Vaksin Hidup Bakteri dengan Tingkat Bergradasi dari Pelemahan Dicapai dengan Mutasi Resistensi Antibiotik: Transduksi Percobaan pada Unit Fungsional Perlawanan, Redaman dan

Spidol Lanjut Menyertainya

Abstrak

Setidaknya 10% dari mutan resisten antibiotik kromosom bakteri spontan mengekspresikan regangan yang tergantung pada pengurangan dinilai virulensi; ini berkorelasi linear dengan generasi lama waktu. Kadang-kadang, mutan ini suhu sensitif atau / dan auxotrophe. Pekerjaan dijelaskan dalam makalah ini memberikan bukti bahwa dalam strain perlawanan dan spidol yang menyertainya hanya ada sebagai unit genetik fungsional. Dalam serangkaian percobaan transduksi dengan patogen strain Salmonella typhimurium, ditemukan bahwa tanpa kecuali, perlawanan dan penanda tambahan 100% secara bersamaan ditransfer. Selanjutnya, resisten antibiotik Mutan Escherichia coli dengan waktu generasi lama, diisolasi dari sampel feses; saya t demikian menunjukkan bahwa, mutan berbahaya seperti terjadi setiap saat dalam usus. Dapat disimpulkan bahwa kekhawatiran menghubungkan mutan tersebut untuk kemungkinan penyebaran resistensi tidak berdasar; Selanjutnya, bahkan jika transfer resistensi terjadi, hanya strain dilemahkan akan disebarluaskan. # 1998 Elsevier Science BV All rights reserved.

Kata kunci: Resistensi antibiotik; Attenuation; Transduksi; Vaksinasi

1. Pendahuluan

Penyesuaian kelas redaman strain vaccinal bakteri yang berbeda kerentanan dari berbagai spesies inang, menjamin efikasi vaksin yang optimal. Hal ini akan dengan mudah dicapai dengan menggunakan mutan kromosom spontan resisten antibiotik, karena setidaknya 10% dari klon ini secara bersamaan akan bervariasi tergantung clone-, kelas virulensi dan lama waktu generasi, yang terakhir sesuai dengan tingkat atenuasi (Linde et al., 1990). Kadang-kadang, kadang-kadang pada suhu 430C muatan ini sensitif atau tidak akan tumbuh pada media minimal (strain auksotrofik) atau dengan simultan mengekspresikan sensitivitas suhu dan auxotrophy sebagai lanjutan penanda tambahan. Mutan ini telah digunakan dalam penyusunan eksperimental vaksin dan ditemukan untuk memberikan perlindungan sekitar 95% di LD 50 tes tantangan (Linde et al., 1990, 1991).

Mutan tahan antibiotik seperti Salmonella spp., Shigella spp., Listeria spp. Strainshave berhasil digunakan dalam penyusunan vaksin eksperimental. Contohnya seperti typhimurium vaksin S. ditemukan untuk mencegah S. abortus-Ovis aborsi di domba (Linde et al, 1992.); gabungan S. typhimurium / S. enteritidis vaksin ditemukan untuk mengurangi ekskresi wildstrains Salmonella spp. pada unggas (Linde et al., 1993a) dan untuk mencegah subklinis Salmonella spp. infeksi setelah vaksinasi berskala besar di ternak yang sehat (Linde et al., 1996); a Sh gabungan. flexneri 2a / Sh. Vaksin sonnei ditemukan sebagai pemicu produksi antibodi usus s-IgA pada anak-anak ke tingkat yang sama dengan yang diamati dalam infeksi alami (Dentchev et al, 1990;. Linde et al, 1993b.); hidup vaksin L. monocytogenes ditemukan untuk mengurangi kematian domba perinatal dan untuk mencegah ekskresi listerial di susu domba '(Linde et al., 1995). Selain itu, S. typhi galur dengan tingkat

atenuasi Jerman S. typhi 21, vaksin, sepenuhnya ditoleransi pada relawan manusia (Kirsch dan Linde, 1989).

Namun, produksi skala besar dari vaksin tersebut sejauh ini telah terhambat, karena kekhawatiran bahwa vaccinal strain dilemahkan dengan cara mutasi resistensi antibiotik, dapat menyebabkan penyebaran strain bakteri resisten terhadap antibiotik; transfer probabilitas ini diukur gen (Kaper et al., 1994) dan dihitung secara teoritis (Du Pont et al., 1971; Et al Formal., 1971) berada di urutan 10 A10

Dalam karya ini dijelaskan bahwa, dengan cara eksperimen transduksi kita diuji hipotesis transfer mutasi resistensi spontan dengan spontan terjadi penanda tambahan ± seperti redaman, waktu generasi lama, suhu sensitivitas pada 438C dan pertumbuhan pada media minimal (auxotrophy) fungsional unit. Tujuan dari percobaan ini adalah untuk memberikan bukti lebih lanjut bahwa seperti mutan yang tidak berbahaya bila digunakan sebagai strain vaccinal, karena hipotetis in vivo transfer resistensi antibiotik mereka akan secara simultan disertai dengan mereka atenuasi.

1. Bahan dan metode

2.1. Galur bakteri S. typhimurium wildstrain ada 415 dari Metchnikov Institute digunakan. Itu

karakteristik strain adalah sebagai berikut: inokulasi intraperitoneal (ip) LD 50 di ICR model tikus: 10 pembentuk koloni-unit (cfu); waktu generasi (GT) 21 menit (lihat Bagian 2.3.5); rifampisin (Rif) konsentrasi hambat minimum (mic): 12,5 mg ml A1 streptomisin (Stm) mic: 6.2 mg ml A1 ; asam nalidiksat (Nal) mic: 6.2 mg ml A1 ; suhu resistensi (TR): 438C; prototrof regangan (PRO).

2.2. Mutan tahan antibiotik dengan spidol tambahan GT diuji sebagai penanda, karena keberadaan dari korelasi linear terbalik antara LD 50 (Virulensi) dan GT yang telah terbukti (Linde et al., 1990). Selain itu, mutan dengan suhu penanda (di 438C) sensitivitas (TS), tidak ada pertumbuhan pada media minimal (auxotrophy, AUX) atau gabungan TS / AUX digunakan (Fichtner, 1995). Rif-tahan atau Stm tahan satu gen (single-langkah mutasi) atau Nal tahan dua gen (double-langkah mutasi) mutan yang digunakan. Ini adalah sebagai berikut. Satu langkah-tahan Stm Rif-tahan dan mutanS. typhimurium Rif-1, mic: 1000 mg ml A1, GT38 menit, tikus LD 50 ip: 10 8 cfu; S. typhimurium Rif-10, mic: 1000 mg ml A1, TS; S. typhimurium Stm-17, mic: 800 mg ml A1, GT39 min; S. typhimurium Stm-26, mic: 800 mg ml A1, GT42 min; S. typhimurium Stm-28, mic: 800 mg ml A1, TS / AUX; S. typhimurium Stm-30, mic: 800 mg ml A1 , TS / AUX. Dua langkah-tahan muatan NalS. typhimurium Nal-21/11, mic: 800 mg ml A1, GT 40 menit; S. typhimurium Nal-21/10, mic: 800 mg ml A1, AUX; S. typhimurium Nal-21/30 mic: 800 mg ml A1, AUX.

1.3. Teknik mikrobiologi

2.3.1. Isolasi mutan resisten antibiotik spontan 10 8 untuk 10 9 cfu dari wildstrain yang dikultur ke cawan Petri yang berisi agar

nutrien ditambah 400 mg Rif ml A1 atau 400 mg Stm ml A1 atau 50 mg Nal ml A1; ini

diinkubasi pada 378C selama 48 jam. Koloni tumbuh pada media tersebut dipanen sebagai antibiotik spontan satu langkah tahan mutan. Selain itu, 10 8 untuk 10 9 cfu dari Nal tahan satu langkah mutan dikultur ke cawan Petri yang berisi agar nutrien ditambah 800 mg Nal ml A1; ini adalah diinkubasi pada 378C selama 48 jam. Koloni yang tumbuh pada media ini dipanen sebagai spontan Nal tahan dua langkah mutan.

2.3.2. Transduksi Percobaan transduksi dilakukan dengan fag beriklim P22ht; ini adalah varian dari fag

P22 dengan peningkatan kemampuan transduksi (Schmieger, 1972), mentransfer dengan frekuensi yang sama setiap bagian dari genom bakteri. Fag ini disebarkan tiga kali pada setiap donor S. organisme uji typhimurium (Wildstrain atau mutan). Organisme uji (10 7 cfu) dan fag yang (10 9 plak-forming- unit) secara bersamaan diinokulasi ke dalam 5 ml semi-padat R-menengah (Miller, 1972) di 508C. Campuran itu kemudian dibiakkan ke cawan Petri yangberisi agar nutrien; ini diinkubasi pada 378C selama 24 jam. Overlay budaya dipanen setelah penambahan 5 ml cair R-menengah dan lanjut diinkubasi pada 378C selama 30 menit; setelah penambahan 1 ml kloroform, itu disentrifugasi pada 1500g selama 10 menit. Akhirnya, 0,1 ml kloroform ditambahkan untuk supernatan. Donor berasal fag ditambahkan ke sekitar 5Â10 8 cfu ml A1 dari wildstrain (dalam `'Reverse percobaan transduksi untuk sesuai dilemahkan penerima), dengan fag sebuah rasio bakteri 1: 1 dan diinkubasi selama 30 menit pada 378C. Selanjutnya, jumlah yang sama kaldu nutrisi ditambahkan ke dalam campuran dan diinkubasi budaya gemetar selama 60 menit pada 378C. Akhirnya, ose penuh (0,1 ml) budaya itu berlapis pada media selektif sesuai dengan protokol yang dijelaskan dalam Bagian 2.4.

2.3.3. Estimasi antibiotik konsentrasi hambat minimum Estimasi mic antibiotik dilakukan oleh kultur masing-masing strain uji dan wildstrain

(kontrol) ke cawan Petri yang berisi agar nutrien ditambah antibiotik uji; sebuah serangkaian cawan Petri dengan konsentrasi antibiotik secara eksponensial meningkatkan digunakan untuk masing-masing antibiotik tes dan cawan Petri tanpa antibiotik adalah kontrol. Masakan itu diinkubasi pada 378C selama 24 jam dan interpretasi hasil adalah seperti yang dijelaskan oleh Garrod et al. (1981).

2.3.4. Estimasi sensitivitas suhu atau auxotrophy TS atau AUX diuji dengan mencatat pertumbuhan pada nutrien agar pada 438C atau

minimal media dimodifikasi oleh TschaÈpe dan Tietze (1982) masing-masing, setelah 24 jam inkubasi. Gabungan TS / AUX diuji dengan mencatat pertumbuhan pada media minimal setelah 24 jam inkubasi pada 438C.

2.3.5. Estimasi waktu generasi Estimasi GT dilakukan selama fase pertumbuhan eksponensial bakteri oleh

menggunakan unit penelitian MS-2 (Abbott). 10 5 cfu dari masing-masing strain uji diinokulasi ke LB menengah (Yeast ekstrak 0,5%, Bactopeptone 1%; Difco) dan 1% natrium klorida (Merck) dan diinkubasi pada 358C sebagai budaya gemetar. Dengan cara dioda cahaya dan fotosel, yang transmisi pada 670 nm tercatat setiap 5 menit dan diplot dengan tepat.

The aktual GT dihitung oleh komputer, berdasarkan sudut kemiringan bagian linier dari fase pertumbuhan eksponensial (Kintsher, 1987). The wildstrain (GT21 min) dan mutan dengan GT32 dikenal min digunakan sebagai kontrol. Sepuluh pengukuran ulang dilakukan untuk setiap mutan tes. Semua pengukuran KASIH organisme uji dan kontrol yang ditemukan dalam Æ5% dari masing-masing berarti GT.

2.4. Desain eksperimen transduksi dengan fag p22ht

2.4.1. Percobaan 1: dampak infeksi fag pada waktu generasi GT 30 wildstrain isolat dan 30 S. typhimurium Stm-26 mutan diukur sebelum dan

setelah infeksi dengan bakteriofag P22ht, untuk menilai pengaruh penggabungan fag beriklim ke dalam kromosom bakteri, di GT. Itu GT isolat sebelum dan setelah infeksi dibandingkan dengan menggunakan konvensional metode statistik (Armitage, 1971). 124 K. Linde et al. / Kedokteran Hewan Mikrobiologi 62 (1998) 121 ± 134

2.4.2. Percobaan 2: Transfer simultan resistensi antibiotik dan berkepanjangan waktu generasi dari satu langkah mutan untuk transductants dari wildstrain yang

Transfer GT berkepanjangan S. typhimurium Rif-1, S. typhimurium Stm-17 dan S.typhimurium Stm-26 diuji dengan mengukur GT dari wildstrain trans- ductants dipilih di antara orang-orang tumbuh pada agar nutrisi yang mengandung 200 mg Rif ml A1 atau 800 mg Stm ml A1 .

2.4.3. Percobaan 3: Transfer simultan resistensi antibiotik dan suhu sensitivitas atau gabungan suhu sensitivitas / auxotrophy dari satu langkah mutan untuk transductants dari wildstrain yang

Transfer TS S. typhimurium Rif-10 diuji dengan kultur pada agar nutrien di 438C, transductants wildstrain dipilih di antara orang-orang yang tumbuh di nutrisi agar contai- ning 200 mg Rif ml A1 . Transfer gabungan TS / AUX S. typhimurium Stm-28 dan S. typhimurium Stm-30 diuji dengan kultur pada nutrien agar pada 438C, transductants wildstrain dipilih di antara orang-orang tumbuh pada agar nutrisi yang mengandung 800 mg Stm ml A1 . 2.4.4. Percobaan 4: Transfer simultan resistensi antibiotik dan redaman dari satu langkah mutan untuk transductants dari wildstrain yang

Transfer pelemahan (ip LD 50 ! 10 8 cfu) S. typhimurium Rif-1 diuji oleh ip inokulasi ICR tikus (`Versuckstierproduktion Berlin ± Lichtenberg ') dengan 10 7 cfu dari transductants wildstrain dipilih di antara orang-orang yang tumbuh di hara agar yang mengandung 200 mg Rif ml A1 ; 15 transductants diuji oleh inokulasi masing-masing menjadi 10 tikus. Selanjutnya, masing-masing dari 10 spontan Rif-tahan S. typhimurium satu langkah mutan diinokulasikan ke dalam 10 tikus. Sebagai positif kontrol, 10 tikus ditantang dengan 10 3 cfu dan 10 tikus dengan 10 4 cfu dari wildstrain tersebut; sebagai kontrol negatif 10 tikus ditantang dengan 10 7 cfu dari S. typhimurium Rif-1 mutan. Jumlah tikus, yang meninggal dalam waktu 14 hari setelah tantangan, tercatat.

2.4.5. Percobaan 5: simultan 'Transfer' kebalikan dari ketahanan suhu dan sensitivitas antibiotik dari wildstrain untuk transductants dari resisten antibiotik satu langkah mutan

`Pengalihan 'reverse sensitivitas antibiotik diuji dengan mempelajari sensitivitas Rif S. typhimurium Rif-10 transductants dipilih di antara orang-orang yang tumbuh di agar nutrien di 438C.

2.4.6. Percobaan 6: Transfer simultan resistensi yang tinggi Nal dan berkepanjangan waktu generasi dari Nal tahan yang sangat dua langkah mutan untuk transductants dari Nal tahan cukup satu langkah (nenek moyang) mutan

Transfer GT berkepanjangan S. typhimurium Nal-21/11 diuji dengan mengukur GT S. typhimurium Nal-21 (nenek moyang mutan) transductants dipilih di antara orang-orang dewasa pada agar nutrisi yang mengandung 800 mg Nal ml A1 dan transductants wildstrain yang dipilih antara yang tumbuh pada agar nutrien yang mengandung 50 mg Nal ml A1 . K. Linde et al. / Kedokteran Hewan Mikrobiologi 62 (1998) 121 ± 134 125

2.4.7. Percobaan 7: Transfer simultan resistensi yang tinggi Nal dan auxotrophy dari Nal tahan yang sangat dua langkah mutan untuk transductants dari Nal tahan cukup satu langkah (nenek moyang) mutan

Transfer AUX S. typhimurium Nal-21/10 dan S. typhimurium Nal-21/30 adalah diuji oleh kultur pada media minimal S. typhimurium Nal-21 (nenek moyang mutan) transductants dipilih di antara orang-orang tumbuh pada agar nutrisi yang mengandung 800 mg Nal ml A1 dan transductants wildstrain dipilih di antara orang-orang tumbuh pada agar nutrisi yang mengandung 50 mg Nal ml A1 . 2.4.8. Percobaan 8: simultan 'Transfer' kebalikan dari prototrophy dan Nal moderat resistensi dari wildstrain atau tahan cukup satu langkah (nenek moyang) mutan Nal ke transductants dari Nal tahan yang sangat dua langkah mutan

Transfer `'reverse penurunan resistensi antibiotik (dari resistensi yang tinggi Nal untuk Resistensi moderat Nal) diuji dengan mempelajari sensitivitas Nal S. typhimurium Nal-21/10 dan S. typhimurium Nal-21/30 transductants dipilih di antara orang-orang dewasa di Media minimal di 378C.

2.5. Isolasi usus Rif tahan Escherichia coli dengan waktu generasi lama Delapan puluh empat sampel feses segar manusia dikumpulkan dan diperiksa. Sampai

50 g setiap sampel dihentikan dalam volume keempat kali lipat dari fosfat bufferred pH garam 7,3 (PBS). Cairan disentrifugasi pada 1000g untuk menghapus bahan kasar; supernatan recentrifuged di 5200g dan sedimen disuspensikan dalam PBS untuk volume 5 ml, yang sekitar satu sepersepuluh dari volume awalnya. Materi dibagi menjadi aliquot dari 0,2 ml, masing-masing yang berlapis ke cawan Petri yang berisi agar nutrisi atau gizi agar ditambah 400 mg Rif ml A1 ; ini diinkubasi pada 378C selama 48 jam. E. coli koloni ditanam di nutrien agar ditambah antibiotik dipanen secara alami terjadi Rif- mutan tahan. Biasanya, 1-3 mutan tersebut diperoleh dari setiap sampel, ketika jumlah total E. coli adalah! 10 8 cfu ml A1 , Seperti dihitung dengan metode Miles dan Misra (1938). GT 50 Rif tahan E. coli mutan, 50 Rif-sensitif E. coli isolat dan 50 spontan terisolasi Rif-tahan S. typhimurium mutan diukur. Itu Isolat GT dari mutan resisten antibiotik dan antibiotik-sensitif yang dibandingkan dengan menggunakan metode statistik konvensional (Armitage, 1971).

3. Hasil

3.1. Pengaruh infeksi fag pada waktu generasi Hasil Percobaan 1 (Tabel 1) menunjukkan bahwa infeksi fag tidak

secara signifikan (p> 0,05) mempengaruhi GT strain yang terinfeksi; Oleh karena itu, itu akan tidak mempengaruhi GT dari transductants dari mutan resisten antibiotik dengan GT berkepanjangan. 126 K. Linde et al. / Kedokteran Hewan Mikrobiologi 62 (1998) 121 ± 134

3.2. Transfer simultan resistensi antibiotik dan spidol tambahan diuji dari satu langkah mutan untuk transductants dari wildstrain yang

Hasil Percobaan 2 (Tabel 2) menunjukkan bahwa resistensi antibiotik dan berkepanjangan GT 100% secara bersamaan ditransfer ke wildstrain transductants. GT dari transductants bervariasi dari A18% ke ‡ 67% dari GT dari mutan donor. Hasil Percobaan 3 (Tabel 2) menunjukkan bahwa resistensi antibiotik dan TS atau TS / AUX 100% secara bersamaan ditransfer ke wildstrain transductants.

3.3. Transfer simultan resistensi antibiotik dan redaman dari satu langkah-mutan untuk transductants dari wildstrain yang

Hasil Percobaan 4 (Tabel 3) menunjukkan bahwa resistensi antibiotik dan redaman 100% secara bersamaan ditransfer ke wildstrain transductants. Hasil ini juga memberikan bukti tambahan pada korelasi terbalik antara virulensi dan GT. Attenuation dari Rif-1 mutan 100% ditransfer: ada salah satu 150 tikus ditantang intraperitoneal dengan satu atau lain dari transductants wildstrain, meninggal. Dari 100 tikus ditantang dengan satu atau lain dari 10 spontan Rif tahan S. typhimurium satu langkah mutan, 89 meninggal. Akhirnya, dari 20 tikus kontrol positif, 19 meninggal; dari 10 tikus kontrol negatif, tidak mati.

3.4. Simultan 'Transfer' kebalikan dari ketahanan suhu dan sensitivitas antibiotik dari wildstrain ke transductants dari resisten antibiotik satu langkah mutan

Hasil Percobaan 5 (Tabel 4) menegaskan 100% pengalihan simultan sensitivitas antibiotik dengan karakteristik wildstrain tersebut. Rif-sensitivitas dan Suhu (di 438C) tahan secara bersamaan dipindahkan ke S. typhimurium Rif- 10 transductants: semua transductants tumbuh pada 438C yang Rif-sensitif.

3.5. Transfer simultan resistensi yang tinggi Nal dan spidol tambahan diuji dari Nal tahan yang sangat dua langkah mutan untuk transductants dari Nal tahan cukup satu langkah (nenek moyang) mutan

Resistensi bakteri atau sensitivitas terhadap kuinolon ditentukan oleh gyrA atau gyrB gen, masing-masing, (Yamagishi et al, 1986;.. Soussy et al, 1993;. Ouabdesselam et al, 1995; Reyna et al., 1995). Pendekatan untuk konfirmasi transfer simultan resistensi antibiotik dan satu penanda tambahan, yang digunakan di tahan Stm Rif- atau satu langkah mutan, tidak dapat digunakan dalam satu langkah Nal tahan mutan, karena tidak ada penanda tambahan ditemukan di mutan yang terakhir. Dalam strain ini tidak berubah gyrA gen dan / atau gen gyrB menghambat ekspresi penanda tambahan. Oleh karena itu, unit fungsional perlawanan Nal dipelajari di Nal tahan yang sangat dua langkah mutan. Hasil Percobaan 6 dan 7 (Tabel 5) menunjukkan bahwa daya tahan tinggi Nal (mic: ! 800 mg ml A1 ) Dan GT lama atau AUX adalah 100% secara bersamaan ditransfer ke S. typhimurium transductants Nal-21 (nenek moyang mutan). Hanya resistensi moderat Nal (Mic: 200 mg ml A1 ) Dipindahkan ke wildstrain transductants.

3.6. Simultan 'Transfer' kebalikan dari prototrophy dan Nal resistensi moderat dari wildstrain dan tahan cukup satu langkah (nenek moyang) mutan Nal ke transductants dari Nal tahan yang sangat dua langkah mutan

Hasil Percobaan 8 (Tabel 6) menegaskan 100% pengalihan simultan Penurunan resistensi antibiotik (dari resistensi yang tinggi Nal resistensi moderat Nal) dengan karakteristik satu langkah (nenek moyang) mutan. Penurunan resistensi Nal dan prototrophy 100% secara bersamaan ditransfer ke S. typhimurium Nal-21/10 dan S. typhimurium Nal-21/30 transductants: semua transductants tumbuh pada media minimal adalah Nal tahan cukup (200 mg ml A1).

3.7. Isolasi usus Rif tahan E. coli dengan waktu generasi lama GT dari 50 alami Rif-tahan E. coli mutan (x26.6 min Æ0.85) secara signifikan

(p<0,001) lebih lama dibandingkan dengan 50 Rif-sensitif E. coli isolat. E. coli mutan adalah lebih lama dari GT terpanjang yang tercatat di antara Rif-sensitif E. coli isolat. GT dari 50 laboratorium yang berasal spontan Rif tahan S. typhimurium mutan (x26.2 min Æ0.81), yang mengurangi patogenisitas juga ditunjukkan, juga lebih lama dari yang dari wildstrain masing (21 menit)

4. Diskusi Penggunaan strain bakteri hidup dalam vaksin hewan atau manusia membutuhkan

mutan ini untuk menjadi berbahaya. Dengan demikian, dalam hal tidak mungkin transfer resistensi terhadap strain lapangan tidak ada masalah terapi harus muncul.

Dalam karya ini, dengan menggunakan eksperimen transduksi, kami menemukan bahwa berbagai penanda diperiksa ± yang muncul dengan mutasi resistensi: atenuasi, GT berkepanjangan, TS, AUX, TS gabungan / AUX ± hanya ada resistensi ditambah unit fungsional. Hasil menunjukkan bahwa, tanpa kecuali strain rekombinan menyatakan secara simultan resistensi dan spidol yang disebutkan di atas.

Tanda tersebut dipelajari, karena mereka dengan mudah diuji. Penanda fenotip lainnya memiliki juga telah diidentifikasi; misalnya, dalam E. coli RNA polimerase(resistance Rif) ditambah pembentukan flagela yang rusak (Yamamori et al., 1977) atau ditambah perubahan pada promotor selektivitas (Kaca et al., 1986) atau di Sh. protein ribosom flexneri (Stm resistance) terhubung dengan pelemahan (Lyceva dan Aleshkin, 1977).

Dalam tahan Stm Rif- atau mutan satu langkah, keberadaan dan pengalihan simultan resistensi ditambah dengan penanda tambahan konsisten ditemukan dalam in vitro eksperimen (nos. 2, 3 dan 5). Mengurangi virulensi yang dari transductants resisten antibiotik ditunjukkan oleh hasil Percobaan 4. Dalam Nal tahan cukup (mic: 200 mg ml A1) Satulangkah mutan, hanya wildstrain perilaku ditemukan, mungkin, karena gyrA tidak berubah atau gen gyrB menghalangi Tabel 7 Distribusi frekuensi berbagai kali generasi disimpan di 50 Rif tahan E. coli mutan, 50 Rif- sensitif E. coli strain dan 50 Rif tahan S. typhimurium mutan Kisaran GT (Min) Rif-tahan Strain E. coli (n) Rif-sensitif Strain E. Namun, di Nal tahan yang sangat (mic: ! 800 mg ml A1) Mutan dua langkah, spidol tambahan ± GT berkepanjangan seperti atau AUX ± yang menyatakan. Dalam kasus transfer gen resistensi kedua dari Nal seperti tahan yang sangat dua langkah mutan menjadi tahan cukup satu langkah (nenek moyang) mutan Nal, sebuah berbahaya rekombinan juga akan berasal. Resistensi terhadap kuinolon mungkin konsekuensi dari berbagai mutasi, yang baik mengurangi permeabilitas membran luar bakteri atau memerlukan peningkatan penghabisan antibiotik (Hooper et al, 1987, 1992;. Li et al, 1994;. Maneewannakul dan Levy, 1996; Hancock, 1997). Mutan kuinolon-tahan seperti itu tidak diselidiki dengan ini. Transfer 100% dari perlawanan bersamaan dengan penanda tambahan Unit genetik fungsional, menunjukkan bahwa mutasi yang sama menguasai berbagai penanda sebagai efek pleiotropik. Hipotesis ini lebih dikuatkan oleh hasil `'reverse transductions. Satu mungkin dengan demikian, menyimpulkan bahwa mutasi tersebut merupakan bagian dari evolusi adaptasi bakteri terhadap perubahan lingkungan. Selanjutnya, tahan antibiotik E. coli mutan dengan GT berkepanjangan yang terisolasi dari sampel feses. Hal demikian, menunjukkan bahwa mutan resisten antibiotik terutama Rif- klon tahan, terjadi setiap saat di usus sebagai konsekuensi untuk alam dan berbahaya hanyut bakteri. Semua temuan di atas memberikan bukti yang menyangkut menghubungkan kromosom antibiotik tahan dilemahkan strain vaccinal untuk penyebaran strain bakteri resisten dan transfer resistensi seperti bakteri lainnya, tidak sah. Kegigihan seperti strain vaccinal resisten antibiotik dilemahkan dalam host adalah seperti

yang bakteri lainnya hidup waktu terbatas strain (Linde et al., 1996). Selanjutnya, bahkan jika transfer resistensi terhadap lainnya Enterobacteria terjadi [ini secara teoritis mungkin (Du Pont et al, 1971;. Formal et al., 1971; Kaper et al., 1994), tetapi sejauh ini belum diamati], strain hanya dilemahkan akan disebarluaskan. Temuan ini memberikan dukungan lebih lanjut untuk menggunakan vaksin bakteri dilemahkan dengan cara mutasi resistensi antibiotik.

Referensi

Armitage, P., 1971. Statistical Methods in Medical Research. Blackwell, Oxford, 504 pp.Dentchev, V., Marinova, S., Vassilev, T., Bratoyeva, M., Linde, K., 1990. Live Shigella

flexneri 2a and Shigellasonnei I vaccine candidate strains with two attenuating markers. II. Preliminary results of vaccination ofadult volunteers and children aged 2-17 years. Vaccine 8, 30-34.

Du Pont, H.L., Hornick, R.B., Libonati, J., Snyder, M.J., Formal, S.B., 1971. Study of Shigella vaccine in man.Proc. Int. Symp. on Enterobacterial Vaccines. Karger, Basel, pp. 213-218.

Fichtner, A., 1995. [Estimation of the functional unit of metabolic drifts and pleiotropic effects]. (De)Dissertation A, University of Leipzig.

Formal, S.B., La Brec, E.H., Hornick, R.B., Du Pont, H.L., Snyder, M.J., 1971. Attenuation of strains ofdysentery bacilli. Proceedings of the international symposium on enterobacterial vaccines. Karger, Basel, pp. 73-78.

Garrod, L.P., Lambert, H.P., O'Grady, F., 1981. Antibiotics and Chemotherapy, 5th ed. Churchill Livingstone,Edinburgh, 514 pp.

Glass, R.E., Jones, S.T., Nene, V., Nomura, T., Fujita, N., Ishihama, A., 1986. Genetic studies in the _-subunit ofEscherichia coli RNA polymerase. VIII. Localisation of a region involved in promotor selectivity. Mol.Gen. Genet. 203, 487-491.

Hancock, R.E.W., 1997. The bacterial outer membrane as a drug barrier. Trends Microbiol. 5, 37-42.Hooper, D.C., Wolfson, J.S., Bozza, M.A., Ng, E.Y., 1992. Genetics and regulation of outer

membrane protein expression by quinolone resistance loci nfxB, nfxC, and cfxB. Antimicrob. Agents Chemotherapy 36, 1151-1154.

Hooper, D.C., Wolfson, J.S., Ng, E.Y., Swartz, M.N., 1987. Mechanism of action of and resistance tociprofloxacin. Am. J. Med. 82, (suppl. 4A), 12-20.

Kaper, J.B., Michalski, J., Ketley, J.M., Levine, M.M., 1994. Potential for reacquisition of cholera enterotoxingenes by attenuated Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. Infect. Immun. 62, 1480-1483.

Kintsher, A., 1987. Investigation on the application of MS-2 (Abbott Corp., USA) to estimate the generationtime for differentiation of bacterial strains. (De) Medical Diploma Study, University of Leipzig.

Kirsch, W.D., Linde, K., 1989. Clinical Trial Phase I of an Oral Salmonella typhi Live Vaccine KHU/SSW, Karl-Marx University, Leipzig and Saxon Serum Laboratory, Dresden. (De) Expert Report of the DistrictHospital `St Georg', Department of Infectious and Tropical Diseases.

Li, X.Z., Livermore, D.M., Nikaido, H., 1994. Role of efflux in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa:resistance to tetracycline, chloramphenicol and norfloxacin. Antimicrob. Agents Chemotherapy 38, 1732-1741.

Linde, K., Abraham, A.A., Beer, J., 1991. Stable Listeria monocytogenes live vaccine candidate strains with graded attenuation on the mouse model. Vaccine 9, 101-105.

Linde, K., Beer, J., Bondarenko, V., 1990. Stable Salmonella live vaccine strains with two or more attenuatingmutations and any desired level of attenuation. Vaccine 8, 278-282.

Linde, K., Bondarenko, V., Sviridenko, V., 1992. Prophylaxis of Salmonella abortus-ovis induced abortion ofsheep by a Salmonella typhimurium live vaccine. Vaccine 10, 337-340.

Linde, K., Fthenakis, G.C., Lippmann, R., Kinne, J., Abraham, A.A., 1995. The efficacy of a live Listeriamonocytogenes combined serotype 1/2a and serotype 4b vaccine. Vaccine 13, 923-926.

Linde, K., Hahn, I., Vielitz, E., 1996. Development of live salmonella vaccines optimally attenuated forchickens. (De) Tierarztl. Umschau 51, 23-31.

Linde, K., Randhagen, B., Beer, J., 1993a. Salmonella Lebendimpfstoff fur HuÈhner. European Patent No.93114221.0.

Linde, K., Randhagen, B., Beer, J., Dentchev, V., Marinova, S., Vassilev, T., Bratoyeva, M., 1993b. Shigella flexneri 2a and sonnei I vaccine with two attenuating markers: construction, tolerability and immunogenicity in 143 children aged 3-17 years. Vaccine 11, 197-200.

Lyceva, T.A., Aleshkin, G.I., 1977. A study of the mechanism of reduction of the virulence in the Shigella flexneri strains resistant to streptomycin. (Ru) Z. Mikrobiol. Epidemiol. Immunol. pp. 114-118.

Maneewannakul, K., Levy, S.B., 1996. Identification of mar mutants among quinolone-resistant clinical isolates of Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemotherapy 40, 1695-1698.

Miles, A.A., Misra, J.S., 1938. The estimation of the bactericidal power of the blood. J. Hyg., Camb. 38, 732-749.

Miller, J.H., 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,New York, 466 pp.

Ouabdesselam, S., Hooper, D.C., Tankovic, J., Soussy, C.J., 1995. Detection of gyrA and gyrB mutations in quinolone-resistant clinical isolates of Escherichia coli by single-strand conformational polymorphism analysis and determination of levels of resistance conferred by two different single gyrA mutations. Antimicrob. Agents Chemotherapy 39, 1667-1670.

Schmieger, H., 1972. Phage P22 mutants with increased or decreased transduction abilities. Mol. Gen. Genet.119, 75-88.

Reyna, F., Huesca, M., Gonzalez, V., Fuchs, L.Y., 1995. Salmonella typhimurium gyrA mutations associatedwith fluoroquinolone resistance. Antimicrob. Agents Chemotherapy 39, 1621-1623.

Soussy, C.J., Wolfson, J.S., Ng, E.Y., Hooper, D.C., 1993. Limitations of plasmid complementation test for determination of quinolone resistance due to changes in the gyrase A protein and identification of conditional quinolone resistance locus. Antimicrob. Agents Chemotherapy 37, 2588-2592.

TschaÈpe, H., Tietze, E., 1982. Catalogue of Methods for Typing of Plasmids for Epidemiological, Clinical andEcological Purposes. (De) Institut fur Experimentelle Epidemiologie, Wenigerode.

Yamagishi, J., Yoshida, H., Yamayoshi, M., Nakamura, S., 1986. Nalidixic acid-resistant mutations of the gyrBgene of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 204, 367-373.

Yamamori, T., Ito, K., Yura, T., Suzuki, T., Iino, T., 1977. Ribonucleic acid polymerase mutant of Escherichiacoli defective in flagella formation. J. Bacteriol. 132, 254-261.