 3.6.1 war immer vorhanden. Anhand des Farbumschlages von hellrosa zu pink

können Laktose-positive Kulturen sofort angesprochen werden. Zur Abgrenzung von E. coli

von den übrigen coliformen Keimen wurde dann die Überimpfung einiger Kolonien in ein

SIM-Medium nach 3.6.1 durchgeführt. Eine positive Indol-Reaktion wurde als Nachweis von

E. coli gewertet.

Traten große, flache, kompakte oder auch große raue Kolonien mit zahlreichen Ausläufern

auf, so wurden diese als Bacillus (B.) spp. beurteilt, wobei Bazillen in einer großen Variation

von Kulturmorphologien auftreten. Lag eine Hämolyse um die Kolonie herum vor, wurde die

Kultur als B. cereus angesprochen. Im Grampräparat zeigen sich grampositive Stäbchen mit

Endosporen. Sie sind etwa 1 x 4 µm groß.

Als Hefen wurden Kulturen angesprochen, die meist erst nach 48h ihre volle Ausbildung mit

einem Durchmesser von etwa 2 mm zeigten. Sie treten in weißen und cremefarbenen

Varianten auf, und ihre Oberfläche ist meistens rau. Nach Überimpfung auf Sabouraud-2%-

Glucose-Agar nach 3.6.1 tritt im Gegensatz zu anderen Kulturen nach Bebrütung bei 20˚C

Wachstum auf. Im Lichtmikroskop zeigen sich runde bis ovale Zellen mit einem Durchmesser

von 5-9 µm. Häufig sind Sprossung oder Hyphen erkennbar.

Die Isolation von mehr als drei unterschiedlichen Bakterienarten aus einer Milchprobe wurde

als Kontamination angesprochen. Kontaminierte Proben wurden von der Auswertung

ausgenommen. Nachweise von zwei unterschiedlichen Spezies in einer Probe wurden als ein

Mastitisfall für jedes einzelne Pathogen gewertet.

58

3.7 PCR-vermittelter Nachweis speziesspezifischer Genabschnitte

3.7.1 Präparation der bakteriellen DNA Alle Schritte der PCR wurden im PCR-Labor des Landesbetriebs Hessisches Landeslabor

Giessen durchgeführt. Zur Gewinnung der als „template“ in der PCR eingesetzten DNA kam

eine ursprünglich von BENTLEY et al. (1993) beschriebene, modifizierte Methode zum

Einsatz. Die zu untersuchenden Kulturen wurden zunächst auf Blutagar nach 3.6.1

subkultiviert und über Nacht bei 37˚C unter aeroben Bedingungen bebrütet. Nach erneuter

Reinheitskontrolle wurden dann etwa 5-10 Kolonien in 100µl TE-Puffer (s. Anhang) in 1,5 ml

Reaktionsgefäße überführt.

Bei Vorliegen von Staphylokokken-Kulturen wurde nun 5µl Lysostaphin (1,8 U/µl,Sigma,

Deisenhofen, Deutschland), bei Streptokokken-Kulturen hingegen 5µl Mutanolysin (10 U/µl;

Sigma, Deisenhofen, Deutschland) zugesetzt. Es folgte eine Inkubation im Wasserbad bei

37˚C für 1h, wodurch die Bakterienzellwände lysiert wurden. Zur Deproteinisierung erfolgte

die Zugabe von 2µl bzw. 10µl Proteinase K (14,8mg/ml, Roche, Mannheim, Deutschland)

und eine zweistündige Inkubation im Wasserbad bei 56˚C. Durch anschließendes Kochen der

Proben für 10min erfolgte die Inaktivierung der Proteinase K. Anschließend wurde die Probe

zentrifugiert (1min, 10.000 x g) und der Überstand entweder direkt in die PCR eingesetzt oder

bei -20˚C eingefroren.

3.7.2 Verwendete Oligonucleotidprimer und Thermocycler-

Temperaturprogramme

3.7.2.1 Staphylococcus aureus Zur Amplifizierung eines speziesspezifischen Abschnitts des 23 S rRNA-Gens von S. aureus

wurden die von STRAUB et al. (1999) beschriebenen Primer Staur4 mit der Sequenz 5'-ACG

GAG TTA CAA AGG ACG AC-3' und Staur6 mit der Sequenz 5'-AGC TCA GCC TTA

ACG AGT AC-3' in der PCR eingesetzt. Alle verwendeten Primer wurden von MWG-

Biotech (Ebersberg, Deutschland) bezogen.

Der Mastermix wurde nach folgendem Protokoll pipettiert:

59

S. aureus Streptococcus spp.

Aqua bidest. (μl) 12,9 12,6

Inkubationspuffer (μl) (Sigma) 2,0 2,0

MgCl2 (µl) (Sigma) 1,2 -

dNTP (µl) (Biozym, Oldendorf, D.) 0,4 1,6

Primer І (µl) 0,7 0,8

Primer ІІ (µl) 0,7 0,8

Taq-DNA-Polymerase (µl) (Sigma) 0,1 0,2

Nach gründlicher Durchmischung des Mastermixes wurden 18µl in ein 200µl Reaktionsgefäß

überführt und mit je 2,0 µl der nach 3.7.1 präparierten DNA vermischt. Nach Einsetzen der

Proben in den Thermocycler (T3 Thermocycler, Biometra, Göttingen, Deutschland) wurde

folgendes Temperaturprogramm gestartet:

1 Zyklus 94˚C 4min initiale Denaturierung

30 Zyklen 94˚C 60s Denaturierung

64˚C 60s Primeranlagerung

72˚C 60s Polymerisierung

1 Zyklus 72˚C 5min Renaturierung

Bis zur Entnahme verblieben die Proben bei 4˚C im Thermocycler.

3.7.2.2 Streptococcus agalactiae Hier wurden die von ABDULMAWJOOD und LÄMMLER (1999) beschriebenen Primer

agal І mit der Sequenz 5'-ATA AGA GTA ATT ACA TGT TAG-3' und agal ІІ mit der

Sequenz 5'-ACT TCG GGT GTT ACA AAC-3' spezifisch für die V2-Region des 16S rRNA-

Gens verwendet.

Nach Einsetzen der Proben wurde folgendes Temperaturprogramm gestartet:

1 Zyklus 94˚C 4min initiale Denaturierung

30 Zyklen 90˚C 90s Denaturierung

58˚C 90s Primeranlagerung

72˚C 90s Polymerisierung

1 Zyklus 72˚C 5min Renaturierung

60

3.7.2.3 Streptococcus uberis Die Amplifizierung eines speziesspezifischen Abschnitts des 16S rRNA-Gens von S. uberis

wurde mit den von BROWN und BROWN (1995) und OKA et al. (1999) beschriebenen

Primern ub І mit der Sequenz 5'-CGCATGACTTATCA-3' und ub ІІ mit der Sequenz 5'-

GCCTTTAACTTCAGACTTATCA-3' sowie dem unter 3.7.2.2 beschriebenen

Temperaturprogramm durchgeführt.

Desweiteren wurden 17 S. aureus-Stämme von EL-SAYED et al. (im Druck) mit Hilfe der

PCR auf das Vorkommen der Gene für die S. aureus-Enterotoxine A-J (entA- entJ) und das

Toxic-shock-syndrome-toxin 1 (tst) untersucht. Der Nachweis beschränkte sich auf die

Untersuchung von jeweils einem Isolat stellvertretend für jeden ermittelten S. aureus-Betrieb.

3.7.3 Agarosegelelektrophorese Der Nachweis der Amplifikate erfolgte mittels Elektrophorese in einem 2%-igen Agarosegel.

Hierfür wurden zunächst 0,7g Agarose NEEO (Roth, Karlsruhe, Deutschland) in 35ml TBE-

Puffer (40mmol/l Tris, 1% [v/v] Essigsäure, 1mmol/l EDTA) durch mehrminütiges Kochen in

der Mikrowelle in Lösung gebracht und nach Abkühlung im Wasserbad auf etwa 56˚C in eine

Flachbettform mit eingesetzten Kämmen gegossen. Nach dem Abkühlen wurden die Kämme

entfernt, und in die entstandenen Mulden konnte jeweils 8µl des PCR-Produkts nach

Vermischung mit jeweils 3µl Probenpuffer (50% Glycerin, 50mmol/l EDTA, 0,25%

Bromphenolblau) pipettiert werden. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte im

Horizontalgel für 1h bei 100V, wobei als Laufpuffer ebenfalls TBE-Puffer diente. Eine

Bestimmung der Größe der PCR-Produkte ermöglichte ein ebenfalls in das Gel aufgetragener

Marker (GeneRulerTM DNA Ladder Mix, MBI Fermentas, St. Leon-Rot; 100Bp DNA Ladder,

Gibco/BRL, Eggenstein; DNA-Längenstandard VIII, Roche, Mannheim).

3.7.4 Ethidiumbromidfärbung Im Anschluss an die Elektrophorese erfolgte die Dokumentation durch Färbung des Gels für

20min in einer wässrigen Ethidiumbromid-Lösung (5μg/ml, Sigma, Deisenhofen,

Deutschland), wobei sich das fluoreszierende Ethidiumbromid als interkalierende Substanz in

die Doppelstränge der DNA einlagerte. Überschüssiges Ethidiumbromid wurde durch kurzes

Schwenken in Aqua dest. entfernt. Die Auswertung und photographische Dokumentation

erfolgte anschließend unter UV-Licht (Gel-Videodokumentationssystem Image Master, VDS,

61

Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland), wobei sich die DNA-Fragmente als helle Banden

vor dunklem Hintergrund darstellten.

3.8 Makrorestriktionsanalyse der chromosomalen DNA und

Pulsfeldgelelektrophorese (DNA-Fingerprinting)

3.8.1 Präparation der bakteriellen DNA Zur Erstellung eines DNA-Fingerprints erfolgte zunächst die Präparation der bakteriellen

Gesamtzell-DNA von 27 ausgewählten Isolaten nach einer modifizierten Methode von

MASLOW et al. (1993) und THIELE et al. (1993). Aus jedem Betrieb mit positivem

Erregernachweis wurden 1-4 Isolate ausgewählt. Die auf Blutagar nach 3.6.1 angezüchteten

Reinkulturen der zu untersuchenden Bakterienisolate wurden in 40ml THB nach 3.6.1

überführt und für 24h bei 37˚C unter aeroben Bedingungen bebrütet. Anschließend wurden

die Bakteriensuspensionen für 10min bei 4.000 x g abzentrifugiert und zweimal in TE-Puffer

(10mmol/l Tris-HCl (pH 8,0), 1mmol/l EDTA) gewaschen. Das Sediment wurde daraufhin in

0,25ml TE-Puffer resuspendiert und bei einer Wellenlänge von 620nm (Spectronic 20,

Bausch und Lomb, New York) photometrisch auf 5% Transmission eingestellt. Aus der

eingestellten Suspension wurden je Kultur vier Agaroseblöckchen hergestellt. Hierzu wurde

200µl der auf 55˚C vorgewärmten Bakteriensuspension mit 205µl einer 1%-igen „low

melting, low gelling“ InCert-Agarose (Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf, Deutschland)

sorgfältig vermischt und in eine Gießkammer (100µl, BioRad, München, Deutschland)

pipettiert. Bis zum Erstarren der Blöckchen wurden diese auf Eis inkubiert. Der Aufschluss

der Bakterienzellwand erfolgte in 200µl Lysispuffer (6mmol/l Tris [pH 7,6], 1 mol/l NaCl,

10mmol/l EDTA [pH 7,6], 0,5% Brij-58 (Polyoxyethylene-20-Cetyl-Ether (Sigma,

Deisendorf, Deutschland), 0,2% Natriumdodecylsulfat (Sigma), 0,5% NatriumIauroylsarcosin

(Sigma)) unter Zusatz von 5mg/ml Lysozym (Sigma) und 5 U/ml Lysostaphin (Sigma) über

Nacht bei 37˚C. Eine anschließende Deproteinisierung erfolgte durch Zusatz von Proteinase K

(Endkonzentration 0,5 μg/ml; Boehringer, Mannheim, Deutschland) und eine Inkubation im

Wasserbad bei 56˚C über Nacht. Nach zweimaligem Waschen der Blöckchen mit 200µl TE-

Puffer und jeweils 30- minütiger Inkubation bei Raumtemperatur sowie zweimaligem

Waschen mit 200µl TE-Puffer unter Zusatz von Phenylmethylsulfonylfluorid

(Endkonzentration 1,0mmol/l; Sigma) und einer Inkubation für 1h bei 56˚C zur Inaktivierung

der Proteinase K schlossen sich nochmals zwei Waschschritte mit jeweils 200µl TE-Puffer

und eine Inkubation bei Raumtemperatur für 30min an. Die Blöckchen konnten nun mit den

62

Restriktionsenzymen verdaut werden oder verblieben bis zur weiteren Verwendung bei 4˚C in

TE-Puffer im Kühlschrank.

3.8.2 Restriktionsverdau der Gesamtzell-DNA

Der Restriktionsverdau der nach 3.8.1 präparierten chromosomalen DNA erfolgte mit Hilfe

der Restriktionsendonucelease SmaI (Promega, Mannheim, Deutschland). Der

Restriktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen (Ansatz pro Blöckchen):

Aqua dest. 158µl

Puffer J (Promega) 20µl

Bovines Serumalbumin (10 x BSA, Promega) 20µl

SmaI 2 µl

Die Agaroseblöckchen wurden für 5h bei 25˚C inkubiert.

3.8.3 Laufbedingungen der Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) Zur Auftrennung der Fragmente der nach 3.8.1 präparierten und nach 3.8.2 geschnittenen

DNA mittels PFGE wurden die Agaroseblöckchen in ein 1%-iges Agarosegel (1,1g Agarose

in 110ml 0,5x TBE-Puffer (45mmol/l Tris, 45mmol/l Borat, 1,0mmol/l EDTA (pH 8,0))

eingebettet. Nach Verbringen der Blöckchen in die Vertiefungen des Gels und Verschließen

der Vertiefungen mit flüssigem 1%-igem Agarosegel erfolgte die Elektrophorese in 2 Litern

0,5xTBE-Puffer in einem Chef DR ІІ-Elekrophoresegerät (Bio-Rad, München, Deutschland)

bei 14˚C unter folgenden Bedingungen:

1. Lauf 2. Lauf

Spannung 5 V/cm 6 V/cm

Anfangsumschaltzeit 0,1s 9,0s

Endumschaltzeit 11,0s 40,0s

Dauer 8h 17h

Als DNA-Längenstandard diente λ-ladder PFGE Marker (Bio-Rad).

Anschließend folgte das Färben und die Dokumentation des Gels wie in unter 3.7.4

beschrieben.

63

3.8.4 Auswertung der PFGE-Muster Die durch die PFGE erhaltenen Bandenmuster wurden von zwei unabhängigen Personen

visuell ausgewertet. In Anlehnung an TENOVER et al. (1995) wurden Isolate als nicht

unterscheidbar und zum identischen Makrorestriktionstyp gehörend angesprochen, wenn ihre

Bandenmuster vollständig übereinstimmten. Hatten zwei Muster die gleiche Anzahl von

Banden und unterschieden sich nur in einer Bande wurde dies als ein Verlust bzw. eine

Aufnahme von DNA gewertet. Isolate mit solchen Bandenmustern wurden als Subklone des

entsprechenden PFGE-Genotyps eingestuft. Gleiches galt für Isolate, die infolge der

Aufnahme bzw. des Verlustes einer Schnittstelle für das Restriktionsenzym in ihrem

Bandenmuster einen Unterschied von zwei bis drei Banden aufwiesen. Sofern Isolate, die als

Subklone eines PFGE-Genotyps eingestuft waren, in epidemiologischem Zusammenhang

standen, d.h. aus einer Herde stammten, wurden die Muster als identisch gewertet. Bei

größerem Unterschied der Bandenmuster wurden die Isolate als unterschiedlich klassifiziert

und in verschiedene PFGE-Genotypen eingeordnet.

3.9 Statistische Methoden Die Datenauswertung erfolgte auf den Rechnern im lokalen Rechnernetzwerk (LAN) der

Arbeitsgruppe Biomathematik und Datenverarbeitung des Fachbereichs Veterinärmedizin der

Justus-Liebig-Universität Giessen. Die statistischen Auswertungen wurden unter Verwendung

des Statistikprogrammpakets BMDP/Dynamic, Release 7.0, (DIXON 1993) durchgeführt.

Bei der Bewertung der statistischen Signifikanzen wurde das Signifikanzniveau α = 0,05

zugrunde gelegt, d.h. Ergebnisse mit p≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die

Untersuchung der Zusammenhänge erfolgte bei quantitiativen Merkmalen mit Hilfe von

Korrelations- bzw. Regressionsanalysen mit dem Programm BMDP6D unter Angabe des

Korrelationskoeffizienten (r) und der Regressionsgeraden (y = m·x + b) bzw. mit dem

Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman. Die statistischen Zusammenhänge wurden mit

dem Fisher-Test/Chi-Quadrat-Test überprüft.

64

4 Ergebnisse

4.1 Beschreibung der besuchten Betriebe Auf den 33 besuchten Betrieben mit insgesamt 2205 Milchkühen wurden zu 95% Tiere der

Rasse Holstein Friesian gehalten. Die übrigen 5% setzten sich aus den Rassen Jersey, Brown

Swiss, Criollo und Simmental zusammen. In Übereinstimmung mit den Witterungsverhältnissen muss man in Mexiko das Jahr in die

Regen- und Trockenzeit einteilen. Die Trockenzeit reicht von November bis Mai, während die

Regenzeit von Juni bis Oktober andauert. Von den 33 Betrieben wurden 23 (69,7%) zum

Zeitpunkt der Trockenzeit und 10 (30,3%) in der Regenzeit besucht.

25 (75,8%) der 33 Betriebe halten ihre Tiere halbaufgestallt in eingezäunten Ausläufen mit

provisorischen Überdachungen zum Sonnenschutz. Zusätzlich zu dieser Haltung gewähren

fünf von diesen 25 Betrieben (20%) ihren Tieren tagsüber Weidegang, fünf (20%) Betriebe

lassen ihre Tiere nur während der Regenzeit weiden und 15 (60%) halten ihre Tiere ohne

Weidegang.

Acht (24,2%) der 33 Betriebe halten ihre Tiere das ganze Jahr auf der Weide und treiben diese

nur zur Melkzeit in die provisorischen Melkstände.

Zum Reinigungsintervall ihrer Ausläufe machten die 25 betroffenen Betriebsleiter folgende

Angaben:

Keinerlei Reinigung (2; 8%), einmal im Jahr (1; 4%), monatlich (1; 4%), alle 14 Tage (3;

12%), einmal pro Woche (8; 32%), zweimal pro Woche (3, 12%) oder alle 2 Tage (4; 16%).

Keine Angaben machten drei Betriebsleiter (12%).

Die Sauberkeit der Ausläufe wurde bei Besichtigung der Betriebe wie folgt bewertet:

Tab. 6 Einteilung der 25 Betriebe mit Auslaufhaltung nach der Sauberkeit ihrer Auläufe

Hygienischer Zustand der Ausläufe Anzahl Betriebe Prozentualer Anteil

Sehr gut 0 0%

Gut 10 40%

Mäßig 13 52%

Schlecht 2 8%

In der Regenzeit sind insbesondere die Haupttriebwege der Tiere extrem matschig, so dass die

Kühe teilweise bis zu den Karpalgelenken im Matsch stehen, und damit die Zitzen einer

65

möglichen Kontamination ausgesetzt sind. Häufig verfügen die Ausläufe über keine

geeigneten Vorrichtungen zum Ablaufen des Regenwassers. In der Sommerzeit besteht der

Bodenbelag vieler Ausläufe überwiegend aus eingetrocknetem Kot. Auf einigen Ausläufen

stehen den Tieren keine Dächer zum Schutz vor der Sonnenbestrahlung zur Verfügung.

Beispiele zur Auslaufsauberkeit zeigen die Abb. 7 und 8 auf S. III des Anhangs.

Auf die Frage nach gehäuft auftretenden gesundheitlichen Problemen nannten 15 Betrieben

(45,5%) Aborte. Fünf (15,2%) der Betriebsleiter gaben bei der Befragung an Probleme mit

verlängerten Zwischenkalbezeiten zu haben. Ferner wurden folgende Erkrankungen

angegeben, die hier entsprechend der Häufigkeit ihres Auftretens genannt werden:

Piroplasmose, Anaplasmose, Leptospirose, Retentio secundinarum, Pneumonien, Tuberkulose

und Brucellose. Das Auftreten von klinischen Mastitisfällen beurteilten 17 (51,5%) der

Betriebsleiter als selten, 13 (39,4%) als häufig und drei (9,1%) als sehr häufig. In 20 der

Betriebe (60,6%) kommt die künstliche Besamung zum Einsatz. Die übrigen Betriebe halten

meist ihren eigenen Bullen, der die Kühe im Natursprung deckt.

4.2 Beurteilung der Fütterung Der Ernährungszustand der Tiere wurde in sieben (21,2%) Herden mit sehr gut, bei 16

(48,5%) Betrieben als gut und bei vier (12,1%) Betrieben als mäßig beurteilt. Der

Ernährungszustand der Tiere der übrigen sechs (18,2%) Betriebe schwankte stark innerhalb

der einzelnen Herden, auch kümmernde Tiere kamen vor.

Tab. 7 Einteilung der Betriebe nach Art der Rationsberechnung der einzelnen Milchkühe

Art der Rationsberechnung Anzahl der Betriebe Prozentualer Anteil

Keinerlei Berechnung 18 54,5

Grob geschätzt 12 36,4

Exakte Berechnung 3 9,1

Bei den auf der Weide gehaltenen Tieren haben die Kühe generell nur während der Melkzeit

die Möglichkeit zur Kraftfutteraufnahme. Die Tiere werden zum Melken in den

Fangfressgittern eingesperrt und während des Melkvorgangs gefüttert.

66

Auch bei den in Ausläufen gehaltenen Tieren erfolgt die Kraftfuttergabe häufig während des

Melkens in den Fangfressgittern. Nur in den spezialisierten Betrieben haben die Tiere

melkzeitunabhängig Zugang zu Kraftfutter.

Zur Fütterung der Tiere kommen neben den Spezialkraftfuttermischungen für Milchkühe auch

Soja, Mais, Baumwollsamen, Weizenspelzen, Zuckerrohr, Brauereiabfälle, Luzerne und Hafer

zum Einsatz. Als Grundfutter werden häufig Maissilage oder –stroh und Leguminosen

vorgelegt. Die Kraftfuttermenge liegt zwischen 5-12 kg/Kuh/Tag. Gelegentlich wird den

Tieren Mineralfutter zugefüttert.

4.3 Beurteilung der Melkhygiene und des Trockenstellens Zum Zeitpunkt des Melkvorgangs sind nur bei drei (9,1%) Betrieben die Melkplätze als

sauber einzustufen. Die übrigen melken ihre Tiere in provisorischen Melkständen, die meist

keinen befestigten und leicht zu reinigenden Boden besitzen. Meist findet man einen feuchten

Boden mit einer Schicht aus Futterresten, Einstreu und Dung vor. Der während des Melkens

anfallende Kot wird meist nur grob entfernt. Eine den Melkvorgang abschließende Reinigung

bzw. Desinfektion des Melkbereiches findet gar nicht bzw. nur sporadisch statt. Eine extreme

Belästigung mit Fliegen war in vielen Melkständen eine direkte Folge dieser

Bodenverschmutzung. Die meisten Betriebe melken ihre Tiere in den Fangfressgittern

während der Kraftfuttergabe.

Tab. 8 Zustand der Melkzeuge in den 26 maschinenmelkenden Betrieben

Zustand der Melkzeuge Anzahl der Betriebe Prozentualer Anteil

Sehr gut 6 23,1

Gut 13 50,0

Mäßig 3 11,5

Schlecht 4 15,4

Die Betriebe melken mit 2-12 Melkzeugen. Auf jedes Melkzeug kommen zwischen acht und

43 Kühe/Melkzeit, durchschnittlich sind es 15 Kühe pro Melkzeug/Melkzeit. Die

Zitzengummis werden nach Angaben der Besitzer in neun (34,6%) Betrieben alle 3-4 Monate,

in sechs (23,1%) Betrieben alle 6 Monate, in fünf (19,2%) Betrieben alle 10-12 Monate und in

sechs (23,1%) Betrieben erst, wenn die Gummis defekt und brüchig sind, gewechselt.

67

Tab. 9 Zustand der Zitzengummis in den 26 maschinenmelkenden Betrieben

Zustand der Zitzengummis Anzahl der Betriebe Prozentualer Anteil

Sehr gut 4 15,4

Gut 11 42,3

Einzelne Gummis brüchig 6 23,1

Schlecht 5 19,2

Tab. 10 Durchführung einiger melkhygienischer Maßnahmen in den Betrieben

Melkhygienische Maßnahme Anzahl der Betriebe Prozentualer Anteil

Feste Melkreihenfolge 9 27,3

Einteilung in Gruppen nach Leistung oder Zellzahlen

6 18,2

Keine Melkreihenfolge 18 54,6

Keine Vorgemelksprüfung 17 51,5

Vormelken auf den Boden 14 42,4

Vormelken in Vormelkbecher 2 6,1

Keinerlei Euterreinigung 6 18,2

Euterreinigung trocken mit Einmalpapier

5 15,1

Feuchte Euterreinigung mit Abtrocknen

13 39,4

Feuchte Euterreinigung ohne Abtrocken

9 27,3

Melkzeugzwischendesinfektion 5 19,2

Keine Melkzeugzwischendesinfektion

21 80,8

Einige Betriebe, die die feuchte Euterreinigung einsetzen, verwenden hierfür Lappen, die

teilweise in einem aus der Tränke gefüllten Eimer angefeuchtet werden, und mit denen

mehrere Euter nacheinander gereinigt werden.

Die optische Sauberkeit der Euter nach der durchgeführten Reinigung wurde in 11 (33,3%)

Betrieben als sehr gut und in 14 (42,4%) als gut beurteilt. Eine mäßige Eutersauberkeit fand

sich bei zwei (6,1%) Betrieben. Ungenügend saubere Euter wurden in drei (9,1%) Betrieben

bemängelt, und in weiteren drei (9,1%) waren die Euter beim Ansetzen der Melkzeuge bzw.

68

vor dem Handmelken noch nass. In einigen Betrieben wurden die Euter nach dem

Maschinenmelken mit der Hand nachgemolken.

In den sieben handmelkenden Betrieben erfolgte das Melken meist mit Vollhandgriff. Hierfür

wurden die Zitzen mit der Milch anderer Kühe aus dem Melkeimer schlüpfrig gemacht.

Andere Melker verwendeten hierfür Melkfett, wobei sie ihre Hände vor Entnahme des Fettes

nicht wuschen. Das Ansetzen der Melkzeuge wurde in allen Betrieben ohne Fehler

durchgeführt. Ein Blindmelken konnte in fünf (19,2%) der Fällen festgestellt werden.

Das Zitzentauchen mit jodhaltigen Lösungen nach dem Melken gehörte bei 21 (63,6%) der

Betriebe zum festen Bestandteil des Melkens, von diesen tauchen acht (38,1%) Betriebe die

Zitzen zusätzlich noch vor dem Melken mit einem nicht jodhaltigen Desinfektionsmittel. Die

übrigen 12 (36,4%) Betriebe dippen die Zitzen weder vor noch nach dem Melken.

Ein Milchtank für die Kühlung und Aufbewahrung der Milch war in 20 (60,6%) Betrieben

vorhanden. Die übrigen 13 (39,4%) Betriebe hatten keinen eigenen Milchtank. Hier wurde die

Milch entweder von den Melkern sofort zu Sammelkühltanks oder direkt zu

Zwischenhändlern gefahren oder bis zur Abholung durch die Molkerei provisorisch im

Wasserbad gekühlt.

Der durchschnittlich pro Liter erzielte Milchpreis lag bei 3,12 mexikanische Pesos mit

Schwankungen zwischen 2,2 und 5,5 Pesos. Die höheren Preise werden beim Direktverkauf

von Rohmilch erzielt. Ein Liter pasteurisierte Milch kostet im Supermarkt etwa 8 Pesos.

Sechzehn (48,5%) der Betriebe stellen ihre Kühe trocken, indem sie Melkzeiten überspringen

und die Futtermenge radikal reduzieren. Das derartige Trockenstellen nimmt 1-2 Wochen in

Anspruch. Von diesen 16 Betrieben verwenden sieben (43,8%) einen antibiotischen

Trockensteller. Von einer Melkzeit auf die folgende stellen 17 (51,5%) der Betriebe ihre Kühe

trocken. In 11 (64,7%) dieser 17 Betriebe kommen antibiotische Trockensteller zum Einsatz.

4.4 Ergebnisse des California-Mastitis-Test (CMT) Von den 752 untersuchten Kühen wurden 2937 Euterviertel mit Hilfe des CMT untersucht.

Insgesamt zeigten 1996 (66,9%) eine positive Reaktion, wobei 1087 (37%) deutlich bis stark

positiv reagierten, was einem Zellgehalt von > 500.000 Zellen/ml entspricht. Tab. 11 zeigt die

Resultate der 2937 durchgeführten Tests. Der geometrische Mittelwert der durchgeführten

Tests lag bei 1,19.

69

Tab. 11 Resultate des CMT von 2937 untersuchten Viertelgemelksproben

Stufe Anzahl Prozentualer Anteil

0 972 33,1%

1 878 29,9%

2 706 24,0%

3 381 13,0%

Bei 105 (3,5%) der Viertel konnte anhand makroskopischer Veränderungen der Milch bzw.

akut entzündlicher Veränderungen am Euter die Diagnose klinische Mastitis gestellt werden.

Neunundzwanzig (1%) Viertel waren verödet, so dass weder der CMT durchgeführt, noch

eine Milchprobe für die bakteriologische Untersuchung entnommen werden konnte. Der

Verdacht auf eine subklinische Mastitis wurde bei einem mindestens einfach positiven CMT-

Ergebnis bei gleichzeitig unverändertem Viertelgemelk und unauffälligem Palpationsbefund

ausgesprochen.

4.5 Befunde der Euterpalpation und Sekretbeurteilung Von den 3008 untersuchten Eutervierteln konnten 448 (14,9%) wegen zu erheblicher Störung

des normalen Melkablaufes oder aus Sicherheitsgründen nicht palpiert werden. Ein

physiologischer Palpationsbefund konnte bei 1929 (75,4%) der untersuchten 2560 Viertel

erhoben werden. Bei 154 (6,0%) der Viertel erschien das Drüsenparenchym grobkörnig.

Neunundneunzig (3,9%) Viertel waren von prall-elastischer Konsistenz, so dass die

durchgängige Palpation des kompletten Drüsenparenchyms nicht möglich war. In 289

(11,3%) der Viertel konnten kleinere bis große derbe Knoten ermittelt werden, während 89

(3,5%) Viertel akut entzündlich geschwollen oder komplett verhärtet erschienen.

Bei 2925 (98,2 %) Milchproben konnten keinerlei makroskopisch erkennbare

Sekretionsstörungen festgestellt werden. Deutliche Flockenbildung zeigten 21 (0,7%) der

Proben, eine deutliche Gelbfärbung 33 (1,1%) Proben.

70

4.6 Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen

Von den 2979 Viertelanfangsgemelkproben zeigten 1603 (53,8%) kulturell keinen

Keimgehalt. Die am häufigsten isolierten Erreger waren KNS, Corynebacterium spp., S.

agalactiae und S. aureus, gefolgt von coliformen Keimen und Streptokokkenspezies. Die

Prävalenzen der isolierten Erreger können der Tab. 12 entnommen werden.

Tab. 12 Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen von Viertelanfangsgemelkprobe

auf Kuh-, Viertel- und Herdenebene

Erreger Viertelprävalenz Kuhprävalenz Herdenprävalenz

KNS

Corynebacterium spp.

S. agalactiae

S. aureus

Coliforme Keime

Streptococcus spp.

S. dysgalactiae

464 (15,6%)

417 (14,0%)

200 (6,7%)

175 (5,9%)

123 (4,1%)

109 (3,7%)

10 (0,4%)

295 (15,4%)

227 (30,2%)

111 (14,8%)

118 (15,7%)

109 (14,5%)

95 (12,6%)

9 (1,2%)

33 (100%)

30 (90,1%)

19 (57,6%)

22 (66,7%)

27 (81,8%)

30 (90,1%)

3 (9,1%)

Total 2979 (100%) 752 (100%) 33 (100%)

Insgesamt konnten 175 Kulturen, d.h. 11,7% aller isolierten Keime, als S. aureus

angesprochen werden. Alle diese Kulturen zeigten einen positiven Röhrchen-Koagulase-Test.

33% der Katalse-positiven Kulturen (n=464) zeigten keine Hämolyse und einen negativen

Röhrchen-Koagulase-Test und wurden als KNS bewertet. Eine weitere Identifizierung dieser

Kulturen wurde nicht vorgenommen.

Von den 210 Äskulin-negativen Streptokokken-Isolaten zeigten 200 Isolate eine positive

CAMP-Reaktion auf Schafblutagar und wurden daher als S. agalactiae angesprochen (14,0%

der Kulturen). Die übrigen 10 Äskulin-negativen Streptokokken-Isolate wurden als S.

dysgalactiae angesprochen und entsprachen 0,7% aller Kulturen.

Von den 109 Äskulin-positiven Streptokokken (7,3% aller Kulturen) wurden 45 Isolate mit

dem Identifizierungssystem (Api20 Strep, Biomerieux) bzw. mit Hilfe der 16S/23S-PCR

näher identifiziert. Hierbei ergaben sich folgende Resultate:

Aerococcus viridans 16 Isolate (35,6%), Enterococcus spp. 12 Isolate (26,7%), S. uberis 11

Isolate (24,4%), Lactococcus lactis 4 Isolate (8,9%) und S. bovis 2 Isolate (4,4%).

71

4.7 Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchungen

Die Amplifizierung des speziesspezifischen Bereichs des 23S rRNA-Gens (siehe 3.7.2.1) mit

den Oligonukleotidprimern Staur4 und Staur6 ergab bei allen 35 untersuchten koagulase-

positiven Staphylokokken-Kulturen ein einheitliches Amplifikat mit der Größe von 1270

Basenpaaren (Bp). Bei dem als Negativkontrolle mitgeführten S. epidermidis-Stamm konnte

unter Verwendung dieser Primer kein Amplifikat erzeugt werden. Es konnte somit mittels der

molekularbiologischen Technik der Nachweis erbracht werden, dass es sich bei den

untersuchten koagulase-positiven Staphylokokken um S. aureus-Isolate handelt. Die

zugehörigeAbbildung (Abb.13) befindet sich auf S. X des Anhangs.

Das Amplifikat der nach 3.7.2.2 durchgeführten Untersuchung des 16 S rRNA-Gens von 40

CAMP-Faktor positiven, Äskulin-negativen Streptokokken-Kulturen wies eine einheitliche

Größe von 1250 Bp auf. Der als Negativ-Kontrolle mitgeführte S. canis- Stamm ergab kein

Amplifikat. Hierdurch konnte der molekularbiologische Nachweis erbracht werden, dass es

sich bei den CAMP-Faktor positiven, Äskulin-negativen Streptokokken um S. agalactiae-

Isolate handelt. Die zugehörige Abbildung (Abb.14) befindet sich auf S. XI des Anhangs.

Die Amplifizierung des speziesspezifischen Bereichs des 16S rRNA-Gens von 25 Äskulin-

positiven Streptokokken-Kulturen mit den Oligonukleotidprimern ubІ und ubІІ (siehe 3.7.2.3)

ergab bei 11 der untersuchten Kulturen ein Amplifikat mit der einheitlichen Größe von 445

Bp. Hierdurch konnte molekularbiologisch nachgewiesen werden, dass es sich bei diesen

positiven Kulturen um Isolate von S. uberis handelt. Die übrigen Kulturen ohne Amplifikat

gehörten anderen Streptokokkenspezies wie z.B. Enterococcus faecalis oder S. bovis an.

Unter Verwendung der Primer ubІ und ubІІ ließ sich keine Amplifizierung der

entsprechenden Größe darstellen. Die entsprechende Abbildung (Abb. 15) befindet sich auf S.

XI des Anhangs.

EL-SAYED et al. (im Druck) konnten unter den 17 mittels Multiplex-PCR auf SE-Toxingene

untersuchten S. aureus-Stämmen nur einen einzigen Stamm (5,9%) mit einem 580 Bp

Amplifikat für das SEI Gen nachweisen. Bei keinem der untersuchten Stämme konnten Gene

für die SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEJ und das TSST-1 gefunden werden.

72

4.8 Ergebnisse der Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)

Nach der Makrorestriktionsanalyse der 27 S. aureus-Kulturen mittels der

Restriktionsendonuklease SmaІ (3.8.2) und anschließender Auftrennung der Fragmente in der

PFGE (3.8.3) konnten 15 verschiedene Makrorestriktionsmuster unterschieden werden. Es

konnten pro Isolat jeweils zwischen 12 und 17 Fragmente dargestellt werden. In den meisten

Fällen war eine völlige Übereinstimmung der Bandenmuster vorhanden. In den Betrieben 19

und 27 waren geringe Unterschiede (eine Bande, die während der Elektrophorese weniger

weit gewandert war) nachweisbar. In Betrieb 9 zeigten die Isolate Unterschiede in zwei

Banden. Isolate mit epidemiologischem Zusammenhang, die aus einem einzelnen Betrieb

stammten und sich voneinander nur durch eine bis drei Banden unterschieden, wurden als

Subklone des jeweiligen PFGE-Genotyps beurteilt und in Tab. 13 jeweils mit a/b

gekennzeichnet. Die übrigen PFGE-Genotypen waren dagegen anhand von mehr als vier

abweichenden Banden deutlich voneinander unterscheidbar und wurden in Tab. 13 jeweils

mit einem c/d gekennzeichnet.

Tab. 13 Ergebnisse der PFGE von 27 Isolaten aus zwölf Betrieben

Betrieb Anzahl untersuchter Isolate

Verwandtschaft der Isolate

Isolat- bezeichnung

Verwandtschaft zu anderen Betrieben

7 2 identisch VII zu XXIIc, XXV, XXVII

9 2 zwei Banden Unterschied IXa, IXb IXa zu XXXIa

10 2 acht Banden Unterschied Xc, Xd Xc zu XIIc und XXVIIb

12 2 sieben Banden Unterschied XIIc, XIId XIIc zu Xc und XXVIIb

19 4 jeweils 2 Isolate identisch, dabei 1 Bande Unterschied zwischen den Isolaten

IXXa, IXXb

20 1 - XX

22 3 jeweils 2 Isolate identisch, das dritte Isolat zeigte 5 Banden Unterschied

XXIIc, XXId

XXIIc zu VII, XXVIIb

23 2 identisch XXIII 25 3 identisch XXV zu VII

27 2 eine Bande Unterschied XXVII a, XXVIIb

XXVIIb zu Xc und XIIc

31 3 identisch XXXI XXXI zu IXa 33 1 - XXXIII

73

Interessanterweise unterschieden sich viele der Makrorestriktionstypen zwischen den

untersuchten Betrieben nur durch 1-3 Banden, wodurch auf eine starke Verwandtschaft dieser

Isolate untereinander geschlossen werden kann. So unterscheidet sich Isolat VII von Isolat

XXV und XXVIIc nur durch jeweils eine einzige Bande und von Isolat XXIIa durch zwei

Banden. Isolat Xc und XIIc scheinen identisch und unterscheiden sich von Isolat XXVIIb nur

durch eine einzige Bande. Auch die Isolate IXa und XXXI zeigten bei Vergleich ihrer

Bandenmuster nur in einer Bande einen Unterschied.

4.9 Ergebnisse der statistischen Auswertung Die einfaktorielle Auswertung der erhobenen Daten zeigte statistisch signifikante

Unterschiede bei der Vorkommenshäufigkeit der einzelnen Mastitiserreger in Bezug auf

Betriebsformen oder einzelne melkhygienische Maßnahmen.

So konnte S. aureus in den spezialisierten Betrieben mit einer Prävalenz von 1,3%

nachgewiesen werden, während S. agalactiae in gar keinem spezialisierten Betrieb isoliert

werden konnte. In den halbspezialisierten Betrieben stiegen die Nachweisraten auf jeweils

6,7%. Die höchste Prävalenz für beide Erreger konnte in den Familienbetrieben mit 7,4% für

S. aureus bzw. 12,7% für S. agalactiae gefunden werden. Diese Unterschiede waren für beide

Erreger hoch signifikant (p<0,0001). Da überwiegend die Familienbetriebe auch Rohmilch an

Privatpersonen verkaufen, kam S. aureus in Betrieben mit Rohmilchabgabe mit 10,4% fast

dreimal häufiger vor als in Betrieben, die ihre Milch direkt an die Molkereien liefern (3,1%).

Für S. agalactiae liegen die Werte bei 9,7% gegenüber 4,9% (p<0,0001).

In Bezug zu den verschiedenen Melksystemen, konnten S. aureus und S. agalactiae bei

handmelkenden Betrieben mit jeweils 4,8%, bei festen Eimermelkanlagen mit 8,2% bzw.

22,4%, bei mobilen Eimermelkanlagen zu 2,1% bzw. 5,8% und bei Rohrmelkanlagen mit

6,2% bzw. 4% nachgewiesen werden (p=0,0022 und p<0,0001).

Auch das Vormelken hatte einen signifikanten (p=0,0093 bzw. p<0,0001) Einfluss auf die

Vorkommenshäufigkeit der kontagiösen Mastitiserreger. Nicht vormelkende Betriebe zeigten

mit 7,0 bzw. 9,5% eine höhere Prävalenz für S. aureus bzw. S. agalactiae als Betriebe, die auf

den Boden vormelken (4,9% bzw. 4,0%). Die niedrigste Prävalenz zeigte sich beim

Vormelken mit Verwendung eines Vormelkbechers (2,9% bzw. 1,3%).

74

0

2

4

6

8

10

Kein Vormelken Vormelken auf den Boden Vormelken in Becher

Präv

alen

zen

in %

S. aureus S.agalactiae Abb. 4. Vergleich der Prävalenzen von S. aureus und S. agalactiae bei verschiedenen

Vormelktechniken (p=0,0093 bzw. p<0,0001)

Ebenso stieg die Prävalenz mit einer Verschlechterung der Zitzensauberkeit zum Zeitpunkt

des Melkens an. Ohne Euterreinigung vor dem Melken lag die Prävalenz für S. aureus bei

11,1% und sank je nach Reinigungsmethode auf 3,1-7,6% (p<0,0001). Für S. agalactiae lagen

die Werte bei 19,6% bzw. 2,7-4,5% (p<0,0001).

Bei Einhaltung einer festen Melkreihenfolge war die Vorkommenshäufigkeit von S. aureus

mit 4,9% statistisch signifikant (p<0,0001) geringer als in Betrieben ohne Melkreihenfolge

(8,6%). Für S. agalactiae konnte ein solcher Zusammenhang nicht festgestellt werden.

Auch das Zitzendippen hatte einen Einfluss auf die Nachweisraten von S. aureus und S.

agalactiae. In Betrieben mit Durchführung des Zitzendippens nach dem Melken traten diese

statistisch signifikant (p<0,0001) seltener (4,2% bzw. 7,0%) auf als in Betrieben ohne

Zitzendippen (12,8% bzw. 9,8%). Die niedrigste Prävalenz zeigten Betriebe, in denen die

Zitzen vor dem Melken mit einer Reinigungslösung und nach dem Melkvorgang mit einer

Jodlösung gedippt wurden. Hier lagen die Prävalenzen für S. aureus bei 2,4% und für S.

agalactiae bei 3,0%.

75

0

2

4

6

8

10

12

14

Ohne Zitzendippen Mit Zitzendippen Zweimaliges Dippen

Präv

alen

zen

in %

S. aureus S. agalactiae Abb. 5 Vergleich der Prävalenzen von S. aureus und S. agalactiae in Abhängigkeit vom

Zitzendippen (p<0,0001)

Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Erreger in Betrieben mit Durchführung einer

Melkzeugzwischendesinfektion seltener auftraten (5,5% bzw. 3,8%) als in Betrieben, die

diese melkhygienische Maßnahme nicht durchführten (6,2% bzw. 8,1%) (p<0,0001).

Die Nachweisraten korrelierten auch mit dem Zustand der Zitzengummis: So stieg die

Prävalenz von 2,9% bei Zitzengummis mit sehr gutem Zustand auf 12,6% bei Zitzengummis

mit gerade noch ausreichendem Zustand für S. aureus, bzw. von 7,2% auf 19,8% für S.

agalactiae (p<0,0001).

Auch die verschiedenen Methoden für das Trockenstellen der Kühe zeigten statistisch

signifikante (p<0,0001) Unterschiede. Die höchsten Prävalenzen der kontagiösen

Mastitiserreger traten beim langsamen Trockenstellen ohne antibiotischen Schutz auf (14,5%

bzw. 8,7%). Bei gleichzeitigem Einsatz antibiotischer Trockensteller traten niedrigere

Prävalenzen auf (2,8% bzw. 4,5%). In Betrieben, die ihre Kühe ohne antibiotische

Langzeitpräparate von einer Melkzeit auf die andere trockenstellen, traten mit 2,5% bzw.

3,7% die niedrigsten Prävalenzen auf. Der gleichzeitige Einsatz von Trockenstellern zeigte

hier keinen weiteren Effekt auf das Auftreten von kontagiösen Mastitiserregern im Bestand.

S. aureus hatte bei Tieren mit palpatorisch erfassbaren Knoten im Eutergewebe eine fast

doppelt so hohe Prävalenz wie bei Tieren ohne Knoten (p<0,0001). S. agalactiae kommt

76

sogar dreimal häufiger mit Knoten im Euterparenchym als bei normalem Palpationsbefund

vor (p<0,0001).

Mit ansteigendem CMT steigt die Prävalenz für S. aureus bzw. S. agalactiae von 2,4% bzw.

1,1% bei einfach positivem Testergebnis auf 12,9% bzw. 21% bei dreifach positivem

Testergebnis an (p<0,0001).

Tab. 14 Übersicht über die Prävalenzen von S. aureus und S. agalactiae in Abhängigkeit von

Betriebsformen, Melksystemen und verschiedenen melkhygienischen Einflussfaktoren

Es sind nur statistisch signifikante Werte aufgeführt (p≤ 0,05).

S. aureus

S. agalactiae S.

aureus S.

agalactiae

Spezialisierte Betriebe 1,3 0,0 Ohne Euterreinigung 11,1 19,6

Halbspezialisierte Betriebe 6,7 6,7 Mit Euterreinigung 3,1-7,6 2,7-4,5

Familienbetriebe 7,4 12,7 Ohne Melkreihenfolge 8,6

Auslaufhaltung 4,2 6,1 Mit Melkreihenfolge 4,9

Weidehaltung 12,3 8,9 Ohne Zitzendippen 12,8 9,8

Handmelken 4,8 4,8 Mit Zitzendippen 4,2 7,0

Feste Eimermelkanlage 8,2 22,4 Melkzeug-zwischendesinfektion 5,5 3,8

Mobile Eimermelkanlage 2,1 5,8 Ohne Melkzeug-zwischendesinfektion 6,2 8,1

Rohrmelkanlage 6,2 4,0 Sehr guter Zustand der Zitzengummis 2,9 7,2

Kein Vormelken 7,0 9,5 Schlechter Zustand der Zitzengummis 12,6 19,8

Vormelken auf den Boden 4,9 4,0 Langsames

Trockenstellen 14,5 8,7

Vormelken in Becher 2,9 1,3 Schnelles Trockenstellen 2,5 3,7

77

KNS konnten in den spezialisierten und in den Familienbetrieben mit 20,5% bzw. 20,7% in

etwa gleich häufig isoliert werden. In den halbspezialisierten Betrieben kamen sie mit 12,1%

statistisch signifikant (p<0,0001) seltener vor. Außerdem konnten sie verstärkt in

handmelkenden Betrieben (23,3%) und bei festen Eimermelkanlagen (17,9%) nachgewiesen

werden, während sie bei mobilen Eimermelkanlagen (9,7%) und Rohrmelkanlagen (14,9%)

seltener auftraten (p<0,0001).

Die meisten melkhygienischen Maßnahmen zeigten keine signifikante Auswirkung auf die

KNS-Prävalenz. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass KNS in nicht vormelkenden

Betrieben mit 22,3% statistisch signifikant (p<0,0001) häufiger vorkamen als in Betrieben,

die auf den Boden oder in den Melkbecher vormelken (13,1% bzw. 13,4%).

Zu einem Anstieg der Prävalenz kam es mit der schlechter werdenden Zitzensauberkeit, bei

im Auslauf gehaltenen Tieren und in der Regenzeit. Diese Unterschiede zeigten jedoch keine

statistische Relevanz. Die Nachweishäufigkeit der KNS stieg jedoch statistisch signifikant

(p=0,0003) mit schlechter werdender Auslaufhygiene. Die KNS waren vermehrt mit prall-

elastischen Euterpalpationsbefunden und deutlich positiven CMT-Ergebnissen

vergesellschaftet (p<0,0001).

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

S. aureus

S. agalactiae

coliforme Keime

KNSCorynebacterium spp.

Präv

alen

zen

in %

Spezialisierte Betriebe Halbspezialisierte Betriebe Familienbetriebe Abb. 6 Prävalenzen der wichtigsten Mastitiserreger in Abhängigkeit von der Betriebsform

78

Die Corynebacterium spp. kamen mit 21,2% signifikant (p<0,0001) häufiger in

Familienbetrieben vor. In spezialisierten bzw. halbspezialisierten Betrieben lag ihre

Nachweishäufigkeit bei 7,7% bzw. 13,3%. Des Weiteren traten sie bei festen

Eimermelkanlagen (28,4%) häufiger als bei Rohrmelkanlagen (12,8%) und in handmelkenden

Betrieben (9,2%) auf. Die geringste Prävalenz ergab sich bei mobilen Eimermelkanlagen mit

7,9% (p<0,0001).

In Betrieben mit Einhaltung einer festen Melkreihenfolge oder Durchführung des

Zitzendippens traten Corynebacterium spp. seltener auf als ohne Durchführung dieser

Maßnahmen (p<0,0001). Bezüglich der Zitzensauberkeit war ein statistisch signifikanter

(p<0,0001) Unterschied zwischen Kühen mit und ohne Erregernachweis vorhanden. So stieg

die Nachweishäufigkeit mit schlechter werdender Zitzensauberkeit an. Die Erreger waren am

häufigsten mit einem leichten Anstieg des Zellgehaltes und einem grobkörnigen

Euterpalpationsbefund vergesellschaftet.

Coliforme Keime traten mit 5,4% am häufigsten in den spezialisierten Betrieben auf. Die

geringste Prävalenz zeigten sie mit 2,0% in den Familienbetrieben (p=0,008).

Ein Einfluss der Haltungsform auf das Auftreten konnte nicht ermittelt werden. Jedoch stieg

die Prävalenz signifikant mit sinkender Auslaufhygiene an. (p=0,002).

Von allen melkhygienischen Maßnahmen zeigte nur die Verwendung von antibiotischen

Trockenstellern einen Einfluss auf die Vorkommenshäufigkeit dieser Erreger. Bei sofortigem

Trockenstellen ohne Trockensteller konnten sie zu 6,1% und bei gleichzeitiger Verwendung

eines antibiotischen Trockenstellers zu 2,2% isoliert werden (p<0,0001). Bei dem langsamen

Trockenstellen war dieser Unterschied statistisch nicht signifikant. Coliforme Keime waren

meist mit hohen bis sehr hohen Zellzahlen vergesellschaftet und traten vermehrt in Eutern mit

Knotenbildung auf (p<0,0001).

Die Äskulin-positiven Streptokokken ließen sich häufiger bei Auslaufhaltung (4,0%) als bei

reiner Weidehaltung (2,2%) nachweisen (p=0,03). Auch eine mangelhafte Auslaufhygiene

war statistisch signifikant mit einem vermehrten Auftreten dieser umweltassoziierten Erreger

verbunden (p=0,006). Außerdem waren sie vermehrt bei Kühen mit schlechter

Zitzensauberkeit nachweisbar (p=0,0311). Die Äskulin-positiven Streptokokken waren

häufiger mit hohen Zellzahlen und einem prall-elastischen Euterpalpationsbefund

vergesellschaftet als mit niedrigeren Zellzahlen und anderen Palpationsbefunden (p<0,0001).

79

Tab. 15 Übersicht über Prävalenzen von den coliformen Keimen, KNS und Corynebacterium

spp. in Abhängigkeit von der Betriebsform, dem Melksystem und dem Vormelken. Es wurden

nur statistisch signifikante Werte aufgeführt (p≤ 0,05).

coliforme Keime KNS Corynebacterium spp.

Spezialisierte Betriebe 5,4% 20,5% 7,7%

Halbspezialisierte Betriebe 12,1% 13,3%

Familienbetriebe 2,0% 20,7% 21,2%

Handmelken 23,3% 9,2%

Mobile Eimermelkanlage 9,7% 7,9%

Stationäre Eimermelkanlage 17,9% 28,4%

Rohrmelkanlage 14,9% 12,8%

Kein Vormelken 22,3%

Vormelken 13,2%

80

5 Diskussion

5.1 Hygienische Verhältnisse von Ausläufen und Melkständen Die Beurteilung der Sauberkeit der Ausläufe gibt einen Hinweis auf den auf die Kuh

wirkenden Erregerdruck. Als hohen Keimdruck bezeichnet man eine starke Ansammlung von

Bakterien in der Umwelt der Tiere. Dazu gehört auch die Sauberkeit des Melkstandes. Wird

dieser nicht nach jedem Melken gereinigt, kommt es zu einer Ansammlung und eventuell zu

einer Vermehrung von Bakterien, durch welche der auf die Tiere einwirkende Keimdruck

ansteigt. Stresssituationen, unausgeglichene Fütterung, schlechte Stall- und Melkhygiene wie

auch geschwächte Abwehrreaktionen begünstigen Manifestationen von Euterinfektionen

(KIELWEIN 1994). Die Beurteilung der Betriebe zeigte, dass in 60,6% die Sauberkeit der

Ausläufe als mäßig bis schlecht anzusehen ist. Die von den Betriebsleitern bei der Befragung

angegebenen Reinigungsintervalle waren in den meisten Fällen zu lang. Durch die fehlenden

Ablaufmöglichkeiten für Regenwasser kommt es in der Regenzeit häufig zu extrem

matschigen Böden, wodurch eine Kontamination der Zitzen häufig unvermeidbar wird.

Zusammen mit der häufig ungenügenden Reinigung der Zitzen vor dem Melken besteht

hierbei eine lebensmittelhygienische Problematik. In der Sommerzeit besteht der Bodenbelag

vieler Ausläufe überwiegend aus eingetrocknetem Kot. Ähnlich sieht die Situation auf den

Melkplätzen aus: Zum Zeitpunkt des Melkvorgangs sind nur bei drei (9,1%) Betrieben die

Melkplätze als sauber einzustufen. In vielen Betrieben besitzen die Melkplätze keinen

befestigten, leicht zu reinigenden Boden. Häufig ist der feuchte Boden mit einem Gemisch

aus Futterresten, Einstreu und Dung bedeckt. Eine den Melkvorgang abschließende Reinigung

bzw. Desinfektion des Melkbereiches findet gar nicht bzw. nur oberflächlich statt. Durch

diese Gegebenheiten muss von einer starken Keimansammlung und -vermehrung auf dem

Boden ausgegangen werden. Diese ist insbesondere bei gleichzeitigem Vormelken auf den

Boden, wobei Milch vom Boden an die Zitzen zurückspritzen kann, als kritisch für den

Eutergesundheitszustand einer Herde anzusehen. Es muss daher davon ausgegangen werden,

dass die Mastitissituation in Jalisco mit der ungenügenden Haltungs- und Melkstandhygiene

im direkten Zusammenhang steht und durch eine Behebungung dieses und weiterer Mängel

verbessert werden könnte. Diese Ergebnisse sind typisch für Länder ohne

Masitiskontrollprogramme. So stufte FRESE (2003) die allgemeine Farmhygiene in

äthiopischen Betrieben in 43% als schlecht ein. Nur 19% der Farmen wurde die generelle

Hygiene als gut eingestuft.

81

5.2 Vorkommenshäufigkeit subklinischer und klinischer Mastitiden

Von den 2937 vorliegenden CMT-Ergebnissen zeigten 62,9% ein positives und von diesen

37% ein deutlich bis stark positives Ergebnis. Nach GRAY und SCHALM (1962) liegt der

Produktionsverlust bei einem einfach, mittel oder stark positivem CMT-Ergebnis in etwa bei

10%, 16% bzw. 24%. Dies zeigt, dass die Mehrzahl der mexikanischen Betriebe weit unter

ihrem möglichen Potential produzieren.

Ein Vergleich mit Ergebnissen aus anderen Regionen Mexikos zeigt, dass dieser Wert

durchaus typisch für die Milchwirtschaft in Mexiko ist. So zeigte JUÁREZ et al. (1980), dass

im Gebiet Valle de México eine Inzidenz der subklinischen Mastitis von 78% herrschte.

AVILA et al. (1991) konnten bei Zweinutzungsrindern in den feucht-tropischen Zonen

Mexikos eine Inzidenz von 39,7% nachweisen. Ferner untersuchten AVILA et al. (2001)

1092 Viertel in Xochimilco und fanden eine Inzidenz der subklinischen Eutererkrankungen

von 34%. DOMÍNGUEZ (1996) sammelte über 5 Jahre Daten aus ganz Mexiko und schätzt

die Inzidenz der subklinischen Mastitis im gesamten Land auf etwa 50%.

Auch beim Vergleich dieses Wertes mit in anderen Ländern gefundenen Daten zeigt sich,

dass die hohe Mastitisinzidenz keineswegs ungewöhnlich ist. PUIG DE CENTORBI et al.

(1992) untersuchten 652 Viertel in Argentinien, von denen 131 (80,3%) ein positives und

hiervon immerhin 46,6% ein deutlich bis stark positives CMT-Ergebnis zeigten. FRESE

(2003) konnte subklinische Mastitiden in äthiopischen Milchviehherden mit einer Prävalenz

von 52,7% nachweisen. LAFI et al. (1994) fanden bei ihrer Untersuchung von 63 Herden in

Jordanien, dass 60% der Viertel einen Milchzellgehalt von über 283.000 Zellen/ml aufwiesen.

THOMPSON und HOUSTON (1967) geben an, dass in Australien 50% aller untersuchten

Kuhviertel ein positives und hiervon 34% ein deutlich bis stark positives CMT-Resultat

zeigten. Diese Ergebnisse liegen ungefähr in der gleichen Größenordnung, wie der in Jalisco

gefundene Wert. Sie liegen jedoch weitaus höher als vorliegende Untersuchungsergebnisse

aus Finnland und Schweden, welche auf Kuhebene eine Inzidenz von 37 bzw. 30% angeben

(MYLLYS et. al. 1998; Swedish Dairy Association 2000). In Hessen betrug die

durchschnittliche Zellzahl der Anlieferungsmilch im Jahr 2004 176.000 Zellen pro ml Milch

(ADR 2004). Diese Differenzen können durch das vollständige Fehlen von

Eutergesundheitsprogrammen zum Untersuchungszeitpunkt in Mexiko, Argentinien,

Jordanien und in Australien sowie das mangelhafte Management bei der Viehhaltung sowie

die hygienischen Konditionen der Stalleinrichtungen erklärt werden. In Schweden, Finnland

und Hessen wurden zum Untersuchungszeitpunkt schon Eutergesundheitsprogramme

durchgeführt, wodurch die Mastitisinzidenz offensichtlich gesenkt werden konnte.

82

Bei der Beurteilung von nur auf CMT-Ergebnissen beruhenden Studien muss jedoch immer

berücksichtigt werden, dass der CMT zwar eine verlässliche indirekte Methode zur Schätzung

des Milchzellgehaltes von individuellen Vierteln darstellt, seine Probleme vor allem aber

darin liegen, dass seine Sensitivität unter anderem von der Subjektivität der anwendenden

Person abhängig ist. In der vorliegenden Studie wurde der CMT meist von einem häufiger

wechselnden Team mexikanischer Studenten der Tiermedizin oder Landwirtschaft

durchgeführt, weswegen von gewissen Schwankungen bei der Interpretation ausgegangen

werden muss.

Als indirekte Methode zur Bestimmung der Leukozytenzahl kann der CMT lediglich ein

Indikator für eine Zellzahlerhöhung durch eine Euterentzündung sein.

Bei der Interpretation der Ergebnisse muss ebenfalls in Betracht gezogen werden, dass der

von der DVG (2002) festgesetzte Grenzwert für Milchzellgehalte für mexikanische

Verhältnisse zu niedrig angesetzt sein könnte. So fand GIRAUDO et al. (1995) z. B. bei

seinen Untersuchungen in argentinischen Milchviehherden, dass der arithmetrische Mittelwert

bei bakteriologisch-negativen Vierteln bei 494.000 Zellen/ml lag. Auch GIANNEECHINI et

al. (2002) setzten für die Auswertung ihrer Ergebnisse in Uruguay den Schwellenwert für die

subklinische Mastitis auf 300.000 Zellen/ml, um den aktuellen Verhältnissen in Uruguay und

Südamerika besser gerecht zu werden. Laut FRESE (2003) ist ein Schwellenwert von 300.000

Zellen pro ml/Milch zu niedrig angesetzt, da die Zellzahlen auch offensichtlich gesunder

Euterviertel erhöht sind. PUIG DE CENTORBI et al. (1992) werteten bei ihren

Untersuchungen in Argentinien nur deutlich bis stark positive CMT-Ergebnisse als

subklinische Mastitiden. DOHOO und MEEK (1982) sowie BROLUND (1985) setzen die

Grenze, welche die eutergesunden von euterkranken Vierteln trennt, zwischen 200.000 und

500.000 Zellen/ml Milch. Für die vorliegende Arbeit wurde bereits ein einfach positiver CMT

als eine Sekretionsstörung gewertet. Dies war bei 62,9% der untersuchten Viertel vorhanden.

Wäre erst ein zweifach positives CMT-Ergebnis als Eutergesundheitsstörung gewertet

worden, wäre der Prozentsatz der betroffenen Viertel auf 37,7% gesunken.

Die klinische Mastitis wurde im Gegensatz zur subklinischen Mastitis nicht durch

Überschreitung eines bestimmten Zellzahlgrenzwertes, sondern durch visuell abnormales

Eutersekret und/oder ein vermehrt warmes, akut geschwollenes oder schmerzhaftes Euter mit

oder ohne Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens definiert. Die Untersuchungen zeigten,

dass 76 (2,5%) aller untersuchten Viertel zum Untersuchungszeitpunkt nach dieser Definition

an einer klinischen Mastitis erkrankt waren. AVILA et al. (2001) konnten 3,5% klinisch

erkrankte Euterviertel bei der Untersuchung von 273 Kühen in Xochimilco, Mexiko

83

nachweisen. ALARCǑN (1997) untersuchte die jahreszeitlichen Schwankungen des

Auftretens von klinischen Mastitiden bei in tropischen Regionen gehaltenen Milchviehherden

und konnte bei seinen Untersuchungen je nach Jahreszeit in 2,1 bis 6,5% der Viertel eine

klinische Erkrankung nachweisen.

Die eigenen Ergebnisse stimmen gut mit den Untersuchungen von DANIEL et al. (1982) in

Australien überein, die in 26 Herden in Queensland eine Viertelprävalenz von 2,6% fanden.

BISHI (1998) untersuchte Milchviehherden in Äthiopien und zeigte, dass 1,6% der

untersuchten Euter klinische Erkrankungsanzeichen zeigten. Mc CLURE et al. (1966) fanden

in Australien eine Erkrankungsrate an klinischer Mastitis von 3,4%. FRESE (2003) konnte in

äthiopischen Betrieben eine Prävalenz von nahezu 5% nachweisen. GIANNEECHINI et al.

(2002) stellten bei ihren Untersuchungen in Uruguay eine Inzidenz von 14,4 Fällen/100

Kuhjahren in Risiko fest. In Schweden, Norwegen und Dänemark wird die Inzidenz von

PLYM-FORSHELL et al. (1995) mit 21, 30 bzw. 56 Fällen/100 Kuhjahren in Risiko

angegeben, und liegt somit über den eigenen ermittelten Werten. Nach BARLTETT et al.

(1992) können Mastitisinzidenzen verschiedener geographischer Lokalisationen bzw. Länder

nur unter Vorbehalt miteinander verglichen werden, da die Unterschiede der Inzidenz der

klinischen Mastitiden in Milchviehherden mit vielen verschiedenen Faktoren wie z.B. dem

Klima, der Rasse, dem Produktionslevel und dem Herdenmanagement in enger Verbindung

stehen. Ferner müssen auch jahreszeitliche und ökologische Einflüsse berücksichtigt werden.

Wichtig ist auch, dass es unmöglich ist, die tatsächliche Inzidenz klinischer Mastitiden durch

eine einmalige Herdenuntersuchung festzustellen, da diese meist nur von kurzer Dauer sind

und deshalb nach der Gesundung und Elimination des Erregers schnell durch eine einzelne

Beprobung nicht entdeckt werden.

In Mexiko überwiegen mittlere bis hohe Zellgehalte in der Herdensammelmilch, und beim

direkten Vergleich mit den skandinavischen Ländern fällt eine weitaus niedrigeres Auftreten

klinischer Mastitiden auf. Diese negative Korrelation zwischen Zellgehalt der Tankmilch und

der Inzidenz klinischer Mastitiden zeigten bereits ERSKINE et al. (1998), die in Herden mit

niedrigem Tankmilchzellgehalt eine weitaus höhere Inzidenz klinischer Mastitiden

nachweisen konnten als in Herden mit hohen Tankmilchzellzahlen. Auch SCHUKKEN et al.

(1990) beschrieben, dass Farmen mit einem sehr geringen Tankmilchzellgehalt einen Anstieg

der klinischen Mastitisfälle mit einer hohen Prävalenz von E. coli-Infektionen zeigen.

84

5.3 Prävalenz der einzelnen Mastitiserreger Nach dem Ausstreichen auf Blutagar zeigten 53,8% der untersuchten

Viertelanfangsgemelksproben kulturell keinen Keimgehalt. Diese Rate liegt über den meisten

in der Literatur gemachten Angaben, lässt sich aber durch die Tatsache erklären, dass

keinerlei Vorselektion der zur bakteriologischen Untersuchung verwendeten Proben durch

z.B. den CMT stattfand, sondern sämtliche entnommene Proben bakteriologisch untersucht

wurden. So konnten THOMPSON und HOUSTON (1967) in zwei verschiedenen

Untersuchungsgruppen bei 41 bzw. 37% der Milchproben kein bakterielles Wachstum

nachweisen. Die Autoren untersuchten jedoch nur Proben, die mindestens eine einfach

positive Reaktion beim CMT zeigten, wodurch kein direkter Vergleich dieser Ergebnisse mit

den Resultaten der vorliegenden Untersuchung möglich ist. Vergleichbar ist hingegen das

Ergebnis von WILSON et al. (1997), die Milchproben von 108.312 Milchkühen in den

Staaten New York und Pennsylvania ebenfalls ohne Vorselektion untersuchten, und hierbei in

51,5% der Fälle kulturell-bakteriologisch keine Erreger isolieren konnten.

Die aus den Viertelgemelksproben Mastitis-kranker Kühe isolierten Erreger sind KNS 15,6%,

Corynebacterium spp. 14,0%, S. agalactiae 6,7%, S. aureus 5,9%, coliforme Keime 4,1%,

Streptococcus spp. 3,7% und sonstige Keime (Bazillus spp. Nocardia spp. Candida spp.)

1,7%. Diese Resultate unterscheiden sich substantiell von in anderen Ländern durchgeführten

Studien.

Einen ähnlichen prozentualen Anteil an KNS konnte in einer Studie von HARMON und

LANGLOIS (1989) aus Milchproben einer Milchviehherde in Kentucky mit 14,7% isoliert

werden. Auch FRESE (2003) konnten in seinen Studien in Äthiopien deutlich mehr fakultativ

pathogene Erreger als strikt euterpathogene Erreger nachweisen. Seine Nachweisraten der

KNS lagen je nach Betriebsform bei 12,1-39,4%. Auch BRAMLEY (1975) fand in einer

britischen Herde, in der kein Zitzendippen nach dem Melken praktiziert wurde, eine

Prävalenz von 13,4%, während er in einer anderen Herde, in der regelmäßig gedippt wurde,

eine Prävalenz von 6,3% nachweisen konnte. KUDINHA und SIMANGO (2002) konnten bei

ihrer Untersuchung von 406 Milchproben mit 22,9% bzw. 33,2% einen sehr hohen Anteil der

KNS an klinischen bzw. subklinischen Mastitiden feststellen. Gleichzeitig zeigten sie, dass

95% dieser Isolate aus Milchproben mit erhöhtem Zellgehalt isoliert wurden. Dies beweist,

dass die Isolate Auslöser von Euterparenchyminfekionen sind und nicht allein von

Strichkanalbesiedelungen stammen. Die hohe Isolierungsrate der KNS in der vorliegenden

85

Arbeit könnte durch den protektiven Effekt, welchen KNS gegenüber einer Superinfektion

mit E. coli, S. agalactiae und S. aureus ausüben sollen, erklärt werden. Interessanterweise

konnten nämlich in Herden mit hohen (bis 100%) Prozentsätzen an KNS kaum

majorpathogene Erreger nachgewiesen werden. In Herden, in denen überwiegend S. aureus

oder S. agalactiae nachgewiesen wurden, lag die Herdenprävalenz für KNS sehr viel

niedriger.

Zu ähnlichen Ergebnissen kam ABDELLA (1996) bei ihren Untersuchungen in mehreren

Milchviehherden in Äthiopien. Sie zeigte, dass die Präsenz von KNS das Wachstum potentiell

pathogener Keime hemmte und deswegen Viertel mit KNS-Nachweis weniger empfindlich

für eine Infektion mit majorpathogene Keimen waren. Die hohe Nachweisrate der KNS in

subklinisch erkrankten Vierteln zeigt jedoch auch, dass die KNS eine große Rolle als

Mastitiserreger spielen können.

Die eigenen Untersuchungen zeigten außerdem eine hohe Prävalenz von Corynebacterium

spp.. Die Rolle der Corynebakterien als Mastitiserreger ist nicht eindeutig geklärt.

ROBINSON und HARWOOD (1998) vertreten die Auffassung, dass Corynebacterium spp.

imstande sind Mastitiden auszulösen, während sie von anderen Autoren als opportunistische

Erreger und Bewohner des Strichkanals angesehen werden (RAINARD 1987). So sind die

Zellzahlen meist nur moderat erhöht und die Milchmenge, wenn überhaupt, geringgradig

reduziert. Corynebacterium spp. haben auch dadurch das Interesse geweckt, dass verschiedene

Autoren ihre protektive Wirkung in Bezug auf majorpathogene Mastitiserreger beschrieben.

So sollen mit C. bovis infizierte Viertel weniger anfällig gegen Infektionen mit

majorpathogenen Keimen sein als nicht infizierte (RAINARD 1987, LAM et al. 1997).

Hierdurch könnte sich die verglichen mit anderen Studien geringere Prävalenz von S. aureus

in der vorliegenden Studie erklären lassen.

Die hohe Prävalenz von S. agalactiae in der vorliegenden Kuhpopulation ist eine direkte

Reflexion des mangelhaften Herdenmanagements. So konnten KLOPPERT et al. (1999) in

Hessen zeigen, dass durch die Einführung geeigneter Mastitiskontrollprogramme die

Prävalenz von S. agalactiae in der kontrollierten Kuhpopulation auf einen Wert von 0,2%

gesenkt werden konnte. Auch in der Schweiz und in Finnland, zwei Ländern, in denen die

Milchhygiene weit fortgeschritten ist, konnten BUSATO (1997) bzw. MYLLYS et al. (1998)

nur eine Prävalenz von 0,8% bzw. 0,12% nachweisen. Deutlich höher ist die Nachweisrate in

Ländern, in denen keine gezielten Mastitiskontrollprogramme zur Anwendung kommen. So

86

lag die Prävalenz in Äthiopien nach WORKINEH et al. (2002) bei 7,4%, und

GIANNEECHINI et al. (2002) konnten für Uruguay eine Prävalenz von 11,3% feststellen.

Interessanterweise konnte in spezialisierten Betrieben Jaliscos, in denen eine konsequente

Melkhygiene betrieben wird, kein S. agalactiae nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse

unterscheiden sich deutlich von den Untersuchungen von FRESE (2003) in Äthiopien, der S.

agalactiae mehr als doppelt so häufig in großen periurbanen Milchbetrieben nachweisen

konnte als in kleinen urbanen Betrieben. Besonders hoch hingegen war die Prävalenz in den

Familienbetrieben, in denen Zitzendippen und antibiotisches Trockenstellen der Tiere kaum

bis keine Anwendung finden. S. agalactiae kann nach KEEFE (1997) mit Hilfe der

antibiotischen Blitztherapie und einer konsequenten Verbesserung der Melkhygiene schnell

und erfolgreich aus einem geschlossenen Bestand eliminiert werden.

Das in Jalisco nachgewiesene Vorkommen von S. aureus mit einem Anteil von 5,9% an den

gesamten Milchproben lag höher als Nachweisquoten in Herden mit einer niedrigen Zellzahl

der Herdensammelmilch und niedriger als Nachweisquoten in Herden mit sehr hohem

Tankmilchzellgehalt. WILSON et al. (1997) fanden bei ihren mehrjährigen Untersuchungen

in den USA eine S. aureus-Prävalenz von 9,1%. Eine ähnliche Nachweisrate fanden BISHI et

al. (1998) mit 9,5% der untersuchten Proben in Äthiopien. Wieder zeigt sich, dass in Ländern

mit guter Milchhygiene wie Finnland, dem Vereinigten Königreich und Hessen/Deutschland

relativ geringe Prävalenzen von 3,5 bzw. 3,0% (MYLLYS et al. 1998; KLOPPERT et al.

1999; MILNE et al. 2002) nachgewiesen werden konnten, während die Prävalenzen in

Ländern mit fehlenden Mastitiskontrollprogrammen deutlich höher liegen. FRESE (2003)

konnte in äthiopischen Betrieben eine Prävalenz von 15,8% nachweisen. Teilweise werden

sogar Prävalenzen von bis zu 34,2% in Zimbabwe oder sogar 38,5% in Australien

beschrieben (KUDINHA u. SIMANGO 2002; DANIEL et al. 1982). Eine mit Jalisco

vergleichbare Rate fand sich mit einer Prävalenz von 7,6% in Brasilien (BENITES et al.

2002). Ferner konnte eine statistische Abhängigkeit der Vorkommenshäufigkeit des Erregers

von der Zwischendesinfektion der Melkzeuge, der Anwendung von antibiotikahaltigen

Trockenstellern, dem Vormelken, der Einhaltung einer Melkreihenfolge, dem Dippen, der Art

der Euterreinigung und dem Zustand der Zitzengummis festgestellt werden. Durch

Optimierung all dieser Faktoren könnte die Prävalenz von S. aureus auch in Jalisco mit

Sicherheit erheblich gesenkt werden.

Die Makrorestriktionsanalyse der Gesamt-DNA von 27 S. aureus Stämmen aus 12 Betrieben

wurde zum Nachweis epidemiologischer Zusammenhänge innerhalb der einzelnen Betriebe

87

sowie zwischen den Betrieben durchgeführt. Nach KAPUR et al. (1995) ist ein besseres

Wissen über die Verteilung der infektiösen Stämme in den Milchviehherden für die

Entwicklung von Strategien zur Reduzierung der Infektionsverbreitung unerlässlich.

Die Untersuchungen zeigten, dass die Isolate von vier Betrieben (Betrieb 7, 23, 25, 31)

jeweils identisch waren und keine Unterschiede im Restriktionsmuster zeigten. Durch die

ebenfalls fehlende Variation der Bandenmuster innerhalb der Betriebe ist anzunehmen, dass

in jedem Bestand ein einzelner Bakterienklon für die Mastitissituation verantwortlich ist.

Diese Beobachtungen bestätigen Untersuchungen von ANNEMÜLLER et al. (1999) und

ZSCHÖCK et al. (1999), die die Kontagiosität der S. aureus-Mastitis ebenfalls mittels

Makrorestriktionsanalyse nachwiesen. So breitet sich ein einzelner Klon innerhalb der Herde

aus. Von diesen Klonen wird vermutet, dass sie aufgund eines erhöhten

Übertragungspotentials, einer gesteigerten Resistenz gegenüber den Abwehrmechanismen des

Wirtes und ihrer erhöhten Neigung im Wirt zu persistieren, eine erhöhte Virulenz besitzen. So

ist z.B. bekannt, dass Isolate des dominierenden Genotyps eine erhöhte Resistenz gegenüber

der bakteriziden Aktivität der neutrophilen Granulozyten aufweisen (SCHLEGELOVÁ et al.

2003).

Innerhalb des Betriebs 19 unterschieden sich die Muster durch ein Fragment. Dieses Ergebnis

ist laut GOERING (1998) zwar möglich, aber äußerst selten. So könnte die Deletion eines

DNA-Fragmentes mit beiden flankierenden Schnittstellen zum Verlust eines einzelnen

Fragmentes im PFGE-Muster führen. Die relative Sicherheit solcher genetischen „events“

lässt vermuten, dass die meisten beschriebenen Einzelfragmentdifferenzen in Wirklichkeit

Zweifragmentunterschiede sind, bei denen eines der Fragmente hinter einem gleich großen

versteckt ist. In Betrieb 27 zeigten die untersuchten Isolate Abweichungen in Form von zwei

Banden. Diese Differenz könnte nach GOERING (1998) durch Insertion bzw. Deletion eines

DNA-Sequenzabschnittes außerhalb einer SmaI-Schnittstelle hervorgerufen worden sein.

Diese Kulturen sind durch ihre geringen Differenzen vom Ursprungsklon innerhalb des

jeweiligen Betriebes als Subklone eines Makrorestriktionstyps zu werten. Die subklonale

Heterogenität ist nach ZADOKS et al. (2000) durch die zeitliche Evolution bedingt. Dieses

Phänomen wurde für humane S. aureus Stämme beschrieben (O´BRIEN et al. 1999). Die

Variation des genetischen Inhalts der Chromosomen von S. aureus kann mit dem Verlust von

nicht essentiellen, aber klinisch und epidemiologisch relevanten Genen wie z.B. Virulenz-

oder Resistenzgenen vergesellschaftet sein, wodurch sich das seltenere Vorkommen

bestimmter Klone erklären lässt (PREVOST et al. 1992; MATSUNAGA et al. 1993).

88

In den Betrieben 10, 12 und 22 zeigten die Isolate in der PFGE einen Unterschied von mehr

als fünf Banden. Nach BANNERMANN et al. (1995) werden Isolate mit mehr als drei

Unterschieden im Bandenmuster als unterschiedliche, nicht miteinander verwandte Stämme

angesprochen und daher unterschiedlichen Makrorestriktionstypen zugeordnet.

Die Mehrzahl der in den 12 Betrieben nachwiesenen Genotype konnte in mehreren Herden

gefunden werden. Dieses Phänomen zeigte sich auch in anderen Studien (AARESTRUP et al.

1995; FITZGERALD et al. 1997; ANNEMÜLLER et al. 1999; SU et al. 1999; ZADOKS

2000). Die genannten Autoren konnten jeweils eine limitierte Anzahl von dominierenden S.

aureus-Klonen sowohl innerhalb einer Herde als auch zwischen unterschiedlichen

Milchviehherden nachweisen. Dies lässt annehmen, dass bestimmte in der Umwelt

vorkommende Varianten einen Vorteil für die Auslösung einer intramammären Infektion

besitzen. Nach AARESTRUP et al. (1995) und MULLARKY et al. (2001) haben sie

außerdem eine höhere Resistenz gegenüber dem Immunsystem des Wirtsorganismus. Solche

Klone haben nach FITZGERALD et al. (1997) eine weite geographische Verbreitung, die

ihnen durch besondere Faktoren für eine effektive Verbreitung in der bovinen Umwelt

ermöglicht wird. So konnte eine limitierte Anzahl dominierender Typen in verschiedenen

Herden, Regionen, Ländern und sogar Kontinenten gefunden werden.

Meist lässt sich jedoch, wie auch bei den hier überprüften Betrieben, eine gewisse genetische

Heterogenität der Stämme innerhalb geschlossener Populationen nachweisen (MATTHEWS

et al. 1994; KAPUR et al. 1995; ANNEMÜLLER et al. 1999; FITZGERALD et al. 1997;

MYLLYS et al. 1997, SOMMERHÄUSER 2002). Selbst bei einzelnen Tieren oder innerhalb

eines Euterviertels können gelegentlich verschiedene S. aureus-Klone gefunden werden.

EL-SAYED et al. (im Druck) konnten unter den 17 auf SE-Toxingene untersuchten S. aureus-

Stämmen lediglich einen einzigen Stamm (5,9%) mit einem 580 bp Amplifikat für das SEI

Gen nachweisen. Keiner der untersuchten Stämme beherbergte Gene für die SEA, SEB, SEC,

SED, SEE, SEG, SEJ und das TSST-1.

Dieses Ergebnis überrascht nicht, wenn man es mit den Untersuchungsresultaten von PUIG

de CENTORBI et al. (1992) vergleicht. Diese fanden bei 27 Stämmen aus Argentinien kein

Enterotoxin- oder TSST-1 produzierendes Isolat. Die geographische Verteilung von

enterotoxinbildenden S. aureus-Stämmen ist weltweit sehr unterschiedlich. So zeigten

Untersuchungen in Dänemark, dass hier keine Enterotoxingene bei den S. aureus-Stämmen

nachgewiesen werden konnten, während sie in den übrigen skandinavischen Ländern recht

häufig vertreten waren (TOLLERSRUD et al. 2000). Da von den in Jalisco isolierten

89

Stämmen nur 17 Isolate auf ihr Enterotoxinbildungsvermögen untersucht worden sind, ist die

Untersuchung einer größeren Anzahl von Stämmen notwendig, um mit größerer Sicherheit

Aussagen über das Vorkommen von Enterotoxinbildnern in Mexiko und ihre

lebensmittelhygienische Bedeutung für die mexikanische Bevölkerung machen zu können.

Dies ist insbesondere in Anbetracht der hohen Rohmilchdirektvermarktung in Jalisco von

großer Bedeutung, da gezeigt werden konnte, dass die Prävalenz von S. aureus in

Familienbetrieben, bei denen der Verkauf von Rohmilch sehr verbreitet ist, besonders hoch

ist. Vor diesem Hintergrund muss ein potentielles gesundheitliches Risiko zumindest

vermutet werden.

Bei der Interpretation der Prävalenz der coliformen Keime muss nach GOLDBERG et al.

(1992) das Haltungsmanagement miteinbezogen werden. So konnten die Autoren

umweltassoziierte Bakterien bei Weidehaltung der Tiere seltener auf der Zitzenhaut

nachweisen als bei aufgestallten Tieren. Dieses Phänomen lässt sich durch das höhere

Expositionsrisiko der aufgestallten Tiere erklären, während bei weidenden Tieren die

bakterielle Kontamination der Zitzen geringer ist. Ein Risikofaktor liegt allerdings in den

häufig matschigen Weidearealen, an denen sich die Tiere vermehrt zusammenfinden. So

können morastige Areale an Wasserstellen, Eingängen oder Triebwegen zum Melkstand

durch vermehrte Zitzenkontamination zu einer erhöhten Inzidenz von Mastitiden mit

umweltassoziierten Erregern in Milchviehherden führen (SMITH u. HOGAN 1995). Eine

derartige Korrelation konnte anhand der eigenen Ergebnisse jedoch nicht gefunden werden. In

Jalisco konnten die coliformen Keime in der Trockenzeit doppelt so häufig nachgewiesen

werden wie in der Regenzeit. Ferner konnten sie in Familienbetrieben weitaus seltener isoliert

werden als in den halbspezialisierten und spezialisierten Betrieben. Dies lässt sich dadurch

erklären, dass coliforme Keime in Betrieben mit einem hohen Zellgehalt der

Herdensammelmilch infolge einer S. aureus bzw. S. agalactiae-Infektion, wie dies in den

Familienbetrieben häufig der Fall ist, keine so große Bedeutung haben wie in hygienisch

einwandfrei geführten Betrieben mit einem geringen Zellgehalt der Herdensammelmilch. Die

in Jalisco nachgewiesene Prävalenz von 4,1% korreliert mit Ergebnissen aus Äthiopien und

Zimbabwe, zwei Ländern mit einem ähnlich hohen Zellgehalt in der Anlieferungsmilch. Hier

konnten BISHI et al. (1992) bzw. KUDINAH et al. (2002) einen Anteil von 5,2% bzw. 5,4%

nachweisen. FRESE (2003) konnten bei seinen Untersuchungen in äthiopischen Betrieben gar

keine coliformen Keime nachweisen. In Schweden und Finnland, zwei Ländern mit hohem

Milchhygienestandard, konnten HALLEN-SANDGREN (2000) und MYLLYS et al. (1998)

90

coliforme Keime zu 1,5% bzw. 0,29% aus Milchproben von an subklinischer Mastitis

erkrankten Kühen isolieren. Erwähnt werden muss hierbei, dass die coliformen Keime zu

einem wesentlich höheren Anteil aus Milchproben von klinischen Mastitiden isoliert werden

können. So wiesen MILNE et al. (2002) aus Milchproben von klinischen Erkrankungen im

Vereinigten Königreich eine Prävalenz von 23% nach.

Äskulin-positive Streptokokken wurden in Jalisco nur zu 3,7% isoliert. Eine weitergehende

Identifizierung wurde an 45 Isolaten durchgeführt, wobei zu 35,6% Aerokokkenspezies, zu

26,7% Enterokokkenspezies und zu 24,4% S. uberis differenziert wurden. Aerokokken und

Enterokokken werden häufig als Kontamimaten angesehen. S. uberis hingegen gilt eindeutig

als umweltassoziierter Mastitiserreger. Eine mit Jalisco vergleichbare Nachweisrate wurde

von BISHI et al. (1998) mit einer Prävalenz von 3,8% in Äthiopien und von DANIEL et al.

(1982) mit 3,4% in Australien beschrieben. FRESE (2003) konnte in Äthiopien ebenfalls eine

S. uberis-Prävalenz von unter 5% nachweisen. In den Ländern mit konsequent durchgeführter

Milchhygiene haben die Äskulin-positiven Streptokokken in den letzten Jahren durch den

gravierenden Rückgang von S. agalactiae zahlenmäßig bzw. relativ an Bedeutung gewonnen.

So konnte S. uberis in Schweden und Hessen/Deutschland, zwei Ländern mit niedriger S.

agalactiae-Prävalenz, von HALLEN-SANDGREN (2000) und KLOPPERT et al. (1999) aus

6,4% bzw. 7,3% der Proben isoliert werden. In der Schweiz liegen die Prävalenzen für die

erste bzw. zweite Laktationshälfte nach BUSATO et al. (1997) bei 19,4 bzw. 15,6%.

S. dysgalactiae, Bazillus spp., Nocardia spp. und Candida spp. konnten nur ganz vereinzelt

(0,4%, 1,0%, 0,6% und 0,1%) aus den untersuchten Proben isoliert werden. Eine ähnlich

niedrige Prävalenz für S. dysgalactiae beschreibt lediglich MYLLYS et al. (1998) mit 0,08%

für Finnland. In den übrigen Ländern schwanken die Prävalenzen zwischen 1,6% in Brasilien

(BENITES et al. 2002) und 6,6% in Australien (DANIEL et al. 1982).

5.4 Melkhygiene und -technik Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass kontagiöse und umweltassoziierte Mastitiserreger

wie auch die so genannten minorpathogenen Bakterien in Mexiko weit verbreitet und am

Mastitisgeschehen beteiligt sind. Bei der Überprüfung der Betriebe zeigten sich

erwartungsgemäß viele Defizite insbesondere bei der Melkhygiene und der Melktechnik.

Nach THOMPSON und HOUSTON (1967) wirkt sich vor allem das Fehlen einer adäquaten

Melkhygiene auf eine schnelle Ausbreitung von Euterinfektionen aus. Die Milchviehhalter

91

der besuchten Betriebe waren im Allgemeinen unwissend über den Gesundheitsstatus ihrer

Herden, selbst wenn sehr hohe Infektionsraten vorlagen. Bei der Eingangsbefragung gaben

54% der Landwirte an, nur selten Probleme mit Mastitiden zu haben. 37,5% schätzen ihre

Mastitisproblematik als häufig ein, und immerhin 9,5% gaben an, dass ihre Kühe sehr häufig

an Euterentzündungen erkranken. Diese Selbsteinschätzung liegt fern der Realität von 62,9%

subklinischen und 2,5% klinischen Mastitiden zum Untersuchungszeitpunkt. Auch über den

bestehenden Zusammenhang von Hygiene, Zellzahlen der Einzeltiere und der Tankmilch

sowie der Milchleistung waren sich viele Tierhalter nicht bewusst. Die meisten Mastitiden in

Mexiko verlaufen subklinisch und werden daher keiner Behandlung zugeführt, weswegen die

sie verursachenden kontagiösen Erreger als Ansteckungsquelle für eutergesunde Kühe einer

Herde dienen. Die hohe Präsenz von subklinischen Reservoiren, das Fehlen eines

Gesundheitsmonitorings und das empirische Behandeln der klinischen Fälle zeigt große

Defizite im Management auf. Auch FRESE (2003) beschreibt in seinen Untersuchungen in

Milchviehbetrieben Äthiopiens das totale Fehlen von Kenntnissen über den Einfluss der

Melk-, Haltungs- und Stallhygiene sowie des Managements auf die Eutergesundheit, und

vermutet deswegen so hohe Mastitisprävalenzen in Äthiopien.

Da die Mehrzahl der mexikanischen Milchbetriebe mit halbextensiven und halbaufgestallten

Systemen geführt werden, und der Melkvorgang mit wenig bis keiner technischen Assistenz

durchgeführt wird, ist es sehr schwierig neue Praktiken vorzuschlagen und einzuführen.

Jedoch wurden die ungenügende Hygiene und das Herdenmanagement auf den meisten

Betrieben angesprochen. Eine Verbesserung der Mastitissituation in Jalisco wird nur durch

intensive Aufklärung der Betriebsleiter und Einführung von speziell auf die einzelnen

Betriebe angepassten Programmen zur Bekämpfung und Prävention der Mastitis zu erreichen

sein. Zur Erlangung und Sicherung einer stabilen Eutergesundheit müssen neben der

Melktechnik und Melkhygiene weitere Faktoren optimiert werden. Da die Haltung einen

entscheidenden Einfluss auf das Wohlbefinden der Tiere hat, sollte sie innerhalb der

gegebenen Voraussetzungen verbessert werden, einschließlich der Hygiene auf den Ausläufen

und in den Melkständen. Nur durch regelmäßige Beseitigung des Tierkotes kann der

Keimdruck nachhaltig gesenkt werden. Als weitere Maßnahme müssten die Tiere bedarfs-

und wiederkäuergerecht gefüttert werden, um ein Leistungsoptimum für jede einzelne Kuh zu

erreichen. Hierfür müssen Futteranalysen durchgeführt und anschließend der Bedarf jedes

einzelnen Tieres im jeweiligen Laktationsstadium berechnet werden. Insbesondere ein

Energie- oder Eiweißmangel beeinträchtigen die Abwehrkräfte des Gesamtorganismus und

des Euters. Wichtig ist der ständige Zugang zu Grundfutter guter Qualität. Die alleinige

92

Zufütterung von Kraftfutter während des Melkvorgangs stellt keine tiergerechte Lösung dar.

Besser wäre es, Kraftfutter häufig in kleinen Portionen auch außerhalb der Melkzeiten

anzubieten.

Eine fehlerhafte Melkarbeit und Melktechnik wirken sich ebenfalls negativ auf die

Eutergesundheit aus. Insbesondere die Melkzeuge müssen hygienische und technische

Mindestanforderungen erfüllen. In Jalisco waren jedoch viele Melkmaschinen veraltert und

wurden über Jahre nicht auf ihre Funktionstüchtigkeit hin überprüft. Als weiterer wichtiger

Bestandteil sollten die Zitzengummis mindestens zweimal im Jahr gewechselt werden, da

diese nach spätestens diesem Zeitraum ihre Elastizität verlieren. Sind sie überaltert bilden sich

Risse auf der Gummioberfläche, die keine ausreichende Reinigung ermöglichen, wodurch es

zu einer Keimansammlung kommt. Überalterte Zitzengummis beeinträchtigen direkt den

Zustand der Zitzen. Die Auswertung der Daten zeigte, dass die Prävalenz für S. aureus in

Herden mit Zitzengummis in sehr guten Zustand bei 2,9%, in Herden mit Zitzengummis in

nur ausreichendem Zustand jedoch bei 12,6% lag. Der Boden des Melkplatzes sollte befestigt

sein, so dass er mit Wasser gereinigt anschließend abtrocknen kann. Eine ausreichende

Wasserversorgung hierfür ist auch in der Trockenzeit sicherzustellen.

Nur durch eine optimale Melkhygiene können Ausbreitung und Vermehrung von

Mastitiserregern innerhalb einer Herde verringert werden. Für jeden Betrieb müssen die

einzelnen Maßnahmen auf das vorliegende Erregerspektrum, die örtlichen Begebenheiten und

Möglichkeiten angepasst werden. Die statistische Auswertung der Daten konnte zeigen, dass

die Prävalenz von S. aureus in Betrieben mit einer festen Melkreihenfolge bzw. mehreren

Melkgruppen signifikant geringer war als in Herden ohne Melkreihenfolge. Für die

Durchführung dieser Maßnahme ist die Herde in mindestens zwei Gruppen mit eutergesunden

bzw. mit kontagiösen Mastitiserregern infizierten Tieren aufzuteilen, und die eutergesunden

Tiere sind stets vor den kranken Tieren zu melken.

Des Weiteren konnten statistisch signifikant geringere Prävalenzen kontagiöser

Mastitiserreger in Herden in denen regelmäßig vorgemolken wird, gefunden werden.

Besonders niedrige Prävalenzen waren vorhanden, wenn dafür ein Vormelkbecher verwendet

wurde. Der große Nutzen des Vormelkbechers ist bei konsequenter Anwendung die

Verhinderung der Kontamination des Melkplatzbodens mit Mastitiserregern. Ferner können

durch diese zweimal tägliche Kontrolle klinische Entzündungen schnell erkannt und adäquat

behandelt werden. Auf diese Weise werden die Tiere schnell als Erregerreservoire

identifiziert. Auch die Euterreinigung zeigte sich als wichtige Einflussgröße auf die Prävalenz

mit kontgiösen Mastitiserregern. Diese wurde in vielen Betrieben nicht optimal durchgeführt.

93

Auf keinen Fall darf dasselbe Tuch für mehrere oder gar alle Kühe einer Herde benutzt

werden. Selbst wenn das Tuch in Desinfektionslösung eingelegt wird, ist mit einer

erheblichen bakteriellen Kontamination zu rechnen. Stattdessen muss für jede Kuh ein

frisches Reinigungstuch verwendet werden. Bei geringgradiger Verschmutzung reicht meist

eine trockene Reinigung der Zitzen. Angetrocknete Kotreste müssen sowohl zum Schutz der

Kuh als auch aus lebensmittelhygienischer Sicht restlos entfernt werden. Wird zum Reinigen

Wasser verwendet, so müssen die Euter und Zitzen anschließend auf jeden Fall getrocknet

werden, bevor die Melkzeuge angesetzt werden. Die Daten zeigten, dass die höchste S.

aureus-Prävalenz in den Herden nachgewiesen werden konnte, in denen die Zitzen zum

Melkzeitpunkt noch nass waren. In Herden ohne jegliche Euterreinigung ließ sich S. aureus

mit einer Prävalenz von 11,1% nachweisen, während je nach angewendeter

Reinigungsmethode Prävalenzen zwischen 3,1 und 7,6% auftraten. In Beständen mit

kontagiösen Mastitiserregern empfiehlt sich außerdem die Zwischendesinfektion der

Melkzeuge nach jeder gemolkenen Kuh (DVG 2002). Dies konnte durch den statistisch

signifikanten Unterschied der Nachweishäufigkeit von S. aureus bzw. S. agalactiae von 6,2%

bzw. 8,1% ohne Desinfektion zu 5,5% bzw. 3,8% mit Desinfektion belegt werden.

Einen weiteren wichtigen Faktor der Mastitiskontrolle stellt das Zitzendippen dar (HOGAN et

al. 1987). Hierbei werden direkt nach der Abnahme des Melkzeuges Mastitiserreger auf den

Zitzen sämtlicher Tiere durch Zitzentauchen in eine geeignete Desinfektionslösung abgetötet.

Das Dippmittel ist hierbei mindestens einmal täglich zu erneuern (ZSCHÖCK et al.1998).

Alle Kühe eines Betriebes müssen 6-8 Wochen vor dem Abkalben trockengestellt werden.

Das schlagartige Trockenstellen von einer Melkzeit auf die andere ist hierfür die Methode der

Wahl (ZSCHÖCK et al 1998). Das in vielen mexikanischen Betrieben bevorzugte langsame

Trockenstellen durch das Überspringen von Melkzeiten bei gleichzeitiger Reduzierung der

Futtermenge ist nicht zu empfehlen. Sämtliche Tiere sollten außerdem unter antibiotischem

Schutz trockengestellt werden, wobei es zu einer Ausheilung subklinischer Euterinfektionen

und zur Senkung von Neuinfektionen kommt (ZSCHÖCK et al. 1998). Das Merzen

therapieresistenter Tiere ist für die Kontrolle und Prävention der Mastitis anzuraten (DVG

2002).

In Mexiko werden all diese Maßnahmen bisher nur sporadisch bzw. in vielen Betrieben

überhaupt nicht durchgeführt.

Zur Kontrolle der umweltassoziierten Mastitiserreger belegten die Daten, dass sich eine

vermehrte Auslaufhygiene und eine verbesserte Euterreinigung vor dem Melken als wirksam

erweisen. Die Prävalenz von S. uberis war interessanterweise in Betrieben mit Durchführung

94

der Melkzeugzwischendesinfektion geringer als in den übrigen Betrieben. Bei den coliformen

Keimen konnte ein positiver Einfluss durch Vormelken und Zitzentauchen gezeigt werden.

Die Auswertung der Daten in Bezug auf die Corynebacterium spp. zeigte, dass sie bei

Einhaltung einer Melkreihenfolge, bei Durchführung einer feuchten Euterreinigung mit

anschließendem Abtrocknen der Zitzen sowie bei gezieltem antibiotischem Trockenstellen

aller Tiere statistisch signifikant seltener nachweisbar waren.

Anhand der vorgeführten Verbesserungsvorschläge können für jeden einzelnen Betrieb

umsetzbare vorbeugende, kontrollierende und korrigierende Maßnahmen ausgearbeitet und

den Betriebsleitern unterbreitet werden, mit dem Ziel, Milch mit einem besseren hygienischen

und gesundheitlichen Status zu produzieren.

Der von uns in Mexiko bestimmte durchschnittliche Zellzahlwert von 623.000 Zellen/ml

Milch ist die direkte Folge der schlechten Mastitisprävention und –kontrolle. Auch wenn in

Mexiko einige Molkereien Zellzahlbestimmungen der Anlieferungsmilch durchführen und

langfristig den Aufkauf von Milch mit weniger als 200.000 Zellen/ml anstreben, gibt es

bislang noch keine mit der Milchgüte-Verordnung vergleichbare gesetzliche Verankerung der

Mindestanforderungen von Anlieferungsmilch in den Normas Oficial de México. Eine

gesetzliche Zellzahlobergrenze wie diese in Deutschland in der Milchverordnung vom 1. Juli

2000 festgesetzt ist, wäre vonnöten. Nur so können die Milchviehhalter zu einer verstärkten

Mastitiskontrolle, die letztendlich sowohl aus wirtschaftlicher, tierschützerischer als auch aus

lebensmittelhygienischer Sicht erforderlich ist, bewegt werden.

Die momentan gültigen offiziellen Normen bieten keine Grundlage für eine derartige

Forderung, jedoch könnte eine Aus- bzw. Überarbeitung der gängigen Normen den

Problemen Abhilfe schaffen. Es bleibt zu hoffen, dass das nationale Komitee für Normierung

mit der Umsetzung des Projektes PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2003, das die

physiochemischen und biologischen Eigenschaften der Rohmilch regeln soll, diesen

Anforderungen nahe kommen wird. Mit Hilfe einer neuen Norm könnte ein wichtiger Schritt

in Richtung Mastitisprävention und Verbraucherschutz in Mexiko erreicht werden.

95

6 Zusammenfassung

Sybille Petra Jäger

Untersuchungen zur Eutergesundheit in Milchviehbeständen des Bundesstaates Jalisco,

Mexiko

Ambulatorische und Geburtshilfliche Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der

Universität Leipzig

und

Abteilung Veterinärmedizin des Landesbetriebes Hessisches Landeslabor, Gießen

Eingereicht im März 2006

(116 S., 6 Abb., 15 Tab., 242 Lit., Anhang mit 13 Abb., 2 Tab.)

Schlüsselworte: Eutergesundheit, Mastitisinzidenz, Jalisco, Mexiko, Erregerprävalenzen,

Zytobakteriologie, PCR, Pulsfeldgelelektrophorese, Toxine, Melkhygiene,

Sanierungsmaßnahmen.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, das Vorkommen subklinischer und klinischer

Eutergesundheitsstörungen in 33 Milchviehherden in Jalisco, Mexiko, aufzuzeigen. Von 2937

mittels CMT untersuchten Eutervierteln zeigten 1996 (66,9%) eine positive und hiervon 1087

(37%) eine deutlich bis stark positive Reaktion. Im Abgleich mit den bakteriologischen

Untersuchungen ergab sich eine Prävalenz an subklinischen Mastitiden in Höhe von 43,7%.

Klinische Mastitiden ließen sich zu 2,5% nachweisen.

53,8% der untersuchten Milchproben zeigten bakteriologisch keinen Keimgehalt. Aus den

übrigen Proben konnten zu 15,6% KNS, 14,0% Corynebacterium spp. 6,7% S. agalactiae,

5,9% S. aureus, 4,1% coliforme Keime, 3,7% Streptococcus spp. und 1,7% sonstige Keime

(Bacillus spp., Nocardia spp., Candida spp.) isoliert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass

neben den kontagösen Mastitiserregern wie S. aureus und S. agalactiae minorpathogene

Erreger zu einem hohen Anteil am Mastitisgeschehen in Jalisco beteiligt sind.

Mit Hilfe der Pulsfeldgelelektrophorese konnte gezeigt werden, dass in jedem der Betriebe, in

denen S. aureus isoliert werden konnte, überwiegend ein einzelner Genotyp für das

Mastitisgeschehen verantwortlich war. Die betriebsspezifischen Genotypen zeigten

überwiegend eine enge Verwandtschaft zu den Genotypen aus anderen Betrieben. Hierdurch

konnte der kontagiöse Charakter dieses Mastitiserregers und ein dominierendes Vorkommen

bestimmter S. aureus-Klone belegt werden.

96

Durch die Besichtigung der Betriebe und Befragung der Betriebsleiter konnten Defizite in der

Haltungs- und Melkhygiene aufgezeigt werden. Sie korrelierten statistisch signifikant mit

erhöhter Mastitisprävalenz und mit erhöhten Nachweisraten von kontagiösen

Mastitiserregern. Vorbeugende, kontrollierende und korrigierende Maßnahmen wurden

vorgeschlagen und erörtert. Durch die genannten Programme zur Vorbeuge und Kontrolle der

Mastitis könnte die Milchproduktion in Jalisco und Mexiko um bis zu 20% gesteigert und

somit das starke Defizit des mexikanischen Milchsektors sowie die hohen

Milchpulverimportmengen minimiert werden. Da die verminderte bakteriologische Qualität

der Milch von an subklinischer Mastitis erkrankten Kühen außerdem, insbesondere vor dem

Hintergrund des hohen Rohmilchkonsums, ein mögliches gesundheitliches Risiko für den

Verbraucher darstellt, wurden 17 der aus den Betrieben isolierten S. aureus-Isolate auf ihr

Toxinbildungsvermögen und ihre Toxin-Genmuster hin untersucht. Nur bei einem Stamm

konnte ein Amplifikat für das SEI Gen nachgewiesen werden. Keiner der untersuchten

Stämme beherbergte Gene für die SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG, SEJ und das TSST-1.

Trotz dieser geringen Nachweisrate sollte in Mexiko durch Einführung eines konsequent

durchgeführten Mastitiskontrollprogramms Milch mit einer höheren hygienischen Wertigkeit

produziert und somit das vom Lebensmittel Milch für den Verbraucher ausgehende

gesundheitliche Risiko reduziert werden.

97

7 Summary

Sybille Petra Jäger

Investigations on the udder health in dairy herds of the federal state Jalisco, Mexico.

Large Animal Clinic for Theriogenology and Ambulatory Services, Faculty of Veterinary

Medicine, Universitiy of Leipzig

and

Abteilung Veterinärmedizin des Landesbetriebes Hessisches Landeslabor, Gießen 2006

Submitted in March 2006

(116 pages, 6 figures, 15 tables, 242 lit; appendix with 13 figures, 2 tables)

Keywords: udder health, mastitis incidence, Jalisco, Mexico, pathogen prevalences,

cytobacteriology, PCR, pulsed-field gel electrophoresis, toxins, milking hygiene, control

programs.

Aim of the present work was to prove the occurrence of subclinic and clinic disturbances of

udder health in 33 herds of dairy cattle in Jalisco, Mexico. 1996 (66.9 %) out of 2937 udder

quarters examined by means of CMT showed a positive reaction, 1087 (37%) out of these

reactions were from clearly up to significantly positive reactions. Compared to the

bacteriological examinations the prevalence for subclinic mastitides came up to 43.7%. On

the other hand clinical mastitides could be proved in 2.5%.

In 53.8% of the examined quarter milk samples there was no bacteriological pathogen

content. From the rest of the samples we could isolate CNS (15.4%), Corynebacterium spp.

(13.9%) S. agalactiae (6.6%), S. aureus (5.8%), coliform pathogens (3.6%) and others

(Bacillus spp., Nocardia spp., Candida spp.) (1.7%). These results demonstrate a significant

share of minor pathogens beside contagious mastitis pathogens as S. aureus and S. agalactiae

in masititis incidents in Jalisco.

By means of the pulsed-field-gel-electrophoresis we proved that in each of those farms where

S. aureus had been isolated, only one genotype was responsible for mastitis incidents. The

farm specific genotypes mostly showed a close relationship to the genotypes of other farms.

Therefore the contagious character of mastitis pathogens and the dominating occurrence of

certain S. aureus clones could be proved.

By inspecting the farms and questioning work managers deficits in hygienic keeping and

milking could be demonstrated. Statistically they correlate significantly with an increased

mastitis prevalence and increased proving rates of contagious mastitis pathogens.

Prophylactic, controlling and correcting measurements were supposed and discussed. Those

98

prophylactic and controlling programmes for mastitis could elevate milk production in Jalisco

and Mexico by up to 20% and therefore reduce the large deficit in the Mexican milk sector as

well as the large amount of import of powdered milk. The decreased bacteriological quality of

milk of cows with subclinical mastitis means a possible health risk for the consumer,

especially considering the consumption of raw milk. Therefore 17 S. aureus isolates of those

farms were examined according to their toxigenic ability and their toxin gene pattern. Only in

one strain an amplification for the SEI gene could be proved. None of the examined strains

contained genes for SEA, SEB, SEC, SED SEE, SEG, SEJ and TSST-1.

In spite of this low proving rate milk of a higher hygienic value should be produced in

Mexico by introducing a mastitis controlling programme carried out consequently and thereby

reducing the health risk of milk as a comestible for the consumer.

99

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I

Anhang Zusammensetzung der Reagenzien und Nährböden: Standard-Schalm-Reagenz nach Christ:

Natrium-Dodecylsulfat 160 g

Harnstoff 960 g

Aqua dest. 4000 ml

Phenolphataleinlösung 2 ml

Blutagar-Basis (Merck, Darmstadt, Deutschland):

Herzextrakt 10,0 g

Tryptose 10,0 g

NaCl 5,0 g

Agar 15,0 g

Aqua dest. 1000 ml

McConkey-Agar (Oxoid GmbH, Wesel, Deutschland):

Pepton 20,0 g

Laktose 10,0 g

Bile Salz 5,0 g

Neutralrot 0,075 g

Agar 12,0 g

Aqua dest. 1000 ml

pH 7,4 +/- 0,2

SIM-Medium von Merck (Darmstadt, Deutschland):

Pepton aus Casein 20,0 g

Pepton aus Fleisch 6,6 g

Ammoniumeisen (III)- Citrat 0,2 g

Natriumthiosulfat 0,2 g

Agar Agar 3,0 g

Aqua dest. 1000 ml

pH 7,3 +/- 0,2

II

Sabouraud-2%-Glucose-Agar (Merck, Darmstadt, Deutschland):

Pepton 10,0 g

D (+)-Glucose 20,0 g

Agar 17,0 g

Aqua dest. 1000 ml

pH 5,6 +/- 0,2

Todd-Hewitt-Bouillon (THB; Oxoid GmbH, Wesel, Deutschland):

Hirn-, Herzextrakt und Peptone 27,5 g

Glucose 2,0 g

Natriumchlorid 5,0 g

Dinatriumhydrogenphosphat 2,5 g

Aqua dest. 1000 ml

pH 7,4 +/- 0,2

TE-Puffer:

Tris-HCl (10mmol/l) 1,21 g

EDTA (1mmol/l) 372,5mg

Aqua dest. 1000 ml

pH 7,6

III

Abb. 7 Beispiel für einen sauberen Auslauf bei reiner Auslaufhaltung (Note 2)

Abb. 8 Beispiel für einen ungenügenden sauberen Auslauf (Note 4)

IV

Abb. 9 Melkstand mit Rohrmelkanlage eines spezialisierten Betriebs

Abb. 10 Typischer Melkstand mit Fangfressgittern und Rohrmelkanlage der halbspezialisierten Betriebsformen

V

Abb. 11 Mobile Eimermelkanlage mit Motor in einem Familienbetrieb

Abb. 12 Typische familiäre Hinterhofhaltung

VI

Tab. 16 Mastitiserregerprävalenzen der untersuchten Betriebe

Betrieb S. aureus S. agalactiae KNS spp. Csp spp. Streptococcus spp.

ColiformeKeime

blinde Viertel

Bakteriol. positive Proben

1 0% 0% 25% 29% 6% 4% 0% 62% 2 0% 0% 10% 0% 0% 0% 0% 10% 3 0% 8% 13% 3% 3% 2% 0% 16% 4 0% 0% 35% 2% 1% 3% 1% 43% 5 8% 16% 31% 9% 3% 1% 5% 67% 6 2% 2% 13% 38% 6% 0% 2% 55% 7 44% 9% 15% 2% 0% 7% 1% 68% 8 5% 5% 65% 0% 3% 0% 0% 75% 9 5% 12% 17% 8% 1% 9% 1% 43%

10 19% 8% 30% 21% 0% 5% 5% 76% 11 0% 0% 9% 9% 5% 0% 0% 23% 12 10% 10% 3% 13% 2% 3% 0% 42% 13 0% 0% 7% 20% 4% 4% 0% 36% 14 0% 0% 18% 4% 6% 8% 0% 34% 15 2% 0% 27% 14% 1% 8% 0% 52% 16 4% 0% 7% 4% 8% 4% 2% 30% 17 1% 10% 7% 29% 3% 12% 2% 58% 18 0% 26% 11% 7% 2% 7% 4% 69% 19 13% 0% 6% 40% 1% 3% 0% 61% 20 2% 38% 16% 16% 5% 2% 0% 71% 21 0% 1% 3% 3% 6% 5% 0% 28% 22 13% 8% 8% 8% 12% 7% 0% 50% 23 5% 13% 8% 13% 6% 3% 1% 48% 24 1% 1% 8% 8% 2% 4% 1% 30% 25 27% 0% 13% 50% 6% 4% 2% 88% 26 0% 0% 59% 0% 6% 0% 3% 61% 27 25% 14% 5% 2% 2% 7% 2% 51% 28 0% 0% 6% 23% 2% 4% 1% 32% 29 1% 0% 21% 2% 2% 7% 0% 35% 30 1% 24% 15% 47% 5% 0% 0% 77% 31 5% 3% 12% 3% 3% 1% 2% 22% 32 3% 3% 15% 15% 3% 3% 0% 47% 33 3% 0% 14% 10% 3% 3% 0% 32%

VII

Tab. 17 Übersicht über einige auf den 33 Betrieben erfassten Daten

In der Tabelle verwendete Abkürzungen: Betriebsform: 1 spezialisiert 2 halbspezialisiert 4 Familienbetrieb Haltungsform: 1 Auslauf 2 Weide Hygiene des Auslaufs bzw. der Melkzeuge:

1 sehr gut 2 gut 3 befriedigend 4 ausreichend

Melksystem:

1 Handmelken 2 Eimermelkanlage mobil 3 Eimermelkanlage stationär 4 Rohrmelkanlage

Vormelken:

0 Kein Vormelken 1 auf den Boden 2 mit Melkbecher

Euterreinigung:

0 keine Reinigung 1 trockene Reinigung mit Papier 2 feuchte Reinigung mit nachfolgendem Abtrocknen mit Papier 3 feuchte Reinigung ohne Abtrocknen

Melkreihenfolge:

0 keine 1 feste Melkreihenfolge 2 Kühe werden in verschiedenen Gruppen gemolken

Zwischendesinfektion:

0 nein 1 ja

Dippen: 0 kein Dippen 1 Dippen nach dem Melken mit Jodlösung 2 Dippen vor und nach dem Melken mit einer Reinigungs- bzw. mit einer Jodlösung

VIII

Trockenstellen: 0 langsam mit übersprungenen Melkzeiten und Futterreduzierung 1 wie oben jedoch mit Verwendung eines antibiotischen Trockenstellers 2 von einer Melkzeit auf die andere ohne Trockensteller 3 von einer Melkzeit auf die andere mit Trockensteller 4 nur nach vorheriger Euterkontrolle mittels CMT

IX

X

M 1 2 3 4 5 6 7 Abb. 13: Amplifikate des speziesspezifischen Bereichs des 23S rRNA-Gens von S. aureus mit einem einheitlichen Amplifikat von 1270 Basenpaaren. M = Marker. Als Negativkontrolle wurde in Reihe 1 oben S. epidermidis mitgeführt, der kein Amplifikat erzeugte.

1270-

900-

600-

100-

300-

Bp

1500-

XI

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Abb. 14: Amplifikate des 16 S rRNA-Gens von 10 S. agalactiae-Isolaten mit einer

einheitlichen Größe von 1250 Bp. Als Negativ-Kontrolle wurde auf Postion 1 ein S. canis-

Stamm mitgeführt, der kein Amplifikat erzeugte.

M 1 2 3 4 5 6 7

Abb. 15: Amplifikate des speziesspezifischen Bereichs des 16S rRNA-Gens von S. uberis mit

der einheitlichen Größe von 445 Bp (Reihe 1, 4, 5, 7). Hiermit konnte nachgewiesen werden,

dass es sich bei den positiven Kulturen um Isolate von S. uberis handelt. Die übrigen Kulturen

(Reihe 2, 3, 6) ohne Amplifikat gehörten anderen Streptokokkenspezies wie z.B.

Enterococcus faecalis oder S. bovis an, weswegen unter Verwendung der Primer ub І und ub

ІІ keine Amplifizierung der entsprechenden Region möglich war.

1250-

1500-

Bp

900-

600-

300-

100-

900-

1500-

600- 445-

300-

100-

Bp

XII

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Abb. 16: PFGE-Restriktionsmuster der chromosomalen DNA von 9 S. aureus-Isolaten nach Verdau mit dem Restriktionsenzym SmaI; (1-2: Isolate aus Betrieb 7, 3-6: Isolate aus Betrieb 19, 7-9: Isolate aus Betrieb 25); M= Längenstandard (Low Range PFGE Marker, 0,1-200 Kb, Lambda-Ladder PFGE Marker, 50-1000 Kb, Sigma).

XIII

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Abb. 17: PFGE-Restriktionsmuster der chromosomalen DNA von 9 S. aureus-Isolaten nach Verdau mit dem Restriktionsenzym SmaI; (1-3: Isolate aus Betrieb 22, 4-5: Isolate aus Betrieb 27, 6-7: Isolate aus Betrieb 23, 8-9: Isolate aus Betrieb 12); M= Längenstandard (Low Range PFGE Marker, 0,1-200 Kb, Lambda-Ladder PFGE Marker, 50-1000 Kb, Sigma).

XIV

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Abb. 18: PFGE-Restriktionsmuster der chromosomalen DNA von 9 S. aureus-Isolaten nach Verdau mit dem Restriktionsenzym SmaI; (1-2: Isolate aus Betrieb 10 (liefen in diesem Lauf nicht), 3-4: Isolate aus Betrieb 9, 5: Isolat aus Betrieb 20, 6-8: Isolate aus Betrieb 31, 9: Isolat aus Betrieb 33); M= Längenstandard (Low Range PFGE Marker, 0,1-200 Kb, Lambda-Ladder PFGE Marker, 50-1000 Kb, Sigma).

XV

Abb. 19 Landkarte von Jalisco, Mexiko mit eingezeichneten Milcherzeugerbetrieben (Betriebe 1 und 11 liegen außerhalb der Karte)

16, 17, 32, 33

23

22 20

8, 10

18

14, 27, 28, 29

25

26 21

19

2, 3, 4, 5, 9, 13, 30, 31

7

6, 12

15

24

Zum Gelingen dieser Arbeit möchte ich mich bei folgenden Menschen bedanken: Dr. Wilfried Wolter und Dr. Bärbel Kloppert für die freundliche Überlassung des Themas, die Korrekturen und aufmunternden Worte. Prof. Dr. Hugo Castañeda und meinen mexikanischen Studenten für die nette Zusammenarbeit und tatkräftige Unterstützung bei der Probenentnahme in Mexiko. Hans-Peter Jung, Silke Zimmermann, Tanja Puchtinger und Jens Wiessner für die Einarbeitung in die verschiedenen Untersuchungsmethoden am Hessischen Landeslabor Gießen. Dr. Michael Zschöck und Prof. Dr. Axel Sobiraj für die Betreuung der Arbeit. Dr. Klaus Failing für die statistische Auswertung meiner Daten. Meinen Eltern und Freunden, ohne deren Unterstützung eine Fertigstellung dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Mein letzter Dank gilt dem DAAD für die finanzielle Unterstützung meines Aufenthaltes in Mexiko.