VALIDERING AF DYRKNINGSMETODER I KLINISK MIKROBIOLOGI

David Fuglsang-Damgaard

Specialeansvarlig overlæge (og teknisk assessor DANAK)

Klinisk Mikrobiologisk Afdeling

Aalborg Universitetshospital

VALIDERING AF DYRKNINGSMETODER I KL INISK MIKROBIOLOGI

HVAD ER STATUS I DK FOR VALIDERING AF DYRKNINGSBASEREDE METODER

KOMPLEKSITETEN I METODERNE

MANGEL PÅ GULDSTANDARD

BIOLOGISKE FÆNOMENER OG BIOLOGISK DRIFT

PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ VALIDERING OG UDFORDRINGER

VALIDERING – ANVENDT SYNTAKS I FOREDRAGET

Validering af analyser/test udføres ved;

a) Metoder der ikke er standardmetoder

b) b) Metoder, der er udviklet/udformet af laboratoriet

c) Standardmetoder der anvendes uden for deres tilsigtede anvendelseområde

d) Validerede metoder der efterfølgende er ændret

Bør omfatte;

Målekorrekthed, målenøjagtighed, præcision, måleusikkerhed, detektionsgrænse (kvantitative mål)

Repertérbarhed, intermediær præcision, sensitivitet, specificitet (kvalitative mål)

Interfererende substanser, prøvematerialet(standardiseret vs. non standardiseret)

Dokumentere den anvendte metode og resultaterne

FORSKELLEN MELLEM DE VIDENSKABELIGE DISCIPLINER

Efter Auguste Comte (1798-1857)

”Hierarchy of the Sciences”

Billede omfattet af copyright

Link: https://xkcd.com/435/

ISO AKKREDITERING I KL INISK MIKROBIOLOGI I DANMARK

STATENS SERUM INSTITUT

(ISO17125)

KMA OUH

(ISO15189)

KMA SLAGELSE

(ISO15189)

KMA

AALBORG

(ISO15189)

19

97

19

98

19

99

20

00

20

01

20

02

20

03

20

04

20

05

20

06

20

07

20

08

20

09

20

10

20

11

20

12

20

13

20

14

20

15

20

16

20

17

20

18

http://portal.danak.dk/

3 DYRKNINGSBASEREDE METODER AKKREDITERET EFTER ISO15189LUFTVEJSPATOGENE DYRKNING (KMA OUH)

URINPATOGENE DYRKNING (KMA SLAGELSE)

TARMPATOGENE BAKTERIER (DYRKNING) (KMA AALBORG)

MET ODER I KL INISK MIKROBIOLOGI - STATUS

ESTIMERET ANDEL I DK KVALITETSKONTROL DÆKNING

IN-HOUSE

KOMMERCIEL

/STANDARD

METODE

EKSTERN

KONTROL

INTERN

KONTROL

MIKROSKOPI 20-40% 60-80% MIDDEL/DÅRLIG DÅRLIG/INGEN

DYRKNING >90% <10% DÅRLIG DÅRLIG/INGEN

MET ODEANBEFALINGER - EVIDENS

HVOR ER VI MED STANDARDISERING I DK - T ERMINOLOGI

KOMPLEKSITETEN I MET ODERNE - BLODDYRKNING

Tra

nsp

ort

Op

bevari

ng Inkubering Mikroskopi Aflæsning Identifikation Resistens

Bactec®

PlademedierVarmeskabe

Gram-farvningApi®

MALDI-TOF-MSHurtig ID

DensiCheck

E-test®Tablet diffusion

IT/S

var

KOMPLEKSITETEN I MET ODERNE - URINDYRKNING

Anvendt apparatur:

WASP udsåningsrobot

CO2 inkubator (primær dyrkning)

Almindelig inkubator (resistensbestemmelse)

Densicheck (resistensbestemmelse)

MALDI-TOF-MS apparatur (identifikation)

Anvendte reagenser/forbrugsvarer:

3 plademedier

14 resistenstabletter

”Anvendte” bioanalytikere og evt. læger:

Op til 4 afhængigt af kompleksitet og tilfældighed

I alt mindst 5 apparaturer, mindst 17 komponenter og op til 4 personer for ét fund i en urindyrkning!

KOMPLEKSITETEN I MET ODERNE - KENDTE VS. UKENDTE UDFALD

Tarmpatogene bakterier (Dyrkning) Blod (Dyrkning)

Defineret liste over mikroorganismer: Ikke endelig liste over mikroorganismer

Campylobacter coli/jejuni ?

Salmonella species

Vibrio cholerae

Shigella species

Yersinia enterocolitica

Historisk <20 kombinationer af svar Historisk >>200 kombinationer af svar

KOMPLEKSITETEN I MET ODERNE – VALG AF MET ODE

Præanalyse

Prøveremedier (diverse fabrikater)

Analyse

Plademedier (5% blod, 10% blod, chokoladeplade, kromogene, selektive plader, m.fl.)

Inkubation (atmosfærisk luft, CO2, mikroaerofilt, anaerobt)

Temperatur (stuetemperatur, 35°C, 37°C, 42°C)

Tid (1, 2, 4, 6, 10, 14, 21 dage)

Identifikation (MALDI-TOF-MS, API®, diverse hurtig test,

Resistensbestemmelse (discdiffusion, gradient MIC, mikrotiter MIC, automatiseret MIC)

Postanalyse

Postanalytisk strukturering af svar (hvad betragtes som (potentielt) patogent og rapporteres)

MANGEL PÅ GULDSTANDARD FOR EN SYGDOMSENTITET

Hvordan defineres en patient som havende pneumokok pneumoni?

a) Klinisk pneumoni diagnose (klinisk)

b) Röngten thorax med lobær pneumoni (paraklinisk)

c) Luftvejsprøve med vækst af S. pneumoniae (paraklinisk)

d) Bakteriæmi med vækst af S. pneumoniae (paraklinisk)

e) Positiv pneumokok urin antigen test (PUT) (paraklinisk)

f) Luftvejsprøve med PCR positiv for S. pneumoniae (paraklinisk)

e) Alle øvrige årsager til pneumoni udelukket (paraklinisk)

En eller flere af ovenstående kan formentlig anvendes som sammensat Guldstandard, men det

er næppe praktisk gennemførbart for alle kombinationer af målorganismer.

MANGEL PÅ GULDSTANDARD – FORTOLKNING AF BETYDNING

5 danske KMA´er

10 simulerede urindyrkningsfund

(ikke dyrket)

21 påviste bakterier

= Konsensus rapportering 10af21

Azuz S et al. Infect Dis. 2017

VIGTIGHEDEN AF DEN KLINISKE KONTEKST

Staphylococcus epidermidis, vækst af

Podning, sår tolkning = hudflora, helt uden betydning!

Vævsprøve 1. tå (Diabetes Mellitus) tolkning = hudflora/potentielt patogen?

Kammeprøve (hofteprotese) 5af5 prøver tolkning = signifikant fund!

E. coli 10e5 CFU/ml

Urin, midtstråle (65 årig ♀ uden symptomer) tolkning =asymptomatisk bakteuri

Urin, midtstråle (65 årig ♀ med symptomer) tolkning =signifikant dyrkningsfund

ANVENDELSE AF KOMMENTARER/FORTOLKNING HYPPIG

Den samlede konklusion kan afhænge af flere (og forskellige) serielle prøver !

SERIELLE PRØVER – SAMLET VURDERING

SERIELLE PRØVER – SAMLET VURDERING

MANGEL PÅ GULDSTANDARD –HVILKEN MET ODE ER T ÆTTEST PÅ SANDHEDEN ?

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

16s Dyrkning

Ob

se

rvere

t fo

rde

lin

g %

(D

NA

ell

er d

yrk

et m

æn

gd

e)

Pasteurella canis

Bacillus cereus

Rhizobium radiobacter

Acinetobacter species

Prevotella species

Streptococcus agalactiae

Staphulococcus aureus

FP 16s PCR

FN dyrkning

FN 16s PCR

BIOLOGISK DRIFT - ”HOW T O HIT A MOVING TARGET”

Fysik og Kemi Biologi

Billede omfattet af copyright

Link: https://blog.forecast.it/the-

difference-between-accuracy-

and-precision

BIOLOGISK DRIFT - RESISTENSBESTEMMELSE

E. coli (meropenem resistent)

Fænotypisk carbapenemase test: KPC positiv

Immunkromatografisk test: Negativ

PCR (GenXpert): Negativ

Whole-genome-sequencing (WGS): IMI positiv

Brandt C et al. Sci Rep. 2017

Conclusion

“The bacterial domain of life is not uniform. Instead we see clumps of similar strains that share many characteristics,

and with an innate human urge to classify, we have defined these as species.” Hanage WP et al. BMC Biology. 2005

≈ En art er ikke en SI enhed

BIOLOGISK DRIFT – ART SBEGREBET OG IDENTIFIKATION

PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ UDFORDRINGERPRÆANALYTISK USIKKERHED

Ofte større end den analytiske usikkerhed;

Mikroorganismen

Mikroorganismens fordeling

Hæmmende faktorer

Podepinden

Podningsproceduren

Transport

Temperatur

m.fl.

Gør det svært at argumentere for at analytiske usikkerheder bestemmes minutiøst i validering

PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ UDFORDRINGERPRÆANALYTISK USIKKERHED

Ikke standardiseret prøvemateriale Opformering (P. aeruginosa) &

hæmning (N. gonorrhoeae) under transport

S.

au

reu

s

Podning

1

Podning

2

S.

pyo

ge

ne

s

Podning

1

Podning

2

+ + ++ ++

++ + + ++

+ + ++ ++

+++ ++ + +++

+ +++ ++ +

+ ++ 0v ++

0 v + ++ ++

+ + + +

+++ +++ +++ +

++ ++ +++ +++

Egne data

P. aeruginosa ørepodning (antal fund / antal prøver)

2011 (før E-swab) 3.kvartal 47/251 = 0,18 (95%CI: 0,14-0,24)2013 (efter E-swab) 3.kvartal 67/274 = 0,24 (95%CI: 0,19-0,29)

10af20 med overensstemmedekvantitering

8af 20 med varierende kvantitering (minor error)2af20 med varierende konklusion (major error)

+ = få kolonier++ = en del kolonier

+++ = mange kolonier

PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ UDFORDRINGERKVALITATIV OBJEKTIV BEDØMMELSE

Antal fund rapporteret (urindyrkning) Kvantitering (urindyrkning)

1,4

1,5

1,7

1,6

1,4

1,5

1,4

0 mdr 6 mdr 12 mdr 18 mdr

AFLÆSNING

(MEAN)

KONSENSUS

AFLÆSNING

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5

Lo

g(C

FU

/ml)

Log(CFU/ml)

Reference CFU/ml

Målt (aflæst) CFU/ml

Lineær (Målt (aflæst)

CFU/ml)

Egne data

Systematiske usikkerhed tiltaget over tid Systematiske usikkerhed i valideringsperioden

PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ UDFORDRINGERUFORUDSETE BIOLOGISKE FÆNOMENER - HÆMNING

E. coli (isolat 1) E. coli (isolat 2)

PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ UDFORDRINGER

Hvor mange forskellige bakterier er der i prøven?

Eschericia coli

Tolkning 1:

Mikrokolonier i CTX zone er

udspaltninger af samme klon der

udtrykker kromosomal ampC beta-

lactamase

Tolkning 2:

Mikrokolonierne i CTX zonen er en

unik bakterie der skal betragtes som

selvstændigt fund.

Ovenstående vil evt. kunne afklares

ved whole-genome-sequencing, men

dette er ikke realistisk i en klinisk

sammenhæng

PERSPEKTIV

Der er behov for validering af dyrkningsbaserede metoder

og…..

der er behov for mere standardisering af dyrkningsbaserede metoder i Danmark

men…..

der eksisterer ikke en manual for hvordan

og……

Klinisk Mikrobiologi ≠ Klinisk Biokemi ≠ øvrige laboratorie specialer

Spørgsmål og kommentarer?