BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

…………***…………

VŨ THỊ THU LÊ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA LOÀI NÀNG NÀNG (CALLICARPA CANDICANS)

VÀ LOÀI TỬ CHÂU LÁ TO (CALLICARPA MACROPHYLLA)

Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên

Mã số: 9.44.01.17

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2020

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công

nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. Phạm Thị Hồng Minh

Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2. GS.TS. Phạm Quốc Long

Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phản biện 1: PGS. TS. Phan Minh Giang

Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học

Quốc gia Hà Nội

Phản biện 2: TS. Đỗ Hữu Nghị

Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Luận án đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp

Học viện họp tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Số 18

Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội.

Vào hồi ….. giờ…. ngày ….. tháng …. năm 2020

Có thể tìm luận án tại thư viện Quốc gia Việt Nam và thư

viện Học viện Khoa học và Công nghệ

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của luận án

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có nguồn thiên

nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu

quý. Việc sử dụng các loại thảo dược theo y học cổ truyền hay từ các

hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một

vị trí quan trọng trong nền y học. Những bài thuốc sử dụng thảo dược là

đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản

chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên, các kết quả nghiên cứu

sẽ góp phần giải thích rõ hơn về tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc

cổ truyền vẫn hay được sử dụng trong dân gian

Trên thế giới những nghiên cứu về các loài chi Callicarpa chủ

yếu tập trung nghiên cứu về: thực vật học, dược lý, hóa thực vật và lâm

sàng của nó. Nghiên cứu dược lý được thực hiện trên dịch chiết thô

hoặc các hợp chất tinh khiết cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng

truyền thống. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học chủ yếu tập trung

vào các hoạt tính: kháng viêm, cầm máu, mất trí nhớ, oxi hóa, kháng

khuẩn. Những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

trên thế giới chỉ ra rằng, các hợp chất diterpenoid và triterpenoid có

hoạt tính chống ung thư rất tốt mà các hoạt chất này là thành phần hóa

học phong phú nhất trong chi Callicarpa.

Việc nghiên cứu nhằm tìm ra những hoạt chất có ích của thực

vật đã và đang nhận được sự quan tâm của giới khoa học nhiều quốc

gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Đây cũng là lý do đề tài

“ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

loài Nàng nàng (Callicarpa candicans) và loài Tử châu lá to

(Callicarpa macrophylla ) ở Việt Nam.” được lựa chọn để nghiên cứu.

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ loài C.

candicans và loài C. macrophylla thu hái ở Việt Nam.

Đánh giá hoạt tính gây độc trên một số dòng tế bào ung thư:

gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) của các hợp chất sạch

phân lập được.

Nghiên cứu thành phần hóa học trong tinh dầu loài C.

candicans và loài C. macrophylla

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

2

1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lá loài C. candicans và loài C. macrophylla ở Việt Nam 2. Xác định thành phần hóa học tinh dầu của lá loài C. candicans và loài C. macrophylla ở Việt Nam bằng các phương pháp chưng cất lôi quấn hơi nước thông thường và phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng. 3. Đánh giá hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư (gan - HepG2, tiền liệt tuyến - PC3, phổi - A549) và kháng vi sinh vật kiểm định in vitro của tinh dầu thu được từ lá loài C. candicans và loài C. macrophylla . 4. Đánh giá hoạt tính gây độc trên ba dòng ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) in vitro của các hợp chất sạch phân lập được từ lá loài C. candicans và loài C. macrophylla

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

Phần tổng quan tài liệu là tập hợp các nghiên cứu trong nước và

quốc tế về các vấn đề:

1.1. Đặc điểm chung về thực vật học chi Callicarpa

1.2. Tác dụng dược lý của chi Callicarpa

1.3. Thành phần hóa học các thực vật chi Callicarpa

1.4. Hoạt tính sinh học các thực vật chi Callicarpa

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phần này mô tả chi tiết các quá trình xử lý mẫu, phương pháp

tạo cặn chiết, sắc ký và phân lập các hợp chất; xác định thành phần hóa

học của tinh dầu và các phương pháp thử hoạt tính sinh học.

2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.1. Mẫu thực vật

Lá, thân cành và quả loài Nàng nàng (Callicarpa candicans

(Burm.f.) Hochr.) và Tử châu lá to (Callicarpa macrophylla Vahl) thu

tại huyện Tam Đảo – Vĩnh Phúc vào tháng 10/2015 và huyện Đại Từ,

tỉnh Thái Nguyên vào tháng 10 năm 2017, được TS. Nguyễn Quốc

Bình (Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam - VAST) xác định tên khoa học,

mẫu số tiêu bản lưu tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam.

2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây

3

Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết của cây được thực

hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng

(TLC), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký

cột pha đảo với pha tĩnh là YMC RP 18 (Merck), sắc ký dây phân tử

với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck) và sắc ký điều chế pha tĩnh là

silica gel.

2.1.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các

thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại như: điểm nóng chảy

(Mp), độ quay cực ([α]D), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), phổ khối

lượng phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-

MS), phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân gồm phổ 1 chiều (1H-, 13C-NMR và DEPT) phổ 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC và NOESY).

2.2. Phương pháp chiết xuất tinh dầu

2.2.1. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng bộ cất tinh dầu vi lượng

2.2.2. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự hỗ trợ của vi sóng

2.2.3.Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu

Xác định thành phần hóa học của tinh dầu bằng cách kết hợp hệ

thống máy GC –MS với thư viện phổ chuẩn và phần mềm khóa thời

gian lưu Mass Finder 4.0.

2.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

Hoạt tính gây độc tế được thử nghiệm bằng phương pháp SRB trên

ba dòng ung thư: gan (Hep-G2), phổi (LU-1) và vú (MCF-7) và phương

pháp MTT [3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium

bromide] trên ba dòng ung thư gan (Hep-G2), tiền liệt tuyến (PC3) và

phổi (A549).

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được

tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết theo

phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane &

Kandel (1996) trên 8 chủng: Vi khuẩn Gram, nấm sợi và nấm men.

Các thử nghiệm được thực hiện tại tại Phòng Hoạt chất sinh học,

Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, VAST.

4

Chương 3. THỰC NGHIỆM

Phần thực nghiệm đã mô tả chi tiết các quá trình: Xử lý mẫu và

phân lập các chất sạch từ lá 2 loài Tử châu lá to (C. macrophylla) và

Nàng nàng (C. candicans); Hằng số vật lí và dữ kiện phổ của các hợp

chất phân lập được từ 2 loài được nghiên cứu.

3.1. Lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla)

3.1.1. Thu nhận các dịch chiết từ lá cây Tử châu lá to

Quá trình xử lý mẫu lá cây Tử châu lá to

Sơ đồ 3.1. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Tử châu lá to (C. macrophylla)

3.1.2. Phân lập, tinh chế các chất từ các cặn chiết lá Tử châu lá to

Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane và ethyl

acetate của lá cây Tử châu lá to như Sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2. Phân lập cặn n-hexane và ethyl acetate lá cây Tử châu lá to

3.2. Lá cây Nàng nàng (C. candicans)

5

3.2.1. Thu nhận các dịch chiết từ lá cây Nàng nàng

Quá trình xử lý mẫu lá cây Nàng nàng như Sơ đồ 3.3.

Sơ đồ 3.3. Sơ đồ ngâm chiết lá cây Nàng nàng (C. candicans)

3.2.2. Phân lập, tinh chế các chất từ các cặn chiết lá Nàng nàng Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn n-hexane và ethyl

acetate lá cây Nàng nàng như Sơ đồ 3.4

Sơ đồ 3.4. Sơ đồ phân lập cặn n-hexane và ethyl acetate của lá cây Nàng nàng

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 4 trình bày về cách xác định cấu trúc của các hợp chất

phân lập được, thành phần hóa học của tinh dầu và kết quả thử hoạt tính

sinh học của các thành phần.

4.1. Thành phần hóa học tinh dầu cây Nàng nàng và Tử châu lá to

Phân tích GC - MS trong thành phần lá khô Nàng nàng có 39

cấu tử, chiếm 92,57% tổng hàm lượng. Trong đó có 25 sesquiterpene

6

hydrocacbon (62,98%) và 11 sesquiterpen có chứa oxi (22,46%). Cấu

tử chính được xác định trong tinh dầu là α-Gurjunene (21,97%).

Trong tinh dầu của lá cây Nàng nàng tươi có 47 cấu tử được

phát hiện chiếm 93,17% tổng hàm lượng tinh dầu. Trong số đó, có 28

sesquiterpene hydrocarbon (69,84%), 12 sesquiterpen (16,50%). Trong

đó, cấu tử chiếm hàm lượng lớn nhất là α-gurjunene (21,31%)

Thành phần hóa học tinh dầu từ hoa Nàng nàng cho biết có

tổng 47 cấu tử, chiếm 92,86% tổng hàm lượng. Các cấu tử có hàm

lượng cao được xác định trong tinh dầu hoa là. Các cấu tử có hàm

lượng chính được xác định trong tinh dầu hoa cây Nàng nàng là E-

caryophyllene (5,07%), α- selinene (5,66%), δ-cadinene (5,44%).

Thành phần hóa học tinh dầu lá tươi cây Tử châu lá to phát hiện có

50 cấu tử, chiếm 90,59% tổng hàm lượng. Cấu tử chính được xác định trong

tinh dầu là Phytol (11,03%).

4.2. Các hợp chất phân lập được từ lá Tử châu lá to và Nàng nàng

Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Tử châu

lá to 10 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học,

gồm 7 hợp chất terpenoid: callimacrophylla B (M8), 3β-

hydroxyolean-12-ene (M2), β-amyrin (M3), ursolic acid (M6),

oleanolic acid (M10), callimacrophylla A (M1) và ent-1β-acetoxy-

7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) và 3 hợp chất steroid:

spinasterol (M5), β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó,

callimacrophylla A (M1) và callimacrophylla B (M8) là hai hợp

chất mới. Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Nàng nàng

(C. candicans) 11 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa

học, gồm 4 hợp chất flavonoid: 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon

(C1), 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3), Hợp chất genkwanin

(C9) và cynaroside (C10); 5 hợp chất terpenoid: ursolic acid (M6),

2α-hydroxy-ursolic acid (C7), 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic

acid (C8), seco-hinokiol (C5) và methyl seco-hinokiol (C6) và 2 hợp

chất steroid: β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó, hợp

chất methyl seco-hinokiol lần đầu phân lâp được từ tự nhiên.

Thành phần hóa học chính của 2 loài thực vật chi Callicarpa

được nghiên cứu chủ yếu là các hợp chất flavonoid, diterpennoid và

7

triterpenoid. Một số hợp chất phân lập được giống nhau ở hai loài như:

ursolic acid, β-sitosterol và daucosterol.

Các hợp chất triterpenoid phân lập được từ 2 loài nghiên cứu cho thấy

thành phần hóa học chính là các hợp chất khung ursane và oleane, phù hợp với

thành phần hóa học chính của các hợp chất triterpenoid trong chi Callicarpa

trong các tài liệu đã công bố.

Các hợp chất diterpene phân lập được từ 2 loài nghiên cứu cho thấy

thành phần hóa học chính là các hợp chất khung ent-kaurane và abietane, phù

hợp với thành phần hóa học chính của các hợp chất diterpenoid trong chi

Callicarpa trong các tài liệu đã công bố.

Các hợp chất phân lập được từ lá 2 loài nghiên cứu

Bảng 4.26. Các hợp chất phân lập được từ 2 loài nghiên cứu

Tên hợp chất Lớp chất Loài phân lập KL

(mg) Tính mới

callimacrophylla A (M1) Diterpneoid C. macrophylla 10,8 M ent-1α-acetoxy-7β,14 α-dihydroxy-kaur-16-en-15-on (M7)

Diterpenoid C. macrophylla 12,5 H

seco-hinokiol (C5) Diterpenoid C. candicans 22,8 H methyl seco-hinokiol (C6) Diterpenoid C. candicans 31,0 H

3β-hydroxyolean-12-ene (M2) Triterpenoid C. macrophylla 10,3 L

8

β-amyrin (M3) Triterpenoid C. macrophylla 12,7 L

ursolic acid (M6) Triterpenoid C. macrophylla C. candicans

15,5 15,7

L L

callimacrophylla B (M8) Triterpenoid C. macrophylla 10,1 M 2α-hydroxy-ursolic acid (C7) Triterpenoid C. candicans 12,5 L 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8)

Triterpenoid C. candicans 11,5 L

oleanolic acid (M10) Triterpenoid C. macrophylla 8,5 spinasterol (M5) Steroid C. macrophylla 11,2 L

β–sitosterol (M4) Steroid

C. macrophylla C. candicans

20,0 19,0

daucosterol (M9) Steroid C. macrophylla C. candicans

16,5

5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1) Flavonoid C. candicans 8,5 L 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3) Flavonoid C. candicans 11,2 L genkwanin (C9) Flavonoid C. candicans 13,0 L cynaroside (C10) Flavonoid C. candicans 10,8 L

M: Hợp chất mới; L: Lần đầu tiên phân lập từ loài; H: Lần đầu tiên phân lập từ họ

Hai hợp chất mới thu được gồm 1 chất thuộc lớp chất diterpenoid và triterpenoid. Chúng được xác định cấu trúc dựa trên các dữ liệu phổ như sau: 4.2.1.1. Hợp chất callimacrophylla A (M1) – Hợp chất mới

Hợp chất M1 thu được dưới dạng tinh thể trắng. Công thức phân tử của hợp chất M1 được xác định là C20H28O5 dựa trên sự xuất hiện của các píc ion giả phân tử trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 387,1940 [M + 35Cl] (tính toán lý thuyết cho C20H32O5

35Cl: m/z 387,1938) và m/z 389,1918 [M + 37Cl] (tính toán lý thuyết cho C20H32O5

37Cl: 389,1909).

Hình 4.7. Phổ ESI-MS của M1

Phổ 1H-NMR của hợp chất M1 cho thấy sự xuất hiện hai tín

hiệu dưới dạng singlet của 2 nhóm methyl [H 0,65 (3H, s, H3-19) và

1,02 (3H, s, H3-20)], 1 nhóm oxymethine [H 3,62 (1H, dd, J = 10,5; 5,5

9

Hz, H-7)], tín hiệu của 2 nhóm oxymethylen [H 2,85 (1H, dd, J = 10,5;

5,0 Hz, Ha-18); 3,18 (1H, dd, J = 10,5; 5,0 Hz, Hb-18) và H 3,45 (1H,

dd, J = 12,0; 6,5 Hz, Ha-17); 3,54 ((1H, dd, J = 12,0; 4,5 Hz, Hb-17)]

và tín hiệu của các proton khác nằm trong khoảng từ H 0,93 đến 2,38

ppm. Ngoài ra, phổ 1H-NMR của hợp chất M1 còn xuất hiện tín hiệu

của 4 nhóm hydroxyl [H 4,30 (1H, d, J = 5,0 Hz, 7-OH); 4,78 (1H, s,

16-OH); 4,43 (1H, dd, J = 4,5; 6,5 Hz, 17-OH)] và H 4,49 (1H, dd, J =

5,0; 10,0 Hz, 18-OH) (Bảng 4.3).

Hình 4.8. Phổ 1H-NMR của M1

Hình 4.9. Phổ 13C-NMR của M1

Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất M1 xuất hiện tín

hiệu của 20 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm keton tại C 219,3 (C-

15), 1 nhóm oxymethine tại C 69,5 (C-7), 2 nhóm oxymethylene [C

61,4 (C-17) và 69,9 (C-18)], 2 nhóm methyl tại C 17,4 (C-19) và C

17,7 (C-20), 4 tín hiệu carbon bậc 4 [C 36,9 (C-4), 38,6 (C-1), 58,4 (C-

10

8) và 78,4 (C-16)], 6 nhóm methylene [C 38,6 (C-1), 17,3 (C-2), 34,7

(C-3), 26,9 (C-6), 17,9 (C-11), 28,0 (C-12) và 25,3 (C-14)] và 3 nhóm

methine [C 44,9 (C-5), 52,6 (C-9) và 38,7 (C-13)]. Các dữ liệu trên cho

thấy hợp chất M1 là một hợp chất ent-kaurane diterpen và có cấu trúc

tương tự hợp chất ent-7α,16β,17-trihydroxy-18-acetoxykaur-15-one

ngoại trừ nhóm acetoxy tại C-18 của hợp chất ent-7α,16β,17-

trihydroxy-18-acetoxykaur-15-one [101].

Hình 4.10. Phổ DEPT của M1

Phổ HSQC cho thấy các proton tại H 0,65 (H3-19); H 1,02 (H3-20)

và H 3,62 (H-7) liên kết với các nguyên tử carbon tương ứng C 17,4 (C-19);

C 17,7 (C-20) và C 69,5 (C-7) cũng như các proton tại H 2,85/3,18 (H-18)

và H 3,45/3,54 (H-17) có tương tác với các nguyên tử carbon tương ứng tại

C 69,9 (C-18) và 64,1 (C-17). Ngoài ra, bốn tín hiệu proton tại H 4,30 (7-

OH); 4,43 (17-OH); 4,49 (18-OH) và H 4,78 (16-OH) không liên kết với bất

kỳ nguyên tử carbon nào trên phổ HSQC chứng tỏ rằng hợp chất M1 có 4

nhóm hydroxyl (hình 4.6 và bảng 4.3).

11

Hình 4.11. Phổ HSQC của M1

Hình 4.12. Phổ HMBC của M1

Phổ HMBC của hợp chất M1 xuất hiện các tương tác xa dị hạt

nhân của các proton tại H 0,65 (H3-19) và 2,85/3,18 (H-18) với các

nguyên tử carbon tại C 34,7 (C-3), 36,9 (C-4) và C 44,9 (C-5); proton

tại H 1,02 (H-20) với C 38,6 (C-1), C 44,9 (C-5), C 52,6 (C-9) và C

38,5 (C-10). Hơn nữa, các liên kết từ proton tại H 3,45/3,54 (H-17) đến

các nguyên tử carbon tại C 38,7 (C-13), C 219,3 (C-15) và C 78,4

(C-16) cũng xuất hiện trên phổ HMBC, điều đó khẳng định rằng 3

nhóm hydroxyl nằm ở vị trí C-18, C-6 và C-17 (Hình 4.6). Nhóm

hydroxyl cuối cùng được xác định tại C-7 bởi các liên kết HMBC

giữa proton tại H 4,30 (7-OH) với các nguyên tử carbon tại C 26,9

(C-6), C 69,5 (C-7) và C 58,4 (C-8). Ngoài ra, các liên kết từ proton

12

tại H 4,49 (18-OH) với các nguyên tử carbon tại C 69,9 (C-18) và C

36,9 (C-4); từ proton tại H 4,78 (16-OH) với các nguyên tử carbon tại

C 38,7 (C-13), C 219,3 (C-15), C 26,9 (C-16) và từ proton tại H

4,43 (17-OH) tới các nguyên tử carbon tại C 61,4 (C-17)/C 78,4 (C-

16) cũng xuất hiện trên phổ HMBC (Hình 4.6). Mặt khác, độ dịch

chuyển hóa học carbon tại vị trí C-18 (C 69,9) và C-19 (C 17,4) của

hợp chất M1 tương tự hợp chất scopariusol L [C 71,1 (C-18) và C

17,8 (C-19)] [102] và khác hẳn so với hợp chất diterpen SL-II [C 22,8

(C-18) và C 64,3 (C-19) [103] khẳng định thêm sự tồn tại của nhóm

hydroxyl ở vị trí C-18. Hằng số ghép lớn của H-7 (J = 10,5 Hz) giống

với hợp chất 7β,16α,17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid [104] xác

định hướng α của nhóm hydroxyl (7-OH) trong hợp chất M1. Độ dịch

chuyển hóa học của các nguyên tử carbon tại C-16 (C 78,4) và C-17

(C 61,4) của hợp chất M1 phù hợp với các giá trị carbon tương ứng

của hợp chất ent-7α,16β,17-trihydroxykaur-18-acetoxy-15-one [C 77,4

(C-16) và C 63,1 (C-17)] [101] và khác hẳn so với hợp chất 16α,17-

dihydroxy-15-oxo-ent-kaur-19-oic acid [C 83,0 (C-16) và C 65,3 (C-

17)] [105] đề xuất cấu hình β của nhóm hydroxyl (16-OH). Từ các dữ

liệu trên, hợp chất M1 được xác định là ent-7α,16β,17,18-

tetrahydroxykaur-15-one. Đây là một hợp chất mới và được đặt tên là

callimacrophylla A.

Hình 4.6. Cấu trúc hóa học, tương tác chính HMBC(HC) của M1

Bảng 4.3. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của M1 và chất tham khảo

TT Hợp chất M1 [103]

δC δH (mult., J Hz) #δC #δH (mult., J Hz)

1 38,6 0,57 (1H, m)/ 1,66 (1H, m) 41,7 3,57 (m)

2 17,3 1,38 (1H, m)/ 1,57 (1H, m) 20,3 2,03 (m) 1,85 (overlap)

3 34,7 1,11 (1H, m)/ 1,40 (1H, m) 39,2 2,01 (m) 1,42 (m)

4 36,9 - 44,2

13

5 44,9 - 48,1 1,63 (dd, 11,9, 1,7)

6 26,9 1,75 (1H, m)/ 1,66 (1H, m) 30,5 1,75 (m) 1,40 (m)

7 69,5 3,62 (1H, dd, 10,5; 5,5) 78,1 2,28 (dt, 13,3, 4,1) 1,33 (overlap)

8 58,4 - 49,0 -

9 52,6 0,94 (1H, d, 9,0) 51,1 1,85 (overlap)

10 38,5 1,20 (1H, m)/ 1,53 (1H, m) 40,4 -

11 17,9 1,20 (1H, m)/ 1,53 (1H, m) 19,1 3,66 (dd, 10,7, 6,0) 1,68 (m)

12 28,0 1,18 (1H, m)/ 1,60 (1H, m) 27,6 1,98 (m) 1,57 (m)

13 38,7 2,21 (1H, br d, 3,5) 46,1 2,95 (br s)

14 25,3 1,66 (1H, m)/ 2,38 (1H, m) 37,5 2,45 (d, 11,8) 1,33 (overlap)

15 219,3 - 219,3 -

16 78,4 - 82,9 -

17 61,4 3,45 (1H, dd, 6,5; 12,0) 3,54 (1H, dd, 4,5; 12,0)

66,7 6,02 (br s) 5,16 (br s)

18 69,9 2,85 (1H, dd, 5,0; 10,5) 3,18 (1H, dd, 5,0; 10,5)

71,0 3,64 (d, 10,5) 3,32 (d, 10,5)

19 17,4 0,65 (3H, s) 16,8 0,88 (s)

20 17,7 1,02 (3H, s) 16,1 1,44 (s)

7-OH 4,30 (1H, d, 5,0)

16-OH 4,78 (1H, s)

17-OH 4,43 (1H, dd, 4,5; 6,5)

18-OH 4,49 (1H, dd, 5,0; 10,0)

#δH và #δC của scopariusol L (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz, pyridine-d5) [102]

4.2.2.1. Hợp chất callimacrophylla B (M8)- Hợp chất mới Hợp chất M8 thu được dưới dạng tinh thể trắng. Công thức phân tử

của hợp chất M8 được xác định là C32H50O4 dựa trên sự xuất hiện của các píc ion giả phân tử trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 499,3786 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho C32H51O4: m/z 499,3786).

Phổ 1H-NMR của hợp chất M8 xuất hiện 6 nhóm methyl singlet tại H 0,83 (3H, s, H3-28); 1,17 (3H, s, H3-26); 1,18 (3H, s, H3-25); 1,34 (3H, s, H3-27); 0,89 (6H, s, H3-23 và H3-24), 2 nhóm methyl dưới dạng doublet tại H 0,80 (3H, J = 6,5 Hz, H3-29) và 0,93 (3H, J = 6,5 Hz, H3-30) và 1 nhóm methyl tại H 2,05 (3H, s, CH3CO) của nhóm acetoxy. Phổ 1H-NMR của M8 còn cho thấy sự xuất hiện của 6 nhóm methien [H 4,53 (1H, dd, J = 11,5; 4,5, H-3); 0,82 (1H, m, H-5); 2,50 (1H, s, H-9), 2,43 (1H, dd, J = 11,5; 1,5, H-18); 1,42 (1H, m, H-19) và 1,08 (1H, m, H-20)] và 8 nhóm methine có độ dịch chuyển hóa học

14

trong khoảng H 0,95-2,75 (H-1, H-2, H-6, H-7, H-15, H-16, H-21 và H-22), một proton singlet tại H 6,27 (1H, s, 12-OH) (Bảng 4.7)

Hình 4.17. Phổ HR-ESI-MS của M8

Hình 4.18. Phổ 1H-NMR của M8

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy hợp chất M8 có 32 nguyên tử cacbon, trong đó có 8 cacbon bậc bốn [C 38,0 (C-4); 45,5 (C-8); 37,0 (C-10); 195,2 (C-11); 144,5 (C-12); 134,4 (C-13); 41,7 (C-14) và 33,4 (C-17)], 6 nhóm methine [C 80,5 (C-3); 55,0 (C-5); 59,7 (C-9); 48,9 (C-18); 39,3 (C-19) và 40,8 (C-20)], 8 nhóm methilen [C

38,9 (C-1); 23,5 (C-2); 17,4 (C-6); 32,9 (C-7); 27,3 (C-15); 27,5 (C-16); 31,2 (C-21) và 41,2 (C-22)] và 8 nhóm methyl [C 28,0 (C-23); 16,6 (C-24); 16,7 (C-25); 18,6 (C-26); 21,0 (C-27); 28,8 (C-28); 16,6 (C-29) và 20,9 (C-30)]. Ngoài ra, còn có tín hiệu của 01 nhóm acetoxy tại C 170,9 (CH3CO) và 21,3 (CH3CO) cũng thu được từ phổ 13C-NMR

15

Hình 4.19. Phổ 13C-NMR của M8

Tất cả dữ liệu trên gợi ý cho biết hợp chất M8 là một triterpene

khung ursane chứa một nhóm acetoxy và có cấu trúc giống hợp chất 3β-

acetoxy-urs-12-ene-11-one [94], ngoại trừ sự khác biệt về độ dịch chuyển

hóa học của các nguyên tử cacbon tại vị trí C-11, C-12 và C-13. Khi so sánh

dữ liệu NMR của các hợp chất M8 và hợp chất 3β-acetoxy-urs-12-ene-11-

one (TLTK) có thế thấy ở TLTK tín hiệu proton của nhóm olefin tại H 5,54

(1H,s) liên kết trực tiếp với C-12 là một cacbon bậc 4(không liên kết với

hydro) có độ chuyển dịch hóa học C 144,5 ppm (C-12). Đồng thời tại vị trí

C-12 có gắn với nhóm hydroxy cũng được thể hiện bởi phổ khối phân giải

cao. Ngoài ra còn được xác định bởi tương tác xa dị hạt nhân của proton tại

H 6,27 (1H, s, 12-OH) với các nguyên tử cacbon tại C 195,2 (C-11); 144,5

(C-12) và 134,4 (C-13). Thêm vào đó, các liên kết trên phổ HMBC giữa H-

18 (H 2,43) và C-12 (144,5)/C-13 (C 134,4) chỉ ra vị trí của liên kết đôi tại

C-12/C-13 và nhóm keton tại C-11 (Hình 4.16)

Hình 4.20. HSQC của M8

16

Hình 4.21. Phổ HMBC của M8

Bên cạnh đó, liên kết giữa các proton methyl tại H-23/H-24 (H

0,89) với C-3(C 80,5)/C-4 (C 38,0) và C-5(C 55,0) cũng như liên kết

giữa H-3 (H 4,53)/CH3CO (H 2,05) với nguyên tử carbon tại C 170,9

(CH3CO), kết hợp với hằng số ghép lớn của H-3 (J = 11,5 Hz) trên phổ 1H-NMR xác nhận nhóm acetoxy liên kết tại C-3 có hướng β. Ngoài ra,

proton H-3 có hướng α được xác định bởi các liên kết từ H-2α (H 1,65)

và H3-23 (H 0,89) đến H-3 (H 4,53) cũng như từ H3-25 (H 1,18) đến

H-2β (H 1,72) trên phổ ROESY. Mặt khác, các liên kết giữa H-20 với

H-29/H-19 và giữa các proton H-2 với H-1/H-3 cũng được tìm thấy trên

phổ 1H-1H COSY.

Hình 4.22 Phổ 1H-1H COSY và NOESY của M8

Kết hợp các dữ liệu phổ với HMBC, 1H-1H COSY và ROESY

và so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất 3β-acetoxy-urs-12-ene-11-

one [94] trong tài liệu tham khảo cho phép khẳng định hợp chất M8 là

3β-acetoxy-urs-12-ene-11-one-12-ol. Đây là một hợp chất mới và

được đặt tên là callimacrophylla B

17

Hình 4.16. Cấu trúc hóa học, tương tác chính HMBC (HC) của M8

Bảng 4.7. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của M8 và chất tham khảo

Vị trí M8 [94]

δC δH (mult., J Hz) #δC #δH (mult., J Hz)

1 38,9 2,75 (1H, dt, 6,5; 3,5)

1,13 (1H, m) 38,9 2,75(lH,ddd, 3,5;3,5;13,5)

2 23,5 1,65 (1H, m) / 1,72 (1H, m) 23,6 3 80,5 4,53 (1H, dd, 11,5; 4,5) 80,7 4,51 (lH, dd, 4,6; 11,7) 4 38,0 - 38,1 5 55,0 0,82 (1H, m) 55,1 6 17,4 1,43 (1H, m)/ 1,58 (1H, m) 17,5 7 32,9 1,43 (1H, m)/ 1,68 (1H, m) 32,8 8 45,5 - 45,2 9 59,7 2,50 (1H, s) 61,5 2,34 (1H, s)

10 37,0 - 36,7 11 195,2 - 199,5 12 144,5 - 130,5 5,54 (1H, s) 13 134,4 - 164,8 14 41,7 - 43,7 15 27,3 0,95 (1H, m)/ 2,10 (1H, m) 27,2 16 27,5 1,17 (1H, m)/ 1,90 (1H, m) 27,3 17 33,4 - 33,9 18 48,9 2,43 (1H, dd, 11,5; 1,5) 59,1 19 39,3 1,42 (1H, m) 39,2 20 40,8 1,08 (1H, m) 39,3 21 31,2 1,25 (1H, m)/ 1,43 (1H, m) 30,9 22 41,2 1,39 (1H, m)/ 1,47 (1H, m) 40,9 23 28,0 0,89 (3H, s) 28,1 0,87 (3H, s) 24 16,6 0,89 (3H, s) 16,7 0,88 (3H, s) 25 16,7 1,18 (3H, s) 16,5 1,16 (3H, s) 26 18,6 1,17 (3H, s) 18,6 1,18 (3H, s)

27 21,0 1,34 (3H, s) 20,5 1,29 (3H, s)

28 28,8 0,83 (3H, s) 28,9 0,81 (3H, s) 29 16,6 0,80 (3H, d, 6,5) 17,5 0,80 (3H,d, 6,0) 30 20,9 0,93 (3H, d, 6,5) 21,2 0,94 (3H, d, 6,0)

CH3CO 170,9 - 170,9 -

18

CH3CO 21,3 2,05 (3H, s) 21,1 2,04 (3H, s) 12-OH 6,27 (1H, s) #δH và #δC của 3β-acetoxy-urs-12-ene-11-one (1H: 500 MHz,13C:125MHz,CDCl3) [94]

4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của Nàng nàng và lá Tử châu lá to

4.3.1. Đánh giá hoạt tính sinh học của tinh dầu lá Nàng nàng và Tử châu lá to

Kết quả cho thấy, tinh dầu lá Nàng nàng khô thể hiện hoạt tính

yếu trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 (IC50 = 94,5 µg/mL). Tinh

dầu lá tươi được chiết xuất bằng phương pháp chưng cất lôi quấn hơi

nước thông thường và tinh dầu lá tươi Tử châu lá to không thể hiện

hoạt tính trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm.

Bảng 4.20. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro của tinh dầu lá Nàng

nàng và Tử châu lá to trên các dòng tế bào ung thư: gan (Hep-G2), ung thư tiền

liệt tuyến (PC3) và ung thư phổi (A549).

Tên mẫu IC50 (µg/mL)

Hep-G2 PC3 A549

Tinh dầu lá khô 94,53 >100 >100

Tinh dầu lá tươi cất thông thường >100 >100 >100

Tinh dầu lá tươi sử dụng lò vi sóng 14,65 23,87 56,21

Tinh dầu lá tươi Tử châu lá to >100 >100 >100

Đối chứng (paclitaxel) 4,03 3,48 3,69

Kết quả còn cho biết phương pháp cất tinh dầu có hỗ trợ vi

sóng đã thu được các cấu tử hoặc hỗn hợp cấu tử trong tinh dầu lá Nàng

nàng có hoạt tính sinh học tốt hơn so với phương pháp chưng cất tinh

dầu lôi quấn hơi nước thông thường. Điều đó có ý nghĩa quan trọng cho

định hướng nghiên cứu tiếp theo về tinh dầu loài Nàng nàng nói riêng

và các tinh dầu từ các loài thực vật khác nói chung. Bảng 4.21. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu

lá Nàng nàng và Tử châu lá to

Tên mẫu MIC (g/mL)

EC PA BS SA AN FO SC CA

Tinh dầu lá khô >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200

Tinh dầu lá tươi cất thông

thường >200 >200 >200 >200 >200 200 >200 200

Tinh dầu lá tươi dùng lò

vi sóng >200 >200 >200 >200 >200 100 >200 200

Tinh dầu lá Tử châu lá to >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 >200 EC: Escherichia coli, PA: Pseudomonas aeruginosa, BS: Bacillus subtillis, SA: Staphylococcus aureus, AN: Aspergillus niger, FO: Fusarium oxysporum, SC: Saccharomyces cerevisiae, CA: Candida albicans

19

4.3.2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của cao chiết từ loài

Tử châu lá to và Nàng nàng

Các số liệu từ bảng 4.22 cho thấy cặn chiết ethanol từ lá, quả,

thân loài Tử châu lá to và Nàng nàng thể hiện hoạt tính ức chế tốt trên 3

dòng tế bào ung thư thử nghiệm với các giá trị CS(%) từ 29,69 0,8

đến 89,62 1,2%. Đặc biệt cặn chiết ethanol của lá loài Tử châu lá to

và Nàng nàng (L.CM và L.CC) có tác dụng ức chế tốt với giá trị CS(%)

lần lượt là 47,84 2,1 và 56,28 2,6 (đối với dòng tế bào ung thư Hep-

G2); 39,40 2,2 và 29,69 0,8 (đối với dòng tế bào ung thư Lu-1) và

30,23 1,5 và 35,18 1,0 (đối với dòng tế bào ung thư MCF-7). Kết

quả sàng lọc sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào ung thư đối với ba dòng tế

bào ung thư Hep-G2, Lu-1 và MCF-7 cho thấy lá loài Tử châu lá to và

Nàng nàng có tác dụng mạnh hơn quả và thân cành của chúng. Do vậy,

các nghiên cứu về thành phần hóa học tiếp theo ưu tiên tập trung vào lá

loài Tử châu lá to và Nàng nàng.

Bảng 4.22. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các cặn chiết tổng ethanol

từ lá, quả và thân cành cây Tử châu lá to và Nàng nàng

TT KH mẫu Nồng độ

đầu

(g/mL)

Giá trị CS (%) Dòng tế bào

Hep-G2 LU-1 MCF-7

DMSO - 100 100 100

Chứng (+) 5 1,34 0,8 2,66 0,9 1,21 0,71

1 Q.CC 20 89,29 1,1 33,04 1,4 40,43 2,79

2 T.CC 20 89,62 1,2 33,53 1,6 91,29 0,32

3 L.CC 20 56,28 2,6 29,69 0,8 35,18 1,0

4 Q.CM 20 60,02 2,3 47,31 1,5 38,86 2,26

5 T.CM 20 64,66 2,2 55,64 2,8 90,22 0,15

6 L.CM 20 47,84 2,1 39,40 2,2 30,23 1,5

(Q: quả, T: thân cành, L: lá, CC: C. candicans, CM: C. macrophylla)

Tiếp tục thử hoạt tính của các cặn chiết phân đoạn n-hexane,

EtOAc và methanol của lá cây Tử châu lá to và Nàng nàng đối với

dòng tế bào ung thư Hep-G2, Lu-1 và MCF-7. Ngoại trừ cặn chiết phân

đoạn methanol hầu như không thể hiện hoạt tính, cả 2 cặn chiết phân

đoạn còn lại của lá loài hai loài này đều có tác dụng ở các mức độ khác

nhau, trong đó phân đoạn n-hexane (L.CM.H) của cây Tử châu lá to và

20

EtOAc (L.CC.E) của lá cây Nàng nàng thể hiện hoạt tính mạnh nhất

với các giá trị CS(%) thấp với giá trị CS (%) từ 12,49 1,4 - 30,17

0,1 %. Kết quả này được giải thích là do sự hiện diện của các nhóm

chất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh như terpenoid và flavonoid trong

các phân đoạn có độ phân cực yếu và trung bình. Bảng 4.23. Hoạt tính gây độc tế bào của các cặn chiết phân đoạn từ lá loài

Tử châu lá to và Nàng nàng

TT KH mẫu Nồng độ đầu

(g/mL)

Giá trị CS (%)

Dòng tế bào

Hep-G2 LU-1 MCF-7

DMSO - 100 100 100

Chứng (+) 5 1,34 0,8 2,66 0,9 1,21 0,71

1 L.CM.H 20 20,18 0,8 12,49 1,4 11,61 2,11

2 L.CM.E 20 98,03 0,9 18,20 1,3 40,43 2,79

3 L.CM.M 20 100 100 91,29 0,32

4 L.CC.H 20 98,84 0,9 73,04 1,5 38,86 2,26

5 L.CC.E 20 30,17 0,1 15,69 2,3 19,93 0,11

6 L.CC.M 20 100 100 90,22 0,15

(L: lá, H: n-hexane, E: ethyl acetate, M: methanol, CC: C. candicans,

CM: C. macrophylla)

4.3.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất

sạch phân lập được từ lá Tử châu lá to và Nàng nàng

Bảng 4.24. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các chất trên các dòng tế bào ung thư (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7)

TT Hợp chất

Giá trị IC50 (g/mL) Dòng tế bào

HepG2 Lu1 MCF7

Ellipticine 0,29 0,51 0,48

1 methyl seco-hinokiol (C6) 8,65 8,53 2,20

2 seco-hinokiol (C5) 8,25 9,13 2,46

3 callimacrophylla A (M1) 2,72 2,68 1,57

4 ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) 0,31 1,55 0,23

5 callimacrophylla B (M8) 0,32 1,87 0,28

6 ursolic acid (M6) 0,25 0,31 0,21

7 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8) - - -

8 β-amyrin (M3) - - -

9 3β-hydroxyolean-12-ene (M2) 5,85 - 2,36

10 spinasterol (M5) 8,22 8,29 1,82

21

11 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1) - - -

12 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3) - - -

13 genkwanin (C9) - - -

14 cynaroside (C10) - - - Đánh giá hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm:

Bảng 4.24 cho thấy hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) của các hợp chất terpenoid mạnh hơn so với các hợp chất steroid và flavonoid. Các hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) tốt hơn dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và phổi (Lu-1). Hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) trong số 14 hợp chất thử kết quả hoạt tính có 6 hợp chất không có hoạt tính với IC50 > 100 (g/mL) gồm: 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1), 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3), 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8), Genkwanin (C9) và cynaroside (C10) và β-amyrin (M3). Các hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính tương mạnh là methyl seco-hinokiol (C6), seco-hinokiol (C5), ent-1 α-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7), callimacrophylla B (M8), ursolic acid (M6), spinasterol (M5), 3β-hydroxyolean-12-ene (M2), callimacrophylla A (M1) với 0,2 g/mL < IC50 < 9,2 g/mL. Đặc biệt hợp chất ursolic acid (M6) có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) rất mạnh với giá trị IC50 = 0,25; 0,31 và 0,21 g/mL nhỏ hơn cả nồng độ chất đối chứng Ellipticine với IC50 = 2,9; 0,51 và 0,48 g/mL. Hợp chất ent-1α -acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) và callimacrophylla B (M8) thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư vú MCF-7 mạnh với IC50= 0,23 và 0,21 g/mL, mạnh hơn so với chất đối chứng Ellipticine với IC50 = 0,48 g/mL. Hai hợp chất abietane (methyl seco-hinokiol (C6), seco-hinokiol (C5)) và một hợp chất steroid (spinasterol (M5) thể hiện hoạt tính gây độc mạnh đối với dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) với giá trị IC50 trong khoảng 1,82 g/mL < IC50 < 2,46 g/mL nhưng thể hiện hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) với giá trị 8,22 g/mL < IC50 < 9,13 g/mL, kém hơn khoảng 5 lần so với ung thư vú (MCF-7). Các hợp chất có hoạt tính còn lại đều thể hiện hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) mạnh hơn không đáng kể so với dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1). Trừ hợp chất 3β-hydroxyolean-12-ene (M2) không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng ung thư phổi (Lu-1), hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng ung thư vú (MCF-7) tốt hơn đối với dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) với giá trị IC50 tương ứng bằng 2,36 g/mL và 5,85 g/mL

Đối với dòng ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) các hợp chất khung ent-kaurane diterpenoid (callimacrophylla A (M1) và ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7)) và ursane-triterpenoid (callimacrophylla B (M8) và ursolic acid (M6) với 0,25 g/mL < IC50 < 2,72 g/mL biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn gấp 8 lần so với các hợp chất khung abietane (methyl seco-hinokiol (C6), seco-hinokiol (C5)) và steroid (spinasterol (M5)) với 8,22 g/mL < IC50 < 9,13 g/mL. Đối với dòng ung thư vú (MCF-7) các hợp chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào gần tương đương nhau với giá trị 0,21 g/mL < IC50 < 2,46 g/

22

mL. Trừ hợp chất ursane-triterpenoid: 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8) không thể hiện hoạt tính.

Nhóm hydroxyl ở vị trí C-3 trong hợp chất seco-hinokiol (C5) được thay thế bằng nhóm CH3O- tại vị trí C-3 trong methyl seco-hinokiol (C6) của hai hợp chất khung abietane-diterpenoid dẫn đến hoạt tính hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng ung 25 g/mL và 8,65 g/ mL) nhưng lại kém hơn dòng tế bào ung thư phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) (giá trị IC50 tương ứng 9,13 g/ml và 8,53 g/ml đối với dòng ung thư Lu-1; 2,46 g/mL và 2,20 g/mL đối với dòng ung thư MCF-7) tuy nhiên sự khác nhau không đáng kể.

Sự biến mất của nhóm hydroxy tại vị trí C-18; xuất hiện thêm nhóm α-acetoxy ở vị trí C-1 và β-OH ở vị trí C-14 và thay thế nhóm β-OH, α-CH2-OH tại C-17 thành nhóm olefin của hợp chất ent-1 α-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) so với hợp chất callimacrophylla A (M1) thuộc bộ khung ent-kaurane-triterpenoid dẫn đến làm tăng hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) với giá trị tương ứng 0,31 g/mL và 2,72 g/mL; 1,55 g/mL và 2,68 g/mL; và 0,23 g/mL và 1,57 g/ mL.

Đối với các hợp chất khung ursane-triterpenoid, ursolic acid (M6) có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) rất mạnh với giá trị IC50 = 0,25; 0,31 và 0,21 g/mL, còn hợp chất 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8) không thể hiện hoạt tính. Điều này có thể do sự xuất hiện của hai nhóm hidroxy ở vị trí C-2 và C-23 đã làm giảm hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7). Một hợp chất ursane-triterpenoid khác, callimacrophylla B (M8) có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) rất mạnh với giá trị IC50 = 0,32; 1,87 và 0,28 g/mL, tương đương với ursolic acid, điều này có thể liên quan tới nhóm keton ở C-11.

KẾT LUẬN Thành phần hóa học các chất sạch phân lập

1. Luận án lần đầu tiên nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài thực vật Nàng nàng (C. candicans) và loài Tử châu lá to (C. macrophylla) thuộc chi Callicarpa ở Việt Nam. Đã phân lập được 21 hợp chất trong đó có 2 hợp chất mới, một hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên.

2. Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Tử châu lá to 10 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, gồm 7 hợp chất terpenoid: callimacrophylla B (M8), 3β-hydroxyolean-12-ene (M2), β-amyrin (M3), ursolic acid (M6), oleanolic acid (M10),

23

callimacrophylla A (M1) và ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) và 3 hợp chất steroid: spinasterol (M5), β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó, callimacrophylla A (M1) và callimacrophylla B (M8) là hợp chất mới.

3. Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Nàng nàng (Callicarpa candicans) 11 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, gồm 4 hợp chất flavonoid: 5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1), 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3), genkwanin (C9) và cynaroside (C10); 5 hợp chất terpenoid: ursolic acid (M6), 2α-hydroxy-ursolic acid (C7), 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8), seco-hinokiol (C5) và methyl seco-hinokiol (C6) và 2 hợp chất steroid: β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó, hợp chất methyl seco-hinokiol lần đầu phân lâp từ tự nhiên.

Thành phần hóa học trong tinh dầu 4. Thành phần hóa học tinh dầu lá và hoa Nàng nàng

Theo phương pháp chưng cất thông thường. Phân tích GC - MS trong thành phần lá khô Nàng nàng có 39 cấu tử, chiếm 92,57% tổng hàm lượng. Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu là α-Gurjunene (21,97%). Trong tinh dầu của lá tươi cây Nàng nàng có 47 cấu tử chiếm 93,17% tổng hàm lượng tinh dầu. Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu là α-Gurjunene (21,31%). Thành phần tinh dầu hoa Nàng nàng có 47 cấu tử chiếm 92,86% tổng hàm lượng. Cấu tử có hàm lượng chính được xác định trong tinh dầu hoa cây Nàng nàng là E-caryophyllene (5,07%), α- selinene (5,66).

Theo phương pháp chưng cất hơi nước có hỗ trợ vi sóng Phân tích GC - MS trong thành phần lá tươi Nàng nàng có 46 cấu tử chiêm 93,4% tổng hàm lượng. Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu lá Nàng nàng tươi là β-caryophyllene (10,45%), δ - cadinene (10,28%).

5. Thành phần hóa học tinh dầu lá Tử châu lá to Thành phần tinh dầu lá tươi Tử châu lá to có 50 cấu tử, chiếm 90,59% tổng hàm lượng. Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu là phytol (11,03%).

Hoạt tính sinh học 6. Kết quả thử hoạt tính gây độc trên 3 dòng ung thư gan (Hep-G2), ung

thư phổi (Lu-1) và ung thư vú (MCF-7) của một số chất sạch phân lập được, cho biết 2 hợp chất mới (callimacrophylla A và callimacrophylla B) thể hiện hoạt tính mạnh, hầu hết các chất còn lại

24

đều thể hiện hoạt tính ở mức khá. Trong đó, hợp chất ursolic acid (M6) có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (Lu-1) và vú (MCF-7) rất mạnh với giá trị IC50 = 2,5; 0,31 và 0,21 g/mL; hợp chất ent-1β-acetoxy-7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) và callimacrophylla B (M8) thể hiện hoạt tính kháng tế bào ưng thư vú CF-7 mạnh với IC50 = 0,23 và 0,21 g/mL, nhỏ hơn cả nồng độ chất đối chứng Ellipticine.

7. Tinh dầu lá tươi Nàng nàng thu được từ phương pháp sử dụng lò vi sóng thể hiện hoạt tính tốt trên cả 3 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư tiền liệt tuyến (PC3), ung thư phổi (A549) được thử nghiệm với các giá trị IC50 tương ứng bằng14,65; 23,87 và 56,21 µg/mL và thể hiện hoạt tính ức chế nấm Fusarium oxysporum tốt với giá trị MIC bằng 100 g/mL. Các mẫu còn lại: tinh dầu lá khô và hoa tươi Nàng nàng, lá tươi Tử châu lá to chưng cất theo phương pháp lôi quấn hơi nước thông thường không thể hiện hoạt tính

KIẾN NGHỊ

Các kết quả nghiên cứu trong luận án cho thấy các loài chi Callicarpa là nguồn giàu có các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học thú vị. Vì vậy, trong tương lai tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính chống ung thư của các bộ phận còn lại của hai loài trên và các loài chi Callicarpa khác nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính chống ung thư và hoạt tính sinh học khác từ các loài thuộc chi Callicarpa của Việt Nam, để khẳng định thêm giá trị khoa học của các loài này, góp phần trong việc tạo ra các sản phẩm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Luận án lần đầu tiên đã nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài

thực vật: Nàng nàng (C. candicans) và Tử châu lá to (C. macrophylla) thuộc chi Callicarpa ở Việt Nam. Đã phân lập được 21 hợp chất sạch. Trong đó, callimacrophylla A và callimacrophylla B là hai hợp chất mới và hợp chất methyl seco-hinokiol lần đầu phân lập từ tự nhiên.

25

Lần đâu tiên tinh dầu của 2 loài Nàng nàng và Tử châu lá to được nghiên cứu tại Việt Nam. Riêng tinh dầu Nàng nàng ở trên thế giới chưa có một công trình nào nghiên cứu.

Lần đâu tại Việt Nam đã nghiên cứu tác dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu-1) và ung thư vú (MCF-7) của 14 hợp chất sạch phân lập được từ loài Tử châu lá to (C.macrophylla) và Nàng nàng (C. Candicans). Trong đó 2 hợp chất mới thể hiện hoạt tính mạnh, hầu hết các chất còn lại đều thể hiện hoạt tính ở mức khá.

Tinh dầu lá tươi Nàng nàng thu được từ phương pháp sử dụng lò vi sóng thể hiện hoạt tính tốt trên cả ba dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư tiền liệt tuyến (PC3), ung thư phổi (A549) được thử nghiệm với các giá trị IC50 tương ứng bằng14,65; 23,87 và 56,21 µg/mL và thể hiện hoạt tính ức chế nấm Fusarium oxysporum tốt với giá trị MIC bằng 100 g/mL. Các mẫu còn lại: tinh dầu lá khô và hoa tươi Nàng nàng, lá tươi Tử châu lá to chưng cất theo phương pháp lôi quấn hơi nước thông thường không thể hiện hoạt tính.

26

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ

Bài báo quốc tế (ISI/Scopus):

1. Vũ Thị Thu Lê, Lại Phương Phương Thảo, Phạm Thị Hồng Minh,

Hoàng Thị Bích, Đỗ Tiến Lâm, Đinh Thị Thu Thủy, Phạm Minh Quân,

Phạm Quốc Long, Đào Việt Hùng, Trần Quốc Toàn, Essential oil of

Callicarpa candicans (Burm.f.) Hochr, Asian Journal of Chemistry,

2019 (chấp nhận đăng) (Scopus).

2. Do Tien Lam, Vu Thi Thu Le, Pham Minh Quan, Pham Thi Hong

Minh, Bui Huu Tai, and Phan Van Kiem, Two new terpenoids from the

leaves of Callicarpa macrophylla, Natural Product Research, 2019, 34,

688 (SCIE).

3. Quoc Toan Tran, Thu Le Vu Thi , Tien Lam Do, Hong Minh Pham

Thi, Bich Hoang Thi, Quang Truyen Chu, Phuong Thao Lai Phuong,

Huu Nghi Do , Hoai Thu Hoang Than , Thu Thuy Ta Thi, Van Huyen

Luu, Mai Duong Phuong Thi Thu Huong Phung Thi, Optimization of

Microwave-Assisted Extraction Process of Callicarpa candicans

(Burm.f.) Hochr Essential Oil and Its Inhibitory Properties against

Some Bacteria and Cancer Cell Lines, Processes, 2020, 8(2):173

(SCIE).

Bài báo trong nước:

4. Vũ Thị Thu Lê, Luân Thị Thu, Phạm Thị Hồng Minh, Đỗ Tiến Lâm,

Nguyễn Phi Hùng, Đoàn Lan Phương, Nguyễn Thị Hồng Vân, Phạm Quốc

Long, Một số kết quả nghiên cứu ban đầu về dịch chiết n-hexan của cây

Nàng nàng (Callicarpa candicans (Burm.F) Hochr) ở Việt Nam, Tạp

chí Khoa học và Công nghệ, 2016, 54 (2B), 251-257.

5. Vũ Thị Thu Lê, Đỗ Tiến Lâm, Cầm Thị Ính, Đoàn Lan Phương,

Phạm Quốc Long, Trần Đăng Thạch, Tạ Thị Thu Thủy, Phạm Thị

Hồng Minh, nghiên cứu thành phần hóa học cặn chiết etyl axetat của

cây Nàng nàng (Callicarpa candicans (burm.f) hochr.) ở Việt Nam,

Tạp chí Khoa học và công nghệ, 2018, 178(2), 1859-2171.

6. Vũ Thị Thu Lê, Đỗ Tiến Lâm, Cầm Thị Ính, Phạm Quốc Long, Trần

Đăng Thạch, Nguyễn Thị Hồng Vân, Phạm Thị Hồng Minh,

Triterpenoid và flavonoid từ dịch chiết etyl axetat của cây Nàng nàng

(Callicarpa candicans (Burm. f. Hochr.) Ở Việt Nam, Tạp chí Hóa học,

2018, 56(3), 341-345.

27

7. Do Tien Lam, Pham Minh Quan, Vu Thi Thu Le, Nguyen Thi Hong

Van, Cam Thi Inh, Ta Thi Thu Thuy, Pham Thi Hong Minh, Terpene

compounds isolated from Callicarpa macrophylla in Vietnam Journal of

Science and Technology, 2018, 56 (4A), 213-220.